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CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

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4. SIEMBRA Y AISLAMIENTO MÉTODOS DE RECUENTO

DE

MICROORGANISMOS.

4.1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Para trasladar microorganismos de un medio de cultivo a otro se utilizan micropipetas, pipetas graduadas, asas de siembra y asas de siembra calibradas. a. El asa de Kolle consta de un mango aislante y de un filamento de platino o de niquelcromo (nicrom) recto o acabado en un anillo. Esta asa se esteriliza por incineración a la llama del mechero, dejándola enfriar sin que toque ninguna superficie antes de la siembra. Las asas calibradas sirven para trasladar alícuotas de un volumen pequeño de muestra (p.ej. 0,01 ml o 0,001 ml). El hilo de siembra (asa de picadura) se emplea para sembrar por picadura en el fondo de un tubo conteniendo agar, el asa redondeada (asa de Kolle) para sembrar por estría o en medios líquidos. b. Asa Digralsky, son varillas de vidrio con una rama horizontal. c. Las pipetas graduadas se utilizan para trasladar alícuotas de determinados volúmenes de muestra (0,1-100 ml). Pueden ser de vidrio o de plástico. d. Las micropipetas constan de un mango y de una punta. Las puntas son de PVC de diferentes medidas y colores dependiendo del volumen de muestra; se esterilizan en el autoclave.

Nunca dejar material contaminado sobre la mesa del laboratorio
(asas de siembra, tapones de cualquier tipo) TÉCNICA DE SIEMBRA Se toma el tubo o erlenmeyer que contiene el inóculo con la mano izquierda (fig. 4.1) y con los 4º y 5º dedos de la mano derecha se estira o desenrosca el tapón. Con los dedos 1º y 2º se coge el material para trasladar la muestra (asa de Kolle, pipeta...) antes de quitar el tapón.

Fig. 4.1 Es muy importante flamear al mechero la boca de los tubos o erlenmeyers y el extremo de las pipetas antes de inocular las muestras. Las asas de Digralsky sirven para extender homogéneamente una alícuota sembrada sobre un medio sólido. Para esterilizarlas, se sumergen en un recipiente con alcohol y se pasan por la

haciendo un zig-zag hasta que se agote el inóculo. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso una o dos veces más. a la Tª adecuada. 4. Incubar 24 . 6. Antes de sembrar. alícuotas de la muestra por toda la superficie del medio de cultivo. Fig. sin que toque ninguna superficie. El objetivo es conseguir colonias aisladas. B) Siembra por superficie o en masa Es un método cuantitativo de aislamiento y recuento de las bacterias presentes en una muestra problema.4. Los tubos y placas deben marcarse con rotulador de vidrio: 1. Incubar en posición invertida para que las gotas de agua de condensación no se depositen encima de las colonias. 2. se espera un tiempo hasta que se enfríe al lado de la llama.poner el asa suavemente sobre el agar. 7. 3. Siembra escocesa.48 h. 4. los microorganismos quedarán aislados en las últimas estrías y se podrán observar colonias aisladas. 4. Para siembra escocesa.2) 5. o ml. Para siembra en estría. hacer una serie de estrías paralelas y no superpuestas hasta que se agote el asa (fig. Tomar una alícuota del cultivo (líquido o sólido) con el asa de siembra. Esterilizar el asa de siembra.1 SIEMBRA EN PLACA A) Siembra en estría o por agotamiento. Hacer una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores de manera que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior. Tipo de análisis 3. Concentración del inóculo En las placas de Petri dichas anotaciones se realizan de forma circular en el borde de la tapa.2 Metodología 1. Este método no permite saber el número de microorganismos por gr. de la muestra. .1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 30 llama de un mechero. La última serie de estrías no se ha de superponer con la primera. Código de identificación 2. con el asa de Kolle. Se basa en arrastrar. Si la siembra ha sido correcta. 8. Se basa en repartir homogéneamente. un número cada vez menor de microorganismos sobre un medio sólido en placa de Petri. Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar al lado del mechero.

6.3.1. Efectuar el recuento de las colonias sobre la superficie del medio (microorganismos aerobios). Añadir entre 15-20 ml. 3. en un movimiento en forma de ocho por espacio de dos minutos. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas. 6. para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. B. Añadir 0.48 h.2 SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO a) Siembra por estría Es el método utilizado para el mantenimiento de cultivos puros y para determinar algunas características fisiológicas de los microorganismos. a la temperatura indicada.48 h. Asa Digralsky Procedimiento: 1. Incubar las placas invertidas. del agar nutritivo en forma líquida atemperado a 45-47 ºC. No es necesario homogeneizar. Añadir 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. 5. 7. Incubar durante 24 . Siembra en doble capa Procedimiento: 1. 5. B. 4. Tras solidificar añadir una nueva capa del mismo medio de cultivo (aproximadamente 10 ml por placa). 2. Siembra homogénea en superficie. 3. para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio.48 h. 8. 4.2. Incubar durante 24 .1 ml. Homogeneizar las placas con suavidad. Dejar solidificar el agar. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas. 4. 3. 4. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (aerobios y anaerobios facultativos). Esperar unos 10 minutos hasta que solidifique.1. 5. fig. a la temperatura indicada. 6. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (microorganismos anaerobios). Agitar suavemente deslizando la placa de Petri encima de la mesa. para mezclar el medio y la alícuota. Incubar durante 24 . 2. Siembra en profundidad ("pouring"). Sembrar 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 31 B. 4. 9. Procedimiento: 1. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa .3 . Efectuar el recuento de las colonias en el medio. de la muestra o de las diluciones correspondientes en placas de Petri con agar nutritivo. a la temperatura indicada. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. Esterilizar el asa Digralsky. Añadir 15-20 ml de agar nutritivo líquido a 45-47 ºC. 2. Repartir el inóculo por toda la superficie con movimientos de rotación hasta que el líquido quede totalmente absorbido.

Esterilizar el asa de Kolle. Cargar el asa con el cultivo que se quiere transferir. Introducir el asa de Kolle cargada con el inóculo dentro del medio y agitarla para que las bacterias queden resuspendidas. nº de células 2. masa celular 3. MÉTODOS DE RECUENTO MICROBIANOS Determinación de: 1. Procedimiento: 1. densidad bacteriana o magnitud proporcional (concentración. Homogeneizar la suspensión. absorbancia) . 5. 4.1. 4. 7. Flamear el tubo y ponerle el tapón. 4. 2. Se basa en inocular.3 fig.2. 4. El medio se inocula introduciendo verticalmente en el centro del tubo.3. 6. Incubar a la temperatura adecuada. masa microbiana procedente de un cultivo (sólido o líquido) a un medio líquido. 3. mediante el asa de Kolle.3 SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO Medio utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos o para la obtención de cultivos. Abrir el tubo con el medio de cultivo estéril y flamear la boca. cargado con el inóculo. 4. Esterilizar el asa. un alambre largo y recto.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 32 b) Siembra en picadura Es un método utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos. Fig. Los tubos o frascos con el medio de agar se dejan solidificar en posición vertical o inclinada.

. nº de células viables (banco de diluciones) Cámara de recuento Método Breed Contador electrónico (se basa en la pérdida de conductividad de un electrolito cuando pasa una célula bacteriana a través de un orificio estrecho) e. ácido). Magnitudes metabólicas (captación de O2. a. Determinación de nitrógeno o carbono. Filtros de membrana Métodos de determinación masa bacteriana: a. Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un número muy elevado de microorganismos. Para la medida se pueden emplear métodos electroquímicos. Banco dilucionesi. por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos. b. producción de CO2. Masa húmeda (por centrifugación) II. La siembra en profundidad ("pouring"). Métodos indirectos: 1. Esta técnica de recuento nos permite conocer el número de microorganismos viables en una determinada muestra. Turbidimetría / Nefelometría. . 2.1 RECUENTO VIABLES .4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 33 Métodos de determinación nº células: a. La siembra en placa en superficie es idónea para aerobios. que posteriormente se siembran en placas con medio de cultivo. d. Para ello se realizan diluciones seriadas. La viabilidad en Microbiología se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio sólido formando una colonia.) 4. titulaciones volumétricas. Masa seca (centrifugación y secado) 1. Permite tomar las colonias para su resiembra en otro medio o para su posterior identificación. Métodos directos: 1. c. se utiliza principalmente para el recuento de hongos y en análisis de microorganismos mesófilos aerobios totales en aguas y alimentos... Centrifugación: I.2.

10-5.300 colonias. etc. ni se cuentan dos veces. esta placa no es válida para efectuar el recuento.gr. = nº colonias · 1 1 dilucio ´n vol. las colonias deben estar aisladas. se cuentan las colonias de las placas que contienen entre 30 . A medida que se van contando se marcan con un rotulador. 4. Rotular los tubos de Ringer con el factor de dilución: 10-1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 34 Fig. Repetir la operación con las sucesivas diluciones. que se depositara en el tubo de Ringer (-2). Hay que contar las colonias a contraluz.10-6 (1). 7. Esterilizar los tubos Ringer. 6. 4. ufc/ml. Se agita bien el tubo (-1 ) y se toma 1 ml. 2. Para realizar un recuento correcto.4 Procedimiento 1. Lectura y recuento. que se multiplica por la inversa de la dilución y por la inversa del volumen del inóculo sembrado en las placas. ino ´culo . así no se deja de contar ninguna.10-4. 10-2. Sembrar en placas de agar a partir de las diversas diluciones. En caso de encontrarse superpuestas. marcado como dilución 10-1 (-1). Colocar 9 ml de solución Ringer en cada uno de ellos. se calcula la media aritmética. 5.10-3. Incubar. (-2). Tomar 1 ml de la muestra problema con la pipeta y depositarlo en un tubo de Ringer con 9 ml de Ringer. (-3). Para obtener el número de organismos por unidad de peso o volumen de la muestra analizada. Agitar la muestra inicial para homogeneizarla. 3.

Utilizando un objetivo de inmersión se inspeccionan los campos microscópicos y se calcula el valor medio del número de bacterias que hay en cada campo.12 13 . A continuación contar el número de microorganismos en varios campos. campos totales en 1 cm 2 volumen (ml) núm. hay que aplicar la fórmula siguiente: (N) núm.2 RECUENTO DIRECTO A) MÉTODO BREED Por la técnica de método directo se coloca un volumen conocido de una suspensión bacteriana sobre un área conocida del portaobjetos. Para obtener el nº de células/ml de la muestra problema.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 35 4. de manera que el número de campos es más grande cuanto más bajo es el de microorganismos. Procedimiento 1. campos totales en cm2 = 1 r 2 (determinar "r" con cámara de recuento) . Desengrasar con cuidado un portaobjetos. Si las células están homogéneamente repartidas.3 4 .6 7 . 5.50 51 .2. Número de bacterias / campo 0 . lavar con agua del grifo. células/ml.25 26 . 6. 2. 4. = ´lulas/campo ) x nu (media ce ´m . se puede aplicar la siguiente tabla. En el método Breed se extiende una muestra sobre un recuadro de un centímetro marcado sobre el porta y se tiñe. Dibujar en él un cuadrado de 1 cm por lado. Colocar en la superficie y extender en los límites del cuadrado 1 gota de micropipeta (16 l) de inóculo. Cubrir la extensión con azul de metileno durante 1 min. secar y observar al microscopio con objetivo de 40-60 aumentos). Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente. 3. Dar la vuelta al porta y observamos una superficie bien delimitada de 1 cm2.100 > 100 Número de campos que se han de contar 64 32 16 8 4 2 1 Si la distribución no es homogénea se ha de contar un mínimo de 10 campos y en total como mínimo 300 células.

1 Técnica de llenado de cámara de recuento: Tomar el inóculo con una pipeta Pasteur y acercarla al borde del cubre permitiendo que entre la muestra por capilaridad a la cámara de recuento. La principal ventaja es que no se necesita ningún tiempo de incubación. Observar con objetivo x60 aumentos. las células muertas son demasiado similares a las vivas que se quieren contar.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 36 B) CAMARA DE RECUENTO Para los recuentos microscópicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseñado llamado Cámara de Petroff-Hausser. Las bacterias móviles son difíciles de contar por este método y como pasa con otros métodos microscópicos. Su uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal. Se calcula la media del nº de bacterias de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que proporciona el recuento por mililitro. . Además se requiere una concentración bastante alta de bacterias. La cavidad se llena1 con la suspensión bacteriana. Una cavidad de volumen conocido está excavado en la superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un área conocida. de unos 10 millones de bacterias por ml.

Medio de cultivo Durante algún tiempo hay poco o ningún cambio en el número de células debido a que no se reproducen inmediatamente en medio nuevo. particularmente de síntesis enzimática. el crecimiento no es uniforme sino que varía a lo largo del tiempo. Estas variaciones dependen de factores como el agotamiento de nutrientes. . o si ha cambiado de medio de cultivo. Edad cultivo b. Fase de latencia Periodo de tiempo entre inoculación y la tasa de crecimiento máxima. El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo el incremento del número de células. Para unas condiciones determinadas. temperatura. ribosomas y enzimas. Si el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria. la acumulación de sustancias tóxicas.). Pero en este tiempo las células no se encuentran inactivas. Si se representan gráficamente estas variaciones en función del tiempo. Este periodo se llama fase de latencia y puede durar desde una hora a varios días. obtenemos una curva en la cual se diferencian cuatro periodos diferentes: 1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 37 4.3 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS. pH. debe adaptarse primero a las nuevas condiciones de crecimiento: síntesis de RNA (aumenta entre 8-12 veces). La velocidad de multiplicación varía de una especie a otra y depende de las condiciones de cultivo (nutrientes. etc. La población microbiana presenta una intensa actividad metabólica. etc. Depende de factores como: a.

temperatura. los microorganismos son mas sensibles de lo normal a las condiciones adversas. Fase estacionaria Si el crecimiento exponencial continua sin control da lugar a un número de células asombrosamente altos. Fase idónea para estudiar influencia de factores ambientales (pH. etc) o capacidad de usar diversos sustratos nutritivos. Este periodo se llama fase estacionaria. La reproducción celular adquiere una actividad máxima durante este periodo y el tiempo de generación llega a un mínimo constante. Bacterias del suelo 60-150' .4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 38 Cerca del final de la fase de latencia algunas células doblarán o triplicarán su tamaño. Por otra parte durante la fase logarítmica del crecimiento. El tamaño celular y el contenido en proteínas es constante en la fase logarítmica (células estándar). color.. Las actividades metabólicas de las células supervivientes también se hacen más lentas en esta fase. densidad. Es también cuando son metabólicamente activas.. Como el tiempo de duplicación es constante la representación logarítmica del crecimiento durante esta fase exponencial es una linea recta. aireación. Enterobacterias 15-30'. Fase logarítmica Finalmente las células empiezan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento exponencial. Ello implica la fiabilidad de las técnicas de medición indirecta. Finalmente la velocidad del crecimiento disminuye el número de células muertas compensa al de células vivas y la población se estabiliza. Pero esto no ocurre. . preparándose para la reproducción. Existe aparentemente un tiempo de generación mínimo característico determinado genéticamente en cada especie (TD). Nitrosomas y Nitrobacter 5-10 h. Durante esta fase logarítmica las células empiezan a mostrar sus características visibles: Morfología.

coli. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de muestra o en un gramo de material sólido. Se acumulan productos de degradación tóxicos par las células y se agotan ciertos nutrientes esenciales. Penicilina). Algunos métodos miden el número de células (Breed. . Causas poco conocidas en general.1 MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO. En fase estacionaria sólo las células muy sensibles mueren rápidamente.3. En Biotecnología: a. después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. utilizar materiales de reserva b. descomponer parte de los ribosomas c. Trofofase: Fase de nutrición o crecimiento b. que es frecuentemente proporcional al número de células. cámara de recuento). lactobacilos) autolisis (por la acción de los propios enzimas) 4. Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Debido a que las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayoría de métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas. Disminución de presión parcial de O2. Algunas debido a: producción de ácidos (e. Idiofase: Fase de producción Aunque las células no crezcan durante la idiofase. las células puede aún: a. otros la masa total de la población. sintetizar enzimas En muchos procesos microbianos la fase estacionaria es la fase de producción de un metabolitosecundario (p. se añaden sustratos que actúan como precursores del producto objeto de la producción.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 39 Las razones del cese del crecimiento exponencial son siempre claras. También tienen lugar variaciones del pH y de temperatura. Fase de muerte Normalmente el número de células muertas supera al de células formadas y la población entra en la fase de muerte o fase de descenso logarítmico.ej.

Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales. dentro de un rango. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. Por este procedimiento se puede estimar el número de bacterias en el cultivo. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica.20 millones por ml. ya que. para que la sustancia sea suficientemente turbia como para ser medida por un espectrofotómetro. siendo inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. 3. La turbidimetría mide la cantidad de luz transmitida por la suspensión.. ESPECTROFOTÓMETRO El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. La dispersión depende de: 1. la luz absorbida por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. Para que sean visibles las primeras trazas de turbidez es necesario mas de un millón de células por ml. 4. Tamaño y peso molecular de las partículas Longitud de onda de la luz incidente Longitud detector-cubeta Concentración partículas Si las lecturas de absorbancia se comparan con el recuento en placa del mismo cultivo esta correlación se puede utilizar en estimaciones futuras del número de bacterias hechas directamente por turbidimetría. 2.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 40 A) TURBIDIMETRÍA En algunos tipos de trabajos experimentales. la medida de la turbidez (turbidimetría) es un método muy práctico para seguir el crecimiento bacteriano. . Por tanto la turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias. y entre 10 .

(A = a·b·c). sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia).4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 41 En general. antes. Luz monocromática ( única).log % de Transmitancia Fuente de luz. Ajustar la absorbancia a 0 con el blanco (medio de cultivo empleado) 2 Ley de Beer. a = coeficiente de absorción c = concentración del absorbente . Seleccionar la longitud de onda adecuada. b. para estabilizar componentes eléctricos y fuente de luz. 3. Conectar el aparato 15 m. 2. siendo: A = absorbancia b = longitud del paso de la luz en cm. ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión (Ley de Beer2) La relación entre Transmitancia (T) y Absorbancia (A) se expresa matemáticamente por: Io -----> 7 -------> I s T= Is I0 %T= Para %T = 0 Is I0 · 100 => Absorbancia = ∞ Para %T = 100 => Absorbancia = 0. La selección se realiza mediante: a. Absorbancia = 2 . el crecimiento bacteriano no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia). Sistema de registro Convierte señales eléctricas del detector en señales registradas de lectura. Se obtiene seleccionando una onda de una fuente de luz policromática. Recipiente donde se coloca la muestra (l = 1 cm en general) Detector. Convierte la energía luminosa que recibe en energía eléctrica. Fases de utilización (con aparato calibrado) 1. Filtros de vidrios coloreados que absorben las radiaciones no deseadas. Según esta ley la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz. Prismas o redes de difracción (espectro fotómetro) Cubeta. Establece la relación entre el grado de absorbancia de una disolución y otras dos variables: La concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz recorre a través de la solución.

tendríamos: Tiempo en min. . Siendo N = No ·2n . o bien las últimas.024 210 10 220 2. Por ello se prefiere la representación semilogarítmica. Dicha curva no es apropiada para expresar un número grande de divisiones celulares. se obtiene una curva exponencial. En este tipo de representación se obtiene una recta. o bien las primeras divisiones. Si se ha partido inicialmente de 1 célula.048 211 11 240 4. en la cual se coloca en ordenadas el logaritmo del número de células. si aplicamos logaritmos log N = log No + n·log 2 y n= log N−log N 0 log 2 La tasa de crecimiento (v = número de divisiones celulares/hora) será: v= n t = log N−log N 0 (t−t 0 )$log 2 El tiempo necesario para un ciclo de división es el tiempo de generación: g= t n = 1 v En la representación gráfica del crecimiento bacteriano. se reconocerán únicamente. El crecimiento exponencial se caracteriza por una relación lineal entre el tiempo y el logaritmo del número de células. porque según que escala escojamos . Nº de bacterias (N) N = 2n n = nº divis.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 42 CURVA DE CRECIMIENTO Suponiendo que un cultivo bacteriano crece a razón de una división cada 20 min.096 212 12 Se produce un crecimiento exponencial. celulares 0 1 20 0 20 2 21 1 40 4 22 2 60 8 23 3 80 16 24 4 100 32 25 5 120 64 26 6 140 128 27 7 160 256 28 8 180 512 29 9 200 1. se habla por tanto de crecimiento logarítmico. La pendiente de dicha recta refleja la velocidad del crecimiento celular.

587 0.5 0 0 50 100 150 200 250 300 tiempos (min) Tiempo de duplicación. Td (min) Tasa específica de crecimiento (h-1) . Tiempo 0 30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240' 2 Absorbancia 0.356 1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 43 Cálculo del Tiempo de duplicación (Td) y la Tasa específica de crecimiento () En los cálculos se toma como base la densidad bacteriana (x) o alguna magnitud proporcional a ella (número de células.852 1.360 0.850 1.180 0.Coli.104 0. las absorciones siguientes medidas en un espectrofotómetro de un cultivo de E.990 1.750 1.5 Absorbancias 1 Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en el tramo: 60' . absorción). La tasa de crecimiento (pendiente de la recta) El tiempo de duplicación es td = ln 2  = ln x t −ln x o (t−t o ) ================================================================== Ejercicio: Cálculo de los parámetros (Td) y () Microorganismo utilizado Escherichia coli Medio de cultivo utilizado TSB Longitud de onda 540 nm Anota en la tabla siguiente los resultados obtenidos: Se utilizará como datos de cálculo. 0.150' (fase exponencial del crecimiento).

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 44 TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en placa) TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en tubo) .

1) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Muestra problema: Disolución ringer . -3. 10. Sabouraud 1 sector más) 4. Conkey. Completar la tablas de observaciones. 6. Preparar y esterilizar los medios sólidos: Mc Conkey.. 10. Manitol Salt. Staphylococcus epidermidis.). 2. tantos sectores como microorganismos se tengan que sembrar.(A. 2. 15. .. 3. 8.. 13. de dº Ringer 3.. G:2 Sabouraud CAF. . Enfriar.1 ml. 6. 9. Levine. -2. de cada una de las diluciones con asa Digralsky en placas con agar nutritivo (G1: -1. . Sabouraud 8. G2: -2. Observar los resultados obtenidos. 12. Rotular en la parte posterior de cada placa (excepto Levine). Incubar las placas en la estufa de cultivos a 37 ºC durante 48 h. Sembrar en superficie 0.Sabouraud a 27 ºC) 9. C. Incubar 24-48 h a 37 ºC. 7. 4. 5. Marcar placas Petri.. A) Aislamiento por dilución 1. Hacer un esquema del banco de diluciones y de las siembras que has realizado. 14. Obtener conclusiones. Efectuar lectura de los resultados obtenidos. Sabouraud. Realizar el cálculo del nº de U. B) Aislamiento por agotamiento en placa 1. Proseguir con el procedimiento B. Tomar del agar nutritivo una colonia del tipo "A" obtenida en el protocolo nº 4. A partir de una colonia que haya dado positivo en el Agar Mc. "C". Escherichia coli. 5. Esterilizar. -4). 3. ( A. Preparar 2 placas (xG) de agar nutritivo Preparar 4 tubos con 9 ml. 7. Evitar que se superpongan las estrías. -4) con la muestra disponible. Sembrar Saccharomyces cerevisiae en un sector del A. en agar Mc Conkey. Incubar 48 h.1 y sembrarla en estría por agotamiento./mL en la muestra con los resultados obtenidos. completando los cuadros correspondientes. 11.C. Consultar la composición y características de los medios de cultivo que se emplean en esta práctica e indicar que función cumplirá cada uno de ellos. Proceder de igual manera con las colonias del tipo "B" . Hacer un esquema con la metodología seguida. -3. B. resembrar en siembra escocesa en medio agar Levine (xG). Repetir la operación con los agares Manitol Salt. En otra placa de Agar Levine realizar una siembra escocesa a partir de un cultivo puro de Enterobacter cloacae. a 37 ºC.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 45 PRÁCTICA 4. Distribuir los medios. Preparar un banco de diluciones decimales (-1.F. en uno de los sectores. Cuestionarios. Describe las morfologías coloniales observadas (A.

preparar diluciones decimales -1.y 180 minutos (longitud de onda aconsejada: 540 nm). -2.2 g de azúcar. Hacer un recuento de levaduras en cada sesión de prácticas. colocar 50 ml de solución nutritiva. A)Crecimiento población Saccharomyces cerevisiae. 3. B) Curva crecimiento Escherichia coli. Método Breed. coli. Resuspender 2 g de levadura en 100 ml de solución salina. En 1 erlenmeyer de 100 ml. Disolución nutritiva: En un frasco de 250 ml. Sembrar 1 ml de inóculo de la dilucion (-2).. Turbidimetría. preparar una de solución de 25 ml de vino blanco (sin tratar). 5... coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 ml) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación. 4. 8. b. 5. Cálculo parámetros (v) y (g). con los datos obtenidos. 1. Incubar 48 h. Calcular la tasa de crecimiento v (número de dividiones celulares por día) y el tiempo de generación g (en horas). Añadir solución salina estéril al tubo inclinado de E. 30. a 37 ºC 3. con agitación 200 rpm (si disponible) 6. Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en fase exponencial del crecimiento. del inóculo.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 46 PRACTICA 4. Cámara de recuento. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos: 0. en 25 ml de agua destilada. 4. 7.2 Crecimiento población microorganismos. colocando en el eje de abscisas los valores del tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.. 1. 7. Inóculo. 2. mediante: a.S. y añadir 1. Sembrar en estría un inóculo de E. Tomar 1 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 100 ml de TSB estéril. en papel milimétrico.. Dibujar una curva de crecimiento. Turbidimetría. Preparar un tubo inclinado con agar nutritivo. 60. Incubar el matraz en la estufa de cultivos a 37 ºC. En dos tubos de ensayo con S. Incubar a 22 ºC durante 7 días. . Ajustar el espectrofotómetro a 0 % de absorbancia con un tubo de TSB estéril antes de cada medida (blanco). Agitar suavemente el cultivo con periodicidad 6. 2.

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