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CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CONSORCIOS BACTERIANOS CAPACES DE CRECER SOBRE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS Maria Luisa CASTREJÓN GODINEZ1, Enrique SÁNCHEZ

SALINAS2, Ma. Laura ORTIZ HERNÁNDEZ2 Facultad de Ciencias Biológicas y 2 Laboratorio de Investigaciones Ambientales. Centro de Investigación en Biotecnología. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Av. Universidad No 1001 col. Chamilpa, Cuernavaca Morelos, C.P 62209 Tel. (777) 329-7057. sanchez@buzon.uaem.mx, luicado@yahoo.com.mx Palabras claves: plaguicidas, bacterias, consorcios bacterianos, suelo RESUMEN Los plaguicidas aplicados constantemente a suelos agrícolas, los envases contenedores y los productos caducos, generan grandes cantidades de residuos líquidos y sólidos que contaminan suelos y cuerpos de agua, afectando a las cadenas tróficas y al hombre mismo. Ante esta situación, es importante generar alternativas para el tratamiento de residuos de estos xenobióticos y/o para la limpieza de sitios contaminados. La biodegradación con bacterias aisladas de sitios expuestos a estos xenobioticos, es una alternativa valiosa. Sin embargo, estas bacterias pueden ser patógenas, de ahí la importancia de identificarlas para utilizarlas de manera segura o bien emplear estrategias moleculares para su aprovechamiento en el tratamiento de residuos de plaguicidas o en la restauración de sitios contaminados. El consorcio bacteriano aislado de suelos agrícolas esta compuesto por 11 bacterias, seis con capacidad de crecer en presencia de Paratión metilico y cinco para cadusafos. Las especies identificadas son: Bacillus brevis, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Weeksella virosa, Flavobacterium odoratum, Burkholderia cepacia, Pseudomonas stutzeri. La cepa identificada como Bacillus brevis resultó con mayor capacidad de crecimiento en un medio mínimo con paratión metílico como única fuente de carbono y en medio líquido. Burkolderia cepacia es una bacteria con capacidad de crecer en medio liquido con cadusafos; se ha reportado para la recuperación de suelos contaminados con residuos tóxicos. Diferentes bacterias identificadas son patógenas, sin embargo pueden ser utilizadas en el tratamiento de residuos de paratión metílico y cadusafos y probablemente, de otros plaguicidas de la misma familia química, con el debido control o utilizando herramientas moleculares. INTRODUCCION La extraordinaria diversidad biológica de la tierra, no solo comprende a los animales, plantas, hongos y otros organismos macroscópicos, sino también a los millones de especies microscópicas, distribuidas en los hábitats más diversos que incluyen a suelos y aguas contaminados con xenobioticos. Debido al papel particular que juegan las
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dispuestos de manera inadecuada. incluyendo los vectores de enfermedades humanas o de los animales. Se estima que 4. rodenticidas. que son los más usados a nivel mundial. industrial y doméstico. arácnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos. Fue en 1940 cuando aparecieron en el mercado los primeros plaguicidas organoclorados que tienen su máximo exponente en el dicloro 2 . Posteriormente fueron los compuestos arsenicales los que se emplearon para el tratamiento de las plagas de insectos en la producción agrícola. herbicidas y fumigantes. La Organización de las Naciones Unidas para la alimentación (FAO 2002) define a un plaguicida como cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a prevenir. principalmente de la familia de los organofosforados. La era de los plaguicidas químicos comenzó en el siglo pasado cuando se desarrollaron los sulfuros y se les encontró una aplicación práctica como fungicidas. En ambos casos se trataba de sustancias de una elevada toxicidad. lo que limitó su empleo generalizado. 2001). son comercializados en todo el mundo anualmente (Klaasen 2001). Están incluidos insecticidas. las especies de plantas o animales indeseables que causan perjuicio o que interfieren de cualquier otra forma en la producción.5 billones de libras de plaguicidas.bacterias en los ecosistemas y su importancia en la vida del hombre. debido a que han sido el resultado de un proceso de evolución de poblaciones microbianas autóctonas que se han adaptado a estos contaminantes y porque proveen la posibilidad de ser usadas in situ en la detoxificacion de ambiente severamente contaminados. destruir o controlar cualquier plaga. Esto genera grandes cantidades de residuos y productos obsoletos. Por esta razón. La presencia de bacterias capaces de metabolizar compuestos organofosforados ha recibido una especial atención. defoliantes. productos agrícolas. elaboración. se han empezado a investigar sus patrones de diversidad y las factores que los regulan (Horner-Devine et al. Los estudios de diversidad microbiana en sitios con constantes aplicaciones de plaguicidas permiten la caracterización e identificación de especies bacterianas con un potencial de aplicación en procesos de biorremediación de sitios contaminados y/o el tratamiento de residuos caducos u obsoletos. o que pueden administrarse a los animales para combatir insectos. almacenamiento. agentes para reducir la densidad de fruta o agentes para evitar la caída prematura de la fruta. madera y productos de madera o alimentos para animales. El término incluye las sustancias destinadas a utilizarse como reguladoras del crecimiento de las plantas. MARCO TEORICO Definición de plaguicida. Cronología del desarrollo de los plaguicidas. transporte o comercialización de alimentos. de uso agrícola. desecantes. fungicidas. 2003). y las sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha para proteger el producto contra la deterioración durante el almacenamiento y transporte. estos sitios son los mas apropiados para el aislamiento de cepas capaces de crecer y en consecuencia de degradar estos xenobioticos (Ortiz-Hernández et al.

hay muchos hábitats donde.000 las sustancias químicas de nueva síntesis y los subproductos derivados de éstas producidos por la actividad humana. El empleo de agroquímicos en las actividades agropecuarias es una de las más grandes amenazas para la pérdida de la fertilidad de los suelos. El suelo contiene básicamente cinco grupos de microorganismos: bacterias. también lo es para el crecimiento de microorganismos. en algunos casos. algas y protozoarios. el suelo incluye además a los constituyentes orgánicos e inorgánicos propios de un determinado lugar (Alexander 1980). sino que llegan a través de los ríos hasta las zonas costeras afectando las especies marinas. no se encuentran organismos superiores. que impactan no sólo los suelos de las áreas en donde se aplican. Importancia de los plaguicidas. Se sustenta que es indudable el gran beneficio derivado del empleo de los plaguicidas en los programas de salud y en la lucha contra enfermedades transmitidas por vectores o con huéspedes intermediarios (Olea y Fernández 2001). se estiman en más de 120. 2001). las cosechas se han visto incrementadas significativamente y las pérdidas en la producción se han reducido de forma espectacular. Se ha manifestado frecuentemente que debido al empleo de plaguicidas. En el transcurso de los últimos 150 años el hombre ha fabricado muy diversos compuestos químicos con objeto de satisfacer las necesidades crecientes del desarrollo tecnológico y mejorar su calidad de vida. Los microorganismos del suelo.000 nuevos compuestos cada año (Olea y Fernández 2001). debido a las extremas condiciones físicas o químicas. herbicidas y fertilizantes. hongos. Efecto de los plaguicidas en el ambiente. sin embargo. incluso crecen mejor ahí. frecuentemente mediante prácticas inadecuadas. En la tabla 2 se muestra el número aproximado de organismos comúnmente encontrados en suelos. Desde entonces se han empleado tanto en los tratamientos agrícolas como en el control de plagas vehiculizadas por insectos portadores. Pero además. En la tabla 1 se muestra la distribución de los microorganismos en varios horizontes del suelo. Los hábitats naturales de los microorganismos son extremadamente diversos. La aplicación de plaguicidas genera conflictos sociales por el elevado número de trabajadores del campo intoxicados por estos productos. censo que se incrementa día a día y que parece no tener fin si se considera que se incorporan a la lista cerca de 2. constituye una de las formas de contaminación más importantes.difenil tricloroetano (DDT). la flora y la fauna (Lichtinger et al. actinomicetos. de su capacidad biodegradadora y otras funciones. en ellos pueden existir microorganismos que. Desde el inicio de la revolución industrial. así como también por la sospecha de efectos adversos sobre la salud de las comunidades vecinas. con un alto índice de mortalidad. Cualquier hábitat que sea adecuado para el crecimiento de organismos superiores. Como ecosistema. 3 .

4 ACTINOMICETOS 2.000. OBJETIVO GENERAL Caracterizar e identificar bacterias de consorcios bacterianos aislados de suelos agrícolas. con capacidad de crecimiento sobre plaguicidas organofosforados. 4 .800 1. Las bacterias llegan a necesitar micronutrimentos en concentraciones traza y algunos factores de crecimiento como aminoácidos.000 a 500. La mayoría de los microorganismos necesitan de diferentes factores para su óptimo crecimiento.800 472 10 1 BACTERIAS ANAEROBIAS 1. ya que se componen por más de un 80% de agua. 4. Por lo tanto.5.5 0.000 a 900. Distribución de microorganismos en diferentes profundidades de un perfil de suelo (Alexander 1980). La mayoría de las bacterias crecen de manera óptima.1 - Tabla 2. el cual es el oxígeno para el caso de las aerobias. 1997): 1.000/g 1.000. igual que todos los organismos. necesitan humedad para crecer. aunque hay excepciones.000 a 100. se enlistan continuación (Ortiz et al.950 379 98 1 0. Humedad del suelo: Los microorganismos.000/g 1.000 a 20. PROFUNDIDAD (cm) 3-8 20-25 35-40 65-75 135-145 BACTERIAS AEROBIAS 7.Tabla 1. que de acuerdo a varios autores.000.000/g 5.080 245 49 5 HONGOS 119 50 14 6 3 ALGAS 25 5 0.000/100g Requerimientos fisiológicos de los microorganismos degradadores. 3. Organismos Bacterias Actinomicetos Hongos filamentosos Algas Protozoarios Levaduras Nemátodos Número estimado 3. otros nutrimentos y un aceptor final de electrones. vitaminas u otras moléculas orgánicas. es importante mantener el contenido de humedad a un nivel adecuado.000 a 500.000 a 500. Nutrimentos y oxígeno: Las bacterias heterotróficas para crecer necesitan una fuente de carbono.000 a 20. Número aproximado de organismos comúnmente encontrados en suelos (Martínez 1997).000/g 5.000/g 1.000/g 1. 2. pH del suelo: La acidez o alcalinidad de una solución afecta el crecimiento de los microorganismos.000. es de 50 a 80%. Temperatura: La temperatura óptima para el crecimiento de las bacterias aisladas del suelo es entre 20 y 25°C. en un rango de 6.5 a 7.

Flavobacterium odoratu. utilizando tubos eppendorf con glicerol adicionado con cada plaguicida a una concentración final de 25 mg/L y conservados a una temperatura de -70ºC en un congelador REVCO (Yañez-Ocampo 1998). oxidasa. Yersinia pseudotuberculosis. motilidad y citrato de Simons (Koneman et al. fermentación de carbohidratos. Las diversas pruebas bioquímicas aplicadas. Pseudomonas stutzeri. Las colonias se incubaron durante 24 horas a 37ºC.60 y 100 mg/L de cadusafos como única fuente de carbono. Pseudomonas aeruginosa. Voges Proskauer. Fueron cultivadas en placas con agar de soya de tripticaseína (ATS) conteniendo 15 mg/L de paratión metilico y cadusafos (concentración final). Caracterización de los consorcios bacterianos. Stenotrophomonas maltophilia. Se tomaron aquellas que se lograron aislar para asegurar la pureza. consistencia. 25 y 40 mg/L de paratión metilico y 40. 1992). Proceso de selección y obtención de colonias puras (Ortiz-Hernández et al. Burkholderia cepacia. proporcionaron la información que permitió la identificación y el porcentaje de confiabilidad para cada cepa bacteriana (tabla 3).MATERIAL Y METODOS Los consorcios bacterianos previamente aislados de suelos agrícolas del estado Morelos (Sánchez-Salinas 2005) fueron empleados para la obtención de cepas puras. 5 . El procedimiento para la identificación fue realizado de acuerdo con Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology (Krieg y Holt 1984). bordes y superficie. Se realizaron cinéticas de crecimiento de los consorcios y fueron cultivaron en 30 mL de medio mineral a 10. tinción de Gram. Las colonias se eligieron en función de su morfología. Conservación de los consorcios. Weeksella virosa. Los consorcios bacterianos y las cepas puras se adicionaron a la colección bacteriana del Laboratorio de Investigaciones Ambientales. Indol. además del sistema de BBL Crystal. tamaño. Se cultivaron por un periodo de 120 horas. RESULTADOS Y DISCUSION De los consorcios seleccionados se aislaron 6 cepas puras para el consorcio bacteriano aislado en presencia de Paratión metílico (CB-SP) y 5 para el consorcio bacteriano aislado sobre medio con Cadusafos (CB-SC). El sistema de identificación bacteriana BBL-Crystal® fue empleado para la identificación bacteriana. 2002). 150 rpm y bajo ausencia de luz. este procedimiento fue repetido varias veces para asegurar el aislamiento de las colonias. a una temperatura de 25°C. adicionalmente se aplicaron diferentes pruebas bioquímicas como rojo de metilo. color. Las cepas fueron identificadas como: Bacillus brevis.

dermatitis. Su temperatura óptima para el crecimiento es 37ºC y crece a temperaturas de hasta 42ºC. son móviles por medio de un flagelo polar. Móvil mediante varios flagelos polares.67% Stenotrophomonas maltophilia 97. Es resistente a las altas concentraciones de sales y de tintes. plantas y residuos orgánicos (López et al. y aguas negras. 1991). Crawford (1975) informa que esta especie presenta una importante eficiencia en remoción de hidrocarburos.5 a 3. Lee et al. Es un bacilo gram-negativo versátil. Este género es típico de la familia Bacillaceae. Esta especie fue aislada a partir de suelos agrícolas con un amplio historial de aplicaciones de plaguicidas organofosforados. bacteremia.8% Stenotrophomonas maltophilia 99. (Schaumann 2003). B.9 µm x 1. y las infecciones gastrointestinales. agua embotellada. 2003). pozos. resultó ser la cepa con mayor capacidad de crecimiento en un medio mínimo con paratión metílico como única fuente de carbono. Stenotrophomonas maltophilia.Tabla 3.60. Es un patógeno oportunista causa infecciones de la zona urinaria. Anteriormente conocida como Pseudomonas maltophilia o Xantophomonas maltophilia. agua y polvo del aire.67% RM = Rojo de metilo. animales. etilbenzeno. y de muchos antibióticos 6 . B. lagos. aerobio. Las especies de Bacillus son de naturaleza ubicua y habitan en el suelo. habita en suelo y agua. se ha aislado principalmente de suelos. de agua y de alimentos.5-4 µm.19% Yersinia pseudotuberculosis 99. reportan a esta especie con capacidad para degradar tolueno. benceno. Algunas pueden ser parte de la flora intestinal normal del hombre y los animales (Krieg y Holt 1984). Gram = Tinción de gram. esto permite plantear su potencial en la degradación de residuos de plaguicidas. suelo. aerobio. pertenece a la familia pseudomonadaceae.8 µm por 1. Ac = Acido.99% Weeksella virosa 97. infecciones del sistema respiratorio.8% Alc-SC CB-SC5 + + Alc-SC + + Coco Pseudomonas stutzeri 87. alimentos. suelos y aguas contaminados con estos xenobioticos. brevis. Mot = Motilidad. mide 0. Clave CB-SP1 CB-SP2 CB-SP3 CB-SP4 CB-SP5 CB-SP6 CB-SC1 CB-SC2 CB-SC3 CB-SC4 RM V-P Gram + Indol Mot + + + + ++ Cat + + + + + + + + + + F-C Ac SC Alc-SC Alc-SC SC Alc-SC Alc-SC Alc-SC Alc-SC Ox + -(+) + + + CS + + +(-) + + + Forma Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Cocobacilo Bacilo Cocobacilo Coco Bacilo Bacilo Identificación (sistema BBL) Bacillus brevis 97% Stenotrophomonas maltophilia 98% Pseudomonas aeruginosa 97. V-P = Voges-Proskauer. brevis.0 µm. Características de las bacterias identificadas Bacillus brevis. F-C = Fermentación de carbohidratos.67% Flavobacterium odoratum 85% Burkholderia cepacia 75% Burkholderia cepacia 99. comprende más de 40 especies de bacilos aerobios y anaerobios facultativos grampositivos que producen endosporas y son generalmente cilíndricos o elipsoidales. La mayor parte de las especies producen catalasa (Grimont et al. CS = Citrato de simons. Este microorganismo produce antibióticos como la gramicidina y la tirotricina (Zinsser 2004). es un bacilo gram-negativo no fermentativo. de antisépticos débiles. Bacillus brevis mide 0. (2002). es un microorganismo ubicuo que ha sido aislado en numerosas fuentes de agua: ríos. Pseudomonas aeruginosa. Pruebas bioquímicas de las cepas aisladas.5 a 0. y xileno.

Éste es un ejemplo de las capacidades de biodegradación de este género (Korin 2004). de la pseudotuberculosis felina. Mide 0. pertenece a la familia Enterobacteriaceae. aeruginosa que tienen la capacidad de degradar alcanos y alquenos de cadena ramificada y que. La designación de pseudotuberculosis deriva de la característica histopatológica encontradas en nodos linfáticos mesentéricos. 1986). agua. Esta bacteria es capaz de utilizar una enorme variedad de compuestos orgánicos como sustrato para crecer. Las colonias son generalmente de color amarillo. Yersinia pseudotuberculosis se encuentra distribuida ampliamente en el ambiente (suelo. Se reporta como un nuevo género y una nueva especie. 1998). no presentan movilidad. El genero Yersinia incluye 11 especies. 1994). 7 .0 µm. Es la causante. Casi todas las especies de animales son vectores. es un cocobacilo gram negativo.5 µm x 1.0-2. aerobias. Aislada por primera vez en 1883 por Malasez y Vignal el organismo recibió distintos nombres hasta concluir en el genero Yersinia. Es un bacilo gram-negativo. en los gatos. Algunas especies del Flavobacterium son capaces de degradar el pentaclorofenol y otros compuestos similares. son útiles en la limpieza de sitios contaminados con estos compuestos o con metales pesados (Soberón-Chávez et al. Se encuentra en suelo. En relación taxonómica las flavobacterias son suficientemente similares al género Weeksella por lo que Botha et al. Weeksella virosa. Se han reportado cepas de P. Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia enterocolitica. 1990). oxidasa positiva. por tanto. vegetales. Yersinia Pseudotuberculosis es un cocobacilo gram negativo. producen olor a frutas. son aisladas de los especimenes clínicos humanos (Holmes et al. Además mencionan que Weeksella virosa presenta una semejanza con Bergeyella. Flavobacterium Odoratum. (Reina et al. Hasta el momento no se sabe donde clasificarla. debido a la semejaza que presenta con estas dos bacterias. (1989) sugieren la inclusión posible en este género. capacidad que le permite colonizar nichos en los que son escasos los nutrimentos que otros organismos pueden asimilar. plantas y materias del alimento. al ser examinadas por taxonomía numérica (Botha et al. Son no fermentadores. indol negativo.comúnmente usados (Zinsser 2004). en el hombre es la responsable de la peste bubónica. El contagio es por la ingestión de pequeñas aves y roedores que son portadores de la bacteria. es importante realizar experimentos de cinéticas de degradación de la cepa y de sus extractos enzimáticos. afín de confirmar su capacidad de transformación de los organofosforados y la posibilidad de continuar con otros trabajos con herramientas moleculares. etc) esta bacteria es el patógeno principal de animales salvajes y domésticos en todos los continentes. Es característico que reduzcan nitritos pero no nitratos. Aun cuando no hay reportes de su posible capacidad de degradación de xenobioticos y su patogenicidad. agua. tres de las cuales son potencialmente patógenas para humanos: Yersinia pestis. No se encontraron reportes acerca de su capacidad de crecer o degradar algún xenobiotico. enfermedad de pronóstico fatal en la que se producen lesiones piogranulomatosas generalizadas. Yersinia pseudotuberculosis. aerobio facultativo y presenta movilidad por flagelos peritricos. catalasa positiva.

Es un microorganismo con una extraordinaria variabilidad fenotípica y genotípica. Puede crecer en niveles bajos de hierro y degradar el tetracloruro de carbono a bióxido de carbono o a otros compuestos inertes (Dybas 1995). los hidrocarburos derivados del petróleo y otros compuestos halogenados (Fuenmayor y Rodríguez 1997. o bien utilizando herramientas moleculares como la clonación y la transformación. Chablain et al. crece a una temperatura optima de 37ºC. 8 .Burkolderia cepacia. Pseudomonas stutzeri. pyridine-2. CONCLUSIONES Se identificaron ocho especies bacterianas: Bacillus brevis. poseen una forma fusiforme con bordes ondulados irregulares y una superficie convexa. En medio sólido TS en un periodo de 24 horas a 28ºC se observan colonias grandes 4-6 mm de diámetro. Es un reconocido patógeno en pacientes portadores de fibrosis quística (FQ) y neutropénicos. Burkholderia cepacia se reporta para la biorecuperación de suelos contaminados con residuos tóxicos (Hillyard 2005). entendiendo a la genomovar como un estatus taxonómico provisional que agrupa a cepas genotípicamente similares dentro de una misma especie.2. Flavobacterium odoratu. 1999). Flavobacterium odoratu. Moller et al. Debido a esta enorme variabilidad genotípica la especie se subdivide en genomovares. Whyte et al. cepacia (antes denominadas Pseudomonas cepacia) es un bacilo Gram negativo no fermentador. En la actualidad se conocen 18 genomovares diferentes (Cladera et al. Descrito en 1950 como patógeno de plantas. multiresistente. Pseudomonas aeruginosa. Auto compiten con otras bacterias a un pH 8. Hubert et al. Para sobrevivir e incluso degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos como los plaguicidas. puede también crecer en antisépticos (Gil 2001). Stenotrophomonas maltophilia. distribuidas por todo el medio. 1999. Pseudomonas stutzeri. Son muy numerosas las publicaciones en las que se hace referencia a la capacidad de Pseudomonas sp. Secretan una biomolecula. 1998. Frateuria y Zooglea). Burkholderia cepacia. Kallastu et al. Pseudomonas stutzeri. Es una bacteria gram negativa. Stenotrophomonas maltophilia. Kumasi et al. Isken et al. Yersinia pseudotuberculosis.6-bis (thiocarboxylic acid) (PDTC). B. Lee y Kim 1997. Pertenece a la familia Pseudomonadaceae que incluye cuatro géneros diferentes (Pseudomonas. Bacillus brevis. presentan un color café claro y son opacas (Yañez-Ocampo 1998). Diferentes bacterias identificadas son reportadas como patógenas. Burkholderia cepacia. Esta especie se ubica dentro del género Pseudomonas. Xanthomonas. 1998. 1997. pueden ser utilizadas en el tratamiento de residuos de plaguicidas como el paratión metílico y cadusafos y probablemente de otros de la misma familia química. presenta motilidad. sin embargo con un manejo adecuado como el tratamiento de residuos en reactores. 1998. Pseudomonas aeruginosa. han sido reportadas por su capacidad de degradar diferentes xenobioticos. Ashok et al. 2005). 1998. especialmente encontrado en cebollas y ampliamente distribuido en el suelo. 1995. Bieszkiewics et al. Esta biomolécula es usada en transformaciones de tetracloruro de carbono a CO2 (Lewis 1999). presenta respiración aeróbica. Lebkowska et al. 1997. Weeksella virosa. 1995.

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