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6º LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA I

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Técnicas de Cultivo
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Universidad Nacional Federico Villarreal Laboratorio de Microbiología I - Técnicas de Cultivo

Ing. Vanessa García Díaz

Ingeniería Agroindustrial

Universidad Nacional Federico Villarreal Laboratorio de Microbiología I - Técnicas de Cultivo

I.- OBJETIVOS
Aprender a sembrar en tubos con Agar inclinado de adentro hacia fuera. Dominar y practicar la siembra de placas por estrías. Reconocer la importancia del plaqueado y el flameado

II.- GENERALIDADES:
Cuando se trata de estudiar la flora bacteriana de un cuerpo, suelo, agua, alimento o cualquier otra parte de nuestro medio ambiente se ha encontrado que la mayoría de las bacterias existen en poblaciones mixtas. Solamente en muy raras situaciones es que estas se encuentran como especies simples .Para ser capaz de estudiar las características morfológicas y fisiológicas de un cultivo es esencial ante todo que los organismos sean separados de otras especies con las que normalmente s4e encuentran es su hábitat natural, es decir se debe obtener n cultivo puro del microorganismo. Existen varios métodos para obtener un cultivo puro a partir de mezclas de cultivos. Los dos métodos mas frecuentemente usados involucran hacer una estría en una placa o una sobre una placa. Ambas técnicas involucran el uso de pequeñas cantidades de microorganismos de tal forma que las especies individuales puedan ser seleccionadas de las otras.

INOCULACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

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En microbiología se entiende por "siembra" la operación que consiste en depositar un germen asépticamente en un medio de cultivo. Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales: 1. Practicarla en medios de cultivo favorable y previamente esterilizado. 2. Emplear instrumentos asépticos. 3. No contaminar ni destruir el inóculo, 4. Depositarla asépticamente en los medios elegidos. 5. Esterilizar os instrumentos empleados antes y después de cada operación. El instrumento corrientemente empleado en las siembras son los siguientes: 1. El asa: Es un alambre de cromo níquel, tiene un diámetro de 0,3 a 1 mm. de diámetro y está sujeto a un mango de vidrio o de metal. El hilo puede terminar recto (aguja), en anillo (asa) o aplastado (espátula). Los medios de cultivo, como ya se ha dicho, pueden ser sólidos o líquidos, y estar contenidos en tubos, placas o frascos. La técnica general de las siembras variará según el estado físico del material a sembrar y del medio de cultivo.

METODOS DE CULTIVO DE USO RUTINARIO: Al inocular debe trabajarse siempre dentro del radio de un mechero Bunsen (30 cm.), o, en el ambiente dentro de una campana de flujo laminar, ya que, la corriente ascendente de aire que va por la llama, o la corriente de aire del flujo laminar arrastra el polvo y otras partículas con el aire hacia arriba, o hacia afuera; impidiendo la contaminación del medio de cultivo. El asa debe ser flameada adecuadamente y enfriada antes de tocar el inóculo, o el medio de cultivo. 1. Siembra en placas:

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Con el asa ya esterilizada, se toma una gota de líquido o de una emulsión del producto patológico y se deposita en un costado del agar de una placa Petri, se estría a partir de ese punto pasando suavemente el asa en zig-zag por la superficie del agar sin rasparlo, rotar la placa en 1/3 y repetir el procedimiento 2 a 3 veces. A menudo se reciben tórulas para cultivo y con ellas se practica la primera de las estrías, procediendo después a diseminar con el asa o pipeta en la forma descrita.

2. Siembra en tubos de agar tendido: El cuello del tubo debe ser flameado antes y después de ser sembrado. Con el asa previamente esterilizada a la llama, se toma una pequeña cantidad de la muestra y se lleva al fondo del tubo, luego se estría suavemente la superficie del medio en forma ondulante. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo, debe dejarse suelto el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. 3. Siembra por picadura: El inóculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. 4. Siembra en superficie y picadura: El inóculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estría ondulada. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. 5. Siembra en profundidad: Al inocular un medio líquido como es el tioglocolato, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo, cuando éste se endereza el material se encuentra bajo la superficie del medio. Al inocular el medio líquido con tórula o con inóculo líquido se deposita este en el fondo del tubo. Debe flamearse la

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boca del tubo antes y después de efectuada la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. 6. INCUBACION: Los medios de cultivo pueden ser: inoculados en estufa a 35°C en aerobiosis, anaerobiosis o en atmósfera de C02. Para aerobiosis se incuban las placas y tubos en estufa de cultivo a 35°C. Para anaerobiosis se colocan las placas y tubos dentro de una jarra Anaerobia y luego ésta se coloca en estufa de cultivo a 35°C. Con un sobre productor de atmósfera anaerobia. Para incubar en atmósfera de C02 se colocan las placas y tubos dentro de la Jarra de C02 y ésta se coloca en la estufa de cultivo a 35°C con un sobre productor de atmósfera microaerofila.

III. MATERIAL PARA LA PRÁCTICA

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1 tubo de ensayo 1 mechero para flamear Alcohol, para esterilizar la zona de trabajo 1 asa de siembra Torula de algodón Muestras: • • • • Papa con huevo Cebiche de pota(Muestra de nuestro grupo analizado) Queso Yogurt

Pipeta Pasteur Agar : Manitol salado Para su preparación:        Espátula Balanza analítica Luna de reloj Agua destilada Agitador Probeta graduada Matraz

IV. EXPERIMENTO

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Siga cada uno de los pasos como lo indica su Profesor, Técnico o Instructor. PREPARACION DEL MANITOL SALADO Permite el crecimiento de microorganismos Tolerante a la sal. Genero Staphylococcus aureus. LA SIEMBRA SE REALIZA POR ESTRÍA Se debe desinfectar previamente la zona de trabajo Se procede a someter al calor el asa de siembra hasta que este al rojo vivo, luego se dejara enfriar por breves segundos. Con ayuda del asa de siembra se tomara una pequeña muestra a sembrar. Se debe flamear el pico del tubo donde se va a depositar la sustancia a sembrar. De inmediato se introduce el asa de siembra con la muestra dentro del tubo, se debe introducir el asa primero al fondo, luego a la mitad y por última vez a la superficie donde se encuentre el caldo. Para el momento de la siembra el tubo debe estar ligeramente inclinado .Luego de alcanzar el limite deseado con el asa, es decir la parte de la mitad del tubo, se procederá a establecer la muestra la cual se esparcirá de forma pareja de abajo hacia arriba y luego se barrera de derecha a izquierda. Luego se retira el asa de siembra y se tapa el tuvo todo esto en presencia del calor dado por el mechero.

V.- RESULTADO

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Con esta tercera práctica hemos podido aprender y conocer:

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VI.- CONCLUSIONES

Hay que ser minuciosos en la composición de los caldos nutritivos porque el incorrecto uso de ellos puede llevar al fracaso de nuestra experiencia de manipular microorganismos. Hemos aprendido a reconocer un caldo a diferencia de un agar. El caldo es para muestras liquidas y el agar para muestras sólidas. Los medios químicamente definidos se preparan añadiendo al agua destilada cantidades purificados. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias. La mayoría de las bacterias se desarrolla en un medio de cultivo básico que contiene agua extracto de carne y pepsina. Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Hemos aprendido a reconocer y clasificar medios de cultivo por su origen animal, vegetal y mineral. precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente

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VII.- RECOMENDACIONES

No se puede meter las botellas en la jarra con las manos porque eso puede llevar a que se contamine el caldo nutritivo. Es obligatorio el uso del mandil en el laboratorio. Se requiere que la puerta del laboratorio este cerrada y que el ingreso al laboratorio sea restringido. Esta prohibido fumar y comer en el laboratorio. Lavarse las manos antes y después de realizar una experiencia en el laboratorio, pues se requiere la mayor limpieza posible al manipular los materiales y caldos de cultivos. Limpiar con alcohol la mesa en que se va a trabajar. Rotular los tubos de ensayo indicando las sustancias que contienen estos. La mesa del laboratorio debe estar libre para poder llevar acabo la practica. A la hora de vaciar el cultivo en los tubos de ensayo hay que hacerlo de una manera rápida, minuciosa y la tapa enroscada de dicho tubo debe estar la boca arriba sin contacto con el área de trabajo. No debemos acercar nuestra boca con los tubos de ensayo, ya que hay que recordar que hay que evitar todo contacto de contaminación.

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0Biblioteca de consulta Encarta 2004.

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