P. 1
4. Siembra y Aislamiento de Microorganismos, Recuento

4. Siembra y Aislamiento de Microorganismos, Recuento

|Views: 96|Likes:
Publicado porGlicet P. Pineda

More info:

Published by: Glicet P. Pineda on Sep 11, 2013
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

04/21/2014

pdf

text

original

4

CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

29

4. SIEMBRA Y AISLAMIENTO MÉTODOS DE RECUENTO

DE

MICROORGANISMOS.

4.1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Para trasladar microorganismos de un medio de cultivo a otro se utilizan micropipetas, pipetas graduadas, asas de siembra y asas de siembra calibradas. a. El asa de Kolle consta de un mango aislante y de un filamento de platino o de niquelcromo (nicrom) recto o acabado en un anillo. Esta asa se esteriliza por incineración a la llama del mechero, dejándola enfriar sin que toque ninguna superficie antes de la siembra. Las asas calibradas sirven para trasladar alícuotas de un volumen pequeño de muestra (p.ej. 0,01 ml o 0,001 ml). El hilo de siembra (asa de picadura) se emplea para sembrar por picadura en el fondo de un tubo conteniendo agar, el asa redondeada (asa de Kolle) para sembrar por estría o en medios líquidos. b. Asa Digralsky, son varillas de vidrio con una rama horizontal. c. Las pipetas graduadas se utilizan para trasladar alícuotas de determinados volúmenes de muestra (0,1-100 ml). Pueden ser de vidrio o de plástico. d. Las micropipetas constan de un mango y de una punta. Las puntas son de PVC de diferentes medidas y colores dependiendo del volumen de muestra; se esterilizan en el autoclave.

Nunca dejar material contaminado sobre la mesa del laboratorio
(asas de siembra, tapones de cualquier tipo) TÉCNICA DE SIEMBRA Se toma el tubo o erlenmeyer que contiene el inóculo con la mano izquierda (fig. 4.1) y con los 4º y 5º dedos de la mano derecha se estira o desenrosca el tapón. Con los dedos 1º y 2º se coge el material para trasladar la muestra (asa de Kolle, pipeta...) antes de quitar el tapón.

Fig. 4.1 Es muy importante flamear al mechero la boca de los tubos o erlenmeyers y el extremo de las pipetas antes de inocular las muestras. Las asas de Digralsky sirven para extender homogéneamente una alícuota sembrada sobre un medio sólido. Para esterilizarlas, se sumergen en un recipiente con alcohol y se pasan por la

los microorganismos quedarán aislados en las últimas estrías y se podrán observar colonias aisladas. 4. . Antes de sembrar. B) Siembra por superficie o en masa Es un método cuantitativo de aislamiento y recuento de las bacterias presentes en una muestra problema. haciendo un zig-zag hasta que se agote el inóculo. alícuotas de la muestra por toda la superficie del medio de cultivo. 3. Este método no permite saber el número de microorganismos por gr. 7. de la muestra. Hacer una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores de manera que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior.48 h. sin que toque ninguna superficie.2) 5. Código de identificación 2.1 SIEMBRA EN PLACA A) Siembra en estría o por agotamiento. Incubar en posición invertida para que las gotas de agua de condensación no se depositen encima de las colonias. Para siembra en estría. Incubar 24 . hacer una serie de estrías paralelas y no superpuestas hasta que se agote el asa (fig. con el asa de Kolle. El objetivo es conseguir colonias aisladas. Si la siembra ha sido correcta.poner el asa suavemente sobre el agar. Se basa en repartir homogéneamente. 8. 4. Siembra escocesa.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 30 llama de un mechero. Para siembra escocesa. 6. La última serie de estrías no se ha de superponer con la primera. Esterilizar el asa de siembra.1. Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar al lado del mechero. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso una o dos veces más. Se basa en arrastrar. Tomar una alícuota del cultivo (líquido o sólido) con el asa de siembra. Concentración del inóculo En las placas de Petri dichas anotaciones se realizan de forma circular en el borde de la tapa. un número cada vez menor de microorganismos sobre un medio sólido en placa de Petri. Los tubos y placas deben marcarse con rotulador de vidrio: 1. Tipo de análisis 3. 2. Fig. a la Tª adecuada. se espera un tiempo hasta que se enfríe al lado de la llama. o ml.4.2 Metodología 1. 4.

a la temperatura indicada. Asa Digralsky Procedimiento: 1. para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. 5. No es necesario homogeneizar.48 h. 4. Procedimiento: 1. Siembra en profundidad ("pouring").1. Incubar durante 24 . Incubar durante 24 . Efectuar el recuento de las colonias en el medio. Agitar suavemente deslizando la placa de Petri encima de la mesa. 5. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (microorganismos anaerobios). 9. Añadir 15-20 ml de agar nutritivo líquido a 45-47 ºC.3 . 8.1.2. B. Siembra homogénea en superficie.1 ml. Incubar durante 24 . para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. Añadir 0. fig. Esperar unos 10 minutos hasta que solidifique. Tras solidificar añadir una nueva capa del mismo medio de cultivo (aproximadamente 10 ml por placa). Efectuar el recuento de las colonias sobre la superficie del medio (microorganismos aerobios).48 h.3. Añadir entre 15-20 ml. del agar nutritivo en forma líquida atemperado a 45-47 ºC. 4. 6. Dejar solidificar el agar. 2. 6.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 31 B. Añadir 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. en un movimiento en forma de ocho por espacio de dos minutos. Repartir el inóculo por toda la superficie con movimientos de rotación hasta que el líquido quede totalmente absorbido. 3. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa . 7. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (aerobios y anaerobios facultativos). de la muestra o de las diluciones correspondientes en placas de Petri con agar nutritivo. Esterilizar el asa Digralsky. Incubar las placas invertidas. 6. para mezclar el medio y la alícuota. 4. B. 3. Sembrar 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. Homogeneizar las placas con suavidad. 5.2 SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO a) Siembra por estría Es el método utilizado para el mantenimiento de cultivos puros y para determinar algunas características fisiológicas de los microorganismos. 4. 3. a la temperatura indicada. Siembra en doble capa Procedimiento: 1. 2. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas. a la temperatura indicada.48 h. 2. 4.

4. 5. densidad bacteriana o magnitud proporcional (concentración.2. Homogeneizar la suspensión. 4. cargado con el inóculo. Abrir el tubo con el medio de cultivo estéril y flamear la boca. masa microbiana procedente de un cultivo (sólido o líquido) a un medio líquido. mediante el asa de Kolle. 4. un alambre largo y recto. Incubar a la temperatura adecuada.3 fig.3. MÉTODOS DE RECUENTO MICROBIANOS Determinación de: 1. 3. 2. El medio se inocula introduciendo verticalmente en el centro del tubo. Procedimiento: 1. Flamear el tubo y ponerle el tapón.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 32 b) Siembra en picadura Es un método utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos.3 SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO Medio utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos o para la obtención de cultivos. Introducir el asa de Kolle cargada con el inóculo dentro del medio y agitarla para que las bacterias queden resuspendidas. Los tubos o frascos con el medio de agar se dejan solidificar en posición vertical o inclinada. masa celular 3. 6. 7. Se basa en inocular. Esterilizar el asa de Kolle. Fig.1. 4. nº de células 2. Cargar el asa con el cultivo que se quiere transferir. absorbancia) . 4. Esterilizar el asa.

que posteriormente se siembran en placas con medio de cultivo. Para la medida se pueden emplear métodos electroquímicos. La viabilidad en Microbiología se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio sólido formando una colonia. Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un número muy elevado de microorganismos. Centrifugación: I. Permite tomar las colonias para su resiembra en otro medio o para su posterior identificación. Filtros de membrana Métodos de determinación masa bacteriana: a. nº de células viables (banco de diluciones) Cámara de recuento Método Breed Contador electrónico (se basa en la pérdida de conductividad de un electrolito cuando pasa una célula bacteriana a través de un orificio estrecho) e. Determinación de nitrógeno o carbono. Masa seca (centrifugación y secado) 1. Magnitudes metabólicas (captación de O2. b.. c. d. Métodos directos: 1.) 4. Masa húmeda (por centrifugación) II. titulaciones volumétricas. producción de CO2.1 RECUENTO VIABLES .. se utiliza principalmente para el recuento de hongos y en análisis de microorganismos mesófilos aerobios totales en aguas y alimentos. a. ..4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 33 Métodos de determinación nº células: a. Esta técnica de recuento nos permite conocer el número de microorganismos viables en una determinada muestra. ácido). La siembra en profundidad ("pouring"). 2. Banco dilucionesi.2. por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos. Para ello se realizan diluciones seriadas. Turbidimetría / Nefelometría. La siembra en placa en superficie es idónea para aerobios. Métodos indirectos: 1.

10-2. Repetir la operación con las sucesivas diluciones. se cuentan las colonias de las placas que contienen entre 30 . marcado como dilución 10-1 (-1). 6. esta placa no es válida para efectuar el recuento. 2. las colonias deben estar aisladas. que se depositara en el tubo de Ringer (-2). ufc/ml.10-6 (1).10-4.10-3. = nº colonias · 1 1 dilucio ´n vol.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 34 Fig. Para obtener el número de organismos por unidad de peso o volumen de la muestra analizada. Rotular los tubos de Ringer con el factor de dilución: 10-1. Colocar 9 ml de solución Ringer en cada uno de ellos. que se multiplica por la inversa de la dilución y por la inversa del volumen del inóculo sembrado en las placas. Tomar 1 ml de la muestra problema con la pipeta y depositarlo en un tubo de Ringer con 9 ml de Ringer. Agitar la muestra inicial para homogeneizarla.4 Procedimiento 1.300 colonias. se calcula la media aritmética. 10-5. Esterilizar los tubos Ringer. (-3). Para realizar un recuento correcto. 4. Sembrar en placas de agar a partir de las diversas diluciones. 4. (-2).gr. Incubar. En caso de encontrarse superpuestas. Se agita bien el tubo (-1 ) y se toma 1 ml. Lectura y recuento. Hay que contar las colonias a contraluz. 5. ni se cuentan dos veces. A medida que se van contando se marcan con un rotulador. así no se deja de contar ninguna. 7. ino ´culo . etc. 3.

= ´lulas/campo ) x nu (media ce ´m . Si las células están homogéneamente repartidas. lavar con agua del grifo. A continuación contar el número de microorganismos en varios campos. Dibujar en él un cuadrado de 1 cm por lado. Utilizando un objetivo de inmersión se inspeccionan los campos microscópicos y se calcula el valor medio del número de bacterias que hay en cada campo. En el método Breed se extiende una muestra sobre un recuadro de un centímetro marcado sobre el porta y se tiñe. 6.3 4 . campos totales en cm2 = 1 r 2 (determinar "r" con cámara de recuento) .100 > 100 Número de campos que se han de contar 64 32 16 8 4 2 1 Si la distribución no es homogénea se ha de contar un mínimo de 10 campos y en total como mínimo 300 células. Número de bacterias / campo 0 . células/ml. Procedimiento 1.12 13 .2. Dar la vuelta al porta y observamos una superficie bien delimitada de 1 cm2. Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 35 4.2 RECUENTO DIRECTO A) MÉTODO BREED Por la técnica de método directo se coloca un volumen conocido de una suspensión bacteriana sobre un área conocida del portaobjetos. 5.6 7 . campos totales en 1 cm 2 volumen (ml) núm. Cubrir la extensión con azul de metileno durante 1 min. se puede aplicar la siguiente tabla. hay que aplicar la fórmula siguiente: (N) núm. Para obtener el nº de células/ml de la muestra problema. 4. 2. Desengrasar con cuidado un portaobjetos.25 26 . Colocar en la superficie y extender en los límites del cuadrado 1 gota de micropipeta (16 l) de inóculo. 3. secar y observar al microscopio con objetivo de 40-60 aumentos).50 51 . de manera que el número de campos es más grande cuanto más bajo es el de microorganismos.

La principal ventaja es que no se necesita ningún tiempo de incubación. La cavidad se llena1 con la suspensión bacteriana. Observar con objetivo x60 aumentos. . Las bacterias móviles son difíciles de contar por este método y como pasa con otros métodos microscópicos. Se calcula la media del nº de bacterias de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que proporciona el recuento por mililitro. Una cavidad de volumen conocido está excavado en la superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un área conocida. Además se requiere una concentración bastante alta de bacterias. las células muertas son demasiado similares a las vivas que se quieren contar. 1 Técnica de llenado de cámara de recuento: Tomar el inóculo con una pipeta Pasteur y acercarla al borde del cubre permitiendo que entre la muestra por capilaridad a la cámara de recuento. de unos 10 millones de bacterias por ml.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 36 B) CAMARA DE RECUENTO Para los recuentos microscópicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseñado llamado Cámara de Petroff-Hausser. Su uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal.

etc. temperatura. obtenemos una curva en la cual se diferencian cuatro periodos diferentes: 1. El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo el incremento del número de células. Si se representan gráficamente estas variaciones en función del tiempo.3 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS. Para unas condiciones determinadas.). particularmente de síntesis enzimática. la acumulación de sustancias tóxicas. o si ha cambiado de medio de cultivo. . La población microbiana presenta una intensa actividad metabólica. Depende de factores como: a. Estas variaciones dependen de factores como el agotamiento de nutrientes. Si el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria. Fase de latencia Periodo de tiempo entre inoculación y la tasa de crecimiento máxima. La velocidad de multiplicación varía de una especie a otra y depende de las condiciones de cultivo (nutrientes.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 37 4. ribosomas y enzimas. Medio de cultivo Durante algún tiempo hay poco o ningún cambio en el número de células debido a que no se reproducen inmediatamente en medio nuevo. Este periodo se llama fase de latencia y puede durar desde una hora a varios días. Edad cultivo b. debe adaptarse primero a las nuevas condiciones de crecimiento: síntesis de RNA (aumenta entre 8-12 veces). el crecimiento no es uniforme sino que varía a lo largo del tiempo. pH. etc. Pero en este tiempo las células no se encuentran inactivas.

Fase logarítmica Finalmente las células empiezan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento exponencial. . Enterobacterias 15-30'. Fase estacionaria Si el crecimiento exponencial continua sin control da lugar a un número de células asombrosamente altos. Las actividades metabólicas de las células supervivientes también se hacen más lentas en esta fase. densidad. Este periodo se llama fase estacionaria. aireación. Es también cuando son metabólicamente activas. Durante esta fase logarítmica las células empiezan a mostrar sus características visibles: Morfología. etc) o capacidad de usar diversos sustratos nutritivos. Fase idónea para estudiar influencia de factores ambientales (pH. El tamaño celular y el contenido en proteínas es constante en la fase logarítmica (células estándar). Ello implica la fiabilidad de las técnicas de medición indirecta. La reproducción celular adquiere una actividad máxima durante este periodo y el tiempo de generación llega a un mínimo constante. Nitrosomas y Nitrobacter 5-10 h. color. Por otra parte durante la fase logarítmica del crecimiento.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 38 Cerca del final de la fase de latencia algunas células doblarán o triplicarán su tamaño. Bacterias del suelo 60-150' . Como el tiempo de duplicación es constante la representación logarítmica del crecimiento durante esta fase exponencial es una linea recta.. Finalmente la velocidad del crecimiento disminuye el número de células muertas compensa al de células vivas y la población se estabiliza. Existe aparentemente un tiempo de generación mínimo característico determinado genéticamente en cada especie (TD).. Pero esto no ocurre. temperatura. los microorganismos son mas sensibles de lo normal a las condiciones adversas. preparándose para la reproducción.

que es frecuentemente proporcional al número de células. Causas poco conocidas en general. En Biotecnología: a. Penicilina). las células puede aún: a. Trofofase: Fase de nutrición o crecimiento b. También tienen lugar variaciones del pH y de temperatura. Algunos métodos miden el número de células (Breed. lactobacilos) autolisis (por la acción de los propios enzimas) 4. utilizar materiales de reserva b. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de muestra o en un gramo de material sólido. otros la masa total de la población.coli. Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. se añaden sustratos que actúan como precursores del producto objeto de la producción. Disminución de presión parcial de O2.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 39 Las razones del cese del crecimiento exponencial son siempre claras. Fase de muerte Normalmente el número de células muertas supera al de células formadas y la población entra en la fase de muerte o fase de descenso logarítmico. sintetizar enzimas En muchos procesos microbianos la fase estacionaria es la fase de producción de un metabolitosecundario (p. cámara de recuento). Se acumulan productos de degradación tóxicos par las células y se agotan ciertos nutrientes esenciales. Algunas debido a: producción de ácidos (e. .3. descomponer parte de los ribosomas c. En fase estacionaria sólo las células muy sensibles mueren rápidamente. después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. Debido a que las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayoría de métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas.ej. Idiofase: Fase de producción Aunque las células no crezcan durante la idiofase.1 MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO.

ESPECTROFOTÓMETRO El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Tamaño y peso molecular de las partículas Longitud de onda de la luz incidente Longitud detector-cubeta Concentración partículas Si las lecturas de absorbancia se comparan con el recuento en placa del mismo cultivo esta correlación se puede utilizar en estimaciones futuras del número de bacterias hechas directamente por turbidimetría. 2. La dispersión depende de: 1. la medida de la turbidez (turbidimetría) es un método muy práctico para seguir el crecimiento bacteriano. la luz absorbida por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. Para que sean visibles las primeras trazas de turbidez es necesario mas de un millón de células por ml. 4. Por este procedimiento se puede estimar el número de bacterias en el cultivo.20 millones por ml. ya que. y entre 10 . para que la sustancia sea suficientemente turbia como para ser medida por un espectrofotómetro. 3. Por tanto la turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias.. Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. siendo inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. . La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica. dentro de un rango.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 40 A) TURBIDIMETRÍA En algunos tipos de trabajos experimentales. La turbidimetría mide la cantidad de luz transmitida por la suspensión.

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 41 En general. ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión (Ley de Beer2) La relación entre Transmitancia (T) y Absorbancia (A) se expresa matemáticamente por: Io -----> 7 -------> I s T= Is I0 %T= Para %T = 0 Is I0 · 100 => Absorbancia = ∞ Para %T = 100 => Absorbancia = 0. b. (A = a·b·c). para estabilizar componentes eléctricos y fuente de luz.log % de Transmitancia Fuente de luz. 3. siendo: A = absorbancia b = longitud del paso de la luz en cm. Seleccionar la longitud de onda adecuada. 2. Fases de utilización (con aparato calibrado) 1. a = coeficiente de absorción c = concentración del absorbente . Convierte la energía luminosa que recibe en energía eléctrica. antes. Sistema de registro Convierte señales eléctricas del detector en señales registradas de lectura. Ajustar la absorbancia a 0 con el blanco (medio de cultivo empleado) 2 Ley de Beer. Absorbancia = 2 . Se obtiene seleccionando una onda de una fuente de luz policromática. Conectar el aparato 15 m. Según esta ley la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz. Establece la relación entre el grado de absorbancia de una disolución y otras dos variables: La concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz recorre a través de la solución. Recipiente donde se coloca la muestra (l = 1 cm en general) Detector. Filtros de vidrios coloreados que absorben las radiaciones no deseadas. sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia). Luz monocromática ( única). Prismas o redes de difracción (espectro fotómetro) Cubeta. La selección se realiza mediante: a. el crecimiento bacteriano no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia).

o bien las últimas. en la cual se coloca en ordenadas el logaritmo del número de células. Dicha curva no es apropiada para expresar un número grande de divisiones celulares. o bien las primeras divisiones. Por ello se prefiere la representación semilogarítmica. Siendo N = No ·2n . La pendiente de dicha recta refleja la velocidad del crecimiento celular.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 42 CURVA DE CRECIMIENTO Suponiendo que un cultivo bacteriano crece a razón de una división cada 20 min.024 210 10 220 2. porque según que escala escojamos . se habla por tanto de crecimiento logarítmico.096 212 12 Se produce un crecimiento exponencial. . tendríamos: Tiempo en min. celulares 0 1 20 0 20 2 21 1 40 4 22 2 60 8 23 3 80 16 24 4 100 32 25 5 120 64 26 6 140 128 27 7 160 256 28 8 180 512 29 9 200 1. El crecimiento exponencial se caracteriza por una relación lineal entre el tiempo y el logaritmo del número de células. Nº de bacterias (N) N = 2n n = nº divis. En este tipo de representación se obtiene una recta.048 211 11 240 4. se obtiene una curva exponencial. Si se ha partido inicialmente de 1 célula. si aplicamos logaritmos log N = log No + n·log 2 y n= log N−log N 0 log 2 La tasa de crecimiento (v = número de divisiones celulares/hora) será: v= n t = log N−log N 0 (t−t 0 )$log 2 El tiempo necesario para un ciclo de división es el tiempo de generación: g= t n = 1 v En la representación gráfica del crecimiento bacteriano. se reconocerán únicamente.

0.990 1. Tiempo 0 30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240' 2 Absorbancia 0.Coli.360 0.587 0.150' (fase exponencial del crecimiento).180 0. La tasa de crecimiento (pendiente de la recta) El tiempo de duplicación es td = ln 2  = ln x t −ln x o (t−t o ) ================================================================== Ejercicio: Cálculo de los parámetros (Td) y () Microorganismo utilizado Escherichia coli Medio de cultivo utilizado TSB Longitud de onda 540 nm Anota en la tabla siguiente los resultados obtenidos: Se utilizará como datos de cálculo.850 1.750 1. Td (min) Tasa específica de crecimiento (h-1) .852 1. las absorciones siguientes medidas en un espectrofotómetro de un cultivo de E.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 43 Cálculo del Tiempo de duplicación (Td) y la Tasa específica de crecimiento () En los cálculos se toma como base la densidad bacteriana (x) o alguna magnitud proporcional a ella (número de células. absorción).356 1.5 0 0 50 100 150 200 250 300 tiempos (min) Tiempo de duplicación.5 Absorbancias 1 Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en el tramo: 60' .104 0.

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 44 TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en placa) TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en tubo) .

Consultar la composición y características de los medios de cultivo que se emplean en esta práctica e indicar que función cumplirá cada uno de ellos. 5. 11. 2. . C.. de dº Ringer 3. Hacer un esquema del banco de diluciones y de las siembras que has realizado. Incubar 48 h. -3. -4).. A) Aislamiento por dilución 1. 4. 3. Hacer un esquema con la metodología seguida. 10.(A. B) Aislamiento por agotamiento en placa 1. 13. 7. Escherichia coli. Proseguir con el procedimiento B. Completar la tablas de observaciones. Enfriar. "C". ( A. Evitar que se superpongan las estrías.Sabouraud a 27 ºC) 9. 7. Sabouraud 1 sector más) 4. Preparar 2 placas (xG) de agar nutritivo Preparar 4 tubos con 9 ml.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 45 PRÁCTICA 4. Proceder de igual manera con las colonias del tipo "B" . 8. de cada una de las diluciones con asa Digralsky en placas con agar nutritivo (G1: -1. . Sembrar Saccharomyces cerevisiae en un sector del A. Incubar las placas en la estufa de cultivos a 37 ºC durante 48 h. 15.C.1) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Muestra problema: Disolución ringer . A partir de una colonia que haya dado positivo en el Agar Mc. en uno de los sectores. 2. Repetir la operación con los agares Manitol Salt. Preparar y esterilizar los medios sólidos: Mc Conkey.F. 12. Cuestionarios. Rotular en la parte posterior de cada placa (excepto Levine). 5. tantos sectores como microorganismos se tengan que sembrar. Manitol Salt. -4) con la muestra disponible. B. Sabouraud.. Staphylococcus epidermidis. 14. G:2 Sabouraud CAF. Esterilizar. Observar los resultados obtenidos. Incubar 24-48 h a 37 ºC. Sembrar en superficie 0. Distribuir los medios. Conkey. a 37 ºC.1 ml. Preparar un banco de diluciones decimales (-1. 10. En otra placa de Agar Levine realizar una siembra escocesa a partir de un cultivo puro de Enterobacter cloacae. -3. . en agar Mc Conkey. Obtener conclusiones. Efectuar lectura de los resultados obtenidos. Describe las morfologías coloniales observadas (A.). resembrar en siembra escocesa en medio agar Levine (xG). 6../mL en la muestra con los resultados obtenidos. Sabouraud 8.1 y sembrarla en estría por agotamiento. 6. Levine. Realizar el cálculo del nº de U. 3. G2: -2. 9. Marcar placas Petri. -2. Tomar del agar nutritivo una colonia del tipo "A" obtenida en el protocolo nº 4.. completando los cuadros correspondientes.

Añadir solución salina estéril al tubo inclinado de E. 3.. con los datos obtenidos. Resuspender 2 g de levadura en 100 ml de solución salina. 5. En dos tubos de ensayo con S. En 1 erlenmeyer de 100 ml. Método Breed. a 37 ºC 3. b. 7. Turbidimetría. Sembrar 1 ml de inóculo de la dilucion (-2). 4. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 ml) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación. -2. con agitación 200 rpm (si disponible) 6. 5.2 Crecimiento población microorganismos. A)Crecimiento población Saccharomyces cerevisiae. Turbidimetría. en 25 ml de agua destilada. Preparar un tubo inclinado con agar nutritivo.S. Cámara de recuento. Dibujar una curva de crecimiento. coli. 1. 30. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos: 0. Disolución nutritiva: En un frasco de 250 ml. 60. Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en fase exponencial del crecimiento.. Inóculo. en papel milimétrico. Incubar el matraz en la estufa de cultivos a 37 ºC. Sembrar en estría un inóculo de E. mediante: a. colocar 50 ml de solución nutritiva. 7. Agitar suavemente el cultivo con periodicidad 6.y 180 minutos (longitud de onda aconsejada: 540 nm). Cálculo parámetros (v) y (g)..4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 46 PRACTICA 4. 1. Tomar 1 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 100 ml de TSB estéril.2 g de azúcar. Incubar a 22 ºC durante 7 días. del inóculo.. Hacer un recuento de levaduras en cada sesión de prácticas. 2. colocando en el eje de abscisas los valores del tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia. y añadir 1. 4.. B) Curva crecimiento Escherichia coli. . preparar diluciones decimales -1. preparar una de solución de 25 ml de vino blanco (sin tratar). Incubar 48 h. 2. Ajustar el espectrofotómetro a 0 % de absorbancia con un tubo de TSB estéril antes de cada medida (blanco). Calcular la tasa de crecimiento v (número de dividiones celulares por día) y el tiempo de generación g (en horas). 8.

You're Reading a Free Preview

Descarga
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->