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TRANSAMINACIN Baltazar Gonzlez Chvez (1025715), Kimberly Navarro Vlez (1025088), Jezir Valencia Gmez (1023851) Departamento de Biologa,

Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad del Valle, Cali Colombia - 2011

RESUMEN
La transaminacin es una de las reacciones ms importantes del catabolismo y de la biosntesis de los aminocidos, en donde el grupo amino de un aminocido es transferido a la enzima, produciendo el correspondiente a-ceto cido y la enzima aminada y finalmente el grupo amino es transferido al a-ceto cido aceptor (ej. Alfa-cetoglutarato) formando el producto aminocido (ej. Glutamato) y regenerando la enzima. En la prctica se quiso colocar en prueba la reaccin de transaminacion, usando como sustratos alanina--cetoglutarato y a partir de la preparacin de un extracto enzimtico de corazn de res, la formacin de los productos piruvato y glutamato; para lograr la mxima eficacia de la actividad enzimtica, se le brindo a la enzima todas las condiciones necesarias para que funcionara y diera los productos esperados comprobando por medio de cromatografa de papel que la enzima era la alanina aminotransferasa por el desplazamiento de los aminocidos al ser revelado con ninhidrina. Se observ una transaminacin efectiva por parte de la alanina aminotransferasa presente en el extracto enzimtico, esto se evidencia con la cromatografa de papel. Concluyendo a partir de los resultados que la enzima efectivamente convierte un a-cetocido en un aminocido en presencia de otro (a.g. Alanina- a-cetoglutarato Piruvato Glutamato). Palabras Claves: Transaminacin, Alanina Aminotransferasa, Fosfato de piridoxal, Cromatografa, Metabolismo.

INTRODUCCIN: El catabolismo de los aminocidos ocurre de manera diferente en plantas y animales. En las plantas, la capacidad de fijar el nitrgeno atmosfrico hace posible la sntesis de aminocidos, y ante una alta concentracin de estos, el almacenaje en protenas de reserva, que de acuerdo a las necesidades metablicas de la planta se usaran o acumularan ms; sin embargo, en los animales tales macromolculas de reserva no

existen, de modo que continuamente se deben sintetizar o ingerir a travs de la dieta en forma de protenas (Peret et al, 2007). Cuando los aminocidos obtenidos ya han cumplido su objetivo en el organismo, y hay un exceso de estos, son degradados. La degradacin requiere inicialmente la eliminacin del grupo -amino; pero esta no es una reaccin fortuita, por tanto, debe realizarse mediante molculas intermediarias como las transaminasas, que transfieren el grupo amino al -cetoglutarato para formar glutamato que en la mayora de animales, ser posteriormente desaminado mediante la enzima glutamato deshidrogenasa que utilizando NAD+ o NADP+ como agentes oxidantes libera amonio (NH4+), que a travs del ciclo de la urea se eliminar del organismo (Berg et al, 2004); al extraer el grupo amino solo queda la estructura carbonada del aminocido inicial que consecutivamente ser transformada en glucosa o en acetylCoA, que intervendrn en reacciones glucognicas o cetognicas respectivamente (Peret et al, 2007). Las transaminasas, tambin denominadas amino-transferasas o enzimas anaplerticas son las encargadas de las reacciones de transaminacin (anaplerticas) que fueron descritas por primera vez por Braunstein & Kritzmann en 1938 que a su vez determinaron su carcter reversible. Todas las aminotransferasas contienen una coenzima de gran versatilidad, denominada fosfato de piridoxal (PLP por sus siglas en ingles); esta coenzima se enlaza a la enzima y al sustrato formando una base de Schiff. Este enlace es posible gracias al grupo aldehdo que presenta, el cual acepta el grupo -amino de los aminocidos y se convierte en fosfato de piridoxamina (PMP) que transferir el grupo amino a un 2-oxocido y con esto se regenerar el PLP y se producir un nuevo aminocido (Nelson & Cox, 2005). Esta prctica de laboratorio tuvo como principal finalidad la demostracin cualitativa de la transaminacin entre alanina (Ala, A) y glutamato (GLU, Q) as como la identificacin del cido actico como inhibidor de la reaccin y la comprensin de la importancia metablica de este proceso.

METODOLOGA Se sigui el procedimiento mencionado en la gua de laboratorio de Biologa Celular y Bioqumica II. Observada en el anexo 1.

RESULTADOS El corazn de res del cual se dispuso fue licuado y posteriormente llevado a centrifugacin. El lquido resultante tena una textura espesa y de color rojizo salmn.

(a)

(b)

Figura 1.Observacion del licuado y trasvaso de la preparacin enzimtica cruda. (a)Se observa la coloracin rojo-salmn del preparado mientras se trasvasa en un tubo de centrifuga de 50 mL, (b) Medicin del peso del tubo para centrifugacin.

Luego de haber pesado los tubos de centrfuga con su respectivo licuado de corazn de res se procedi a centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 15 minutos. Pasado este tiempo, la sustancia de los tubos se estratific en dos fases lo cual se puede observar en la Figura 2, una fase superior acuosa (sobrenadante) que contena el extracto enzimtico crudo y una inferior (precipitado). El extracto enzimtico fue decantado en un tubo de ensayo y los sedimentos desechados.

.
Figura 2. Resultado obtenido luego de centrifugar el licuado de corazn. Se observa las dos fases resultantes de la centrifugacin del licuado de corazn de res, arriba la fase lquida que corresponde al extracto enzimtico crudo, y abajo el sobrante que fue desechado.

Al realizar el punto 2 de los mtodos, los tubos 1 y 2 presentaron unas particulas de color caf claro flotando, a diferencia del tubo 3 que se mostr hialino (ver figura 3). A continuacin se muestra el sobrenadante y el resultado de los tubos 1, 2 y 3, del punto 2 de la gua.

(a)

(b)

Figura 3. (a) Aspecto del tubo 1 luego del bao en ebullicin, antes de la filtracin, que muestra sedimentos caf claro (b) Apariencia del tubo 2 (izquierda) que presenta partculas de coloracin caf claro, el tubo 3 (derecha) es incoloro y sin partculas suspendidas.

Al haber terminado los puntos 1 y 2 de la gua de mtodos se procedi a realizar la cromatografa que dur 41:54 (min) los resultados obtenidos se pueden apreciar en la Figura 4, donde en la primera columna (izquierda a derecha), correspondiente al filtrado libre de protenas del tubo 1, se observ una mancha oscura superior y otra muy leve por debajo de la primera, en la columna 2 (filtrado libre de protenas del tubo 2) se observan dos manchas oscuras, en la columna 3 (Blanco) se observa una nica mancha superior y por ltimo, en la columna 4 (sustancia patrn) se observan dos manchas.

Figura 4. Cromatografa de los tubos 1, 2 y 3 con un patrn para comparacin. Se observa las manchas correspondientes a la cromatografa, 1, 2, 3 y P corresponden a tubo 1, tubo 2, tubo 3 y Patrn respectivamente.

Posterior a esto se realizaron los clculos del Rf (Formula I) de las manchas de los tubos 2 y Patrn para comparar, la Tabla 1 ilustra los datos recogidos.

Formula I

Tabla 1. Valores de los Rf obtenidos a partir de la cromatografa. La distancia recorrida por el solvente fue de 8.1 cm.

# Tubo Tubo 2 Patrn

Distancia Recorrida Ala (cm) 3,3 2,4

Distancia Recorrida Glu (cm) 1,1 1,5 DISCUSIN

Rf Ala 0,407 0,419

Rf Glu 0,135 0,185

Para la prctica de transaminacin, se prepar un extracto enzimtico a partir de corazn de res. Inicialmente el corazn fue partido en pequeos trozos y se procedi a realizar el licuado agregando amortiguador de fosfatos que es de gran importancia ya que mantiene un pH estable para las protenas globulares que son muy sensibles a los cambios brucos de pH. Posteriormente la mezcla homogenizada se centrifug durante 15 minutos para obtener el extracto enzimtico crudo (sobrenadante) y se descartaron los sedimentos celulares. Se prepararon 3 tubos de acuerdo a la metodologa (anexo 1). En el tubo 1 se quiso inhibir la funcin enzimtica de modo que se evitase la formacin de piruvato y glutamato, para ello antes de agregar el extracto enzimtico, se coloc el tubo en un bao de agua en ebullicin durante 3 minutos, donde la temperatura modific la estructura tridimensional de la enzima y junto con la adicin de cido actico que modifica el pH de la solucin, y cambia la estructura de la protena al desprotonar el grupo R de la cadena lateral, se logra una desnaturalizacin de la enzima y al ocurrirle esto, no se puede llevar a cabo la catlisis enzimtica. (Badui 1999). Para el tubo No.2, se quera hacer que el extracto enzimtico que contena la enzima especifica de transaminacion, funcionara correctamente; para ello se le brind los sustratos (alanina--cetoglutarato) y temperatura adecuada (37C) sabiendo que las enzimas son extremadamente selectivas y solo funcionara la que cataliza la produccin de piruvato y glutamato, conocida como alanina aminotransferasa o transaminasa glutamicopirvica (GPT) (Bergmeyer & Horder, 1980). Despus de 30 minutos de posible accin enzimtica durante la incubacin a 37C, al igual que en el tubo 1 se inhibe la accin enzimtica mediante la adicin de acido actico y la exposicin a un bao en ebullicin durante 3 minutos. Esto hace que las protenas precipiten y puedan

ser filtradas quedando solo una solucin libre de protenas y posibles productos por la accin de la enzima. Por otra parte el tubo No. 3 fue tomado como blanco; pues ste fue sometido a las mismas condiciones que el tubo No. 2, pero sin contener el extracto enzimtico, y en vez de este 1 mL de agua destilada, y aunque tena los mismos sustratos que los otros dos tubos y tambin se obtuvo una solucin libre de protenas, el comportamiento fue diferente. Posteriormente se realiz una cromatografa como mtodo para determinar cualitativamente la presencia de Acido Glutmico (Glu, E) como producto de la reaccin entre el cido -cetoglutarato y la Alanina. Especficamente, se realiz una cromatografa de reparto en capa fina (TLC Thin-Layer chromatography) la cual consiste a groso modo en la distribucin de los solutos (aminocidos) sobre la fase esttica de acuerdo a la afinidad con la fase mvil (Smith & Feinberg, 1966); para esta prctica, la fase esttica fue papel Whatman que est hecho a base de celulosa; y como fase mvil se us etanol, agua y amoniaco (80:10:10 respectivamente); tambin se utilizaron las sustancias citadas en la metodologa ( Anexo 1), realizando tres aplicaciones por cada punto para tener una concentracin de aminocidos adecuada, y se realiz el revelado con ninhidrina al 0,2% en acetona; que debido a su fuerte poder oxidante decarboxila y desamina al aminocido, esta ninhidrina reducida reacciona con otra molcula de ninhidrina no reducida y con el amoniaco resultante de la desaminacin formando un complejo violeta (Teijn,2005). En la Figura 4, las manchas correspondientes a la sustancia patrn indican la presencia de dos aminocidos diferentes. La Alanina, un aminocido no polar (hidrofbico), esta caracterstica le confiere una muy poca afinidad por el solvente de la cromatografa, lo que provoca un largo recorrido en el cromatograma (Smith & Feinberg, 1966); de modo que, la marca superior corresponde a este aminocido. Por deduccin, la marca inferior correspondera al cido Glutmico, sin embargo esta afirmacin se apoya en el hecho de que este aminocido es polar y debido a su gran afinidad con el solvente, recorrer poca distancia y tendr un Rf menor que el de la alanina, estos valores se confirman en la Tabla 1. En todas las columnas del cromatograma se pudo observar una mancha superior a la misma altura de la mancha de Alanina de la columna 4(P), de modo que las manchas de las columnas 1, 2 y 3 corresponden a la porcin de Alanina que no fue transaminada. La columna 1 que contena el filtrado libre de protenas con control a tiempo 0, present una ligera mancha inferior que demuestra la formacin de una leve transaminacin; aunque se intento detener a tiempo 0 la reaccin mediante la adicin de cido actico, se llev a cabo; lo que nos dice que esta reaccin tiende a suceder de manera espontnea; pues es una de las reacciones ms comunes de un organismo vivo. En la columna 2 que corresponde al filtrado libre de protenas sin inhibicin inmediata, se observ una mancha inferior de coloracin prpura oscura que tiene un

Rf cercano al del cido Glutmico obtenido en la columna 4(P) (Tabla 1); por tanto, se puede afirmar que hubo una transaminacin entre la Alanina y el c. -cetoglutrico, por medio de la alanina aminotransferasa, cuyo producto observado fue el cido Glutmico. En la columna 3 se aplic una preparacin sin extracto enzimtico, lo cual claramente se comprueba al observar en la Figura 4 la ausencia de una mancha prpura inferior y por ende la no realizacin de una transaminacin. La reaccin de Alanina + cido -cetoglutrico no solo tiene como producto el cido Glutmico, sino tambin, Piruvato (Anexo 2). Este ltimo no tuvo comprobacin en la prctica de laboratorio, sin embargo, para detectar el cido Pirvico existen varias pruebas; las ms utilizadas son la prueba del Nitroprusiato de Sodio y la prueba del 2,4 Dinitrofenilhidracina, que dan positivo al reaccionar con el carbonilo 7 etonico del piruvato mostrando un anillo verde o azul y una coloracin caf-rojiza oscura respectivamente. Estas pruebas requieren que la preparacin se encuentre a un pH ligeramente alcalino de 7.4, pues a este pH se inactiva la enzima piruvato descarboxilasa (Lozano & Campos, 2007) y se evita la formacin oxalacetato, un intermediario implicado en la gluconeogenesis. El proceso de la transaminacin es un proceso llevado a cabo por el metabolismo, ms especficamente por el catabolismo del nitrgeno (de los aminocidos).Este se da en el citosol de algunas clulas en algunas regiones de los animales, es llevado acabo para la sntesis de aminocidos a partir de otros aminocidos o de protenas. Se basa en el transporte del grupo amino de un aminocido a un -cetocido, as el aminocido de partida se transforma en un -cetocido y el -cetocido de partida en un aminocido. Esto se puede demostrar mediante la aparicin de Glutamato a partir del cetoglutarato presente en el sustrato ofrecido a la enzima transaminasa, para este caso la alanina aminotransferasa, que transporta mediante el piridoxal fosfato (derivado de la vitamina B6) que se encuentra en el sitio activo de la enzima (Muoz y Garca. 1997), el grupo amino de la alanina a el -cetoglutarato. Esta enzima es abundante en el hgado, corazn y msculo (Fuentes, 2003) por esto se utiliz el corazn de res. En algunas enfermedades a estos rganos, los procesos patolgicos crean injuria tisular y liberacin de estas enzimas al plasma, aumentando la concentracin de las mismas, siendo utilizado esta medicin de concentracin de la enzima como indicador para diagnstico y pronostico. Adems de que la transaminacin se da para la obtencin de distintos aminocidos, con unas excepciones como lo son lisina, prolina, hidrixiprolina y treonina, ocurre tambin como participante en los procesos de la obtencin de energa, el ciclo de Krebs. Un ejemplo de esto es la valina, la cual al ser metabolizada da cetoisovalerato, este a continuacin es rpidamente convertido en succinil-CoA y utilizado en el ciclo de Krebs, sin posibilidad de volver a transaminarse.

En conclusin, la transaminacin es una de las reacciones celulares ms importantes y comnmente realizadas en organismos animales, ya que a travs de ella se pueden originar aminocidos de los cuales haya deficiencia en el organismo y sean requeridos en alguna ruta metablica; sin embargo, para que haya un proceso de transaminacin efectivo, es necesario que el medio cumpla con la temperatura y acidez apropiadas a la enzima catalizadora. Adems, como se observ en la prctica, la cromatografa es un excelente mtodo para detectar una transaminacin positiva.

BIBLIOGRAFIA Badui S. 1999. Quimica de los Alimentos. 3 ed. 5 reimpresin. Editorial Alhambra Mexicana. Mxico. Berg J., Tymoczko J., Stryer L. Biochemistry. Sexta edicin. Estados Unidos. W. H. Freeman and Company. 2004. Pginas: 656 661 Bergmeyer, H.U., and Horder, M. IFCC Methods for the Measurement of Catalytic Concentration of Enzymes, Part 3 IFCC Method For Alanine Aminotransferase, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 18, 521 Fuentes X. 2003. Codex de Ciencias de Laboratorio Clnico. Elsevier Espaa. pp 740 Lozano A., Campos A., Gua No5: Reconocimiento de aldehdos y cetonas. Gua de Laboratorio de Qumica Orgnica. Bogot, Colombia. Universidad Jorge Tadeo Lozano. 2007. Pginas : 3-6 Nelson D. and Cox M., Lehninger Principles of biochemistry Quinta edicin. Madrid. W.H and Co, 2005. Pginas: Peret J., Sendra R., Pamblanco M., Ba, C. Fundamentos de Bioqumica. Primera edicin. Espaa. Universidad de Valencia, 2007. Paginas: 249, 296-297 Teijn J.M., Garrido A. Fundamentos de bioqumica structural. Primera edicin. Argentina. Grupo editor Alfaomega, 2005. Pginas 67-68 Smith I., Feinberg J. Paper and thin layer chromatography and electrophoresis. En Journal of Chromatography. [En lnea], 1966, Volumen 23, Pagina 185. [Citado Octubre 1 de 2011]. En lnea: http://www.sciencedirect.com. bd.univalle.edu.co/science/article/pii/S0021967301986728

Anexos Anexo 1: Gua de laboratorio de biologa celular y bioqumica II, prctica nmero 2, transaminacin

Anexo 2. Reaccin de la Alanina transaminasa como catalizador de la reaccin entre alanina y cido -cetoglutrico produciendo Piruvato y Acido glutmico.

Alanina