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CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

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4. SIEMBRA Y AISLAMIENTO MÉTODOS DE RECUENTO

DE

MICROORGANISMOS.

4.1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Para trasladar microorganismos de un medio de cultivo a otro se utilizan micropipetas, pipetas graduadas, asas de siembra y asas de siembra calibradas. a. El asa de Kolle consta de un mango aislante y de un filamento de platino o de niquelcromo (nicrom) recto o acabado en un anillo. Esta asa se esteriliza por incineración a la llama del mechero, dejándola enfriar sin que toque ninguna superficie antes de la siembra. Las asas calibradas sirven para trasladar alícuotas de un volumen pequeño de muestra (p.ej. 0,01 ml o 0,001 ml). El hilo de siembra (asa de picadura) se emplea para sembrar por picadura en el fondo de un tubo conteniendo agar, el asa redondeada (asa de Kolle) para sembrar por estría o en medios líquidos. b. Asa Digralsky, son varillas de vidrio con una rama horizontal. c. Las pipetas graduadas se utilizan para trasladar alícuotas de determinados volúmenes de muestra (0,1-100 ml). Pueden ser de vidrio o de plástico. d. Las micropipetas constan de un mango y de una punta. Las puntas son de PVC de diferentes medidas y colores dependiendo del volumen de muestra; se esterilizan en el autoclave.

Nunca dejar material contaminado sobre la mesa del laboratorio
(asas de siembra, tapones de cualquier tipo) TÉCNICA DE SIEMBRA Se toma el tubo o erlenmeyer que contiene el inóculo con la mano izquierda (fig. 4.1) y con los 4º y 5º dedos de la mano derecha se estira o desenrosca el tapón. Con los dedos 1º y 2º se coge el material para trasladar la muestra (asa de Kolle, pipeta...) antes de quitar el tapón.

Fig. 4.1 Es muy importante flamear al mechero la boca de los tubos o erlenmeyers y el extremo de las pipetas antes de inocular las muestras. Las asas de Digralsky sirven para extender homogéneamente una alícuota sembrada sobre un medio sólido. Para esterilizarlas, se sumergen en un recipiente con alcohol y se pasan por la

Concentración del inóculo En las placas de Petri dichas anotaciones se realizan de forma circular en el borde de la tapa. Se basa en repartir homogéneamente. con el asa de Kolle. Se basa en arrastrar. Para siembra en estría. Tipo de análisis 3. Hacer una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores de manera que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior. B) Siembra por superficie o en masa Es un método cuantitativo de aislamiento y recuento de las bacterias presentes en una muestra problema. Fig. Para siembra escocesa. o ml. La última serie de estrías no se ha de superponer con la primera. Este método no permite saber el número de microorganismos por gr. El objetivo es conseguir colonias aisladas. Código de identificación 2. se espera un tiempo hasta que se enfríe al lado de la llama. . un número cada vez menor de microorganismos sobre un medio sólido en placa de Petri. de la muestra. Incubar en posición invertida para que las gotas de agua de condensación no se depositen encima de las colonias.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 30 llama de un mechero. a la Tª adecuada. Esterilizar el asa de siembra. Tomar una alícuota del cultivo (líquido o sólido) con el asa de siembra. 2. 4.poner el asa suavemente sobre el agar. 6.48 h.2) 5. 7. haciendo un zig-zag hasta que se agote el inóculo. Incubar 24 . Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar al lado del mechero. 8. sin que toque ninguna superficie. Si la siembra ha sido correcta. 4. 3.1. Siembra escocesa. alícuotas de la muestra por toda la superficie del medio de cultivo. 4. Los tubos y placas deben marcarse con rotulador de vidrio: 1.4. hacer una serie de estrías paralelas y no superpuestas hasta que se agote el asa (fig. Antes de sembrar.1 SIEMBRA EN PLACA A) Siembra en estría o por agotamiento. los microorganismos quedarán aislados en las últimas estrías y se podrán observar colonias aisladas.2 Metodología 1. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso una o dos veces más.

48 h. Incubar durante 24 .1. B. Esterilizar el asa Digralsky.48 h. Asa Digralsky Procedimiento: 1. Incubar durante 24 .1 ml.2. a la temperatura indicada. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas.48 h.2 SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO a) Siembra por estría Es el método utilizado para el mantenimiento de cultivos puros y para determinar algunas características fisiológicas de los microorganismos. Siembra homogénea en superficie. Efectuar el recuento de las colonias sobre la superficie del medio (microorganismos aerobios). para mezclar el medio y la alícuota. 2. 5. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. Homogeneizar las placas con suavidad. 8. 5. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (aerobios y anaerobios facultativos). Tras solidificar añadir una nueva capa del mismo medio de cultivo (aproximadamente 10 ml por placa). 5. Añadir 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. 2. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa . Añadir entre 15-20 ml. 7. 4. del agar nutritivo en forma líquida atemperado a 45-47 ºC. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. a la temperatura indicada. Incubar las placas invertidas.3 . 6. para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. Añadir 15-20 ml de agar nutritivo líquido a 45-47 ºC. 6. 6. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas. Esperar unos 10 minutos hasta que solidifique. 3.1. 4. de la muestra o de las diluciones correspondientes en placas de Petri con agar nutritivo. Repartir el inóculo por toda la superficie con movimientos de rotación hasta que el líquido quede totalmente absorbido. 3. 4. Procedimiento: 1. 3. 4. para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. 4. B. Agitar suavemente deslizando la placa de Petri encima de la mesa.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 31 B. fig. 9. 2. Siembra en doble capa Procedimiento: 1. a la temperatura indicada. en un movimiento en forma de ocho por espacio de dos minutos. Añadir 0. Siembra en profundidad ("pouring"). A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (microorganismos anaerobios). Dejar solidificar el agar.3. No es necesario homogeneizar. Sembrar 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. Incubar durante 24 .

4. Flamear el tubo y ponerle el tapón.1. Se basa en inocular. densidad bacteriana o magnitud proporcional (concentración. Cargar el asa con el cultivo que se quiere transferir. mediante el asa de Kolle. 5. Introducir el asa de Kolle cargada con el inóculo dentro del medio y agitarla para que las bacterias queden resuspendidas. El medio se inocula introduciendo verticalmente en el centro del tubo. Homogeneizar la suspensión. 4. Fig. masa microbiana procedente de un cultivo (sólido o líquido) a un medio líquido. absorbancia) . masa celular 3.3. 3. un alambre largo y recto. nº de células 2. 6. Procedimiento: 1. 4.2. 4.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 32 b) Siembra en picadura Es un método utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos. MÉTODOS DE RECUENTO MICROBIANOS Determinación de: 1. Abrir el tubo con el medio de cultivo estéril y flamear la boca. Esterilizar el asa. Los tubos o frascos con el medio de agar se dejan solidificar en posición vertical o inclinada.3 SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO Medio utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos o para la obtención de cultivos. 2. Esterilizar el asa de Kolle. 7.3 fig. 4. cargado con el inóculo. Incubar a la temperatura adecuada.

Métodos indirectos: 1. Determinación de nitrógeno o carbono. Magnitudes metabólicas (captación de O2. Masa húmeda (por centrifugación) II. a. Esta técnica de recuento nos permite conocer el número de microorganismos viables en una determinada muestra. Filtros de membrana Métodos de determinación masa bacteriana: a. La siembra en profundidad ("pouring"). se utiliza principalmente para el recuento de hongos y en análisis de microorganismos mesófilos aerobios totales en aguas y alimentos. c.) 4. por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos. Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un número muy elevado de microorganismos. d. Permite tomar las colonias para su resiembra en otro medio o para su posterior identificación. ácido). b. titulaciones volumétricas. Métodos directos: 1. La viabilidad en Microbiología se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio sólido formando una colonia. Banco dilucionesi.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 33 Métodos de determinación nº células: a. Masa seca (centrifugación y secado) 1.. que posteriormente se siembran en placas con medio de cultivo.. Para la medida se pueden emplear métodos electroquímicos. producción de CO2. 2. Centrifugación: I. .1 RECUENTO VIABLES . Para ello se realizan diluciones seriadas. nº de células viables (banco de diluciones) Cámara de recuento Método Breed Contador electrónico (se basa en la pérdida de conductividad de un electrolito cuando pasa una célula bacteriana a través de un orificio estrecho) e. Turbidimetría / Nefelometría. La siembra en placa en superficie es idónea para aerobios.2..

gr. marcado como dilución 10-1 (-1). 7. 6. así no se deja de contar ninguna. 2. 4. 4. 10-2. ino ´culo . Para realizar un recuento correcto. Hay que contar las colonias a contraluz. (-3). que se depositara en el tubo de Ringer (-2).10-6 (1). 5. Rotular los tubos de Ringer con el factor de dilución: 10-1. Colocar 9 ml de solución Ringer en cada uno de ellos. Sembrar en placas de agar a partir de las diversas diluciones. A medida que se van contando se marcan con un rotulador. Tomar 1 ml de la muestra problema con la pipeta y depositarlo en un tubo de Ringer con 9 ml de Ringer. Se agita bien el tubo (-1 ) y se toma 1 ml. etc.300 colonias. = nº colonias · 1 1 dilucio ´n vol. (-2). Repetir la operación con las sucesivas diluciones. Agitar la muestra inicial para homogeneizarla. ni se cuentan dos veces.10-3.10-4. Incubar. las colonias deben estar aisladas. En caso de encontrarse superpuestas. que se multiplica por la inversa de la dilución y por la inversa del volumen del inóculo sembrado en las placas. se cuentan las colonias de las placas que contienen entre 30 . 3. se calcula la media aritmética.4 Procedimiento 1. 10-5. Lectura y recuento. esta placa no es válida para efectuar el recuento. Para obtener el número de organismos por unidad de peso o volumen de la muestra analizada.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 34 Fig. ufc/ml. Esterilizar los tubos Ringer.

Dar la vuelta al porta y observamos una superficie bien delimitada de 1 cm2. Para obtener el nº de células/ml de la muestra problema. Utilizando un objetivo de inmersión se inspeccionan los campos microscópicos y se calcula el valor medio del número de bacterias que hay en cada campo. hay que aplicar la fórmula siguiente: (N) núm. campos totales en cm2 = 1 r 2 (determinar "r" con cámara de recuento) . = ´lulas/campo ) x nu (media ce ´m . secar y observar al microscopio con objetivo de 40-60 aumentos). células/ml.25 26 .12 13 .4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 35 4. 6. Colocar en la superficie y extender en los límites del cuadrado 1 gota de micropipeta (16 l) de inóculo. se puede aplicar la siguiente tabla. lavar con agua del grifo. 5.50 51 . Dibujar en él un cuadrado de 1 cm por lado.3 4 . En el método Breed se extiende una muestra sobre un recuadro de un centímetro marcado sobre el porta y se tiñe.2. 4. Cubrir la extensión con azul de metileno durante 1 min. Procedimiento 1. Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente. 3.100 > 100 Número de campos que se han de contar 64 32 16 8 4 2 1 Si la distribución no es homogénea se ha de contar un mínimo de 10 campos y en total como mínimo 300 células. Si las células están homogéneamente repartidas.6 7 . Número de bacterias / campo 0 . de manera que el número de campos es más grande cuanto más bajo es el de microorganismos. A continuación contar el número de microorganismos en varios campos. Desengrasar con cuidado un portaobjetos. campos totales en 1 cm 2 volumen (ml) núm. 2.2 RECUENTO DIRECTO A) MÉTODO BREED Por la técnica de método directo se coloca un volumen conocido de una suspensión bacteriana sobre un área conocida del portaobjetos.

1 Técnica de llenado de cámara de recuento: Tomar el inóculo con una pipeta Pasteur y acercarla al borde del cubre permitiendo que entre la muestra por capilaridad a la cámara de recuento. Las bacterias móviles son difíciles de contar por este método y como pasa con otros métodos microscópicos. de unos 10 millones de bacterias por ml. . Además se requiere una concentración bastante alta de bacterias. Observar con objetivo x60 aumentos. las células muertas son demasiado similares a las vivas que se quieren contar. La cavidad se llena1 con la suspensión bacteriana. La principal ventaja es que no se necesita ningún tiempo de incubación.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 36 B) CAMARA DE RECUENTO Para los recuentos microscópicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseñado llamado Cámara de Petroff-Hausser. Una cavidad de volumen conocido está excavado en la superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un área conocida. Se calcula la media del nº de bacterias de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que proporciona el recuento por mililitro. Su uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal.

la acumulación de sustancias tóxicas. debe adaptarse primero a las nuevas condiciones de crecimiento: síntesis de RNA (aumenta entre 8-12 veces). Estas variaciones dependen de factores como el agotamiento de nutrientes. pH. ribosomas y enzimas. Este periodo se llama fase de latencia y puede durar desde una hora a varios días. Edad cultivo b. Si se representan gráficamente estas variaciones en función del tiempo.). etc. etc.3 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS. Depende de factores como: a. Fase de latencia Periodo de tiempo entre inoculación y la tasa de crecimiento máxima. La velocidad de multiplicación varía de una especie a otra y depende de las condiciones de cultivo (nutrientes. El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo el incremento del número de células. Para unas condiciones determinadas. el crecimiento no es uniforme sino que varía a lo largo del tiempo. particularmente de síntesis enzimática. obtenemos una curva en la cual se diferencian cuatro periodos diferentes: 1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 37 4. Si el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria. Pero en este tiempo las células no se encuentran inactivas. Medio de cultivo Durante algún tiempo hay poco o ningún cambio en el número de células debido a que no se reproducen inmediatamente en medio nuevo. . temperatura. o si ha cambiado de medio de cultivo. La población microbiana presenta una intensa actividad metabólica.

Nitrosomas y Nitrobacter 5-10 h. . preparándose para la reproducción. Bacterias del suelo 60-150' .4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 38 Cerca del final de la fase de latencia algunas células doblarán o triplicarán su tamaño. aireación. Pero esto no ocurre. Como el tiempo de duplicación es constante la representación logarítmica del crecimiento durante esta fase exponencial es una linea recta. Enterobacterias 15-30'. Finalmente la velocidad del crecimiento disminuye el número de células muertas compensa al de células vivas y la población se estabiliza. densidad. Este periodo se llama fase estacionaria. La reproducción celular adquiere una actividad máxima durante este periodo y el tiempo de generación llega a un mínimo constante. Fase estacionaria Si el crecimiento exponencial continua sin control da lugar a un número de células asombrosamente altos. Las actividades metabólicas de las células supervivientes también se hacen más lentas en esta fase. los microorganismos son mas sensibles de lo normal a las condiciones adversas. etc) o capacidad de usar diversos sustratos nutritivos. El tamaño celular y el contenido en proteínas es constante en la fase logarítmica (células estándar).. Existe aparentemente un tiempo de generación mínimo característico determinado genéticamente en cada especie (TD). Durante esta fase logarítmica las células empiezan a mostrar sus características visibles: Morfología.. Fase logarítmica Finalmente las células empiezan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento exponencial. temperatura. Fase idónea para estudiar influencia de factores ambientales (pH. Por otra parte durante la fase logarítmica del crecimiento. Es también cuando son metabólicamente activas. color. Ello implica la fiabilidad de las técnicas de medición indirecta.

Penicilina). Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Idiofase: Fase de producción Aunque las células no crezcan durante la idiofase. Se acumulan productos de degradación tóxicos par las células y se agotan ciertos nutrientes esenciales. Disminución de presión parcial de O2. También tienen lugar variaciones del pH y de temperatura. . Causas poco conocidas en general. Debido a que las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayoría de métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas. utilizar materiales de reserva b.coli. las células puede aún: a. Fase de muerte Normalmente el número de células muertas supera al de células formadas y la población entra en la fase de muerte o fase de descenso logarítmico. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de muestra o en un gramo de material sólido. En Biotecnología: a. otros la masa total de la población.ej. sintetizar enzimas En muchos procesos microbianos la fase estacionaria es la fase de producción de un metabolitosecundario (p. Trofofase: Fase de nutrición o crecimiento b. se añaden sustratos que actúan como precursores del producto objeto de la producción.1 MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO.3. descomponer parte de los ribosomas c. después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. En fase estacionaria sólo las células muy sensibles mueren rápidamente. lactobacilos) autolisis (por la acción de los propios enzimas) 4. que es frecuentemente proporcional al número de células. cámara de recuento). Algunas debido a: producción de ácidos (e. Algunos métodos miden el número de células (Breed.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 39 Las razones del cese del crecimiento exponencial son siempre claras.

La turbidimetría mide la cantidad de luz transmitida por la suspensión. ESPECTROFOTÓMETRO El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. y entre 10 . siendo inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. dentro de un rango.20 millones por ml. . absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. Para que sean visibles las primeras trazas de turbidez es necesario mas de un millón de células por ml. Por tanto la turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias. ya que. Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica. Tamaño y peso molecular de las partículas Longitud de onda de la luz incidente Longitud detector-cubeta Concentración partículas Si las lecturas de absorbancia se comparan con el recuento en placa del mismo cultivo esta correlación se puede utilizar en estimaciones futuras del número de bacterias hechas directamente por turbidimetría. Por este procedimiento se puede estimar el número de bacterias en el cultivo. la luz absorbida por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 40 A) TURBIDIMETRÍA En algunos tipos de trabajos experimentales.. 3. para que la sustancia sea suficientemente turbia como para ser medida por un espectrofotómetro. 4. 2. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. la medida de la turbidez (turbidimetría) es un método muy práctico para seguir el crecimiento bacteriano. La dispersión depende de: 1.

b. (A = a·b·c). Seleccionar la longitud de onda adecuada. Fases de utilización (con aparato calibrado) 1. para estabilizar componentes eléctricos y fuente de luz. sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia). Conectar el aparato 15 m. el crecimiento bacteriano no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia). siendo: A = absorbancia b = longitud del paso de la luz en cm. Absorbancia = 2 . a = coeficiente de absorción c = concentración del absorbente . Luz monocromática ( única). antes. 3. 2. Establece la relación entre el grado de absorbancia de una disolución y otras dos variables: La concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz recorre a través de la solución. ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión (Ley de Beer2) La relación entre Transmitancia (T) y Absorbancia (A) se expresa matemáticamente por: Io -----> 7 -------> I s T= Is I0 %T= Para %T = 0 Is I0 · 100 => Absorbancia = ∞ Para %T = 100 => Absorbancia = 0.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 41 En general. Según esta ley la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz. Recipiente donde se coloca la muestra (l = 1 cm en general) Detector. Filtros de vidrios coloreados que absorben las radiaciones no deseadas. Prismas o redes de difracción (espectro fotómetro) Cubeta.log % de Transmitancia Fuente de luz. Se obtiene seleccionando una onda de una fuente de luz policromática. Convierte la energía luminosa que recibe en energía eléctrica. Sistema de registro Convierte señales eléctricas del detector en señales registradas de lectura. Ajustar la absorbancia a 0 con el blanco (medio de cultivo empleado) 2 Ley de Beer. La selección se realiza mediante: a.

se reconocerán únicamente. La pendiente de dicha recta refleja la velocidad del crecimiento celular. si aplicamos logaritmos log N = log No + n·log 2 y n= log N−log N 0 log 2 La tasa de crecimiento (v = número de divisiones celulares/hora) será: v= n t = log N−log N 0 (t−t 0 )$log 2 El tiempo necesario para un ciclo de división es el tiempo de generación: g= t n = 1 v En la representación gráfica del crecimiento bacteriano. Siendo N = No ·2n . Si se ha partido inicialmente de 1 célula.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 42 CURVA DE CRECIMIENTO Suponiendo que un cultivo bacteriano crece a razón de una división cada 20 min. El crecimiento exponencial se caracteriza por una relación lineal entre el tiempo y el logaritmo del número de células. porque según que escala escojamos . celulares 0 1 20 0 20 2 21 1 40 4 22 2 60 8 23 3 80 16 24 4 100 32 25 5 120 64 26 6 140 128 27 7 160 256 28 8 180 512 29 9 200 1. En este tipo de representación se obtiene una recta. o bien las últimas. Dicha curva no es apropiada para expresar un número grande de divisiones celulares.048 211 11 240 4.024 210 10 220 2. tendríamos: Tiempo en min. Por ello se prefiere la representación semilogarítmica. en la cual se coloca en ordenadas el logaritmo del número de células. Nº de bacterias (N) N = 2n n = nº divis. se habla por tanto de crecimiento logarítmico.096 212 12 Se produce un crecimiento exponencial. . se obtiene una curva exponencial. o bien las primeras divisiones.

5 0 0 50 100 150 200 250 300 tiempos (min) Tiempo de duplicación.5 Absorbancias 1 Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en el tramo: 60' .356 1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 43 Cálculo del Tiempo de duplicación (Td) y la Tasa específica de crecimiento () En los cálculos se toma como base la densidad bacteriana (x) o alguna magnitud proporcional a ella (número de células. absorción).104 0. Tiempo 0 30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240' 2 Absorbancia 0.750 1.587 0.852 1.Coli. La tasa de crecimiento (pendiente de la recta) El tiempo de duplicación es td = ln 2  = ln x t −ln x o (t−t o ) ================================================================== Ejercicio: Cálculo de los parámetros (Td) y () Microorganismo utilizado Escherichia coli Medio de cultivo utilizado TSB Longitud de onda 540 nm Anota en la tabla siguiente los resultados obtenidos: Se utilizará como datos de cálculo.360 0. Td (min) Tasa específica de crecimiento (h-1) .850 1. 0.990 1.180 0. las absorciones siguientes medidas en un espectrofotómetro de un cultivo de E.150' (fase exponencial del crecimiento).

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 44 TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en placa) TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en tubo) .

Tomar del agar nutritivo una colonia del tipo "A" obtenida en el protocolo nº 4. 2. Conkey. Cuestionarios. en agar Mc Conkey. Sabouraud 8. Consultar la composición y características de los medios de cultivo que se emplean en esta práctica e indicar que función cumplirá cada uno de ellos. de cada una de las diluciones con asa Digralsky en placas con agar nutritivo (G1: -1.F. Distribuir los medios. Evitar que se superpongan las estrías. Preparar 2 placas (xG) de agar nutritivo Preparar 4 tubos con 9 ml. G2: -2. 15. . Preparar un banco de diluciones decimales (-1. Proceder de igual manera con las colonias del tipo "B" . Obtener conclusiones. Sabouraud. Levine. Proseguir con el procedimiento B. -2. -4).1) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Muestra problema: Disolución ringer . 6. Describe las morfologías coloniales observadas (A. 6. 2. 13. 8. 4.1 ml..C.Sabouraud a 27 ºC) 9. -4) con la muestra disponible. Escherichia coli. 10. Incubar 48 h.). . -3.. 3. Efectuar lectura de los resultados obtenidos.. Staphylococcus epidermidis. Sembrar Saccharomyces cerevisiae en un sector del A./mL en la muestra con los resultados obtenidos. de dº Ringer 3. G:2 Sabouraud CAF. 12. Repetir la operación con los agares Manitol Salt. C. Sabouraud 1 sector más) 4. Marcar placas Petri. Sembrar en superficie 0.. Realizar el cálculo del nº de U. B. -3. 7. Hacer un esquema con la metodología seguida. ( A. "C". . Hacer un esquema del banco de diluciones y de las siembras que has realizado. a 37 ºC. Observar los resultados obtenidos. 5. A partir de una colonia que haya dado positivo en el Agar Mc. 9. Esterilizar. Enfriar. 10. Incubar 24-48 h a 37 ºC. Manitol Salt. resembrar en siembra escocesa en medio agar Levine (xG).4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 45 PRÁCTICA 4. En otra placa de Agar Levine realizar una siembra escocesa a partir de un cultivo puro de Enterobacter cloacae. B) Aislamiento por agotamiento en placa 1. 11. 7. completando los cuadros correspondientes. en uno de los sectores. A) Aislamiento por dilución 1.1 y sembrarla en estría por agotamiento. Preparar y esterilizar los medios sólidos: Mc Conkey. Rotular en la parte posterior de cada placa (excepto Levine). 3. 14..(A. 5. tantos sectores como microorganismos se tengan que sembrar. Completar la tablas de observaciones. Incubar las placas en la estufa de cultivos a 37 ºC durante 48 h.

Resuspender 2 g de levadura en 100 ml de solución salina. en 25 ml de agua destilada. 2. 8. Calcular la tasa de crecimiento v (número de dividiones celulares por día) y el tiempo de generación g (en horas). 4. A)Crecimiento población Saccharomyces cerevisiae. 3. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 ml) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación. y añadir 1. 7. 5. colocando en el eje de abscisas los valores del tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.. Hacer un recuento de levaduras en cada sesión de prácticas. Incubar a 22 ºC durante 7 días. preparar una de solución de 25 ml de vino blanco (sin tratar). Incubar el matraz en la estufa de cultivos a 37 ºC. 1. Preparar un tubo inclinado con agar nutritivo. En 1 erlenmeyer de 100 ml. .. Turbidimetría. En dos tubos de ensayo con S. Inóculo. preparar diluciones decimales -1. 4. Dibujar una curva de crecimiento.. colocar 50 ml de solución nutritiva. Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en fase exponencial del crecimiento. Tomar 1 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 100 ml de TSB estéril. 7.y 180 minutos (longitud de onda aconsejada: 540 nm). Ajustar el espectrofotómetro a 0 % de absorbancia con un tubo de TSB estéril antes de cada medida (blanco). 60. Disolución nutritiva: En un frasco de 250 ml. b. del inóculo.2 Crecimiento población microorganismos.2 g de azúcar. Cámara de recuento. a 37 ºC 3. con los datos obtenidos. Agitar suavemente el cultivo con periodicidad 6. Turbidimetría... Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos: 0. coli. 30. Añadir solución salina estéril al tubo inclinado de E. -2. 1. Método Breed. mediante: a.S. 5. Cálculo parámetros (v) y (g). Incubar 48 h. en papel milimétrico. Sembrar en estría un inóculo de E. con agitación 200 rpm (si disponible) 6. Sembrar 1 ml de inóculo de la dilucion (-2). B) Curva crecimiento Escherichia coli. 2.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 46 PRACTICA 4.