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2 LABORATORIO II Aminoacidos y Proteinas

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LABORATORIO Nº 2 DE BIOQUÍMICA DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS PROTEÍNAS I Y II

LUCY GARCIA ROJAS LORENA TORRES KLISLERTS VIVAS LUZ BENAVIDES YULIMAR BERROCAL

DOCENTE: MARTÍN NÚÑEZ CANTILLO

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD VALLEDUPAR-CESAR

Se encuentran en el protoplasma de todas las células animales y vegetales. algunas. pero su composición es variable según su origen. Método Van Slike. La reacción xantoproteíca se debe a la nitración de los anillos fenilos presentes en la tiroxina. triptófano y fenilalanina con producción de nitrocompuestos de color amarillo que se vuelven naranjados por la adición de álcalis. Millón. Fe (hemoglobina) Yodo (tiroglobulina). Contienen los elementos de C. mayor de 10. no obstante se han obtenido en forma cristalina. Son biopolímeros de aminoácidos. O y N y a veces otros elementos como el P (nucleoproteínas). en particular puentes de hidrogeno. Kjeldahl. Fibrosas (fibrina de la seda) y CONJUGADAS. todos presentan a nivel del grupo amino sobre el átomo de carbono alfa una configuración (L). Folin Gicolteau. cualitativas y cuantitativas para valorar e identificar proteínas: reacción de la Ninhidrina Biuret. las que por hidrólisis producen únicamente aminoácidos. La reacción de biuret es para reconocer enlaces peptídico dando con las proteínas color violeta. H. las cuales se clasifican en: SIMPLES. pueden ser Globulares (albúmina). En las proteínas naturales se encuentran 20 aminoácidos diferentes. químicas o biológicas por ejemplo. En cuanto al tamaño las proteínas. con excepción de la glicina. es prueba para grupo guanidino dando color rojo. Las estructuras secundarias y terciarias obedecen a otras fuerzas intra-moleculares. Son de naturaleza coloidal. Sakaguchi.INTRODUCCIÓN Las proteínas son péptidos de peso molecular muy alto.000. La forma fundamental depende de enlaces peptídicos entre cada par de ácidos animados en su orden específico. sin puntos de fusión característicos. de alto peso molecular. . Todas son ópticamente activas. las alteraciones en casos de desnaturalización se acompañan de modificaciones de las fuerzas de unión no covalentes que en última instancia establecen la forma o la geometría de las moléculas proteicas. Xantoproteíca. los péptidos rosa pálido y las gelatinas de color azul. La reacción de sakaguchi. Los cambios de propiedades físicas. Existen varias pruebas. Electroforesis Cromatográfica.

.OBJETIVOS ESPECÍFICOS Reconocer las principales propiedades de las proteínas y sus características. Entender como la estructura y funcionamiento de las células y por de los organismos dependientes de las proteínas que contienen.

. MATERIALES Y REACTIVOS Trípode Malla de asbesto Estufa Gradilla Goteros Balanza Pipetas Probetas Tubos de ensayo Mechero de Busen Agitador Erlenmeyer Beacker Embudo Ácido clorhídrico Ácido nítrico Ácido pícrico Ácido tánico Ácido fosfotunstico Ácido acético o Ácido tricoloacético Nitrato de plata Alcohol etílico Sulfato de cobre Cloruro mercúrico Nitroprusiato de sodio Hidróxido de sodio Hidróxido de amonio Cetona Reactivo de millón Reactivo de biuret. Ca). Fe. Mediante técnicas como la electroforesis se han clasificado en fracciones o grupos: albúmina. Las proteínas plasmáticas cumplen distintas funciones. también intervienen en la coagulación sanguínea y en el control de la distribución del liquido extracelular.PROTEÍNAS SÉRICAS El plasma sanguíneo contiene en solución coloidal una gran cantidad de proteínas. siendo su concentración aproxima de 7 g/100ml. soporte y vehículo de distintas sustancias (lípidos. y forman parte del sistema tampón del organismo debido a su naturaleza anfótera. B12. Estas fracciones están constituidas por un conjunto de proteínas con características físico-químicas semejantes. alfa. beta y gamma globulinas y fibrinógenos. en síntesis: nutrición celular.

REACCIÓN DE MILLÓN Agregar en un tubo de ensayo 3ml de albúmina. . REACCIÓN DEL BIURET Agregar a un tubo de ensayo 3ml de albúmina. COAGULACIÓN En 5 tubos de ensayo colocar porciones aproximadas de 2ml de albúmina (solución proteica).PROCEDIMIENTO 1. Observar y anotar. agregar 1 o 2 gotas de ácido acético diluido. darán positivo esta reacción. 2 gotas de solución de sulfato de cobre al 1% y observar. las proteínas que contienen tiroxina. ¿Qué se observa? No calentar en exceso porque la solución puede desaparecer. 3ml de solución NaOH al 10%. más 1 ó 2ml de ácido nítrico concentrado. más 5 gotas de reactivo de millón. Mezclar y calentar a 37 ºC durante 10 minutos. Filtrar la mezcla a través de una tela fina y guardar el filtrado para los experimentos siguientes. 5. batiendo la clara de huevo por un tiempo corto y mezclándola luego con cinco veces su volumen de agua. enfriar y agregar 4ml de solución de NaOH al 36% (o NH4OH). Tubo 2: agregar 4ml de etanol Tubo 3: agregar 1ml de solución concentrada de NaOH Tubo 4: agregar 1ml de HCl concentrado Tubo 5: agregar 1ml de HNO3 Anotar observaciones y reacciones químicas. Cuando ciertas proteínas se tratan con este reactivo se produce un color rojo o anaranjado debido a una reacción que es característica de los grupos fenólicos. Agregar a un tubo de ensayo 4ml de solución de albúmina. calentar por 10 minutos. ¿Qué sucede? Puede hacerse con trocitos de lana o seda natural. ¿A qué se debe la reacción? 4. calentar y observar el color. 3. Dejar enfriar y leer la extinción. REACCIÓN XANTOPROTEÍCA Esta preparación se debe a los grupos fenilos en la molécula de la proteína. observar. Y realizar lo siguiente: Tubo 1: calentar. tratando de disolver el producto coagulado utilizando solventes comunes de proteínas (cetona). 2. OBTENCIÓN DE ALBÚMINA Preparar una solución acuosa de albúmina de huevo.

cloruro mercurio o nitrato de plomo. más 5 gotas de solución de nitrato de plata. .6. observar y anotar los resultados. DESNATURALIZACIÓN *Ácidos Fuertes: Agregar en un tubo de ensayo 1ml de solución de proteína (albúmina) al 5%. *Iones Metálicos Pesados: agregar en un tubo de ensayo 1ml de solución de albúmina al 5% previamente alcalinizada. Observar y anotar. mezclar. adicionar 1ml de ácido tricloroacético.

Orifico hecho al Albúmina + Filtración de la huevo para sustraer agua solución la clara De lo anterior se concluye que la albúmina es una proteína que encuentra en casi todos los tejidos animales y además de eso se demuestra que es soluble en agua. Gotas de ácido acético . luego la batimos por un tiempo corto y se mezcló con cinco veces su volumen de agua. Y realizamos lo siguiente: En el tubo 1: sometimos a calentamiento la solución y agregamos 1 o 2 gotas de ácido acético diluido. COAGULACIÓN En 5 tubos de ensayo procedimos a colocar porciones aproximadas de 2ml de albúmina (solución proteica). Luego filtramos la solución a través de una tela fina dejando el filtrado para los experimentos siguientes. tratando de disolver el producto coagulado utilizando solventes comunes de proteínas (cetona). observamos que la albúmina se disolvió en el agua. Pudimos observar que se torno de un color blanco lechoso y no se obtuvo cambios. 1.INVESTIGACIÓN 1. 2. Describir en orden cada una de las reacciones y dar sus conclusiones. tomamos un huevo al cual se el hizo un pequeño orifico en su parte superior para sustraerle la clara de modo que la yema no se mezclara con la clara. la vertimos en un erlenmeyer. OBTENCIÓN DE ALBÚMINA Al preparar la solución acuosa de albúmina.

De esta forma. Se observó que se formaron partículas pequeñas que se fueron precipitando lentamente hasta llegar al fondo del tubo. alcohol. es decir. Observamos que se formó aglutinación y que al adicionar cetona ésta deshizo la coagulación. la albúmina se deteriora. 2 gotas de solución de sulfato de cobre al 1% y observamos. al adicionar etanol a albúmina se produce un coágulo de gran turbidez. 3. esto es debido a que las proteínas tienen diversos factores coagulantes pero entre ellos no se encuentran las bases que es el cado del NaOH. Mezclamos y calentamos a 37 ºC durante 10 minutos. REACCIÓN DEL BIURET Agregamos a un tubo de ensayo 3ml de albúmina.Solución más Formació Solución En esta reacción concluimos que las proteínas se pueden precipitar con formaciones de cetona n de Aplicació coágulos de al ser sometidas a temperaturas superiores a 70ºC o al ser tratadas con coágulos n de soluciones salinas. En el tubo 5: agregar 1ml de HNO3. En el tubo 3: agregamos 1ml de solución concentrada de NaOH. tomando la solución un color blanco lechoso. mientras que si son factores coagulantes los alcoholes y los ácidos. Observar y anotar. etc. ¿A qué se debe la reacción? . muy utilizado por su especial capacidad para disolver compuestos apolares como los hidrocarburos. etc. Por otro lado observamos que la cetona es un albúmina excelente disolvente calor orgánico. éteres. De lo anterior se puede decir que al alcohol a una proteína se realiza una prueba de estabilidad que se basa en el aumento de la estabilidad térmica de las proteínas de la albúmina durante el tiempo. 3ml de solución NaOH al 10%. Al agregarle 1ml de NaOH y de 2 a 5 gotas de alfa-naftol la solución obtuvo un color blanco. Al agregar HNO3 a la solución albuminita se observa que hubo una precipitación rápida y al adicionar cetona ésta disuelve la reacción tomando un amarrillo. pero no se mostró coagulación alguna. grasas. En el tubo 2: agregamos 4ml de etanol. por lo que indica una vez mas que la cetona es un buen disolvente orgánico. pero esta reacción se realiza de forma lenta. Tuvo 4: agregamos 1ml de HCl concentrado. ácidos. Dejar enfriar y leer la extinción. y especialmente por la transformación que ocurre en la forma nativa de la ovoalbúmina (N-ovoalbúmina) a una forma más estable (Sovoalbúmina).

Esta solución tomo un color violeta a amarillo caro. lo que indica que la proteína se desnaturalizó. tiroxina. es decir. dejamos enfriar y agregamos 4ml de solución de NaOH al 36% (o NH4OH). más 1 ó 2ml de ácido nítrico concentrado. más 5 gotas de reactivo de millón. Al calentar la solución se observa que se forma una capa amarilla gruesa. y ser sometido a calentamiento se observa que la solución toma un color anaranjado. 4. REACCIÓN XANTOPROTEÍCA Agregamos a un tubo de ensayo 4ml de solución de albúmina. se nitrogenan los anillos fenílicos de los aminoácidos. esto se debe a que la reacción es positiva. 5. que la proteína presenta grupos fenólicos. El hidróxido de sodio convierte el medio lo suficientemente básico de manera que ayuda a la precipitación y permite el cambio de color a anaranjado pueda darse. . REACCIÓN DE MILLÓN Al agregar en un tubo de ensayo 3ml de albúmina. se observo burbujeo luego cambio de color verdoso. calentamos por 10 minutos. como si hubiera una separación de sustancias formándose un liquido anaranjado oscuro la parte superior del tubo y otro liquido amarillento o anaranjado pero menos intenso que el anterior en el fondo del tubo. Observamos que al agregar a la solución de albúmina en la reacción se efectúo un aglutinamiento de color blanco y amarillento. esta reacción se debe a que las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta. se cristalizó la albumina e hizo precipitado. Se necesitan 2 ó más uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado. El resultado anterior es debido a que al agregarle ácido nítrico a las soluciones proteicas y del aminoácido. fenilalanina y triptófano y se forma un precipitado blanco que al calentar la solución cambia de color a amarillo. observamos. Después esperamos que se enfriara la solución y le agregamos 5 gotas de nitrito de sodio y presento una efervecencia y evaporización.Observamos que en la solución se produjo una reacción coloreada.

Sin embargo. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS Las proteínas pueden variar sus características de solubilidad mediante alteraciones en el medio acuoso en que se hallan disueltas. los ácidos o bases fuertes. por ejemplo. sustituyéndolo con grupos hidroxilo y dando como resultado proteínas desaminadas. c. Así. 6. Sales minerales: (NH4) Na2 SO4 Alcohol en distintas proporciones Ácidos orgánicos. De lo anterior decimos que al igual que el calor. *Iones Metálicos Pesados: agregamos en un tubo de ensayo 1ml de solución de albúmina al 5% previamente alcalinizada. f. se puede conseguir la precipitación mediante la adición de: a. etanol o iones de metales pesados alteran irreversiblemente la estructura secundaria de las proteínas. NHO3 Iones de metales pesados: Pb++. tricloacetico… Ácidos minerales_ HCL. DESNATURALIZACIÓN *Ácidos Fuertes: agregamos en un tubo de ensayo 1ml de solución de proteína (albúmina) al 5%. Cu++. mezclamos y observamos el ácido tricloroacético es un ácido orgánico débil que además está en baja concentración por lo que al cambiar en poco el pH la precipitación por desnaturalización de las proteínas puede darse. adicionamos 1ml de ácido tricloroacético. Observamos que hubo precipitación lo que indica que la reacción con metales pesados desnaturalizó la proteína. Este proceso. cloruro mercurio o nitrato de plomo.En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente ácido (ácido nítrico del reactivo) se condensan con el grupo fenólico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. más 5 gotas de solución de nitrato de plata. conocido como desnaturalización se ejemplifica en la coagulación y endurecimiento de la clara de huevo (albúmina) inducido por el calor. Hg++ Por calentamiento . e. La desnaturalización destruye la actividad fisiológica de las proteínas. d. b. pícrico. en el caso de la adición de ácido nítrico las proteínas reaccionan con el ácido nítrico liberando nitrógeno.

b. A 2ml de orina se añaden 2 gotas de disolución saturada de acido pírico. Describir algunas técnicas de separación de proteínas.05ml de acetato de plomo ó de cloruro de mercurio (II). El principio de separación de la cromatografía es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no. cromatografía de afinidad. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas. neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna. d. en general la desnaturalización de la proteína provocada por estos procedimientos resulta irreversible. y se produce precipitación inmediata. En un tubo e ensayo se colocan 2ml de disolución proteica y se calienta a ebullición. electroforesis. Esta técnica variando las concentraciones de etanol. c.Algunas veces la precipitación es irreversible. puede utilizarse en el fraccionamiento de proteínas séricas. No contiene albúmina puesto que no se efectúo precipitación. electroenfoque. Este criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las proteínas que se quieren separar: peso molecular. afinidad de una de ellas por alguna otra. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. sólo puede encontrarse entre las bolas. En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna: Cromatografía de intercambio iónico: La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga neta. se mezcla y parece un precipitado proteico. ALGUNAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Cromatografía de intercambio iónico. carga eléctrica. Si se produce precipitación apreciable. Se filtran los 4ml de mezcla y se añade al filtrado (NH) 4 SO2 cristalino hasta saturación: precipitan las albúminas. por lo que el efecto neto es el de acelerar . siendo eluidas las restantes. Cromatografía de filtración en gel: La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. a. A 2ml de disolución de clara de huevo (1x10) se añade 1ml de disolución 0. En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente). la orina contiene albúmina. positiva en el esquema. o 2 gotas de HCl concentrado. Para eluir las proteínas retenidas se pueden variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. A 2ml de suero humano se añaden 2ml de disolución saturada de (NH) 4 (SO)2 y se mezclan: precipitan las globulinas. La segunda proteína. por tamaño. etc. filtración por gel. e. A otra muestra de 2ml e suero humano en frío se añade 2ml de etanol. la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros. las proteínas precipitan.

Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad: En la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico. dependiendo de la técnica que se use. Lo bueno de la técnica es que no importa donde pongas la muestra. La resolución del método permite separar diferencias de pI de 0. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín. separándose por tanto por carga. la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica. las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. etc. y deja pasar el resto. y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. mientras que las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad). Lo importante de la técnica es conseguir el gradiente de pH. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elusión. más rápidamente. una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Así. Electroenfoque: se trata de la separación de péptidos o proteínas en un gradiente de pH. que se consigue principalmente por dos técnicas comerciales: Anfolitos o Anfolinas: Se trata de moléculas (TOP SECRET): . éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla. por la que las pequeñas se moverán mejor. o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja. variando la fuerza iónica del solvente. con lo que migrará hacia el polo negativo hasta detenerse con carga 0. primero de las proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido específico).02 unidades. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido. puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa.) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. y en segundo lugar las menores. y si se coloca por debajo de su pI tendrá carga positiva. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores. (pI). que los dirigirá al polo positivo. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas. En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. La naturaleza del ligando es muy variada.el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. con lo que migrará hacia el polo positivo hasta que al ir perdiendo carga se detiene en su punto isoeléctrico. como una malla). La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa. ya que si la pones por encima de su pI tendrá carga negativa. La elusión de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico.

aplicándole calor. pudiendo transmitir corriente aún con carga 0. donde pierden su estructura nativa. y de esta forma su óptimo funcionamiento y a veces también cambian sus propiedades físico-químicas. Las proteínas recién creadas experimentan una modificación en la que se agregan átomos o moléculas adicionales. Estas moléculas se sintetizan al azar. La acción de los detergentes es similar a la de los disolventes orgánicos. ya que como es normal migran hacia su punto isoeléctrico. Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrofóbico de las proteínas y desorganizan la estructura terciaria. Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Las proteínas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional (conformación química) y así su característico plegamiento de su estructura. una vez fabricados exponerlos a un campo eléctrico y fraccionar la columna. la desnaturalización es un cambio estructural de las proteínas o ácidos nucleicos. Éste es el proceso llamado desnaturalización. Son creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y ensamblan la combinación requerida de aminoácidos por la instrucción genética. y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los residuos hidrófobos de la proteína quedan encerrados dentro de su estructura y los elementos hidrófilos quedan expuestos al exterior. fuerza iónica). Inertes para que no modifiquen las proteínas. El fabricante no tiene más que. Una vez que finaliza este proceso. De bajo Pm.Altísima capacidad taponadora. no es capaz de cumplir su función celular. provocando su desnaturalización y precipitación. Las proteínas son filamentos largos de aminoácidos unidos en una secuencia específica. teniendo la propiedad de generar un gradiente de pH al ponerlos en contacto con un campo eléctrico. disolventes orgánicos. medir el pH de cada fracción y embotellar rangos de pH que saben que va a dar. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes. pH. la proteína comienza a plegarse sin alterar su secuencia (espontáneamente. Transmiten la corriente en su pI (sin carga). ácidos o álcalis). Como en algunos casos el fenómeno de la . Si la forma de la proteína es alterada por algún factor externo (por ejemplo. como el cobre. No absorben a 280 nm. ¿Qué es la desnaturalización de una proteína? ¿Cuál es la estructura responsable? Diga por lo menos 5 agentes desnaturalizantes de las proteínas. RTA: En bioquímica. La forma final de la proteína determina cómo interaccionará con el entorno. Son muy solubles. zinc e hierro. PREGUNTAS 1.

3. 4. para formar un complejo proteico. La secuencia determinara la forma de la proteína. Se estabilizan por la existencia de enlaces entre los radicales de los aminoácidos y la estructura cuaternaria Informa de la unión mediante enlaces débiles de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria. 2. se forma una sustancia compleja denominada Biuret. cada uno de los cuales informa de la disposición en el espacio de la anterior estructura.desnaturalización es reversible. el pH. pero no los aminoácidos. y por tanto. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado. la temperatura. RTA: La reacción de Biuret la producen los péptidos y las proteínas. lo que origina una disposición globular. de fórmula: Debido a dicha reacción fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas ovoalbúmina precipito a una coloración violeta. la fuerza iónica. su función.CO. es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en: la polaridad del disolvente. ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (. en la estructura primaria. Esta estructura comienza por la secuencia de aminoácidos de la proteína.NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos. Son frecuentes tres tipos de estructura secundaria: a-hélice. La estructura terciaria de una proteína informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma. Por tanto. Hélice de colágeno y Conformación b. Indique la estructura del complejo que se forma en la reacción de Biuret. ¿Cuáles son los principales métodos de determinación de proteína totales? RTA: Los métodos para la determinación de proteínas séricas totales son muy antiguos y se basa en la determinación del nitrógeno proteico (método Kjeldahl) que aunque resulta muy exacto es muy lento y complicado. idénticas o no. A los 2ml de peptona se le agregaron 2 gotas del reactivo de Biuret Precipitando a una coloración amarilla la reacción nos torna negativa al no haber presencia de proteínas. Cada cadena polipeptídica recibe el nombre de protómero. La secuencia se escribe enumerando los aminoácidos desde el extremo N-Terminal (primer aminoácido con su grupo amino libre) hasta el C-Terminal (último aminoácido con su grupo carboxilo libre). La estructura secundaria se forma por la disposición de la secuencia de aminoácidos (estructura primaria) en el espacio. ¿Cómo puede establecerse la secuencia de aminoácidos en una proteína? ¿Cómo se separan los aminoácidos de una proteína más fácilmente? RTA: La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales. los métodos más rápidos empleados son: . Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva.

Desempeña un papel fundamental en numerosas reacciones metabólicas y bioquímicas como la síntesis y reparación del ADN. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto. aumentar la proliferación de los linfocitos. fuertes o débiles. especialmente el sistema inmunitario. lo que influye en la producción de citoquinas y el tipo de respuesta (celular o humoral) que se desarrolla. Cuál es la función del glutatión RTA: Glutatión tiene múltiples funciones:  Es el mayor antioxidante endógeno producido por las células. 5. tanto orgánicos como inorgánicos. el transporte de aminoácidos y la activación de la enzima.7g/dl en recién nacidos. la síntesis de proteínas. de partición. Por lo tanto. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas. grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. A través de la conjugación directa. el sistema nervioso. desintoxica muchos xenobióticos (compuestos extraños) y los agentes carcinógenos. la modulación de la presentación de antígenos a los linfocitos. la síntesis de prostaglandinas. de afinidad? RTA: cromatografía De Intercambio Iónico: La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. de exclusión molecular. en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. así como el mantenimiento de los antioxidantes exógenos. participando directamente en la neutralización de radicales libres y compuestos de oxígeno reactivo. *Método de Lowry *Método de absorción en el ultravioleta Como muestra se utilizan sueros y exudados (líquido en el que se escapan proteínas por una disminución de la permeabilidad).    6. y la regulación de la apoptosis. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo . manteniendo así el control de la respuesta inmune. aumentar la actividad de eliminación de las células T citotóxicas y las células NK.*Método de Biuret y la Refractometría: Para sueros claros: Refractometría Reacción del Biuret es el método referencia. Los valores de referencia son de 66-83 g/L para adultos y de 5. Es esencial en el sistema inmunológico para ejercer todo su potencial. por ejemplo. Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos. En el caso de intercambiadores aniónicos. el sistema gastrointestinal y los pulmones. ¿Qué es cromatografía de intercambio iónico. lo que aumenta la magnitud de la respuesta. de absorción. como las vitaminas C y E en sus formas reducidas (activas). todos los sistemas del cuerpo pueden ser afectados por el estado del sistema de glutatión.

Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). . Cromatografía De Exclusión: La cromatografía de exclusión. derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. escalable y rápida. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. mecánica y químicamente. Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables. de esto se deduce que el volumen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Es una técnica reproducible. el tamaño de la partícula y el flujo de elusión. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos. tener bajo contenido en grupos iónicos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas. En resumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro. Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos. se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex). por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas muy cargadas.catiónicos a cualquier valor de pH. mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen. determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar. derivados de agarosa (Sepharosa). Cromatografía De Adsorción: La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel. El tiempo de elusión es proporcional al peso molecular de los mismos. La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. etc. En este tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. aunque en algunos casos se superponen. uniformidad de poro y tamaño. En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. siendo la primera la preferida. como las proteínas.

una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. como su nombre lo indica. Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad: En la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando. Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar.Cromatografía de reparto: La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la cromatografía unida químicamente. puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes. y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. y deja pasar el resto. En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elusión. . Esta técnica puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía líquido-líquido necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil. En el segundo caso. la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. bebidas refrescantes entre otras. La elusión de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico. o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen.) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. . Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. etc. variando la fuerza iónica del solvente. que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja. porosas y uniformes. primero de las proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido específico). o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad). antioxidantes. aflatoxinas. La naturaleza del ligando es muy variada. En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar.

CONCLUSIÓN En las practicas realizadas en el laboratorio de proteínas II hemos comprendido y aprendido que las moléculas de las proteínas son capaces de formar o desarrollar con el agua soluciones coloidales y que estas a su vez se pueden precipitar con formación de coágulos al ser sometidas a calentamiento o al ser tratadas con ciertas sustancias a las cuales reaccionan positivamente. esta desnaturalización se produce debido a los agentes indicados. . La coagulación de toda proteína se debe al proceso conocido como desnaturalización que además es irreversible. que al entrar en contacto con la proteína destruyen su estructura terciaria y cuaternaria .

com/trabajos-tesis-monografias-resumenes www.BIBLIOGRAFÍA INTERNET biozoot.iespana. México .es/estrucproteinas temas-estudio.org/apuntes/proteinas_b1 Murray.avolaje. R. Editorial El Manual Moderno. Et al (1997): BIOQUIMICA DE HARPER.

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