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CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

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4. SIEMBRA Y AISLAMIENTO MÉTODOS DE RECUENTO

DE

MICROORGANISMOS.

4.1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Para trasladar microorganismos de un medio de cultivo a otro se utilizan micropipetas, pipetas graduadas, asas de siembra y asas de siembra calibradas. a. El asa de Kolle consta de un mango aislante y de un filamento de platino o de niquelcromo (nicrom) recto o acabado en un anillo. Esta asa se esteriliza por incineración a la llama del mechero, dejándola enfriar sin que toque ninguna superficie antes de la siembra. Las asas calibradas sirven para trasladar alícuotas de un volumen pequeño de muestra (p.ej. 0,01 ml o 0,001 ml). El hilo de siembra (asa de picadura) se emplea para sembrar por picadura en el fondo de un tubo conteniendo agar, el asa redondeada (asa de Kolle) para sembrar por estría o en medios líquidos. b. Asa Digralsky, son varillas de vidrio con una rama horizontal. c. Las pipetas graduadas se utilizan para trasladar alícuotas de determinados volúmenes de muestra (0,1-100 ml). Pueden ser de vidrio o de plástico. d. Las micropipetas constan de un mango y de una punta. Las puntas son de PVC de diferentes medidas y colores dependiendo del volumen de muestra; se esterilizan en el autoclave.

Nunca dejar material contaminado sobre la mesa del laboratorio
(asas de siembra, tapones de cualquier tipo) TÉCNICA DE SIEMBRA Se toma el tubo o erlenmeyer que contiene el inóculo con la mano izquierda (fig. 4.1) y con los 4º y 5º dedos de la mano derecha se estira o desenrosca el tapón. Con los dedos 1º y 2º se coge el material para trasladar la muestra (asa de Kolle, pipeta...) antes de quitar el tapón.

Fig. 4.1 Es muy importante flamear al mechero la boca de los tubos o erlenmeyers y el extremo de las pipetas antes de inocular las muestras. Las asas de Digralsky sirven para extender homogéneamente una alícuota sembrada sobre un medio sólido. Para esterilizarlas, se sumergen en un recipiente con alcohol y se pasan por la

4.4. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso una o dos veces más. Este método no permite saber el número de microorganismos por gr.1 SIEMBRA EN PLACA A) Siembra en estría o por agotamiento. Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar al lado del mechero. 4. Hacer una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores de manera que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior. 7. Esterilizar el asa de siembra. La última serie de estrías no se ha de superponer con la primera. B) Siembra por superficie o en masa Es un método cuantitativo de aislamiento y recuento de las bacterias presentes en una muestra problema. El objetivo es conseguir colonias aisladas. un número cada vez menor de microorganismos sobre un medio sólido en placa de Petri. sin que toque ninguna superficie. Se basa en arrastrar.48 h. Incubar 24 . 3. .1. Para siembra en estría. Tipo de análisis 3. 6. los microorganismos quedarán aislados en las últimas estrías y se podrán observar colonias aisladas. haciendo un zig-zag hasta que se agote el inóculo. a la Tª adecuada. 2. Los tubos y placas deben marcarse con rotulador de vidrio: 1. con el asa de Kolle. Se basa en repartir homogéneamente. Concentración del inóculo En las placas de Petri dichas anotaciones se realizan de forma circular en el borde de la tapa.2) 5.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 30 llama de un mechero. 8. Tomar una alícuota del cultivo (líquido o sólido) con el asa de siembra. de la muestra. Fig. Código de identificación 2. se espera un tiempo hasta que se enfríe al lado de la llama.2 Metodología 1. Incubar en posición invertida para que las gotas de agua de condensación no se depositen encima de las colonias. hacer una serie de estrías paralelas y no superpuestas hasta que se agote el asa (fig. alícuotas de la muestra por toda la superficie del medio de cultivo. Para siembra escocesa. Si la siembra ha sido correcta. o ml.poner el asa suavemente sobre el agar. Antes de sembrar. Siembra escocesa. 4.

4. Tras solidificar añadir una nueva capa del mismo medio de cultivo (aproximadamente 10 ml por placa). Esperar unos 10 minutos hasta que solidifique. 2. 3. 4. a la temperatura indicada. Siembra en doble capa Procedimiento: 1. Incubar durante 24 . Agitar suavemente deslizando la placa de Petri encima de la mesa. Procedimiento: 1. 8. de la muestra o de las diluciones correspondientes en placas de Petri con agar nutritivo. Asa Digralsky Procedimiento: 1. 4. para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. Repartir el inóculo por toda la superficie con movimientos de rotación hasta que el líquido quede totalmente absorbido.2 SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO a) Siembra por estría Es el método utilizado para el mantenimiento de cultivos puros y para determinar algunas características fisiológicas de los microorganismos. a la temperatura indicada. 6. Sembrar 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. Añadir 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. Homogeneizar las placas con suavidad. B. fig.1 ml. Esterilizar el asa Digralsky.2. 2. 4.48 h. Incubar durante 24 . 6. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (microorganismos anaerobios). Incubar las placas invertidas.1. B. a la temperatura indicada. 4. en un movimiento en forma de ocho por espacio de dos minutos. del agar nutritivo en forma líquida atemperado a 45-47 ºC.48 h.3. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa . Incubar durante 24 . Añadir entre 15-20 ml. Dejar solidificar el agar. Efectuar el recuento de las colonias sobre la superficie del medio (microorganismos aerobios). Siembra en profundidad ("pouring"). para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. 3. para mezclar el medio y la alícuota. No es necesario homogeneizar. 9.3 . Añadir 15-20 ml de agar nutritivo líquido a 45-47 ºC. 5. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (aerobios y anaerobios facultativos). Añadir 0.48 h. 7. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. 3. Siembra homogénea en superficie. 5.1. 5.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 31 B. 2. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas. 6.

2.1. 4. Abrir el tubo con el medio de cultivo estéril y flamear la boca. Homogeneizar la suspensión. nº de células 2. masa celular 3. MÉTODOS DE RECUENTO MICROBIANOS Determinación de: 1. El medio se inocula introduciendo verticalmente en el centro del tubo. 4.3. cargado con el inóculo. Esterilizar el asa de Kolle. Cargar el asa con el cultivo que se quiere transferir.3 fig. Flamear el tubo y ponerle el tapón. 3. Esterilizar el asa. 7. 5. Los tubos o frascos con el medio de agar se dejan solidificar en posición vertical o inclinada. 4. Incubar a la temperatura adecuada. 6. Introducir el asa de Kolle cargada con el inóculo dentro del medio y agitarla para que las bacterias queden resuspendidas.3 SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO Medio utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos o para la obtención de cultivos. absorbancia) . Se basa en inocular. masa microbiana procedente de un cultivo (sólido o líquido) a un medio líquido. densidad bacteriana o magnitud proporcional (concentración. Fig.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 32 b) Siembra en picadura Es un método utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos. Procedimiento: 1.2. 4. mediante el asa de Kolle. un alambre largo y recto. 4.

Determinación de nitrógeno o carbono. Esta técnica de recuento nos permite conocer el número de microorganismos viables en una determinada muestra. c.. . Masa húmeda (por centrifugación) II. Masa seca (centrifugación y secado) 1. d. Banco dilucionesi. Centrifugación: I. La siembra en profundidad ("pouring"). nº de células viables (banco de diluciones) Cámara de recuento Método Breed Contador electrónico (se basa en la pérdida de conductividad de un electrolito cuando pasa una célula bacteriana a través de un orificio estrecho) e. por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos. Magnitudes metabólicas (captación de O2. a. La siembra en placa en superficie es idónea para aerobios. 2. Para ello se realizan diluciones seriadas. se utiliza principalmente para el recuento de hongos y en análisis de microorganismos mesófilos aerobios totales en aguas y alimentos. producción de CO2. Permite tomar las colonias para su resiembra en otro medio o para su posterior identificación. Métodos indirectos: 1. Turbidimetría / Nefelometría. La viabilidad en Microbiología se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio sólido formando una colonia..4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 33 Métodos de determinación nº células: a. Métodos directos: 1. que posteriormente se siembran en placas con medio de cultivo. titulaciones volumétricas. ácido). Para la medida se pueden emplear métodos electroquímicos. Filtros de membrana Métodos de determinación masa bacteriana: a.2. Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un número muy elevado de microorganismos.1 RECUENTO VIABLES . b.) 4..

ufc/ml. etc. A medida que se van contando se marcan con un rotulador. En caso de encontrarse superpuestas.4 Procedimiento 1.10-3. Lectura y recuento. 4. Repetir la operación con las sucesivas diluciones. Para obtener el número de organismos por unidad de peso o volumen de la muestra analizada.300 colonias. Para realizar un recuento correcto. Se agita bien el tubo (-1 ) y se toma 1 ml. Agitar la muestra inicial para homogeneizarla. 10-2. Tomar 1 ml de la muestra problema con la pipeta y depositarlo en un tubo de Ringer con 9 ml de Ringer. 3. 10-5. = nº colonias · 1 1 dilucio ´n vol.10-6 (1). Sembrar en placas de agar a partir de las diversas diluciones. las colonias deben estar aisladas. esta placa no es válida para efectuar el recuento. 4. que se multiplica por la inversa de la dilución y por la inversa del volumen del inóculo sembrado en las placas. así no se deja de contar ninguna. 5. Esterilizar los tubos Ringer.gr. se cuentan las colonias de las placas que contienen entre 30 .10-4. (-2). se calcula la media aritmética. 7. marcado como dilución 10-1 (-1). ni se cuentan dos veces. (-3). ino ´culo . Colocar 9 ml de solución Ringer en cada uno de ellos. 2. Rotular los tubos de Ringer con el factor de dilución: 10-1. Hay que contar las colonias a contraluz. Incubar. que se depositara en el tubo de Ringer (-2). 6.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 34 Fig.

de manera que el número de campos es más grande cuanto más bajo es el de microorganismos. Número de bacterias / campo 0 . Procedimiento 1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 35 4.100 > 100 Número de campos que se han de contar 64 32 16 8 4 2 1 Si la distribución no es homogénea se ha de contar un mínimo de 10 campos y en total como mínimo 300 células. células/ml. 6. hay que aplicar la fórmula siguiente: (N) núm. 4.2 RECUENTO DIRECTO A) MÉTODO BREED Por la técnica de método directo se coloca un volumen conocido de una suspensión bacteriana sobre un área conocida del portaobjetos. = ´lulas/campo ) x nu (media ce ´m .25 26 . campos totales en cm2 = 1 r 2 (determinar "r" con cámara de recuento) .3 4 .6 7 .2. 2. Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente. A continuación contar el número de microorganismos en varios campos. Dibujar en él un cuadrado de 1 cm por lado. Utilizando un objetivo de inmersión se inspeccionan los campos microscópicos y se calcula el valor medio del número de bacterias que hay en cada campo. 5. 3. lavar con agua del grifo. En el método Breed se extiende una muestra sobre un recuadro de un centímetro marcado sobre el porta y se tiñe. secar y observar al microscopio con objetivo de 40-60 aumentos). Dar la vuelta al porta y observamos una superficie bien delimitada de 1 cm2. Desengrasar con cuidado un portaobjetos. campos totales en 1 cm 2 volumen (ml) núm. Cubrir la extensión con azul de metileno durante 1 min. se puede aplicar la siguiente tabla. Si las células están homogéneamente repartidas. Para obtener el nº de células/ml de la muestra problema.12 13 .50 51 . Colocar en la superficie y extender en los límites del cuadrado 1 gota de micropipeta (16 l) de inóculo.

Las bacterias móviles son difíciles de contar por este método y como pasa con otros métodos microscópicos. Una cavidad de volumen conocido está excavado en la superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un área conocida.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 36 B) CAMARA DE RECUENTO Para los recuentos microscópicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseñado llamado Cámara de Petroff-Hausser. La principal ventaja es que no se necesita ningún tiempo de incubación. Además se requiere una concentración bastante alta de bacterias. las células muertas son demasiado similares a las vivas que se quieren contar. de unos 10 millones de bacterias por ml. Se calcula la media del nº de bacterias de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que proporciona el recuento por mililitro. 1 Técnica de llenado de cámara de recuento: Tomar el inóculo con una pipeta Pasteur y acercarla al borde del cubre permitiendo que entre la muestra por capilaridad a la cámara de recuento. Su uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal. Observar con objetivo x60 aumentos. . La cavidad se llena1 con la suspensión bacteriana.

obtenemos una curva en la cual se diferencian cuatro periodos diferentes: 1. . Estas variaciones dependen de factores como el agotamiento de nutrientes. Pero en este tiempo las células no se encuentran inactivas.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 37 4.3 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS. ribosomas y enzimas. pH. El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo el incremento del número de células. temperatura. o si ha cambiado de medio de cultivo. Depende de factores como: a. La velocidad de multiplicación varía de una especie a otra y depende de las condiciones de cultivo (nutrientes. etc. Fase de latencia Periodo de tiempo entre inoculación y la tasa de crecimiento máxima. Para unas condiciones determinadas. debe adaptarse primero a las nuevas condiciones de crecimiento: síntesis de RNA (aumenta entre 8-12 veces). la acumulación de sustancias tóxicas. particularmente de síntesis enzimática. Si el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria. Medio de cultivo Durante algún tiempo hay poco o ningún cambio en el número de células debido a que no se reproducen inmediatamente en medio nuevo. Edad cultivo b. Si se representan gráficamente estas variaciones en función del tiempo. La población microbiana presenta una intensa actividad metabólica.). Este periodo se llama fase de latencia y puede durar desde una hora a varios días. el crecimiento no es uniforme sino que varía a lo largo del tiempo. etc.

Bacterias del suelo 60-150' . Fase estacionaria Si el crecimiento exponencial continua sin control da lugar a un número de células asombrosamente altos. densidad. Fase logarítmica Finalmente las células empiezan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento exponencial. Es también cuando son metabólicamente activas. Este periodo se llama fase estacionaria. Fase idónea para estudiar influencia de factores ambientales (pH.. Las actividades metabólicas de las células supervivientes también se hacen más lentas en esta fase. Por otra parte durante la fase logarítmica del crecimiento. etc) o capacidad de usar diversos sustratos nutritivos. Enterobacterias 15-30'. Ello implica la fiabilidad de las técnicas de medición indirecta.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 38 Cerca del final de la fase de latencia algunas células doblarán o triplicarán su tamaño. Como el tiempo de duplicación es constante la representación logarítmica del crecimiento durante esta fase exponencial es una linea recta. Nitrosomas y Nitrobacter 5-10 h. Pero esto no ocurre. . preparándose para la reproducción. Existe aparentemente un tiempo de generación mínimo característico determinado genéticamente en cada especie (TD).. La reproducción celular adquiere una actividad máxima durante este periodo y el tiempo de generación llega a un mínimo constante. los microorganismos son mas sensibles de lo normal a las condiciones adversas. aireación. Durante esta fase logarítmica las células empiezan a mostrar sus características visibles: Morfología. color. Finalmente la velocidad del crecimiento disminuye el número de células muertas compensa al de células vivas y la población se estabiliza. temperatura. El tamaño celular y el contenido en proteínas es constante en la fase logarítmica (células estándar).

ej.3. Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunas debido a: producción de ácidos (e. que es frecuentemente proporcional al número de células. En fase estacionaria sólo las células muy sensibles mueren rápidamente. Fase de muerte Normalmente el número de células muertas supera al de células formadas y la población entra en la fase de muerte o fase de descenso logarítmico.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 39 Las razones del cese del crecimiento exponencial son siempre claras. cámara de recuento). otros la masa total de la población. sintetizar enzimas En muchos procesos microbianos la fase estacionaria es la fase de producción de un metabolitosecundario (p. Idiofase: Fase de producción Aunque las células no crezcan durante la idiofase. después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total.coli. descomponer parte de los ribosomas c.1 MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO. se añaden sustratos que actúan como precursores del producto objeto de la producción. . lactobacilos) autolisis (por la acción de los propios enzimas) 4. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de muestra o en un gramo de material sólido. Debido a que las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayoría de métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas. Algunos métodos miden el número de células (Breed. Trofofase: Fase de nutrición o crecimiento b. utilizar materiales de reserva b. las células puede aún: a. Causas poco conocidas en general. Disminución de presión parcial de O2. Se acumulan productos de degradación tóxicos par las células y se agotan ciertos nutrientes esenciales. En Biotecnología: a. Penicilina). También tienen lugar variaciones del pH y de temperatura.

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 40 A) TURBIDIMETRÍA En algunos tipos de trabajos experimentales. dentro de un rango. para que la sustancia sea suficientemente turbia como para ser medida por un espectrofotómetro. absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. siendo inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Por tanto la turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias. la medida de la turbidez (turbidimetría) es un método muy práctico para seguir el crecimiento bacteriano. la luz absorbida por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. La turbidimetría mide la cantidad de luz transmitida por la suspensión. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. Tamaño y peso molecular de las partículas Longitud de onda de la luz incidente Longitud detector-cubeta Concentración partículas Si las lecturas de absorbancia se comparan con el recuento en placa del mismo cultivo esta correlación se puede utilizar en estimaciones futuras del número de bacterias hechas directamente por turbidimetría. La dispersión depende de: 1. Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales. ESPECTROFOTÓMETRO El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica.. 3. ya que. Para que sean visibles las primeras trazas de turbidez es necesario mas de un millón de células por ml.20 millones por ml. 4. Por este procedimiento se puede estimar el número de bacterias en el cultivo. 2. . y entre 10 .

Luz monocromática ( única). Prismas o redes de difracción (espectro fotómetro) Cubeta.log % de Transmitancia Fuente de luz. Convierte la energía luminosa que recibe en energía eléctrica. Seleccionar la longitud de onda adecuada. Sistema de registro Convierte señales eléctricas del detector en señales registradas de lectura. b. para estabilizar componentes eléctricos y fuente de luz. (A = a·b·c). Filtros de vidrios coloreados que absorben las radiaciones no deseadas. a = coeficiente de absorción c = concentración del absorbente . ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión (Ley de Beer2) La relación entre Transmitancia (T) y Absorbancia (A) se expresa matemáticamente por: Io -----> 7 -------> I s T= Is I0 %T= Para %T = 0 Is I0 · 100 => Absorbancia = ∞ Para %T = 100 => Absorbancia = 0. La selección se realiza mediante: a. antes. siendo: A = absorbancia b = longitud del paso de la luz en cm. Absorbancia = 2 . 3. Establece la relación entre el grado de absorbancia de una disolución y otras dos variables: La concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz recorre a través de la solución. 2. Según esta ley la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz. Conectar el aparato 15 m.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 41 En general. sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia). el crecimiento bacteriano no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia). Ajustar la absorbancia a 0 con el blanco (medio de cultivo empleado) 2 Ley de Beer. Recipiente donde se coloca la muestra (l = 1 cm en general) Detector. Se obtiene seleccionando una onda de una fuente de luz policromática. Fases de utilización (con aparato calibrado) 1.

en la cual se coloca en ordenadas el logaritmo del número de células.048 211 11 240 4. . Por ello se prefiere la representación semilogarítmica. Si se ha partido inicialmente de 1 célula. tendríamos: Tiempo en min. En este tipo de representación se obtiene una recta. La pendiente de dicha recta refleja la velocidad del crecimiento celular. Siendo N = No ·2n . Dicha curva no es apropiada para expresar un número grande de divisiones celulares. celulares 0 1 20 0 20 2 21 1 40 4 22 2 60 8 23 3 80 16 24 4 100 32 25 5 120 64 26 6 140 128 27 7 160 256 28 8 180 512 29 9 200 1.096 212 12 Se produce un crecimiento exponencial. El crecimiento exponencial se caracteriza por una relación lineal entre el tiempo y el logaritmo del número de células. Nº de bacterias (N) N = 2n n = nº divis. se reconocerán únicamente. se obtiene una curva exponencial. porque según que escala escojamos . se habla por tanto de crecimiento logarítmico. o bien las primeras divisiones. o bien las últimas. si aplicamos logaritmos log N = log No + n·log 2 y n= log N−log N 0 log 2 La tasa de crecimiento (v = número de divisiones celulares/hora) será: v= n t = log N−log N 0 (t−t 0 )$log 2 El tiempo necesario para un ciclo de división es el tiempo de generación: g= t n = 1 v En la representación gráfica del crecimiento bacteriano.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 42 CURVA DE CRECIMIENTO Suponiendo que un cultivo bacteriano crece a razón de una división cada 20 min.024 210 10 220 2.

Tiempo 0 30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240' 2 Absorbancia 0.150' (fase exponencial del crecimiento). absorción).587 0.5 Absorbancias 1 Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en el tramo: 60' .750 1.180 0. Td (min) Tasa específica de crecimiento (h-1) .360 0.5 0 0 50 100 150 200 250 300 tiempos (min) Tiempo de duplicación.850 1.356 1.104 0.990 1. las absorciones siguientes medidas en un espectrofotómetro de un cultivo de E.Coli. La tasa de crecimiento (pendiente de la recta) El tiempo de duplicación es td = ln 2  = ln x t −ln x o (t−t o ) ================================================================== Ejercicio: Cálculo de los parámetros (Td) y () Microorganismo utilizado Escherichia coli Medio de cultivo utilizado TSB Longitud de onda 540 nm Anota en la tabla siguiente los resultados obtenidos: Se utilizará como datos de cálculo. 0.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 43 Cálculo del Tiempo de duplicación (Td) y la Tasa específica de crecimiento () En los cálculos se toma como base la densidad bacteriana (x) o alguna magnitud proporcional a ella (número de células.852 1.

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 44 TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en placa) TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en tubo) .

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 45 PRÁCTICA 4. 10.(A.). completando los cuadros correspondientes. Hacer un esquema con la metodología seguida. Describe las morfologías coloniales observadas (A. Escherichia coli. G:2 Sabouraud CAF. "C". . 4. Proseguir con el procedimiento B.. ( A. Marcar placas Petri. Hacer un esquema del banco de diluciones y de las siembras que has realizado.. Preparar y esterilizar los medios sólidos: Mc Conkey. Efectuar lectura de los resultados obtenidos. Preparar 2 placas (xG) de agar nutritivo Preparar 4 tubos con 9 ml.Sabouraud a 27 ºC) 9.. Sembrar en superficie 0. tantos sectores como microorganismos se tengan que sembrar./mL en la muestra con los resultados obtenidos. Sabouraud. 5.C. en uno de los sectores. Esterilizar. Sembrar Saccharomyces cerevisiae en un sector del A. Preparar un banco de diluciones decimales (-1. 10. 14. Incubar 48 h. 7. 11. Sabouraud 1 sector más) 4. A) Aislamiento por dilución 1. ..1 ml. Sabouraud 8. en agar Mc Conkey. -4) con la muestra disponible. Enfriar. 12. 2. -2. G2: -2. En otra placa de Agar Levine realizar una siembra escocesa a partir de un cultivo puro de Enterobacter cloacae.1) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Muestra problema: Disolución ringer . 6. 2. 5. -3. resembrar en siembra escocesa en medio agar Levine (xG). 15. 3. -4).1 y sembrarla en estría por agotamiento. B) Aislamiento por agotamiento en placa 1. Rotular en la parte posterior de cada placa (excepto Levine). Evitar que se superpongan las estrías. Realizar el cálculo del nº de U. Cuestionarios. Conkey. C. 3. Manitol Salt. Repetir la operación con los agares Manitol Salt. A partir de una colonia que haya dado positivo en el Agar Mc.. 13. . Observar los resultados obtenidos. de cada una de las diluciones con asa Digralsky en placas con agar nutritivo (G1: -1. 8. B. de dº Ringer 3. Obtener conclusiones. Levine. Distribuir los medios. Proceder de igual manera con las colonias del tipo "B" . a 37 ºC.F. 7. Staphylococcus epidermidis. Consultar la composición y características de los medios de cultivo que se emplean en esta práctica e indicar que función cumplirá cada uno de ellos. 6. Incubar las placas en la estufa de cultivos a 37 ºC durante 48 h. Completar la tablas de observaciones. Incubar 24-48 h a 37 ºC. 9. -3. Tomar del agar nutritivo una colonia del tipo "A" obtenida en el protocolo nº 4.

y 180 minutos (longitud de onda aconsejada: 540 nm). Agitar suavemente el cultivo con periodicidad 6. Dibujar una curva de crecimiento. Turbidimetría. En 1 erlenmeyer de 100 ml. 4. 4. Resuspender 2 g de levadura en 100 ml de solución salina. Incubar a 22 ºC durante 7 días. A)Crecimiento población Saccharomyces cerevisiae. preparar una de solución de 25 ml de vino blanco (sin tratar).2 g de azúcar. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos: 0. en papel milimétrico.2 Crecimiento población microorganismos. Preparar un tubo inclinado con agar nutritivo. Sembrar en estría un inóculo de E. Inóculo. 30. Cámara de recuento. con agitación 200 rpm (si disponible) 6. Ajustar el espectrofotómetro a 0 % de absorbancia con un tubo de TSB estéril antes de cada medida (blanco). Tomar 1 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 100 ml de TSB estéril. Método Breed. Incubar 48 h.. 7. colocar 50 ml de solución nutritiva. Cálculo parámetros (v) y (g). Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en fase exponencial del crecimiento. Incubar el matraz en la estufa de cultivos a 37 ºC. del inóculo. 1. Añadir solución salina estéril al tubo inclinado de E. Disolución nutritiva: En un frasco de 250 ml. preparar diluciones decimales -1. Turbidimetría.. colocando en el eje de abscisas los valores del tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia. -2. 7. 3. Sembrar 1 ml de inóculo de la dilucion (-2).S. 2. Hacer un recuento de levaduras en cada sesión de prácticas. 2. . Calcular la tasa de crecimiento v (número de dividiones celulares por día) y el tiempo de generación g (en horas).. a 37 ºC 3. mediante: a. 1. b. B) Curva crecimiento Escherichia coli. 5. en 25 ml de agua destilada. En dos tubos de ensayo con S... con los datos obtenidos.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 46 PRACTICA 4. coli. 8. 5. y añadir 1. 60. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 ml) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación.

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