8.

Espectrofometra: Espectros de absorcin y cuantificacin colorimtrica de biomolculas

Nieves Abril Daz1, J. Antonio Brcena Ruiz1, Emilio Fernndez Reyes1, Aurora Galvn Cejudo1, Jess Jorrn Novo1, Jos Peinado Peinado1, Fermn Toribio Melndez-Valds1, Isaac Tnez Fiana2
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Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba, 2 Facultad de Medicina, Avda. Menndez Pidal s/n, 14004-Crdoba.

RESUMEN

La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. En esta prctica se darn a conocer las caractersticas generales y conceptos relacionados con la espectrofotometra. A continuacin y tras la explicacin del funcionamiento del espectrofotmetro se harn espectros de absorcin con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la mxima absorcin, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarn las concentraciones de distintas biomolculas. Palabras clave: Absorbancia; espectro; rectas de calibrado. transmitancia; colorimetra; cromforo;

Abreviaturas empleadas. A: Absorbancia; 4-AP: 4-Aminoantipirina; FMN: flavin mononucletido; FMNH2: forma reducida del flavin mononucletido; I: intensidad de luz; N-NEDA: N-Naftol-1-etilendiamino; p-NP: p-nitrofenol; POD: Peroxidasa; T: transmitancia; UV: luz ultravioleta. 1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la utilizacin de tcnicas analticas que permitan su determinacin cualitativa y cuantitativa, as como su caracterizacin fsico-qumica y biolgica. Uno de los mtodos ms sencillos, accesibles, tiles y utilizados es la espectroscopa, en general, y la espectroscopa ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomolculas en solucin y en muestras biolgicas, con el empleo

de reactivos especficos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas. El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las molculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UVvisible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas. Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energa) es absorbida por una molcula se origina un salto desde un estado energtico basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energa (estado excitado), E2. Y slo se absorber la energa que permita el salto al estado excitado. Cada molcula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de molculas. Como consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes de onda presenta una molcula -esto es, su espectro de absorcinconstituye una sea de identidad de la misma. Por ltimo, la molcula en forma excitada libera la energa absorbida hasta el estado energtico fundamental.
Figura 1. Diagrama de niveles de energa en una molcula. La absorcin de energa luminosa hace que la molcula pase desde un estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la molcula relaja su energa mediante distintos mecanismos (vibracin, rotacin, etc.)

E2 - E1 = h

En espectroscopa el trmino luz no slo se aplica a la forma visible de radiacin electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectofotometra de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
400 nm 700 nm

Longitud de onda (metros)

Luz visible

Rayos gama Frecuencia (hertz)

Rayos X

ultravioleta

infrarrojo

microondas

energa (electrn-voltios)

Figura 2. Espectro electromagntico

La regin UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una regin de energa muy alta. Provoca dao al ojo humano as como quemadura comn. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptdicos, sistemas aromticos, grupos carbonilos y otros heterotomos tienen su mxima absorbancia en la regin UV, por lo que sta es muy importante para la determinacin cualitativa y cuantitativa de compuestos orgnicos. Diversos factores -como pH, concentracin de sal y el disolvente- que alteran la carga de las molculas, provocan desplazamientos de los espectros UV. La fuente de radiacin ultravioleta es una lmpara de deuterio. En la regin visible apreciamos el color visible de una solucin y que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorcin es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solucin coloreada. La fuente de radiacin visible suele ser una lmpara de tungsteno y no proporciona suficiente energa por debajo de 320 nm. longitud de onda
aproximada 390 - 435 435 - 490 490 - 580 580 - 595 595 - 650 650 - 780 color de luz que se absorbe Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo color de luz que se refleja o ve Amarillo verdoso Amarillo Rojo Azul Azul verdoso Verde azulado

1.1.

Transmitancia y Absorbancia Io

Ia It

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico que absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (Ia) y dejar pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It

La transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidi sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100 La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa. La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0.

La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a travs de la solucin del cromforo y de la concentracin de ste. 1.2. Ley de Lambert-Beer Esta ley expresa la relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de longitud de onda fija) y concentracin de un cromforo en solucin: A = log I/Io = cl La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a su concentracin a mayor nmero de molculas mayor interaccin de la luz con ellas-; tambin depende de la distancia que recorre la luz por la solucin a igual concentracin, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra ms molculas se encontrar-; y por ltimo, depende de , una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de extincin- que es especfica de cada cromforo. Como A es adimensional, las dimensiones de dependen de las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de resultan ser M-1cm-1. Este coeficiente as expresado, en trminos de unidades de concentracin molar (o un submltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extincin molar (M). Cuando, por desconocerse el peso molecular del soluto, la concentracin de la disolucin se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo gL-1, las dimensiones de resultan ser distintas, por ejemplo g-1Lcm-1, y al coeficiente as expresado se denomina coeficiente de extincin especfico (s). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, vara con la concentracin, debido a fenmenos de dispersin de la luz, agregacin de molculas, cambios del medio, etc. 1.3. Instrumentacin para la medicin de absorbancias de la luz visible y ultravioleta: espectrofotmetro UV-visible La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en unos aparatos llamados espectrofotmetros. Aunque pueden variar en diseo, en especial con la incorporacin de ordenadores para el anlisis de datos, todos los espectrofotmetros constan, segn se indica en la figura, de: 1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno. 2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difraccin. 3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no transmite la radiacin UV. 4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en seales elctricas. 5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotmetros de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro caso se trabajar con los de un solo haz. Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuacin se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de sta.
OH

ESPECTROFOTMETRO

NO 2 p-Nitrofenol

Detector Muestra Rendija salida

Prisma dispersin Rendija entrada

Fuente luminosa

Compartimento muestra ON/OFF Ajuste 0% T

Ajuste de longitud de onda Ajuste de 100% T

1.4 Obtencin de un espectro de absorcin El espectro de absorcin es una representacin grfica que indica cantidad de luz absorbida () a diferentes valores de . A partir de una solucin diluida de un compuesto, cuya absorbancia mxima entra dentro del rango de medida del espectrofotmetro, se ver el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solucin de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorcin se obtendr el valor de al que el compuesto presenta la mayor absorbancia (max). Dicho se utilizar a la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. El espectro de absorcin de un cromforo depende, fundamentalmente, de la estructura qumica de la molcula.

Clorofila a

Absorcin de los pigmentos del cloroplasto

Clorofila b Carotenoides

Espectros de absorcin de tres pigmentos fotosintticos cloroplastdicos. Observar que un compuesto puede tener ms de un pico de absorcin (max).

Longitud de onda (nm) No obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los valores de max y M, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o molculas vecinas y la orientacin de los cromforos vecinos; y cada uno afecta de forma particular. Por ejemplo, variaciones originadas por cambios de pH son debidas al efecto de ste sobre la ionizacin del compuesto. A continuacin se muestran como ejemplo los espectros de absorcin de HNTS (un reactivo empleado para la determinacin de especies oxidantes) y comprobndose que por espectrotometra se puede seguir el efecto que ejercen el pH y los oxidantes.

Efecto del pH en la absorcin de HNTS. Espectros 1 y 2 en medio cido (mximo de absorcin a 370 nm); espectros 3 y 4 en medio bsico (mximo a 410 nm).

Desplazamiento del mximo de absorcin y descenso de absorbancia cuando el HNTS se incuba con H2O2 a distintos tiempos (0, 5, 10 y 15 minutos).

1.5 Curvas de calibrado

Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones de diferentes concentraciones del mismo, determinndose para cada una de ellas el valor de absorbancia a max. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentracin en el eje de ordenadas (eje de y). Se observar que, a bajas concentraciones, el aumento de concentracin se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la linealidad se pierde y se observa que la lnea se aplana, por lo que las medidas son poco fiables. La representacin de Lambert-Beer, A = cl, nos permitir calcular el valor del coeficiente de extincin molar, que corresponde a la pendiente de la recta. 1.6. Objetivos Espectos de absorcin Se van a realizar espectros de absorcin de distintas sustancias para determinar su max y comprobar que un cambio en la estructura de la molcula, por ejemplo su reduccin, supone una modificacin en su espectro. Ley de Lambert-Beer Se aplicar la ley de Lambert-Beer y tras hacer una recta de calibrado para dos sustancias, se calcular grficamente el valor de los correspondientes coeficientes de extincin molar. Determinaciones colorimtricas especficas de compuestos Se aplicarn reacciones especficas para la determinacin colorimtrica de sustancias. 2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO 2.1. Material de uso general Espectrofotmetro. Agitador de tubos de ensayo. Balanza. pHmetro. Tijeras 2.2. Material para cada grupo Gradillas con tubos de ensayo. Juego de pipetas (0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 y 25.0 ml). Prepipetas (dos juegos). Probetas (100 y 250 ml). Vasos de precipitado (100 y 500 ml).

Frasco lavador con agua destilada. Recipientes para muestras biolgicas de 50 ml. Papel de filtro. Papel de parafilm. Rotulador para vidrio. Pipetas Pasteur de plstico (cuatro). Guantes de latex. Cubetas de plstico para medir en el espectrofotmetro. 2.3. Reactivos Espectos de absorcin Solucin de p-nitrofenol 0,20 mM en agua destilada. Solucin de NaOH 0,50 N. Solucin de p-nitrofenol de concentracin desconocida. Solucin de flavn mononucletido (FMN) 0,25 M en agua destilada. Ditionito sdico. Determinacin colorimtrica de glucosa y nitrito mediante reacciones especficas Glucosa Glucosa oxidasa Peroxidasa Fenol 4 amino-antipirina Tampn fosfato Nitrito potsico Sulfanilamida Dicloruro de N-naftol-1-etilendiamino cido clorhdrico