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CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

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4. SIEMBRA Y AISLAMIENTO MÉTODOS DE RECUENTO

DE

MICROORGANISMOS.

4.1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Para trasladar microorganismos de un medio de cultivo a otro se utilizan micropipetas, pipetas graduadas, asas de siembra y asas de siembra calibradas. a. El asa de Kolle consta de un mango aislante y de un filamento de platino o de niquelcromo (nicrom) recto o acabado en un anillo. Esta asa se esteriliza por incineración a la llama del mechero, dejándola enfriar sin que toque ninguna superficie antes de la siembra. Las asas calibradas sirven para trasladar alícuotas de un volumen pequeño de muestra (p.ej. 0,01 ml o 0,001 ml). El hilo de siembra (asa de picadura) se emplea para sembrar por picadura en el fondo de un tubo conteniendo agar, el asa redondeada (asa de Kolle) para sembrar por estría o en medios líquidos. b. Asa Digralsky, son varillas de vidrio con una rama horizontal. c. Las pipetas graduadas se utilizan para trasladar alícuotas de determinados volúmenes de muestra (0,1-100 ml). Pueden ser de vidrio o de plástico. d. Las micropipetas constan de un mango y de una punta. Las puntas son de PVC de diferentes medidas y colores dependiendo del volumen de muestra; se esterilizan en el autoclave.

Nunca dejar material contaminado sobre la mesa del laboratorio
(asas de siembra, tapones de cualquier tipo) TÉCNICA DE SIEMBRA Se toma el tubo o erlenmeyer que contiene el inóculo con la mano izquierda (fig. 4.1) y con los 4º y 5º dedos de la mano derecha se estira o desenrosca el tapón. Con los dedos 1º y 2º se coge el material para trasladar la muestra (asa de Kolle, pipeta...) antes de quitar el tapón.

Fig. 4.1 Es muy importante flamear al mechero la boca de los tubos o erlenmeyers y el extremo de las pipetas antes de inocular las muestras. Las asas de Digralsky sirven para extender homogéneamente una alícuota sembrada sobre un medio sólido. Para esterilizarlas, se sumergen en un recipiente con alcohol y se pasan por la

1.48 h. Siembra escocesa. Tomar una alícuota del cultivo (líquido o sólido) con el asa de siembra. un número cada vez menor de microorganismos sobre un medio sólido en placa de Petri. Incubar en posición invertida para que las gotas de agua de condensación no se depositen encima de las colonias. Concentración del inóculo En las placas de Petri dichas anotaciones se realizan de forma circular en el borde de la tapa. Fig. Incubar 24 . Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso una o dos veces más. Para siembra en estría. 6. La última serie de estrías no se ha de superponer con la primera. Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar al lado del mechero. se espera un tiempo hasta que se enfríe al lado de la llama. 7. Código de identificación 2. 4.4. Hacer una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores de manera que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior. Se basa en repartir homogéneamente. Para siembra escocesa.2) 5. 2. sin que toque ninguna superficie. o ml. B) Siembra por superficie o en masa Es un método cuantitativo de aislamiento y recuento de las bacterias presentes en una muestra problema.poner el asa suavemente sobre el agar. Esterilizar el asa de siembra. hacer una serie de estrías paralelas y no superpuestas hasta que se agote el asa (fig. de la muestra. alícuotas de la muestra por toda la superficie del medio de cultivo. Antes de sembrar. Tipo de análisis 3. con el asa de Kolle.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 30 llama de un mechero. haciendo un zig-zag hasta que se agote el inóculo. Se basa en arrastrar. a la Tª adecuada. El objetivo es conseguir colonias aisladas. 8. Si la siembra ha sido correcta. Los tubos y placas deben marcarse con rotulador de vidrio: 1. 3.1 SIEMBRA EN PLACA A) Siembra en estría o por agotamiento.2 Metodología 1. . 4. Este método no permite saber el número de microorganismos por gr. los microorganismos quedarán aislados en las últimas estrías y se podrán observar colonias aisladas. 4.

de la muestra o de las diluciones correspondientes en placas de Petri con agar nutritivo. 2. 3. 5.48 h. 3. Sembrar 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri. B. Efectuar el recuento de las colonias en el medio. Agitar suavemente deslizando la placa de Petri encima de la mesa. del agar nutritivo en forma líquida atemperado a 45-47 ºC. 3. Repartir el inóculo por toda la superficie con movimientos de rotación hasta que el líquido quede totalmente absorbido.3 . No es necesario homogeneizar. Esterilizar el asa Digralsky. 4. Incubar las placas invertidas.2.1 ml. Añadir 1 ml de muestra o de las diluciones correspondientes en placas Petri.48 h. 4.3. Siembra homogénea en superficie. Incubar durante 24 . en un movimiento en forma de ocho por espacio de dos minutos. 2. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa . Añadir 15-20 ml de agar nutritivo líquido a 45-47 ºC. 4. 5. Efectuar el recuento de las colonias sobre la superficie del medio (microorganismos aerobios). 6. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (aerobios y anaerobios facultativos). Esperar 10 min y incubar las placas invertidas. Esperar unos 10 minutos hasta que solidifique. 8. 9. a la temperatura indicada. 5.48 h. para mezclar el medio y la alícuota.1. 4. Asa Digralsky Procedimiento: 1. 6. 4. Dejar solidificar el agar. para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. Siembra en profundidad ("pouring"). a la temperatura indicada. 2. Incubar durante 24 . Efectuar el recuento de las colonias en el medio. fig. a la temperatura indicada. Siembra en doble capa Procedimiento: 1. Añadir entre 15-20 ml. para evitar que el agua de condensación caiga sobre el medio. 7. Incubar durante 24 . Homogeneizar las placas con suavidad. Procedimiento: 1. B. 6.2 SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO a) Siembra por estría Es el método utilizado para el mantenimiento de cultivos puros y para determinar algunas características fisiológicas de los microorganismos. Añadir 0. Esperar 10 min y incubar las placas invertidas.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 31 B. Tras solidificar añadir una nueva capa del mismo medio de cultivo (aproximadamente 10 ml por placa).1. A medida que se hace el recuento se marcan con un rotulador sobre la placa (microorganismos anaerobios).

6. 7.1. Fig. 4.2. Incubar a la temperatura adecuada. 5. Esterilizar el asa. Flamear el tubo y ponerle el tapón. Introducir el asa de Kolle cargada con el inóculo dentro del medio y agitarla para que las bacterias queden resuspendidas. un alambre largo y recto. 3. Esterilizar el asa de Kolle. Procedimiento: 1. 4. Cargar el asa con el cultivo que se quiere transferir.3 fig. 2.3. mediante el asa de Kolle. 4.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 32 b) Siembra en picadura Es un método utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos. 4. Los tubos o frascos con el medio de agar se dejan solidificar en posición vertical o inclinada. masa microbiana procedente de un cultivo (sólido o líquido) a un medio líquido. Abrir el tubo con el medio de cultivo estéril y flamear la boca. 4. densidad bacteriana o magnitud proporcional (concentración.3 SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO Medio utilizado para determinar algunas características bioquímicas de los microorganismos o para la obtención de cultivos. nº de células 2. Se basa en inocular. masa celular 3. MÉTODOS DE RECUENTO MICROBIANOS Determinación de: 1. Homogeneizar la suspensión. El medio se inocula introduciendo verticalmente en el centro del tubo. absorbancia) . cargado con el inóculo.

Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un número muy elevado de microorganismos. Centrifugación: I. titulaciones volumétricas. Permite tomar las colonias para su resiembra en otro medio o para su posterior identificación. producción de CO2. Métodos directos: 1. Determinación de nitrógeno o carbono.1 RECUENTO VIABLES . Masa húmeda (por centrifugación) II. Filtros de membrana Métodos de determinación masa bacteriana: a. ácido). Turbidimetría / Nefelometría. 2... b. se utiliza principalmente para el recuento de hongos y en análisis de microorganismos mesófilos aerobios totales en aguas y alimentos. Métodos indirectos: 1.) 4.. Masa seca (centrifugación y secado) 1. . d. Banco dilucionesi. a.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 33 Métodos de determinación nº células: a. que posteriormente se siembran en placas con medio de cultivo. Magnitudes metabólicas (captación de O2. Para ello se realizan diluciones seriadas.2. Para la medida se pueden emplear métodos electroquímicos. La viabilidad en Microbiología se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio sólido formando una colonia. c. La siembra en profundidad ("pouring"). por lo que se requiere diluirlas para poder contarlos. nº de células viables (banco de diluciones) Cámara de recuento Método Breed Contador electrónico (se basa en la pérdida de conductividad de un electrolito cuando pasa una célula bacteriana a través de un orificio estrecho) e. La siembra en placa en superficie es idónea para aerobios. Esta técnica de recuento nos permite conocer el número de microorganismos viables en una determinada muestra.

7. = nº colonias · 1 1 dilucio ´n vol. Se agita bien el tubo (-1 ) y se toma 1 ml. 3. 10-2. Repetir la operación con las sucesivas diluciones. Incubar. etc. Agitar la muestra inicial para homogeneizarla. Sembrar en placas de agar a partir de las diversas diluciones. 4. 2. que se multiplica por la inversa de la dilución y por la inversa del volumen del inóculo sembrado en las placas. (-2). que se depositara en el tubo de Ringer (-2). Para realizar un recuento correcto.10-6 (1). 10-5.gr. En caso de encontrarse superpuestas. 5. Lectura y recuento. Para obtener el número de organismos por unidad de peso o volumen de la muestra analizada. se cuentan las colonias de las placas que contienen entre 30 . ni se cuentan dos veces. Colocar 9 ml de solución Ringer en cada uno de ellos.10-3. (-3). así no se deja de contar ninguna.4 Procedimiento 1. Rotular los tubos de Ringer con el factor de dilución: 10-1. 4. se calcula la media aritmética. marcado como dilución 10-1 (-1). Hay que contar las colonias a contraluz.10-4.300 colonias. 6. Tomar 1 ml de la muestra problema con la pipeta y depositarlo en un tubo de Ringer con 9 ml de Ringer. las colonias deben estar aisladas. A medida que se van contando se marcan con un rotulador.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 34 Fig. esta placa no es válida para efectuar el recuento. ino ´culo . ufc/ml. Esterilizar los tubos Ringer.

50 51 . Colocar en la superficie y extender en los límites del cuadrado 1 gota de micropipeta (16 l) de inóculo. 4.12 13 .6 7 . Desengrasar con cuidado un portaobjetos. A continuación contar el número de microorganismos en varios campos. Para obtener el nº de células/ml de la muestra problema. 3. En el método Breed se extiende una muestra sobre un recuadro de un centímetro marcado sobre el porta y se tiñe. Inmediatamente secar y fijar por calor suavemente. de manera que el número de campos es más grande cuanto más bajo es el de microorganismos. campos totales en cm2 = 1 r 2 (determinar "r" con cámara de recuento) .4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 35 4. células/ml. = ´lulas/campo ) x nu (media ce ´m . Si las células están homogéneamente repartidas. secar y observar al microscopio con objetivo de 40-60 aumentos). Utilizando un objetivo de inmersión se inspeccionan los campos microscópicos y se calcula el valor medio del número de bacterias que hay en cada campo.3 4 . se puede aplicar la siguiente tabla. Cubrir la extensión con azul de metileno durante 1 min. Dar la vuelta al porta y observamos una superficie bien delimitada de 1 cm2.2 RECUENTO DIRECTO A) MÉTODO BREED Por la técnica de método directo se coloca un volumen conocido de una suspensión bacteriana sobre un área conocida del portaobjetos.2.25 26 . Procedimiento 1. Número de bacterias / campo 0 . 2. campos totales en 1 cm 2 volumen (ml) núm. 6. hay que aplicar la fórmula siguiente: (N) núm. lavar con agua del grifo.100 > 100 Número de campos que se han de contar 64 32 16 8 4 2 1 Si la distribución no es homogénea se ha de contar un mínimo de 10 campos y en total como mínimo 300 células. Dibujar en él un cuadrado de 1 cm por lado. 5.

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 36 B) CAMARA DE RECUENTO Para los recuentos microscópicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseñado llamado Cámara de Petroff-Hausser. Observar con objetivo x60 aumentos. Se calcula la media del nº de bacterias de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que proporciona el recuento por mililitro. La principal ventaja es que no se necesita ningún tiempo de incubación. Una cavidad de volumen conocido está excavado en la superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un área conocida. La cavidad se llena1 con la suspensión bacteriana. Su uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal. 1 Técnica de llenado de cámara de recuento: Tomar el inóculo con una pipeta Pasteur y acercarla al borde del cubre permitiendo que entre la muestra por capilaridad a la cámara de recuento. . Además se requiere una concentración bastante alta de bacterias. Las bacterias móviles son difíciles de contar por este método y como pasa con otros métodos microscópicos. de unos 10 millones de bacterias por ml. las células muertas son demasiado similares a las vivas que se quieren contar.

debe adaptarse primero a las nuevas condiciones de crecimiento: síntesis de RNA (aumenta entre 8-12 veces). Depende de factores como: a. pH. Medio de cultivo Durante algún tiempo hay poco o ningún cambio en el número de células debido a que no se reproducen inmediatamente en medio nuevo.).4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 37 4.3 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS. Si el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria. . Pero en este tiempo las células no se encuentran inactivas. La velocidad de multiplicación varía de una especie a otra y depende de las condiciones de cultivo (nutrientes. Para unas condiciones determinadas. el crecimiento no es uniforme sino que varía a lo largo del tiempo. La población microbiana presenta una intensa actividad metabólica. etc. temperatura. ribosomas y enzimas. etc. obtenemos una curva en la cual se diferencian cuatro periodos diferentes: 1. Este periodo se llama fase de latencia y puede durar desde una hora a varios días. particularmente de síntesis enzimática. Fase de latencia Periodo de tiempo entre inoculación y la tasa de crecimiento máxima. Edad cultivo b. o si ha cambiado de medio de cultivo. El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo el incremento del número de células. Si se representan gráficamente estas variaciones en función del tiempo. la acumulación de sustancias tóxicas. Estas variaciones dependen de factores como el agotamiento de nutrientes.

Por otra parte durante la fase logarítmica del crecimiento. Finalmente la velocidad del crecimiento disminuye el número de células muertas compensa al de células vivas y la población se estabiliza. Fase estacionaria Si el crecimiento exponencial continua sin control da lugar a un número de células asombrosamente altos. . temperatura. Es también cuando son metabólicamente activas.. Fase logarítmica Finalmente las células empiezan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento exponencial. preparándose para la reproducción. aireación. densidad. Como el tiempo de duplicación es constante la representación logarítmica del crecimiento durante esta fase exponencial es una linea recta. Existe aparentemente un tiempo de generación mínimo característico determinado genéticamente en cada especie (TD). Ello implica la fiabilidad de las técnicas de medición indirecta. Las actividades metabólicas de las células supervivientes también se hacen más lentas en esta fase. Bacterias del suelo 60-150' . Nitrosomas y Nitrobacter 5-10 h. los microorganismos son mas sensibles de lo normal a las condiciones adversas. El tamaño celular y el contenido en proteínas es constante en la fase logarítmica (células estándar). Pero esto no ocurre.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 38 Cerca del final de la fase de latencia algunas células doblarán o triplicarán su tamaño. Este periodo se llama fase estacionaria. La reproducción celular adquiere una actividad máxima durante este periodo y el tiempo de generación llega a un mínimo constante. Durante esta fase logarítmica las células empiezan a mostrar sus características visibles: Morfología. etc) o capacidad de usar diversos sustratos nutritivos. Fase idónea para estudiar influencia de factores ambientales (pH. Enterobacterias 15-30'. color..

Disminución de presión parcial de O2. Algunos métodos miden el número de células (Breed. También tienen lugar variaciones del pH y de temperatura. Se acumulan productos de degradación tóxicos par las células y se agotan ciertos nutrientes esenciales. utilizar materiales de reserva b.ej. se añaden sustratos que actúan como precursores del producto objeto de la producción. En Biotecnología: a. Idiofase: Fase de producción Aunque las células no crezcan durante la idiofase. Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. sintetizar enzimas En muchos procesos microbianos la fase estacionaria es la fase de producción de un metabolitosecundario (p. cámara de recuento). lactobacilos) autolisis (por la acción de los propios enzimas) 4. después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. En fase estacionaria sólo las células muy sensibles mueren rápidamente. Algunas debido a: producción de ácidos (e.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 39 Las razones del cese del crecimiento exponencial son siempre claras. Fase de muerte Normalmente el número de células muertas supera al de células formadas y la población entra en la fase de muerte o fase de descenso logarítmico. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de muestra o en un gramo de material sólido. Penicilina). otros la masa total de la población. Trofofase: Fase de nutrición o crecimiento b. que es frecuentemente proporcional al número de células.coli. Debido a que las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayoría de métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas. Causas poco conocidas en general.1 MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO.3. . descomponer parte de los ribosomas c. las células puede aún: a.

siendo inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. La turbidimetría mide la cantidad de luz transmitida por la suspensión. Por este procedimiento se puede estimar el número de bacterias en el cultivo. la medida de la turbidez (turbidimetría) es un método muy práctico para seguir el crecimiento bacteriano. .. la luz absorbida por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. La dispersión depende de: 1. Para que sean visibles las primeras trazas de turbidez es necesario mas de un millón de células por ml. ESPECTROFOTÓMETRO El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales. 4. Tamaño y peso molecular de las partículas Longitud de onda de la luz incidente Longitud detector-cubeta Concentración partículas Si las lecturas de absorbancia se comparan con el recuento en placa del mismo cultivo esta correlación se puede utilizar en estimaciones futuras del número de bacterias hechas directamente por turbidimetría. 2.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 40 A) TURBIDIMETRÍA En algunos tipos de trabajos experimentales. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica. Por tanto la turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias. dentro de un rango. absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. para que la sustancia sea suficientemente turbia como para ser medida por un espectrofotómetro.20 millones por ml. ya que. 3. y entre 10 .

3. Establece la relación entre el grado de absorbancia de una disolución y otras dos variables: La concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz recorre a través de la solución. Sistema de registro Convierte señales eléctricas del detector en señales registradas de lectura. Filtros de vidrios coloreados que absorben las radiaciones no deseadas. Conectar el aparato 15 m. Convierte la energía luminosa que recibe en energía eléctrica. Ajustar la absorbancia a 0 con el blanco (medio de cultivo empleado) 2 Ley de Beer. Absorbancia = 2 . Luz monocromática ( única). Seleccionar la longitud de onda adecuada. Se obtiene seleccionando una onda de una fuente de luz policromática. antes.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 41 En general. el crecimiento bacteriano no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia).log % de Transmitancia Fuente de luz. 2. ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión (Ley de Beer2) La relación entre Transmitancia (T) y Absorbancia (A) se expresa matemáticamente por: Io -----> 7 -------> I s T= Is I0 %T= Para %T = 0 Is I0 · 100 => Absorbancia = ∞ Para %T = 100 => Absorbancia = 0. Según esta ley la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz. Recipiente donde se coloca la muestra (l = 1 cm en general) Detector. a = coeficiente de absorción c = concentración del absorbente . Fases de utilización (con aparato calibrado) 1. para estabilizar componentes eléctricos y fuente de luz. siendo: A = absorbancia b = longitud del paso de la luz en cm. sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia). b. Prismas o redes de difracción (espectro fotómetro) Cubeta. (A = a·b·c). La selección se realiza mediante: a.

tendríamos: Tiempo en min. En este tipo de representación se obtiene una recta. Nº de bacterias (N) N = 2n n = nº divis. Siendo N = No ·2n . si aplicamos logaritmos log N = log No + n·log 2 y n= log N−log N 0 log 2 La tasa de crecimiento (v = número de divisiones celulares/hora) será: v= n t = log N−log N 0 (t−t 0 )$log 2 El tiempo necesario para un ciclo de división es el tiempo de generación: g= t n = 1 v En la representación gráfica del crecimiento bacteriano. o bien las últimas.024 210 10 220 2. o bien las primeras divisiones. El crecimiento exponencial se caracteriza por una relación lineal entre el tiempo y el logaritmo del número de células. porque según que escala escojamos . La pendiente de dicha recta refleja la velocidad del crecimiento celular. celulares 0 1 20 0 20 2 21 1 40 4 22 2 60 8 23 3 80 16 24 4 100 32 25 5 120 64 26 6 140 128 27 7 160 256 28 8 180 512 29 9 200 1. se habla por tanto de crecimiento logarítmico.048 211 11 240 4. Si se ha partido inicialmente de 1 célula. Dicha curva no es apropiada para expresar un número grande de divisiones celulares.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 42 CURVA DE CRECIMIENTO Suponiendo que un cultivo bacteriano crece a razón de una división cada 20 min. se obtiene una curva exponencial.096 212 12 Se produce un crecimiento exponencial. en la cual se coloca en ordenadas el logaritmo del número de células. Por ello se prefiere la representación semilogarítmica. se reconocerán únicamente. .

180 0.850 1. La tasa de crecimiento (pendiente de la recta) El tiempo de duplicación es td = ln 2  = ln x t −ln x o (t−t o ) ================================================================== Ejercicio: Cálculo de los parámetros (Td) y () Microorganismo utilizado Escherichia coli Medio de cultivo utilizado TSB Longitud de onda 540 nm Anota en la tabla siguiente los resultados obtenidos: Se utilizará como datos de cálculo.360 0.104 0.Coli.5 0 0 50 100 150 200 250 300 tiempos (min) Tiempo de duplicación. absorción).356 1.750 1. las absorciones siguientes medidas en un espectrofotómetro de un cultivo de E.5 Absorbancias 1 Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en el tramo: 60' .990 1.852 1.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 43 Cálculo del Tiempo de duplicación (Td) y la Tasa específica de crecimiento () En los cálculos se toma como base la densidad bacteriana (x) o alguna magnitud proporcional a ella (número de células.150' (fase exponencial del crecimiento). Tiempo 0 30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240' 2 Absorbancia 0.587 0. 0. Td (min) Tasa específica de crecimiento (h-1) .

4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 44 TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en placa) TIPOS DE MORFOLOGÍAS COLONIALES (siembra en tubo) .

7. resembrar en siembra escocesa en medio agar Levine (xG).C. Sembrar en superficie 0. "C". 8. B. Describe las morfologías coloniales observadas (A. -4). Completar la tablas de observaciones. En otra placa de Agar Levine realizar una siembra escocesa a partir de un cultivo puro de Enterobacter cloacae. Hacer un esquema del banco de diluciones y de las siembras que has realizado. 2..1 y sembrarla en estría por agotamiento. Incubar 24-48 h a 37 ºC. Preparar 2 placas (xG) de agar nutritivo Preparar 4 tubos con 9 ml. Manitol Salt. Proceder de igual manera con las colonias del tipo "B" . A) Aislamiento por dilución 1. 13. 9. a 37 ºC. Conkey. 11.1 ml. .Sabouraud a 27 ºC) 9. en uno de los sectores. B) Aislamiento por agotamiento en placa 1.. Enfriar. Consultar la composición y características de los medios de cultivo que se emplean en esta práctica e indicar que función cumplirá cada uno de ellos. Marcar placas Petri. Esterilizar. Rotular en la parte posterior de cada placa (excepto Levine). 3. Proseguir con el procedimiento B.F. 7. de dº Ringer 3. 12. 10. -4) con la muestra disponible. Repetir la operación con los agares Manitol Salt. Preparar un banco de diluciones decimales (-1. Obtener conclusiones. completando los cuadros correspondientes. Cuestionarios. Escherichia coli. Efectuar lectura de los resultados obtenidos. de cada una de las diluciones con asa Digralsky en placas con agar nutritivo (G1: -1. tantos sectores como microorganismos se tengan que sembrar. 15. Staphylococcus epidermidis. C. 10. Distribuir los medios. Hacer un esquema con la metodología seguida. A partir de una colonia que haya dado positivo en el Agar Mc. -3. Sabouraud 8. 6. Sabouraud.4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 45 PRÁCTICA 4. ( A. G:2 Sabouraud CAF. Tomar del agar nutritivo una colonia del tipo "A" obtenida en el protocolo nº 4. 14.(A... G2: -2. Observar los resultados obtenidos.1) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Muestra problema: Disolución ringer . Preparar y esterilizar los medios sólidos: Mc Conkey. Evitar que se superpongan las estrías. Levine. . 4. 5. -3. Incubar las placas en la estufa de cultivos a 37 ºC durante 48 h. 3..). Sabouraud 1 sector más) 4./mL en la muestra con los resultados obtenidos. -2. Realizar el cálculo del nº de U. en agar Mc Conkey. Incubar 48 h. 5. Sembrar Saccharomyces cerevisiae en un sector del A. 6. . 2.

. Agitar suavemente el cultivo con periodicidad 6. Sembrar en estría un inóculo de E. Dibujar una curva de crecimiento. A)Crecimiento población Saccharomyces cerevisiae. b. Preparar un tubo inclinado con agar nutritivo. preparar diluciones decimales -1. -2. B) Curva crecimiento Escherichia coli. y añadir 1. Sembrar 1 ml de inóculo de la dilucion (-2). colocar 50 ml de solución nutritiva. en papel milimétrico. a 37 ºC 3. preparar una de solución de 25 ml de vino blanco (sin tratar). 7. Hacer un recuento de levaduras en cada sesión de prácticas. Cámara de recuento. 4. Turbidimetría. Cálculo parámetros (v) y (g). . 4. en 25 ml de agua destilada. Añadir solución salina estéril al tubo inclinado de E. Inóculo. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 ml) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación. Incubar 48 h. 5. 8. Tomar 1 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 100 ml de TSB estéril. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos: 0. 30. Calcular la tasa de crecimiento v (número de dividiones celulares por día) y el tiempo de generación g (en horas). Efectuar el cálculo del tiempo de duplicación (Td) y de la tasa específica de crecimiento ( ) del microorganismo en fase exponencial del crecimiento.. 2. 2..4 CRECIMIENTO POBLACIÓN MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS 46 PRACTICA 4.y 180 minutos (longitud de onda aconsejada: 540 nm). 3.2 Crecimiento población microorganismos. 60. con los datos obtenidos. Resuspender 2 g de levadura en 100 ml de solución salina. del inóculo. colocando en el eje de abscisas los valores del tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia. En dos tubos de ensayo con S. Incubar a 22 ºC durante 7 días.. 1. mediante: a. Turbidimetría.S. coli.2 g de azúcar. 7. Ajustar el espectrofotómetro a 0 % de absorbancia con un tubo de TSB estéril antes de cada medida (blanco). Disolución nutritiva: En un frasco de 250 ml. Método Breed. con agitación 200 rpm (si disponible) 6. 5. Incubar el matraz en la estufa de cultivos a 37 ºC. 1. En 1 erlenmeyer de 100 ml..

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