Citometra de flujo

Bibliografa: Flow Cytometry: Principles and Applications Editado por Marion G. Macey, PhD. (captulos 1 y 11)

http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/

Para qu queremos contar y clasificar clulas? Un ejemplo: Infeccin por HIV

El virus se une a receptores de membrana (CD4) de ciertos linfocitos T (que son parte del sistema inmunolgico), se replica y finalmente los destruye. El nmero de estos linfocitos nos informa del estado inmunolgico del enfermo

Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?

Para clasificar y contar clulas especficas necesitamos: a. Diferenciar los linfocitos del resto de las clulas de la sangre b. Usar una sonda que se una especficamente a protenas de membrana nicas en las clulas de inters y que pueda ser observada con facilidad.

Anticuerpos o Inmunoglobulinas
Intervienen en la respuesta inmune de los organismos ante la presencia de un patgeno Se unen al antgeno y lo inactivan Esta unin ayuda a activar la respuesta inmune

regin a la que se une el antgeno La regin variable es la zona de reconocimiento del antgeno

Un ejemplo: anticuerpos en infecciones bacterianas

Unin antgeno-anticuerpo Ag + Ac Ag-Ac K= 104-1011 M-1 Fab

Fc

tambin puede haber unin al Fc pero con menor afinidad

5 clases de anticuerpos que se diferencian por la secuencia de aminocidos de la cadena pesada

Propiedades cadena pesada nmero de unidades % en sangre

IgM 5 10

IgD 1 <1

IgG 1 75

IgA 1 or 2 15

IgE 1 <1

Marcacin con anticuerpos

Los anticuerpos presentan alta afinidad y especificidad por un antigeno dado sondas muy especficas Directa Indirecta

Ac

Simple y rpida

se puede usar un Ac marcado para muchas marcaciones distintas se amplifica la respuesta (varios Ac secundarios se unen a uno primario)

Uso de anticuerpos para microscopa de fluorescencia

Figure 1 Primary rat hippocampus neurons. Immunofluorescence detection of primary neuronal cells stained with mouse anti-MAP2 antibody (green) and astrocytes stained with rabbit anti-GFAP antibody (red). Nuclei are stained with DAPI (blue)

Otras aplicaciones: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay )

Biochemistry. 5th edition. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L.

Aplicaciones de ELISA: Test de embarazo

Se detecta gonadotrofina corinica humana (hCT) producida en la placenta

Los anticuerpos pueden usarse para detectar protenas expecficas de clulas

Cmo las contamos y clasificamos rpidamente?

Citometra de flujo

Para qu queremos contar y clasificar clulas? Un ejemplo: Infeccin por HIV

El virus se une a receptores de membrana (CD4) de ciertos linfocitos T (que son parte del sistema inmunolgico), se replica y finalmente los destruye. El nmero de estos linfocitos nos informa del estado inmunolgico del enfermo

Objetivos de citometra:
1. Realizar medidas (de fluorescencia y dispersin de luz) sobre clulas individuales para clasificarlas. Las clulas se estudian individualmente pero se realizan los anlisis en una poblacin grande (104) de clulas 2. Separar distintas subpoblaciones de acuerdo a sus propiedades

Citometra de flujo
Surge a mediados de la dcada del 70 Resulta de avances en: Microscopa Tinciones citoqumicas Tinciones fluorescentes (1880) Anticuerpos conjugados (1950) Anticuerpos monoclonales (1975) Electrnica Fotomultiplicador (1945) Computacin

Esquema general de un citmetro de flujo

ptica para la separacin de seales

celda de flujo

detectores fuente de excitacin

La celda de flujo
Sample Sheath

Flow chamber

Laser optics

Laser Beam

Se estudian 5000- 50000 clulas/s

El punto de interrogacin

laser

Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?

Podemos reconocer los linfocitos por sus propiedades nicas de tamao y granulosidad

Qu seales colectamos? Dispersin de luz: Forward scattering

Se mide la dispersin de luz para ngulos entre 0.510 (proporcional a r2)

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Qu seales colectamos? Dispersin de luz: Side scattering

La dispersin va a depender del contenido de la clula: granulosidad o complejidad

http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/

Representacin de los datos: Histogramas y dot plots

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Este tipo de representacin simplifica la deteccin de poblaciones celulares

separamos los linfocitos!

Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?

Se pueden utilizar anticuerpos para reconocer ciertas protenas de membrana caractersticas de tipos especficos de linfocitos

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Esquema general de un citmetro de flujo

ptica para la separacin de seales

celda de flujo

detectores fuente de excitacin

Adems de la informacin de dispersin de luz colectamos la fluorescencia de cada clula Podemos seleccionar una poblacin y analizar la distribucin de fluorescencia de esa poblacin

analizamos nicamente la distribucin de fluorescencia de los linfocitos

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Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?: tenemos que saber 1. cuales son linfocitos T? 2. cuales de estos linfocitos son CD4+?
CD3= marcador de linfocitos T: anticuerpos anti CD3 linfocitos T

Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?: tenemos que saber 1. cuales son linfocitos T? 2. cuales de estos linfocitos son CD4+? Anticuerpos anti CD4 que emitan a otra

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Controles y calibraciones
1. Coeficiente de variacin (CV): el ruido experimental se determina con microesferas de tamao uniforme CV = (SD/promedio) 100
SD= desvo standard de la distribucin

2. Control de isotipo: se necesita conocer la unin inespecfica del anticuerpo. Se usa anticuerpo de igual Fc y distinto Fab

Controles y calibraciones
3. Compensacin La emisin de fluorescencia de una (o varias) de las sondas se ve en ms de 1 detector

s1 =fa,1.sa+(1-fb,2).sb s2 =(1-fa,1).sa +fb,2.sb

1 y 2 = nmero de detectores a y b = sondas fluorescentes

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Cell sorting: separacin y clasificacin de clulas

Objetivo: separar una poblacin celular en una muestra compleja para estudiarla posteriormente

deflection plates

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