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CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

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4. SIEMBRA Y AISLAMIENTO MÉTODOS DE RECUENTO

DE

MICROORGANISMOS.

4.1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Para trasladar microorganismos de un medio de cultivo a otro se utilizan micropipetas, pipetas graduadas, asas de siembra y asas de siembra calibradas. a. El asa de Kolle consta de un mango aislante y de un filamento de platino o de niquelcromo (nicrom) recto o acabado en un anillo. Esta asa se esteriliza por incineración a la llama del mechero, dejándola enfriar sin que toque ninguna superficie antes de la siembra. Las asas calibradas sirven para trasladar alícuotas de un volumen pequeño de muestra (p.ej. 0,01 ml o 0,001 ml). El hilo de siembra (asa de picadura) se emplea para sembrar por picadura en el fondo de un tubo conteniendo agar, el asa redondeada (asa de Kolle) para sembrar por estría o en medios líquidos. b. Asa Digralsky, son varillas de vidrio con una rama horizontal. c. Las pipetas graduadas se utilizan para trasladar alícuotas de determinados volúmenes de muestra (0,1-100 ml). Pueden ser de vidrio o de plástico. d. Las micropipetas constan de un mango y de una punta. Las puntas son de PVC de diferentes medidas y colores dependiendo del volumen de muestra; se esterilizan en el autoclave.

Nunca dejar material contaminado sobre la mesa del laboratorio
(asas de siembra, tapones de cualquier tipo) TÉCNICA DE SIEMBRA Se toma el tubo o erlenmeyer que contiene el inóculo con la mano izquierda (fig. 4.1) y con los 4º y 5º dedos de la mano derecha se estira o desenrosca el tapón. Con los dedos 1º y 2º se coge el material para trasladar la muestra (asa de Kolle, pipeta...) antes de quitar el tapón.

Fig. 4.1 Es muy importante flamear al mechero la boca de los tubos o erlenmeyers y el extremo de las pipetas antes de inocular las muestras. Las asas de Digralsky sirven para extender homogéneamente una alícuota sembrada sobre un medio sólido. Para esterilizarlas, se sumergen en un recipiente con alcohol y se pasan por la

48 h. Esterilizar el asa de siembra. 6. alícuotas de la muestra por toda la superficie del medio de cultivo.1 SIEMBRA EN PLACA A) Siembra en estría o por agotamiento. .2) 5. Se basa en repartir homogéneamente. o ml. los microorganismos quedarán aislados en las últimas estrías y se podrán observar colonias aisladas. 8. 3. 4. Para siembra en estría. haciendo un zig-zag hasta que se agote el inóculo. B) Siembra por superficie o en masa Es un método cuantitativo de aislamiento y recuento de las bacterias presentes en una muestra problema. a la Tª adecuada. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso una o dos veces más. 4.1. Tomar una alícuota del cultivo (líquido o sólido) con el asa de siembra. Concentración del inóculo En las placas de Petri dichas anotaciones se realizan de forma circular en el borde de la tapa. se espera un tiempo hasta que se enfríe al lado de la llama.2 Metodología 1. 2. Hacer una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores de manera que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior. Este método no permite saber el número de microorganismos por gr. Los tubos y placas deben marcarse con rotulador de vidrio: 1. Incubar en posición invertida para que las gotas de agua de condensación no se depositen encima de las colonias. 4. Fig. 7. un número cada vez menor de microorganismos sobre un medio sólido en placa de Petri. Se basa en arrastrar. La última serie de estrías no se ha de superponer con la primera. Incubar 24 . Antes de sembrar. Si la siembra ha sido correcta. El objetivo es conseguir colonias aisladas. Código de identificación 2. Tipo de análisis 3. con el asa de Kolle.4. Para siembra escocesa. de la muestra.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 30 llama de un mechero.poner el asa suavemente sobre el agar. Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar al lado del mechero. Siembra escocesa. sin que toque ninguna superficie. hacer una serie de estrías paralelas y no superpuestas hasta que se agote el asa (fig.

Incubar las placas invertidas. fig. Añadir 0. 4. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (aerobios y anaerobios facultativos). Efectuar el recuento de las colonias en el medio. Siembra en profundidad ("pouring"). 5. B. B. 7. 3. 3. 2. Procedimiento: 1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 31 B. Siembra homogénea en superficie. Tras solidificar añadir una nueva capa del mismo medio de cultivo (aproximadamente 10 ml por placa). del agar nutritivo en forma líquida atemperado a 45-47 ºC. en un movimiento en forma de ocho por espacio de dos minutos. Siembra en doble capa Procedimiento: 1. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa . 9. de la muestra o de las diluciones correspondientes en placas de Petri con agar nutritivo. Dejar solidificar el agar. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas.3 .48 h.1. 6. 4.48 h.2 SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO a) Siembra por estría Es el método utilizado para el mantenimiento de cultivos puros y para determinar algunas características fisiológicas de los microorganismos. 8. No es necesario homogeneizar. para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (microorganismos anaerobios). Esperar 10 min y incubar las placas invertidas. Homogeneizar las placas con suavidad. Incubar durante 24 . 4. Sembrar 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. Agitar suavemente deslizando la placa de Petri encima de la mesa. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. 2.2. 4. a la temperatura indicada. a la temperatura indicada. 4. 5. Repartir el inóculo por toda la superficie con movimientos de rotación hasta que el líquido quede totalmente absorbido. Incubar durante 24 .1 ml.48 h. Incubar durante 24 . 6. 2. Añadir 15-20 ml de agar nutritivo líquido a 45-47 ºC. a la temperatura indicada. Asa Digralsky Procedimiento: 1. Añadir entre 15-20 ml. para mezclar el medio y la alícuota. Añadir 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri.1. 5.3. 6. 3. Esterilizar el asa Digralsky. Esperar unos 10 minutos hasta que solidifique. Efectuar el recuento de las colonias sobre la superficie del medio (microorganismos aerobios). para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio.

nº de células 2. 4. 4. Introducir el asa de Kolle cargada con el inóculo dentro del medio y agitarla para que las bacterias queden resuspendidas. Esterilizar el asa. Se basa en inocular.2.3 fig.3 SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO Medio utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos o para la obtención de cultivos. 7. Fig. densidad bacteriana o magnitud proporcional (concentración. 4. 5. 3. mediante el asa de Kolle. 6. cargado con el inóculo. un alambre largo y recto. Flamear el tubo y ponerle el tapón. Procedimiento: 1.1. masa celular 3. masa microbiana procedente de un cultivo (sólido o líquido) a un medio líquido. 4. Abrir el tubo con el medio de cultivo estéril y flamear la boca. MÉTODOS DE RECUENTO MICROBIANOS Determinación de: 1. Cargar el asa con el cultivo que se quiere transferir. Esterilizar el asa de Kolle.3.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 32 b) Siembra en picadura Es un método utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos. Los tubos o frascos con el medio de agar se dejan solidificar en posición vertical o inclinada. 4. 2. El medio se inocula introduciendo verticalmente en el centro del tubo. Homogeneizar la suspensión. absorbancia) . Incubar a la temperatura adecuada.

nº de células viables (banco de diluciones) Cámara de recuento Método Breed Contador electrónico (se basa en la pérdida de conductividad de un electrolito cuando pasa una célula bacteriana a través de un orificio estrecho) e. Magnitudes metabólicas (captación de O2. c... titulaciones volumétricas. Masa húmeda (por centrifugación) II. Centrifugación: I. La siembra en placa en superficie es idónea para aerobios. Métodos indirectos: 1. Permite tomar las colonias para su resiembra en otro medio o para su posterior identificación. Para la medida se pueden emplear métodos electroquímicos. Para ello se realizan diluciones seriadas. ácido). Banco dilucionesi. La viabilidad en Microbiología se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio sólido formando una colonia. La siembra en profundidad ("pouring").) 4. se utiliza principalmente para el recuento de hongos y en análisis de microorganismos mesófilos aerobios totales en aguas y alimentos. Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un número muy elevado de microorganismos. Determinación de nitrógeno o carbono. Turbidimetría / Nefelometría. a. por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 33 Métodos de determinación nº células: a. Filtros de membrana Métodos de determinación masa bacteriana: a. Métodos directos: 1. Esta técnica de recuento nos permite conocer el número de microorganismos viables en una determinada muestra. 2. d. . b. Masa seca (centrifugación y secado) 1. que posteriormente se siembran en placas con medio de cultivo. producción de CO2.2.1 RECUENTO VIABLES ..

esta placa no es válida para efectuar el recuento. 4. Tomar 1 ml de la muestra problema con la pipeta y depositarlo en un tubo de Ringer con 9 ml de Ringer. A medida que se van contando se marcan con un rotulador. ino ´culo . Para realizar un recuento correcto. Rotular los tubos de Ringer con el factor de dilución: 10-1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 34 Fig.300 colonias. (-2). así no se deja de contar ninguna. Para obtener el número de organismos por unidad de peso o volumen de la muestra analizada. 7. 10-5. Lectura y recuento. ni se cuentan dos veces. se calcula la media aritmética. las colonias deben estar aisladas. Agitar la muestra inicial para homogeneizarla. Incubar.10-4. que se multiplica por la inversa de la dilución y por la inversa del volumen del inóculo sembrado en las placas.gr.4 Procedimiento 1. = nº colonias · 1 1 dilucio ´n vol. 5. 2. 10-2. (-3). se cuentan las colonias de las placas que contienen entre 30 . 3. En caso de encontrarse superpuestas. Repetir la operación con las sucesivas diluciones.10-6 (1). Esterilizar los tubos Ringer. 6. Hay que contar las colonias a contraluz. etc. ufc/ml. Colocar 9 ml de solución Ringer en cada uno de ellos.10-3. Se agita bien el tubo (-1 ) y se toma 1 ml. Sembrar en placas de agar a partir de las diversas diluciones. marcado como dilución 10-1 (-1). 4. que se depositara en el tubo de Ringer (-2).

4. se puede aplicar la siguiente tabla.25 26 . Número de bacterias / campo 0 . Colocar en la superficie y extender en los límites del cuadrado 1 gota de micropipeta (16 l) de inóculo. Si las células están homogéneamente repartidas. Para obtener el nº de células/ml de la muestra problema. Dar la vuelta al porta y observamos una superficie bien delimitada de 1 cm2. de manera que el número de campos es más grande cuanto más bajo es el de microorganismos.100 > 100 Número de campos que se han de contar 64 32 16 8 4 2 1 Si la distribución no es homogénea se ha de contar un mínimo de 10 campos y en total como mínimo 300 células. 2.2 RECUENTO DIRECTO A) MÉTODO BREED Por la técnica de método directo se coloca un volumen conocido de una suspensión bacteriana sobre un área conocida del portaobjetos. 3.2. Desengrasar con cuidado un portaobjetos. En el método Breed se extiende una muestra sobre un recuadro de un centímetro marcado sobre el porta y se tiñe. 6.50 51 . campos totales en cm2 = 1 r 2 (determinar "r" con cámara de recuento) . células/ml. campos totales en 1 cm 2 volumen (ml) núm.6 7 . secar y observar al microscopio con objetivo de 40-60 aumentos). A continuación contar el número de microorganismos en varios campos. Cubrir la extensión con azul de metileno durante 1 min. 5.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 35 4.3 4 . hay que aplicar la fórmula siguiente: (N) núm. = ´lulas/campo ) x nu (media ce ´m . Utilizando un objetivo de inmersión se inspeccionan los campos microscópicos y se calcula el valor medio del número de bacterias que hay en cada campo. lavar con agua del grifo. Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente. Procedimiento 1. Dibujar en él un cuadrado de 1 cm por lado.12 13 .

1 Técnica de llenado de cámara de recuento: Tomar el inóculo con una pipeta Pasteur y acercarla al borde del cubre permitiendo que entre la muestra por capilaridad a la cámara de recuento. . las células muertas son demasiado similares a las vivas que se quieren contar.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 36 B) CAMARA DE RECUENTO Para los recuentos microscópicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseñado llamado Cámara de Petroff-Hausser. La cavidad se llena1 con la suspensión bacteriana. Las bacterias móviles son difíciles de contar por este método y como pasa con otros métodos microscópicos. Se calcula la media del nº de bacterias de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que proporciona el recuento por mililitro. La principal ventaja es que no se necesita ningún tiempo de incubación. de unos 10 millones de bacterias por ml. Su uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal. Además se requiere una concentración bastante alta de bacterias. Observar con objetivo x60 aumentos. Una cavidad de volumen conocido está excavado en la superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un área conocida.

La velocidad de multiplicación varía de una especie a otra y depende de las condiciones de cultivo (nutrientes.3 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS. el crecimiento no es uniforme sino que varía a lo largo del tiempo. Pero en este tiempo las células no se encuentran inactivas. Para unas condiciones determinadas. etc. Este periodo se llama fase de latencia y puede durar desde una hora a varios días. Si se representan gráficamente estas variaciones en función del tiempo. Fase de latencia Periodo de tiempo entre inoculación y la tasa de crecimiento máxima. Estas variaciones dependen de factores como el agotamiento de nutrientes. El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo el incremento del número de células. pH. Depende de factores como: a. La población microbiana presenta una intensa actividad metabólica.). ribosomas y enzimas. obtenemos una curva en la cual se diferencian cuatro periodos diferentes: 1. etc. Edad cultivo b. o si ha cambiado de medio de cultivo. particularmente de síntesis enzimática. . debe adaptarse primero a las nuevas condiciones de crecimiento: síntesis de RNA (aumenta entre 8-12 veces). Medio de cultivo Durante algún tiempo hay poco o ningún cambio en el número de células debido a que no se reproducen inmediatamente en medio nuevo. la acumulación de sustancias tóxicas. Si el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 37 4. temperatura.

aireación. Es también cuando son metabólicamente activas. temperatura. color. Finalmente la velocidad del crecimiento disminuye el número de células muertas compensa al de células vivas y la población se estabiliza. los microorganismos son mas sensibles de lo normal a las condiciones adversas. Fase logarítmica Finalmente las células empiezan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento exponencial. Como el tiempo de duplicación es constante la representación logarítmica del crecimiento durante esta fase exponencial es una linea recta. Enterobacterias 15-30'. Las actividades metabólicas de las células supervivientes también se hacen más lentas en esta fase. Nitrosomas y Nitrobacter 5-10 h. Fase idónea para estudiar influencia de factores ambientales (pH. Durante esta fase logarítmica las células empiezan a mostrar sus características visibles: Morfología. densidad.. Pero esto no ocurre. El tamaño celular y el contenido en proteínas es constante en la fase logarítmica (células estándar). Por otra parte durante la fase logarítmica del crecimiento.. Ello implica la fiabilidad de las técnicas de medición indirecta.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 38 Cerca del final de la fase de latencia algunas células doblarán o triplicarán su tamaño. La reproducción celular adquiere una actividad máxima durante este periodo y el tiempo de generación llega a un mínimo constante. Bacterias del suelo 60-150' . Fase estacionaria Si el crecimiento exponencial continua sin control da lugar a un número de células asombrosamente altos. . Existe aparentemente un tiempo de generación mínimo característico determinado genéticamente en cada especie (TD). etc) o capacidad de usar diversos sustratos nutritivos. preparándose para la reproducción. Este periodo se llama fase estacionaria.

se añaden sustratos que actúan como precursores del producto objeto de la producción.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 39 Las razones del cese del crecimiento exponencial son siempre claras. En Biotecnología: a. Algunas debido a: producción de ácidos (e. Causas poco conocidas en general. Algunos métodos miden el número de células (Breed. Idiofase: Fase de producción Aunque las células no crezcan durante la idiofase. cámara de recuento). después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. descomponer parte de los ribosomas c. utilizar materiales de reserva b. Se acumulan productos de degradación tóxicos par las células y se agotan ciertos nutrientes esenciales.ej. las células puede aún: a.1 MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO. lactobacilos) autolisis (por la acción de los propios enzimas) 4. . otros la masa total de la población. Fase de muerte Normalmente el número de células muertas supera al de células formadas y la población entra en la fase de muerte o fase de descenso logarítmico.coli. sintetizar enzimas En muchos procesos microbianos la fase estacionaria es la fase de producción de un metabolitosecundario (p. Debido a que las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayoría de métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas. Disminución de presión parcial de O2.3. Penicilina). Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de muestra o en un gramo de material sólido. que es frecuentemente proporcional al número de células. También tienen lugar variaciones del pH y de temperatura. En fase estacionaria sólo las células muy sensibles mueren rápidamente. Trofofase: Fase de nutrición o crecimiento b. Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano.

. la luz absorbida por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetría mide la cantidad de luz transmitida por la suspensión.20 millones por ml. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. 2.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 40 A) TURBIDIMETRÍA En algunos tipos de trabajos experimentales. 4. la medida de la turbidez (turbidimetría) es un método muy práctico para seguir el crecimiento bacteriano. Tamaño y peso molecular de las partículas Longitud de onda de la luz incidente Longitud detector-cubeta Concentración partículas Si las lecturas de absorbancia se comparan con el recuento en placa del mismo cultivo esta correlación se puede utilizar en estimaciones futuras del número de bacterias hechas directamente por turbidimetría. La dispersión depende de: 1. ya que. Por tanto la turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias. y entre 10 . para que la sustancia sea suficientemente turbia como para ser medida por un espectrofotómetro. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica. ESPECTROFOTÓMETRO El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Para que sean visibles las primeras trazas de turbidez es necesario mas de un millón de células por ml. 3. siendo inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. dentro de un rango. Por este procedimiento se puede estimar el número de bacterias en el cultivo. Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales..

a = coeficiente de absorción c = concentración del absorbente . Ajustar la absorbancia a 0 con el blanco (medio de cultivo empleado) 2 Ley de Beer. La selección se realiza mediante: a. Fases de utilización (con aparato calibrado) 1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 41 En general. Filtros de vidrios coloreados que absorben las radiaciones no deseadas. Establece la relación entre el grado de absorbancia de una disolución y otras dos variables: La concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz recorre a través de la solución. Conectar el aparato 15 m.log % de Transmitancia Fuente de luz. (A = a·b·c). Sistema de registro Convierte señales eléctricas del detector en señales registradas de lectura. para estabilizar componentes eléctricos y fuente de luz. b. Luz monocromática ( única). Seleccionar la longitud de onda adecuada. el crecimiento bacteriano no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia). 2. sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia). Se obtiene seleccionando una onda de una fuente de luz policromática. Según esta ley la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz. siendo: A = absorbancia b = longitud del paso de la luz en cm. Convierte la energía luminosa que recibe en energía eléctrica. Absorbancia = 2 . Recipiente donde se coloca la muestra (l = 1 cm en general) Detector. 3. Prismas o redes de difracción (espectro fotómetro) Cubeta. antes. ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión (Ley de Beer2) La relación entre Transmitancia (T) y Absorbancia (A) se expresa matemáticamente por: Io -----> 7 -------> I s T= Is I0 %T= Para %T = 0 Is I0 · 100 => Absorbancia = ∞ Para %T = 100 => Absorbancia = 0.

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 42 CURVA DE CRECIMIENTO Suponiendo que un cultivo bacteriano crece a razón de una división cada 20 min. Siendo N = No ·2n . Por ello se prefiere la representación semilogarítmica. se reconocerán únicamente. o bien las primeras divisiones. se obtiene una curva exponencial. celulares 0 1 20 0 20 2 21 1 40 4 22 2 60 8 23 3 80 16 24 4 100 32 25 5 120 64 26 6 140 128 27 7 160 256 28 8 180 512 29 9 200 1.096 212 12 Se produce un crecimiento exponencial. si aplicamos logaritmos log N = log No + n·log 2 y n= log N−log N 0 log 2 La tasa de crecimiento (v = número de divisiones celulares/hora) será: v= n t = log N−log N 0 (t−t 0 )$log 2 El tiempo necesario para un ciclo de división es el tiempo de generación: g= t n = 1 v En la representación gráfica del crecimiento bacteriano. se habla por tanto de crecimiento logarítmico. Dicha curva no es apropiada para expresar un número grande de divisiones celulares.024 210 10 220 2. en la cual se coloca en ordenadas el logaritmo del número de células. Nº de bacterias (N) N = 2n n = nº divis. . Si se ha partido inicialmente de 1 célula. tendríamos: Tiempo en min. porque según que escala escojamos . En este tipo de representación se obtiene una recta. o bien las últimas. La pendiente de dicha recta refleja la velocidad del crecimiento celular. El crecimiento exponencial se caracteriza por una relación lineal entre el tiempo y el logaritmo del número de células.048 211 11 240 4.

Coli.180 0.852 1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 43 Cálculo del Tiempo de duplicación (Td) y la Tasa específica de crecimiento () En los cálculos se toma como base la densidad bacteriana (x) o alguna magnitud proporcional a ella (número de células.750 1.360 0.990 1.5 Absorbancias 1 Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en el tramo: 60' .150' (fase exponencial del crecimiento). absorción). Tiempo 0 30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240' 2 Absorbancia 0.5 0 0 50 100 150 200 250 300 tiempos (min) Tiempo de duplicación.356 1. Td (min) Tasa específica de crecimiento (h-1) . La tasa de crecimiento (pendiente de la recta) El tiempo de duplicación es td = ln 2  = ln x t −ln x o (t−t o ) ================================================================== Ejercicio: Cálculo de los parámetros (Td) y () Microorganismo utilizado Escherichia coli Medio de cultivo utilizado TSB Longitud de onda 540 nm Anota en la tabla siguiente los resultados obtenidos: Se utilizará como datos de cálculo.587 0.104 0.850 1. las absorciones siguientes medidas en un espectrofotómetro de un cultivo de E. 0.

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 44 TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en placa) TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en tubo) .

1 y sembrarla en estría por agotamiento.(A. 2. -4). A) Aislamiento por dilución 1. 3.. -2. tantos sectores como microorganismos se tengan que sembrar.1 ml.. Escherichia coli. C. 5. Observar los resultados obtenidos. Realizar el cálculo del nº de U. Proceder de igual manera con las colonias del tipo "B" . Sembrar en superficie 0. "C". 15. Conkey. Preparar un banco de diluciones decimales (-1. de dº Ringer 3. ( A. Sabouraud 8. Preparar y esterilizar los medios sólidos: Mc Conkey. en agar Mc Conkey.1) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Muestra problema: Disolución ringer . Hacer un esquema con la metodología seguida.C. de cada una de las diluciones con asa Digralsky en placas con agar nutritivo (G1: -1. Completar la tablas de observaciones.. 4. 7. B) Aislamiento por agotamiento en placa 1. 13. Manitol Salt. 12. B. Evitar que se superpongan las estrías. . Rotular en la parte posterior de cada placa (excepto Levine). Efectuar lectura de los resultados obtenidos. Describe las morfologías coloniales observadas (A. 14. Sabouraud 1 sector más) 4. 5. 8. Repetir la operación con los agares Manitol Salt. 10. Esterilizar. Tomar del agar nutritivo una colonia del tipo "A" obtenida en el protocolo nº 4. a 37 ºC. Proseguir con el procedimiento B. . Marcar placas Petri. 7. Levine. 9. -3. Incubar 24-48 h a 37 ºC. 3.). completando los cuadros correspondientes. Obtener conclusiones. 11. Sembrar Saccharomyces cerevisiae en un sector del A. Consultar la composición y características de los medios de cultivo que se emplean en esta práctica e indicar que función cumplirá cada uno de ellos. resembrar en siembra escocesa en medio agar Levine (xG). G:2 Sabouraud CAF./mL en la muestra con los resultados obtenidos. Enfriar. . 10.. Incubar las placas en la estufa de cultivos a 37 ºC durante 48 h. Preparar 2 placas (xG) de agar nutritivo Preparar 4 tubos con 9 ml. En otra placa de Agar Levine realizar una siembra escocesa a partir de un cultivo puro de Enterobacter cloacae. 6. A partir de una colonia que haya dado positivo en el Agar Mc.. -3. Distribuir los medios.F. Incubar 48 h. Cuestionarios. Staphylococcus epidermidis. Hacer un esquema del banco de diluciones y de las siembras que has realizado. 2. Sabouraud.Sabouraud a 27 ºC) 9. -4) con la muestra disponible. 6.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 45 PRÁCTICA 4. en uno de los sectores. G2: -2.

Sembrar 1 ml de inóculo de la dilucion (-2). Incubar el matraz en la estufa de cultivos a 37 ºC. .. 30. Disolución nutritiva: En un frasco de 250 ml. Dibujar una curva de crecimiento. preparar diluciones decimales -1.. preparar una de solución de 25 ml de vino blanco (sin tratar). 1. 5. Cámara de recuento. Método Breed. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 ml) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación. 3.y 180 minutos (longitud de onda aconsejada: 540 nm). mediante: a. 2. en 25 ml de agua destilada.. colocar 50 ml de solución nutritiva. con los datos obtenidos. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos: 0..4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 46 PRACTICA 4. y añadir 1. Incubar a 22 ºC durante 7 días.2 Crecimiento población microorganismos. Hacer un recuento de levaduras en cada sesión de prácticas. 7.2 g de azúcar. Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en fase exponencial del crecimiento. b. Preparar un tubo inclinado con agar nutritivo. Cálculo parámetros (v) y (g). Sembrar en estría un inóculo de E. A)Crecimiento población Saccharomyces cerevisiae. Incubar 48 h. con agitación 200 rpm (si disponible) 6. 60. En 1 erlenmeyer de 100 ml. Calcular la tasa de crecimiento v (número de dividiones celulares por día) y el tiempo de generación g (en horas). 4. En dos tubos de ensayo con S. 5. Tomar 1 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 100 ml de TSB estéril. 1. Turbidimetría. colocando en el eje de abscisas los valores del tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia. 7. 4. 2. -2. Inóculo. 8. del inóculo. a 37 ºC 3.S.. Ajustar el espectrofotómetro a 0 % de absorbancia con un tubo de TSB estéril antes de cada medida (blanco). en papel milimétrico. Turbidimetría. B) Curva crecimiento Escherichia coli. Añadir solución salina estéril al tubo inclinado de E. coli. Resuspender 2 g de levadura en 100 ml de solución salina. Agitar suavemente el cultivo con periodicidad 6.

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