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MICROBIOLOGA AGRCOLA

Leonor Carrillo
Dra. en Ciencias Qumicas (Orientacin Biolgica) Profesora Titular en Facultad de Ciencias Agrarias, UNJu y Facultad de Ingeniera, UNSa

Universidad Nacional de Salta ISBN 987-9381-16-5


(http://www.unsa.edu.ar/matbib)

2003

CONTENIDO
1.Microorganismos. Reinos. Organismos procariticos: eubacterias, arqueobacterias, actinomicetos, cianobacterias, mixobacterias. Organismos eucariticos: mohos levaduras, macromicetos, mixomicetos, protozoos, algas, lquenes. Organismos acelulares: virus, viroides, priones. Transferencia gentica en bacterias: conjugacin, transformacin, transduccin, fusin de protoplastos. 2. Vida y muerte de los microorganismos. Crecimiento. Tipo de nutricin. Factores de crecimiento orgnicos y minerales. Transporte de solutos. Factores ambientales: agua y presin osmtica, tensin superficial, pH, oxgeno, potencial redox, temperatura. Medios de cultivo. Esterilizacin. Accin del calor, radiaciones, luz ultravioleta, microondas y ultrasonido. Separacin por filtracin. Desinfeccin. Interacciones microbianas: antibiosis, mutualismo y simbiosis. Fijacin simbitica del nitrgeno. Micorrizas. Biopelculas. Predacin. 3. Actividad microbiana. Suelo. Metabolismo. Degradacin de biopolmeros: celulosa, almidn, levanos, xilanos y otras hemicelulosas, pectinas, quitina, lignina, lpidos, protenas, polinucletidos. Metabolismo productor de energa. Respiracin: degradacin de hexosas, ciclo del cido tricarboxlico, cadena de transporte de electrones, fosforilaciones. Fermentaciones: lcticas, alcohlica, propinicas, frmicas, butricobutanlica, acticas, de aminocidos. Oxidaciones incompletas. Respiracin anaerbica. Desnitrificacin, reduccin a nitritos, sulfatorreduccin y metanognesis. Bacterias autotrficas. Nitrificacin, sulfooxidacin, ferrooxidacin. Biosntesis. Sntesis de protenas y otros compuestos. 4. Estructuras fngicas. Estructuras somticas. Estructuras reproductoras anamrficas y teleomrficas. 5. Rumen y biogas. Metanognesis, diversidad de las arqueobacterias metanognicas. Rumen, un digestor natural. Caractersticas del biogas. Digestores anaerbicos, materia prima, factores ambientales, criterios de diseo y construccin, operacin, peligros potenciales y seguridad. 6. Micotoxinas. Hongos en el campo y el almacenamiento. Honhos toxignicos y micotoxinas naturales. Produccin de micotoxinas. Peligros. Prevencin. 7. Hongos. Clasificacin. Macromicetos. Ascomycota y Basidiomycota. Hongos micorrizantes, inoculacin de plantines. Cultivo del champin, obtencin del micelio, preparacin del compost, siembra del inculo, produccin. Cultivo de hongos lignvoros, preparacin del substrato, inoculacin y produccin de las setas, cultivo sobre troncos. Apndice Medios de cultivo y esterilizacin. Aislamiento y cultivo de microorganismos. Fijacin simbitica de nitrgeno en leguminosas. Microorganismos del suelo. Inhibidores y desinfectantes. Digestin anaerbica de residuos agrcolas. Morfologa microscpica de hongos. Identificacin de mohos toxignicos. Micorrizas. Microorganismos del agua.

NDICE
Actinomicetos 1-8 fijadores de nitrgeno 2-7 Aerobio 2-7 Agua 2-5 actividad 2-5 humedad relativa 2-5 microorganismos A-31 potencial 2-6 Algas 1-13 Amonificacin A-16 Anaerobio 2-7, 3-19 Antibacteriano 2-14, A-21 Antibiosis 2-14 Antifngico 2-14, A-21 Arqueobacterias 1-7, 3-21, 5-2 Autottrofo 2-2, 3-21, A-2 Bacterias butricas 3-19 celulolticas 3-6 eubacterias 1-4 fijadoras simbiticas 2 -16 fijadoras vida libre 3-24 formas 1-7 gram-positivas 1-4 gram-negativas 1-4 halfilas 1-8 lisognicas 1-14 metangenas 1-8, 3-21, 5-1 ruminales 3-21, 5-4 termoacidfilas 1-8 Bactericida 2-14 Bacteriocinas 2-14 Bacterifago 1 -14 Bacteriosttico 2-14 Bacteroide 2-16, 3-25 Biodegradacin 3-5 Biogas 5 -1 caractersticas 5-8 Biopelcula 2-18 Biosntesis 3-20, 3-23 cidos grasos 3-25 aminocidos 3-23 glcidos 3-26 nucletidos 3-25 protenas 3 -23 Cadena respiratoria 3-16, 3 -20 Capacidad de campo 2-6, 3-3 Catabolismo 3-14 Clulas

eucariticas 1-10 procariticas 1-3 Cianobacterias 1-9, 3 -25 Ciclo del azufre 3-21 citrato 3-16 nitrgeno 3 -21 Colonias de bacterias 1-6 Coloraciones A-10 Crecimiento 2-1 Cultivos bacterias 2-9, A-8 hongos 7-11, 7-12, A-11 medios 2 -9, A-2 Degradacin de almidn 3-8 biopolmeros 3-4 celulosa 3-6, A-18 hemicelulosas 3-9 hexosas 3-15 levanos 3-15 lignina 3-11 lpidos 3-12 pectinas 3-10 polinucletidos 3 -14 protenas 3-13 quitina 3-11 xilanos 3-9 Desinfeccin 2-13, A-21 Desnitrificacin 3-19, A-16 Digestin anaerbica 5-2, A-23 carga 5-13, 5-14 construccin 5-10 criterios de diseo 5-10 digestores rurales 5-5 etapas 5-2 factores ambientales 5-9 microorganismos 5-2 operacin 5 -13 otros digestores 5-6 parmetros 5-7. 5-11 residuos 5-6 seguridad 5 -14 Divisin celular 1-7 Endosporos bacterianos 1-6 termorresistencia 2-11 Esporas fngicas 1-11, 4-2 Esterilizacin calor 2-11, A-3 filtracin 2-13, A-4 presin autoclave 2-11 radiaciones 2-12

Factores de crecimiento 2-3 Factores ambientales 2-5, 3-3, 5-9 actividad agua 2-5 luz ultravioleta 2 -13 microondas 2-13 oxgeno 2-7 pH 2 -6 potencial agua 2-6 potencial de reduccin 2-8 presin osmtica 2-5 radiaciones 2-12 temperatura 2-8, 3-3 tensin superficial 2-6, 2-14 ultrasonido 2-13 Facultativo 2-7 Fermentaciones 3-17 actica 3-19 cida mixta 3-18 aminocidos 3-19 butanodilica 3 -18 butrico-butanlica 3-19 etanlica 3-18 frmicas 3 -18 lcticas 3-17 propinicas 3-18 Ferrooxidacin 3-22 Fijacin del CO2 3-26 Fijacin de nitrgeno vida libre 3-24, A-17 inoculante 2-17, A-13 mecanismo 3 -24 simbitica 2-16, A-13 Flagelos bacterianos 1-5 Fotosntesis bacteriana 3-26 Fottrofo 2-2, 3-26 Gentica bacteriana 1-15 conjugacin 1-16 genoma 1-4 plsmidos 1-6 recombinacin 1-16 replicacin 1-15 transduccin 1-18 transforma cin 1-17 Halfilo 2-6 Hetertrofo 2-2, A-2 Hongos 4-1, 7-1, A-25 ascomicetos 4-4, 7 -3 anamorfos 4-2 basidiomicetos 4-5, 7-4 clasificacin 7-1 champin 7-11 cultivo 7-11, 7-12

deteriorantes 6-1 estructuras somticas 4-1 estruct. reproductoras 4-1 levaduras 1 -12 lignvoros 3 -11, 7 -12 macromicetos 1-12, 7-3 mohos 1-11 micorrizantes 2-18, 7-8, A -29 teleomorfos 4-4 Humedad relativa 2-5 Inoculantes bacterianos 2-17, A-13 fngicos 7-10 Interacciones microbianas 2-15 Levaduras 1-12, 4-1 Lquenes 1-13 Macromicetos 1-12, 7 -3 Medios de cultivo 2-9, A-2 Membranas bacterianas citoplasmtica 1-4 internas 3-22 Mesfilo 2-8 Metabolismo 3-4 bacteroides 3-25 productor de energa 3-14, 3 -20 Metabolitos secundarios 3 -26, 6 -1 Metanognesis 3-21, 5-1 Micorrizas ectomicorriza 2-18, 7-9, A-29 endomicorriza 2-18, 7-9, A-29 inoculacin 7-10. A-29 Micotoxinas 6-1 mohos toxignicos 6-3, A-27 prevencin 6-6 principales toxinas 6-3 produccin 6-2 toxicidad 6-4 Microorganismos 1-1 agua A-31 amilolticos 3-8 celulolticos 3-6 desnitrificantes 3 -19 eucariotas 1-10 lignvoros 3 -11, 7 -12 pectinolticos 3-10 procariotas 1-3 quitinolticos 3-11 suelo 3-1 tamao 1-1, A-12 Micronutrientes 2-3 Mixobacterias 1-9 Mixomicetos 1-12

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice

Apndice
Gua de trabajos prcticos
CONTENIDO
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Medios de cultivo y esterilizacin Aislamiento y cultivo de microorganismos Fijacin simbitica de N 2 en leguminosas Microorganismos del suelo Inhibidores y desinfectantes Digestin anaerbica de residuos agrcolas Morfologa microscpica de hongos Identificacin de mohos toxignicos Micorrizas

10. Microorganismos del agua

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TRABAJO N 1. Medios de cultivo y esterilizacin


Objetivo. Preparar los substratos o medios de cultivo, cuya composicin varia segn el tipo de

organismos y la selectividad esperada, para estudiar los microorganismos en el laboratorio. Esterilizar estos materiales para eliminar los microorganismos que pudieran alterarlos antes del uso.

Introduccin
Nutricin

Los microorganismos toman del ambiente circundante los materiales o nutrientes que son el punto de partida para las reacciones metablicas que los convierten en constituyentes celulares. Hay nutrientes necesarios sin los cuales una clula no puede crecer, y otros tiles pero n o indispensables. La primera divisin en las categoras nutricionales tiene en cuenta dos parmetros: la naturaleza de la fuente de energa y la naturaleza de la fuente principal de carbono. Los organismos que usan la luz como fuente de energa se denominan fottrofos y los que utilizan fuentes de energa qumica se denominan quimitrofos. Los que emplean CO 2 como principal fuente de carbono se definen como auttrofos, pero los que utilizan compuestos orgnicos para el mismo fin se llaman hetertrofos. Los microorganismos necesitan una diversidad de minerales para su crecimiento, y los ms comunes son el potasio, sodio, magnesio, calcio e hierro. Los factores de crecimiento son compuestos orgnicos especficos requeridos en muy pequeas cantidades y no puede ser sintetizados por la clula.

Diseo de un medio de cultivo


En el cuadro siguiente se consideran tres medios de distinta complejidad. Medio 1 agua cloruro de amonio fosfato dipotsico carbonato de calcio sulfato de magnesio sulfato ferroso cloruro de calcio sales inorgnicas de Mn, Mo, Cu, Co, Zn Medio 2 agua peptona o triptona extracto de carne agar Medio 3 agua peptona de soja glucosa extracto de levadura agar

1L 1g 1g 1g 10 mg 10 mg 10 mg 0,02 mg de cada uno

1L 5g 3g 15 g

1L 10 g 10 g 2,5 g 15 g

Al elaborar un medio de cultivo para un organismo cualquiera, el objetivo pricipal consiste en proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, en concentraciones que permitan un buen crecimiento. El punto de arranque es componer una base mineral que proporcione las sales inorgnicas que pueden suministrarse a cualquier organismo. Esta solucin puede suplementarse luego, si es necesario, con una fuente de carbono, una de energa, una de nitrgeno y algn factor de crecimiento requerido. El medio 1 puede permitir el crecimiento de bacterias nitritantes auttrofas que usan el dixido de carbono como fuente de carbono y oxidan amonio para obtener energa. El medio 2 es un medio complejo que favorece el desarrollo de muchas bacterias hetertrofas que obtienen energa y tambin carbono de aminocidos y pptidos, pero no requieren factores de crecimiento. El 3 contiene glucosa, varios constituyentes nitrogenados orgnicos y factores de crecimiento como para cubrir las necesidades nutricionales de mohos y levaduras. Cualquier medio adecuado para el crecimiento de un organismo especfico es, en cierto modo, selectivo para l. Los microorganismos deseados pueden obtenerse de los ambientes naturales

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tales como el suelo, empleando medios selectivos. Como agente gelificante de los medios de cultivo se utiliza comnmente el agar que es obtenido de algas pero no es nutriente para la mayora de los microorganismos. El gel de agar es firme a las temperaturas de incubacin pero se convierte en lquido (sol) cuando se calienta a la temperatura de ebullicin del agua, gelificando nuevamente cuando se enfria a 45C. Otra manera de proporcionar una superficie nutritiva es utilizar un filtro de membrana de esteres de celulosa depositado sobre un disco de absorbente embebido con el medio de cultivo. El medio traspasa los poros permitiendo el desarrollo de los microorganismos que estn en la superficie. El extracto de carne es un extracto acuoso de msculo de bovino, concentrado hasta una consistencia pastosa o desecada hasta polvo, que contiene compuestos solubles tales como azcares, aminocidos y sales. El hidrolizado de protena se obtiene por digestin de msculo con pepsina (peptona) o tripsina (triptona) o de casena (casitona, tripticase) o de proteina de soja (peptona de soja). Los medios complejos deshidratados contienen algunos componentes cuya concentracin vara con cada partida y suelen tener una baja capacidad reguladora del pH.

Esterilizacin
Esterilizar significa eliminar toda clase de microorganismos. Esto puede realizarse de diferentes modos. Pueden eliminarse las bacterias del aire por filtracin, como en las cmaras de flujo laminar estril, y de los lquido a travs de membranas fltrantes u otro filtro. La destruccin de las bacterias puede hacerse mediante calor seco o hmedo para el tratamiento de la mayora de los materiales, o rayos ultravioletas para el caso de superficies, o con radiaciones ionizantes para esterilizar plsticos deseartables. El calor seco se utiliza en estufa de aire caliente, pero no es un mtodo eficaz de calentamiento porque el aire es un mal conductor del calor. En ausencia de humedad las formas ms resistentes (endosporos bacterianos) requieren temperaturas por sobre 160C durante una hora y media para morir. El vapor a presin es el procedimiento ms efectivo de esterilizacin por calor hmedo. El vapor a una presin absoluta de 2,066 kg/cm2 proporciona una temperatura de 120,6C que es mortal para los endosporos bacterianos en pocos minutos, pero el tiempo de aplicacin vara segn el tiempo necesario para homogeneizar la temperatura en el material tratado. La presin absoluta a la que est sometido el material dentro d el autoclave es igual a la presin leda en el manmetro sumada a la presin atmosfrica del lugar. Como esta ltima varia con la altura sobre el nivel del mar, debe calcularse la presin manomtrica necesaria para llevar a cabo la esterilizacin en cada localidad, haciendo caso omiso de las graduaciones en temperaturas adicionadas al manmetro por los fabricantes a nivel del mar. En la figura 1 se ven las curvas de temperaturas alcanzadas en funcin del tiempo en un autoclave con distinto grado de purgado del aire. La figura 2 muestra el tiempo requerido para esterilizar distintos volmenes a 120,6C. La temperatura de ebullicin del agua puede ser usada para esterilizar materiales nutritivos que se alteraran a temperaturas mayores, mediante el siguiente artilugio: el material es tratado durante 30 minutos el primer da e incubado a la temperatura ambiente, vuelto a calentar 30 minutos el segundo da y otra vez incubado, para finalmente calentarla otros 30 minutos el tercer da. El tratamiento durante el primer da destruye las formas vegetativas, el perodo de

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice incubacin permite la germinacin de muchos endosporos y las formas sensibles originadas mueren con el segundo calentamiento. Los endosporos que persistieron germinarn durante el segundo perodo de incubacin y las clulas formadas morirn con el tercer calentamiento. Como se ve, la tindalizacin es efectiva nicamente cuando el medio a esterilizar es favorable para la germinacin de los esporos. No destruir los endosporos de anaerobios si la incubacin no se lleva a cabo en condiciones de anaerobisis y tampoco destruir a los endosporos del grupo termoflico. Teniendo en cuenta la cintica microbiana el fin prctico de la esterilizacin mediante un agente letal es lograr que la probabilidad de que el material tratado contenga tan slo un superviviente, sea muy pequea. Los procedimientos habituales de esterilizacin se proyectan siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

Filtracin
Los microorganismos quedan retenidos por el pequeo tamao de los poros del filtro y con algunos tipos de materiales filtrantes por adsorcin sobre los mismos, adems de la influencia del pH del lquido sobre las cargas de los microorganismos y el filtro. Comnmente en el laboratorio se usan membranas de esteres de celulosa con porosidades de 0,45 m 0,2 m, pero tambin suelen usarse en otros casos unos filtros de porcelana o vidrio fritado (sinterizado).

Procedimiento
Preparacin del material de vidrio

Obturar con algodn la extremidad no aguzada de las pipetas con la ayuda de un punzn. Colocar dos o tres de ellas en un sobre de papel y cerrarlo con broches metlicos, o bien envolverlas separadamente en una tira de papel. Envolver con papel cada caja de Petri cerrada. Tapar los tubos de ensayo con algodn prensado de tal modo que, se pueda quitar y colocar el tapn sin deformarlo. Reunir unos diez tubos en un paquete.

Esterilizacin por aire caliente


El material limpio y bien seco, una vez tapado con algodn y/o envuelto con papel, se ubica en el interior de la estufa (horno o esterilizador). Luego se calienta hasta que la temperatura alcance 170C y se la mantiene durante 30 a 60 minutos enfriar segn la carga. Se deja enfriar el aparato antes de abrir, para evitar la rotura del vidrio por el contacto brusco con el aire fro. Al

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terminar la operacin, el algodn y/o el papel de diario tendrn un color tostado plido. Desde los 150C ambos comienzan a amarillear, pero a los 180C pierden la propiedad de detener las bacterias y se forman residuos carbonosos ms o menos antispticos.

Control de la eficacia de la esterilizacin

Se coloca en la estufa, junto con el material de vidrio, un tubo con endosporos bacterianos (cultivo seco o suelo tamizado). Una vez sometido al tratamiento trmico, se le agrega un medio nutritivo lquido y se incuba a 30C durante 48 horas. Si se ha logrado la esterilizacin, no habr desarrollo bacteriano.

Preparacin de medios de cultivo

La mayora de las bacterias hetertrafas pueden multiplicarse en el medio 2 denominado " agar nutritivo". Para disolver el agar se calienta el recipiente en un bao de agua hirviente o en el autoclave a vapor fluente. El pH del medio debe estar prximo a 7. Si se prepara sin agar se obtiene el medio llamado "caldo nutritivo". Los hongos suelen crecer ms lento que las bacterias y toleran mejor la acidez, por lo que suele usarse para su cultivo el medio 3 conocido como "agar micolgico" cuyo pH es aproximadamente 5,6, al que se le aadi extracto de levadura para que desarrollen aun los organismos exigentes en vitaminas. Los medios se distribuyen en tubos de ensayo o en matraces de Erlenmeyer ocupando slo un tercio de su capacidad. Tanto los tubos como los matraces llevan tapones de algodn, excepto cuando tienen tapa a rosca esterilizable. Los tubos se renen en cestos y se los cubre con dos o tres hojas de papel poroso donde se escribe con lpiz el nombre del contenido. Se cubren los matraces con un capuchn de papel y un hilo atado de tal forma que pueda quitarse fcilmente. Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave.

Esterilizacin por vapor de agua a presin

En el autoclave se logra que la temperatura del vapor de agua sea superior a la ebullicin (96C a 1300 m s.n.m.) por medio de un aumento de la presin, luego de la eliminacin del aire por la espita o vlvula de purga. Si funciona a 1,18 kg/cm2 por sobre la presin atmosfrica promedio local (0,88 kg/cm2 = 884 HPa), el agua hervir a 121C. Al mantener esta temperatura durante 15 minutos se logra la destruccin de toda forma de vida en volmenes menores a 100 mL. El mismo resultado se alcanza prcticamente en 2 de presin manomtrica) materiales poco contaminados, calentando a 115C (0,84 kg/cm durante 20 minutos. Los slidos o liquidos muy viscosos deben ser calentandos a 121C durante 30 minutos. Si el autoclave est muy cargado, o los volmenes son mayores, es necesario prolongar el tiempo de calentamiento. Con estas condiciones de tratamiento pueden sobrevivir los endosporos de bacterias termoflicas, pero stas no crecen a las temperaturas comunes de incubacin (25 - 37C). Colocar agua hasta la rejilla, ubicar los recipientes y cerrar el autoclave, ajustando las mariposas opuestas para que la tapa quede bien apoyada sobre la junta de goma. Encender el mechero. Cerrar la espita, o vlvula de purga, recin cuando sale un chorro de vapor continuo pues entonces se ha logrado purgar el aparato. A partir de este momento comienza a aumentar la presin, la que se regula y mantiene con la altura de la llama. Vigilar el autoclave durante la esterilizacin. Cumplido el tiempo, cerrar la llave de gas y esperar hasta que la aguja del manmetro vuelva a cero, antes de abrir la espita para igualar las presiones, interna y externa. Luego abrir la tapa. Si se abriera la espita durante el enfriamiento, la brusca descompresin producirla la ebullicin violenta de los lquidos y los proyectarla fuera de los recipientes. Por otra parte si se abre demasido tarde, el vapor se habr condensado sobre los papeles y algodones, y se habr acelerado el deterioro de la junta de goma por el vacio formado.

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Control de la temperatura de esterilizacin


Se coloca un tubito con cido benzoico en polvo (p.f. 121C) junto al material a esterilizar.. Si se alcanza la temperatura de fusin durante el proceso de esterilizacin, luego del enfriamiento quedar una masa homognea de cido benzoico. Tambin se usan mezclas indicadoras adheridas sobre cartn u otro material, tal como la compuesta por carbonato de plomo + azufre precipitado + carbonato de litio (10 + 1+ 3). Esta mezcla vira al gris despus de 30 minutos a 100C, en 3 4 minutos a 110C y en 30 segundos a 121C. Toma color negro si est expuesta ms de 30 minutos a 110C y en 5 minutos a 121C. Se eliminan los bacterias de las soluciones que se descomponen o inactivan al someterlas a la temperatura del autoclave, pasndolas a travs de membranas con poros de 0,2 0,45 m u otros filtros. La membrana o disco filtrante se coloca sobre una superficie porosa rgida, en una suerte de embudo desmontable adaptado a un matraz de Kitasato (ver figura 3) mediante un tapn de goma, para poder hacer un vacio parcial con una bomba o una trompa de agua. La tubuladura lateral del matraz se conecta a un tubo engrosado en su parte media, donde se coloca algodn. Se envuelve el conjunto con papel y se esteriliza en el autoclave. Despus se ubica el disco filtrante en el embudo desmontable cumpliendo con las reglas de asepsia y se conecta el matraz de Kitasato a la trompa de agua o la bomba de vaco.

Esterilizacin por filtracin

Control de la eficiencia de la filtracin


Dos porciones del material nutritivo filtrado se transfieren en condiciones de asepsia a recipientes estriles y se incuban, uno a 30C y otro a 45C, d urante 48 horas. Si se logr la esterilizacin no debe haber desarrollo microbiano.
Bibliografia
o o o o

Madigan TM et al. Brock- Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998 Stanier RY et al. Microbiologa. Revert, Barcelona, 1984 Carpenter P, Microbiologa, Interamericana, Mxico, 1979 Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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TRABAJO N 2. Aislamiento y cultivo de microorganismos


Objetivo. Separar por mtodos fsicos los microrganismos, provenientes de un ambiente natural,

de tal manera que al multiplicarse sobre un substrato nutritivo se obtenga una poblacin (en el caso de bacterias o levaduras) o un individuo (en el caso de un moho). Reconocer al microscopio las caractersticas generales de los microorganismos mediante preparaciones en fresco o coloraciones de extendidos del material.

Introduccin
Microbios uni y pluricelulares
Los organismos ms sencillos son aqullos que estn constituidos por una sola clula. Como las clulas se miden en micrmetros ( m) estos organismos unicelulares caen dentro de la categora general de microbios o microorganismos. La organizacin unicelular se observa en protozoos, algunas algas, levaduras y la mayora de las bacterias. Un tipo ms complejo de organizacin biolgica es la de los organismos pluricelulares. Aunque surgen en general a partir de una sola clula, en estado maduro constan de varias clulas permanentemente unidas unas a otras de un modo caracterstico, lo cual le confiere una forma tpica al organismo. As un moho esta compuesto por filamentos ramificados. Cada filamento se denomina hifa y al conjunto de hifas se lo llama micelio.

Aislamiento, cultivo

Dos clases de operaciones fundamentales en la microbiologa clsica son el aislamiento o separacin de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza, y el cultivo o crecimiento del microorganismo en medios artificiales bajo condiciones de laboratorio. Estas operaciones son bsicamente iguales para el estudio de las bacterias, los hongos, las algas, los protozoos y las lineas de clulas vegetales o animales (cultivo de tejidos). Para el aislamiento directo se emplean medios gelificados. Cuando un inoculo mixto que contiene una cierta variedad de organismos diferentes se extiende directamente sobre la superficie de un medio gelificado, todos aqullos que puedan crecer sobre el mismo producirn colonias. La dispersin de los microbios sobre el medio elimina gran parte de la competencia por los nutrientes y por ello algunos que crecen lentamente son capaces de multiplicarse en el mismo ambiente de los que crecen rpidamente. Como consecuencia del aislamiento aparecen luego de la incubacin, poblaciones de bacterias y levaduras e individuos fngicos sobre la placadel medio de cultivo. Se los puede mantener vivos en el laboratorio mediante transplantes a otros medios de cultivo.

Ambiente
Los principales ambientes naturales de los microorganismos son el suelo y el agua. Muchos organismos se encuentran en una capa delgada de suelo de algunos decmetros de espesor. Los microrganismos de las masas de agua, por ejemplo lagos, estn concentrados en la superficie y en el fondo por encima del cieno. Los microorganismos transportados por el aire son seres que accidentalmente se encuentran en este medio y provienen del suelo, agua u otros organismos vivos. Es necesario que haya ciertas condiciones en el ambiente para que sirva como reservorio de los microorganismos. El crecimiento depende del abastecimiento adecuado del agua y las substancias nutritivas, el pH conveniente, la tensin de oxigeno suficiente, la temperatura necesaria y otros factores.

Oxgeno

Muchos organismos requieren oxigeno molecular pues dependen de la respiracin aerobia para cubrir sus necesidades energticas y se los denomina aerobios obligados. Entre stos,

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice algunos crecen mejor a presiones parciales de oxigeno menores que la presente en el aire y se los conoce como microaerfilos. Hay microorganismos son anaerobios facultativos, pues pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de aire. Comprende dos subgrupos: uno, el de las bacterias que tienen un metabolismo productor de energia exclusivamente fermentativo pero no los afecta la presencia de aire; otro, el de las levaduras o bacterias que pueden pasar del metabolismo respiratorio al fermentativo. En cambio los anaerobios estrictos slo fermentan y son sensibles al oxigeno.

Crecimiento, colonia

En cualquier sistema biolgico el crecimiento puede definirse como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de un organismo. El crecimiento determina la multiplicacin celular y en los organismos unicelulares motiva un aumento del nmero de individuos, mientras que en los multicelulares lleva al aumento del tamao del individuo. En el aislamiento se tom una pequea cantidad de clulas microbianas y al deslizar el asa sobre el agar se las distribuy por la superficie. Durante la incubacin la clula aislada se dividi repetidamente hasta formar una masa visible llamada colonia sobre el medio de cultivo. El crecimiento de las poblaciones bacterianas est normalmente limitado por la desaparicin de los nutrientes accesibles o por la acumulacin de productos metablicos txicos. Al describir una colonia se usan distintos vocablos para describir forma, elevacin y borde de la misma como se muestra en la figura 4.

Bacterias

La mayora son organismos unicelulares que se multiplican por escisin binaria transversal. Se distinguen varios tipos respecto a su forma y agrupacin como se esquematiza en la figura 5. Algunas bacterias forman clulas de reposo, conocidas como endosporos, que tienen bajo contenido de agua, son muy refringentes y se tien con dificultad.

Los endosporos soportan el calor, la desecacin y algunas substancias qumicas, muchos resisten a 100.C durante unas 20 horas, otros slo unos minutos a 90C Las bacterias mviles tienen uno o varios flagelos. Para verlos con el microscopio ptico se los debe engrosar mediante un mordiente antes de la coloracin. Suele obs ervarse el movimiento bacteriano cuando se coloca una gota de un cultivo en medio lquido entre cubre y portaobjetos. Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, ramificadas, que forman un micelio delgado y en la mayora de los casos clulas de multiplicacin llamadas esporos.

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Coloraciones
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resulta difcil de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es el poco contraste entre la clula y el medio que la rodea, y la manera ms simple de aumentarlo es utilizando colorantes. Las clulas generalmente son tratadas de diversa manera, antes de teirlas, para coagular el protoplasma en un proceso que se llama fijacin. En el caso de las bacterias, la fijacin por calor es lo ms corriente, aunque tambin puede emplearse formaldehido, metanol o cidos. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos. Luego le sigue la tincin. La mayora de los colorantes usados son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especifica con los materiales celulares. El azul de metileno es un buen colorante que acta rpidamente sobre las bacterias y es til para detectar bacterias en medios naturales, puesto que no tie la mayor parte del material extrao.

Tincin de Gram
Es un mtodo diferencial de tincin para bacterias. Luego del tratamiento con cristal violeta todas las clulas estn coloreadas. Al agregar iodo se forma un complejo con el colorante en el interior de las mismas. Despus d e aadir etanol o acetona algunos organismos se decoloran (Gram-negativos) y otros no (Gram -positivos) segn la estructura fsica de la pared, no por los constituyentes qumicos pues las levaduras son gram-positivas aunque tienen una pared qumicamente distinta a las de las bacterias. Para poner de manifiesto las clulas incoloras se utiliza una coloracin de contraste, tal como safranina o fucsina bsica que tien de rojo a las clulas gram-negativas mientras las grampositivas permanecen violetas.

Procedimiento
Aislamiento de microorganismos del polvo ambiental
La tcnica depende del material a partir del cual se intenta aislar los microorganismos y de las caractersticas de estos ltimos. Vertir unos 15 mL de agar nutritivo, licuado en bao da agua hirviente, en una caja de Petri e igual cantidad de agar de Sabouraud licuado en otra. Dejar gelificar y luego exponer las placas al aire dejando sedimentar el polvo ambiental durante 30 minutos. Incubar a 2730C durante 48 horas la caja con agar nutritivo y a 25-27C por 5 das la del agar de Sabouraud. Al cabo de ese tiempo examinar las colonias microbianas presentes.

Aislamiento de bacterias esporuladas del suelo


Calentar una suspensin de suelo por 10 minutos en un bao de agua a 80C. Flamear e l asa hasta que tenga color rojo brillante y dejar que se enfre dentro de la zona de conveccin del mechero. Tomar una gota de la suspensin y extenderla sobre la superficie de una placa de agar nutritivo haciendo las primeras estras como se muestra en la figura 6. Flamear el asa y hacer la segunda serie de estrias con el asa vacia. Flamear otra vez el asa y hacer la tercera serie de estras con el asa vaca. Incubar las cajas con la tapa hacia abajo (invertidas) a 25-30C durante 48 horas.

Aislamiento de rizobios de ndulos radicales de leguminosas


Lavar la raz para quitar el suelo adherido. Elegir los nodulos de mayor tamao, separarlos y colocarlos en un tubo o frasquito. Lavarlos nuevamente, agitando con fuerza para eliminar la

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice mayor parte de los r esiduos. Poner los nodulos durante 30 segundos en etanol 95% y luego sumergir en lavandina concentrada diluida al 1/10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatro veces, agitando enrgicamente, en sendos tubos de agua estril. Para transferir los nodulos de un recipiente a otro usar una pinza con la punta previamente mojada en alcohol y flameada. Tomar un nodulo y colocarlo entre dos portaobjetos cuyas caras enfrentadas haban sido flameadas. Aplastarlo y tomar el material del nodulo con el asa para hacer estras sobre la placa del medio de cultivo especifico como se muestra en la figura 6. Incubar a 25-30C. El medio de cultivo para rizobios contiene manitol 10 g, extracto de levadura 4 g, carbonato de calcio 3 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,l g, agar 15 g, rojo Congo 25 ppm o verde brillante 125 ppm, agua 1 litro; pH 7,0. Se esteriliza a 115C durante 20 minutos.

Observacin de las placas de aislamiento


El inoculo fue diluido progresivamente en cada estra sucesiva de tal manera que, despus de la incubacin en la estufa, el crecimiento es confluente en los trazos iniciales y las colonias estn bien aisladas a lo largo de las ltimas estras. Observar las caractersticas macromorfolgicas de las colonias y registrarlas en la planilla de informes correspondiente. Tomar con un asa material de una colonia y hacer un extendido sobre un portaobjetos. Luego de secar y fijar por calor, hacer una coloracin de Gram para observar las clulas somticas o de Wirtz para ver los endosporos.

Tincin de Gram
Poner el portaobjetos sobre un soporte y cubrirlo con una solucin de violeta cristal. Luego de 1 minuto agregar solucin de iodo. Despus de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar con alcohol 96. Lavar con agua y cubrir con una solucin de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersin. Llevar el portaobjetos a la platina de un microscopio. Mirar a travs del objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto colocar el objetivo de inmersin en aceite (100x) moviendo el revlver. Levantar el condensador pues la intensidad de la luz debe ser mayor con los objetivos de mayor aumento. Ajustar el enfoque mediante el tornillo micromtrico. Regular la cantidad de luz por medio del diafragma. Las bacterias Gram-negativas se tien de rojo anaranjado y las Gram-positivas adquieren color violeta. Dibujar lo observado manteniendo la proporcin respecto al campo microscpico . La solucin de violeta cristal contiene 1 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96 y 80 mL de agua. La de safranina se prepara de igual manera usando 0,25 g de colorante. La solucin de iodo segn Lugol contiene 1 g de iodo y 2 g de ioduro de potasio en 100 mL de agua.

Coloracin de endosporos
Cubrir el extendido con solucin de verde de malaquita. Encender un hisopo embebido en alcohol y calentar el portaobjetos por debajo del soporte. Apagar y repetir la operacin luego de un minuto. Repetir el calentamiento dos veces ms. Lavar con agua. Cubrir con solucin de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersin. Los endosporos se vern verdes y las clulas somticas de color rojo anaranjado. Dibujar lo observado. La solucin de verde de malaquita contiene 2 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96 y 80 mL de agua.

Seleccin y transplantes de colonias


Elegir colonias de bacterias y hongos en las placas anteriores y repicarlas como se muestra

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice

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en la figura 7. Incubar los cultivos de bacterias a 30-35C en la obscuridad, si se trata de hongos colocarlos a 25-27C preferentemente donde reciban una iluminacin diurna difusa para favorecer la esporulacin.

a) cultivo de bacterias en aerobiosis

sobre medios gelificados . Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante. Tomar el tubo con la mano izquierda. Quitar el tapn de algodn sostenindolo con el dedo meique de la mano derecha. Pasar la boca del tubo por la llama del mechero. Introducir el asa, estril y fra, en el tubo y extraer un poco de material microbiano. Volver a flamear la boca del tubo y colocar el tapn. Tomar el tubo con medio estril, destapar y flamear como el anterior. Introducir el asa y depositar los microorganismos rayando en zig-zag la superficie del medio gelificado, con mucha suavidad. Sacar el asa, flamear la boca del tubo y tapar. Flamear el asa. en medios lquidos . Proceder igual que en el caso anterior y depositar los organismos dentro del medio lquido.

El procedimiento para sembrar levaduras es similar al empleado para bacterias. Para cultivar hongos se emplea un gancho, inserto en el mango de Kolle, que permite tomar los filamentos para transferirlos al nuevo medio. microcultivo. Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y enfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 a 3 mm de espesor, tomado de una placa estril. Sembrar en los bordes libres del trozo de agar como se muestra en la figura 8. Colocar un cubreobjetos, tambin flameado y enfriado. Incubar los microcultivos en una cmara hmeda, lograda poniendo algodn mojado bajo el soporte de los portaobjetos dentro de un recipiente cerrado.

b) cultivo de hongos

Observacin de los cultivos en tubos macroscpica


Despus de la incubacin observar los cultivos a simple vista o con ayuda de la lupa y registrar en el informe las caractersticas morfolgicas (ver figura 9). Evitar la agitacin del medio lquido pues si ha crecido una pelcula superficial, esta puede caer confundindose con el sedimento.

microscpica

Hacer un preparado de las bacterias (ver figura 10), fijar por calor en la llama o microondas, y colorearlo segn el mtodo de Gram. Suspender los hongos en agua, lquido de Patterson o colorante de Guegun al hacer el preparado en fresco y con ayuda de dos agujas separar los filamentos.

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice El colorante de Guegun contiene 0,1 g de azul de algodn y 0,1 g de Sudn III en 100 g de cido lctico, adems de 10 gotas de tintura de iodo. El lquido de Patterson se prepara mezclando 50 mL de solucin acuosa de acetato de potasio al 2%, con 20 mL de glicerina y 30 mL de etanol 96 Observar el microcultivo con el objetivo de menor aumento, luego de enfocar un objeto adherido a la cara inferior del cubreobjetos se podr utilizar el siguiente objetivo.

Medida del tamao de los microorganismos


El mtodo ms prctico usa un ocular autoenfocable, con una escala arbitraria dividida en cien pequeas partes iguales, a veces numeradas, la que debe calibrarse con la escala de 1 mm con cien divisiones de diez micrmetros cada una, grabada en un portaobjetos llamado micro-mtrico (ver figura 11). Enfocar al portaobjetos y mover ste de modo que su escala quede paralela a la del ocular. Observar cual nmero de las pequeas divisiones de 10 m grabadas en el portaobjetos coincide con un nmero entero de las contenidas en el ocular. Calcular el valor en micrmetros correspondiente a una divisin pequea de la escala del ocular mediante la regla de tres simple. Calibrar la escala del ocular para cada aumento del microscopio. Tener en cuenta que las rayas del ocular siempre tendrn el mismo espesor mientras que las del portaobjetos irn engrosndose al cambiar los objetivos.

Bibliografia
o o o

Hall GS et al. Methods for the Examination of Organismal Diversity in Soils and Sediments. CAB International, Wallingford, 1996 Seeley HW & Van Demarck PJ. Microbios en Accin. Blume, Madrid, 1973 Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice

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TRABAJO N 3. Fijacin simbitica de N 2 en leguminosas


Objetivo. Observar las caractersticas macro y micromorfolgicas de los ndulos radicales de

leguminosas. Comprobar la capacidad de nodular de la cepa de rizobio aislada.

Introduccin
Fijacin simbitica del nitrgeno molecular

Una de las simbiosis ms importantes es la que se da entre leguminosas y bacterias de los gneros Rhizobium y Bradyrhizobium . Figura 12 La infeccin de las races con una cepa adecuada de la bacteria (hay especificidad de husped) conduce a la formacin de ndulos radicales que tienen distinta forma segn la planta hospedadora (figura 12). Los rizobios especficos entran en la raz por el extremo de los pelos absorbentes que se retuercen en forma de bculo. Se forma en el pelo uno o varios tubos de infeccin dentro de los cuales los rizobios se hallan dispuestos en fila. El tubo de infeccin penetra en las clulas del crtex de la raz. Algunas clulas de la raz se dividen activamente produciendo un meristema. Los rizobios contenidos en el tubo de infeccin son liberados en el citoplasma de estas clulas meristemticas donde adquieren una forma distinta al rizobio de vida libre y se los llama bacteroides. stos son capaces de fijar el nitrgeno molecular. En los ndulos la presin parcial de oxgeno es muy baja, si se eleva la enzima nitrogenasa quedara inhibida y no se producira la fijacin. Sin embargo el ndulo consume oxigeno provisto por la leghemoglobina, una molcula transportadora de O2 que contiene grupo hemo y da a los ndulos color rojizo.

Nodulacin de leguminosas
Ndulos efectivos

o o o o o o o o o o

pocos y situados sobretodo en la raz primaria voluminosos, con superficie lisa o rugosa actividad meristematica y nodular prolongada infeccin generalizada, zona bacteriana grande con muchos bacteroides interior pigmentado de rojo por la leghemoglobina. numerosos y repartidos en todo el sistema radicular pequeos con superficie lisa actividad meristematica y nodular corta pocas clulas infectadas, pocos o sin bacteroides y granulos de almidn interior no coloreado de rojo.

Nodulos inefectivos

Inoculante para leguminosas


La bsqueda y seleccin de buenas cepas de rizobios puede resultar intil si las leguminosas nodulan eficientemente con las cepas nativas, situacin frecuente en especies tropicales. Pero, en muchos suelos el nivel y la eficiencia de las cepas nativas pueden no ser los adecuados y la nodulacin y la fijacin de nitrgeno resultan insuficientes para satisfacer las demandas del cultivo. La inoculacin artificial resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas, sobre todo si son hospedadores de alta especificidad o cuando la deficiencia en nitrgeno limita

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice el desarrollo vegetal. El mtodo y las condiciones de inoculacin deben permitir la supervivencia de los rizobios, adems la semilla inoculada debe poseer la especie de rizobio adecuada y en nmero suficiente. Las condiciones del suelo prximo a la semilla deben favorecer la colonizacin de la rizsfera por la bacteria para lograr la formacin de los nodulos y su funcionamiento efectivo. Para determinar la necesidad de inoculacin se suele emplear un ensayo Figura 13 simple de tres tratamientos: - la inoculacin con una cepa de rizobio conocida para saber si es efectiva en el hospedador, - la fertilizacin para asegurar un buen desarrollo del hospedador si no hay inhibidores en el suelo, Ensayo - el control no inoculado para observar la presencia o ausencia de rizobios nativos Testigo y su efectividad. Las cepas usadas en los inoculantes deben ser cuidadosamente seleccionadas y mantenidas, y probarse anualmente para minimizar la posibilidad de cambio en las propiedades simbiticas. La eficencia de la fijacin se evala por el nmero de ndulos, la masa nodular, el peso seco de la planta y el contenido de nitrgeno de la parte area. Son bacterias eficaces las que, por intermedio de los ndulos radicales, aportan nitrgeno reducido a la planta hospedadora produciendo un aumento de peso de la misma.

Procedimiento
Examen de los ndulos y bacteroides

Tomar un ndulo de la raz de una leguminosa, medirlo y dibujar su forma. Cortarlo y observar el color. Si la fijacin de nitrgeno era efectiva se lo ver rosado o rojo, a veces pardo. Aplastarlo entre dos portaobjetos. Extender el material interno mezclado con una gota de agua, haciendo movimientos circulares con el asa. Secar cerca de una llama. Fijar pasando tres veces el portaobjetos por dentro de la llama. Colocar el portaobjetos sobre un soporte colocado en una bandeja o la pileta. Cubrirlo la solucin colorante (fucsina bsica 0,3 g, etanol 96 10 mL, fenol 5 g, agua destilada 90 mL). Luego de un minuto lavar con agua. Secar cerca de una llama. Depositar una gota de aceite de inmersin, apoyar un cubreobjetos y sobre ste poner otra gota de ese aceite. Observar al microscopio los bacteroides coloreados y dibujarlos tratando de mantener la proporcin respecto al campo microscpico. Anotar el aumento.

Germinacin de semillas de leguminosas


Colocar las semillas necesarias, de buen poder germinativo, en un matraz de Erlemeyer con etanol al 70% v/v y agitar durante 3 a 5 minutos. Volcar y aadir agua lavandina al 10% v/v, agitando por igual tiempo. Lavar varias veces con agua destilada estril. Depositarlas sobre agar-agua estril y dejar germinar.

Preparacin del inoculante


Sembrar en matraces con 50 mL de medio de cultivo con la cepa aislada de ndulos durante el desarrollo del trabajo n2. El medio de cultivo contiene: fosfato monopotsico 0,5 g, fosfato

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice

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dipotsico 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, nitrato de potasio 0,8 g, sulfato de magnesio 0,2 g, extracto de levadura 4 g, fosfato diamnico 0,3 g, glicerol 10 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Inoculacin de leguminosas

Escoger de las placas de germinacin las dieciseis plntulas de mejor aspecto y trasladarlas al medio mineral inclinado en tubos grandes. Dejar en lugar iluminado y ventilado. Uno o dos das despus verter 1 mL del cultivo homogeneizado de rizobio sobre la radcula de ocho plntulas cultivadas. El medio mineral contiene: fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro frrico 0,01 g, fosfato triclcico 2 g, agua 1 L, agar 15 g, pH 7. Esterilizar a 110C durante 20 minutos.

Control de las leguminosas inoculadas


Medir la longitud de las plantas inoculadas y las testigo. Observar y registrar la ubicacin, tamao y forma de los ndulos. Controlar la humedad del substrato.
Bibliografa
o o Balatti AP & Jardim Freire JR. Legume Inoculants. Selection and Characterization of Strains. Production, Use and Management. Kingraf, La Plata, 1996 Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990 Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice

TRABAJO N 4. Microorganismos del suelo


Objetivo. Demostrar la biodiversidad de los grupos fisiolgicos de microorganismos del suelo

mediante cultivos selectivos que provean las condiciones ambientales y disponibilidad de nutrientes adecuadas.

Introduccin
Los microoganismos juegan un papel significativo en la mayora de los procesos naturales que afectan al ambiente. Un ejemplo es la fijacin del nitrgeno molecular por los organismos de vida libre y los simbiticos, otro es el reciclado de materiales orgnicos. La materia orgnica que llega al suelo a travs de residuos de cosechas, la cada del follaje, las races y sus productos de descamacin y exudacin, los restos animales y microbianos sufren una serie de procesos de degradacin que asegura la continuidad de los ciclos biogeoqumicos. Empleando medios selectivos se puede lograr cultivos enriquecidos en microorganismos con una caracterstica fisiolgica determinada, por ejemplo si carece de una fuente de nitrgeno soluble slo crecern las bacterias capaces de reducir el nitrgeno gaseoso disuelto, procedente de la atmsfera.

Amonificacin

El nitrgeno orgnico de los productos de hidrlisis de protenas y polinucletidos, se convierte en amonaco por el proceso de desaminacin. La urea se hidroliza rpidamente a amonaco y dixido de carbono por la enzima ureasa producida por muchos microorganismos. La evolucin de la microbiota vara segn la materia nitrogenada transformada. En general, primero aparecen bacilos, esporulados o no, y cocos. Despus se observan actinomicetos y ms tarde mohos. La demostracin de la amonificacin se basa en investigar amonaco mediante el reactivo de Nessler en el medio acuoso con aminocidos (peptona, etc). La solucin de yodo-mercuriato potsico alcalinizada origina desde un color amarillo hasta un precipitado rojo ladrillo segn la cantidad de amoniaco presente. El amoniaco formado puede ser asimilado directamente por otros microrganismos o ser convertido en nitrato por las bacterias especficas. Si se aade a un suelo materiales tales como estircol, aumenta en consecuencia la velocidad de nitrificacin.

Nitrificacin
El nitrgeno tiene tres formas estables de oxidacin en la naturaleza (nitrgeno molecular, amonaco, nitrato) cuya interconversin est dada casi exclusivamente por bacterias. Algunos organismos pueden usar directamente amonio para sintetizar sus aminocidos y otras molculas nitrogenadas de la clula, pero otros, incluyendo las plantas, prefieren nitrato. La oxidacin del amonio a nitrato se denomina nitrificacin y unas bacterias auttrofas aerobias las llevan a cabo en dos etapas: 1) oxidacin del amonio por Nitrosomonas, Nitrosococcus 2) oxidacin del nitrito por Nitrobacter, Nitrococcus Tanto la formacin de nitrito como la de nitrato por los microorganismos quimioauttrofos constituyen procesos metablicos aerbicos generadores de energa. Ocurre rpidamente en suelos bien drenados a pH neutro. Aunque el nitrato es fcilmente asimilado por las plantas, como es muy soluble en agua resulta rpidamente lavado de los suelos que reciben una gran cantidad de lluvia. Por el contrario, el amonio queda fuertemente adsorbido a las arcillas.

Desnitrificacin
Es el proceso en el cual algunos organismos que pueden usar el nitrato como aceptor final de electrones durante la respiracin anaerbica producen molculas reducidas gaseosas (xido de dinitrgeno, nitrgeno molecular) que desaparecen del ecosistema. Existen otros

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microorganismos que pueden reducir nitrato hasta amonio, manteniendo el nitrgeno en el ecosistema (reduccin asimilatoria del nitrato). Si un suelo queda anegado se producen condiciones anaerbicas y ocurre la desnitrificacin, principalmente si es rico en materia orgnica. Tambin sucede cuando se originan puntos de anaerobiosis por otras causas. Como los productos de la desnitrificacin son gaseosos se escapan del suelo disminuyendo el contenido en nitrgeno del mismo. En el laboratorio tales gases quedan atrapados en la campanita del medio de cultivo.

Fijacin de nitrgeno molecular

La utilizacin de este como fuente de nitrgeno es una propiedad que poseen ciertas bacterias y cianobacteras. A continuacin se da una lista abreviada de organismos fijadores de nitrgeno de vida libre. Algunos gneros de bacterias con especies fijadoras de nitrgeno Aerobios Anaerobios Heterotrficos Fotosintetizadores Heterotrficos Fotosintetizadores Azotobacter cianobacterias Clostridium Chromatium Klebsiella Chlorobium Beijerinckia Rhodospirillum Bacillus Heliobacterium Azomonas Azospirillum (microaerfilo) El nitrgeno es reducido a amonio en el proceso de fijacin catalizado por el complejo nitrogenasa, uno de cuyos componentes protenicos contiene molibdeno, los otros hierro. La enzima es inactivada por el oxgeno. El nitrgeno molecular es muy inerte y su reduccin requiere mucha energa. Azotobacter crece en un medio liquido sin agitacin, en forma de una pelcula superficial. Es bastante sensible a la acidez pues no suele crecer por debajo de pH 6. Al microscopio se observan bacilos gram-negativos, grandes, de 4 a 6 m de largo, acompaados de clulas de mayor tamao con paredes gruesas y apariencia de levadura, conocidas como cistos. Esta bacteria tiene una gran capacidad respiratoria, medida como velocidad de consumo de oxigeno, para proveer la energa requerida por la fijacin. Los clostridios fijadores no slo son incapaces de crecer en presencia de aire sino que generalmente son muertos por el oxgeno, a menos que se encuentren en forma de endosporos, pero pueden crecer por debajo de la pelcula de Azotobacter, generando burbujas de gas por la fermentacin de azcares.

Sulfo-oxidacin
El sulfuro de hidrgeno, el azufre elemental y el ion sulfato son tres formas estables importantes del azufre. El sulfuro de hidrgeno es txico para la mayora de los organismos y los sulfuros son oxidados a sulfato por bacterias aerobias del gnero Thiobacillus y azufre elemental por bacterias fotosintetizadoras anaerobias de ambientes acuticos, el que se acumula en la clula, sufriendo una posterior oxidacin en algunos casos. La mayora de los microorganismos oxidantes del azufre son auttrofos obligados.

Sulfato-reduccin
El sulfato y otros compuestos oxigenados del azufre, pueden ser reducidos a sulfuro de hidrgeno por bacterias heterotrficas anaerobias. Esta actividad microbiana es muy evidente en los barros del fondo de estanques y lagos. Suelen usar hexosas, alcoholes o cidos orgnicos como fuente de carbono, pero algunas especies crecen autotrficamente con hidrgeno molecular y tiosulfato, por ej. Desulfovibrio.

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice

Celulolisis, amilolisis
El almidn y la celulosa estn compuestos por unidades de glucosa, pero conectadas de diferente manera: uniones 1,4 - y 1,4 -glucosidicas respectivamente, lo que afecta a sus propiedades. La celulosa es insoluble y se digiere a mucho menor velocidad que el almidn soluble. La celulosa forma largas fibrillas a las que se encuentran intimamente asociados los microorganismos que la degradan. Muchos hongos son celulolticos, pero entre las bacterias esta propiedad est restringida a unos pocos grupos: mixobacterias, clostridios y actinomicetos. El almidn, en cambio, es hidrolizado por muchos hongos y bacterias. Las bacterias celulolticas predominan en la zona radicular y su densidad decrece en muestras tomadas a cierta distancia de la planta. Por otra parte, es el proceso fundamental que ocurre durante el compostaje de residuos agrcolas, donde predominan los microorganismos termfilos.

Solubilizacin de fosfatos

Algunos mohos comunes, por ej. Penicillium, Aspergillus, Fusarium, pueden solubilizar fosfatos insolubles como polvo de huesos y apatita. Aproximadamente un dcimo de las bacterias del suelo tambin los solubilizan. La solubilizacin de fosfato de calcio se aprecia como zonas claras que rodean las colonias y generalmente se produce cuando los microorganismos forman cidos orgnicos tales como cido 2-ceto-glucnico (bacterias), c. citrico u oxlico (hongos), pero stos son rpidamente degradados por otros organismos del suelo. Los fosfatos de hierro y aluminio pueden ser solubilizados por los microorganismos productores de sulfuro de hidrgeno.

Procedimiento
Fijacin de nitrgeno molecular
El medio contiene: manitol 10 g, carbonato de calcio 0,5 g, solucin salina 50 mL, solucin de oigoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razn de 50 mL en cada uno y se esteriliza a 110C durante 20 minutos. Sembrar unos granulos de suelo e incubar a 25-27C durante 7 das. La solucin salina contiene: fosfato dipotsico 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2,5 g, cloruro de sodio 2,5 g, sulfato ferroso heptahidrato 0,05 g, agua 1 L, pH 7 - 7,5. La solucin de oigoelementos contiene 0,05 g/L de las sales siguientes: molibdato de potasio, borato de sodio, nitrato de cobalto, sulfato de cadmio, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato de manganeso, cloruro frrico. Hacia el tercer da el medio se enturbia ligeramente y en la superfiie aparece un velo grisceo. Los das siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del liquido. A su vez el liquido se enturbia cada vez ms y suelen aparecer burbujas e n el fondo. La observacin microscpica del velo muestra clulas bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esfricos, mientras que el material tomado del fondo permite ver bacilos esporulados Gram-positivo o variable. Medio para Azotobacter: sacarosa 20 g, fosfato dipotsico 0,05 g, fosfato monopotsico 0,15 g, cloruro de calcio 0,01 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, molibdato de sodio 0,002 g, cloruro frrico 0,01 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 2 mL, carbonato de calcio 1 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Medio para Derxia: Reemplazar la sacarosa por almidn o glucosa y omitir el carbonato de calcio. Medio para Azospirillum : cido mlico 5 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro de calcio 0,02 g, molibdato de sodio 0,002 g, sulfato de manganeso 0,01 g, etiln -diamino-tetra-acetato frrico (al 1,64% p/v) 4 mL, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 3 mL, biotina 0,1 mg, agua 1 L, p H 6,8. Medio para Clostridium pasteurianum : glucosa 10 g, fosfato monopotsico 0,75 g, solucin

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice

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salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Distribuir en tubos con campanita de Durham. Luego de sembrar cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina estril.

Desnitrificacin
El medio de cultivo contiene: nitrato de potasio 2 g, carbonato de calcio 5 g, glucosa 10 g, solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Los tubos llevan dentro una campanita de vidrio y se esterilizan a 110C durante 20 minutos. Inocular unos grnulos de suelo sin agitar e incubar una semana a 25-27C. Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrgeno molecular u xido de nitrgeno quedarn retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formacin de nitritos se comprueba agregando 1 mL del reactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecer un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes: o Disolver 0,05 g de naftilamina en 100 mL de cido actico al 30% (v/v) en agua. o Disolver 0,32 g de cido sulfanilico en 100 mL de cido actico al 30% (v/v) en agua.

Nitrificacin
El medio de cultivo para formadores de nitritos contiene: sulfato de amonio 0,5 g, carbonato de calcio 1 g, solucin salina 50 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razn de 50 mL en cada uno. El medio para productores de nitratos contiene 1 g de nitrito de sodio en lugar del sulfato de amonio. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Sembrar unos grnulos de suelo en ambos matraces e incubar a 25-27C durante dos semanas. Formadores de nitritos. Volcar 5 mL del cultivo en un tubo de ensayo y agregar 1 mL del reactivo de Griess recien preparado. Aparecer un color rosado si se han formado nitritos por accin microbiana. Formadores de nitratos. Transferir unos 5 mL del cultivo a un tubo de ensayo y agregar 1 mL del reactivo de Griess. Si esta reaccin da negativa los microorganismos han oxidado los nitritos a nitratos. Colocar otros 5 mL de cultivo en un tubo, agregar unos 50 mg de urea y 10 gotas de acido sulfrico. Calentar para eliminar los nitritos. Luego aadir 1 mL de reactivo difenilamina por las paredes del tubo. Si en la zona de contacto aparece un color azul hay nitratos formados por accin microbiana. El reactivo difenilamina contiene: difenilamina 1 g, agua destilada 20 mL, cido sulfrico 100 mL. Colocar en frasco obscuro.

Amonificacin
El medio de cultivo contiene peptona 0,2 g, solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos y se esteriliza a 110C durante 20 minutos. Sembrar unos grnulos de suelo e incubar una semana a 25-27C. Despus agregar 1 mL de reactivo de Nessler a cada tubo a ensayar. La aparicin de un color ladrillo indica la presencia de amoniaco. El reactivo de Nessler consta de dos soluciones que se mezclan en partes iguales en el momento de usar. o Colocar en un mortero 5 g de ioduro mercrico y 3,65 g de ioduro de potasio, aadir un poco de agua destilada y triturar hasta disolver. Completar a 100 mL con agua. o Disolver 15 g de hidroxido de potasio en lentejas en 100 mL de agua destilada.

Celulolisis
El medio de cultivo contiene: nitrato de amonio 1 g, solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza a 110C durante 20 minutos. Sembrar unas gotas de una suspensin de suelo, que haya sido abonado con estircol, e incubar dos a tres semanas a 25-27C.

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice Donde el papel sobresale del lquido se acumulan las bacterias celulolticas aerobias y suelen colorearlo. Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque de las fibras bajo la lupa. Comp robar si se disgrega con facilidad al tocarla con el asa. Medio para clostridios : sulfato de amonio 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, fosfato dipotsico 0,7 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, cloruro de calcio 0,05 g, celulosa en polvo 3 g, carboximetilcelulosa 1 g, extracto de levadura 1 g, azul de metileno (0,005% p/v) 1 mL, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,0; esterilizar a 121C durante 15 minutos. Agregar 0,5 mL de clorhidrato de cistena (al 1% p/v) a cada tubo con 10 mL de medio estril fundido, sembrar de inmediato con unas gotas de la suspensin de suelo y colocar en agua fra para una rpida gelificacin.

Amilolisis
El medio de cultivo contiene: almidn soluble 2 g, nitrato de amonio 1 g, solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agar 15 g, agua 1 L. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Distribuir en cajas de Petri. Sembrar con unos grnulos de suelo e incubar a 25-27C. Cubrir la superficie con solucin acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La zona de hidrlisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre un fondo azul.

Sulfato-reduccin
El medio de cultivo contiene: cloruro de amonio 1 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2 g, sulfato de sodio 0,5 g, cloruro de calcio 0,1 g, lactato de sodio (al 60% p/v) 6 mL, extracto de levadura 1 g, tioglicolato de sodio 1 g, agua 1 L. Repartir en tubos colocando 10 mL en cada uno. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Sembrar con unos grnulos de suelo e introducir un clavo previamente pasado por la llama y enfriado. Cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina. Incubar dos o tres semanas a 25-27C. Ver si el clavo se ha ennegrecido por la formacin de sulfuro de hierro debido a los microorganismos.

Sulfo-oxidacin

El medio de cultivo contiene: fosfato dipotsico 0,25 g, cloruro de magnesio 0,1 g, cloruro de sodio 0, 1 g, nitrato de amonio 2 g, carbonato de calcio 5 g, agua destilada 1 L. Repartir en tubos a razn de 5 mL en cada uno y esterilizar 20 minutos a 110C. Agregar a cada tubo 1 mL de una solucin a 10% de monosulfuro de sodio y sembrar unos grnulos de suelo. Incubar a 25-27C durante dos a tres semanas. Volcar 2 mL del cultivo en otro tubo, acidificar con dos gotas de cido clorhdrico concentrado y aadir 5 gotas de solucin acuosa de cloruro de bario al 5%. p/v. La aparicin de una opalescencia indica que se han formado sulfatos por la actividad microbiana.

Solubilizacin de fosfatos

El medio de cultivo contiene: extracto de levadura 2 g, glucosa 20 g, agar 15 g, agua 1 L, fosfato triclcico 2 g. Se esteriliza a 110C durante 20 minutos y se distribuye en caja de Petri. Sembrar unos grnulos e incubar a 25-27C. Observar la formacin de una zona transparente alrededor de las colonias.
Bibliografa
o o o Fenchel T et al. Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral Cycling. Academic Press, San Diego, 1998. Alef K & Nannipieri P. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, London, 1995. Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990.

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice

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TRABAJO N 5. Inhibidores y desinfectantes


Objetivo. Determinar la concentracin inhibitoria mnima y la concentracin letal mnima de

productos comerciales usados en el campo.

Introduccin
Los agentes que producen efectos reversibles causan inhibicin sin Figura 14 accin mortal inmediata. Los bacteriostticos actan sobre las bacterias y los fungistticos sobre los hongos. Los compuestos de accin irreversible causan la muerte rpida. Los bactericidas y fungicidas matan bacterias y hongos, respectivamente (figura 14). La diferencia es cuantitativa ms que cualitativa. La adicin de 0,3% de fenol impide el crecimiento de Escherichia coli, pero no mata las clulas en varias horas mientras que 1% las elimina en minutos (figura 15). La palabra desinfeccin se emple para expresar la Figura 15 eliminacin de cualquier agente que pudiera causar infeccin o enfermedad. Los desinfectantes son agentes de esterilizacin. Las clulas activas jvenes tienen una notable sensibilidad a estas substancias. La desinfeccin es ms rpida al aumentar la temperatura del sistema. El medio en que se encuentran los microrganismos puede alterar la eficacia de la desinfeccin, por combinacin del material orgnico con el agente activo. Tambin el pH modifica los mecanismos de desinfeccin. Los endosporos bacterianos son ms difciles de destruir que las clulas vegetativas. Tambin presentan cierta resistencia los organismos encapsulados. Otro factor que posibilita la desinfeccin es un contacto eficaz. La humedad es esencial y los agentes tensoactivos mejoran dicho contacto. Las pruebas de la concentracin inhibitoria mnima (CIM) y la concentracin letal mnima (CLM) son tiles para comparar la eficacia de diversos productos qumicos contra un organismo determinado, o la sensibilidad de diferentes organismos a un mismo producto. Los microorganismos comnmente usados son cepas de coleccin de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, para establecer la accin frente a organismos coliformes, seudomnadas, clostridios y otros aerobios, respectivamente. El tamao del inculo suele ser de 104 a 10 6 /mL, segn el microorganismo y la substancia estudiada.

Procedimiento
Concentracin inhibitoria mnima
Preparar una solucin al 1/10 p/v v/v del compuesto en agua destilada estril. Si se trata de un curasemillas con un principio activo poco soluble, usar alcohol o acetona al 1/2 v/v en esta primera dilucin. Poner 1 mL de la solucin 1/10 en cada uno de los 9 tubos de ensayo estriles. Aadir al primer tubo 1 mL de agua destilada estril, al segundo 2 mL, al tercero 3 mL y as sucesivamente hasta agregar al noveno 9 mL, obteniendo diluciones que van desde 1/20 a 1/100. Transferir 1 mL de la dilucin original al 1/10, y 1 mL de cada una de las otras diluciones a sendos tubos con 9 mL de caldo nutritivo (en el caso del desinfectante) o agua estril (en caso del curasemillas), comenzando por la ms diluida.. Las diluciones obtenidas van de 1/100 a 1/1000.

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Bacterias

Aadir 0,1 a 0,2 mL de un cultivo de 24 hs en caldo, de Staphylococcus aureus o Escherichia coli, a un tubo con 9 mL de caldo nutritivo de tal manera que se obtenga un suspensin de turbiedad poco apreciable a simple vista. Luego transferir 0,2 mL de esta suspensin bacteriana a cada uno de los tubos con diluciones de desinfectante en caldo. Incubar a 35C durante 48 hs.

Hongos

Agregar agua estril (con 0,05% v/v de Tween 80) al tubo de cultivo de 5 das a 25C en medio de Czapek o Sabouraud, de Penicillium expansum, Aspergillus flavus o Cladosporium cladosporioides , agitando para suspender los esporos. Aadir 0,5 a 1 mL de la suspensin de esporos a un matraz con 50 mL de agar de Sabouraud, fundido y enfriado a 45-50C. Mezclar y volcar en cuatro cajas de Petri estriles. Una vez gelificado, se depositan discos de papel de filtro de 4 mm de dimetro previamente humedecidos con las diluciones del producto, a razn de tres discos por placa. Se incuba a 2528C durante 5 das.

Concentracin letal mnima


Preparar, como se indic arriba, una serie de tubos con 10 mL de cada una de las diluciones del compuesto, que van desde 1/100 a 1/1000, utilizando agua estril en lugar de caldo. Adicionar a cada dilucin 0,2 mL de una suspensin bacteriana preparada como se describi arriba. Anotar la hora a la cual se agreg al primer tubo, y a intervalos de 2, 5, 10 y 15 minutos cargar un asa (con un dimetro interno de 4 mm) de cada dilucin y llevar a un tubo de caldo nutritivo que contiene 0,1 % p/v de cido tiogliclico para neutralizar la accin del desinfectante remanente. Incubar a 35C durante 48 hs.
Bibliografa
o o Collins CH, Lyne PM, Grange JM. Collins and Lynes Microbiological Methods. 7 ed. Butterworth Heinemann, Oxford, 1999 Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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TRABAJO N 6. Digestin anaerbica de residuos agrcolas


Objetivo. Transformar los residuos agrcolas en biogas y un lodo til como fertilizante.

Introduccin
Se emplea estircol, paja y lodo procedente de otro digestor. El gas formado en la fermentacin metanica es una mezcla de metano y dixido de carbono. Las denominadas bacterias metnicas implicadas pertenecen a los gneros Methanococcus, Methanobacterium, Methanosarcina y otros. Dependiendo de la composicin del material de partida, se puede producir biogas con alrededor de 70%. de metano. Estas bacterias son anaerobias estrictas y reducen al dixido de carbono. Las bacterias metnicas se diferencian de las dems debido a su peculiar estructura de la pared y la membrana celular, y forman parte de las arqueobacterias junto a las termfilas y las halfilas. Se encuentran en el rumen, los sedimentos de aguas estancadas y en los digestores de las depuradoras de aguas residuales. Las metanobacterias slo podrn desarrollarse cuando por accin de las bacterias facultativas se haya consumido todo el oxgeno, y las fermentadoras hayan producido suficiente dixido de carbono e hidrgeno a partir de almidn, celulosa o aminocidos. Las bacterias metnicas son sensibles al descenso del pH producido por los cidos orgnicos formados por los clostridios. Pero en un sistema en equilibrio consumen los cidos a medida que aparecen manteniendo un ambiente neutro. Las instalaciones pequeas de biogs permiten la obtencin de energa en zonas rurales.

Procedimiento
Figura 16

Equipo de digestin: 1 fermentador, 2 mecanismo de agitacin con varilla, 3 material a fermentar, 4 bao de agua, 5 acuario, 6 calentador conectado a una bomba de circulacin, 7 termmetro y termostato, 8 depsito de gas (neumtico de bicicleta), 9 frasco lavador (indicador de gas y lavado de CO2), 10 frasco lavador abierto (para equilibrar la presin), 11 llave de triple va, 12 tubo de vidrio con virutas de hierro (arrestallamas), 13 mechero.

Colocar en un frasco de 1 L, unos 200 g de estircol fresco de vaca, 25 g de paja cortada en trozos pequeos y agua hasta unos 5 cm de la boca. Poner un tapn atravesado por un agitador y un tubo para la salida de los gases. Instalar el fermentador en un bao de agua a 37C. Unir la salida a un frasco lavador y ste a otro frasco abierto para equilibrar la presin, y a una llave de triple via que est conectada al

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice depsito de gas y al mechero. Entre el mechero y la llave de triple via se coloca un tubo de vidrio lleno con virutas de hierro para evitar el retroceso de la llama. Controlar la hermeticidad de todos los cierres. Agitar diariamente la mezcla en descomposicin. Luego de uno o dos das vaciar la cmara para eliminar la mezcla explosiva de biogs y aire. Dejar hasta que se llene nuevamente el depsito y comprobar cmo arde el biogs a la salida del mechero. Controlar diariamente el nivel de agua del bao, la temperatura y la cantidad de gas.
Bibliografa
o o Madigan TM et al. Brock- Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998 Jagnow G, Dawid W. Biotecnologa. Acribia, Zaragoza, 1991

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TRABAJO N 7. Morfologa microscpica de hongos


Objetivo. Conocer las estructuras microscpicas de mohos, levaduras y setas.

Introduccin
Micelio es el cuerpo filamentoso de un hongo y un trozo del mismo se denomina hifa. Las hifas pueden presentar septos y entonces el micelio est tabicado. Si los tabiques estn ausentes es un micelio contnuo. Rizoides son las hifas de succin que penetran en el substrato. Apresorios son unas hifas achatadas de sostn que se adhieren al hospedador o substrato. Cuando el cuerpo del hongo es una sola clula se lo llama levadura. Los cortos filamentos formados por las clulas brotantes de la levadura se conocen como pseudomicelio. Plectnquima es un conjunto de hifas que se asemeja a un tejido. Esclerocio es un plectnquima generalmente macroscpico que puede permanecer largo tiempo con vida latente. Clamidospora es una clula de resistencia, terminal o intehifal, con pared gruesa y substancias de reserva. Las esporas son los elementos de multiplicacin de los hongos. De acuerdo a su forma y origen reciben distinto nombre como se observa en la figura 17 . Anamorfo es el hongo con reproduccin asexuada o mitosprica. Los conidios son mitosporas que se hallan ssiles o sobre un conidiforo (simple o ramificado), o dentro del plectnquima de un picnidio. Un esporangio contiene numerosos mitosporas dentro de una membrana peridial simple. Teleomorfo es el hongo con reproduccin sexuada o meiosprica. Las ascosporas son meiosporas que se encuentran dentro de los ascos libres de las levaduras, o los ascos encerrados en el plectnquima de un ascoma o sobre el mismo. Las basidiosporas surgen de los esterigmas del basidio donde ocurri la meiosis. Los basidios generalmente se encuentran sobre laminillas, tubos o espinas del basidioma. Las figuras 17 y 18a muestran Figura 17 esquemas de diversas estructuras fngicas. Los conidiforos simples son cortos filamentos que generalmente nacen perpendiculares a la hifa y originan en su extremo el o los conidios. Los ramificados suelen terminar en ramas con forma de botelln (filides) de donde surgen los conidios. Algunas estructuras son tpicas de gneros comunes y llevan su nombre: cabeza aspergilar, penicilio. Tambin los conidiforos simples o ramificados suelen estar reunidos en: coremio (como un fsforo), esporodoquio (como una almohadilla), picnidio (dentro de un plectnquima con forma de pera). Un esporangio contiene innumerables esporas, pero un esporangiolo slo contiene tres o cuatro y se encuentra en el pice de una rama lateral del esporangiforo. La columela es la punta dilatada del esporangiforo y est dentro de la esfera del esporangio. En algunos casos, unas pocas esporas estn reunidas en merosporangios (bolsitas como dedos de guante) que se asientan sobre la columela. Los ascomas tienen distinta forma: cleistotecio (cerrado) que se rompe al madurar las esporas, peritecio (forma de pera) con abertura u ostolo por donde salen las esporas maduras, apotecio (forma de copa) con los ascos expuestos.

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice Los basidiomas ms conocidos son: el champin con laminillas en la parte inferior del sombrero donde se originan las esporas, el boleto con poros en vez de laminillas, la bola de nieve que al romperse libera las esporas maduras (figura 18b). Hay otras formas como el basidioma excntrico de los pleurotos, los estantes rgidos que crecen sobre troncos, las formas gelatinosas.

Figura 18a

Procedimiento
Microcultivos
Observar los microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocada una estructura prxima al cubreobjetos o adherida al mismo, pasar al objetivo 10x. Luego para ver detalles se puede pasar al objetivo seco de mayor aumento, si la distancia focal de la lente lo permite.

Preparaciones
Hacer preparaciones en fresco colocando un trozo de micelio en una gota de lactofenol, o colorante de Guegun, y desagregar con ayuda de dos agujas, montadas en sendos mangos . Poner un cubreobjetos y observar al microscopio. Dibujar las estructuras vistas. El lactofenol contiene: cido lctico 100 mL, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 mL.
Bibliografa
o o Deacon JW . Introduccin a la Micologa Moderna. Limusa -Noriega, Mxico, 1993 Alexopoulos CJ. Introduccin a la Micologa. EUDEBA, Buenos Aires, 1966

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TRABAJO N 8. Mohos toxignicos


Objetivo. Reconocer los mohos comunes que deterioran los granos y forrajes almacenados pues

suelen producir toxinas que afectan al hombre y los animales.

Introduccin
Los problemas causados por los hongos en alimentos y forrajes son numerosos. Los causados por micotoxinas son, con frecuencia, costosos debido a que se descubren muy tarde para prevenir las prdidas econmicas. Una herramienta importante en el control micolgico de cereales y especias, es el uso de mtodos simples de identificacin especfica que se realiza en base al aspecto de las colonias y la micromorfologa en varios medios de cultivo a distintas condiciones de incubacin.

Procedimiento
Hacer repiques de un cultivo puro en tres puntos equidistantes de cada placa con los medios: agar malta, agar Czapeck, agar Czapeck glicerol, agar papa sacarosa, e incubar a 25C durante 7

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice dias. Adems repicar en estras sobre dos tubos de agar malta o Czapeck e incubar uno a 5C y el otro a 37C. El cultivo en agar papa sacarosa se incuba a la temperatura ambiente con luz solar indirecta. La composicin de los medios de cultivo es la siguiente: Agar malta: extracto de malta 20 g, peptona 1 g, glucosa 20 g, agar 20 g, agua destilada 1 litro; esterilzar a 121C durante 15 minutos. Solucin concentrada de Czapeck: nitrato de sodio 30 g, cloruro de potasio 5 g, sulfato de magnesio 5 g, sulfato ferroso 0 , l g, agua destilada 100 mL; mantener a la temperatura ambiente. Agar Czapeck: fosfato dipotasico 1 g, solucin de Czapeck 10 mL, extracto de levadura 5 g, sacarosa 30 g, agar 15 g, agua destilada 1 litro; esterilizar a 121C durante 15 minutos. Agar Czapeck glicerol: disolver las sales y extracto, como el anterior, en una mezcla de 250 mL de glicerol y 750 mL de agua destilada; esterilizar de igual manera. Agar papa sacarosa: hervir 200g de papa rallada en 1 L de agua, durante media hora, y completar el volumen a un litro, aadir 10 g de sacarosa y 15 g de agar, esterilizar a 110C durante 20 minutos. Observar y registrar el aspecto macromorfolgico de las colonias. Hacer preparaciones en fresco con lquido de Patterson o colorante de Guegun. Observar al microscopio y dibujar las estructuras. Si es necesario prolongar la incubacin. Consultar las claves de la bibliografa para identificar el gnero (si es posible la especie) y cules son las micotoxinas que producen.
Bibliografa o Pitt JI, Hocking AD. Fungi and food spoilage. Blackie A&P, London, 1997 o Carrillo L. Los hongos de los Alimentos y Forrajes. 2002 http://www.unsa.edu.ar (material bibliogrfico)

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TRABAJO N 9. Micorrizas
Objetivo. Observar los hongos asociados con plantas herbceas y rboles constituyendo las

micorrizas. Preparar un inoculante para ectomicorrizas.

Introduccin
Las plantas parecen totalmente autnomas, pero la mayora estn asociadas con hongos, en sus races formando micorrizas o, endfitos dentro del tallo.

Endomicorrizas

Cuando el hongo penetra en el interior de las clulas de la raz, formando minsculas arborescencia y vesculas, se las llama endomicorrizas vesculo - arbusculares. Los arbsculos suelen tener una vida efmera, de algunos das a pocas semanas, siendo luego digeridos por el hospedador. Los hongos de este tipo de micorrizas, generalmente presente en la vegetacin herbcea, pertenecen a la familia de la endogonceas. Hay otros tipos de endomicorrizas como las que forman ovillos intracelulares en las orqudeas Cada una de las diferentes especies de orqudeas tiene una alta especificidad por un hongo particular que generalmente es un zigomiceto. El grado de interdependencia es tal que en muchos casos ninguno de los asociados puede ser cultivado sin el otro, pues forman una verdadera simbiosis. Las races se infectan con hongos de las micorrizas vesculo-arbusculares por las hifas desarrolladas a partir de propgulos presentes en el suelo, los que pueden ser esporos o estructuras de resistencia presentes en las races muertas.

Ectomicorrizas
En ellas el hongo rodea la raz con un manto de filamentos y una red miceliar penetra entre las clulas radicales pero no dentro de ellas. Los hongos que forman ectomicorrizas en rboles son macrocrpicos y tpicamente basidiomicetos superiores, por ejemplo Amanita, Boletus, Pisolithus, Suillus. Ms raramente los ascomicetos forman micorrizas, por ejemplo Tuber. Es poca la especificidad de estas asociaciones ya que varios rboles pueden formar micorrizas con un hongo dado y viceversa. Algunas especies de rboles, por ej. los eucaliptos, poseen a la vez ectoy endo-micorrizas.

Inoculacin

La falta de micorrizacin acarrea problemas en el transplante de las plntulas de rboles y plantas ornamentales, excepto en los casos en que el suelo contenga especies fngicas. Para inocular con cultivos puros, el substrato (suelo, turba) debe ser previamente pasterizado con el fin de disminuir la poblacin fngica nativa competitiva. Los hongos son incorporados al substrato de siembra como trozos de races micorrizadas, pedazos de ascoma o basidioma, o micelio obtenido in vitro. El agregado de micelio ofrece mayores garantas en el caso de hongos que se desarrollan bien en cultivo axnico. El primer paso de toda inoculacin consiste en la seleccin del hongo. Los siguientes obtener el cultivo y multiplicarlo para aadirlo al suelo donde se coloca la plntula crecida en condiciones aspticas.

Procedimiento
Observacin de micorrizas

Lavar la raz con agua corriente. Observar su aspecto y seleccionar un trozo. Cortar en porciones de un centmetro de largo y colocarlos en solucin de hidrxido de sodio o potasio al 10% p/v. Calentar a 90C durante 30 minutos o ms si es necesario. Cuando el material es obscuro sumergirlo en agua oxigenada de 10 volmenes durante 15 minutos, sino omitir este paso. Lavar 4 veces con agua corriente. Poner los trozos en solucin de cido clorhdrico 0,1 N

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice durante 10 minutos. Colorear con azul-lactofenol a 90C por 5 minutos. Pasar a lactofenol. Colocar un trozo de la raz tratada entre dos portaobjetos y aplastarla. Observar al microscopio entre porta y cubreobjetos. El lactofenol contiene: cido lctico 100 ml, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 ml. La solucin colorante se prepara mezclando 5 mL de solucin acuosa de azul de algodn o azul tripn o azul de metilo al 1% p/v, con 95 mL de lactofenol.

Preparacin del inoculante para ectomicorrizas


Cortar el basidioma con un instrumento previamente mojado en alcohol y encendido. Con un gancho o pinza estril tomar porciones del interior del sombrero y depositarlas sobre la superficie de una placa de agar malta levadura. Incubar a 25-27C, dos o ms semanas en la obscuridad. El agar malta levadura contiene: extracto de malta 20 g, extracto de levadura 2 g, agar 20 g, agua 1 L. Se esteriliza a 121C durante 15 minutos. Repicar en 50 ml de medio lquido de Melin Norkrins modificado en un matraz de Erlenmeyer de 250 mL e incubar a 25-27C con una agitacin de 100 rpm y en la obscuridad, el tiempo requerido para un buen crecimiento. El medio lquido de Melin Norkins modificado contiene cloruro de calcio 0,05 g, cloruro de sodio 0,025 g, fosfato monopotsico 0,5 g, fosfato diamnico 0,25 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,15 g, cloruro frrico (al 1% p/v) 1,2 mL, extracto de malta 1,5 g, sacarosa 10 g, agua 1 litro. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Homogeinizar el cultivo, mezclar con suelo pasterizado previamente con vapor de agua a 60C. Llenar unas macetas pequeas y colocar los plantines. Llevarlos al invernculo.
Bibliografa
o o Deacon JW Introduccin a la Micologa Moderna. Limusa-Noriega, Mxico, 1993 Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990

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TRABAJO N 10. Microorganismos del agua


Objetivo. Conocer la probable contaminacin del agua con patgenos, a travs de la bsqueda de

microorganismos indicadores y otros.

Introduccin
El agua es un sistema ecolgico en equilibrio que constituye la base de todas las comunidades vivas. Como es indispensable se procura aumentar sus recursos, especialmente almacenndola, y mejorar su calidad mediante purificacin. El anlisis biolgico del agua para determinar la calidad sanitaria utiliza mtodos que indican el grado de contaminacin con excrementos. Se emplean tcnicas para la deteccin y recuento de organismos indicadores, porque principalmente interesa conocer el peligro potencial de la transmisin de patgenos a travs del agua, antes que la bsqueda de stos.

Coliformes

Los coliformes son bacterias de origen entrico que son capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas. Los gneros de enterobacterias incluidos en el grupo d e los coliformes a efectos de anlisis de aguas son Citrobacter, Enterobacter, Escherichia y Klebsiella . Este grupo es el principal indicador de la conveniencia del agua para uso domstico, industrial u otro. La prueba de fermentacin en una serie de t ubos (caldo bilis lactosa verde brillante, caldo McConkey, etc.) con determinacin del nmero ms probable (NMP) fue la primera usada, luego se incorpor la tcnica de filtracin por membrana que, con algunas limitaciones, es comparable a la anterior, y finalmente se introdujo el substrato cromognico ONPG (onitrofenil- -D- galactopiransido) al medio liquido para NMP. Comnmente para determinar el NMP se realiza una prueba presuntiva basada en la fermentacin de la lactosa con produccin de gas que queda atrapado en la campanita. La ausencia de gas se interpreta como ausencia de coliformes, pero su presencia es una posibilidad de presuncin pero no de seguridad puesto que algunas bacterias lcticas suelen producir gas. El medio de cultivo liquido lleva un indicador de pH para facilitar la lectura y sales biliares para inhibir el desarrollo de las bacterias no entricas. Los coliformes presentes en el intestino y las heces de animales de sangre caliente, incluido el hombre, son capaces de producir gas al fermentar lactosa a 44,5C. Ms especifica es la bsqueda de Escherichia coli por cultivo sobre placas de medios que permiten la deteccin en 7 horas (m-7hFC) o en 2448 horas (EMB, Endo y otros), o bien un medio liquido con el substrato fluorognico MUG (4-metilumberiferil- -D-glucurnido) especifico para bacterias con la enzima -glucuronidasa (24 hs a 44,5C). En los casos que se requiere confirmar la presencia de E. coli se emplean las pruebas de: fermentacin de lactosa, sorbitol y celobiosa, hidrlisis de ONPG, produccin de indol, viraje del rojo de metilo, produccin de acetona, uso del citrato, motilidad, descarboxilacin de lisina y ornitina, oxidasa y formacin de pigmento amarillo; las que permiten clasificar las especies de enterobacterias presentes en aguas. El significado de estos anlisis se basa en que la falta de coliformes implica una ausencia de contaminacin fecal prxima o remota,mientras que su presencia no certifica una contaminacin de aguas con materias fecales. En cambio, la presencia de Escherichia coli demuestra una contaminacin fecal reciente.

Enterococos

Constituyen un grupo de estreptococos fecales que incluye S. faecalis, S. faecium , S. gallinarum y S. avium. Se diferencian de los otros estreptococos por su capacidad para crecer en presencia de 6,5% cloruro de sodio, a pH 9,6, entre 10 y 45C. Son bacterias esfricas, gram positivas, fisiolgicamente relacionadas con las bacterias lcticas que dan negativa la prueba de catalasa. Como tienen requerimientos nutricionales ms complejos que otras bacterias difcilmente se

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice multiplican en el agua aunque resisten mejor la cloracin que Escherichia coli. Los enterococos tambin son indicadores fecales, y para su anlisis se emplean pruebas de cultivo en una serie de tubos de medio selectivo (caldo glucosa azida) para determinar el NMP y la filtracin por membrana (agar mE, etc), siendo confirmado por repiques en agar bilis esculina u otro medio especial, adems de la prueba de catalasa y la coloracin de Gram. Los enterococos son indicadores que permiten determinar el grado de la contaminacin fecal. Una relacin entre el nmero de coliformes fecales al nmero de enterococos, mayor que cuatro indica contaminacin fecal humana, mientras que si es menor que uno sugiere otra fuente.

Clostridios
Clostridium perfringens tiene el mismo significado que los enterococos y una supervivencia mucho mayor que cualquier otro indicador bacteriano de polucin fecal, debido a su capacidad formadora de endosporos. En aguas naturales superficiales, no contaminadas, no se suele detectar la presencia de estos microorganismos ni en grandes volmenes de muestra, aunque se lo pueda observar en agua profundas. La proporcin de clostridios frente a otros indicadores fecales es muy reducida. La deteccin simultnea de Cl. perfringens y coliformes o E. coli constituye una clara evidencia del origen fecal de la contaminacin. En cambio la presencia exclusiva de los clostridios debe interpretarse como un indicio de contaminacin fecal remota. La existencia de endosporos de clostridios en aguas tratadas carece de significado. El ensayo se funda en el sistema enzimtico de la sulfito-reductasa que en el caso de Cl . perfringens es estrictamente endocelular, y la reduccin de sulfito a cido sulfhdrico solo tiene lugar en contacto con la colonia y el ennegrecimiento en una zona muy prxima ella, si en el medio existen sales solubles de hierro. Otros esporulados tambin suelen reducir el sulfito.

Pseudomonas spp.

En las aguas se suele buscar Pseudomonas aeruginosa , un organismo asociado al tracto respiratorio superior o la piel, que se comporta como patgeno oportunista. Su presencia es poco favorable para la calidad del agua.. Es un indicador primario de la eficiencia de la desinfeccin, mientras que los coliformes son indicadores de la contaminacin de las superficies. Se emplea tanto el mtodo de siembra en una serie de tubos de medio lquido (caldo asparagina u otro) para determinar el NMP, como la tcnica de filtracin por membrana (agar M-PA). Para la confirmacin se suele usar caldo acetamida, agar leche, agar King A y B, agar King A- cetrimida. El bromuro de N -cetil-N,N,N-trimetilamonio (Cetrimide) es un agente antibacteriano de amplio espectro que no afecta a la especie citada por lo q ue se adiciona en cantidades de 0,1 - 0,3 g/L de medio King A para el aislamiento. Las colonias tpicas de estos bacilos Gram negativos son de bordes generalmente irregulares que tiene tendencia a difundirse, las cepas no pigmentadas dan colonias translcidas, las otras pueden estar teidas de verde o parduzco. El pigmento colorea a la porcin del medio que rodea a la colonia. Pseudomonas aeruginosa forma piocianina que tiene un color azul-verdoso y difunde en el medio cuya produccin se ve favorecida en un medio (King A) que contiene sulfato de potasio, cloruro de magnesio y glicerol y no incluye nitratos ni sales de sodio pues actan como inhibidores. Este pigmento es soluble en agua y cloroformo. La solucin azulada se colorea de rojo por el agregado de cidos. La produccin de un compuesto fluorescente por especies de Pseudomonas se favorece en un medio que contiene fosfatos y sulfatos (King B). Es soluble en agua y cido actico e insoluble en cloroformo. La solucin acida es incolora y no fluorescente; la neutra alcalina es amarillenta a parda y fluorescente.

Otros microorganismos

En las aguas industriales suele ser conveniente conoer la incidencia de bacterias del azufre y el

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice

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hierro, debido a que intervienen en los procesos de corrosin. Los olores desagradables, como a moho, que ocasionalmente suelen presentarse en aguas potabilizadas pueden deberse a la presencia de geosmina y 2-metilisoborneol producidos por actinomicetos en aguas superficiales. Suele hacerse un recuento de estas bacterias ramificadas en agar almidn casena con cicloheximida. Los protozoos patgenos de importancia transmitidos por las aguas son quistes de Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, as como ooquistes de Cryptosporidium parvum. Este ltimo puede encontrarse en aguas cloradas.

Procedimiento
Nmero ms probable de coliformes
Sembrar tres tubos de caldo -lactosa doble concentracin con 10 mL de muestra, tres tubos de medio simple con 1 mL y los tres restantes con 0,1 mL cada uno. Incubar a 35C durante 24-48 hs. Para coliformes fecales usar el medio EC e incubar a 44,5C. El caldo-lactosa simple contiene: extracto de carne 3 g, peptona 5 g, lactosa 5 g, prpura de bromocresol (al 0,5%) 4 mL, agua 1 L, pH 7,2. Repartir en tubos con campanita. El medio doble concentracin contiene los mismos ingredientes en 500 mL de agua. El medio EC simple contiene: peptona 20 g, lactosa 5 g, sales biliares 1,5 g, fosfato dipotasico 4 g, fosfato monopotsico 1,5 g, cloruro de sodio 5 g, agua destilada 1 L. Para el medio doble concentracin se disuelven los slidos en 500 mL de agua. Se reparte en tubos con una campanita (ver figura 19). Observar los tubos que presentan gas en cada una de las series. Obtener el nmero caracterstico donde la primera cifra corresponde a los tubos de positivos sembrados con 10 mL de muestra, la segunda a los positivos que recibieron 1 mL y la tercera a los positivos con 0, 1 mL de agua. Consultar la tabla para obtener el nmero ms probable de coliformes o coliformes fecales en 100 mL de la muestra.

Figura 19

Sembrar 1 asa de cada uno de los tubos positivos para coliformes fecales en sectores de las placas de agar Levine (EMB). Este medio contiene peptona 10 g, lactosa 5 g, sacarosa 5 g, fosfato dipotsio 2 g, agar 15 g, eosina 0,4 g, azul de metileno 0,065 g, agua 1 L, pH 7,2. Incubar a 35C durante 48 horas. En este medio las colonias son negras con brillo metlico.

Escherichia coli

Nmero ms probable de enterococos


Sembrar cada uno de los tres tubos de caldo-azida doble concentracin con 10 mL de muestra. Agregar 1 mL a cada uno de tres tubos de caldo-azida simple y 0,1 mL a los tres restantes. Se incuban a 35.C y se observan a las 24 y 48 horas. El caldo-azida simple contiene peptona 15 g, extracto de carne 4,5 g, glucosa 7,5 g, cloruro de sodio 7,5 g, azida de sodio 0,2 g, agua destilada 1 L. El medio doble concentracin se prepara agregando la misma cantidad de slidos a 500 mL de agua. Se reparten a razn de 10 mL en cada tubo. Se consideran positivos los tubos que presentan turbiedad debido al crecimiento microbiano.

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice Consultar la tabla para obtener el nmero ms probable de enterococos en 100 mL de muestra.
Nmero ms probable por mL de muestra, utilizando series de tres tubos inoculados con 10 mL, 1 mL y 0,1 mL

Nmero caracterstico 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3

ndice NMP 3 6 9 3 6,1 3,2 12 6,2 9,3 12 16 9,4 13 16 19 3,6 7,2 11 15 7,3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29

Nmero caracterstico 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2

ndice NMP 9 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100

Clostridios sulfito-reductores
Repartir, a razn de 20 mL por tubo, un medio que contine caldo nutritivo 1 L, glucosa 20 g, agar 30 g y esterilizar 30 minutos a 110C. Preparar una solucin de 1 g sulfito de sodio y 4 gotas de alumbre frrico (al 5%) en 10 mL de agua destilada estril. Calentar a ebullicin 25 mL de muestra. En el momento de usar fundir cinco tubos de medio en bao de agua hirviente, agregar 1 mL de la solucin de sulfito y 5 mL de la muestra tratada, evitando la incorporacin de aire. Enfriar bajo chorro de agua e incubar a 35C durante 48 horas. Contar las colonias negras en cada tubo sembrado con 5 mL de muestra, sumar y calcular el nmero de organismos presentes en 100 mL de muestra

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Pseudomonas spp.
Sembrar 0,1 mL de la muestra o diluciones de la misma (1/10 1/100 en agua estril) en sendas placas de los medios King A y King B. Incubar el medio A durante 48 hs a 37C y el medio B durante 24 hs a 37C y luego 3-4 das a temperatura ambiente. El medio King A, que exalta la produccin de piocianina, contiene: peptona 20 g, glicerina 10 mL, cloruro de magnesio 1,4 g, sulfato de potasio 10 g, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,2. El medio King B, que favorece la produccin del pigmento fluorescente, contiene: proteosapeptona 20 g, glicerina 10 mL, fosfato monopotsico 1,5 g, sulfato de magnesio 1,5 g, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,2. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Observar las colonias con pigmentos solubles y/o fluorescentes bajo luz visible y ultravioleta.
Bibliografa
o o Eaton AD, Clesceri LS, Greenberg AE. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19 ed. parte 9000: Microbiological Examination. APHA, Washington, 1995 Guinea J, Sancho J, Pars R. Anlisis Microbiolgico de Aguas. Omega, Barcelona, 1979

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1. Microorganismos
Los ambientes capaces de albergar vida microbiana reflejan el amplio espectro de la evolucin de estos organismos. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelacin y el punto de ebullicin del agua, en agua salada y en agua dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse a muchos ambientes diferentes (1). Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes de aire y estar en todas partes, pero las caractersticas del ambiente determinan cules especies pueden multiplicarse. Existen varias clases de microorganismos: mohos, levaduras, bacterias, actinomicetos, protozoos, algas, virus. La figura 1 muestra el tamao comparativo de algunos microorganismos. El suelo es uno de los ambientes donde un conjunto ingobernable de microorganismos compiten entre s para obtener lo que todos ellos necesitan: nutrientes y energa. Al mismo tiempo, los productos de su metabolismo alteran la composicin qumica del suelo donde habitan. Ms an, los propios microorganismos evolucionan en respuesta a la presin del ambiente (3). En un suelo agrcola estn presentes alrededor de 1010 organismos por g de suelo y constituyen una biomasa de aproximadamente 1500 kg por Ha, lo cual corresponde a un cordero por cien m2 . Un gramo de suelo frtil puede contener 5 m de micelio fngico, 10 8 clulas bacterianas, 106 esporos de actinomicetos (4). En los animales monogstricos la poblacin bacteriana alcanza su mximo nivel en el intestino grueso y el impacto metablico de la microbiota es considerable. En el rumiante la accin de los microorganismos contenidos en el rumen es an ms espectacular, pues al degradar la celulosa permiten al animal alimentarse de forrajes (5). Numerosas especies bacterianas y algunas veces incluso algas microscpicas o protozoos, proliferan en las superficies expuestas a la humedad formando una biopelcula de microorganismos contenidos en una matriz de polisacridos, cuyo espesor puede oscilar entre algunos micrmetros y pocos milmetros, que se adhiere fuertemente a la base. Las biopelculas se forman en todas las superficies sumergidas, tanto en agua dulce como de mar, o bien sobre soportes constantemente hmedos tales como paredes de la caera de agua, pisos o dientes. El 99% de toda la actividad microbiana en un ecosistema abierto ocurre sobre las superficies (6). Los mohos y levaduras forman parte de los hongos. Las levaduras son unicelulares en condiciones normales mientras que los mohos crecen como un sistema ramificado de filamentos (micelio). Se trata de organismos eucariticos cuyas clulas, al igual que las

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. captulo 1 de vegetales y animales, tienen un ncleo cerrado por una doble membrana porosa y llevan como mnimo dos cromosomas, a ms de veinte en algunas especies (7). Las eubacterias y los actinomicetos son procariticos. Sus clulas carecen de membrana nuclear y mitocondrias, adems poseen un solo cromosoma que se encuentra libre en el citoplasma y una pared celular rgida. Las clulas de los procariotas son, en general, mucho menores que las de los eucariotas; unas 10 veces menor en medidas lineales y por lo tanto unas 1000 veces menor en volumen (1). Los protozoos del suelo se alimentan de bacterias y presentan movimientos ligados a la fagocitosis que es la ingestin de partculas mediante invaginacin de la membrana citoplasmtica y formacin de vesculas intracelulares (4). Las eubacterias presentan diversa morfologa: esfrica, cilndrica, espiralada e incluso filamentosa. Los actinomicetos incluyen muchos gneros que desarrollan en forma de delgado micelio. Las eubacterias son organismos pequeos, que miden uno o varios micrmetros. Las levaduras, en cambio, miden entre 6 y 12 m. Los mohos son pluricelulares y aunque sus clulas aisladas miden a lo sumo 25 m de largo, su conjunto se distingue a simple vista. Los hongos con reproduccin sexual pueden tener cuerpos fructferos de tamao notable como los championes y otras setas, formados por millones de clulas (7). La figura 2 es un esquema de las clulas procaritica y eucaritica.

1.1. Dominios y reinos


Las dificultades lgicas para ubicar a los microorganismos en los vegetales o los animales desaparecieron al admitir un tercer reino, el de los protistas. Este reino inclua a todos aquellos organismos que se diferencian de las plantas y los animales, por su falta de especializacin morfolgica, siendo la mayora unicelulares. Luego los protistas fueron divididos en dos grupos claramente definidos sobre la base de su estructura celular. Los eucariticos eran protistas superiores. Este grupo comprenda a los protozoos, hongos y algas. Los procariticos eran protistas inferiores e incluan a las diversas bacterias y cianobacterias (2). Otra clasificacin de los seres vivos estaba fundada en el reconocimiento de cinco reinos (9).

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. captulo 1

Los estudios ultraestructurales, bioqumicos y de la biologa molecular hicieron insostenible la permanencia de estos reinos, y los procariotas fueron ubicados en los dominios Bacteria y Archaea mientras que el dominio Eukarya comprende a los microorganismos en tres reinos (10). La importancia de esto ltimo radica en que los organismos estudiados por los fitopatlogos han sido distribuidos entre los reinos Chromista, Fungi y Protozoa, aunque se ha sugerido transferir los hongos que estn en Chromista al nuevo reino Straminipila (11). Los virus no fueron considerados pues son partculas acelulares, diferentes de todos los otros microorganismos, que pueden proliferar y replicarse solamente dentro de clulas vivas (12). Por otra parte, parece que las clulas eucariticas surgieron de antepasados procariticos, pues hay pruebas del origen bacteriano de mitocondrias y cloroplastos (13). Dominio Archea Bacteria Eukarya Reino Tipo celular procaritico " eucaritico " " " " Ejemplos arquibacterias eubacterias, actinomicetos, mixobacterias, cianobacterias oomicetos, algas mixomicetos, protozoos levaduras, mohos, setas, bejines musgos, hepticas, conferas, plantas con flores esponjas, corales, gusanos, moluscos, insectos, vertebrados

Chromista Protozoa Fungi Plantae Animalia

1.2. Organismos procariticos


La clula procaritica tiene solamente dos sistemas internos principales: una molcula circular de ADN con cadena helicoidal doble y un citoplasma no diferenciado donde se halla inmerso ese ADN. La longitud del anillo de ADN que codifica toda la informacin gentica de la clula apenas es superior a un milmetro (7). El citoplasma contiene gran nmero de ribosomas, grnulos constituidos por ARN y protenas, que cumplen la funcin de enlazar los aminocidos formando protenas. Los ribosomas procariticos son ms pequeos que los eucariticos (1). La replicacin del ADN comienza cuando ambas cadenas se separan, permitiendo la sntesis de una cadena complementaria a cada una de ellas mediante la ADN polimerasa. La nueva hlice es un hbrido consistente de una cadena original y una recin formada (replicacin conservativa) (14). La duplicacin del cromosoma de Escherichia coli en

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. captulo 1 condiciones favorables tarda 20 minutos. Un gen, o unidad de informacin gentica, est representado por una secuencia especfica del ADN y determina la estructura de un polipptido. El conjunto de genes se denomina genoma. La informacin contenida en la secuencia del ADN es transferida al ARN mensajero (ARN-m) durante la transcripcin. Los aminocidos son reunidos en una cadena polipeptdica segn la secuencia determinada por el ARN-m en un proceso de traduccin que implica la participacin del ARN-t (ARN que transfiere los aminocidos), los ribosomas, varias enzimas y ATP. Los microorganismos procariticos poseen una cubierta celular muy diferente de la de los eucariotas. Las paredes celulares de muchos de los procariotas poseen un componente qumico comn, el pptidoglucano (murena), que es el responsable de la forma y consistencia de la pared. El pptidoglucano es un extenso polmero que se halla integrado por subunidades alternas de N-acetilglucosamina (que es tambin el constituyente de la quitina en los eucariotas) y el cido N-acetilmurmico. Esta ltima molcula es similar a la N-acetilglucosamina, pero tiene una unidad de cido lctico unida al tercer tomo de carbono de la glucosa. El cido lctico sirve como punto de unin de una cadena lateral lineal constituda por cuatro aminocidos D o L. Las molculas de pptidoglucano que rodean la clula estn entrelazadas por puentes formados por los aminocidos (1). Algunas bacterias filamentosas forman una envoltura tubular constituda por heteropolisacridos que se conoce como vaina (12). La flexibilidad metablica de una bacteria es enorme. Debido al pequeo tamao, una bacteria esfrica tiene espacio para no ms que cien mil molculas de protenas. Las enzimas no estn corrientemente dentro de la clula, sino que su sntesis es inducida por la presencia del substrato en el ambiente (1).

1.2.1. Eubacterias

La cantidad de pptidoglucano de la pared de las clulas bacterianas vara enormemente, desde el 90% en la pared de algunas bacterias gram-positivas hasta menos del 10% en las bacterias gram-negativas. El trmino Gram-positivo hace referencia a la capacidad de ciertas bacterias de retener el colorante violeta cristal en presencia de yodo cuando se agrega alcohol, al hacer la coloracin de Gram sobre un portaobjetos con las bacterias fijadas. Las bacterias negativas no retienen a este colorante (7). La penicilina y otros antibiticos -lactmicos que interfieren con la biosntesis de la pared celular llevan a la produccin de protoplastos carentes de pared bajo condiciones osmticas apropiadas (1). El trmino esferoplasto se usa para los casos en que persisten restos de pared. La figura 3 muestra un esquema de las paredes celulares. La pared celular de las bacterias Grampositivas contiene pequeas cantidades de protenas y polisacridos, a menudo tambin cidos teicoicos (polmeros de ribitol-fosfato o glicerol-fosfato unidos mediante enlaces fosfodister) o de cidos teicournicos. Estos cidos estn unidos al pptido-glucano por los fosfatos (12). En las proteobacterias (Gramnegativas) la capa interna de la pared celular es pobre en pptidoglucano y la capa externa rica en lipoprotena y lipopolisacridos, los cuales constituyen ms del 80% del peso seco de la pared. El espacio entre la membrana externa y la capa de pptidoglucano, llamado periplsmico, contiene un gran nmero de protenas

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enzimticas. La capa de pptido-glucano e st rodeada por una membrana externa compuesta de lpido A y fosfolpidos con protenas en tnel (porinas) que la atraviesan. El lpido A consiste de un disacrido de glucosamina cuyos grupos hidroxilo estn esterificados con cidos grasos de 12, 14 16 carbonos (12). Los micoplasmas son bacterias carentes de pared celular y parecen protoplastos, pero son ms resistentes a la lisis osmtica debido a la naturaleza de su membrana citoplasmtica, la que contiene esteroles en un grupo y carotenoides u otros compuestos en los dems (1). La membrana citoplasmtica bacteriana contiene alrededor del 70-90% de los lpidos celulares mientras que la membrana constituye solamente 8-15% del peso celular seco. La membrana, con un grosor de 5 nanmetros, consiste de una doble capa lipdica con los extremos hidrofbicos de los fosfolpidos en el interior y las cabezas hidroflicas expuestas sobre ambas superficies. Tambin tiene incorporadas protenas que la atraviesan o estn inmersas parcialmente en ella. Otras protenas unidas a la membrana son conocidas como protenas perifricas (17). Las substancias hidrofbicas difunden fcilmente pero no los iones. Las protenas de la membrana intervienen en la entrada y salida de substancias de la clula, y son especficas para un grupo de molculas estrechamente relacionadas. En la figura 4 se observa un esquema de la membrana citoplasmtica La membrana citoplasmtica se extiende y repliega hacia el interior del citoplasma formando los sitios de la generacin de energa respiratoria (mesosomas) y fotosinttica (tilacoides y cromatforos) en las bacterias que posean tales actividades metablicas. Otras bacterias (por ejemplo Nitrobacter, Nitrosomonas , Nitrosococcus) tienen paquetes de lminas paralelas, algunas de las cuales estn conectadas a la membrana citoplasmtica (12). Muchas bacterias estn dotadas de flagelos que les permiten moverse, insertados en la superficie celular. Si los flagelos se encuentran concentrados en un extremo de la clula se denominan polares ; si estn distribudos por toda la superficie celular, reciben el nombre de peritricos (7). La figura 5 muestra la ubicacin de los flagelos en las bacterias. Los flagelos posibilitan la quimiotaxis, que es el movimiento hacia la fuente de nutrientes o el alejamiento de un entorno qumicamente hostil. La protena del flagelo, flagelina, est unida a un gancho asociado a un cuerpo basal que causa el movimiento giratorio del flagelo. La base del flagelo est anclada en la membrana citoplasmtica, asociada en las gram negativas al pptido glucano y a la membrana externa para estabilizar la estructura flagelar (1). Las bacterias sin flagelos carecen de movimiento excepto aqullas que se deslizan sobre el substrato. La superficie bacteriana gram negativa tambin suele tener otras estructuras proteicas filamentosas las fimbrias o pili I que participan en la adhesin a diversas superficies, por ej. las mucosas animales, y los pelos de conjugacin o pili F (18). A veces las bacterias acumulan capas de poliscaridos sobre la superficie exterior (ej. Xanthomonas), pero algunas tienen una cpsula polipeptdica (ej. Bacillus ). La cpsula no es esencial para la vida y no siempre est presente. Para observarla se suspende al microorganismos en una solucin de nigrosina o rojo Congo y como la cpsula no es teida se ve como un halo claro alredor de la clula. En muchos casos el material capsular puede ser separado en forma de limo, por agitacin u homogeinizacin. Por ejemplo, Leuconostoc mesenteroides convierte rpidamente a una solucin de azcar de caa en una jalea de dextrano (1,6- -glucano). Por otra parte Acetobacter aceti var. xylinum secreta celulosa formado una cubierta coricea que rodea a las clulas y da cohesin a la colonia (12).

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. captulo 1 Numerosas eubacterias y tambin arqueobacterias, poseen una envoltura exterior proteica o capa S que suelen perder en las condiciones ptimas del laboratorio. Esta capa favorece la adhesin al substrato para permitir la accin de las exoenzimas y a la virulencia de las bacterias patgenas (19). Un pequeo grupo de eubacterias que se encuentran en el suelo (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, etc.) poseen endosporos. Son paquetes de ADN y otras molculas que pueden permanecer en estado latente por muchos aos, y resultan altamente resistentes al calor (incluso al agua hirviendo), productos quimiotxicos y otros agentes que ocasionan la muerte a las clulas. Ya en el ambiente apropiado, el endosporo puede dar origen a una nueva bacteria (7). Si se calienta una suspensin de suelo a 80-100C durante 10 minutos, slo sobreviven los endosporos bacterianos. stos contienen cido dipicolnico, una substancia no hallada en la forma somtica, en la proporcin de 10-15% del peso seco del esporo. Son varias las cubiertas que rodean al citoplasma del endosporo: membrana citoplasmtica, pared celular, crtex (pptidoglucanos), envoltura interna, envoltura externa (polipptidos) y, en ocasiones, exosporio (10). La figura 6 muestra un esquema de la formacin y estructura de un endosporo bacteriano. Los plsmidos son pequeos anillos (hay algunos lineales) de ADN extracromosomal que se multiplican independientemente en las clulas que los alojan y pueden portar genes que confieren ciertas ventajas a las mismas, por ejemplo resistencia a los antibiticos. Las bacterias hospedadoras a su vez, dejan que el ADN plasmdico se replique en ellas hasta cierto punto, asegurando as la presencia continuada del plsmido en las clulas hijas (20). Los tumores de las plantas producidos por la infeccin con Agrobacterium tumefaciens se deben al plsmido Ti que es el agente infeccioso real. El ADN plasmdico penetra en la clula vegetal y parte del mismo se incorpora al genoma de la planta. Este proceso se llama transformacin oncognica. La parte integrada del plsmido lleva la informacin para la produccin de opinas que son substancias utilizadas solamente por la bacteria. Otra especie, Agrobacterium rhizogenes desencadena el crecimiento anormal de las races mediante el plsmido Ri (21). La conjugacin es una forma de transferencia de genes y para que se produzca debe haber contacto entre las clulas bacterianas a travs de los pili F o pelos de conjugacin que retienen juntas a las clulas dadora y receptora. Los sistemas de conjugacin en bacterias gram-negativas produce la transferencia de una parte del ADN del cromosoma o de un plsmido de la clula dadora a la receptora (20). Las bacterias forman colonias caractersticas sobre la superfice del substrato, que tienden a adoptar una forma circular creciendo por adicin de clulas a su permetro. Al extenderse la colonia sobre el agar se observa que en el crecimiento participan unos

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elementos en anillos y otros en sectores. A todos los sectores los va formando, por propagacin centrfuga, la progenie de un antepasado comn. Algunos sectores se diferencian del resto porque las clulas difieren en su ADN de las de los sectores contiguos debido a mutaciones espontneas. Las bacterias de un anillo comparten algunas propiedades entre s pero no estn emparentadas, pues tienen parentesco directo con las de la zonas precedente y la siguiente (9). La figura 7 presenta algunas colonias de bacterias de distinto aspecto.

Las bacterias generalmente se multiplican por fisin binaria. Despus del crecimiento de la clula, aparece el septo y las clulas se separan o permanecen unidas con formas caractersticas: pares de bacterias, cadenas, paquetes cbicos y acmulos planos irregulares entre las bacterias esfricas (cocos), o pares y cadenas en las cilndricas (bacilos) (12). La multiplicacin por brotacin es rara en los procariotas pero se observa, por ejemplo, en la bacteria del agua estancada Hyphomicrobium. La figura 8 muestra un esquema de las diversas formas de bacterias. La segregacin del ADN es el proceso que distribuye igualitariamente el material gentico en las clulas hijas. Es producida en las bacterias debido a un mecanismo parecido al mittico. La replicacin de los plsmidos en la clula, sobre el replisoma, entraa la formacin de un complejo de separacin o particin donde se adhiere el plsmido cual regin centromrica. Una vez formadas las copias, stas se alejan activamente unidas a las protenas de particin hasta que la clula se divide. La divisin del cromosoma parece ocurrir de igual manera (23). La figura 9 presenta un esquema de la divisin de una bacteria.

1.2.2. Arqueobacterias
Este grupo de procariotas en su bioqumica y en la estructura de los ribosomas, membrana y pared, difieren tanto de los procariotas como de los eucariotas. Se los denomina arqueobacterias pues algunas poseen un metabolismo particularmente adecuado a las condiciones que se supone prevalecieron en los primeros tiempos de la vida sobre la tierra. Comprende tres clases muy diferentes: las metangenas, las halfilas extremas y las termoacidfilas (8). Las arqueobacterias no tienen pptidoglucano en la pared. La membrana est formada por lpidos no habituales, compuestos por un grupo glicerol ligado a dos cadenas de alquil-isoprenoides por un enlace tipo ter ( -O-) (24). Algunas de estas bacterias tiene histonas y nucleosoma de tipo eucaritico (25).

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. captulo 1 Las metangenas ( Methanobacterium , etc.) viven solamente en ambientes libres de oxgeno y liberan metano mediante la reduccin del CO2 . Su apariencia externa es la de las dems bacterias pero su pared celular vara. Algunas metanobacterias contienen pseudomurena donde el cido acetilmurmico est reemplazado por el cido Nacetilalosaminurnico pero en otras predominan las protenas o los heteropolisacridos en la pared celular. Viven en estrecha asociacin con otras bacterias, como los clostridios, que metabolizan materia orgnica en descomposicin y desprenden hidrgeno como producto de desecho. Se encuentran en agua estancadas, en las plantas de tratamiento de aguas residuales, en la panza del ganado, en el intestino de los animales, en el fondo del ocano y en los manantiales de aguas termales (1) (ver captulo 5). Las halfilas extremas son bacterias que, para sobrevivir, requieren elevadas concentraciones de sal. Algunas de ellas crecen fcilmente en salmuera saturada. Pueden conferir color rojo a los estanques de evaporacin donde se obtiene la sal y alteran al pescado salado. Mantienen fuertes gradientes en la concentracin de ciertos iones a travs de la membrana celular y utilizan esos gradientes para transportar diversas substancias hacia adentro o hacia afuera de la clula. Poseen un mecanismo fotosinttico sencillo que se basa en un pigmento ligado a la membrana: la rodopsina bacteriana. La pared de Halobacterium est formada por protenas pero la de Halococcus por heteropolisacridos (12). Entre las termoacidfilas se encuentra Sulfolobus que se halla en los manantiales de aguas termales sulfurosas. Crecen a ms de 80C y a pH inferior a 2. Otro gnero es Termoplasma, un micoplasma que slo posee membrana celular y crece a ms de 55C. El medio interior de la clula tiene un pH prximo a la neutralidad; ello exige mantener un considerable gradiente de pH a travs de la membrana celular. El gradiente es empleado para bombear molculas hacia dentro o fuera de la clula (8).

1.2.3 . Actinomicetos

Los actinomicetos constituyen un importante grupo de organismos procariticos habitantes del suelo y del material vegetal compostado. El gnero principal del grupo es Streptomyces cuyas especies suelen excretar antibiticos y el olor a tierra mojada se debe a compuestos voltiles fabricados por los mismos. Cuando se los cultiva en medio slido, no slo forman un fino micelio ramificado, sino que tambin producen una hifa area que se diferencia en cadenas de conidiosporos. Cada conidiosporo puede, a su vez, generar una colonia micelial. Otro gnero de inters es Nocardia cuyas colonias carecen de micelio areo o es escaso, con unos pocos conidiosporos en los extremos de las cortas ramas hifales o sin ellos, y finalmente las hifas se fragmentan totalmente en elementos bacilares (7). Thermoactinomyces, a diferencia de los otros gneros de actinomicetos, forma endosporos similares a los de Bacillus y Clostridium, en el extremo de pequeas ramificaciones (29). La figura 10 muestra un esquema de la morfologa de algunos actinomicetos. Nocardia, como la bacteria Mycobacterium, no se tie fcilmente por el colorante de Gram ni por otros, para colorearla se recurre al mtodo de Ziehl Neelsen donde el colorante (fucsina fenicada)

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se aplica en caliente y con el fin de diferenciarla se decolora a los otros organismos con un cido mineral diluido. Esto se debe a que el pptidoglucano est unido a los arabino-galactanos esterificados con cidos miclicos de naturaleza cerosa (1).

1.2.4. Cianobacterias

Son organismos procariticos, unicelulares o filamentosos (por reunin de clulas individuales adheridas por sus extremos) que contienen, adems de la clorofila, un pigmento azulado llamado ficocianina. Estn presentes en suelos, y aguas dulces o saladas. A veces colonizan ambientes extremadamente inhspitos. Algunos convierten el nitrgeno atmsferico en compuestos que los vegetales aprovechan y fertilizan los campos y de manera muy especial los arrozales (1). Ciertas especies producen metabolitos secundarios txicos (por ej. un fosfato orgnico letal) que son liberados de las clulas en el tracto digestivo de los animales al beber agua con verdn (27). Algunas son unicelulares adheridas por un limo o dentro de una cpsula, ej. Gloeocapsa. Otras tambin unicelulares generan multiples beocitos en su interior, ej. Dermocarpa. Las que forman cadenas de clulas (tricomas) que pueden deslizarse, suelen tener clulas especiales donde ocurre la fijacin del nitrgeno molecular (heterocistos) y clulas de reposo (acinetos), ej. Nostoc, o carecer de ellas, ej. Oscillatoria . Unas pocas tienen una vaina alrededor del tricoma (12). La figura 11 presenta un esquema de la morfologa de cianobacterias. Los gneros Anabaena, Aphanizomenon , Microcystis y Nodularia contienen especies txicas (27). En cambio el gnero Spirulina es comestible y apreciado por el alto tenor de protenas, del orden del 50-60% del peso seco, con un aminograma similar al de la harina de soja. Las cianobacterias tambin pueden convivir en simbiosis con las plantas, debido a su capacidad de fijar el nitrgeno molecular, por ej. Anabaena en las cavidades dorsales de las hojas del helecho acutico Azolla, y Nostoc en los ndulos caulinares del arbusto tropical Gunnera (28).

1.2.5. Mixobacterias
Las mixobacterias son organismos sociales cuyas clulas son flexibles y no tienen una pared celular rgida, generalmente estn embebidas en un limo espeso. Al desplazarse segregan un material mucoso extracelular que se convierte en grandes avenidas por donde avanzan miles de clulas. El movimiento es muy coordinado. Cuando la poblacin emigra sobre el agar, se desplaza como una unidad indivisa. Incluso las especies que entran en letargo como esporos unicelulares, exhiben hbitos sociales durante buena parte de su ciclo vital. Muchas de ellas nunca se presentan aisladas, por el contrario, entran en una etapa de letargo en forma de cisto pluricelular que luego germina y libera una nueva poblacin de millares de mixosporos (29). Las mixobacterias son organismos del suelo y los cuerpos fructferos se encuentran sobre material vegetal en descomposicin o estircol. Algunas, como Myxococcus , forman cuerpos fructferos como gotitas con

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. captulo 1 menos de 1 mm de dimetro. Otras, como Sporocytophaga forman adems de los bacilos delgados, unas clulas ovales como esporos llamadas microcistos. Pero Cytophaga no forma ni microcistos ni cuerpos fructferos (12). En el conjunto de la poblacin de mixobacterias se dejan sentir ondas pulstiles rtmicas. Las oleadas de mixobacterias que se acercan al centro o se alejan hacia el borde de la colonia en crecimiento, forman agregados en puntos especficos para construir los cistos o, en algunas gneros como Chondromyces, complejos cuerpos fructferos. La produccin de estas estructuras responde a cambios fsicos y nutricionales en el ambiente. Las clulas perciben estos cambios y transforman esta percepcin en una serie de hechos que implican agregacin, construccin del cuerpo fructfero pluricelular y la conversin de las clulas alargadas en mixosporos redondos, resistentes y metablicamente en reposo. Durante estos procesos monitorean la densidad celular, controlan el cronometrado de una serie de acontecimientos evolutivos, emprenden comportamientos tcticos, sufren autlisis evolutiva y se orientan en el espacio tridimensional (29). Las mixobacterias depredadoras se alimentan segregando enzimas en los huecos de las colonias para evitar su dilucin en el medio acuoso, que disuelven la cubierta celular externa de otros microorganismos. Cuando stos estallan, las mixobacterias absorben el contenido (22). La figura 12 muestra el diagrama del ciclo de vida de una mixobacteria ( Myxococcus xanthus) .

1.3. Organismos eucariticos


Los cromosomas eucariticos estn asociados a una clase de protenas bsicas llamadas histonas, y experimentan movimientos en el momento de la divisin celular. Como en los procariotas, la informacin contenida en el ADN es transportada por los ARN mensajeros del ncleo hacia el citoplasma, donde esta informacin es descodificada y da lugar a la sntesis de las protenas en los ribosomas (14). Una clula eucaritica contiene orgnulos definidos por membranas que cumplen funciones esenciales, tales como las mitocondrias (produccin la energa), el retculo endoplsmico (sntesis de protenas en los ribosomas adheridos), el aparato de Golgi o dictiosoma (sntesis y almacenamiento de glicoprotenas), y en algas los cloroplastos (fotosntesis) (12). Las protenas son dirigidas hacia la ruta secretora por una secuencia terminal (seal pptido) que es reconocida por una partcula reconocedora de la seal. Despus de la unin del complejo ribosoma-partcula a la membrana del retculo endoplsmico, el traslado contina y el polipptido naciente llega al lumen del retculo endoplsmico donde una endoproteasa especfica quita la seal y, tiene lugar el ensamblaje (plegado y formacin de puentes disulfuro) y la N -glicosilacin de la protena. Despus las protenas dejan el retculo endoplsmico en vesculas y son transportadas al aparato de Golgi donde ocurren ulteriores modificaciones. De all salen las protenas para sus diversos destinos, otra vez en vesculas, hacia la membrana citoplasmtica (secrecin) o los lisosomas (digestin de molculas) (24). La mayor parte de la energa obtenida por la oxidacin de glucosa y cidos grasos es transformada en energa qumica utilizable por la clula mediante la sntesis del trifosfato de adenosina (ATP) en la cadena respiratoria. Estas reacciones ocurren en las mitocondrias. Tienen dos membranas, la interna est invaginada en crestas. Los pliegues contienen los componentes de la cadena de transporte de electrones y la ATP sintasa. Tambin un pequeo nmero de protenas es sintetizado en los ribosomas de la matriz mitocondrial, la que contiene tambin su propio ADN pues estos orgnulos estn dotados de la capacidad de multiplicarse (30). Todas las estructuras se desplazan por el citoplasma a lo largo de pequeos tubos huecos, los microtbulos, que son polmeros de tubulina nucleados por el centrosoma

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(31). La organizacin de los microtbulos en flagelos y cilios, permite a algunos

eucariotas unicelulares nadar en el medio en que se encuentra (32).

1.3.1. Mohos
Los mohos se caracterizan por tener ncleo verdadero, carecer de pigmentos fotosintticos, poseer micelio con pared celular constituida por glucanos, quitosano y quitina (polmeros de glucosa, glucosamina y N-acetil-glucosamina, respectivamente) (7). En pocas ocasiones la pared est constituida enteramente de quitina. La pared celular del micelio de los hongos semeja un extenso sistema tubular por el que avanza protegido el citoplasma para su dispersin y bsqueda de nutrientes (1). Los elementos somticos tubulares que constituyen el micelio reciben el nombre de hifas. Las hifas pueden estar separadas en secciones, generalmente multinucleadas, por medio de septos perforados o bien carecer de ellos. Los hongos pueden reproducirse tanto sexual como asexualmente. Los hongos asexuales (anamorfos) generan varias clases de esporas asexuales por mitosis del ncleo celular (mitosporas) (33). La morfologa de las estructuras que contienen las esporas es muy variable y constituye una de las bases de la clasificacin de los hongos. El micelio somtico no es suficientemente discriminador para utilizarlo en la clasificacin. El color de muchos mohos que viven en la materia orgnica en descomposicin se debe al color de sus esporas asexuales. stas presentan varias tonalidades de color blanco, amarillo, azul, verde, rojo, pardo o negro (7). Los mohos generan varias clases de esporas asexuales, mono o pluricelulares. Las esporas se desarrollan en los esporforos, estructuras especializadas que se extienden en el aire a partir del micelio vegetativo, y las esporas se acumulan en el extreno superior de los mismos. Si las esporas estn encerradas en un esporangio (en forma de bolsa) se las llama esporangiosporas. Los conidios son esporas externas o sea no estn encerradas. Al madurar, estas esporas son esparcidas por el viento. Muchos mohos pueden reproducirse tambin a travs de esporas sexuales, generadas por meiosis, o divisin reductora, de un ncleo diploide (meiosporas). En la meiosis, el nmero de cromosomas se divide por la mitad. Las esporas sexuales contienen slo un cromosoma de cada par homlogo. La condicin diploide se restablece cuando dos estructuras haploides se unen, completando el ciclo vital. Los mohos a los que no se les conoce ciclo sexual, se consideran hongos imperfectos (33). Los mohos con estructuras reproductoras sexuales (teleomorfos) corresponden a tres grupos: ascomicetos, basidiomicetos y zigomicetos. Los ascomicetos producen sus esporas en ascos, que generalmente se forman dentro de un complejo cuerpo fructfero, el ascoma. De forma similar, los basidiomicetos desarrollan sus esporas sexuales externamente, en los basidios que se hallan en un complejo cuerpo fructfero: el basidioma. Pero este grupo tambin comprende a los carbones y las royas, organismos de inters agronmico por ser parsitos vegetales. Los zigomicetos producen zigosporas a veces visibles a ojo desnudo. En condiciones naturales, los mohos se reproducen en la mayora de los casos asexualmente, las estructuras reproductoras sexuales slo aparecen ocasionalmente en circunstancias favorables (33). La figura 13 muestra un moho (Rhizopus stolonifer ).

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1.3.2. Levaduras
La mayora de la numerosas especies de levaduras se han clasificado desde el punto de vista de la r eproduccin, que puede ser sexual o asexual. En la reproduccin vegetativa, generalmente, una clula madre da lugar a diversas clulas hijas por la formacin repetida de yemas en la superficie celular; en unas pocas levaduras la divisin asexual se hace por escisin celular luego de la duplicacin del ncleo (34). Tres grupos de hongos acogen a las levaduras: los ascomicetos, los basidiomicetos y los hongos imperfectos. El primer grupo incluye las levaduras cuyas estructuras reproductoras sexuales son o l s ascos sencillos que contienen ascosporas. Una clula diploide de levadura sufre meiosis y forma de cuatro a ocho ascosporas, encerradas en el asco. Una ascospora es una clula haploide que al germinar genera una progenie de clulas haploides por mitosis (reproduccin asexual). Las clulas de diferente polaridad sexual se combinan para formar un nuevo organismo diploide. Entre las levaduras que pertenecen a los ascomicetos se encuentra Saccharomyces cerevisiae empleada para la fabricacin del pan y la fermentacin alcohlica. Los basidiomicetos agrupan un nmero reducido de levaduras. Los hongos imperfectos incluyen levaduras que se reproducen slo de forma asexual, ej. Candida tropicalis (7). En la figura 14 se muestra el aspecto de una levadura que se divide por escisin y forma meiosporas.

1.3.3. Macromicetos
Son hongos con cuerpos fructferos (ascoma o basidioma) que se miden en centmetros. Entre ellos son de inters los que forman asociaciones simbiticas con rboles (ectomicorrizas), por ej. Amanita, Boletus, Cortinarius, Lactarius, Russula, Scleroderma, Suillus, Tricholoma, y los que crecen sobre troncos descomponiendo la madera, por ej. Schyzophyllum, Polyporus, Coriolus, Xylaria (35). La figura 14 tambin muestra una seta venenosa.

1.3.4. Mixomicetos
Los mixomicetos son organismos eucariticos mucosos que forman plasmodio y luego un cuerpo fructfero de colores destacados, sobre troncos y hojas en descomposicin o postes viejos, de 0,5 a 1 cm (36). La asociacin celular en los hongos mucilaginosos est mediada por la interaccin entre protenas unidas a carbohidratos de una clula y receptores formados por oligosacridos especficos de otra. De este modo, la diferenciacin de los hongos mucilaginosos desde una forma somtica (unicelular) hasta la forma cohesiva (agregada) va acompaada de la aparicin de lectinas y glicoprotenas especficas en la superficie celular (17). Las esporas liberadas de los cuerpos fructferos germinan sobre una superficie hmeda y producen mixoflagelados que nadan o bien mixamebas. stos se alimentan de los nutrientes lquidos o por fagocitosis de bacterias, levaduras, esporas fngicas, etc. Las clulas flageladas pierden luego su flagelo y

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entran en un estado ameboide. Estas clulas son mononucleadas. Ocasionalmente se fusionan en pares para dar mixozigotos. Estas amebas diploides se fusionan para dar un plasmodio (estructura multinucleada). Luego el plasmodio da origen al cuerpo fructfero o esporangio con numerosos esporas haploides (33). La figura 15 muestra las estructuras de un mixomiceto.

1.3.5. Protozoos
Los protozoos constituyen un grupo muy heterogneo de microorganismos eucariticos, unicelulares y mviles (con algunas excepciones). El ciclo de vida comprende dos fases: una de actividad, durante la cual se desplazan, nutren y reproducen; otra de reposo o enquistamiento. Se alimentan de bacterias, levaduras, algas y otros protozoos. Se los agrupan en: rizpodos que se desplazan por pseudpodos (amebas y testceos o foraminferos), flagelados con uno o ms flagelos, ciliados dotados de cilias y dos ncleos, y esporozoos parsitos. Se observa un esquema de los mismos en la figura 1 y 16. La poblacin de flagelados y amebas es del orden de 103 - 10 5 por gramo de suelo, la de ciliados 103/g y la de rizpodos testceos 10 3 - 104 /g. Participan en el equilibrio biolgico del suelo pues consumen grandes cantidades de bacterias, una ameba ingiere unas 40.000 bacterias entre cada divisin celular (4).

1.3.6. Algas
Son organismos fotosintticos eucariticos. L as algas del suelo viven en la proximidad inmediata a la superficie o sobre la misma. Predominan, arriba las diatomeas y abajo las clorofceas y xantofceas ubicuas. La humedad ptima es del 40 al 60% de la capacidad de retencin del agua por el suelo. Las algas libres o liquenizadas constituyen el estado inicial de la vegetacin rocas y suelos minerales infrtiles (4). En la figura 17 se muestra un alga roja del suelo.

1.3.7. Lquenes

Un lquen est constitudo por un hongo (el micobionte) junto con una o ms algas y/o cianobacterias (el fotobionte) viviendo en una relacin simbitica y formando un cuerpo estable e identificable (39). La figura 18 muestra una rama con varios lquenes.

1.4. Organismos acelulares


1.4.1. Virus
Un virus es un programa gentico que lleva de una clula a otra el mensaje "reprodceme". Consiste de un cido nucleico y una cubierta protenica conocida como

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. captulo 1 cpside, a veces tambin tiene una envoltura. Hay muchas clases de virus y se los puede agrupar por el tipo de material gentico que portan. Algunos tienen una molcula de ARN monocatenario (cadena "ms") compuesto por varios miles de subunidades nucleotdicas, que puede ser ledo directamente por el aparato de traduccin del hospedador, el ribosoma, como si fuera un ARN mensajero propio. Un ejemplo de este tipo de virus es el del mosaico del tabaco. Otros virus, por ej. el de la rabia, cifran sus mensajes en cadenas "menos" de ARN, las que en el interior de la clula deben transcribirse en cadenas complementarias de tipo "ms" para que empiece la replicacin. Los retrovirus constituyen una tercera clase de virus de ARN monocatenario. Cuando un retrovirus infecta a una clula, la enzima retrotranscriptasa transforma la cadena de ARN vrico en ADN monocatenario y ste es copiado por la ADN-polimerasa celular a ADN bicatenario que puede integrarse al genoma del hospedador. Los reovirus, patgenos de plantas y animales, tienen ARN bicatenario. Ejemplos de virus con ADN monocatenario son los inovirus y con ADN bicatenario los miovirus, ambos patgenos de bacterias (39). Un fago (virus que infecta a bacterias) posee una sola molcula de cido nucleico que se inyecta en la clula bacteriana. La figura 19 muestra la forma de un tipo de bacterifago. En la figura 20 se observa el ciclo de un fago lambda con ADN bicatenario lineal cuyos extremos se unen una vez dentro de la bacteria y los genes dispuestos sobre ese anillo dirigen la sntesis de las protenas vricas, valindose de la maquinaria bacteriana de sntesis. Parte de las protenas son enzimas implicadas en la replicacin del cido nucleico del fago, tarea que realizan en conjuncin con enzimas de la propia bacteria. El virus se reproduce, es decir fabrica nuevas molculas de ADN y protenas de la cpsula. Los nuevos ADN se introducen en las cpsulas recin formadas y el hospedador acaba lisndose (40). Por otra parte, el fago puede insertarse en el ADN de la bacteria hospedadora. En el estado integrado, el ADN del fago es replicado junto con el ADN bacteriano y no se expresa la informacin contenida en el primero. Este fago no infeccioso, que puede pasar de clula en clula por herencia, se denomina profago. La excisin del fago en la clula lisognica le devuelve la virulencia. Otra forma de agrupar los virus es por la forma. Se llama nucleocpside al cido nucleico (o virin) con la cpside,

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y puede estar desnuda o recubierta por una membrana. Una cpside consta de capsmeros, y en la mayora de los casos es simtrica. Se observan dos tipos de estructuras simtrcas: helicoidal e icosahdrica (12). En la figura 21 se muestra la forma de algunos virus.

1.4.2. Viroides
Los viroides son ms sencillos que los virus, pues son slo filamentos muy cortos de ARN. Producen enfermedades especficas de las plantas (42).

1.4.3. Priones
Se llama as a las protenas que actan como agentes infecciosos en algunas enfermedades del sistema nervioso de ovejas, vacas y otros animales (43), pero es discutible si se pueden considerar microorganismos.

1.7. Transferencia gentica en bacterias


En una bacteria la informacin gentica est codificada en una molcula de ADN larga y muy plegada para caber en la clula. El cromosoma bacteriano circular tiene al menos un milmetro de largo. La doble hlice formada por dos cadenas de nuclotidos consta de varios millones de pares de bases y la informacin total de la bacteria se despliega en un conjunto de varios miles de genes estructurales. En los procariotas y eucariotas la clave gentica y la bioqumica esencial de la transcripcin y la traduccin son las mismas, pero no as las seales de control. En las bacterias la informacin gentica codificada en un segmento contnuo de la doble hlice de ADN, que constituye el gen estructural, se transcribe directamente en un ARN mensajero cuya traduccin da lugar a una protena, generalmente una enzima (44). Antes de que una clula bacteriana se divida (transferencia vertical) ha de duplicarse su ADN (figura 22). Durante la replicacin del ADN se separan los pares de bases al alejarse ambas cadenas helicoidales. Las ADN polimerasas copian cada una de las hebras. Mientras se va construyendo la nueva hebra, sta se empareja con la que le sirve de molde. Pueden darse errores de replicacin por corrimiento cuando alguna de las hebras se desliza y establecen un emparejamiento inadecuado. En cada tanda de divisin bacteriana asexual habr alguna clula que porte una mutacin. La mutacin altera los genes de un microorganismo. La recombinacin reoordena los genes o parte de los mismos, y agrupa en un mismo individuo la informacin gentica de dos o ms organismos (44). Los tres mecanismos principales de intercambio horizontal de material gentico entre bacterias son: conjugacin, transformacin y transduccin. En todos estos procesos se transfiere ADN de la clula donadora a la receptora, pero difieren en la manera en que es transportado. La transferencia es seguida por la recombinacin y as el ADN de la

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. captulo 1 bacteria donadora se integra al de la receptora. El intercambio de genes en las bacterias no est confinado dentro de una especie o especies afines, acontece entre bacterias de gneros o familias diferentes. La recombinacin homloga ocurre cuando los ADN que poseen secuencias de bases similares, se renen e intercambian segmentos mediante la rotura y ensamblaje de las cadenas. Otra forma de recombinacin que aade nuevas porciones al ADN que ya posee el microorganismo, es la especfica de sitio y requiere solo pequeos fragmentos de ADN homlogo para el reconocimiento. Cuando ambos ADN poseen una secuencia de reconocimiento se habla de recombinacin especfica de sitio doble, por ejemplo la insercin de un fago. Si solamente una molcula de ADN transporta esa secuencia la recombinacin especfica de sitio es simple y permite la insercin de una secuencia mediante la transposicin (12). Ambientes en los que ha observado transferencia gentica horizontal (41)

Ambientes Terrestres Acuticos

Transduccin Suelos, superficies de plantas Lagos, ocanos, ros, zonas de tratamiento de aguas residuales

Interior de organismos

Crustceos, ratones

Conjugacin Suelos, superficies de plantas Lagos, ocanos, sedimentos marinos, ros, epiliton (capas gelatinosas que recubren las piedras de los ros), zonas de tratamiento de aguas residuales Plantas, insectos, gallinas, ratones, humanos

Transformacin Suelos Sedimentos marinos, ros, epiliton de las piedras de los ros

Plantas, insectos, ratones

1.7.1. Conjugacin

Se descubri cuando se mezclaron mutantes nutricionales (auxotrficos) con diferentes requerimientos de la bacteria Gram-negativa Escherichia coli y crecieron sobre un medio mnimo siendo que, separadamente, necesitaban un suplemento de determinados nutrientes para poder multiplicarse. Los genes silvestres de una cepa completaron los genes mutados de la otra (figura 23). Este proceso requiere el contacto entre las clulas y se transfiere el factor sexual F (fertilidad) que es una molcula pequea de ADN circular de doble cadena (plsmido) desde la clula donadora (F+) a la receptora (F-). Las clulas donadoras tienen en la superficie los pelos de conjugacin (pili F) que sirven para facilitar el contacto (figura 24). La presencia de un plsmido altera la capacidad para sintetizar el pelo F y el desplazamiento del ADN para su transferencia a otra clula, adems modifica los receptores superficiales.

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Slo unas pocas bacterias F+ pueden transferir ADN cromosomal. Son las que tienen el factor F integrado al cromosoma. Tales bacterias, llamadas Hfr, transfieren sus genes con una frecuencia muy alta. Durante la transferencia el ADN bacteriano se replica a partir del punto de insercin del factor F y la cadena recin formada entra en la clula aceptora. Este proceso es seguido de la recombinacin homloga del ADN de ambas clulas dentro de la bacteria receptora (figura 25). La introduccin de unas cuantas bacterias con plsmidos en una poblacin receptora, puede convertirla en portadora de plsmidos en poco tiempo (45). En las bacterias Gram-positivas la conjugacin no est mediada por pili. Antes del intercambio gentico, la clula receptora secreta substancias que estimulan la sntesis de protenas aglutinantes por las potenciales donadoras. Una vez que las bacterias se asocian, se forman los poros necesarios para la transferencia del ADN (41).

1.7.2. Transformacin
Algunas bacterias pueden captar ADN desnudo, por ejemplo las clulas de una colonia rugosa de Streptococcus pneumoniae al ser mezcladas con el ADN de una cepa virulenta con colonias lisas adquieren la cualidad de producir colonias lisas. La transformacin suele ocurrir tanto en bacterias Gram-positivas como en Gram-negativas, y es utilizada para introducir genes extraos en una bacteria (12). Un fragmento de ADN se puede insertar en un plsmido pequeo especializado conocido como vector de clonacin usando una enzima especfica. Este ADN recombinante se usa para transformar las bacterias que crecern luego en un medio selectivo apropiado para detectarlas. La capacidad de aislar ADN de un organismo e inducir su incorporacin en otro no relacionado constituye el fundamento de una de las manipulaciones del ADN recombinante (figura 26). El plsmido sirve as de vector para genes que no tienen equivalente en el organismo receptor y que, por lo tanto, no podran heredarse de forma estable mediante recombinacin homloga. Estos genes pueden as transmitirse a travs de generaciones sucesivas conforme el plsmido va replicndose (44). Pero a veces la bacteria pierde el plsmido espontneamente. La mayora de las especies de rizobios, bacterias de gran importancia agronmica, contienen plsmidos con la informacin gentica para la simbiosis en leguminosas (46).

1.7.3. Transduccin

Los genes bacterianos se pueden transferir de una cepa a otra usando bacterifagos como vectores (figura 19), pero este fenmeno no ocurre en todas las especies de bacterias. Segn el comportamiento del bacterifago la transduccin puede ser:

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a) general o inespecfica

Comnmente el bacterifago se replica dentro de la clula que infecta y con la ruptura de la misma se liberan las nuevas partculas vricas. Estas partculas infectan otras clulas completando el ciclo de lisis. Ocasionalmente durante el proceso ltico el genoma bacteriano se fragmenta y algunos segmentos pasan a formar parte del nuevo bacterifago. stos suelen carecer de parte de su propio genoma, pero aunque defectuosos son capaces de infectar nuevas bacterias y dejarles la porcin de ADN bacteriano que transportan. Este ADN suele recombinarse con el genoma de la clula infectada (figura 27). La porcin de genoma bacteriano transportada por bacterifagos es por lo general menor que 1% del ADN total. La mayora de las partculas vricas son normales y no participan en la transduccin (12). Los bacterifagos moderados tambin son capaces de formar una relacin estable con sus hospedadores. Luego de la infeccin suelen incorporarse al genoma bacteriano como profago. ste suele codificar otras funciones adems de las especficas del bacterifago, por ejemplo la produccin de toxinas. La bacterias que albergan profagos se llaman lisognicas (figura 20). Los profagos suelen vivir en armona con su hospedador hasta que una situacin de stress ambiental induce el ciclo ltico. Cuando el bacterifago se escinde del genoma bacteriano puede acarrear una porcin de este ltimo. Estos fagos defectuosos invaden nuevas bacterias. La integracin al genoma de la clula hospedadora es esencial para la trasferencia de los genes. Como cada profago tiene un particular lugar de insercin en el genoma de la bacteria, solamente los
b) especializada

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genes adyacentes pueden ser transferidos por este proceso (12 ). La transposicin es la recombinacin que presentan los transposones o las secuencias de insercin. Las secuencias de ADN cambian de lugar en el genoma y se insertan en una regin que no guarda homologa con ella. Si esta integracin sucede dentro de un gen se produce una mutacin, pues se rompe la continuidad de la informacin codificada (47).

1.7.4. Fusin de protoplastos


Las barreras naturales a la recombinacin entre organismos diferentes pueden romperse a menudo mediante la preparacin de protoplastos, clulas bacterianas cuyas paredes externas se han eliminado poniendo al descubierto la membrana celular. Como las membranas celulares poseen aproximadamente la misma composicin en la mayora de los organismos, puede inducirse la fusin de protoplastos de especies distintas, formando un clula hbrida en la que los genes quedan expuestos a la recombinacin (figura 28). Tambin es una tcnica eficaz para aumentar la frecuencia de recombinacin intraespecfica en los que el apareamiento natural es raro. La operacin se lleva a cabo en una solucin cuya presin osmtica equilibra la presin interior de las clulas, para que no estalle la membrana celular. Despus se induce la regeneracin de la pared de los protoplastos hbridos y se obtiene un cultivo normal (44).

Referencias
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2. Vida y muerte de los microorganismos


2.1. Crecimiento
Es el incremento ordenado de todos los componentes de la clula viva, arribando a la duplicacin de todas las estructuras, orgnulos y componentes celulares, as como la biognesis de mitocondrias y cromoplastos cuando ciertos microorganismos se ven sbitamente expuestos a las condiciones en que dichos orgnulos son esenciales. En la mayora de los organismos unicelulares, la reproduccin es consecuencia del crecimiento y lleva al incremento en el nmero de individuos de la poblacin, mientras que en los pluricelulares el crecimiento conduce al aumento del tamao del organismo (1). La figura 1 muestra una curva general del crecimiento de un microorganismo unicelular . Despus de la inoculacin d e una porcin de medio con unas pocas clulas, transcurre un perodo de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metablica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanz una velocidad constante de crecimiento se dice que est en la fase exponencial debido a que el nmero de clulas se puede expresar como funcin de 2n, donde n es el nmero de ciclos d e duplicacin experimentado por la poblacin (3). Una bacteria originar cuatro clulas (2 2 ) despus de dos ciclos, dieciseis (24 ) despus de cuatro ciclos, etc. Cada clula de bacteria o levadura da, por escisin o gemacin, dos clulas y el nmero inicial X o de clulas (en el instante to=0) se convierte, despus de n generaciones en un tiempo t, en X = X o. 2n Como n representa el nmero de divisiones celulares durante el intervalo de tiempo t, el tiempo de generacin g = t/n, y X = Xo.2t/g o sea ln X = ln X o + t.ln 2/g * El trmino ln 2/g es la velocidad especfica de crecimiento () de la poblacin o sea = 0,69/g y dX/dt = X En el curso de la fase exponencial la velocidad especfica de crecimiento alcanza su valor ms elevado (mx). La ecuacin * puede escribirse bajo la forma lnX

- lnX o = .t por lo tanto X = X o.et

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 En condiciones ideales el tiempo de generacin de las bacterias puede ser de 20 minutos, de esta forma una nica clula producir 2.097.152 bacterias al cabo de 7 horas. Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que permanece constante el nmero de clulas. Esta fase puede durar mucho tiempo, por ejemplo dcadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero siempre ser seguida, ms temprano o ms tarde, por la fase de muerte (3). En los estudios de la cintica del crecimiento individual de los microorganismos pluricelulares, tales como actinomicetos y mohos, se observ que: a) la velocidad de extensin de las hifas cortas es proporcional a la longitud de las mismas y a la velocidad especfica de crecimiento, es decir que estas hifas pueden crecer exponencialmente; b) cada pice hifal puede extenderse a una velocidad independiente de la velocidad de aumento de la biomasa; c) cuando la capacidad de la hifa para extenderse supera las posibilidades brindadas por los puntos de crecimiento existentes, se generan otros nuevos (ramificacin) (4).

2.2. Tipos de nutricin


Los organismos fotosintticos y los que obtienen energa por oxidacin de compuestos inorgnicos suelen usar generalmente CO2 como fuente nica o principal de carbono (auttrofos). Pero, la mayora de los microorganismos del laboratorio son heterotrficos, es decir necesitan fuentes de carbono orgnico y nitrgeno asimilables, as como sales minerales y en ciertos casos vitaminas. Pueden sintetizar todos sus constituyentes celulares a partir de un nico compuesto orgnico que sirve tanto de fuente de carbono y de energa, y de una fuente inorgnica u orgnica de nitrgeno (1). Metabolismo energtico de los microorganismos (1) tipo de organismos dependientes de fottrofos radiacin solar fotolittrofos= auttrofos dadores de electrones inorgnicos fotoorgantrofos dadores de electrones orgnicos quimitrofos compuestos qumicos quimiolittrofos= auttrofos oxidacin de compuestos inorgnicos quimioorgantrofos= hetertrofos oxidacin o fermentacin de compuestos . orgnicos Algunas bacterias, por ejemplo Azotobacter que vive libre en el suelo, y Rhizobium que crece como simbionte en los ndulos de la raz de leguminosas, as como cianobacterias, pueden fijar el nitrgeno gaseoso de la atmsfera, es decir reducirlo convirtindolo en nitrgeno orgnico. Por otra parte, las formas parsitas obligadas obtienen del hospedador los complejos constituyentes de su materia viva (5). En tanto que los sulfatos pueden ser utilizados por casi todas las bacterias y hongos, los nitratos son a menudo menos adecuados como nutrientes. Sin embargo, la mayora de los microorganismos hace uso del amonio como fuente nica o principal de nitrgeno. Sin embargo, algunas bacterias requieren fuentes de azufre reducido, tal como sulfuro o tiosulfato. Los organismos vivos necesitan tambin muchos otros elementos, como fsforo, potasio, magnesio, manganeso, calcio, hierro, cobalto, cobre, cinc y molibdeno (1)

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2.3. Factores de crecimiento


Son los compuestos, necesarios en pequea cantidad, que debe suministrar el medio para que tenga lugar el crecimiento de algunos microorganismos. Los organismos que requieren un determinado factor de crecimiento son auxotrficos para ese compuesto. Por ejemplo, Lactobacillus arabinosus crece normalmente en presencia de 10 -4 g/mL de biotina, pero no en ausencia de esta vitamina (6).

2.3.1. Factores orgnicos

Algunos microorganismos carecen de la capacidad de sintetizar ciertos aminocidos, nucletidos o vitaminas. stos son generalmente aportados por los extractos de levadura y carne, agregados al medio (3). A veces son adicionados en cantidades demasiado elevadas interfiriendo en el metabolismo microbiano, por ejemplo, las clulas de Corynebacterium glutamicum cultivadas en un medio rico en biotina no excretan cido glutmico, mientras que si son suspendidas en un medio pobre en biotina ocurre lo inverso. Generalmente los microorganismos requieren L-aminocidos, por ejemplo Leuconostoc mesenteroides , pero algunas bacterias necesitan D-alanina (6). Vitaminas del grupo B cido nicotnico (niacina) cido pantotnico riboflavina (B2 ) cido flico biotina cobalamina (B12 ) piridoxal- piridoxina (B6 ) tiamina (B1 ) Funcin (1) precursor de piridn-nucletidos (NAD y NADP) coenzima A flavn-nucletidos (FMN, FAD) participa en transferencia de grupos metilo biosntesis de cidos grasos, fijacin de CO2 sntesis de desoxirribosa y transferencia de restos monocarbonados transformaciones de aminocidos y cetocidos -descarboxilaciones

2.3.2. Factores minerales


La ausencia total de metales comporta la muerte o enfermedades carenciales en todos los seres vivos, pero todo es cuestin de dosis pues, el efecto es beneficioso hasta un cierto nivel, traspasado el cual se observan trastornos fisiolgicos. Algunos elementos esenciales, por ejemplo cinc, cobre, cobalto, hierro, molibdeno, son necesarios para la actividad de enzimas especficas (1). Adems, algunos seres vivos tienen requerimientos minerales especiales, como el silicio que es parte esencial de la pared celular de las diatomeas (7).

2. 4. Transporte de solutos
El transporte de nutrientes a travs de la membrana citoplasmtica es especfico porque son captados por la clula solamente aqullos para los cuales existe un sistema transportador. Existen dos tipos principales de transporte. El primario comprende los procesos que conducen a la transferencia de iones (H +, Na+, K +) produciendo alteraciones en el potencial electroqumico. Las fuerzas que intervienen son el transporte de electrones respiratorio o fotosinttico, o las bombas inicas dependientes del ATP o de la descarboxilacin de metabolitos. El transporte secundario est guiado por gradientes en el potencial electroqumico (9). La difusin pasiva o simple est gobernada por el tamao molecular y las propiedades lipoflicas del material, permitiendo la entrada de agua, toxinas no-polares y ciertos inhibidores. La difusin facilitada se lleva cabo debido a la presencia de una

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 permeasa especfica para el substrato y depende de la concentracin de substrato en el medio. El nutriente no puede ser acumulado dentro de la clula. El transporte activo y la trasladacin del grupo se parecen a la anterior en que participan protenas especficas y difieren en que necesitan la provisin de energa. El nutriente puede ser acumulado dentro de la clula. En el transporte activo la molcula liberada en el interior de la clula es idntica a la del exterior, mientras que en la trasladacin del grupo l a molcula fue modificada durante el transporte, por ejemplo por fosforilacin en el caso de un azcar (9). Se distinguen diferentes procesos de transporte activo segn la va por la cual se dispone de la energa necesaria: potencial protn, ATP o fosfoenolpiruvato. El transporte de muchas substancias (azcares, iones inorgnicos y orgnicos) es empujado por el potencial protn, La clula bacteriana mantiene dicho potencial por bombeo constante de protones y otros iones (Na+) al exterior, en el cual intervienen protenas de transporte localizadas en la membrana (9). Cada una de estas protenas tiene una funcin especfica. Por ejemplo, una protena cataliza el transporte simultneo de una molcula de azcar (lactosa, melibiosa o glucosa) y un protn en la misma direccin, lo que se conoce como un simporte de dos (a veces ms) substancias. Otras protenas catalizan el transporte simultneo de dos substancias en direcciones opuestas, por ejemplo un protn y otro in (Na+ o un cido orgnico), lo que se llama antiporte, como se muestra en la figura 2. En las clulas procariticas la entrada de azcares a la clula es favorecida por un simporte acoplado a H +, mientras que en las eucariticas est casi siempre acoplado a Na+. Adems de los sistemas de transporte que dependen del potencial de la bomba de protones hay otros que dependen del ATP, donde intervienen las protenas del espacio periplsmico en las proteobacterias (8) . Cuando el transporte ocurre mediante trasladacin de grupos, la molcula transportada es modificada qumicamente. Por ejemplo, la glucosa (manosa, fructosa u otro azcar) es captada por el sistema fosfotransferasa dependiente del fosfoenolpiruvato y se libera en el interior glucosa-6-fosfato (ver figura 2). En condiciones aerobias y a pH 7,0 la concentracin del Fe+++ es a lo sumo 10 -18 moles/L pues se forma el hidrxido frrico casi insoluble, por lo que algunas bacterias excretan substancias que tienden a solubilizar al hierro formando complejos con Fe+++ que permitan transportado. Tales substancias se denominan siderforos y son compuestos fenlicos e hidroxamatos (9). La levadura de cerveza posee distintos sistemas especficos para la captacin de cada in metlico (Cu++, Fe+++, Mn+, Zn++). En el caso del hierro primero es reducido a

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Fe++ por las reductasas de la membrana citoplasmtica, luego interviene un sistema de baja afinidad para su incorporacin a las clulas con hierro, pero cuando hay una deficiencia limitante del crecimiento acta otro sistema de captacin de alta afinidad. La levadura tambin tiene dos sistemas de captacin para la incorporacin de manganeso. Por otra parte, en algunas bacterias patgenas la virulencia depende de la capacidad del microorganismo para obtener iones metlicos del hospedador. El conocimiento de los genes que generan los sistemas de captacin de iones metlicos de los microorganismos permite obtener vegetales transgnicos que aprovechan mejor los nutrientes del suelo o secuestran metales txicos como, por ejemplo unas plantas donde se haba expresado un gen que les posibilit convertir el Hg++ en Hgo (11).

2.5. Factores ambientales


El suelo, o material de la superficie terrestre en el que se sustenta la vida vegetal, es uno de los sitios ms dinmicos en interacciones biolgicas de la naturaleza. Comprende organismos vivos, minerales disgregados, agua, aire y materia orgnica muerta. El agua y el aire representan aproximadamente la mitad del volumen del suelo
(12).

2.5.1. Agua y presin osmtica

La disponibilidad de agua en el ambien te se expresa indirectamente en trminos de

actividad del agua (aw), la que se define como la razn entre la presin de vapor de temperatura, es decir, aw = p/p o Este concepto se asocia al de humedad relativa de la atmsfera en equilibrio con el

agua del substrato o solucin (p ) y la presin de vapor del agua pura (po) a la misma

sistema, de la siguiente manera HRE = aw . 100 La mayor parte de las bacterias no crecen a una a w por debajo de 0,91 mientras que los mohos pueden desarrollarse con cifras de 0,80. Los valores ms bajos obtenidos para arqueobacterias halfilas son del orden de 0,75 mientras que los mohos xerfilos (amantes de la sequedad) y las levaduras osmfilas (que prefieren presiones osmticas elevadas) se multiplican muy lentamente an con valores de 0,65 y 0,60 respectivamente. Los lmites de a w dentro de los cuales hay crecimiento, son ms amplios a la temperatura ptima de multiplicacin. La capacidad de los organismos para crecer a una temperatura dada, disminuye a medida que se reduce a l aw . La presencia de ciertos elementos nutritivos ampla los lmites de aw dentro de los cuales los organismos pueden sobrevivir (3). La presin osmtica () est relacionada con la actividad del agua a travs una expresin

temperatura absoluta (T), el logaritmo natural de la actividad del agua (aw) y el volumen molar parcial del agua (v ) (3). El potencial agua de un suelo es la suma de los potenciales osmtico, matricial (o capilar) y gravitacional. La humedad relativa de la fase vapor en equilibrio con el suelo es tambin una medida indirecta del potencial agua.

= -RT.ln aw/v que comprende a la constante de los gases (R ), la

= -RT m /109 donde es la densidad del agua, los iones por molcula de soluto, m la molalidad, el coeficiente osmtico a la molalidad m y la temperatura TK. El potencial matricial () est dado por la ecuacin = (RT ln p/p o) /106 M donde M es el peso molecular del agua.
ecuacin

El potencial osmtico de la solucin del suelo ( ) puede expresarse mediante la

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 El trmino capacidad de campo se refiere al contenido en agua de un suelo, drenado despus de la saturacin, cuando la velocidad de la prdida de agua debida a la gravedad es pequea. No es una medida precisa (12). Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio, y estn protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presin osmtica interna (1). En contraposicin a la diversidad de concentraciones de potasio y sodio en los distintos ambientes, los organismos vivos contienen potasio a una concentracin ms elevada que la del medio externo. Adems de neutralizar las cargas negativas de la clula y de regular la funcin enzimtica, el potasio acta como un soluto implicado en la regulacin osmtica de algunos organismos Algunos organismos halfilos que viven en ambientes de alta salinidad sdica, por ejemplo Halobacterium, son la excepcin a esta regla (10). Los organismos que son capaces de crecer a elevadas concentraciones de azcar se denominan osmfilos. Basados en sus respuestas, o tolerancia, a la sequedad los microorganismos se pueden distribuir entre tres grupos definidos por el potencial agua () ptimo y mnimo para el crecimiento: grupo 1. ptimo 0.1 MPa, mnimo alrededor de 2MPa; contiene algunos hongos y una variedad de bacterias Gram-negativas; grupo 2. ptimo alrededor de 1 MPa, mnimo alrededor 5MPa; contiene principalmente zigomicetos, bacterias Gram-negativas y actinomicetos; grupo 3. ptimo alrededor de 1MPa, mnimo 10 a 15 MPa; contiene una variedad de ascomicetos y basidiomicetos y bacterias Gram -positivas (12).

2.5.2. Tensin superficial

La tensin superficial de los medios de cultivo afecta al desarrollo de un microorganismo. Por ejemplo BaciIIus subtilis tiende a crecer en la superficie a modo de pelcula o velo en los medios corrientes con una tensin superficial entre 57 y 63 dinas, pero si se disminuye a menos de 40 dinas por el agregado de un detergente crece en forma difusa (13). La humectabilidad es funcin de la tensin superficial. Las soluciones de detergentes pueden penetrar en grietas y espacios muy pequeos e incluso hasta el centro de los agregados de bacterias, donde el agua quedara por encima sin mostrar penetracin alguna.

2.5.3. pH

El pH del medio puede influir sobre la expresin de genes y regular el transporte de protones, la degradacin de los aminocidos, la adaptacin a condiciones acdicas o bsicas y an la virulencia. Las clulas perciben los cambios del pH ambiente a travs de diferentes mecanismos. La protonacn y desprotonacin de los aminocidos inducida por el pH, puede alterar la estructura protenica secundaria y por lo tanto la funcin que seala el cambio. La clula puede responder slo a una de las formas de las molculas de seal. Por ejemplo, los cidos orgnicos atraviesan la membrana citoplasmtica solamente en la forma protonada y un aumento de la concentracin intracelular indicara un incremento en la acidez ambiental. El gradiente de protones a travs de la membrana puede servir, por s mismo, como un sensor para ajustar los procesos dependientes de la energa (8). El pH intracelular puede ser mantenido sobre un valor crtico en el cual las protenas internas se desnaturalizan irreversiblemente. En Salmonella typhimurium hay tres mecanismos para mantener el pH interno compatible con la vida: la respuesta homeosttica, la respuesta de tolerancia al cido y la sntesis de protenas de shock acdico (14). A pH ambiental mayor que 6,0 las clulas bacterianas ajustan su pH interno a travs de la respuesta homeosttica modulando la actividad de las bombas de protones,

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antiportes y simportes, para aumentar la velocidad a la cual los protones son expelidos del citoplasma. El mecanismo homeosttico es constitutivo y funciona en presencia de inhibidores de la sntesis proteica. La respuesta de tolerancia al cido es iniciada por un pH externo de 5,5 a 6,0. Este mecanismo es sensible a los inhibidores de la sntesis proteica y puede mantener el pH interno por sobre 5,0 teniendo el pH externo valores tan bajos como 4,0. La prdida de la actividad ATPasa, causada por las mutaciones que desorganizan genes o los inhibidores metablicos, anula la respuesta de tolerancia al cido pero no el mecanismo homeosttico. Esta respuesta tambin puede conferir proteccin cruzada frente a otros agentes ambientales de estrs. La sntesis de protenas de shock acdico es la tercera va por la que la clula regula el pH interno. Esta sntesis es generada por un pH ambiental de 3,0 a 5,0 proveyendo un conjunto de protenas reguladoras distintas de las protenas de la respuesta de tolerancia al cido. Rango de pH para el crecimiento (2) lmite inferior ptimo 0,5 2,0-3,5 5,5 7,0-7,5 5,6 7,1 6,0 6,8 6,0 7,5-7,8 6,6 7,6-8,6 1,6 1,8 1,9 2,5 <2,8 2,8

Bacterias Thiobacillus thiooxidans Azotobacter sp. Erwinia carotovora Clorobium limicola Thermus aquaticus Nitrobacter spp. Hongos Aspergillus oryzae Fusarium oxysporum Penicillium italicum Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Aspergillus niger

lmite superior 6,0 8,5 9,3 7,0 9,5 10,0 9,3 11,1 9,3 8,5 7,4 8,8

Aunque para la mayora de las bacterias el pH ptimo para el crecimiento se encuentra entre 8,5 y 7,5; pocas especies son acidfilas (Thiobacillus), algunas son cidotolerantes (lactobacilos), pero muchas crecen en condiciones alcalinas (nitriificadores, rizobios, actinomicetos y bacterias ureolticas). Por su parte, los hongos prefieren valores bajos de pH, y predominan cuando se siembra una muestra de suelo en un medio de pH 5, pero no a pH 8 (15). Algunos organismos productores de cidos no son cido-tolerantes y si el medio no posee un regulador de pH se autoenvenenan, por ejemplo ciertas enterobacterias (2).

2.5.4. Oxgeno

El metabolismo de los microorganismos est fuertemente infludo por el oxgeno molecular. Los organismos que dependen de la respiracin aerbica, para los cuales el oxgeno es el aceptor final de electrones, se conocen como aerbicos estrictos. Un ejemplo de stos es la actinobacteria Streptomyces. Por el contrario para los organismos anaerbicos estrictos el oxgeno es generalmente txico. Las clulas somticas de las bacterias del gnero Clostridium son muy sensibles al oxgeno mientras que los endosporos estn protegidos de su efecto letal. Un grupo intermedio de organismos, los anaerbicos facultativos, pueden crecer en presencia o ausencia de oxgeno molecular, por ejemplo la levadura Saccharomyces cerevisiae que puede obtener su energa tanto de la fermentacin como de la respiracin. Por otro lado estn los organismos que nicamente toleran al oxgeno, como algunas bacterias lcticas que

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 obtienen su energa exclusivamente de la fermentacin sin ser daadas por el oxgeno. Ciertas bacterias aerbicas se cultivan mejor en ambientes donde la concentracin de oxgeno es reducida y se las denomina microaeroflicas (14).

2.5.5 Potencial de reduccin

El potencial de reduccin de un substrato es aquel en que dicho substrato gana electrones con mayor facilidad. Cuando pasan electrones de un compuesto a otro, se crea una diferencia de potencial entre ambos, la que se expresa en milivoltios (mV). Cuanto ms oxidada est una substancia ms positivo ser su potencial elctrico, y cuanto ms reducida el potencial ser ms negativo. El potencial de reduccin de un sistema se expresa con el smbolo Eo. Los microorganismos aerobios crecen en ambientes con valores E o positivos mientras que los anaerbicos necesitan para su desarrollo un medio con Eo negativo. Entre las substancias que ayudan a mantener condiciones reductoras en el medio de cultivo se encuentran los aminocidos con un grupo tiol ( -SH) y los azcares con un grupo aldehdo libre (15).

2.5.6. Temperatura
En muestras de agua recogidas en las proximidades inmediatas a las surgencias termales se han hallado hasta 108 - 109 clulas bacterianas por mL. Las bacterias adaptadas a elevadas presiones hidrostticas (250260 bares o sea 25-26 MPa) muestran adems una notable adaptacin a las altas temperaturas, por ejemplo unas bacterias metanognicas tenan tiempos de duplicacin entre 37 y 65 minutos a 100C bajo tales presiones (16). Temperaturas cardinales en C para microorganismos procariticos (17) grupo mnima ptima mxima termfilos 40-45 55-75 60-90 mesfilos 5-15 30-45 35-47 psicrotrofos -5-+5 25-30 30-35 psicrfilos -5-+5 12-15 15-20 Los valores de las temperaturas cardinales (mnima, ptima, mxima) varan ampliamente entre las bacterias como se muestra en el cuadro siguiente, pero algunas tienen una amplitud mayor, como por ejemplo Clostridium perfringens que crece entre 12 y 50C. Los organismos aislados de ambientes fros crecen a temperaturas por debajo de 0C si las altas concentraciones de solutos impiden la congelacin del medio (1). Temperaturas en C para el crecimiento de bacterias (1) especie mnima ptima mxima Listeria monocytogenes 1 30-37 Pseudomonas maltophila 4 35 Escherichia coli 10 37 Clostridium kluyveri 19 35 Bacillus flavothermus 30 60 Thermus aquaticus 40 70-72 Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 Pyrobacterium brockii 80 102-105

45 41 45 37 72 79 90 115

Los mohos psicrotrofos pertenecen a los gneros Cladosporium, Fusarium, Penicillium, Trichothecium y las levaduras a Candida, Cryptococcus, Torulopsis, Rhodotorula (18).

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Temperaturas cardinales de algunos hongos (18,19) temperatura C grupo mnima ptima Alternaria solani 2 27 Aspergillus fumigatus 12 35 Botrytis cinerea 0 20 Fusarium moniliforme <5 25 Rhizoctonia solani 2 25-30 Trichothecium roseum <10 30

mxima 45 55 30 35 35 35

La velocidad de crecimiento se ve afectada por los cambios de temperatura y en los rangos inferiores el tiempo de generacin puede sobrepasar las cien horas. Los microorganismos eucariticos, por ejemplo protozoos, son ms sensibles a las bajas temperaturas que los procariticos, y entre estos ltimos los gram negativos son ms afectados que los gram positivos (17).

2.6. Medios de cultivo

El medio sirve de reservorio para los nutrientes. El componente dominante es casi siempre el agua. Tambin en el caso en el que los microorganismos se hallen sobre un substrato slido, por ejemplo cereales o forrajes, ste debe estar hmedo para permitir la accin microbiana o enzimtica. Medios complejos para el enriquecimiento de bacterias hetertrofas (21) base : extracto de levadura 1%, KH 2PO4 0,1%, MgSO4 0,02% incubacin : 30C, en la obscuridad fuente condiciones agregado organismos suelo pH 7,0 - aerobiosis --oxidantes de aminocidos " pH 3,0 - anaerobiosis glucosa 2% Sarcina sp. suelo pasterizado pH 7,0 - aerobiosis --Bacillus spp. " pH 7,0 - anaerobiosis --Clostridium fermentadores de aminocidos " pH 8,0 - aerobiosis urea 5% Bacillus pasteurii " pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%, Clostridium fermentadores CaCO3 2% de azcares vegetales, leche, pH 6,5 - anaerobiosis glucosa 2% bacterias lcticas frutas, cerveza pH 6,0 - aerobiosis etanol 4% bacterias acticas suelo, agua pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%, bacterias coliformes residual CaCO3 2% queso suizo pH 7,0 - anaerobiosis lactato Na 2% bacterias propinicas Los microorganismos heterotrficos pueden utilizar azcares, alcoholes y aminocidos como fuente de energa. Algunos son capaces de emplear polisacridos, como almidn y celulosa, al tener la posibilidad de hidrolizar estos compuestos hasta azcares sencillos. Loa aminocidos y nucletidos suelen constituir la fuente primaria de nitrgeno y para obtenerlos, algunos organismos son capaces de degradar pptidos, protenas y polinucletidos. Tambin las grasas son utilizadas como fuente de energa, aunque slo un nmero relativamente pequeo de microorganismos las atacan (20). Adems del carbono, los nutrientes primordiales son nitrgeno y fsforo que se incorporan como amonio o nitrato, y fosfato. Otros nutrientes, tales como vitaminas e iones metlicos, se requieren en pequea cantidad (micronutrientes) y suelen estar, como contaminantes, en los componentes principales de los medios de cultivo e incluso

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 en los recipientes de vidrio que los contienen. Cuando el oxgeno es necesario para el metabolismo, la fuente usual de suministro es el aire filtrado (5). La mayora de los mohos, as como unas pocas bacterias y levaduras, cuando crecen sin alteraciones, forman una pelcula fuerte y contnua en la superficie del medio. En cambio, si crecen bajo el efecto de una agitacin vigorosa, originan bolitas de una pulpa fibrosa dispersadas por todo el medio fludo (20). Los requerimientos nutritivos de los mohos son muy parecidos a los de las levaduras, salvo que los mohos presentan ms diversidad en los tipos de substratos orgnicos que pueden asimilar (5). En el laboratorio un medio corriente es el extracto de malta, con o sin extracto de levadura y agar. Para el crecimiento de algunos mohos se utiliza un medio definido constitudo por sacarosa y sales minerales conocido como agar Czapek, a veces adicionado de extracto de levadura. Cuando se desea aislar hongos osmfilos se le agrega 20 a 50% de sacarosa (18). Un medio con cloruro de amonio y otras sales, sin ninguna fuente de carbono, cuando se incuba aerbicamente tendr disuelto CO2 atmosfrico y en presencia de luz permitir el crecimiento de algas y cianobacterias. Pero si se incuba en la obscuridad facilitar el desarrollo de bacterias que obtienen energa por oxidacin del amonio (20). Medios para el enriquecimiento de bacterias fotosntetizantes (21) base : NH 4 Cl 0,1%; K 2 HPO 4 0,1%; MgSO4 0,02%; FeSO4 0,005%; CaCl2 0,002%; MnCl2 0,0002%; NaMoO4 0,0001% incubacin : 25 - 30C, iluminacin constante, sin aire agregado pH organismos Na2S 0,2% + NaHCO3 0,5% 7,5 bacterias verdes del azufre Na2S 0,2% + NaHCO3 0,5% 8,0 - 8,5 bacterias purpreas del azufre Na malato 0,5% + ext de levadura 0,05% 7,0 - 7,5 bacterias purpreas no del azufre Medios sintticos para el enriquecimiento de bacterias autotrficas (21) base: K2 HPO4 0,1%; MgSO4 0,02%; FeSO4 0,005%; CaCl2 0,002%; MnCl2 0,0002%; NaMoO4 0,0001% incubacin: 25 - 30C, en la obscuridad agregado pH atmsfera organismos NH4 Cl 0,15% + CaCO3 0,5% 8,5 aire Nitrosomonas NaNO2 0,3% 8,5 aire Nitrobacter NH4 Cl 0,1% + Na2 S2 O3 0,7% 7,0 aire Thiobacillus NH4 NO3 0,3% + Na 2 S 2 O3 0,7% + NaHCO3 0,5% 7,0 sin aire T. denitrificans NH4 Cl 0,1% 7,0 H 2 85%, O2 10%, bacterias . CO2 5% del hidrgeno Sea cual fuere la composicin qumica del medio, es necesario que todos los componentes estn perfectamente mezclados, de modo que el microorganismo tenga acceso a todos los nutrientes. La mayora de las bacterias y algunas levaduras crecen comnmente como clulas individuales o como agregados de varias de ellas, y permanecen suspendidas en el medio. Cuando se trata de una poblacin densa o las clulas secretan polmeros, el medio fludo se vuelve viscoso y adems, pueden formar grandes agregados o crecer como una pelcula mucosa sobre la superficie.

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2. 7 Esterilizacin
2.7.1. Accin del calor
Con el fin de evitar el crecimiento de microorganismos extraos introducidos por la contaminacin, se esterilizan con vapor de agua a presin todos los materiales que integran el medio de cultivo. El vapor tambin se suele emplear para esterilizar recipientes y otras superficies con las que el medio est en contacto (20). Tiempo de destruccin de algunos endosporos bacterianos (2) calor hmedo minutos a organismo 100 105 110 bact. termfilas ... 400 100-300 Bacillus anthracis 2-15 5-10 ... B. subtilis horas ... Clostridium tetani 5-90 5-25 C. perfringens 5-45 5-27 10-15 C. botulinum 300-530 40-120 32-90 C.sporogenes 150 45 12 calor seco minutos a organismo 120 130 bacilos termfilos ... ... B. anthracis ... ... C. botulinum 120 60 C.pefringens 50 15-35 C. tetani 20-40 115 40-110 ... 40 4 10-40 ... 140 ... >180 15-60 5 5-15 120 11-35 ... 1 4-20 ... 150 180 60-120 25 30 125 4-8 ... ... ... 160 30-90 9-90 20-25 12 130 3,5 ... ... ... 170 15-60 10-15 5 1340 C 1 ... ... ... ... 1800 C 15 3 5-10 1

Los factores que afectan a la termodestruccin pertenecen a tres tipos generales: (a) factores intrnsecos, por ejemplo diferencias entre cepas y especies, entre endosporos y clulas somticas; (b) factores ambientales que ejercen su influencia durante el crecimiento y la formacin de las clulas o los endosporos, como edad, temperatura y medio de cultivo; (c) factores ambientales que actan durante el tratamiento trmico de las clulas o los endosporos, por ejemplo pH, aw , medio de suspensin, tipo de substrato, sales y otros compuestos org nicos o inorgnicos. Los endosporos bacterianos son muy resistentes a la temperatura, algunos pueden incluso sobrevivir tratamientos de varios minutos a 120C en ambiente hmedo. Cuando se utiliza el calor para destruir los microorganismos presentes en una pelcula lquida es posible utilizar tratamientos muy cortos, pero la esterilizacin de algunos slidos exige horas debido a las dificultades impuestas por la penetracin del calor (17). El autoclave es un aparato cuyo funcionamiento se basa en que la temperatura de ebullicin del agua aumenta con la presin. Por consiguiente si la presin absoluta del vapor en el recipiente cerrado se eleva a 2,02 kg/cm2 la temperatura subir hasta 1200 C. La presin absoluta es la suma de la presin atmosfrica y la presin manomtrica del autoclave. La temperatura de una mezcla de vapor y aire a determinada presin es inferior a la del vapor solo, por lo que debe evacuarse todo el aire de la cmara de esterilizacin (1). Otra precaucin importante es la de que el vapor se introduzca bien en los materiales sometidos a esterilizacin. El tiempo de funcionamiento depende de la naturaleza y volumen del material que se esteriliza, as como del tipo de envase.

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 El orden de la termodestruccin microbiana es logartmico, lo que permite desarrollar combinaciones de tiempo y temperatura que aseguren un efecto destructivo. La figura 3 muestra una recta tpica de supervivencia microbiana obtenida representando, en funcin del tiempo, el logaritmo del nmero de los supervivientes a la exposicin a una determinada temperatura. A partir de este grfico se puede determinar el tiempo de reduccin, decimal (D) que es el nmero de minutos precisos para destruir el 90% de una poblacin. La lnea recta se extiende tericamente hasta la zona de logaritmos negativos, por ejemplo log 10-3 = 1 clula por cada 1000 g (14). La muerte de los microbios por una fuente de calor, u otro agente letal, se expresan mediante la ecuacin cintica de primer

N = No .e-kt donde N es el nmero de clulas (UFC/g), No el nmero inicial de clulas, t el tiempo, k la constante de velocidad, luego 2,3 log(N/No) = - (k t) y entonces t = - [2,3 log(N/N o)] / k
orden El tiempo de reduccin decimal es la constante cintica usada con ms frecuencia en la industria de conservas vegetales e igual a D = 2,3 / k estando D y k definidos para una temperatura dada.

k y T est relacionada con la energa de activacin Ea mediante la ecuacin de Arrhenius k=s -Ea/RT donde s es la constante de frecuencia, R la constante de los gases ideales, T temperatura en grados
La interrelacin entre Kelvin.

D y T est dada por el valor z y est relacionado con E a por la ecuacin E a = [2,3 R. T 1. T 2 / z]. 9/ 5 siendo T 1 la temperatura de referencia y T2 la
La interrelacin entre del ensayo, en grados Kelvin (14).

2.7.2. Accin de las radiaciones


La irradiacin consiste en proyectar una cierta cantidad de energa sobre un cuerpo para expulsar los electrones perifricos fuera de los tomos y producir de esta manera iones. Estos ion es, as como los electrones expulsados, reaccionan a su vez con otros tomos. El resultado es la rotura de enlaces entre los tomos y las molculas que constituyen la substancia tratada. En las clulas, la radiacin afecta en primer lugar a los cidos nucleicos y las protenas, sin que se produzca un calentamiento apreciable. Algunas de las alteraciones que una radiacin ionizante puede producir en un cido nucleico son reparables por el microorganismo, por ejemplo la hidratacin de la citosina. Otras alteraciones son ms perjudiciales, como la formacin de puentes entre ambas cadenas del ADN impidiendo la duplicacin del mismo y por tanto de la bacteria. Se emplean tres formas de radiacin: los rayos gamma, los electrones acelerados y los rayos X. Los irradiadores de rayos gamma funcionan con cobalto 60, emitiendo estos rayos con gran poder de penetracin, de hasta varias decenas de centmetros, lo que permite tratar productos a granel. La irradiacin tambin inhibe la germinacin de las papas y las cebollas, prolongando el tiempo de almacenamiento, as como afecta a las larvas y huevos de insectos en los cereales.

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El gray es la cantidad de energa absorbida correspondiente a un joule por kg de substancia ionizada y reemplaza al rad (1 Gy = 100 rad) en el sistema internacional (22).

2.7.3. Accin de la luz ultravioleta


El rango de la radiacin UV que ms afecta a los microorganismos est entre 240 y 280 nm, y se utiliza para el tratamiento de superficies contaminadas pues tienen poco poder de penetracin. La radiacin germicida (254 nm) es absorbido por el material celular pero de manera ms significativa por los cidos nucleicos, a los que causa el mayor dao. Los endosporos bacterianos son 7 a 50 veces ms resistentes a la radiacin UV de 254 nm que las clulas vegetativas (23). El principal efecto de la luz UV es causar la formacin de dmeros, mediante enlaces transversales, entre pirimidinas adyacentes, especialmente residuos de timina del ADN. Estos residuos unidos por enlaces transversales, alteran el proceso normal de replicacin dando como resultado mutaciones. Muchas bacterias poseen un eficiente mecanismo de fotorreactivacin para reparar el dao causado por la radiacin UV cuando se exponen inmediatamente despus a la luz visible (2).

2.7.4. Accin de las microondas


Las microondas son una parte del espectro de ondas electromagnticas cuya banda se extiende desde los 500 megahertz hasta los 10 gigahertz, es decir incluye ondas cuyas frecuencias de oscilacin van desde los 500 millones a los 10.000 millones de ciclos por segundo, y se usan para generar calor interno en diversos productos (24). Las molculas de agua son dipolos elctricos y cuando se aplica un campo de microondas, se reorientan con cada cambio en la direccin del campo produciendo calor por la friccin intermolecular. Las caractersticas fsicas, trmicas, dielctricas del tejido biolgico, su masa y la frecuencia de la radiacin, causan un calentamiento diferencial de los distintos constituyentes. Esta falta de uniformidad trmica ha limitado el uso de las microondas para la inactivacin microbiana, pues el calentamiento heterogneo puede dejar puntos donde sobrevivan microorganismos, aunque tericamente estas clulas son calentadas especficamente dentro de la matriz del producto que las contiene. La frecuencia comnmente usada, por distintas razones, es 2,45 GHz y no parece ser la ms conveniente (23).

2.7.5. Accin del ultrasonido


Las ondas sonoras de alta frecuencia (ultrasonido) tambin se usan para desintegrar clulas microbianas y eliminar microorganismos de un equipo (2). Se ha usado para productos lquidos un proceso combinado de inactivacin microbiana que incluye calor (112C) y ultrasonido (20kHz) bajo una presin de 300 kPa (23).

2.7.6. Separacin por filtracin


Las preparaciones que contienen productos sensibles al calor se esterilizan mejor por filtracin. El material filtrante se prepara con un ster de celulosa u otros polmeros con poros de tamao preciso y uniforme. Es muy delgado, con un espesor de unos 150 m y por eso se le denomina membrana filtrante. Los filtros ms usados tienen un dimetro de poro de 0,2 m de 0,45 m. Para su uso se suele colocar la membrana preesterilizada sobre el disco que la soporta en la unidad de filtracin estril. Los filtros de aire de elevada eficiencia (HEPA) permiten suministrar aire libre de polvo y microorganismos a una cmara de siembra, y estn acoplados a un sistema de flujo laminar (2).

2. 8. Desinfeccin
Los desinfectantes son substancias qumicas que matan a las clulas somticas adheridas a las superficies inanimadas, pero no necesariamente a las formas

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 esporuladas. Los antispticos destruyen o inhiben el crecimiento y la actividad de los microorganismos que estn sobre los tejidos vivos (1). Se llama bactericida a la substancia que mata las clulas bacterianas y bacteriosttico a la que impide el crecimiento y multiplicacin de las mismas. Un agente antimicrobiano interfiere con el crecimiento y metabolismo de los microorganismos y cuando se refiere a grupos especficos se usan los trminos antibacteriano o antifngico (2). Varios factores influyen sobre la velocidad con que son inhibidos o destrudos los microorganismos. A medida que aumenta la concentracin del agente las clulas mueren ms rpido, por ejemplo 4,25 g de fenol/L requieren unas 10 horas para obtener el mismo resultado que una concentracin de 6,04 g/L en 1,5 horas. Un ligero aumento de la temperatura permite aumentar grandemente la efectividad de un desinfectante por ejemplo, para una solucin de fenol de 4,62 g/L, un incremento de 30 a 42C permite obtener el mismo resultado en un tiempo diez veces menor (2). Las especies de microorganismos difieren en la sensibilidad a los diversos agentes antimicrobianos. Los endosporos bacterianos son las clulas ms resistentes por su capacidad de sobrevivir a las condiciones qumicas adversas. La presencia de materia orgnica puede reducir significativamente la efectividad de un antimicrobiano, inactivndolo por combinacin con el mismo o protegiendo al microorganismo al dificultar el contacto con el desinfectante. Cuando estn en un ambiente con un pH cido los microorganismos son destrudos a temperatura ms baja y en menor tiempo que en un medio ligeramente alcalino (1). Los compuestos fenlicos pueden ser bactericidas o bacteriostticos segn la concentracin usada, pero algunos son fungicidas. La actividad es reducida por un pH alcalino o la presencia de materia orgnica. El alcohol etlico en concentraciones de 50 a 70% v/v es efectivo contra clulas somticas. Los productos que contienen 5 a 7% de hipoclorito de sodio se usan para higienizar diversos equipos, pero es muy afectado por la presencia de materia orgnica. Los detergentes disminuyen la tensin superficial y no son afectados por las aguas duras. Los agentes que al ionizarse tienen la propiedad detergente en el anin son conocidos como detergentes aninicos, por ejemplo el lauril sulfato sdico o los jabones. Producen la eliminacin mecnica de los microorganismos al atraparlos en la espuma. Los que tienen la propiedad detergente en el catin son llamados catinicos, por ejemplo los cloruros de amonio cuaternario. Son bactericidas frente a las grampositivas pero tienen poca accin contra las gramnegativas (2). El formaldehdo es un gas que se comercializa como una solucin acuosa (formol o formalina) que contiene entre 37 y 40 % de formaldehdo. Se emplea en soluciones del 3 al 8%. Tiene una alta actividad microbicida. Se lo suele usar para esterilizar ambientes cerrados bajo c ondiciones apropiadas pues los vapores son nocivos (2).

2. 9. Interacciones microbianas
2.9.1. Antibiosis
Un microorganismo puede producir metabolitos que hagan el ambiente desfavorable para el desarrollo de otros o que perturben su metabolismo hasta el punto de que mueran o sean incapaces de reproducirse. El fenmero recibe el nombre de antibiosis o antagonismo. Los antibiticos constituyen un grupo heterogneo de molculas orgnicas relativamente pequeas, producidas por unos microorganismos para inhibir a otros a una concentracin muy baja. La mayora de los microorganismos notoriamente productores de antibiticos se alojan en el suelo (8). Otro grupo se molculas antagonistas son las bacteriocinas. Constituyen un grupo relativamente heterogneo de pequeas protenas sintetizadas en los ribosomas

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microbianos. Actan sobre bacterias estrechamente relacionadas al agente productor pero no afectan a ste. Algunas bacteriocinas son: nisina producida por Lactococcus Iactis, subtilina por B. subtilis, colicinas por E. coIi, pediocina por Pediococcus acidilactici
(26).

Productos metablicos microbianos que actan como antibiticos (1, 25) antibacterianos producido por modo de accin aminoglucsidos estreptomicina Streptomyces griseus induce sntesis anormal de protenas neomicina Streptomyces fradiae cefalosporinas Acremonium cephalosporium inhiben sntesis de pared celular cloranfenicol Streptomyces venezuelae eritromicina Saccharopolyspora erythraea interfiere con sntesis de protenas lincomicina Streptomyces lincolnensis penicilinas Penicillium chrysogenum inhiben sntesis de pared celular polipptidos polimixinas BaciIIus polymyxa deterioro de membrana celular bacitracina BaciIIus subtilis inhibe formacin de pared celular rifamicinas Amycolatopsis mediterranei interfiere con sntesis de protenas tetraciclinas Streptomyces spp. vancomicina Arnycolatopsis orientalis viomicina Streptomyces griseus antifngicos anfotericina B Streptomyces nodosus interfiere con funcin de membrana griseofulvina PeniciIIium griseofulvum daa la membrana celular lipopptidos iturina A BaciIIus subtilis interfiere con funcin de membrana surfactina BaciIIus subtilis nistatina Streptomyces noursei daa la membrana celular

2.9.2. Mutualismo y simbiosis

Los microorganismos que habitan en un ecosistema presentan varios tipos de asociaciones e interacciones entre las especies. A veces se asocian diferentes especies bacterianas, o bien bacterias y otra clase de organismos, como levaduras, mohos, algas, protozoos e incluso plantas, u hongos con plantas como en el caso de las micorrizas. En muchos casos, el crecimiento y la reproduccin son ms vigorosos en asociaciones favorables de dos tipos de organismos que en cultivos de una sola especie (9). El mutualismo es la vida en comn de dos o ms organismos asociados en beneficio mutuo pero no implica necesariamente el contacto fsico. Simbiosis es una asociacin especfica entre dos tipos de organismos que estn en contacto fsico. Generalmente el de menor tamao (simbionte) vive dentro o est adherido a la superficie del mayor (hospedador). La simbiosis no siempre implica mutualismo. El hospedador es siempre un organismo eucaritico y puede mantener al simbionte (eubacteria, actinomiceto, hongo o alga) intracelular o albergarlo en el interior de cavidades u rganos (12). Por otra parte, la sintrofia es la accin cooperante de dos microorganismos con metabolismos complementarios (un tipo de mutualismo) alcanzando un efecto que no es logrado separadamente por ninguno de ellos (9). Un organismo puede ser incapaz de crecer en presencia de cierto substrato, pero si coincide con un microorganismo capaz de degradarlo y producir molculas tiles para el primero, se observa su crecimiento. Esta asociacin recibe el nombre de comensalismo o vida en comn de dos especies con beneficio para una de ellas y sin

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 dao ni provecho para la otra, por ejemplo cuando los microbios colonizan la superficie externa de una planta obteniendo energa de la metabolizacin de exudados producidos por el hospedador. Otro ejemplo es la influencia favorable de un microbio facultativo sobre el desarrollo de uno anaerobio, el primero reduce la tensin de oxgeno y crea un ambiente adecuado para que prospere el segundo (27). Las comunidades microbianas estn caracterizadas por siete diferentes mecanismos biolgicos: a) provisin de nutrientes especficos por los diferentes miembros de la comunidad, b) moderacin de la inhibicin del crecimiento, c) interacciones que causan la alteracin de los parmetros de crecimiento de las poblaciones individuales, produciendo un desempeo de la comunidad ms eficiente y/o competitivo, d) actividad metablica combinada no expresada por las poblaciones individuales aisladas, e) cometabolismo, f) reacciones de transferencia de hidrgeno, g) interaccin entre varias especies dominantes (28).
2.9.2.1. Fijacin simbitica del nitrgeno

Una particularidad de las plantas leguminosas es su capacidad para asociarse con bacterias fijadoras de nitrgeno pertenecientes a los gneros Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium. Esta simbiosis se traduce en el desarrollo del ndulo en cuyo interior las bacterias se multiplican y transforman el nitrgeno del aire en amonio (ver 3.10). La asimilacin de ese amonio por parte de las plantas les permite crecer en suelos pobres en nitrgeno. En la primera etapa, la planta secreta en su exudado radicular unos flavonoides que atraen a los rizobios por quimiotactismo y activan en la bacterias la expresin de ciertos genes que determinan la produccin, en los rizobios, de molculas fundamentales para el reconocimiento y la infeccin de la planta hospedadora induciendo la formacin de los ndulos. Las bacterias se adhieren a los pelos absorbentes de la raz e inducen la curvatura del extremo de los mismos (29). Los rizobios infectan la planta mediante un filamento de infeccin que avanza hacia la base del pelo y el interior de la raz, simultneamente las clulas de la corteza interna de la raz se dividen y forman el primordium nodular. La multiplicacin muy intensa de estas clulas provoca la aparicin del ndulo, que es un verdadero rgano especializado en el intercambio metablico entre ambos asociados. Algunas especies de bacterias fijadoras de nitrgeno en simbiosis (33) Gnero, especie, biovar Planta hospedadora Sinorhizobium meliloti alfalfa Rhizobium leguminosarum biovar trifolii trbol Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli poroto Rhizobium ciceri garbanzo Bradyrhizobium japonicum soja Azorhizobium caulinodans Sesbania (ndulos en el tallo)

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Las simbiosis entre rizobios y leguminosas son muy especficas, por ejemplo R. leguminosarum induce la nodulacin en el poroto pero no en la alfalfa (30). Las bacterias no se mezclan con los orgnulos citoplasmticos, sino que se mantienen confinadas en los simbiosomas que son vesculas protegidas por membranas. Los simbiosomas del lupino tienen una sola bacteria, los de la soja varias. La figura 4 muestra el corte de un ndulo. La membrana del simbiosoma acta a modo de barrera que controla el flujo de cidos carboxlicos (malato, succinato, fumarato). stos constituyen la fuente de carbono para los bacteroides. Tales cidos proceden de la oxidacin de azcares sintetizados en las hojas por la fotosntesis. Durante el proceso de formacin de los simbiosoma s, las bacterias se van transformando en bacteroides que expresan diversas protenas especficas como la enzima nitrogenasa y algunos citocromos. Las clulas intersticiales sin infectar intervienen en las ltimas etapas de la sntesis de ureidos, asparagina o glutamina, por incorporacin del nitrgeno fijado. stos se exportan hacia la parte area a travs de los vasos del xilema. Para que los ndulos de las leguminosas fijen nitrgeno es imprescindible que contengan leghemoglobina cuyo grupo hemo es sintetizado por el vegetal (32). La fijacin de nitrgeno requiere gran cantidad de energa que se produce en los bacteroides durante la oxidacin de los cidos dicarboxlicos y la leghemoglobina transporta el O2 a una concentracin baja pero estable que permite mantener una elevada actividad respiratoria sin afectar la nitrogenasa, pues esta enzima se inactiva en presencia de oxgeno (30). La rizsfera de algunas plantas contienen acumulaciones de bacterias fijadoras, tal como Azotobacter paspali sobre la superficie de la raz de Paspalum notatum y Azospirillum brasilense en la de caa de azcar. Las bacterias se hallan en el espacio intercelular del crtex radical, en una simbiosis donde se benefician los dos participantes de la asociacin. Por otra parte, el helecho de agua Azolla contiene a la cianobacteria Anabaena azollae en las cavidades de las hojas. Nostoc vive simbiticamente en el lquen Peltigera y sobre las races areas de Cycas y Gunnera (29). Varias dicotiledneas que no pertenecen a las leguminosas, tambin contiene ndulos en las races capaces de fijar N2 . En la mayora de los casos se trata de actinomicetos del gnero Frankia. En la figura 5 se esquematiza la forma en que los filamentos penetran a las clulas de la raz y produce ndulos donde tambin se encuentra una hemoglobina que facilita la provisin de O2 al endfito (32). Un inoculante para enriquecer el suelo con la bacteria simbitica deseada, contiene altas concentraciones celulares en un substrato que favorece largos perodos de supervivencia sin prdidas de las caractersticas fisiolgicas del microorganismo. Los pasos a seguir comprenden: a) seleccin de las cepas convenientes por su mayor eficiencia; b) cultivo del microorganismo en un medio lquido; c) eleccin, preparacin y esterilizacin del material de soporte; d) impregnacin del soporte con el cultivo lquido que posee un alto nmero de clulas, e) control del nmero de bacterias vivas en el producto terminado (34).

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 No todas la cepas infectivas en un hospedador particular son capaces de fijar nitrgeno, debido a la interrrelacin varietal y a la interaccin con los suelos y sistemas de produccin. La cepa seleccionada debe ser genticamente estable, tener una alta competencia frente a las cepas menos eficientes propias del suelo, crecer en los medios corrientemente utilizados en la industria y sobrevivir en el soporte a las condiciones de comercializacin. El empleo de turba estril como soporte, el almacenamiento refrigerado del producto y el control de calidad, permiten mantener altos niveles de rizobios vivos en la distribucin del inoculante. Esto se traduce en un incremento de rizobios por semilla. Se suele exigir 2*109 bacterias/g de inoculante a la salida de la fbrica, para as asegurar que el momento de aplicacin permanezcan vivos unos mil millones por gramo. Las condiciones de transporte, almacenamiento y uso determinan el xito de la inoculacin (34).
2.9.2.2. Micorrizas

Una de las funciones ms importantes de las micorrizas (asociaciones entre hongos y plantas) es absorber los elementos minerales menos mviles del suelo (fosfato, cobre, zinc) y transferirlos a la planta hospedadora, as como amonio. La planta proporciona azcares al hongo (36). Las ectomicorrizas se caracterizan por una modificacin de la raz, que pierde sus pelos absorbentes. El hongo rodea la raz con un manto de filamentos, del cual parte una red micelial externa que se extiende por el suelo y una red micelial interna que penetra la raz en el espacio intercelular. Los hongos implicados son macromicetos que solamente en simbiosis pueden formar basidiomas (por ejemplo Amanita, Boletus, Lactarius, Pisolithus, Suillus) o ascomas (como las trufas) (ver 7.3). En las endomicorrizas el micelio entra en la raz donde inicialmente es intercelular, luego penetra en las clulas y se ramifica formando los arbsculos que son ms o menos digeridos por el hospedador, y unas vesculas. Los hongos de las endomicorrizas son micromicetos (Glomus). En la figura 6 se observa un esquema de una endomicorriza y en la 7 de una ectomicorriza.
2.9.2.3. Biopelculas

Las biopelculas que se forman en el forraje ingerido por el ganado vacuno y otros rumiantes, estn inicialmente formadas por microorganismos que digieren la celulosa del m aterial vegetal y producen cidos grasos y otros metabolitos. Luego las clulas de otras especies invaden la pelcula y comienzan a usar

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esas sustancias para su propio metabolismo. As es como el forraje desaparece y es transformado en una masa bacteriana que el animal digiere ms tarde. Estas pelculas son imprescindibles para los rumiantes. Menos de la tercera parte de la biopelcula est constituda por microcolonias de bacterias, el resto es una sustancia blanda y pegajosa (matriz extracelular) secretada por ellas que absorbe agua, atrapa partculas pequeas y mantiene unidas a las microcolonias (figura 8). La pelcula biolgica est atravesada por diminutos conductos que baan a cada agrupacin bacteriana, aportando nutrientes disueltos y eliminando productos de desecho (37).

2.9.3. Predacin

Algunos microorganismos predadores se alimentan de las bacterias, como los protozoos, mixobacterias, acrasiomicetos y varios flagelados fotosintetizantes que no siempre estn clasificados como algas. Siempre que existen protozoos en estado trfico hay una poblacin bacteriana que le sirve de presa. Debido a que una sola clula de protozoo consume entre divisiones 10 3 a 10 4 bacterias, una comunidad con 103 protozoos por mL g est caracterizada por una predacin activa. Un suelo suele tener 109 bacterias/cm3, pero en solucin los protozoos reducen el nmero de clulas a 106 /cm3 Sin embargo, a pesar de su abundancia y actividad, los protozoos no suelen eliminar sus presas porque esto acarreara la desaparicin consecuente del predador. Con una baja densidad de presas el protozoo debe utilizar gran cantidad de energa para llegar a las pocas clulas que le sirven de alimento y puede morir cuando se acaben o bien enquistarse (27).

Referencias
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3. Actividad microbiana
3.1. Suelo
El medio donde se desarrollan los microrganismos telricos est dividido en una multitud de microambientes donde las condiciones pueden ser muy diferentes unas de otras, confirindole una microheterogeneidad inusual. El soporte orgnico y mineral no es inerte y los diversos procesos fsicos, qumicos y biolgicos que ocurren en el suelo estn ntimamente intrincados. La energa necesaria para el desarrollo de los microorganismos hetertrofos, que son la mayora de las micropoblaciones del suelo, proviene indirectamente de la fotosntesis. Hay tambin una microfauna que a veces interviene activamente al lado de la microbiota (1). El suelo est formado por cinco componentes principales: materia mineral, agua, aire, materia orgnica y seres vivos. La cantidad de estos constituyentes no es la misma en todos los suelos. El aire y el agua juntos representan aproximadamente la mitad del volumen del suelo. El agua que se mueve por la gravedad se encuentra en los poros ms grandes del suelo, que frecuentemente estn llenos de aire. Parte del agua es retenida por interacciones con otros constituyentes del suelo y slo una fraccin de sta es aprovechable por los organismos vivos. La aireacin y la humedad estn directamente relacionados ya que los poros que no contienen agua estn llenos de gas. La atmsfera subterrnea es diferente de la superficial porque contiene generalmente de diez a cien veces ms CO2, y menos O2, debido a la actividad biolgica (2). Un corte vertical del suelo revela un perfil definido por capas horizontales: O) una mantillo superficial, delgado o grueso, de restos orgnicos en descomposicin; A) un horizonte del cual han desaparecido algunos constituyentes inorgnicos durante el largo perodo de formacin del suelo pero ms o menos rico en materia orgnica, que contiene races, pequeos animales y la mayora de los microorganismos; B) otro horizonte en el cual se depositan algunos constituyentes provenientes de las capas superiores, que contiene poca materia orgnica, algunas races y escasos microorganismos; C) un estrato de composicin semejante al material original del cual se origin el suelo, donde hay pocas formas de vida (3). Distribucin de los microorganismos en un suelo expresado como miles por gramo (3) Profundidad Bacterias Bacterias Actinomicetos Hongos Algas cm aerobias anaerobias 3-8 7.800 1.950 2.080 119 25 20-25 1.800 379 245 50 5 35-40 472 98 49 14 0,5 65-75 10 1 5 6 0,1 135-145 1 0,4 ... 3 ... Los microorganismos no e stn distribudos regularmente en el suelo pues hay un mosaico discontnuo de microambientes, aqullos favorables para el desarrollo microbiano se caracterizan por su limitada extensin en el tiempo y en el espacio. La dispersin de los microorganismos, con excepcin de los fotosintetizantes, sigue la distribucin vertical de los nutrientes pero es alterada por varios factores: la

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 composicin de la atmsfera del suelo, el pH, la humedad, la cantidad de minerales asimilables, la presencia de substancias antimicrobianas (1). Tipos de bacterias del suelo (3) Gram-negativas Gram-positivas formadoras de endosporos Gram-positivas no formadoras de endosporos Actinomicetos Pleomrficas 19 24% 12 18 % 2 6% 11 25 % 36 46 %

La figura 1 muestra los principales tipos de distribucin de las bacterias en un suelo. En la curva ms frecuente, de tipo decreciente, la densidad microbiana que alcanz un mximo muy cerca de la superficie disminuye progresivamente con la profundidad. La reduccin en los primeros centmetros de suelo se debe a la luz solar y la desecacin. En la curva de tipo convexo, la densidad microbiana aumenta en un horizonte intermedio, por ejemplo en el caso de ciertos suelos forestales donde el mantillo aporta substancias inhibidoras de Azotobacter y otras bacterias que no son biodegradadas rpidamente en el horizonte superior. La curva de tipo cncavo muestra que la densidad microbiana en el horizonte intermedio es menor que en la superficie y la profundidad, esto ocurre cuando se acumulan compuestos inhibitorios, vegetales o producidos por microorganismos, mientras que la estimulacin de la profundidad suele deberse a un aumento del pH por la proximidad del material calcreo de base (1). La distribucin microbiana horizontal est ligada a la macroheterogeneidad del suelo y puede ser debida a la induccin de la vegetacin que modifica el ambiente superficial a la vez que por el efecto de las races. La figura 2 muestra la heterogeneidad del pH debida a la acidificacin por el mantillo de Pinus . Las interacciones entre los vegetales y los microorganismos del suelo se manifiesta de modo especial en zona que est en contacto con las races o rizsfera. La microbiota es modificada por la estimulacin, en algunos casos inhibicin, debida a los exudados radicales y los restos tisulares. No solamente la intensidad del efecto rizosfrico sino tambin la intensidad de la colonizacin del rizoplano, vara en las diferentes partes de un mismo sistema radical (2). Cada especie o variedad de planta induce un efecto rizosfrico caracterstico., pero cuando las races envejecen desaparece progresivamente este efecto dando lugar a la proliferacin de los microorganismos que

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 intervienen en la descomposicin de los tejidos vegetales muertos (2). Efecto rizosfrico del trigo sobre varios grupos microbianos (1) Densidad fuera de Densidad en la rizsfera (S) * la rizsfera (R)* Bacterias totales 52.700.000 1.121.000.000 Hongos 120.000 1.160.000 Protozoos 990 2.400 Algas y cianobacterias 26.900 4.500 Bacterias nitrificantes 100.000 100.000 Bacterias esporuladas 575.000 927.000 Bacterias celulolticas aerobias 2.700 720.000 Bacterias celulolticas anaerobias 120.000 409.000 Otras bacterias anaerobias 33.000 389.000 Bacterias amonificantes 1.800.000 >100.000.000 Bacterias desnitrifiantes 140.000 12.650.000 * unidades formadoras de colonias (o nmero de individuos) por gramo de suelo Grupo

R/S 21,3 9,7 2,4 0,17 1,0 1,6 267 3,4 11,8 > 50 90,4

Los factores ecolgicos fsicos (humedad, temperatura, luz) actan directamente sobre la microbiota rizosfrica o indirectamente por intermedio de la planta modificando la calidad y cantidad de los exudados radicales. La elevacin de la humedad del suelo por sobre un cierto nivel puede modificar considerablemente el equilibrio microbiano (2). Variacin de la poblacin fngica, en miles por gramo, a diferentes niveles de humedad (3) Humedad promedio Total Hifas Esporas Esporas como del suelo % % del total 8,9 99 60 39 39,4 11,2 89 57 32 36,0 18,5 142 113 29 20,5 24,2 149 133 16 10,7 27,1 173 153 20 11,5

Influencia del anegamiento sobre la densidad, en miles por gramo, de diferentes grupos microbianos en la risfera de maz cultivado en un suelo salino (1) Suelo a la capacidad de campo Suelo anegado Grupos Densidad en Densidad R/S Densidad en Densidad R/S microbianos la rizsfera fuera de la la rizsfera fuera de la (R) rizsfera (S) (R) rizsfera Sulfatoreductores 44 17 2,6 550 11 50 Azotobacter 0,8 0,8 1,0 6 1 6 Amonificantes 4.200 15 280 22.000 4.500 5 La temperatura acta directamente sobre los microorganismos del suelo no rizosfrico como se observa en el cuadro siguiente, pero tambin indirectamente controlando los exudados radicales correspondientes a las temperaturas ptimas de crecimiento de las plantas consideradas, 30-32C para soja y 13-16C para trigo (1).

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Influencia de la temperatura sobre la densidad microbiana, en millones por gramo, en la rizsfera y el rizoplano de trigo y soja (1) C Suelo no Rizosfera R/S Rizoplano Rizsfera R/S Rizoplano rizosfrico de trigo trigo de trigo de soja soja de soja 30-32 167 266 1,6 147 3.570 21,4 138 21-24 120 710 5,9 150 230 1,9 62 13-16 78 1.165 14,9 308 186 2,4 28

3.2. Metabolismo
La energa requerida para el mantenimiento de la vida y para la sntesis de los componentes celulares es obtenida por la transformacin ordenada de las substancias que ingresaron a la clula. stas son modificadas por una serie de reacciones enzimticas sucesivas, a travs de rutas metablicas especficas. Las vas metablicas tienen las funciones de proveer los precursores para los componentes celulares y obtener energa para los procesos de sntesis y otros que requieran energa. Primero, los nutrientes son rotos en pequeos fragmentos durante el catabolismo y luego convertidos por las reacciones del metabolismo intermediario en cidos orgnicos y steres de fosfato. La mayora de los compuestos de bajo peso molecular que representan las unidades para sintetizar la clula, son aminocidos, bases pricas y pirimidnicas, fosfatos de azcares, cidos orgnicos y otros metabolitos, algunos producidos al final de largas cadenas de reacciones. Estas substancias sirven para la sntesis de las macromolculas (cidos nucleicos, protenas, materiales de reserva, constituyentes de la pared celular) durante el anabolismo (6). La figura 3 representa las vas metablicas de organismos que respiran aerbicamente.

3.3. Degradacin de biopolmeros


Los carbohidratos son los productos predominantes de la fotosntesis vegetal y son, tambin, los principales nutrientes de la mayora de los microorganismos en los ambientes naturales. Las macromolculas son comnmente degradadas fuera de las clulas a unidades mono o dimricas por la accin de exoenzimas y esos productos son absorbidos por las mismas.

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La mayor parte de la biomasa es descompuesta aerbicamente por pro y eucariotas, predominando estos ltimos en la red de alimentacin. Tambin participan en esta red los invertebrados tales como gusanos, moluscos, insectos y sus larvas. Por otra parte, los microorganismos siempre participan en la digestin de los nutrientes en el tracto intestinal de los animales, e inclusive en la degradacin de substancias fibrosas, tales como lignocelulosa y celulosa que constituyen ms de la mitad de la biomasa vegetal. Esta actividad ocurre bajo condiciones anaerbicas. Otros ecosistemas anxicos son los sedimentos de aguas estancadas, los campos de arroz, las cinagas, los suelos inundados, los depsitos de deshechos y los silos (5). Los carbohidratos constituyen el 5 a 25% de la materia orgnica del suelo. Los restos vegetales contribuyen en forma de azcares simples, hemicelulosas y celulosa, los que son descompuestos en distinto grado por bacterias, actinomicetos y hongos. Estos organismos a su vez sintetizan sus polisacridos y otros carbohidratos que constituyen la mayor parte de los glcidos hallados en el suelo (5). Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en el interior de las clulas y constituyen ms del 50% de su peso seco. Los polinucletidos forman parte del ncleo celular y del citoplasma. Los diversos lpidos estn en las membranas citoplasmticas, las paredes celulares y los materiales de reserva de vegetales y microorganismos. Los polmeros son degradados mediante enzimas extracelulares que producen mono y oligmeros convenientes para la nutricin microbiana (6). Los xenobiticos son substancias sintetizadas qumicamente que no se encuentran en la naturaleza. Muchos son agregados voluntariamente al suelo. Entre los

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 polmeros xenobiticos se encuentran polietileno y polipropileno que son prcticamente no-degradables. La composicin de la biomasa del suelo aproximadamente est representada por la figura 4. La figura 5 muestra el curso de la descomposicin de la materia orgnica en el suelo.

3.3.1. Degradacin de la celulosa


La celulosa es el componente bsico de los vegetales y consta de unidades de -Dglucopiranosa reunidas por enlaces 1,4-glicosdicos. La molcula de celulosa tiene regiones cristalinas alternadas con zonas amorfas. La insolubilidad de la celulosa y su alta resistencia mecnica se debe a la presencia de puentes hidrgeno inter e intramoleculares y a fuerzas de Van der Waals (4). Los aportes de celulosa al suelo varan mucho con la regin, el clima y los cultivos (3). La celulolisis es catalizada por un sistema constitudo por tres enzimas: endo- -1,4-glucanasa que ataca los enlaces -1,4 en las regiones amorfas internas de la macromolcula dando largos fragmentos solubles (oligosacridos), exo--1,4-glucanasa que separa el disacrido celobiosa desde los extremos de la molcula, -glucosidasa que hidroliza la celobiosa con formacin de glucosa (8). La hidrlisis de la celulosa intacta se cumple mejor cuando estas tres enzimas operan al unsono, como ocurre en el celulosoma de Clostridium thermocellum que se encuentra entre la clula y el substrato al cual hidroliza. El celulosoma est constitudo por nueve sitios polipeptdicos de adhesin a la molcula de celulosa, unidos a segmentos duplicados que a su vez se unen a otro polipptido sobresaliente de la capa S en la pared celular (7). En los suelos bien aireados la celulosa es degradada y utilizada por varios microorganismos aerobios (hongos, mixobacterias y otras eubacterias). En el rumen, bajo condiciones anaerbicas, la celulosa es atacada por bacterias y unos pocos hongos anaerbicos del grupo Chytridiomycetes (4). Los hongos tienen ms xito que las bacterias durante la celulolisis en los suelos cidos o en la madera (lignocelulosa). Excretan celulasas que pueden ser aisladas del medio de cultivo as como del micelio. Las bacterias deslizantes y las mixobacterias no excretan celulasas al medio, pero se adhieren a las fibras de celulosa para digerirlas. En los ambientes anaerbicos la celulosa es degradada por eubacterias meso y termoflicas, por ejemplo Clostridium thermocellum. Esta bacteria crece en un medio mineral con celulosa pero no con glucosa. La digestin de la celulosa por diversas bacterias est acompaada de la secrecin de una substancia carotenoide amarilla que sirve como indicador de la hidrlisis. En el rumen, el 90% de la celulosa es metabolizada, siendo el sistema natural ms eficiente (4). En la figura 6 se muestra un esquema de la celulosa y las microfibrillas.

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Los principales factores ambientales que afectan la descomposicin de la celulosa en el suelo son el nivel de nitrgeno disponible, la temperatura, la aireacin, la humedad, el pH, la presencia de otros glcidos y la proporcin de lignina en los restos vegetales (3). Algunos microorganismos que digieren celulosa (4, 7) Organismos eucariticos Quitridiomicetos Hongos mitospricos Ascomicetos Basidiomicetos Neocallimastix Aspergillus Chaetomium Coprinus Orpinomyces Botrytis Fomes Piromonas Fusarium Pleurotus Sphaeromonas Humicola Polyporus Myrothecium Trametes Trichoderma Rhizoctonia Organismos procariticos Mixobacterias Bacterias Bacterias Bacterias Actinomicetos deslizantes aerobias anaerobias Archangium Cytophaga Cellulomonas Bacteroides Micromonospora Polyangium Sporocytophaga Pseudomonas Butyrivibrio Streptomyces Sorangium Clostridium Streptosporangium Eubacterium . Ruminococcus En suelos con pH 6,5 - 7,5 se encuentra Cellulomonas, a pH 5,7 - 6,2 an desarrolla Cytophaga y si la acidez desciende predominan los hongos. Se pueden encontrar bacterias celulolticas anaerobias tambin en suelos cidos con pH 4,3. Las mixobacterias son las ms sensibles a la acidez por lo que se las encuentra en el mantillo de huertos, en suelos abonados y en los ricos en calcio. Los actinomicetos se hallan en suelos muy diversos, entre pH 4,6 y 9,5. Al tratar el suelo con cal cambia la composicin de la microbiota activa (3). La celulolisis puede producirse en un amplio rango de temperatura, de 5 a 65C. Entre los microorganismos termfilos se encuentran Clostridium, Streptomyces, Chaetomium, Humicola, presentes en el estircol y los vegetales en descomposicin. Los microorganismos celulolticos del suelo son principalmente mesfilos. Una humedad por debajo del 50 al 60% de la capacidad de camp o favorece a las formas filamentosas. En un suelo anegado la degradacin se debe a las bacterias anaerobias. Los actinomicetos persisten a un 20% de la capacidad de campo. La influencia de la salinidad suele encontrarse en la naturaleza enmascarada por los otros factores. En el horizonte A de los suelos halomorfos hay mayor diversidad de organismos, mientras que en el B por la acumulacinlas sales se hallan solamente hongos halotolerantes (1). Las substancias con las que est asociada la celulosa en los desechos vegetales influyen sobre la velocidad de la descomposin. La degradacin de 30 g de celulosa, de los cuales 20 a 30% sirven para la sntesis microbiana, exigen la provisin de 1 g de nitrgeno. Cuando la presencia de lignina hace ms lenta la celulolisis se requiere menos cantidad de nitrgeno, porque ste es poco a poco reciclado. Para los hongos que hidrolizan lignina y celulosa la relacin C/N es mayor que 300. Los nitratos favorecen la actividad de las bacterias mientras que el amonio y los aminocidos son mejor utilizados por las mixobacterias y los hongos. Azotobacter y otros organismos que fijan nitrgeno atmosfrico junto a las bacterias solubilizadoras de fosfatos, favorecen la celulolisis (1). La aplicacin de nitratos, amonio, urea y estircol elevan la velocidad de la descomposicin (3). El clculo del nitrgeno necesario durante la degradacin de 100 kg de material vegetal supuestamente libre del mismo, parte de considerar que solamente el 80% se

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 puede descomponer con facilidad y la mitad es carbono. Entonces se tiene 40 kg de C para transformar, de los cuales 2/3 se convertirn en CO2 y 1/3 (13 kg) sern incorporados a las clulas microbianas involucradas en el proceso. Estas clulas vivas contienen aproximadamente 1 parte de N por cada 10 partes de C y como el 50% del material celular es C, entonces el 5% es N. Por lo tanto los 13 kg de C producirn 26 kg de biomasa microbiana si hay disponible 1,3 kg de N, durante la descomposicin de los 100 kg de material vegetal (3). Pero debido a la formacin de complejos tanino-protenas en ciertos mantillos (lo que inactiva a las exoenzimas) y a que las substancias hmicas son fuentes de N (aunque mediocres), la relacin C/N en los restos vegetales no es suficiente para determinar la velocidad de la degradacin (1).

3.3.2. Degradacin de almidn

El almidn es el material de reserva que predomina en las plantas y comnmente se presenta en grnulos con una tpica estructura en capas. Est compuesto de dos glucanos: amilosa y amilopectina. La amilosa es soluble en agua caliente y se tie de azul con una solucin acuosa de yodo. Consiste de una cadena helicoidal no ramificada de unas 200 - 500 unidades de D -glucosa con enlaces 1,4--glicosdicos. La amilopectina se hincha en agua caliente dando una pasta y toma un color pardo violceo con yodo. Es tambin un polmero 1,4- -D-glucosa que, como el glicgeno, est ramificado por enlaces 1,6--glucosdicos aproximadamente cada 25 unidades de glucosa (8). Los almidones de distinto origen difieren mucho en su ramificacin, el nmero de unidades por cadena y los residuos fosfato e iones calcio y magnesio que los acompaan. Hay tres tipos de descomposicin enzimtica de los glucanos: fosforlisis, hidrlisis y transglicosilacin. La fosforlisis por la -1,4-glucanfosforilasa slo ocurre intracelularmente. La transglicosilacin es la formacin de ciclodextrinas con 6 -8 unidades de glucosa a partir del almidn, por accin de Bacillus macerans y otros (4). El ataque extracelular del almidn es debido a la accin hidroltica de las amilasas, segn se observa en el esquema de la figura 7. La -amilasa ataca los enlaces 1,4--glicosdicos an en el centro de la cadena, por lo que se la conoce como endoamilasa, produciendo glucosa, maltosa y oligmeros de 3 a 7 unidades. Est presente en plantas, animales y microorganismos. La viscosidad de la solucin de almidn y el color de su reaccin con yodo se reducen rpidamente

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durante la hidrlisis. Producen amilasas muchos hongos del suelo as como bacterias de los gneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces entre otras. La -amilasa, presente en plantas y bacterias, tambin degrada los enlaces 1,4-glucosdicos pero comienza su accin por el extremo libre no reductor del almidn, liberando maltosa mientras contina el color frente al yodo. La hidrlisis se detiene en los puntos de ramificacin de la amilopectina y el residuo se conoce como dextrina lmite (6). La pululanasa o isoamilasa hidroliza los enlaces 1,6--glicosdicos quitando las ramas de la amilopectina o las dextrinas. La maltasa hidroliza la maltosa a glucosa (3). Si estas enzimas acompaan a las anteriores se logra una degradacin total del almidn. Las amilasas son inducibles, pero su produccin depende del tipo de almidn empleado. Las -amilasas de Bacillus stearothermophilus y B. licheniformis son termo estables as como las excretadas por algunos clostridios termfilos, los que tambin excretan pululanasas (4). La actividad amiloltica vara a veces con el tipo de vegetacin, la humedad y las caractersticas del suelo. El almidn es degradado por clostridios fijadores de nitrgeno en los suelos anegados, a los que recientemente se incorpor material vegetal rico en polisacridos (3).

3.3.3. Degradacin de levanos

Los levanos (polifructosanos) son substancias de reserva producidas por algunas plantas, por ejemplo la inulina de los tubrculos de dalia con enlaces -2,1 glicosdicos (figura 8), pero otros levanos tienen uniones -2,6 glicosdicas. Los levanos constituyen el 12-15% del peso seco de algunas pasturas y son degradados por numerosas bacterias, actinomicetos y hongos (4). La inulinasa produce unidades de levulosa (fructosa). Algunos Streptomyces tienen tambin 2,6fructosanasa que forma levanobiosa (fructobiosa) y ciertos hongos una 2,1-fructosanasa que origina oligmeros (3).

3.3.4. Degradacin de xilanos y otras hemicelulosas


Las hemicelulosas consisten en polmeros de pentosas (xilosa, arabinosa), hexosas (glucosa, manosa, galactosa) o cidos urnicos (glucurnico, galacturnico). Son substancias de soporte o de almacenamiento en las plantas (4). La figura 9 representa las hemicelulosas en la pared vegetal. El xilano es el polisacrido ms abundante despus de la celulosa. La corteza de los rboles y la paja contienen hasta 30% de xilano, la madera de conferas 7 - 12% y la de rboles de hojas caducas 20 - 25%. La cadena consta de 30 - 100 unidades de -D-xilopiranosa con enlaces 1,4 -glicosdicos.

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 Algunos xilanos tambin presentan arabinosa, glucosa, galactosa y glucuronato en ramas laterales unidas al C3 de la xilosa. El xilano es degradado ms rpidamente que la celulosa. La xilanasa que es constitutiva en algunos clostridios e inducible en otros organismos, produce xilosa, xilobiosa y oligmeros de 2 a 6 unidades. Muchos organismos excretan xilanasas, en los suelos neutros o alcalinos predominan Bacillus, Sporocytophaga, Clostridium y otras bacterias pero en los cidos, los hongos (4). La temperatura ptima para la descomposicin es 37C, y para los actinomicetos termfilos entre 45 y 50C. Los mananos constituyen el 11% del peso seco de la madera de algunas conferas. Son hidrolizados por muchos organismos que tambin actan sobre galactomananos y glucomananos. Los galactanos son degradados ms lentamente que otras hemicelulosas y tienen enlaces -1,4 y -1,3 glicosdicos. Las galactanasas microbianas producen galactosa, galactobiosa y galactotriosa. Algunos organismos producen varias enzimas simultneamente, como Fusarium oxysporum que creciendo en tomate sintetiza arabanasa, xilanasa, galactanasa y glucanasa. Las enzimas extracelulares pueden ser adsorbidas por las arcillas, disminuyendo su actividad (3). La degradacin de las hemicelulosas est determinada la disponibilidad de nitrgeno como ocurre con la descomposicin de la celulosa. Las hemicelulosas de plantas maduras son degradadas ms lentamente que las del tejido ms joven. Por otra parte, al mismo tiempo que se degradan los polmeros vegetales, los microorganismos sintetizan otros polisacridos como los glucanos y pentosanos de los mohos, los mananos de las levaduras, los glucanos y levanos de las cpsulas bacterianas (1).

3.3.5. Degradacin de pectinas

Las pectinas son substancias intercelulares de los tejidos de plantas jvenes y abundantes en las frutas. Estn constitudas por cadenas no ramificadas de cido Dgalacturnico con enlaces 1,4- -glicosdicos, parcial o completamente esterificadas con metanol (4), como se presenta en la figura 10. En las pectinas insolubles (protopectina) las cadenas estn entrecruzadas por cationes Ca ++ y Mg++ unidos a los grupos carboxilos (3).

La degradacin microbiolgica de las pectinas es llevada a cabo por esterasas y despolimerasas. La pectinesterasa hidroliza los steres y libera metanol. La poligalacturonasa hidroliza las uniones glucosdicas de los cidos poligalacturnicos residuales (coloidales o solubles), produciendo monmeros y oligmeros del cido Dgalacturnico. La polimetilgalacturonasa hidroliza los enlaces glucosdicos de las pectinas (1). Las enzimas que fragmentan las cadenas por transferencia de protones generando desoxicidos (transeliminacin) se denominan pectinliasa o pectatoliasa segn acten sobre pectinas o cidos pcticos. Alrededor del 1-10% de los microorganismos del suelo hidrolizan las pectinas, estimulados por el substrato (3). La fitopatogenicidad de algunos microorganismos (Erwinia, Botrytis, Fusarium) es debidad a la capacidad de excretar "pectinasas". Los microorganismos que descomponen pectinas intervienen en el enriado de lino y camo, liberando los haces de fibras de celulosa del tejido vegetal. Los hongos intervienen en el proceso aerobio mientras en el anaerobio intervienen bacterias butricas como Clostridium pectinovorum (4). Las

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bacterias anaerbicas pectinolticas son ms abundantes en los suelos anegados y en los abonados con estircol (1).

3.3.6.Degradacin de quitina
La quitina le sigue a la celulosa en abundancia. Forma parte del exoesqueleto de artrpodos y de la pared celular de hongos filamen -tosos. Est constituda por unidades de Nacetil-glucosamina con enlaces -1,4-glicosdicos (6). La degradacin por la quitinasa produce poca N-acetilglucosamina y predominan los oligmeros (quitobiosa, quitotriosa). Los oligmeros son convertidos en monmero por la -N-acetil-glucosaminidasa. La quitin-desacetilasa transforma la quitina en quitosano y acetato por hidrlisis de los grupos acetamida (10). Un gran nmero de bacterias y actinomicetos pueden hidrolizar quitina. Entre los hongos con tal propiedad se encuentran Mucor y algunos Aspergillus (4). La sntesis de quitinasas es inducida en las plantas por los agentes patgenos. La figura 11 muestra fibrillas de quitina obtenidas de la pared fngica.

3.3.7. Degradacin de lignina

El contenido en lignina del tejido leoso vara entre 18 y 30% del peso seco. Est ubicada en la lmina secundaria de las paredes celulares y es el componente de las plantas degradado ms lentamente. No es qumicamente uniforme y tiene una estructura muy compleja (3). Los monmeros son todos derivados del fenilpropano, principalmente alcohol coniferilo. La complejidad resulta del gran nmero de diferentes enlaces que unen a los monmeros. Las diferencias en la composicin de la ligninas se manifiestan en el contenido de grupos metoxi: 21% en rboles de hojas

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 caducas, 16% en abeto, 14% en gram neas (4). Las unidades fenilpropano estn entrecruzadas por mltiples enlaces ter y C-C, que son extremadamente resistentes al ataque enzimtico. La lignina es un producto final inerte del metabolismo vegetal y solamente es degradada por microorganismos (1). Dos grupos de hongos se distinguen entre los destructores de madera: los que causan la podredumbre parda que degradan celulosa y hemicelulosas dejando la lignina como residuo. y los que provocan la podredumbre blanca que degradan lignina. Entre estos ltimos se encuentran Stereum, Phanerochaete, Pleurotus, Ganoderma, Polyporus, Xylaria (3). La degradacin de lignina ocurre en presencia de oxgeno y glucosa. El sistema enzimtico contiene peroxidasas que catalizan la ruptura oxidativa de los enlaces -O-4 ter y los C-C de la lignina y requieren H2 O2 proveniente de la oxidacin por la glucosa-oxidasa. La formacin de peroxidasas es promovida por la limitacin de nitrgeno y la descomposicin de la lignina parece tener como principal objetivo el acceso a los componentes nitrogenados de la madera. Sobre los compuestos fenlicos de bajo peso molecular liberados actan luego las fenoloxidasas (4). En la figura 12 se observa un esquema simplificado de la lignina, mientras que la figura 13 muestra la velocidades de la descomposicin de algunos componentes del mantillo.

3.3.8. Degradacin de lpidos

De 1,2 a 6,3% de la materia orgnica del suelo se encuentra como grasas, ceras y resinas, aunque los valores pueden ser mayores en suelos forestales y turba. Los fosfolpidos constituyen el 1-5% de los compuestos fosforados del suelo y son de origen microbiano. La fraccin hidrfoba de las gramneas es de unos 2% de la materia seca, pero es ms abundantes en ciertos microorganismos que contienen ms de 10%. Algunos de los componentes de los lpidos son fitotxicos, mientras que otros (vitaminas) estimulan el crecimiento de las plantas (5). Por otra parte, ceras y materiales similares son los responsables de la condicin

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hidrfuga de ciertas arenas. Numerosos microorganismos telricos, entre ellos Aspergillus y Penicillium, sintetizan substancias lipdicas que contribuyen a la estabilidad estructural del suelo (1). Los lodos de aguas residuales digeridas anaerbicamente, que suelen agregarse al suelo, contienen 19,1-19,8% de grasas, aceites y ceras (5). Numerosos microorganismos del suelo producen lipasas, capaces de hidrolizar los glicridos dando glicerol y cidos grasos, as como fosfolipasas. El catabolismo posterior de los cidos grasos se lleva a cabo por una serie de -oxidaciones, pero en el suelo esta degradacin es lenta y limitada. La figura 14 da un esquema de la hidrlisis de un triacilglicrido. Muchas levaduras de la filosfera degradan las ceras de la epidermis vegetal, tambin mohos tales como Penicillium y Mucorales, y algunas bacterias (1).

3.3.9. Degradacin de protenas

Las protenas estn constitudas por una o varias cadenas polipeptdicas donde los -aminocidos estn unidos por enlaces amida. Las protenas conjugadas tienen adems otros componentes: nucletidos, lpidos, glcidos, cationes metlicos o grupo hemo. Los catalizadores biolgicos (enzimas) son tambin protenas. Antes que las protenas puedan incorporarse a las rutas catablicas deben experimentar hidrlisis completa hasta transformarse en aminocidos, ya que las molculas proteicas intactas y la mayora de los pptidos no pueden atravesar la membrana citoplasmtica, mientras que los aminocidos libres son absorbidos fcilmente (6). Las proteasas excretadas por los microorganismos producen aminocidos y oligopptidos al hidrolizar de las uniones peptdicas. Los pptidos son hidrolizados por las exo- y endo-peptidasas. Las exopeptidasas se dividen en dos grupos: las que comienzan su accin por el enlace peptdico adyacente al grupo amino terminal y las que lo hacen por el cercano al carboxilo terminal. Las otras hidrolizan los enlaces del interior de la cadena y son muy especficas, como por ejemplo la accin hidroltica de la tripsina usada en la produccin de peptonas, ocurre solamente si el aminocido que aporta el grupo carboxilo en la unin peptdica es lisina o arginina (4). La figura 15 muestra la hidrlisis de la unin peptdica. Las protenas de los organismos muertos son descompuestas por un gran nmero de hongos y bacterias. Las bacterias termoflicas producen proteasas termoestables. Algunas proteasas

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 extracelulares actan como toxinas, mientras que ciertos polipptidos bacterianos son antibiticos. La degradacin de protenas en el suelo va seguida de la formacin de amonio por la posterior descomposicin de los aminocidos (6).

3.3.10. Degradacin de polinucletidos

Los nucletidos estn formados por una base nitrogenada derivada de la purina o la pirimidina, una pentosa y cido fosfrico. Son los monmeros de los polinucletidos donde estn unidos por puentes fosfodister, como se muestra en la figura 16. Los cidos nucleicos son el 0,2-2,5% de los compuestos fosforados del suelo y su hidrlisis da oligonucletidos y mononucletidos con baja relacin C/N (2). Los mononucletidos a su vez son convertidos en nuclesidos (N-glicsidos de purinas o pirimidinas). stos son despus hidrolizados en las bases nitrogenadas y pentosas. Luego en el suelo el proceso continua con la amonificacin de las purinas y pirimidinas. Las exonucleasas atacan solamente los extremos de las cadenas polinucleotdicas mientras que las endonucleasas hidrolizan enlaces de cualquier punto de las mismas. Las desoxi-ribonucleasas degradan el ADN y las ribonucleasas el ARN, aunque algunas fosfo -diesterasas hudrolizan uniones de nuclotidos de ambos cidos nucleicos. Entre los numerosos organismos que excretan nucleasas se encuentran algunos Clostridium
(4).

3.4. Metabolismo productor de energa


Para su crecimiento y multiplicacin, los micro-organismos llevan a cabo diversos procesos metablicos, destinados a obtener energa y nuevo material celular. Los microorganismos fotosintticos son capaces de utilizar la energa de la luz para convertir el CO 2 , junto con el hidrgeno del H 2O (cianobacterias, algas) o el H 2S (bacterias), en materia orgnica celular. Los autotrficos tambin fijan el CO2 pero con una fuente qumica de energa. Los microorganismos heterotrficos necesitan substratos orgnicos para desarrollarse. Los microorganismos pueden dividirse, de acuerdo con sus necesidades ambientales, en tres grupos. Se encuadran en el primero los aerbicos estrictos, que nicamente pueden respirar y crecer en presencia de oxgeno atmosfrico. En el segundo grupo se hallan los anaerbicos estrictos, que no slo fermentan y crecen en ausencia de oxgeno libre, sino que requieren su eliminacin, por serles perjudicial. En el tercer grupo estn los organismos facultativos, capaces de crecer en presencia o en ausencia de oxgeno, que pueden subdividirse en dos grupos segn puedan cambiar su metabolismo aerbico (respiracin) en anaerbico (fermentacin) adaptndose al ambiente donde se hallan, o bien son nicamente fermentadores que toleran el oxgeno (aerotolerantes) (6).

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Dentro de los aerbicos estrictos estn muchas bacterias y casi todos los mohos y las actinobacterias. Los anaerobios estrictos estn representados por miembros del gnero bacteriano Clostridium , por ejemplo C . pasteurianum que es un fijador de nitrgeno. Las levaduras y las bacterias coliformes, que pueden respirar o fermentar ciertos substratos, son organismos facultativos. Las bacterias lcticas pertenecen al grupo que obtiene su energa exclusivamente de la fermentacin y no sufren lesin por parte de una reducida presin parcial de oxgeno. El metabolismo anaerbico es siempre menos eficiente que la respiracin, ya que la fermentacin no aprovecha toda la energa del substrato orgnico (por ejemplo, un azcar) para la produccin del combustible universal de la clula (el ATP) ni, por tanto, para la sntesis de material celular. Las clulas excretan el producto de degradacin que, a su vez, podra ser oxidado ulteriormente a CO2 y H2O. Pero, los productos de la fermentacin, tales como el etanol liberado por levaduras, no pueden ser metabolizados, en condiciones anaerbicas, por el organismo que los produce. El crecimiento aerbico, por otra parte, capacita a algunos organismos para oxidar completamente una cierta fraccin del substrato y extraer as la mxima energa para convertir el resto del substrato en masa celular. Si el objetivo del cultivo microbiano es aumentar la biomasa, por ejemplo en la produccin de levadura de panadera, resulta una ventaja obvia tener tener un crecimiento aerbico con utilizacin completa del substrato por respiracin (13).

3.5.Respiracin
3.5.1. Degradacin de hexosas
Hay varias vas para convertir la glucosa a piruvato, uno de los compuestos intermediarios ms importantes del metabolismo. Una es la va de la fructosa-1,6-difosfato), esquematizada en la figura 17 . El balance es la formacin de dos molculas de ATP (energa qumica por fosforilacin a nivel de substrato) y dos de NADH2 (poder reductor), por lo que constituye la secuencia de reacciones ms importante para los orga nismos anaerbicos. Otra es la va oxidativa de la pentosa-fosfato que se muestra en la figura 18, la cual adems provee ribosafosfato para la sntesis de nucletidos. El camino inverso es la ruta ms importante en la fijacin autotrfica de CO2 . La va del ceto-desoxi-fosfo-

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 gluconato que se observa en un amplio grupo de bacterias, se detalla en la figura 19. La oxidacin del piruvato se produce, por caminos distintos segn los organismos dando acetil-CoA, que en el caso de los aerobios entra en ciclo del cido tricarboxlico (4).

3.5.2. Ciclo del cido tricarboxlico

Este ciclo, cuyo esquema se da en la figura 20, sirve no solamente para la oxidacin terminal de los nutrientes sino tambin para la generacin de precursores de biosntesis. Si algunos intermediarios se derivan por otro camino, cesa de funcionar este ciclo. Pero, entonces entra en juego la secuencia de reacciones anaplerticas para reaprovisionar los intermediarios faltantes (6). El ciclo del citrato es tambin la ruta final para la oxidacin de las cadenas carbonadas de los aminocidos despus de la desaminacin (ver figura 14).

3.5.3. Cadena de transporte de electrones


Es llamada tambin cadena respiratoria. En los eucariotas las enzimas de la respiracin estn en unos orgnulos denominados mitocondrias mientras que en los organismos procariticos se encuentran en la membrana citoplasmtica. Cada molcula de NADH2 proveniente del ciclo anterior se reoxida a travs de esta cadena con la ganancia de 3 molculas de ATP mientras que cada molcula de FADH2 genera 2 de ATP. La figura 21 representa la secuencia del transporte de electrones en la membrana de algunas bacterias, desde la flavoprotena hasta el O2 u otro aceptor terminal, mientras que los H + son bombeados fuera. Cuando el oxgeno se reduce, requiere protones del citoplasma para completar la reaccin, los que se originan por la disociacin del agua. El resultado neto es la generacin de un gradiente de pH y un potencial electroqumico a travs de la membrana, con la parte interna cargada negativamente, y la externa con carga positiva. Este estado energizado de la membrana se expresa como fuerza motriz de protones (6). La energa puede ser

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usada directamente en el transporte de iones, la rotacin de los flagelos o la produccin de los enlaces fosfato del ATP a travs del sistema ATPasa (fosforilacin oxidativa) anclado en la membrana. La respiracin provee 38 molculas de ATP por cada molcula de glucosa oxidada.

3.6. Fermentaciones
Las rutas bioqumicas de la fermentacin varan mucho. Por ejemplo, las levaduras pueden fermentar una molcula de un monosacrido de seis carbonos, como la glucosa o la fructosa, produciendo dos molculas de etanol y dos de CO2. Pero, para las bacterias, se pueden agrupar esas vas en dos tipos generales: homofermentativos (un producto principal) o heterofermentativos (dos o ms productos). Los productos de la fermentacin no pueden ser metabolizados, en condiciones anaerbicas, por el organismo que los produce. En las fermentaciones el ATP se produce por fosforilacin a nivel de substrato, pues se sintetiza durante el catabolismo de un compuesto y en pasos enzimticos concretos, pero requiere que la fuente genere un intermediario de alta energa (6).

3.6.1. Fermentaciones lcticas


Las lactobacterias llevan a cabo este tipo de fermentacin en presencia o ausencia de aire, aunque prefieren concentraciones reducidas de oxgeno. En cambio las enterobacterias slo producen cido lctico en condiciones anaerbicas. El ambiente natural de lactobacterias es la leche y los lugares donde es procesada ( Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus, Lactococcus lactis), la superficie de plantas intactas o podridas ( Lactobacillus plantarum, L. delbrueckii, Leuconostoc mesenteroides ), el tracto intestinal y las mucosas de animales y humanos (Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecalis). Por tal motivo suele encontrarse cultivos puros naturales, como en algunos productos lcteos, material ensilado, chucrut (14). Las bacterias homofermentativas (por ejemplo Lactobacillus casei) producen lactato puro o casi puro, metabolizando la glucosa por va de la fructosadifosfato y reduciendo el piruvato a lactato. Segn las especies se forma D (-), L (+) o DL-lactato. Las bacterias heterofermentativas (Lactobacillus brevis) degradan la glucosa al comienzo por la va de las pentosas y luego transforman el acetil-P en etanol o acetato y el piruvato en lactato (6). La figura 23 muestra un esquema de la fermentacin heterolctica. La fermentacin lctica permite la conservacin de los forrajes pues las lactobacterias cido-tolerantes

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 desarrollan en cultivo prcticamente puro en el material ensilado, en especial si fu previamente acidificado. Las lactobacterias son imprescindibles en la industria lechera como productores de cido en la coagulacin de la casena para ciertos quesos, y aroma por la formacin de diacetilo en algunas especies. Tambin se emplean lactobacterias en la produccin de salames pues la acidificacin contribuye a la conservacin de estos embutidos
(4).

3.6.2. Fermentacin alcohlica


La levadura Saccharomyces cerevisiae y la bacteria Sarcina ventriculi forman etanol va la fructosa-difosfato y descarboxilacin del piruvato. El rendimiento energtico es 2 molculas de ATP por cada molcula de glucosa fermentada. La bacteria Zymomonas mobilis metaboliza la glucosa por la ruta del ceto-desoxifosfogluconato y descompone el piruvato en CO 2 y acetaldehdo, que luego es reducido a etanol (6). Mientras las enzimas de la fermentacin son constitutivas en la levadura y se encuentran en el citoplasma, los de la respiracin son inducibles. La fermentacin con Saccharomyces spp. se emplea para la produccin de bebidas alcohlicas y la produccin industrial de etanol mientras que la fermentacin con Zymomonas se usa en slo en el ltimo caso (13).

3.6.3. Fermentaciones propinicas

La formacin de propionato, por las especies de Propionibacterium es utilizada en la maduracin de quesos tipo suizo. El piruvato proveniente de la ruta de la fructosadifosfato o el lactato resultante de otras fermentaciones son reducidos mediante la va de la metilmalonil-CoA (4) que se muestra en la figura 24. La produccin de propionato debida a Clostridium propionicum y Bacteroides ruminicola ocurre por una ruta ms simple, donde la lactil-CoA se reduce a propionil-CoA. Estas bacterias habitan el rumen y el intestino de los rumiantes (6).

3.6.4. Fermentaciones frmicas


La fermentacin cida-mixta es llevada a cabo por Escherichia coli (bacteria facultativa del intestino) y otras proteobacterias patgenas de humanos y animales (por ejemplo Salmonella spp.). produciendo cidos orgnicos y el pH desciende a 4,2, punto en el que la solucin de rojo de metilo tiene color rojo (figura 25). Se investiga la presencia de los organismos con caractersticas semejantes a E. coli (coliformes) como indicadores de la contaminacin fecal del agua. La fermentacin butanodilica es

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algunos organismos con este tipo de fermentacin.

cumplida por bacterias que se encuentran en el agua y el suelo (por ejemplo Enterobacter aerogenes, Bacillus cereus y Erwinia que es patgena de plantas) con la formacin 2,3-butanodiol como principal producto (14). Un intermediario es la acetona que da positiva la reaccin de VogesProskauer, til para detectar

3.6.5. Fermentacin butrico -butanlica


Los Clostridium son bacterias esporuladas fermentativas pues solo crecen en condiciones anaerbicas. La fermentacin butrico-butanlica comienza por la conversin de los azcares en piruvato por la va de la fructosa-difosfato. El piruvato es descarboxilado dando acetil-CoA y la transformacin de esta ltima da diversos productos (4) como se observa en la figura 26. En las primeras fases los productos predominantes son los cidos butrico y actico pero luego, al bajar el pH del medio, comienzan a acumularse acetona y butanol que son neutros (6).

3.6.6. Fermentaciones acticas


Algunos clostridios (por ejmplo C. thermoaceticum) fermentan la glucosa por la va de la fructosa-difosfato. Luego generan acetato por descarboxilacin del piruvato y la conversin del CO2 e hidrgeno, producidos antes, en acetato. Otras bacterias convierten los monosacridos en acetato como por ejemplo Ruminococcus albus, y el hidrgeno producido es aprovechado por Vibrio succinogenes en un cultivo mixto (4), como se presenta en la figura 27.

3.6.7. Fermentacin de aminocidos


Varios clostridios obtienen energa fermentando aminocidos (por ejemplo C. sporogenes ). Algunas cepas fermentan pares de aminocidos, donde uno acta como dador de electrones y es oxidado, y el otro como aceptor de electrones y es reducido (6).

3.7. Oxidaciones incompletas


No todas las reacciones oxidativas catalizadas por microorganismos aerbicos estrictos se llevan hasta el ltimo extremo. Por ejemplo la conversin de etanol en cido actico (vinagre) por Acetobacter spp. Aunque estos suboxidadores obtienen energa en forma de ATP a partir de las oxidaciones incompletas, generalmente no pueden obtener molculas para su crecimiento a partir de dichas reacciones y, por consiguiente, requieren para su desarrollo otros nutrientes suministrados por el medio (6).

3.8. Respiracin anaerbica


Es una variacin de la respiracin en la que los aceptores de electrones utilizados son diferentes al oxgeno, e incluyen nitrato, in frrico, sulfato, carbonato y ciertos compuestos orgnicos. La figura 28 muestra los contrates entre la respiracin aerbica y la anaerbica. Los productos de la respiracin anaerbica son fcilmente detectados: las burbujas de N2 , NO2 , CH4 (inflamable); el olor de H2 S; la formacin de xido de hierro diamagntico (2).

3.8.1. Desnitrificacin

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 La desnitrificacin transitoria y localizada en los suelos consiste en la reduccin anaerbica del nitrato a compuestos voltiles (N2 , N2 O, NO). Es producida por bacterias que respiran y solamente pueden crecer anaerbicamente en presencia de nitrato, por ejemplo Pseudomonas fluorescens, Bacillus licheniformis, Paracoccus denitrificans y Thiobacillus denitrificans. Ocurre con frecuencia en los suelos anegados, especialmente cuando se aplicaron juntos fertilizantes orgnicos y nitrato (1). No se observa este proceso en mohos ni actinomicetos (2). La figura 29 expone la velocidad relativa de la desnitrificacin segn la cantidad de agua que ocupa los poros del suelo y la figura 30 muestra un esquema del ciclo del nitrgeno.

3.8.2. Reduccin a nitritos


Algunas bacterias facultativas como Enterobacter y Escherichia, pueden respirar reduciendo el nitrato a nitrito, que se acumula en el ambiente, pero no producen N2 . Luego reducen el nitrito a amonio por la va asimilatoria, si hay deficiencia de NH 4 + en el medio (4). La figura 22 muestra el proceso de transporte de electrones en Escherichia coli cuando usa nitrato como aceptor de electrones. Es la transferencia de hidrgeno al sulfato aceptor terminal de electrones en la respiracin anaerbica, reducindolo a H S. Este proceso, 2 llamado tambin reduccin desasimilatoria de sulfatos, es cumplido por bacterias anaerbicas obligadas tales como Desulfovibrio, Desulfatomaculum. Los donantes de hidrgeno son lactato, acetato y otros cidos grasos, metanol, etanol y compuestos aromticos. Los microorganismos reductores de sulfato son responsables de la precipitacin de Fe++ y otros cationes metlicos en aguas polutas, y la corrosin de metales enterrados. Desulfuromonas y algunas arqueobacterias termoflicas pueden

3.8.3. Sulfatorreduccin

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reducir el azufre elemental a H2 S (5). Por otra parte, casi todas las bacterias, as como los hongos pueden reducir sulfatos para sintetizar aminocidos azufrados por la va de la reduccin asimilatoria de sulfatos (5). La figura 31 presenta un esquema del ciclo del azufre.

3.9. Bacterias autotrficas


Usan CO2 como fuente de carbono a travs del ciclo de la ribulosa-difosfato, excepto las bacterias acetognicas y metanognicas. Obtienen energa y molculas reductoras usando iones amonio, nitrito, sulfuro, tiosulfato, sulfito, ferroso; as como azufre elemental, hidrgeno o monxido de carbono. Tienen los componentes del transporte electrones y la fuerza motriz de protones como los hetertrofos (4). La figura 28 resume los contrastes del metabolismo autotrfico frente al heterotrfico.

3.9.1. Metanognesis

El ecosistema donde ocurre la metanognesis comprende pantanos, arrozales, sedimentos de lagos, estanques y estuarios, digestores de aguas residuales y el rumen. En tales ambientes anaerbicos los substratos orgnicos son fermentados a acetato, CO2 e H2 . Estos productos son utilizados por las arqueobacterias formadoras de metano entre las que se encuentran Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanospirillum (15). Como el CO2 es usado como un aceptor de hidrgeno durante la generacin de energa, el proceso se suele llamar respiracin del carbonato. Algunas bacterias metanognicas tambin pueden convertir el CO en metano. Por otra parte, estas arquibacterias son auttrofas y fijan CO2 por la va acetil-CoA y piruvato, para la sntesis del material celular (4). Ver 5.3.

3.9.2. Nitrificacin
En el curso de la degradacin de substancias nitrogenadas se libera amonio. La conversin del amonio a nitrito es llevada a cabo por las bacterias nitritantes del suelo: Nitrosolobus, Nitrosomonas, Nitrosospira. En el ambiente marino se encuentra Nitrosococcus. No hay bacterias que conviertan directamente el amonio en nitrato. El nitrito es oxidado a nitrato por las bacterias nitratantes Nitrobacter, Nitrococcus (en el mar) y otras. Ambos pasos constituyen la llamada nitrificacin del suelo (1). Estas bacterias autctonas del suelo pueden ser cultivadas en

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 solucin mineral con un tiempo de generacin entre 10 y 20 horas. Nitrobacter winogradskyi puede asimilar acetato (4). La figura 32 muestra las membranas intracitoplasmicas de una bacteria nitrificante. Los iones amonio son oxidados rpidamente en los suelos bien aireados. La conversin de este catin al anin nitrito o nitrato, trae aparejado una acidificacin del suelo con un incremento en la solubilizacin de minerales (potasio, calcio, magnesio y fosfatos). Por tal motivo los microorganismos nitrificantes fueron vistos como un factor significativo de la fertilidad del suelo (3). El amonio es mejor retenido que el nitrato, especialmente por adsorcin sobre arcillas y unin ms o menos firme a los componentes del hum us. El nitrato, por el contrario, es fcilmente eliminado por el agua (4). El nitrato se acumula en las capas freticas y puede afectar la salud de los bebs si la concentracin en el agua potable supera los 50 mg por litro, pues las bacterias del intestino delgado lo reducen y el nitrito que pasa a la sangre se une irreversiblemente a la hemoglobina (16). El proceso de nitrificacin ocurre entre pH 7 y 8, debido a que el amonio libre (en suelos alcalinos) y el cido nitroso (en suelos cidos) son txicos para Nitrobacter (1). En suelos anegados que fueron fertilizados con sales de amonio, Nitrosomonas y Nitrosovibrio pueden llevar a cabo una desnitrificacin. Otras cualidades de las bacterias nitrificantes son su capacidad para oxidar metano, metanol, CO, etileno, propileno, ciclohexano, alcohol benclico y fenol. En cultivo puro la bacteria heterotrfica Arthrobacter es capaz de formar nitrito a partir de substancias nitrogenadas. Tambin algunos hongos pueden oxidar el nitrgeno amnico o el amonio hasta nitrato. Esta nitrificacin hetertrofa no est acoplada al crecimiento y produccin de biomasa, y slo es de importancia en suelos cidos, por ejemplo bosques de pinos (4).

3.9.3. Sulfooxidacin

Los Thiobacillus son unas bacterias capaces de obtener energa por la oxidacin de compuestos de azufre (sulfuro, azufre, tiosulfato) hasta sulfatos. La mayora son auttrofos y dependen de la fijacin de CO 2 como T. thiooxidans, T. denitrificans (1). Entre los hetertrofos se encuentran por ejemplo T. novellus y Sulfolobus acidocaldarius. ste ltimo es una arqueobacteria termoflica de las aguas termales azufradas. T. thiooxidans es un organismo aerobio que produce cido sulfrico y tolera una solucin 1N del mismo. El agregado de azufre permite neutralizar suelos calizos y reducir la incidencia de algunos patgenos vegetales debido a la acidificacin provocada por los sulfooxidantes del suelo. T. denitrificans puede reducir nitratos anaerbicamente pero no lleva a cabo una reduccin asimilatoria y necesita la presencia de sales de amonio en el medio (3). Las bacterias filamentosas Beggiatoa y otras pueden oxidar sulfuros a azufre elemental que se acumula en la clula. Algunas especies de Beggiatoa son organismos heterotrficos (1).

3.9.4. Ferrooxidacin
Las siderobacterias (por ejemplo Gallionella ferruginea y Leptothrix ochracea ) pueden oxidar los iones ferrosos a frricos, y tambin Thiobacillus ferrooxidans. La vaina de la

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bacteria filamentosa Leptothrix est recubierta de sales frricas. Gallionella excreta un mucus que se impregna de hidrxido frrico formando una especie de pednculo (1).

3.10. Biosntesis
En el metabolismo normal, todos los compuestos que necesita la clula se sintetizan en la cantidad justa. Este control se realiza por una serie de reacciones reguladoras estrictas que detienen la formacin de productos intermedios y finales de una reaccin metablica, cuando un compuesto dado alcanza una determinada concentracin. Sin embargo, existen mutantes en los que el mecanismo de regulacin es tan defectuoso que hay una sobreproduccin de algunos metabolitos y los excretan al medio, lo que es aprovechado en la produccin industrial (13).

3.10.1. Sntesis de protenas

Casi todos los organismos estn capacitados para convertir el nitrgeno inorgnico en protenas y cidos nucleicos. El N puede asimilarse en forma de iones amonio y por algunas especies en forma de iones nitrato. Ningn moho o ni levadura fijan nitrgeno gaseoso como lo hacen algunas bacterias, por ejemplo, Azotobacter que vive libre en el suelo y Rhizobium que crece como simbionte en los ndulos de las races de leguminosas (14). La mayora de los microoorganismos son capaces de sintetizar todos los aminocidos requeridos para sntesis de protenas. El grupo amino es introducido por aminacin directa o por transaminacin. La asimilacin del nitrgeno molecular, as como la de nitrato y nitrito implica una reduccin a amonio antes de su incorporacin al compuesto orgnico (4). La figura 33 muestra las rutas ms importantes de incorporacin de nitrgeno para formar los aminocidos y la 34 los caminos de sntesis de los aminocidos La informacin contenida en el ADN no es transferida directamente durante la sntesis de protenas que ocurre en los ribosomas. El intermediario es el ARN mensajero (ARNm) monocatenario sintetizado sobre una sola cadena del ADN efectuando la

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 transcripcin de la informacin. Los aminocidos son reunidos en una cadena polipeptdica segn la secuencia determinada por el ARN-m dura nte la traduccin que implica la participacin del ARN de transferencia de los aminocidos (ARN-t), el ribosoma, varias enzimas y ATP. La figura 35 muestra un esquema de la biosntesis de las protenas en bacterias. La expresin de la nitrogenasa en los bacteroides se modifica por diversos factores aportados por la planta. Una vez establecida la simbiosis, la enzima nitrogenasa se inhibe en presencia de nitrgeno combinado y cesa cuando comienza el desarrollo de las semillas en la planta hospedadora (senescencia de los ndulos). Otros factores que afectan la fijacin son la presencia de hidrogenasa (que aumenta el rendimiento de la misma) y circunstancias ambientales como la temperatura (17). En la figura 36 se muestra un esquema de la actividad metablica en el ndulo. La capacidad para fijar nitrgeno molecular se observa en muchos organismos procariticos de vida libre. La reaccin qumica responsable del proceso de fijacin consiste en la transferencia de seis electrones al N2 para dar NH4 + con el aporte de energa en forma de ATP. La reaccin debe estar acoplada a la fermentacin o a la respiracin de azcares u otros compuestos energticos, o bien a la fotofosforilacin del ADP, para que transcurra espontneamente. Los electrones son provistos a travs de ferredoxina y flavodoxina. El sistema nitrogenasa est constitudo por dos enzimas: la dinitrogenasa reductasa o componente II y la nitrogenasa propiamente dicha o componente I. La dinotrogenasa reductasa tiene dos subunidades idnticas y el grupo prosttico es un centro sulfofrrico. El componente I es un tetrmero con dos subunidades alfa y dos beta, que contienen tomos de hierro y molibdeno (4). Algunas bacterias no-nodulantes capaces de fijar nitrgeno molecular (6) aerbicos facultativos anaerbicos fototrficos Azotobacter Klebsiella Desulfovibrio Chromatium Azomonas Bacillus polymyxa Desulfotomaculum Rhodospirillum Alcaligenes Methanobacterium Rhodobacter Xanthobacter Methanosarcina Heliobacter Beijerinckia Clostridium Chlorobium Derxia Cianobacterias Azospirillum Anabaena Nostoc En algunas bacterias fijadoras de vida libre la nitrogenasa contiene vanadio en lugar de molibdeno. Adems de reducir el nitrgeno molecular, la nitrogenasa puede reducir los H + a H 2 y tambin otros compuestos como se observa en la figura 37. Casi todas las bacterias fijadoras tienen, unida a la membrana, una hidrogenasa (con nquel en su grupo prosttico) como proteccin del sistema nitrogenasa, que transfiere electrones desde el H2 al O2 difundido hacia adentro de la clula (6). Dada la rpida inactivacin

3.10.2. Fijacin de N 2 (ver 2.9)

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de la nitrogenasa en presencia de oxgeno, los microorganismos fijadores has desarrollado diversas estrategias para evitarla: una alta tasa respiratoria, la formacin de estructuras protectoras, la compatimentacin celular o un crecimiento en condiciones anaerbicas o microaeroflicas (17). Las cianobacterias filamentosas son tolerantes al oxgeno ambiental debido a que la actividad nitrogenasa se localiza generalmente en una clula especial, llamada heterocisto. Los heterocistos poseen una pared poco permeable al oxgeno y pueden generar ATP por fotofosforilacin cclica y fosforilacin oxidativa, con lo cual se eliminan las trazas de O2 . El poder reductor necesario para la fijacin proviene de las otras clulas que tienen los dos fotosistemas (6). En la mayora de los microorganismos fijadores de N2 de vida libre, el amonio producido es asimilado para formar glutamina (4).

3.10.3. Sntesis de otros compuestos


Los nucletidos de purina y pirimidina son las unidades para la sntesis de los cidos nucleicos. Tambin forman parte de algunas coenzimas. La parte glicosdica deriva de la ribosa-5-fosfato cuya reduccin a desoxirribosa ocurre a nivel del nucletido (6). La figura 38 muestra los precursores de purinas y pirimidinas. Entre los lpidos bacterianos predominan los cidos grasos saturados o monoinsaturados, los triglicridos y esteroides son raros. Los ms importantes son los lpidos complejos donde un grupo OH del glicerol est esterificado con fosfato o un azcar. El grupo fosfato a su vez est esterificado con serina, etanolamina o glicerol. La formacin de los cidos grasos de cadena larga implica la condensacin, en pasos sucesivos, de los grupos acetilo al butiril-ACP, alargando cada vez la cadena en dos carbonos (6) como se muestra en la figura 39. Cuando las bacterias crecen sobre lactato, piruvato, acetato u otro

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 3 compuesto, se desarrollan rutas metablicas adicionales (reacciones anaplerticas) para mantener funcionando el ciclo de los cidos tricarboxlicos (figura 20) y proveer molculas intermediarias para la sntesis de los azcares (6). La figura 40 muestra un esquema de la biosntesis de glcidos. Muchas bacterias autotrficas y fototrficas, as como las cianobacterias y las plantas, fijan CO2 como nica fuente de carbono a travs del ciclo de la ribulosadifosfato (figura 41). Pero las metanognicas y acetognicas, que tambin son autotrficas, lo hacen por la va reductora del acetil-CoA, mientras que las bacterias verdes del azufre fijan CO 2 por el camino reductor en el ciclo del citrato (4) como se muestra en el cuadro de la pgina siguiente. La actividad de los pigmentos en la fotosntesis de las eubacterias no libera oxgeno como ocurre con las cianobacterias y las plantas. Hay dos tipos de bacterias de color prpura, rojo o pardo porque contienen carotenoides, uno comprende a las anaerbicas (por ejemplo Chromatium dependiente del azufre y Rhodospirillum no dependiente) y otro a las aerbicas (por ejemplo Erythromonas ). En cuanto a las verdes, algunas, por ejemplo Chlorobium, utilizan H2 S como dador de electrones y otras, por ejemplo Chloroflexus, no. Otras bacterias fototrficas anaerbicas y esporuladas, frecuentes en suelos tropicales anegados, estn reunidas en el gnero Helicobacterium. Cualquiera sea el mecanismo de captacin de la luz y transporte de electrones, se genera una fuerza motriz de protones que permite sintezar ATP (fotofosforilacin) (18). La figura 28 resume los contrastes del metabolismo autotrfico frente al fototrfico y la figura 42 muestra el transporte de electrones en algunas bacterias prpura. Los metabolitos secundarios son compuestos no requeridos para la biosntesis celular. Estos productos son sintetizados por algunos microorganismos, generalmente en las ltimas fases del ciclo de crecimiento. Los ejemplos ms conocidos son los antibiticos, otros son las micotoxinas. Los metabolitos secundarios no desempean un papel directo en el metabolismo energtico ni en el crecimiento del organismo, sino que contribuyen a la supervivencia del organismo al inhibir la accin de competidores que pudieran ocupar el mismo nicho ecolgico (14). Ver 6.1.

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Fijacin autotrfica del CO2 (4) Va reductora del acetil-CoA Bacterias fermentadoras homoacetognicas Clostridium thermoaceticum Acetobacter woodii Sporomusa sp La mayora de las bacterias reductoras del sulfato Desulfobacterium autotrophicum Desulfovibrio baarsii Bacterias metanognicas Methanobacterium thermoautotrophicum Methanosarcina barkeri Ciclo reductor del cido tricarboxlico Bacterias verde del azufre Chlorobium limicola Bacterias termoflicasdel hidrgeno Hydrogenobacter thermphilus Algunas bacterias reductoras del sulfato Desulfobacter hydrogenophilus Ciclo de la ribulosa difosfato Bacterias fototrficas anoxignicas Chromatium vinosum Rhodospirillum rubrum Bacterias quimioautotrficas nitrificantes oxidantes del azufre bacterias del hidrgeno y el CO oxidantes del hierro Organismos fototrficos oxignicos Cianobacterias Algas y plantas

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Referencias
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4. Estructuras de los hongos


4.1. Somticas
Micelio es el conjunto de filamentos y un trozo del mismo se denomina hifa. Las hifas pueden presentar septos y entonces el micelio est tabicado. Septos primarios son los formados cuando hay divisin nuclear y adventicios los otros. Si los tabiques estn ausentes se habla de micelio continuo . Los mohos son micromicetos filamentosos. Cuando el hongo es una clula aislada se dice unicelular o levadura . Los cortos filamentos compuestos por las clulas que brotan de una levadura constituyen el pseudomicelio. Plectnquima es un conjunto de hifas entrelazadas que se asemejan a un tejido. Se dice prosnquima si las hifas pueden ser reconocidas y pseudoparnquima cuando han perdido su individualidad. Esclerocio es un plectnquima generalmente macroscpico que puede permanecer en vida latente. Rizomorfa es un cordn grueso donde el conjunto de las hifas fusionadas ha tomado el aspecto de raz. Rizoides son las hifas de succin, como raicillas, que penetran en el substrato. Haustorio es la hifa de succin del hongo parsito dentro de la clula del hospedador. Apresorios son unas hifas achatadas que se adhieren al substrato o al hospedador como sostn, especialmente en el comienzo de la infeccin.

4.2. Reproductoras
Anamorfo es el hongo con multiplicacin asexuada y teleomorfo es el mismo con reproduccin sexuada. Se les asigna distinto gnero y especie. Holomorfo indica el ciclo de vida total. Esporas son los elementos de perpetuacin de la especie. De acuerdo a la morfologa reciben distinto nombre: alantospora con forma de banana, aleuriospora con base plana, dictiospora

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 4 con septos longitudinales y transversales, didimospora con un tabique, equinulada como un erizo, escolescospora como un gusano, estaurospora como una estrella, feospora de color obscuro, fragmospora con tabiques transversales, fusiforme como un huso, helicospora como una espiral, hialospora de color claro y translcido, planospora mvil, verrucosa con verrugas, zoospora con flagelos. Las balistosporas son proyectados violentamente una vez maduras. Las hipnosporas son aqullas capaces de permanecer con vida latente por largo tiempo. Las esporas pueden ser de origen asexuado (mitosporas ) o sexuado (meiosporas), y por su ubicacin relativa internas o externas. Las mitosporas se originan en las estructuras anamrficas y las meiosporas en las teleomrficas.

4..3. Anamrficas
Artrosporas o artroconidios son esporas desarrolladas en una hifa terminal que al madurar se separan. En algunos hongos se forman artrosporas separadas por una zona libre de citoplasma (disyuntor ) cuya pared se rompe liberando las entosporas o clamido-artrosporas. Clamidospora o clamidoconidio es una hipnospora o clula de resistencia, terminal o interh ifal, con pared gruesa y substancias de reserva. Blastosporas o blastoconidios son las esporas que se originan de una parte de una clula somtica, una hifa, un conidiforo u otra espora, y se desarrollan antes de la formacin del septo que lo separa de la clula de origen. Conidios o conidiosporas son las esporas asexuadas externas. Si estn implantadas directamente sobre la hifa se llaman ssiles. La parte del micelio que origina y sostiene a las esporas se denomina esporforo y si se trata de conidios se dice conidiforo. Filide es la clula conidigena que desde un extremo origina por brotacin y sin aumentar su longitud, los fialoconidios o fialosporas. La pared de la filide suele extenderse en el pice formando un collarn. Anlide es una clula conidigena con el pice ancho y cicatrices en anillo, que se alarga con la formacin de cada espora. Los conidiforos pueden ser simples o ramificados y a veces estn agrupados en un conidioma . En Penicillium cada nivel de ramificaciones recibe distinto nombre, se llama mtulas a las que sostienen a las

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filides productoras de esporas. En Aspergillus las filides o las mtulas estn implantadas sobre una vescula o dilatacin del esporforo. Los conidios nacen de los conidiforos aisladamente o quedan reunidos, ya sea en una cabezuela mucosa o en cadenas. stas se forman por sucesin baspeta cuando todos las esporas surgen de la clula conidigena o basfuga si es por brotacin de la espora anterior. A veces despus que se forma un conidio, el conidiforo se alarga lateralmente y origina el segundo conidio. El proceso contina y las esporas quedan en zig-zag (proliferacin simpodial). En algunos hongos surgen, simultneamente o no, varios conidios en diferentes puntos de la misma clula conidigena (brotacin mltiple). Los conidiforos suelen estar reunidos en un haz llamado coremio o sobre un conjunto de hifas entrelazadas constituyendo un conidioma, ya sea un esporodoquio (almohadilla de filides con las esporas expuestas) o una acrvula (estructura chata y cubierta al principio por el tejido del hospedador donde los esporforos estn en empalizada). Funculo es una cuerda de hifas de las cuales surgen, a intervalos, los conidiforos. Picnidio es un conidioma globoso o en forma de pera, cuya p ared plectenquimatosa est recubierta internamente por las clulas conidigenas y est abierto por un ostolo. Las esporas originadas se llaman picnidiosporas . Tambin la cavidad picnidial puede estar encerrada en una estructura somtica compacta denominada estroma . Esporangio es una estructura globosa con una membrana peridial simple, generalmente en el extremo de un esporangiforo, que contiene innumerables esporangiosporas. El pice dilatado del esporangiforo se llama columela . Cuando el esporangio tiene pocas esporas se denomina esporangiolo. Los merosporangios son cilndricos, contienen pocas esporas y estn reunidos sobre la columela o los extremos de las ramas del esporangiforo; si son monosporados suelen ser considerados como conidios. Los zoosporangios de los hongos acuticos o parsitos contienen zoosporas mviles. Conidiosporangio es el zoosporangio inmaduro liberado por algunos hongos.

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4.4. Teleomrficas
Gametas son las clulas diferenciadas que se fusionan y gametangios las estructuras que las producen. Homotlicos son los hongos que forman los gametangios de distinta polaridad en el mismo micelio. Cuando cada micelio da slo gametangios de la misma polaridad, es necesario enfrentar dos micelios distintos del mismo hongo heterotlico para originar las esporas sexuadas. En muchos macromicetos se produce la somatogamia o fusin de clulas no diferenciadas que originan un micelio dicaritico, a veces con una conexin hifal a manera de puente (fbula) entre cada clula. Las oosporas son hipnosporas sexuadas originadas por heterogamia. La estructura femenina u oogonio produce unos elementos grandes inmviles u oosferas que en algunos hongos se fusionan con los anterozoides (zoosporas) producidos en la estructura masculina o anteridio , y en otros se ponen en contacto con el anteridio por medio de los tubos de fertilizacin. Las zigosporas son hipnosporas sexuados formados por isogamia. La hifa emite un mameln en el que se diferencian dos partes: suspensor y gametangio. Los gametangios s e fusionan originando la zigospora que suele estar rodeada por hifas protectoras nacidas de los suspensores. Ascosporas son las esporas sexuadas internas que se originan en un nmero limitado (generalmente 4 u 8) dentro de una clula llamada asco. En las levaduras se fusionan los citoplasmas de dos clulas de polaridad distinta e inmediatamente o mucho despus de la cariogamia ocurre la meiosis formndose las ascosporas dentro del asco libre. En los hongos filamentosos se producen gametangios (anteridio y ascogonio), en general morfolgicamente distintos, y los ncleos pasan a travs del poro formado en el punto de contacto o de un tubo receptivo llamado tricogino . En algunas especies heterotlicas los espermacios , microconidios incapaces de germinar, cumplen la funcin de gametas masculinas. Despus de la fecundacin nacen hifas ascgenas binucleadas cuyas clulas terminales, en forma de cayado, se convierten en ascos. Las hifas somticas vecinas a los elementos sexuales suelen formar un plectnquima originando un ascoma que si est cerrado y es esfrico se llama cleistotecio. Cuando tiene las hifas frtiles (himenio) estratificadas y generalmente una forma de pera, poseyendo en la madurez un poro u ostolo por donde salen las ascosporas, se denomina peritecio. Si el plectnquima tiene forma de copa con el himenio expuesto se habla de

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apotecio. El ascostroma es una estructura con cavidades o lculos que contienen ascos. Los ascos tienen distinta forma segn las especies, pueden ser ssiles o pedicelados, estar organizados en un fascculo comn o nacer independientemente. Con frecuencia hay entre los ascos hifas estriles alargadas llamadas parafises. En el ostolo suele haber hifas cortas como pelos, las perifises. Algunos ascomas tienen hifas ornamentales. La liberacin de los ascos puede ser explosiva o no. En algunos ascos se abre un oprculo en el momento de liberar las esporas. Los ascos bitunicados tienen dos paredes y la externa se rompe, dejando expandirse la interna, antes de la descarga de las ascosporas. Basidiosporas son las esporas sexuadas externas que se originan en el basidio. Este es una clula hifal binucleada que sufre cambios morfolgicos y se llama probasidio al estado o parte de la misma donde se produce la cariogam ia. Se denomina metabasidio a la parte o estado en el cual ocurre la meiosis y forma 4 (a veces 2) tubos pequeos o esterigmas en cada uno de los cuales se forma una basidiospora. Hay dos tipos de metabasidios. El holobasidio es cilndrico o con aspecto de clava y en algunos hongos tiene forma de tenedor. Los fragmobasidios estn divididos generalmente en 4 clulas por septos transversales o longitudinales. En muchos hongos las hifas se agregan para formar un basidioma macroscpico y en aqullos con el himenio expuesto, las basidiosporas estn sobre unas laminillas radiales o tubos o espinas ubicados generalmente en el envs. Algunos basidiomas son como una sombrilla extendida (pleo) sostenida por un pie que a veces tiene un anillo o resto de una membrana que una al pleo con el pie. Otras veces hay en la base una volva o resto de un velo que envolva a todo el basidioma joven. Hay hongos cuyos basidiomas se asemejan a un abanico, en otros son cilndricos, esfricos o coralinos. En el basidioma

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 4 cerrado el peridio envuelve a la gleba frtil y se rompe cuando las esporas estn maduras. En las royas y carbones el probasidio es una espora de pared muy gruesa llamada teliospora o teleutospora , que germina formando un tubo o metabasidio que dar origen a las basidiosporas. En el micelio uninucleado de algunas royas se forma el espermogonio o picnio que da gametas llamadas espermacios o picnosporas y lleva las hifas receptivas en la parte exterior, pero no hay autogamia. Las clulas binucleadas formadas como resultado de la espermatizacin constituyen el estrato basal del ecidio y comienzan a dividirse produciendo cadenas de ecidiosporas. Por germinacin de una ecidiospora surge un micelio binucleado que origina el uredosoro con las uredosporas generalmente de largos pedicelos. stos al germinar dan otra vez un micelio dicaritico que puede formar nuevas uredosporas o bien teleutosporas con clulas binucleadas y paredes gruesas en el teliosoro o teleutosoro. En los carbones el micelio binucleado se forma por fusin de dos clulas compatibles de diverso tipo y constituye un soro de teleutosporas o ustilosporas. Cada una de stas al germinar se convierte en un metabasidio sin esterigmas que origina las basidiosporas o esporidios por brotacin.

Referencias
1. 2. 3. 4. 5. Barnett HL, Hunter BB. Ilustrated Genera of Imperfecti Fungi. APS Press, St. Paul, Minnesota, 1998. Bresinsky A. Plantas Inferiores. pp. 553 -757 en: Denffer Dv, Ehrendorfer F, Bresinsky A, Ziegler H. Strasgurger Tratado de Botnica. Marin, Barcelona,1986. Kirk PM, Cannon PF, David JC, Stalpers JA. Ainsworth & Bisbys Dictionary of the Fungi. 9 ed. CAB International, Wallingford, 2001. Sutton BC. Mitosporic Fungi (Deuteromycetes). pp. 15-55 en: Reynolds DR, Taylor JW, editores.The Fungal Holomorph. CAB International, Wallingford, Oxon, 1993. Webster J. Introduction to Fungi. 2 ed. Cambridge University Press, 1986

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5. Rumen y biogas
La combinacin del reciclado de residuos animales con el cultivo de abonos verdes pueden proporcionar el nitrgeno necesario para la tierra agrcola. El reciclado puede hacerse mediante digestin anaerbica, pues el contenido relativo de nitrgeno es mayor en el estircol digerido que en el fresco. El lodo remanente en el digestor es una alternativa para mejorar los suelos hortcolas (1). Adems este proceso permite obtener metano, un combustible gaseoso. La metanognesis ocurre naturalmente en el rumen de los herbvoros. El aumento del inters popular para contrarrestar la polucin ambiental hace de la digestin anaerbica el medio conveniente para tratar tanto los efluentes lquidos como los desechos slidos, adems de constituir una fuente alternativa de energa.

5.1. Metanognesis
El dixido de carbono es comn en la naturaleza y es un producto importante del metabolismo energtico de los organismos quimioorganotrficos. Los procariotas reductores de CO2 ms importantes son los metangenos, un grupo de arqueobacterias anaerbicas estrictas que emplean generalmente el H2 como donante de electrones (2) . Hay por lo menos diez substratos que se convierten en metano por la accin de uno u otro metangeno, todos los cuales liberan energa adecuada para la sntesis de ATP, incluyendo formiato, acetato, metanol, metilmercaptano y metilamina (3). Se los divide en tres clases: Substratos del tipo CO2 4 H2 + CO 2 CH4 + 2 H2 O 4 HCOO- + 4 H + CH4 + 3 CO2 + 2 H 2 O 4 CO + 2 H 2 O CH4 + 3 CO2 Sustratos con grupo metilo 4 CH 3 OH 3CH4 + CO2 + 2 H 2 O CH3 OH + H 2 CH4 + H2 O 4 CH 3 NH 3 Cl + 2 H2 O 3 CH4 + CO2 +4 NH4 Cl Substrato de acetotrficas CH3 COO - + H2 O CH4 + HCO 3 La conversin de acetato a metano aparece como un proces o ecolgico muy importante en digestores de residuos y en medios anxicos de agua dulce, donde no hay una competencia excesiva por el acetato con otras bacterias. A pesar de que la produccin de metano est muy extendida, son pocos los compuestos de carbono que sirven como precursores directos de la metanognesis. Por lo tanto, es un proceso que depende de la produccin de esos compuestos por otros organismos, a partir de la materia orgnica compleja (2) . En muchos ambientes anxicos los precursores inmediatos del metano son el H2 y el CO2 que se generan por las actividades de los organismos fermentadores. En el proceso general de produccin de metano a partir de la fermentacin de un polisacrido, como la celulosa, pueden intervenir hasta cinco grupos fisiolgicos de procariotas (3) . Las bacterias celulolticas rompen la molcula de celulosa, de peso molecular elevado, en

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 5 celobiosa y glucosa libre. Por accin de los fermentadores primarios, la glucosa origina cidos orgnicos, alcoholes, H 2 y CO2 . Todo el hidrgeno producido es consumido inmediatamente por las bacterias metanognicas, las acetognicas o las reductoras de sulfato si ste se halla en alta concentracin. Adems el acetato puede ser convertido en metano por otros metangenos (2) .

Etapas de la digestin anaerbica Hidrlisis de los polmeros complejos Acidognesis por fermentacin de los monmeros produciendo acetato, propionato, butirato, succinato, alcoholes, H2 y CO2 Acetognesis por fermentacin secundaria generando acetato, H2 , CO2 Metanognesis a partir de H2 , CO2 , acetato Los organismos clave en la conversin de compuestos orgnicos complejos a metano son los fermentadores secundarios, especialmente las bacterias oxidantes de cidos grasos o alcoholes que producen H2 ,. pues utilizan estos compuestos como fuente de energa en cultivos mixtos con un consumidor de H2 a travs de una relacin sintrfica (sintrofia = comiendo juntos). La energa libre asociada a las conversiones de los cidos grasos es positiva, pero si la concentracin de H2 se mantiene muy baja debido al consumo constante por los metangenos pasa a tener signo negativo lo que determina su factibilidad. En la mayora de los ecosistemas anxicos, la acetognesis limita el proceso global porque la velocidad de crecimiento de los microorganismos intervinientes es generalmente muy lenta (3) . Los metangenos estn muy extendidos en la tierra a pesar de su metabolismo especializado. Aunque la produccin de metano se produce en gran cantidad en los ambientes claramente anaerbicos como pantanos, zonas encharcadas o rumen, el proceso tambin se lleva a cabo en lugares como los suelos de bosques o praderas que podran ser considerados aerobios, debido a la formacin de microambientes anxicos en el interior de las partculas de suelo (4). La magnitud de la produccin de metano por las arqueobacterias es superior a la obtenida anualmente de los pozos de gas natural. Las principales fuentes son los eructos de los rumiantes y el gas liberado en las zonas pantanosas. Tambin se lleva a cabo la metanognesis en el intestino de los vertebrados y de los insectos que comen madera como las termitas. Se han encontrado metangenos viviendo como endosimbiontes de amebas y flagelados de vida libre acutica o albergados en el tubo digestivo de invertebrados (3) . La metanognesis se observa con ms frecuencia en los ambientes terrestres y las aguas continentales que en el mar, debido a las proporciones ms bien altas de sulfato presentes en aguas y sedimentos marinos donde las bacterias reductoras de sulfato compiten con las poblaciones metanognicas por el acetato y el H2 disponibles (4). En el ocano los principales precursores de metano son las metilaminas apenas utilizadas por los reductores de sulfato, como la trimetilamina que es un producto importante de excrecin en los animales marinos (3) .

5.2. Arqueobacterias metanognicas


Se clasifica a las metanobacterias en siete grupos principales que comprenden un total de 17 gneros. Hay bacilos cortos y largos, cocos con variada ordenacin, clulas en forma de placas y metangenos filamentosos. Unos son Gram positivos, otros Gram negativos (5) .

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Cuando los metangenos crecen de forma autotrfica, el CO2 es la principal fuente de carbono, sin embargo el crecimiento de casi todos ellos es estimulado por el acetato y en algunas especies por ciertos aminocidos. En cultivos de laboratorio algunos metangenos del rumen necesitan de una mezcla de cidos grasos (3) . Todos los metangenos utilizan NH + como fuente de nitrgeno y algunas especies fijan N2 (Methanosarcina, Methanococcus). El nquel es un componente de una coenzima metanognica y est adems presente en las enzimas hidrogenasa y COdeshidrogenasa. Estos organismos tambin requieren hierro y cobalto para su crecimiento. Tienen algunas coenzimas exclusivas que son portadoras de C1 o intervienen en las reacciones de xido-reduccin como donadores de electrones (2) . La reduccin del CO 2 por lo general depende del H2 , pero el formiato, el CO e incluso el Fe sirven como donadores de electrones. El Fe es oxidado a Fe++ y los electrones liberados se combinan con los protones para formar H 2 , que es el donador inmediato en la metanognesis. Tambin los alcoholes pueden aportar electrones en unos pocos casos (2). En condiciones normales la variacin de energa libre durante la reduccin de CO2 a metano con H2 es -131 kJ/mol, pero debido a la influencia de la concentracin de los reactantes en los ambientes naturales baja a cerca de -30 kJ/mol. La concentracin de H 2 en las zonas meta nognicas no es mayor a 10 mM (3) . La etapa terminal de la metanognesis es la de conservacin de la energa. La reduccin est asociada con la extrusin de protones a travs de la membrana, creando una fuerza motriz de protones. La utilizacin del gradiente de protones mediante una ATPasa integrada a la membrana, impulsa la sntesis de ATP (2). Las metanobacterias autotrficas convierten el CO2 en material celular a travs de la va del acetil-CoA utilizada tambin por las bacterias homoacetognicas y las reductoras de sulfato, pero a diferencia de estas ltimas los metangenos integran las vas biosinttica y bioenergtica porque comparten intermediarios comunes. Las reacciones de la va del acetil-CoA tambin estn estrechamente relacionadas con la produccin de metano a partir de compuestos de metilo o acetato. El crecimiento de metanobacterias sobre compuestos de metilo tambin est ligado a la bomba de protones para la sntesis de ATP, pero en ausencia de H2 la generacin de los electrones necesarios requiere que alguno de los substratos se oxide. Esto se produce por una bomba de sodio ligada a la membrana citoplasmtica, que establece un gradiente de sodio a travs de la misma y conduce a la oxidacin de grupos metilo a CO2 (3) .

5.3. Rumen
Los rumiantes son mamferos herbvoros que poseen un rgano especial en cuyo interior se lleva a cabo la digestin de celulosa y otros polisacridos mediante la actividad microbiana, porque estos animales carecen de las enzimas necesarias para digerirlos. El rumen tiene un tamao relativamente grande, con una capacidad de 100 a 150 litros en una vaca o 6 litros en una oveja, y se encuentra a una temperatura y acidez constantes (39C, pH 6,5). La naturaleza anxica del rumen es un factor significativo

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 5 para su funcionamiento (2) . El forraje llega al rumen o panza, mezclado con la saliva que contiene bicarbonato y all es sometido a un movimiento rotatorio durante el cual ocurren las fermentaciones. Esta accin peristltica facilita la adherencia microbiana al material celulsico suspendido (3) .

Figura 5.1. Digestin anaerbica en el rumen (3)

El alimento permanece en el rumen de nueve a doce horas. El fluido ruminal contiene gran cantidad de clulas, entre ellas 1010 a 1011 bacterias /mL. Las bacterias y los hongos celulolticos actan produciendo el disacrido celobiosa y glucosa. sta experimenta una accin bacteriana en la que se forman principalmente los cidos actico, propinico y butrico, dixido de carbono y metano (figura 1). Los cidos grasos atraviesan la pared del rumen y pasan a la sangre. Desde all van a los tejidos donde son utilizados como la principal fuente de energa. Adems los microorganismos del rumen sintetizan aminocidos y vitaminas esenciales para el animal (3) . La masa de forraje pasa gradualmente a la redecilla donde se forman unas porciones llamadas rumias que regresan a la boca y son masticadas otra vez. Cuando esta masa slida queda bien fragmentada es engullida de nuevo pero pasa directamente al libro y termina en el cuajar, donde las condiciones son cidas y all se inicia un proceso digestivo que continua en el intestino. Muchas de las clulas microbianas formadas en el rumen son digeridas y constituyen la principal fuente de protenas y vitaminas del animal, dado que la pastura es un alimento deficiente en protenas (3) . Las reacciones qumicas que ocurren en el rumen requieren la actividad combinada de una variedad de microorganismos entre los que predominan las bacterias anerobias estrictas, dado que el potencial de reduccin es de -0,4 V. La concentracin de O2 a ese potencial es 10-22 M. Fibrobacter y Ruminococcus son las bacterias celulolticas ms abundantes del rumen, pero tambin degradan xilano. Fibrobacter posee una celulasa periplsmica (entre la membrana citoplasmtica y la membrana externa) por lo que debe permanecer adherido a la fibrilla de celulosa mientras la digiere, en cambio Ruminococcus produce una celulasa que es secretada. Los Ruminobacter y Succinomonas amilolticos se encuentran en minora, as como Lachnospira que digiere pectinas. Los productos de fermentacin de estas y otras bacterias son utilizados por otros microorganismos. El succinato se convierte en propionato y CO2 , y el lactato es fermentado a acetato y otros cidos por Megasphera y Selenomonas (3). El H2 producido en el rumen durante los procesos fermentativos nunca se acumula, ya que es utilizado rpidamente por los metangenos (Methanobrevibacter, Methanomicrobium ) para reducir CO2 a CH 4 . Otra fuente de H2 y CO2 es el formiato. La

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composicin media de los gases acumulados en el rumen es aproximadamente 65% CO2 y 35% CH4 , y se expulsan al exterior por los eructos del animal. El acetato no llega a convertirse en metano dentro del rumen debido a que el tiempo de retencin es demasiado corto para que puedan desarrollarse los organismos acetotrficos y adems las bacterias sintrficas degradadoras de cidos grasos no abundan. Los cidos atraviesan la pared del rumen hacia la sangre del animal (2) . El contenido ruminal posee aproximadamente 10 6 protozoos /mL, principalmente ciliados. Muchos son anaerobios obligados, una caracterstica poco frecuente entre los organismos eucariticos. Los protozoos comen bacterias y ejercen algn control sobre densidad de las mismas en el rumen. Tambin hay hongos anaerbicos que alternan una forma flagelada y otra inmvil. Degradan celulosa, hemicelulosas, pectinas y parcialmente lignina (2) . Las condiciones ambientales del rumen son constantes para cada tipo de alimentacin. El cambio brusco de pasturas a cereales conduce a un desequilibrio en la composicin microbiana que causa enfermedad o an la muerte del animal, por el crecimiento explosivo de Streptococcus bovis que hidroliza almidn produciendo abundante cido lctico y acidificando el rumen. Esta acidosis causa la eliminacin de la microbiota normal (5) .

5.4. Digestores anaerbicos


Para producir biogas se pueden emplearse diversos materiales orgnicos tales como residuos vegetales, estircol, basura domstica, camalotes, algas, efluentes de las industrias de alimentos, bebidas, pulpado y papel, y qumicas (6) . Durante la bioconversin de materiales orgnicos a metano las distintas etapas tienen distinta velocidad: la degradacin de la celulosa ocurre en semanas, la de las hemicelulosas y protenas en das y la de las molculas pequeas, como azcares, cidos grasos y alcoholes, en horas, pero la lignina no es degradada en la mayora de los sistemas de digestin anaerbica (7). El proceso en un digestor difiere de otros tipos de fermentaciones en que no es necesario utilizar cultivos puros de microorganismos. Las diversas bacterias capaces de descomponer las sustancias orgnicas y producir biogs estn ampliamente distribudas en la naturaleza. Se encuentran, por ejemplo en los excrementos animales y humanos. Estas bacterias pueden activarse y mantenerse indefinidamente con un manejo adecuado (8). El tamao del digestor est determinado por el contenido de slidos y el tiempo de retencin del residuo para un tipo de carga dado. Los materiales insolubles, tales como papel, paja y otros lignocelulsicos, pueden requerir un tratamiento de das (o an aos en ciertos rellenos sanitarios) mientras que puede lograrse hasta una reduccin del 95% con una carga diaria de 20 kg / m3 de digestor cuando el residuo es soluble
(5).

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 5 Hay una amplia variedad de diseos pero los digestores de una sola etapa con campana fija o flotante (figuras 2 y 3) son los ms usados en ambientes rurales. El estircol digerido es recuperado como un lodo con 10 a 12% de slidos y un sobrenadante con 2 a 3% de slidos. La digestin ruminal est estratificada en dos sub-fases una lquida, y otra con alto contenido en slidos donde es mayor la actividad metablica y la concentracin de intermediarios. Similarmente los digestores de dos fases tienen un mejor rendimiento en metano que los de una sola (9) . El digestor de campana fija cuyo esquema se muestra en la figura 3, tiene la cubierta inmvil y cuenta con la presin hidrosttica autogenerada para distribuir el biogs. Como se colecta el gas en el mismo digestor, parte de la suspensin digerida es desplazada hacia un tanque de almacenamiento cuyo nivel sube con la produccin y baja con el uso del gas. La ventaja de este modelo consiste la ausencia de partes mviles corrobles (10) . En la figura 2 se da el esquema de un digestor con campana colectora de gas flotante, que puede estar directamente sumergida en la suspensin o bien en el aceite retenido entre las dos paredes concntricas del tanque para lograr el sellado. La descarga del lquido se hace por rebalse a travs de un cao y la de slidos por una abertura de inspeccin. La presin del gas depende del peso de la campana, por lo que suele colocarse bolsas de arena sobre la misma (6) . El digestor tipo bolsa que se muestra en la figura 4, es til en las regiones subtropicales y tropicales (11). Otros tipos de reactores permiten el manejo de grandes cantidades de residuos por unidad de volumen generando biogas a mayor velocidad, como el de contacto anaerbico (figura 5) (12) .

5.5. Residuos
Los materiales que se pueden usar para la generacin de metano son muy variados, por ejemplo: residuos de cosechas: maloja de caa de azcar, malezas, paja, rastrojo de mz y otros cultivos; residuos de origen animal: desechos de establos (estircol, orina, paja de camas), camas de gallinas ponedoras, boigas de cabras y ovejas, desperdicios de matadero (sangre, vsceras), desperdicios de pesca, restos de lana y cuero; residuos de origen humano: basura, heces, orina; residuos agroindustriales: tortas de oleaginosas, bagazo, salvado de arroz, desechos de tabaco y semillas, desperdicios del procesamiento de hortalizas y frutas, limos de prensas de ingenios azucareros, residuos de t, polvo de las desmotadoras e industria textil; mantillo forestal: ramitas, hojas, cortezas; plantas acuticas: camalote, algas marinas (14).

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La DQO es la cantidad total de oxgeno (en mg) necesaria para oxidar completamente las substancias orgnicas e inorgnicas contenidas e n un litro de suspensin y se emplea como medida indirecta de la cantidad de substrato transformable. Otra manera de expresar la cantidad de substrato disponible es mediante los valores de slidos totales (ST) que es el material remanente despus de evaporar a 103-105C o de slidos voltiles (SV) que es el material orgnico descompuesto a 550 + 50C (13) . Otro parmetro de la digestibilidad de los residuos es la demanda biolgica de oxgeno (DBO) que es el consumo de oxgeno, en mg/L de suspensin, d urante la degradacin por microorganismos durante 5 das a 20C. Tanto la DBO como la DQO son proporcionales al contenido de materia orgnica en la suspensin a degradar, pero la primera es ms representativa de la degradabilidad de la misma. Tambin puede usarse el valor de carbono orgnico total (COT) que se obtiene midiendo el CO 2 formado en la combustin (8) . En el cuadro siguiente se muestra la digestibilidad de algunos vegetales expresada como el % de slidos voltiles desaparecidos luego de una i ncubacin de 48 hs con lquido ruminal diludo en buffer fosfato-bicarbonato a 39C y otras 48 hs con pepsinaHCl, a igual temperatura para hidrolizar parcialmente las protenas de los microorganismos y del sustrato (7). Digestibilidad de algunos vegetales (7) Slidos voltiles totales Slidos voltiles digeridos % peso seco % SVT 43,3 - 99,3 15,0 - 87,0 54,6 89,8 33,5 93,8 69,0 97,7 41,0 98,7 69,7 88,1 12,0 80,1 19,7 74,5 21,0 83,4

Material Gramneas Brassica sp. Batatas Camalotes Algas marinas

La digestin anaerbica de madera no es tcnicamente factible sin algn tipo de pretratamiento que aumente su biodegradabilidad (5). En el recuadro siguiente se muestra la relacin C/N de varios materiales residuales. Contenido de nitrgeno y relacin C/N en varios residuos (14) C/N %N vegetales C/N Heno 12 5,1 6,5-10 Amaranto 11 2 7-10 Alfalfa 16-20 0,8 15-18 Paja 48 3 10-14 Algas marinas 19 25 2,3 Restos de lino 58 18 1,7 Paja de trigo 128 14 2,15 Aserrn 511 6-10 5,5-6,5 domsticos basura 25 peladura papas 25

animales Desperdicios de pescado de matadero Orina Sangre Estircol equino Estircol vacuno Estircol de corral Heces humanas .

%N 4 3,6 2,4-3 1,1 1,9 1,0 0,3 0,1 2,2 1,5

Una relacin carbono/nitrgeno de 16/1 se considera ptima para una buena produccin de gas y para una fermentacin estable de los excrementos animales (8), aunque puede obtenerse biogs a valores mayores no se debe superar la relacin 30/1 (14). A continuacin se indican algunas caractersticas de las deyecciones animales.

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 5 Caractersticas de excrementos animales (8) Kg/100kg peso vivo/da Peso Slidos Slidos hmedo totales voltiles 4,6 0,70 0,65 5,1 0,69 0,57 6,6 1,67 1,22 3,6 1,07 0,91 9,4 0,89 0,72

N total 0,055 0,039 0,099 0,043 0,036

Bovinos de carne Cerdos Gallinas ponedoras Ovinos Vacas lecheras

Los volmenes de gas producido suelen expresarse como m3 biogas/m3 digestor o como m3 biogas/kg DQO o DBO y difieren segn el tipo de residuo, la concentracin de slidos voltiles, la relacin carga/volumen del digestor, el tiempo de retencin de los residuos dentro del digestor y el diseo del mismo. En general la produccin oscila entre 1 y 5 m3 biogas/m3 digestor, o dicho de otra manera entre 0,3 y 0,5 m3 /kg SV (6) .

5.6. Caractersticas del biogas


El cuadro siguiente resume la composicin promedio del biogas segn la fuente. El valor calorfico vara entre 17 y 34 MJ/m3 segn el contenido de metano. Composicin del biogas derivado de diversas fuentes (6). Desechos Lodos Desechos Rellenos agrcolas cloacales industriales sanitarios 50 - 80% 50 - 80% 50 - 70% 45 - 65% 30 - 50% 20 - 50% 30 - 50% 34 - 55% saturacin saturacin saturacin saturacin 0 - 2% 0 - 5% 0 - 2% 0 - 1% 100 - 7000ppm 0 - 1% 0 - 8% 0,5 - 100ppm trazas trazas trazas trazas 0 - 1% 0 - 1% 0 - 1% trazas 0 - 1% 0 - 3% 0 - 1% 0 - 20% 0 - 1% 0 - 1% 0 - 1% 0 - 5% trazas trazas trazas 5ppm

Gases Metano CO2 Vapor agua Hidrgeno H2S Amonaco CO Nitrgeno Oxgeno Orgnicos

Propiedades combustible cido, asfixiante corrosivo combustible corrosivo,olor,txico corrosivo txico inerte corrosivo corrosivos,olores

La condensacin del vapor es con frecuencia un problema debido a que el biogas est generalmente ms tibio que las caeras por donde pasa. Es esencial una trampa de agua y puntos de drenaje en la tubera (14) . El hidrgeno es un intermediario en el metabolismo anaerbico y algunas bacterias pueden producir trazas de CO. La presencia de nitrgeno y/u oxgeno puede indicar una entrada accidental de aire y esto constituye un grave peligro debido al riesgo de explosiones. El oxgeno es consumido por los microorganismos facultativos dejando el nitrgeno residual (6) . Tanto el azufre orgnico, presente por ejemplo en algunos aminocidos, y el inorgnico pueden ser reducidos a H 2 S, un gas muy txico y altamente reactivo con los metales tales como hierro y cobre, originando la corrosin. Esta reactividad hace que su contenido sea muy bajo en el gas de los rellenos sanitarios. Por otra parte el amonio liberado por ejemplo durante la desaminacin de las protenas, permanece en solucin (14).

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5.7. Factores ambientales


Entre los factores ambientales importantes para el funcionamiento de los digestores figuran: la temperatura, la concentracin de slidos, la concentracin de cidos voltiles, la formacin de espuma, la concentracin de nutrientes esenciales, las substancias txicas y el pH (8) . Las metanobacterias slo pueden multiplicarse cuando est avanzada la fermentacin de los substratos primarios por accin de las bacterias anaerobias facultativas (por ejemplo Escherichia, Enterobacter, Klebsiella o Bacillus spp.) y se haya consumido todo el oxgeno disuelto, de manera que el potencial redox haya alcanzado en un valor menor que -200 mV. Adems, el pH no debe bajar demasiado, debido a los cidos producidos por los Clostridium , para no inhibir el crecimiento de los metangenos (15) . Comnmente la concentracin de cidos grasos voltiles no supera los 2 a 3 g/L, expresados como cido actico. Si se sobrepasa este nivel, la digestin cesar en dos o tres das debido a que los metangenos no pueden utilizar los cidos a la misma velocidad con que se producen (8) . El pH ptimo para la digestin est entre 7,0 y 7,2, aunque el rango satisfactorio va de 6,6 a 7,6. La digestin comienza a inhibirse a pH 6,5 (14). Una vez que se ha estabilizado un digestor el lodo est bien amortiguado, es decir la concentracin de protones no vara an cuando se aadan cantidades relativamente grandes de cido o lcali. Si esta capacidad de amortiguacin se destruye y el pH disminuye cesa la metanognesis (8). El CO2 es soluble en agua y reacciona con los iones hidroxilo para formar bicarbonato. La concentracin de HCO 3 -- es afectada por la temperatura, el pH y la presencia de otros materiales en la fase lquida. Las condiciones que favorecen la produccin de bicarbonato aumentarn a su vez el porcentaje de metano en la fase gaseosa (14). La gama de temperatura para la digestin anaerbica tiene dos zonas ptimas una mesfila (30 - 40C) y otra termfila (45 - 60C). Casi todos los digestores funcionan dentro de los lmites de temperaturas mesfilas y la digestin ptima se obtiene a unos 35C. La velocidad de digestin a temperaturas superiores a 45C es mayor que a temperaturas ms bajas, sin embargo las bacterias son sumamente sensibles a los cambios ambientales especialmente una disminucin repentina de slo unos pocos grados (8). En la figura 6 se ven las relaciones tpicas que existen entre la produccin de gas y la temperatura con diferentes tiemp os de retencin. Por ejemplo, en un digestor donde los residuos permanecen 12 das, la produccin de gas por unidad de slidos voltiles totales aadidos diariamente, es 20% mayor a 45C que a 35C. En los climas clidos, donde no existen temperaturas de congelacin, los digestores pueden funcionar sin aadir calor pero hay que aumentar en cambio el tiempo de retencin. La regulacin de la temperatura puede lograrse haciendo circular agua caliente a travs del tanque por medio de termointercambiadores (8) . Las causas principales de una excesiva produccin de cidos voltiles son la elevada velocidad de carga, una baja temperatura y la formacin de espuma que constituye una zona favorable para los acetgenos. La sedimentacin

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 5 de los materiales fibrosos y la espuma se puede evitar mezclando el contenido del digestor (14) . Para una digestin ptima, tienen que estar presentes todos los elementos esenciales en forma fcil de asimilar por las bacterias. Se han logrado resultados satisfactorios con concentraciones mayores a 15% de slidos, sin embargo en la prctica la gama es de 3 a 10% (8) . Los requerimientos nutritivos de DBO : nitrgeno : fsforo en la digestin anaerbica estn en la relacin 700 : 5 : 1. Solo los estircoles estn nutricionalmente balanceadas. Adems para el crecimiento ptimo de los metangenos es necesario la presencia de cuatro elementos en concentraciones muy bajas: Fe 2nM, Co 10 nM, Ni 100 nM y Mo 10 nM (6). Los antibiticos empleados en las explotaciones pecuarias llegan a los excrementos pero, como ocurre tambin con los antihelmnticos, no suelen afectar mayormente la digestin debido a la dilucin con materiales no txicos. Los metangenos son sensibles a los antibiticos que afectan la sntesis de protenas o lpidos y a los interfieren con la funcin de la membrana citoplasmtica. La concentracin de nitrgeno amoniacal debe ser inferior a 1,5 g/L si es mayor, como suele ocurrir con la gallinaza, resulta txico. Si bien es un amortiguador, su aumento puede llegar a impedir el proceso de digestin. Tambin son txicas las sales de zinc, cobre y nquel, aunque este ltimo es necesario en nfimas cantidades. Las sales de los elementos alcalinos y alcalino-trreos pueden se estimulantes o inhibitorias segn la concentracin como se observa en el cuadro siguiente (14). Efecto de la concentracin de algunos cationes Concentracin g/L estimulante inhibitoria 0,1 0,2 3,5 5,5 0,2 0,4 2,5 4,5 0,1 0,2 2,5 4,5 0,075 0,15 1,0 1,5
(14)

Catin Sodio Potasio Calcio Magnesio

muy inhibitoria 8,0 12,0 8,0 3,0

Los desinfectantes clorados son muy txicos an a bajas concentraciones (<1 mg/L) pero son rpidamente absorbidos por los slidos e inactivados. La mayora de los detergentes sintticos son degradados fcilmente pero si la concentracin es mayor que 20 mg/L pueden afectar la digestin. Los compuestos de amonio cuaternario son persistentes y txicos a bajas concentraciones (1mg/L). Los solventes clorados y derivados son txicos en concentraciones de 1 mg/L. La toxicidad de los sulfatos se manifiesta a concentraciones mayores que 1 g/L y la inhibicin total ocurre por sobre 4,5 g/L (6).

5.8. Criterios de diseo y construccin


El principal objetivo del diseo de un digestor es alcanzar un alto contenido de biomasa dentro del mismo que permita una alta produccin de biogas y una alta reduccin de la materia orgnica por unidad de volumen del digestor. Antes de comenzar la construccin de cualquier modelo, se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: La instalacin y mantenimiento debe ser socialmente aconsejable, tcnicamente posible y econmicamente justificable. El biogas substituir a la lea, el carbn o algn derivado del petrleo y la digestin contribuir a reducir la polucin, proveyendo adems un biofertilizante. El modelo elegido debe ser el conveniente para las condiciones climticas locales.

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El proyecto debe ser elaborado segn la materia prima disponible y la demanda de biogas diaria. Tambin hay que tener en cuenta la existencia de otras fuentes alternativas de energa en la propiedad. La localizacin ser la apropiada segn la distancia de los puntos de consumo, la ubicacin de los residuos y la fuente de agua, la topografa del terreno, la textura del suelo y el nivel fretico (16) . Las consideraciones dependientes del tamao para el diseo de una planta de biogs en reas rurales incluyen: la cantidad y el tipo de desperdicios disponibles, las dimensiones de los trozos o partculas, el requerimiento de calefaccin, la necesidad de agitacin, la disponibilidad de materiales de construccin (14) . Bajo condiciones ambientales ptimas para la digestin, la cantidad de gas producido es proporcional a la cantidad de residuos agregados. Los materiales que pueden ser degradados fcilmente se estabilizarn ms rpido que los resistentes, necesitando un tiempo de retencin ms corto y un digestor de menor tamao. Las partculas pequeas son mejor fermentadas que los trozos gruesos, por lo que se debe picar bien los materiales tales como paja, virutas, hojas, bagazo antes de agregarlos, para que la suspensin fluya uniformemente evitando el taponamiento de las caeras de carga y descarga, y reduciendo la formacin de espuma (8). Cuando las condiciones climticas lo exigen, se debe calentar el digestor para reducir el tiempo de retencin y a su vez el tamao del mismo. Pero este paso requiere emplear parte del gas producido, disminuyendo la cantidad aprovechable para uso domstico, y aadiendo un costo de instalacin y operacin (14). El volumen del digestor est dado por el volumen de la suspensin de los desperdicios agregados multiplicado por el tiempo de retencin conveniente segn el tipo y el tamao de los desperdicios y la temperatura de operacin. El volumen de un digestor de campana flotante est dado por la siguiente frmula (17): V = [C * R (1+D) tF ]/(Y * d) donde:

C es la capacidad deseada en biogas por da,

R es la relacin estircol hmedo/estircol seco, commnente 5, D es el peso de agua aadida a cada unidad de peso de estircol, tF es el tiempo de fermentacin en das, Y es el gas producido por unidad de peso de estircol seco,
d es la densidad de la mezcla estircol-agua. El volumen del digestor V es proporcional a la relacin tF/Y, por lo que un aumento en la temperatura de fermentacin, dentro de cierto rango, aumenta el rendimiento del gas Y , permitiendo reducir el tiempo de retencin tF o disminuir V (11). 3 /da, R=5, D=1,25; tF=30 das, Y=0,2 m 3 /kg, d=1102 kg/m3 , Por ejemplo, si C=2,8 m 3 el volumen del digestor sera 4,3 m . Sin embargo, suele ser sobredimensionado en un 40% (17). El mezclado influye tanto como el tamao de las partculas, pues expone nuevas superficies a la accin bacteriana y previene la disminucin de sta por agotamiento puntual de los nutrientes o acumulacin de metabolitos. Generalmente no es necesario agitar el contenido de los digestores domsticos cuando el tiempo de digestin es largo (50-60 das), aunque suele ser conveniente incorporar un agitador (18) . La provisin de agua para los digestores es otro punto a tener en cuenta, por ejemplo sobre la base de una relacin estircol hmedo/estircol seco de 5 : 1 y de una relacin estircol hmedo/agua de 4 : 5, se necesita 62,5 litros de agua diarios cada 10 kg de estircol seco. Pero, la fraccin lquida podra ser reciclada en aquellos casos en que el agua es escasa. Por otra parte, la reduccin de la relacin agua/estircol a la mitad ocasiona una disminucin del 40% en la produccin de gas. Sin embargo, cuando la

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 5 temperatura de operacin se eleva, por ejemplo de 15 a 27C, aumenta la cantidad de gas en 100%, por lo que es posible disminuir la cantidad de agua en los climas clidos permitiendo un rendimiento aceptable del biogs (17) . Se puede estimar la demanda mxima de biogas suponiendo las necesidades durante cada hora del da para planificar el tamao de la campana flotante, pero en general se considera conveniente no sobrepasar el volumen del gas producido diariamente. La corrosin es un problema serio por la exposicin constante de las partes metlicas al sulfuro de hidrgeno y los cidos orgnicos, que ya estn en el material o se forman durante la fermentacin, por lo tanto se deben cubrir con una pintura resistente (15). La ubicacin de la zona de operacin del digestor debe ser tal que no contamine la napa de agua, debido a la permeabilidad del suelo. Las plantas de biogas con alimentacin discontnua se construyen cuando es difcil de obtener los materiales diariamente, por ejemplo s e utilizan para fermentar material vegetal grueso, tal como tallos de maz o bagazo de caa de azcar. A las dos semanas de carga comienza la produccin de biogas y contina por unos tres meses. Cuando cesa, se abre el digestor y se limpia. La suspensin remanente se extiende sobre tierras de cultivo como fertilizante. En los casos que se usa este sistema suele haber al menos dos digestores, de modo que al menos uno est en operacin (8) . En los digestores con excrementos animales es necesario remover peridicamente la capa de espuma. Por otra parte, en los modelos en que la carga es horizontal (tipo flujotapn) como el de bolsa, suele haber menos problemas de formacin de espuma que cuando es vertical (9). Para establecer el potencial en biogas de un pequeo pueblo rural es necesario tener informacin exacta sobre el nmero de habitantes, la cantidad de ganado, la produccin diaria de estircol y heces, la eficiencia en la recoleccin de los desechos, la disponibilidad de agua, el rendimiento terico de gas por unidad de peso de estircol y heces, la disponibilidad de residuos celulsicos fermentables, etc. (17). La produccin diaria posible de biogas se calcula mediante la siguiente frmula: donde:

P = NA* XA * YA + NP* XP * YP + P R* Y R NA es la cantidad de animales,

NP la poblacin humana, X A y X P el promedio diario de estircol y heces por animal y por persona, Y A y Y P el rendimiento de gas por unidad de peso de estircol y heces, P R el peso total diario de otros residuos disponibles, Y R el rendimiento de gas por unidad de peso de los otros residuos disponibles (17) .
Algunos parmetros en la ecuacin anterior varan drsticamente de una regin a otra, por ejemplo X A depende del tamao promedio del ganado y PR es siempre diferente. Estos detalles son vitales para tomar las decisiones econmicas y hacer el diseo de la planta de biogas. Se supone un pueblo rural de 500 habitantes con 100 casas y 250 vacunos. Se considera que el valor promedio de estircol seco es de 3,2 kg por animal por da, por lo que se espera un rendimiento de 800 kg de estircol seco por da. Es razonable pensar que el 75% de este material puede ser recogido o sea 600 kg. El rendimiento de biogas a partir de la fermentacin del estircol es de 0,187 m3 /kg a 15C y 0,374 m3 /kg a 27C, por lo tanto en el pueblo se puede generar en invierno 112 m3 de biogas por da. Dado que las casas estn ms o menos alejadas una de otra, conviene que cada una tenga su propio digestor al que se conecta la letrina. Se producir en total 14 m3 de biogas por da sobre la base de 0,028 m3 /persona/da. La produccin total de biogas en el pueblo proveniente de estircol vacuno y heces suma 126 m3 /da, sin contar el que se puede

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obtener de residuos celulsicos, gallinaza, desechos de criaderos de cerdos y conejos, restos de matadero, etc. (17).

5.9. Operacin
Cantidades de diversos materiales para cargar un digestor (17, 19) kg/da necesarios para producir 1,0 3,5 m3 biogas/da pasto seco 1,6 5,6 paja de maz seca 1,2 4,3 cscarillade arroz seca 1,6 5,6 camalote seco 5,3 18,6 camalote hmedo 106 372 estircol de cerdos 13 44 estircol de gallinas 16 56 estircol de vacunos (25C) 28 98 (verano, aire a 30C) 12 41 (invierno, aire a 14C) 31 110 Caractersticas de la suspensin de estircol para cargar el digestor (20) Vacas Lecheras Cerdos Promedio (rango) Unidades Promedio (mg/L) Slidos totales 15,4 (12,9 19,8) % estircol 1700 Slidos voltiles 86,1 (76,7 91,8) % slidos totales 1000 DQO total 149 (81 284) g/L 1400 DBO5 total 16,1 (8,6 21,5) g/L 725 DBO5 soluble 9,3 (4,6 14,4) g/L COT 680 pH 6,2 (5,2 6,8) unidades Nitrgeno total 2,8 (2,6 2,9) % slidos totales 200 Amonio 100 Nitrato 1 Fsforo soluble 0,25 (0,17 0,32) % slidos totales Fosfato total 85 Potasio total (0,5 5) % slidos totales Estircol de En los recuadros anteriores se indican los requerimientos diarios de algunos residuos para alimentar al digestor y las caractersticas del estircol diludo de vacas lecheras y de cerdos. La carga inicial requiere una gran cantidad de materia prima que conviene reunirla mientras se es construyendo el digestor. Dado que ya sufre una transformacin antes de ser introducida se debe controlar el pH, as como asegurar el agregado de estircol vacuno fresco u otro material que contenga los microorganismos necesarios, por ejemplo lodo de un diges tor de aguas cloacales. El xito de un digestor depende de la radicacin y mantenimiento de los organismos acidificantes y metanognicos en forma equilibrada. Si el digestor acumula cidos voltiles como resultado de una sobrecarga, la situacin puede corregirse por la resiembra de organismos, la suspensin temporaria de la alimentacin o el agregado de cal (16) . La temperatura tiene un significativo efecto sobre la digestin anaerbica de los materiales orgnicos. Los digestores enterrados aprovechan l as propiedades aislantes del suelo que los rodea. Pero en caso de los construdos sobre el suelo deben estar

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 5 rodeados de anillos de hojas, aserrn o paja, los que generarn calor durante el compostaje. Una vez transformados los materiales de estos anillos deben ser cambiados por residuos frescos. El material compostado an podra contribuir a la mezcla de alimentacin del digestor (14) . El rendimiento promedio en China, durante el verano, es de 0,2 m3 de gas por da por m3 del digestor mientras que en Sri Lanka aumenta a 0,5 m3 de biogs diarios por m3 del digestor (19). El operario que maneje diariamente el digestor deber estar adiestrado en la tarea y poseer las instrucciones escritas. Entre las actividades diarias estarn las de tomar la temperatura ambiente y del agua, reunir y homogeneizar el material de la carga, reciclar el efluente, apreciar el olor y la presencia de insectos, y semanalmente controlar y corregir el pH. Tambin controlar la seguridad en el uso del biogas. Identificar prdidas, registrar la presin del gas, examinar los puntos de consumo, drenar el agua del tubo de gas, verificar el nivel de lquido del manmetro (16) . Pueden usarse varios mtodos para el mezclado de los diversos materiales que se usan para cargar un diges tor: mediante la carga diaria, por manipulacin de los dispositivos de entrada y salida de manera que las operaciones de alimentacin y descarga favorezcan el mezclado, por instalacin de dispositivos de mezclado que puedan ser operados manualmente, introduciendo la suspensin como un chorro, haciendo entrar la suspensin como un chorro tangencial al contenido del digestor. Si no se hace agitacin se puede reducir la estratificacin usando un digestor de desplazamiento horizontal (14) . El efluente se retira con baldes o por drenaje en un terreno desnivelado. Puede ser usado directamente como fertilizante o bien secado para tener un abono slido (16) . La velocidad de la degradacin de un material orgnico refleja la interaccin de la cantidad de biomasa microbiana activa por unidad de volumen y dicho material disponible para los microorganismos. La carga diaria para un digestor de estircol vacuno es de alrededor de 6,5 kg slidos voltiles por m3 (9) . De la frmula empleada para el clculo del volumen del digestor, puede obtenerse la velocidad de carga L: En el ejemplo dado, L=3,25 kg/m3 * da, o sea se agregara en total 14 kg de estircol seco por da (17) . Los digestores cargados a razn de 0,2-0,5 kg SVT/m3 por da, generalmente sin agitacin, corresponden a las pequeas instalaciones para granjas cuyo tamao medio es de 10 m3 . Cuando la carga es mayor que 0,5 kg SVT/m3 da se requiere un mezclado al menos intermitente y una supervisin mayor que los anteriores (8).

L = d/[R (1+D) tF] = C / (Y * V)

5.10. Seguridad
Adems de gas, la digestin anaerbica genera un efluente que, segn los slidos residuales y el contenido en nitrgeno o en agua, puede ser usado como abono o para riego. Por otra parte juega un papel importante en el control de los olores de los residuos en las granjas o las tierras de relleno. La digestin mesoflica mata organismos patgenos tales como Salmonella y ciertos enterovirus durante un tiempo de retencin de 20-30 das. Sin embargo, algunos parvovirus sobreviven an en el rango termoflico. Tambin la infectividad de los huevos de Taenia saginata es reducida en gran medida pero sobreviven los huevos de Ancylostoma sp. y Ascaris suum, aunque stos desaparecen en el rango termoflico (6) .

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 5 Desaparicin de microorganismos entricos durante la digestin anaerbica (14) Organismos Temperatura Tiempo de residencia desaparicin C das % Salmonella spp. 22 37 6 20 82 96 Salmonella typhi 22 37 6 99 Mycobacterium bovis 30 100 Poliovirus 35 2 98,5 Quistes de protozoos 30 10 100 Ascaris sp. 29 15 90

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Independientemente del tamao del digestor, es necesario colocar un manmetro de agua. Si la presin es negativa por haberse retirado ms efluente que la alimentacin agregada, no se debe abrir los puntos de consumo de gas para evitar la llegada de aire al interior. Adems se debe intercalar un arrestallamas en la caera. Como el metano es explosivo cuando est mezclado con 5-15% v/v de aire, la primera cantidad de gas producido debe ser venteada pues generalmente est mezclada con aire. Luego slo habr biogs en la cpula fija o campana mvil del digestor. Por otra parte cuando se detiene un digestor para retirar los lodos se debe ventilar bien el interior pues el biogs es asfixiante (18) . El cierre de agua de la cubierta mvil se puede romper cuando la alimentacin del digestor es excesiva o la extraccin del gas es demasiado lenta. El vaco se crea cuando la extraccin del gas es muy rpida. La vlvula de seguridad consta de arandelas de peso calibrado que debe igualar a la presin proyectada para el digestor. La presin del gas se establece normalmente entre 15 y 30 cm de columna de agua. El arrestallamas es una caja de placas de metal corrugado con agujeros. Si se produjera alguna llama en la tubera del gas, ste se enfriar por debajo del punto de ignicin, pero podra seguir pasando (13) . La eliminacin del sulfuro de hidrgeno se hace principalmente para prevenir la corrosin por los residuos de la combustin. En el ambiente rural se suele usar el proceso cataltico seco con Fe(OH)3 , y el catalizador se puede regenerar varias veces. El CO2 puede ser removido en parte con agua fra (14) .

Referencias
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6. Micotoxinas
Los mohos crecen sobre materiales vegetales produciendo el deterioro de los mismos. Forman metabolitos secundarios que actan como antibiticos favoreciendo la prevalencia del moho frente a otros microorganismos, muchos de los cuales son txicos para plantas y/o animales. Estos metabolitos que enferman o matan a los animales que los consumen se conocen como micotoxinas, y la afeccin se llama micotoxicosis (1) . Las micotoxinas son compuestos ubicuos que difieren mucho en sus propiedades qumicas, biolgicas y toxicolgicas. Una micotoxicosis primaria se produce al consumir vegetales contaminados, y secundaria al comer carne o leche de animales que ingirieron forrajes con micotoxinas. La presencia de aflatoxina M 1 en la leche es consecuencia de la ingesta de aflatoxina B1 (2) . Las caractersticas de una micotoxicosis son: no es una enfermedad transmisible, en los brotes observados en el campo, el problema es estacional debido a que las condiciones climticas afectan al desarrollo del moho, el brote est comnmente asociado a un alimento o forraje especfico, el examen del alimento o forraje sospechoso revela signos de actividad fngica (2) . Los primeros casos de micotoxicosis conocidos fueron debidos al centeno contaminado con Claviceps purpurea , en la Edad Media. En la Argentina, Quevedo (3) describi la accin de los metabolitos txicos de un Aspergillus del maz sobre varias especies animales. Pero la intoxicacin masiva de pavos en Inglaterra llev al estudio de las aflatoxinas en l960, llamadas as pues son producidas por especies del grupo Aspergillus flavus (2) . La presencia de las micotoxinas en los vegetales puede deberse: a la infeccin de la planta en el campo por el hongo patgeno o la colonizacin de las hojas por los saprobios, al crecimiento de los mohos saprobios o patgenos post-cosecha sobre los frutos y granos almacenados, al desarrollo fngico saprobio durante el almacenamiento de los materiales ya procesados (1) .

6.1. Hongos en el campo y el almacenamiento


Los hongos que deterioran los productos vegetales pueden ser adquiridos en el campo como por ejemplo Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium y otros, adems de los fitopatgenos. Las especies difieren segn el vegetal, el clima y la regin geogrfica (4) . Requieren una humedad relativa ambiente del 90 - 100% y un contenido de agua en las semillas de 22 - 23%, con un amplio rango de temperatura entre 0 y 30C, aunque algunos pueden crecer a 35C o ms (5) . La colonizacin de las partes areas de las plantas por los microorganismos comienza tan pronto como son expuestas al aire. Las bacterias suelen aparecer primero, luego las levaduras y finalmente los hongos filamentosos saprobios y patgenos. Los mohos continan desarrollndose a lo largo de todo el crecimiento de la planta, y se acenta cuando la planta envejece y las semillas

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 6 maduran. La cosecha perturba el ecosistema y las condiciones relativamente estables de almacenamiento entraan un profundo cambio en la composicin de la microbiota (4) . Los hongos abandonados en el campo suelen albergar esclerocios, como en el caso de Aspergillus flavus, que sern la fuente de contaminacin del cultivo en la temporada siquiente (8) . El crecimiento fngico contina en los productos frescos despus de la cosecha y causa lesiones que desfiguran el aspecto de frutas y hortalizas. En los granos de cereales los hongos persisten solamente si el grano est suficientemente seco como para evitar la competencia de otras especies incorporadas posteriormente (5). Otros hongos presentes en los productos almacenados son especies de Aspergillus, Penicillium y algunos xerfilos (4) . Los factores que influyen en su desarrollo son el contenido de agua del producto almacenado, la temperatura, el tiempo, el grado de invasin fngica antes del almacenamiento, la actividad de insectos y caros. Requieren menor humedad relativa ambiente (70 - 90%) y contenido de agua en los granos (15 - 20%), pero el rango de temperatura es ms amplio (0 45C) y puede crecer a menor concentracin de oxgeno (5). La microbiota sobre y dentro de los vegetales afecta la calidad, el comportamiento durante el estacionamiento y el procesamiento. Las poblaciones mixtas de microorganismos que se encuentran naturalmente suelen constituir una desventaja competitiva para la produccin de micotoxinas (1) . Cuando el contenido de agua aumenta, el crecimiento se vuelve ms vigoroso, conduciendo a un calentamiento espontneo del substrato y al desarrollo de especies de mohos termotolerantes, frecuentemente acompaados por actinomicetos termfilos (4) .

6.2. Produccin de micotoxinas


El metabolismo primario de los mohos es similar al de la mayora de organismos eucariticos. Los metabolitos secundarios son formados a partir de unos pocos intermediarios del metabolismo primario, bajo condiciones sub-ptimas y estrs (1) . Durante la biosntesis de estos metabolitos, la cantidad producida depende no slo de parmetros nutricionales y ambientales, sino tambin de la historia previa del desarrollo del moho. La formacin de micotoxinas refleja que el moho ha alcanzado cierto grado de diferenciacin bioqumica, fisiolgica y a veces morfolgica (6). Se conocen unas 300 toxinas fngicas. Las micotoxinas son especificas. Cuanto ms compleja es la ruta biosinttica de estos metabolitos secundarios ms restringido es el nmero de especies de hongos productores de micotoxinas. Las esporidesminas son producidas solamente por Pithomyces chartarum (6) . La aflatoxina B 1 es producida por tres especies estrechamente relacionadas Aspergillus parasiticus , Aspergillus nomius y A. flavus (7) . La patulina es producida por unas once especies de Penicillium, tres de Aspergillus y dos de Byssochlamys (6) . En el recuadro de la pgina siguiente se dan varias especies de los hongos que producen micotoxinas agrupados segn la ruta de biosntesis. La variabilidad en la produccin de metabolitos secundarios por una especie dada es enorme (8) . Penicillium roqueforti produce algunas micotoxinas en las condiciones de laboratorio pero no en los quesos madurados. Los rendimientos de toxina T -2 por cepas de Fusarium sporotrichioides varan considerablemente cuando crecen en el laboratorio, y no todas las cepas de A. flavus son aflatoxinognicas (6). Por otra parte, la temperatura tiene una gran influencia sobre el crecimiento y la actividad de los mohos. El gnero Aspergillus es ms comn en los trpicos, Fusarium est asociado con los climas fros y Penicillium predomina

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en las zonas templadas. La temperatura a la cual el material amohosado es incubado en el laboratorio puede influir en la microbiota aislada a continuacin, la incubacin a 12 C puede favorecer el aislamiento de Penicillium verrucosum de un substrato con ocratoxina A, donde predomina el gnero Aspergillus (5) . Un estrs por sequa, durante el perodo del crecimiento del man puede conducir a la presencia de aflatoxinas, si la temperatura de la geocarpsfera se mantuvo entre 20 y 32C durante las seis semanas anteriores a la cosecha (6) . Aunque el crecimiento de P. verrucosum ocurre entre 0 y 31C a una aw = 0,95, la produccin de ocratoxina slo se detecta si el rango de temperatura fu 12 - 24C, siendo la mxima a 20C y aw = 0,85 (10) . Alternaria alternata produce la mxima concentracin de alternariol sobre granos de trigo a 25 C con una a w = 0,98, pero la produccin ptima de cido tenuazoico por Alternaria tenuissima ocurre a 20C con un contenido de humedad ms elevado. Por otra parte, Fusarium graminearum produce la mayor cantidad de zearalenona a 25C y de desoxinivalenol a 28C a una a w = 0,98. Tambin influye el pH del substrato, as la produccin de patulina en manzanas debida a P enicillium expansum se produce en un rango de pH 3,23,8, mucho ms estrecho que aquel en que hay un crecimiento activo (6). Principales micotoxinas agrupadas segn su origen biosinttico (8, 9) Micotoxinas Algunas especies productoras cido peniclico Aspergillus ochraceus, Penicillium simplicissimum cido secalnico D Penicillium oxalicum, Claviceps purpurea Aflatoxinas Aspergillus flavus, A. nomius, A. parasiticus Alternariol Alternaria alternata Citrinina Penicillium citrinum, P. verrucosum Citroviridina Aspergillus terreus, Penicillium citreonigrum Esterigmatocistina Aspergillus versicolor,Eurotium amstelodami Fumonisinas Fusarium nygamai, F. proliferatum, F. verticilloides, Alternaria arborescens Luteoskirina Penicillium islandicum Moniliformina Fusarium nygamai, F. tapsinum, F. proliferatum Ocratoxinas Aspergillus ochraceus, Penicillium verrucosum Patulina Penicillium expansum, P. griseofulfum, P. roqueforti Zearalenona Fusarium equiseti, F. graminearum Aminocidos cido ciclopiaznico Aspergillus flavus, A. tamarii, Penicillium commune Alcaloides del ergot Claviceps purpurea Bovericina Fusarium proliferatum, F.subglutinans, F. verticilloides Citocalasinas Aspergillus terreus, Phoma medicaginis Eslaframina Macrophomina phaseolina Roquefortinas Penicillium roqueforti Terpenos Fusaproliferina Fusarium proliferatum, F. subglutinans Paspalinina Claviceps paspali Penitrem A Penicillium crustosum Tricotecenos Fusarium graminearum, F. sporotrichoides, F. poae, Myrothecium roridum, Stachybotrys chartarum cidos cido tenuazoico Alternaria arborescens, A. tenuissima tricarboxlicos Rubratoxinas Penicillium purpurogenum Origen Policetonas En el campo se observa que una micotoxina particular se produce en gran cantidad sobre un producto y no sobre otro. As los tricotecenos estn asociados a cereales de zonas templadas, mientras que las aflatoxinas se encuentran con ms frecuencia en

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 6 oleaginosas y cereales de zonas clidas, pero no suelen aparecer en cantidades significativas en soja probablemente debido a sustancias inhibitorias del grano (11). Tambin influyen las prcticas agrcolas (1). La planta sana que crece activamente tiene muchas barreras a la infeccin, pero stas suelen ser sobrepasadas por microorganismos muy especializados que conducen a una interrrelacin planta-hongo muy especfica, tal como el endfito Neotyphodium coenophialum en Festuca arundinacea, o Neotyphodium lolii en Lolium perenne. Por otra parte, la eslaframina producida por Macrophomina phaseolina (= Rhizoctonia leguminicola) est asociada al trbol rojo y otras legumbres forrajeras (6) . La mayora de las micotoxicosis animales implican el consumo de alimentos que han sido deteriorados por la actividad de una compleja microbiota saprobia. Se conocen algunas especies que inhiben la produccin de aflatoxinas, por ejemplo Trichoderma viride (6) . A su vez A. flavus impide la formacin de toxinas en un cultivo mixto con Aspergillus ochraceus o Aspergillus versicolor (12) . Tambin A. flavus y A. ochraceus inhiben la formacin de toxinas de Myrothecium roridum en un cultivo simultneo (13) . Por otra parte la rubratoxina B, un metabolito de Penicillium purpurogenum, aumenta la produccin de aflatoxinas por A. parasiticus (6) .

6.3. Hongos toxinognicos y micotoxinas naturales


Las micotoxinas son ingeridas con los alimentos o forrajes contaminados directa o indirectamente. La contaminacin directa con un moho y la consecuente produccin de toxina puede ocurrir durante la produccin, el transporte, el estacionamiento o el procesamiento del alimento o forraje. Mientras que la contaminacin indirecta se debe a la presencia de un ingrediente previamente contaminado con un moho toxinognico que ya ha desaparecido cuya micotoxina persiste. La presencia, y el peligro asociado, de una micotoxina solamente puede ser determinada despus de la extraccin e identificacin de la misma, porque: la presencia del hongo no asegura.que exista una micotoxina, la micotoxina contina en el producto aunque el moho haya desaparecido, un hongo dado puede producir ms de una micotoxina, una determinada toxina puede ser formada por ms de una especie de mohos (1).

6.4. Peligros
Las concentraciones de micotoxinas se expresan en g/kg (1/109 ), lo que equivale a la relacin que existe entre una regla de dibujo y la distancia entre la tierra y la luna. La accin de estas pequeas cantidades es acumulativa manifestndose la enfermedad, en algunos casos, al cabo de meses o aos. Esto ocurre principalmente con las toxinas mutagnicas. La aflatoxina B 1 causa cncer heptico y las fumonisinas parecen estar relacionadas al cncer de esfago (7) . Entre los factores valorados para establecer unos lmites a la presencia de micotoxinas en los alimentos se encuentran: la distribucin de la micotoxina en el producto, las limitaciones inherentes al mtodo de anlisis, la evaluacin de los riesgos y el potencial txico, la disponibilidad de alimentos para la poblacin (14) . En la pgina siguiente se resumen las afecciones en los animales provocadas por la ingesta de algunas micotoxinas . El nivel de aflatoxinas en los vegetales es muy variable, oscilando los valores en choclo y maz entre 0,1 y 2.000 g/kg. El Comit Mixto de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA) de la FAO no ha determinado cual es la ingesta de aflatoxina M1

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tolerable y recomend reducir los niveles al mnimo posible. En Argentina se establecieron lmites de 5 g aflatoxina B 1 /kg y 20 g aflatoxinas totales/kg para el contenido en alimentos de consumo humano, pero las FAO y WHO fijaron 15 g aflatoxinas totales/kg (15) . Micotoxinas cido ciclopiaznico cido peniclico cido secalnico D cido tenuaznico Trastornos desrdenes gastrointestinales y neurolgicos; cambios degenerativos y necrosis en vsceras (10, 16) hepatotxico y cancergeno (17) teratognico (18) baja eficiencia de la alimentacin, prdida de peso; congestin y hemorragias de estmago e intestino, agrandamiento de riones (19, 20) dao heptico agudo, cirrosis, induccin de tumores, eratognesis; excrecin por leche, acumulacin en tejidos
(18, 21, 22,23)

aflatoxinas alternariol-metilter beauvericina citocalasinas citrinina desoxinivalenol esterigmatocistina fumonisinas ocratoxina A rizonina A patulina tremrgenos (fumitremgeno, paspalinina, penitrem A, territrem B y otros) zearalenona

mutagnica (18) afecta la contractilidad del msculo liso de mamferos (24) inhibe la divisin celular, la funcin tiroidea y la secrecin de amilasa (18) toxicidad renal en monogstricos (25) rechazo del alimento, vmitos; inmunosupresin en cerdos y otros animales (18, 26) cambios patolgicos en hgado, induccin de tumores (18) leucoencefalomalacia equina; edema pulmonar en cerdos; cncer heptico en ratas; excrecin por leche (27) nefropata en cerdos y aves; acumulacin en rin, hgado y msculo (28, 29) gastroenteritis, afecta hgado y riones (30) trastornos gastrointestinales y neurolgicos; induccin de tumores (10, 18) dao del sistema nervioso central, temblores (7, 10)

sndrome estrognico en cerdos y ganado de cra; excrecin por leche junto con y -zearalenol (18, 31, 32)

Los niveles de contaminacin de productos agrcolas con fumonisinas pueden alcanzar hasta 330 mg/kg, principalmente en los destinados al consumo animal. El nivel medio en maz de exportacin es menor que 0,3 g fumonisina B1 /g (33) . La Agencia Internacional para Investigacin sobre Cncer clasific a estas micotoxinas como posibles cancergenos en humanos, pero no se ha establecido lmites aunque se reconocen los efectos txicos cardiovasculares (15) . En Argentina, la ingesta media diaria estimada de fumonisinas es 0,2 g/kg peso corporal y este valor debera aumentarse un 40% si se consideran fumonisinas totales. La ingesta diaria por persona en Latinoamerica oscila entre 0,2 y 17.000 g (34) . Por otra parte, los tricotecenos (diacetoxiscirpenol, desoxinivalenol, toxina T-2 y otros) causan diarrea, hematuria, vmitos, anorexia, leucopenia, necrosis, y en algunos casos letales hemorragias mltiples. En la ex URSS se haba establecido un

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 6 lmite de 0,1 mg/kg para la toxina T -2 (15) . Hay una correlacin positiva entre el contenido de esta toxina y el cncer de esfago en zonas de China (14). Mientras que los psoralenos originan fotodermatitis y los tremgenos (penitrem A y otros) afectan al sistema nervioso provocando temblores y convulsiones, la zearalenona es hiperestrognica (18) . El JECFA estableci como ingesta mxima tolerable el valor de 0,5 g toxina/kg peso corporal/da (35). La ocratoxina A tambin fu considerada como posible cancergena y los valores presentes en granos han llegado hasta un mximo de 5 mg/kg. El JECFA estim tolerable una ingesta semanal mxima de 0,1 g/kg peso corporal. y se establecieron los lmites de 1 a 50 g/kg para el consumo humano y veinte veces mayor para los animales (15) . Tambin los tejidos de las plantas suelen acumular substancias txicas como mecanismo especfico de defensa ante el ataque de algunos hongos, como es el caso de las batatas invadidas por Phytophthora infestans (16).

6.5. Prevencin
El manejo correcto de los cultivos y cosechas de granos y hortalizas, y el control de la calidad de los alimentos para los animales de la granja constituyen los nicos medios de prevencin. La presencia de cualquier alteracin organolptica de frutas u hortalizas es causa suficiente para rechazar el producto por la potencial formacin de toxinas, debida al deterioro fngico, las que se distribuyen con facilidad por todo el substrato por ejemplo, en los tomates. En cuanto a los productos de granja, es difcil preveer un problema al adquirir carnes, huevos y quesos caseros, sin conocer cul era el estado de los animales y la calidad de los alimentos que consuman (1) . Contenido de agua % seguro para el almacenamiento de granos a una HR ambiente del 70% (39) Granos 20C 30C Granos 20C 30C Granos 20C 30C Mijo 16.5 16,0 Avena 14,5 14,0 Arroz 13,5 13,0 Porotos 15,5 15,0 Trigo 14,5 13,5 Soja 12,0 11,5 Caup 15,5 15,0 Sorgo 14,5 13,5 Lino 9,0 8,5 Cebada 15,0 14,5 Maz 14,5 13,5 Girasol 8,0 7,5 Una vez formadas las micotoxinas no se pueden eliminar durante el procesamiento culinario o industrial, aunque en unos pocos casos se reduce su contenido. La mayor cantidad de toxina suele estar concentrada en unos pocos granos y si se logra separarlos, se reduce la proporcin de micotoxina en los subproductos. Las tcnicas de clasificacin por el color u otras caractersticas visuales se han usado en la seleccin de manes y la seleccin neumtica con las nueces de Par. El mondado de las manzanas para remover las zonas alteradas reduce en 9399% el contenido de patulina de la sidra preparada con las mismas (36). Las micotoxinas son moderadamente estables a los procedimientos de tostado, as los manes pierden alrededor del 40% de aflatoxina B1 y los granos de caf verde cerca del 80% de ocratoxina A . El proceso de panificacin reduce 1669% del desoxinivalenol presente en la harina de trigo (37) . El tratamiento de maz quebrado con NaOH disminuye significativamente el contenido de aflatoxina, pero la preparacin del grano entero con CaOH reduce solo un 40% de la misma (38) . La bentonita y otros

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slicoaluminatos adsorben las aflatoxinas de los substratos pero no otras micotoxinas (36), y suelen ser utilizados mezclados con los alimentos para aves.

Referencias
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7. Hongos
7.1. Clasificacin
Los hongos son agrupados de acuerdo a diversos criterios que convergen en la taxonoma o sea el arte de ordenar a los seres segn sus interrelaciones fisiolgicas, morfolgicas o moleculares. A continuacin se indican algunas caractersticas de los reinos del dominio Eukarya que contienen a los diversos hongos y e n la pgina siguiente se muestra un esquema de la divisin de los hongos en grandes grupos. Los mixomicetos y mastigomicetos han sido reubicados en los reinos Protozoa y Chromista que incluyen a los protozoos y las algas respectivamente (1). Caractersticas de los reinos del dominio Eukaryota que contienen a los hongos (1) Fungi Chromista Protozoa Nutricin Heterotrfica Autotrfica Heterotrfica (por absorcin (fotosinttica (fagotrfica) u osmotrfica) o por absorcin) o autotrfica (fotosinttica) Pared celular celulosa con quitina ausente en frecuencia, y -glucanos forma trfica, sin quitina variable si ni -glucanos est presente Crestas mitocondriales tubulares achatadas tubulares Mastigonemas flagelares tubulares ausentes no tubulares La caracterstica principal de los hongos m ucosos es un estado ameboidal que bajo condiciones apropiadas se renen y diferencian para formar estructuras reproductivas semejantes a otros hongos. Algunos miembros del grupo, tal como Dictyostelium discoideum y Physarum polycephalum fueron estudiados n i tensamente por los bilogos evolucionistas. Son organismos comunes de vida libre que habitan el mantillo y el suelo, pero algunas especies son parsitas de plantas superiores, algas marinas y otros hongos (2) . El parsito asintomtico Polymyxa graminis est asociado a las races de cereales y suele actuar como vector de enfermedades virales . Los mastigomicetos son hongos que forman zoosporos. Muchos son saprobios del suelo que actan como descomponedores importantes. Tambin se encuentran en agua dulce as como en aguas residuales. Algunas especies son parsitas de plantas, algas, peces e insectos, por ejemplo Phytophthora infestans causa el tizn de la papa (4) . Los quitridiomicetos difieren de los oomicetos, entre otras cosas, en el nmero de flagelos de los esporos y la composicin de la pared celular (3). Los zigomicetos son saprobios comunes en el suelo. Algunas especies estn asociadas al estircol y otras, como Entomophthora, son parsitas de insectos. Tambin incluye hongos asociados simbiticamente con plantas formando micorrizas vesculoarbusculares, como Glomus y Acaulospora (2) . Los ascomicetos abarcan hongos miceliales y levaduras. Entre stas que se encuentra Saccharomyces empleado en la panificacin y la produccin de cerveza. Las levaduras estn asociadas a frutas, pero tambin se hallan en agua dulce y ambientes marinos.

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 7 Los ascomicetos filamentosos son saprobios comunes del suelo por ejemplo Chaetomium, o estn asociados con estircol como Ascobolus, o forman micorrizas con rboles por ejemplo Tuber que es un hongo comestible muy apreciado. Tambin los hay patgenos de plantas, como Sphaerotheca pannosa que causa el mildi de las rosas
(4).

Clasificacin de los hongos y organismos relacionados (1) PROTOZOA : fagotrficos, sin pared Acrasiales: fase asimilativa ameboide libre, esporocarpo ssil Dictyosteliomycetes: fase asimilativa ameboide, esporocarpo pedicelado Myxomycetes: fase asimilativa plasmodial, saprobio Plasmodiophoromycetes: fase fagotrfica intracelular, parsito CHROMISTA: no fagotrficos, flagelos con mastigonemas, pared con celulosa Labyrinthulomycota: fase trfica reticular con clulas deslizantes Hyphochytriomycota : zoosporas con un flagelo anterior, holo o eucrpico Oomycota : zoosporas con dos flagelos, fase asimilativa diploide unicelular o cenoctica FUNGI : osmotrficos, pared con quitina Chytridiomycota : unicelular o micelial, holo o eucrpico, zoosporas con un flagelo posterior o raramente varios Zygomycota : micelio en general cenoctico, zigosporas por conjugacin hifal o Trichomycetes: parsitos de artrpodos, adheridos a la superficie o Zygomycetes: saprobios en su mayora, si parsitos estn inmersos en el tejido hospedante, mitosporas por lo comn en esporangios Ascomycota : meiosporas dentro de ascas, anamorfos conidiales o Ascomycetes: micelio septado, ascas en ascomas diversos o Taphrinomycetes : parsito, micelio subcuticular o subepidrmico, ascas desnudas o Saccharomycetes : levaduras brotantes, ascas libres o Schizosaccharomycetes : levaduras que se multiplican por fisin, ascas libres Basidiomycota: meiosporas sobre basidios o estructura equivalente, micelio con septos doliporo o levaduras o Basidiomycetes Agaricomycetidae : basidioma visible carnoso, coriceo o duro; hifas con fbulas; basidio sin septos primarios sobre laminillas, poros o en gasteroma; saprobios (epgeos, hipgeos o ligncolas) o ectomicorrzicos, raramente parsitos Tremellomycetidae: basidioma visible gelatinoso o ceroso; basidio septado; ligncolas o micoparsitos o Urediniomycetes: meiosporas en soros, micelio sin fbulas, parsitos obligados de plantas o insectos o Ustilaginomycetes: con fase levaduriforme, septo hifal por lo comn sin doliporo Hongos Anamrficos : no correlacionados con meiosis o Hyphomycetes: micelio con conidios, conidiforos separados o reunidos en coremios o esporodoquios o Coelomycetes: micelio con conidiomas o Agonomycetes: micelio que solo presenta clamidosporas, bulbillos o esclerocios Los basidiomicetos incluyen hongos que viven asociados con plantas formando micorrizas por ejemplo Amanita una seta letal y Boletus comestible, comprenden a la mayora de los hongos comestibles como Agaricus y Pleurotus, y algunos causan enfermedades de vegetales como las royas, pero la mayora son saprobios que crecen sobre mantillo, compost, estircol o suelo. Su tamao es variable, desde levaduriformes hasta enormes hongos en repisa (2) .

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 7

Los hongos anamrficos contienen ms del 95% de los hongos mitospricos, saprobios y parsitos, conocidos. Algunos causan el deterioro de alimentos y producen micotoxinas, por ejemplo Aspergillus, Fusarium y Penicillium (3) .

7.2. Los macromicetos


Cada macromiceto est formado por largas hifas ramificados que se renen en cordones rizomorfos y cuerpos de reproduccin (ascomas, basidiomas) visibles y medibles en centmetros. Son organismos saprobios que absorben la materia orgnica muerta de los residuos donde crecen, o son parsitos de rboles, o viven en simbiosis con plantas formando ectomicorrizas. Los hay comestibles y venenosos. Su ciclo de vida es complejo y varia segn las clases de hongos.

7.2.1. Ascomycota
Xylariales

Pocos son los ascomicetos de gran tamao. Entre los Xylariales se encuentran Xylaria hypoxylon (figura 1) que afecta a las races de los manzanos y X. polymorpha que aparece en otoo en la base de viejos tocones. Poseen peritecios embebidos en un estroma (4). Entre los discomicetos u hongos con apotecios, se hallan los rdenes Pezizales, que comprende dos gneros de inters Tuber y Morchella, y Cyttariales con el gnero Cyttaria.
Pezizales

Las trufas ( Tuber ) son hipgeas o subterrneas, con ascomas cerrados, ms o menos globosos, cuyo himenio no est expuesto al exterior sino que recubre una serie de compartimentos internos (figura 2). Tienen una pared gruesa que no se rompe a la madurez de los esporos (indehiscente) (4). Cuando se cortan las trufas jvenes se ven casi blancas pero se obscurecen con el tiempo, ms o menos segn las especies, tomando un aspecto marmolado. Estos hongos viven en simbiosis con las races de rboles europeos, por ejemplo T. melanosporum est asociado a especies de Quercus (roble, encina) (5) . T. aestivum y T. brumale micorrizan con avellanos (Corylus avellana). T. magnatum, la trufa blanca, crece en suelo calcreo al pie de robles, sauces o tilos, con los que micorriza (7). Las truferas comienzan con la siembra de los plantines de los rboles junto al hongo. Las trufas sern cosechadas bajo tales rboles despus de 7 a 15 aos (8). Debido a su olor caracterstico los animales entrenados pueden hallar la ubicacin de los ascomas subterrneos. Suele confundirse con Elaphomyces granulatus que no es comestible y crece semienterrado en suelos cidos, especialmente al pie de pinos formando micorrizas (7) o con Gauteria chilensis que crece en el mantillo de pinares (9) . Morchella esculenta (figura 3) es un ascomiceto comestible europeo cuyo apotecio alveolado, con el himenio expuesto, tiene un pie. Alcanza entre 5 y 10cm de alto y un ancho de 3 a 5 cm en el extremo amarillo-verdoso o pardo-amarillento con hoyos y rebordes como un panal, mientras que el pie es hueco y de color blanco (5) . Se encuentran en suelo arenoso o

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 7 arcilloso-arenoso bajo nogales y viejos manzanos o en suelos hmicos proximo a olmos y fresnos (11). Puede ser confundida con Gyromitra esculenta o G. antarctica que son txicas por las giromitrinas (N-formil-N-metil-hidrazonas). stas durante la digestin liberan mono-metil-hidrazina que afecta al sistema nervioso central (10). Las falsas morillas tienen un extremo cerebriforme de tono rosa a violeta o castao violceo, y crece en suelos ricos en detritus vegetales (7) . Tambin hay otras especies comestibles como M. elata, o M. intermedia que es una morilla montana con el pleo alveolado cnico a oval de color ocre grisceo (12).
Cyttariales

Cyttaria (figura 4) es un gnero parsito de Nothofagus, que posee algunas especies comestibles. Tienen un cuerpo carnoso de colores claros y casi esfrico, en el cual estn inmersos los apotecios. Alcanzan un dimetro de 2 a 11 cm segn las especies. C. hariotti (llao-llao) crece sobre guindo, ire, lenga, coihue, roble de Chilo, y tiene un color amarilloanaranjado intenso. Es la ms extendida geogrficamente. Otras especies tambin comestibles son C. darwinii (pan de indio), C. berteroi (pinatra), C. espinosae (lihuee) (9) .

7.2.2.

Basidiomycota

Las setas, bejines y otros basidiomas estn constitudos por hifas dicariticas que suelen presentar fibulas. Este micelio puede crecer durante aos en el suelo o la madera hasta que bajo la infl uencia de diversas condiciones ambientes forma los basidiomas (4) .
Auriculariales

Auricularia auricula u oreja de palo (figura 5) tiene basidiomas coriceo-gelatinosos, prpura o pardo obscuro, que se forman en ramas caidas y tocones de seibo, morera y otros rboles. Miden entre 3 y 10 cm de dimetro. La superficie externa es irregular, tiene un color ms plido y est recubierta de una vellosidad casi imperceptible. Llevan el himenio sobre la superficie interna, cncava, lisa, opuesta al substrato. Luego de la meiosis los basidios se dividen en cuatro clulas por tabiques transversales, de cada una nace lateralmente un esterigma que origina un basidiosporo (13) . La especie comestible que se cultiva es Auricularia polytricha (2) .
Cantharellales

Los cantarelos (Cantharellus) tienen forma de embudo con el borde ondulado, sinuoso, y el himenio en pliegues espaciados como laminillas que bajan por el pie, anastomizadas, es decir que se juntan y ramifican (figura 6). La especie comestible ms apreciada es C. cibarius de color amarillo yema en su totalidad. Alcanza de 5 a 10 cm de alto. Forman micorrizas con conferas y rboles de madera dura (7) . Se lo puede confundir con la especie txica Omphalotus olearius (5) .
Agaricales

El champin Agaricus bisporus (figura 7) es la especie que se cultiva comercialmente en las zonas templadas, pero en las subtropicales se utiliza A. bitorquis. El champion alcanza de 5 a 10 cm de alto y de 2 - 10 cm de dimetro en la parte superior o pleo. Cuando el hongo madura, se abre el pleo blanco dejando ver por abajo las laminillas

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rosadas que llevan el himenio. Despus todo el hongo se obscurece y la masa de esporos toma un color pardo violceo o chocolate (11). Cuando recin surge, el hongo tiene el margen del pleo unido al pie por una membrana, que luego se rompe dejando un anillo persistente sobre el pie. A. bisporus que debe su nombre al hecho de tener la solamente dos esporos dicariticos sobre la mayora de los basidios, contiene agaritina un derivado de la fenilhidrazina que se descompone con el calor (10). En el champinn salvaje (A. campestris , A. pampeanus) se forman cuatro esporos de los esterigmas del cada basidio (14). Aparece entre los pastos, especialmente si hay restos de estircol, despus de las primeras lluvias estivales. A. arvensis (figura 7) suele aparecer entre los pastos. El pleo es de color blanco y alcanza de 7 a 15 cm de dimetro. Las laminillas son primero blancas, luego rosadas y al final negruzcas. El anillo es doble (7) . A. xanthoderma es txico. Se reconoce porque toma un color amarillo neto en el lugar donde se lo toc y tiene olor a iodoformo (15). Coprinus comatus (figura 8) es hongo comn en jardines y espacios abiertos que crece aislado o en pequeos grupos. Puede alcanzar 5 cm de dimetro y 15 cm de largo. El pleo es blanco, y est cubierto de pequeas escamas. No se expande hasta la madurez, en que los bordes se enrollan y las laminillas se disuelven dando una masa negra (8) . C. atramentarius es comestible, pero no debe ser acompaado de alcohol pues posee coprina (figura 8) que se hidroliza a hidrato de ciclopropanona e inhibe la aldehdodeshidrogenasa con la consiguiente acumulacin de acetaldehdo txico (10). Este hongo suele encontrarse sobre bagazo de caa de azcar en descomposicin. Las setas del gnero Amanita (figura 9) son muy venenosas. A. phalloides, A. verna y A. virosa contienen toxinas letales (11) que destruyen clulas del sistema

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 7 nervioso central, riones, higado y musculatura. Las amatoxinas son pptidos cclicos (10). A. phalloides es esfrica cuando emerge de la tierra, luego en forma de sombrilla color verde-aceituna con laminillas blancas. Como en otras especies, el pie est ensanchado en la base, con restos en forma de copa (volva) de la cubierta general (velo universal) que envolva al basidioma joven. Adems tiene un anillo, residuo de la membrana (velo parcial) que cubra las laminillas inmaduras (4). A. verna tiene un pleo blanco-amarillento y A. virosa blanco. El de A. muscaria es amarillento al comienzo, luego se torna escarlata, cubierto de verrugas blancas que son restos del velo universal (7) . Posee muscarina, muscimol y cido ibotnico, que afectan al sistema nervioso central y causan trastornos gastrointestinales (10). Las Amanita son hongos micorrizantes y A. diemii se asocia con Nothofagus (9) . Macrolepiota (figura 10) comprende especies de setas con laminillas y esporos blancos, anillo grueso o doble, pero que carecen de volva. Crecen entre la hierba, en lugares soleados (11) . Entre especies comestibles se encuentran las introducidas M. procera y M. rhacodes, junto con M. bonaerensis. El aspecto macroscpico de esta ltima puede confundirse fcilmente con un hongo nativo comn en la zona, M. molybdites (figura 10), que crece en grupos unidos por el pie, tiene esporos verde-amarillento y es txico. Bajo pinares suele crecer M. gracilenta que tiene pleo el primero cnico y luego aplanado con un gran mameln central, de 12 a 20 cm de dimetro, con el pie ensanchndose hacia la base. y alcanza los 20 a 30 cm de alto. El anillo simple y la superficie del pleo permite diferenciarlo de M. bonaerensis (12) . Los Lepiota (figura 11) son hongos con algunas caractersticas similares a los anteriores, pero ms pequeos y no comestibles. Algunos producen trastornos gastrointestinales, tal como L. clypeolaria. Otros tienen amanitinas letales, como L. josserandi. Tambin hay especies con amanitinas en los gneros Galerina y Conocybe (16) . Volvariella volvacea (figura 12) es comestible, pero no debe ser ingerida cruda pues tiene una toxina termolbil (10) . Junto con V. bombycina crecen en la zona subtropical sobre restos lignocelulsicos: ramas y troncos muertos, viruta de madera, bagazo de caa de azcar.. Tienen volva y anillo. Las laminillas son blancas al comienzo y rosa salmn despus, debido a las esporas (11) . Lactarius deliciosus (figura 13) es comestible pero la mayora de las especies de este gnero micorrizante son txicas o tienen un sabor desagradable. Cuando se lo corta exuda un ltex . El pleo anaranjado-azafrn, al principio es convexo con bordes ondulados y luego adquiere forma de embudo. Las laminillas son decurrentes o sea baja por el pie anaranjado. Donde exuda ltex se vuelve verde. Es una especie que micorriza con pinos (16) . Puede ser confundido con L. torminosus que es txico, pero ste tiene el pleo

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rosado a anaranjado parduzco y velloso (5) . Clitopilus prunulus (figura 14) es una especie comestible de color blanco amarillento que puede confundirse fcilmente con algunos Clitocybe blancos que son txicos pues contienen muscarina. Tiene el pleo aplanado con laminillas blancas al principio que se vuelven rosadas y bajan por el pie (decurrentes) que es central o excntrico. No presenta anillo ni volva. Micorriza con conferas (11) . Tambin puede ser confundido con Entoloma lividum que causa gastroenteritis severa (5). Tricholoma (figura 15) es otro gnero de hongos que micorriza, fueron descriptas algunas especies simbiontes de Nothofagus en el sur del pas y otras de la zona subtropical (9) . Tienen laminillas y esporos blancos, y carecen de anillo. Entre las especies comestibles que crecen bajo los pinares se encuentran T. terreum, T. flavovirens y T. matsutake. Algunos son txicos como T. sejunctum que produce trastornos intestinales (16). T. fusipes micorriza con varias especies de Nothofagus (9) . Omphalotus olearius (figura 6) es una especie txica de color amarillo o anaranjado en su totalidad, con laminillas bien definidas que bajan por el pie. Crece sobre troncos (5) . Contiene iludina que provoca gastroenteritis severa (10) . Puede ser confundido con Cantharellus cibarius. Todas las especies del gnero Psilocybe y algunas de Gymnopilus y Panaeolus (figura 16) poseen las substancia alucingenas psilocina y psilocibina (10). G. pampeanus (= G. spectabilis) tiene color anaranjado y crece en racimos sobre tocones de eucaliptos (15).

Cortinarius (figura 17) es otro gnero de hongos micorrizantes, la mayora txicos o sin valor culinario, pero algunas especies s on comestibles como C. albidoviolaceus (7) y C. magellanicus (9) . Cuando se rompe la membrana que une al pleo con el pie, quedan restos en el borde que asemejan una cortina, generalmente fugaz. C. orellanus y otros producen dao hepatico y renal pues contienen orelanina y cortinarinas (10) . Lentinus edodes (figura 18) es una especie asitica comestible (shii-take) que crece sobre residuos lignocelulsicos. Las laminillas y los esporos son blancos. Se cultiva en muchos lugares (8) . Pleurotus ostreatus (figura 19) crece en racimos sobre los troncos podridos,. El pleo carnoso tiene 8 a 13 cm de dimetro y es de color pardo-oliva que se obcurece con el tiempo. Las laminillas y los esporos son blancos. Las laminillas bajan por el pie

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 7 (decurrentes), el que es lateral u excntrico (16). P. eryngii y P. laciniato -crenatus son otras especies comestibles, la ltima es nativa (15) .
Russulales

Russula (figura 20) tambin es un gnero micorrizante. Algunas especies son comestibles como R. cyanoxantha, pero la mayora de las especies tienen sabor acre u olor ftido por ejemplo R. foetens o son txicas, tal como R. emetica que causa gastroenteritis (5). Se han descripto especies propias de la Patagonia (R. nothofaginea, R. fuegiana ), algunas relacionadas a Nothofagus (9) .
Boletales

Boletus edulis (figura 21) tiene un pie de 5 - 15 cm de alto y un pleo carnoso, pardo, de 10 - 15 cm de dimetro. Por el envs se ven los tubos donde se encuentran los basidios. El pie est recubierto con una red de finas venas, blancas al comienzo, que se tornan amarillo-verdoso con el tiempo. Una especie comestible nativa es B. loyo que micorriza con Nothofagus (12) . Algunos tienen sabor amargo y otros son txicos, como por ejemplo B. satanas que causa trastornos gastrointestinales (16) . Suillus (figura 21) es tambin micorrizante de conferas, por ejemplo S. luteus y S. granulatus (17) . Laetiporus sulphureus (figura 22) tiene un basidioma en repisa, de color amarillo azufre, en el reverso se encuentra el himenio en el reborde de tbulos o poros. Se presenta en racimos y provoca la podredumbre parda de muchas maderas (11). Fistulina antarctica es otro hongo comestible en repisa (9) .
Lycoperdales Poriales

Entre los bejines o basidiomas cerrados, Langermania gigantea es una especie grande (de 8 a 51 cm de dimetro), globosa, de color blanco-crema, inconfundible. Los esporos nacen en cavidades internas y una vez maduros el pice se disuelve dando lugar a la salida de los esporos. Es comestible mientras el interior est blanco (7) . Lycoperdon perlatum y L. piriforme (figura 23) son dos especies comestibles de este gnero que crece sobre restos lignocelulsicos, generalmente en los bosques. Son comestibles en estado juvenil. Cuando maduran tienen esporos pardos que se libera n por una abertura del pice (7) .
Sclerodermatales

Entre otros bejines se encuentra Scleroderma (figura 23), un gnero micorrizante, con un peridio de consistencia coricea, olor desagradable y txico (5) .

7.3. Los hongos micorrizantes


A modo de ejemplo de la diversidad de especies micorrizantes, se da una nmina de especies de basidiomicetos que micorrizan con Pinus sylvestris y P. strobus , y a continuacin las plantas que hospedan a especies del zigomiceto Glomus .

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 7 Lista de hongos que forman ectomicorrizas con especies de Pinus (20) P. strobus especies gneros especies muscaria, pantherina Amanita muscaria graniforme Boletinus pictus prunulus Boletus rubellus glaucopus, mucosus Cantharellus cibarius deliciosus, helvus Cenococcum geophilum immundum Gyrodon merulioides roseolus, luteolus Gyroporus castaneus rhodopolius Lactarius chrysorrheus, emetica aurantium bovinus, flavidus, granulatus, luteus, variegatus flavobrunneum, flavovirens, imbricatum, pessundatum, saponaceum, vaccinium Russula Scleroderma Suillus Tuber Endogone lepida aurantium granulatus, luteus maculatum, albidum lactiflua

P. sylvestris gneros Amanita Coenococcum Clitopilus Cortinarius Lactarius Lyophyllum Rhizopogon Rhodophyllus deliciosus Russula Scleroderma Suillus Tricholoma

especies G. mosseae mays G. monosporus G. microcarpus G. fasciculatus

Formacin de micorrizas por especies de Glomus (20) hospedantes comprobados por cultivos en macetas Allium cepa, Fragaria vesca, Sambucus caerulea, Triticum aestivum, Zea Bellis perennis, Lycopersicum esculentum, Maianthemum dilatatum, Trillium ovatum, Zea mays Fragaria spp., Geum sp., Juniperus communis, Phleum pratense, Rubus spectabilis, Taxus brevifolius, Thuja plicata, Zea mays Allium cepa, Clintonia uniflora, Crataegus douglasii, Deschampsia danthioides, Epilobium watsonii, Fragaria vesca, F. chiloensis. Geum sp., Hypochaeris radicata, Maianthemum dilatatum, Malus sp., Mentha arvensis, Plantago lanceolata, Potentilla sp., Rubus spectabilis, R. ursinus, Sitanion lystrix, Stachys mexicana, Taxus brevifolius, Thuja plicata, Zea mays var. macrocarpus Allium cepa, Epilobium glandulosum, Fragaria chiloensis,Galium aparine, mexicana, Trifolium repens, Triticum aestivum, Zea mays var. geosporus Fragaria sp., Lycopersicum esculentum, Zea mays Triticum sp., Zea mays

G. macrocarpus Stachys G. macrocarpus G. caledonius

Las ventajas nutricionales que obtiene cada integrante de una asociacin micorrzica explica, en parte, el xito de tal interrelacin. Algunos hongos micorrzicos pueden producir auxinas o sea hormonas que estimulan el crecimiento de los vegetales, y otros producen antibiticos. Esto ayuda a regular el microambiente alrededor de las races y contribuye a prevenir la infeccin de las plantas. Experimentalmente se demostr que los hongos micorrzicos proveen proteccin contra Phytophthora infestans (2) . Pero, a pesar de los beneficios que las asociaciones micorrzicas de ciertos hongos confieren a determinadas plantas, pueden causar un dao considerable a otros vegetales. Incluso a veces las asociaciones micorrzicas se establecen an cuando bajo condiciones diferentes esos mismos hongos pueden actuar como patgenos agresivos. Esto ilustra la naturaleza compleja de la asociacin biolgica y tambin indica que las plantas poseen mecanismos para prevenir el dao potencial causado por su socio fngico (20).

10

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 7 Las plantas tienen una variedad de defensas contra la infeccin y sta puede ser moderada en ejemplares que tienen asociaciones micorrcicas. Los compuestos fenlicos y ciertas protenas protectoras (quitinasas y peroxidasas) producidas por la planta pueden tener un efecto antimicrobiano significativo. Pero, aquellos ejemplares que crecen sin estar asociados a un hongo forman ms de estos compuestos que las plantas micorrizadas, pues previenen la invasin fngica (2) . Los hongos que forman asociaciones micorrcicas con rboles en bosques son tpicamente basidiomicetos superiores. Es poca la especificidad de estas asociaciones ya que varios rboles pueden formar micorrizas con un hongo dado y viceversa. Ms raramente los ascomicetos forman micorrizas. En contraste a las micorrizas de los rboles, estn las formadas por la orqudeas. Cada una de las diferentes especies de orqudeas tiene una alta especificidad por un hongo particular que generalmente es un zigomiceto. El grado de interdependencia es tal que en muchos casos ninguno de los asociados puede ser cultivado sin el otro, pues forman una verdadera simbiosis (20) .

7.3.1. Inoculacin de plantines


En general los hongos ectomicorrcicos deben incorporarse a las plntulas de rboles y plantas ornamentales, cuando se desarrollan en medios artificiales con vermiculita o arena. La falta de micorrizacin acarrea problemas en el transplante, excepto en los casos en que el suelo contenga especies fngicas (21). Las races se infectan con hongos de las micorrizas vesculo-arbusculares por las hifas desarrolladas de propgulos presentes en el suelo, los que pueden ser esporos o estructuras de resistencia presentes en las races muertas (20). Las primeras tcnicas de inoculacin consistan en el transporte de suelo desde la zona de origen de la plantacin al vivero, pero se corra el riesgo de llevar tambin microorganismos patgenos. Para inocular con cultivos puros, el substrato (suelo, turba) debe ser previamente pasterizado o fumigado con el fin de disminuir la poblacin fngica nativa que podra competir con el inculo (21) . Los hongos son incorporados al substrato de siembra con trozos de races micorrizadas, pedazos de ascoma o basidioma, o micelio obtenido in vitro. El agregado de micelio ofrece mayores garantas en el caso de hongos que se desarrollan bien en cultivo axnico. El primer paso de toda inoculacin consiste en la seleccin del hongo. La introduccin de especies de Pisolithus en viveros incrementa la calidad de las plntulas de pinos, y especialmente se lo usa para suelos muy erosionados, pobres en materia orgnica y nutrientes minerales (20). La figura 24 muestra los pasos de la produccin del inoculante para micorrizar rboles con hongos ectomicorrcicos. En cambio para la preparacin del inculo de micorrizas vesculo-arbusculares se requiere la separacin de los esporos del suelo por tcnicas de tamizado hmedo y flotacin, luego se colocan en una caja, la que se ubica a 2-3 cm ms abajo de las semillas de Allium cepa en una maceta con suelo y arena (1+2 vol.) a pH ligeramente cido. A los 3 -4 meses se extraen las races colonizadas, se las secciona y aade al substrato Figura 7-24. Aislamiento del micelio con esporos, y se homogeneiza. Se mantiene a un 50% de y produccin de inoculante (21) la capacidad de campo y a temperaturas de 5 -10C (21) .

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7.4. Cultivo del champin


Algunos hongos (Agaricus, Coprinus ) crecen sobre substratos que deben descomponerse en parte para que desaparezcan los azcares solubles favorecedores de los mohos y bacterias competidores (8) .

7.4.1. Obtencin del micelio

El primer paso lo constituye la obtencin del micelio de la especie a cultivar, lo que coincide con la tcnica descripta en la figura 24. Una vez logrado el cultivo puro del hongo, se lo repica en semillas esterilizadas, por ejemplo sorgo o trigo (8) . Los granos deben cocinarse durante unos veinte minutos (1 kg en 1,5 L agua), se escurren y mezclan con carbonato de calcio y yeso (3,5 g y 13 g respectivamente, por cada kg de grano cocido). Luego se llenan los frascos y se esterilizan en autoclave. Una vez repicado el micelio del hongo en los granos, se incuba a unos 25C hasta que todo el contenido del frasco haya sido invadido por el mismo. Para mantener los granos separados se debe agitar con frecuencia los frascos. Luego se los puede mantener en el refrigerador a menos de 4C, no ms de un mes (8) .

7.4.2. Preparacin del compost


La obtencin de un substrato adecuado es una fase crtica en la produccin de championes. Tradicionalmente se lo preparaba de paja de trigo y estircol de caballo, pero se pueden usar otros residuos (23) . Se agrega un suplemento para obtener un 22,5% de nitrgeno. Como la paja de trigo es deficiente en potasio se aade cloruro o sulfato de potasio. El yeso mejora la textura final del compost y evita la compactacin, adems de neutralizarlo (22) . El objetivo del compostado es transformar un subs trato no especfico en uno altamente selectivo conveniente para la proliferacin de A. bisporus y otros agricos. El proceso se divide en dos fases. La primera ocurre al aire libre, o bajo un tinglado para evitar las lluvias, en largas pilas de aproximadamente un metro de alto y dos de ancho. Durante esta fase que dura entre 7 y 10 das, se produce la termognesis microbiana alcanzando una temperatura interna de hasta 70 - 80C. Las condiciones aerbicas se mantienen volteando el compost a intervalos regulares. La importancia de esta primera fase es lograr que el substrato sea inadecuado para los mohos que podran afectar a la produccin del champin (22) . La cantidad de agua aadida debe ser tal que humezca el material en compostaje, pero que no escurra lquido al tomarlo con las manos (24) . La segunda fase ocurre dentro de un galpn aislado. El compost es colocado en cajones, en capas de 15 a 20 cm de altura. Estos que se apilan dejando huecos entre ellos para permitir el pasaje de los gases. Aqu contina la actividad microbiana elevando la temperatura a 50-60C, con una adecuada ventilacin. Esta fase dura 3 a 7 das. Se producen nutrientes por la actividad microbiana, especialmente protenas, y se elimina los restos de amonio o aminas producidos durante la primera fase (22). Durante el compostado se pasteriza el interior del compost matando esporos fngicos, caros, insectos y nemtodos. Se suele acelerar el proceso introduciendo vapor de agua a 60 - 70C. La temperatura del compost en la segunda f ase no debe pasar los 60C (24).

7.4.3. Siembra del inculo.


Se obtiene el inculo haciendo crecer el micelio del champin sobre granos esterilizados adicionados de tiza (carbonato de calcio) para mantener el pH. Estos granos invadidos por el hongo se mezclan con el compost (22) .

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7.4.4. Produccin
Durante el primer perodo o de crecimiento del inculo la temperatura de los locales est entre 21 y 28C. Cuando el micelio coloniza todo el substrato, unos 10-12 das despus de la siembra, ste se cubre con una capa delgada de turba sin esterilizar mezclada con tiza (pH 7 - 8) para evitar la desecacin (22) y la temperatura ambiente se reduce a 18C. Cuando aparecen los primeros botones de A. bisporus se baja a 15C. A. bitorquis crece a mayor temperatura (23). La humedad del ambiente se mantiene por encima del 70% (24) . Las bacterias de la turba liberan iones ferrosos esenciales para el desarrollo de los basidiomas (22) . Durante el perodo de crecimiento del micelio se requiere cambiar el aire una o d os veces al da, pero despus de colocar la cobertura se aumenta la ventilacin haciendo 2 a 3 renovaciones del aire por hora, pues una concentracin de 1% de CO 2 provoca la deformacin de los championes (24). El aire pasa sobre los cajones a 100 - 250 mm3 /min. El micelio que est creciendo produce metabolitos voltiles tales como etanol, aldehdo actico, acetato de etilo y dixido de carbono (22). Para mantener la humedad se riega con frecuencia mediante un rociador de niebla sin empapar la cobertura. Los primeros basidiomas se recogen a los 15-25 das despus de colocar la cobertura. 2 y la La produccin depende de numerosos factores y oscila de 5 a 8 kg por m conversin biolgica es del orden de 50 kg de championes frescos por 100 kg de paja seca (6). El perodo de cosecha es de unas seis semanas, al final del cual se vacan las bandejas y el compost usado se aleja del local de produccin para usarlo como abono (24). En este proceso complicado hay tres hechos principales: la provisin del substrato conveniente, la produccin de un inculo adecuado para incorporarlo al compost y la induccin de la formacin de los basidiomas por la cobertura y la temperatura. El compost debe contener fuentes de carbono y nitrgeno adecuadas as como de minerales, vitaminas y acetato. La fuente carbonada es provista por la paja en forma de celulosa, hemicelulosa y lignina. El compostado remueve a los carbohidratos simples que podran ser usados por mohos competidores, permitiendo el desarrollo de hongos celulolticos como los agricos. Tambin A. bisporus necesita acetato para formar algunas macromolculas esenciales (22) . ste es formado por la actividad microbiana que adems origina grasas y aceites que constituyen un reservorio de acetato. A. bisporus requiere protenas como fuente de nitrgeno (22) . Los compuestos simples, como la urea, presentes en la mezcla inicial son convertidos a protena microbiana. Los compuestos minerales de potasio, fsforo, magnesio, calcio, hierro y microelementos se encuentra n en la paja, el estircol y los aditivos o bien son aadidos. Adems requiere algunas vitaminas, como biotina y tiamina, que son formadas por otros organismos durante el compostado. El micelio del hongo produce metabolitos voltiles que estimulan el cr ecimiento de bacterias en la capa de recubrimiento ( Arthrobacter, Bacillus, Rhizobium ), particularmente especies de Pseudomonas como P. putida que parece ser esencial para la produccin de championes. Adems, la capa de recubrimiento realiza otras funciones como la de proporcionar un medio pobre en nutrientes donde se desarrollan los cordones miceliales (4) .

7.5. Cultivo de hongos lignvoros


Volvariella volvacea es un hongo cultivado en China sobre paja de arroz y en el sudeste asitico sobre otros materiales como hojas de banana, bagazo de caa de azcar y residuos de algodn (22) . Pleurotus se cultiva con una eficiencia de 63 kg de basidiomas

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frescos por 100 kg de substrato seco (6) tanto sobre troncos cortados o tocones, como sobre paja (8) .

7.5.1. Preparacin del substrato


Se puede aprovechar la paja de cereales, especialmente trigo o centeno, marlos de maz, aserrn de maderas blandas (8) , tambin hojas de bananero, bagazo de caa de azcar o de algodn (22). Se pican o muelen y se mezclan con 3-5% de yeso o 1-2% de carbonato de calcio. Los residuos se mojan hasta que al tomar un manojo no gotee (70-80% de agua) y luego se agrega el yeso o el carbonato. El pH conveniente oscila entre 6 y 6,5. El tratamiento trmico consiste en una pasterizacin anloga a la empleada para el compost del champin (8) .

7.5.2. Inoculacin y produccin de las setas

Figura 7-25. Cultivo de hongos lignvoros (8).

Cuando el substrato se ha enfriado hasta a unos 25 -30C y tiene un 70% de humedad se mezcla con 1 -4% del micelio comercial sobre granos de cereales, y se llenan bolsas plsticas negras, o no, que se colocan sobre alambres separadas unas de otras. La siembra debe hacerse de la forma ms limpia posible. La humedad relativa dentro del local deber ser del 90%. Una vez que el micelio ha cubierto al substrato, se perforan las bolsas con agujeros de unos 2 cm de dimetro o bien se las quita, para permitir el desarrollo de los basidiomas a la luz. La concentracin de CO2 debe ser menor que 600 ppm y el da anterior a la cosecha la humedad ambiente debe ser reducida al 70% (6) .

7.5.3. Cultivo sobre troncos


Los troncos ms adecuados son los de madera blanda, por ejemplo lamo y sauce. Se cortan al final del otono o en invierno y se guardan en un sitio fresco. En primavera se coloca los troncos en una zanja intercalando una capa de micelio preparado sobre granos u otro substrato, tal como se muestra en la figura 25. Despus se tapa la zanja con tabla o chapa y se cubre con tierra. Si la temperatura dentro de la zanja llega a los 25C y la humedad es alta, los troncos sern invadidos por el micelio. Para asegurar la humedad se suele drenar agua en la zanja. Luego de unos tres meses se sacan los troncos cubiertos de una costra blanquecina, se entierran en parte protegidos del viento y a la sombra. Se riegan lo suficiente con una fina lluvia. En otoo empiezan a salir las setas, hecho que se repite durante dos o tres temporadas (6) .

Referencias
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Mohos 1 -11 Mutualismo 2 -15 Nitratos desnitrificacin 3-19 reduccin 3-20 Nitrificacin 3-21, A -16 Nitrgeno fijacin vida libre 3-24, A-17 fijacin simbitica 2-16, 3-24, A-13 incorporacin 3 -23 mecanismo fijacin 3 -24 Ndulos radicales 2-16, 2-17, A -13 Nutricin 2-2 Oxgeno 2 -7 Oxidacin del piruvato 3 -16 Oxidaciones incompletas 3-19 Pared celular arqueobacterias 1-7 Gram-positiva 1-3 Gram-negativa 1-3 Pelos de conjugacin 1-6, 1-17 Plsmidos 1-6, 1-17 Predacin 2-19 Priones 1-15 Proteobacterias 1-4 Protoplastos 1 -19 Protozoos 1 -1, 1-13 Psicrfilo 2-8 Psicrotrofo 2-8 Quimiotrofo 2 -2 Radiaciones 2 -12 Reinos microbianos 1-2 Respiracin aerbica 3 -15

anaerbica 3-19 Rizobios 2-16, 3-24 Rizsfera 3-2 fijadores 3-24 Rumen 5-3 Simbiosis 2-15 Suelo 3-1 bacterias 3-1 biomasa 3-5 efecto rizosfrico 3 -3 horizontes 3-1 humedad 3-3 microorganismos 3-1, A-16 temperatura 3-3 Sulfatorreduccin 3-20, A-17 Sulfooxidacin 3-22, A-17 Termfilo 2-8 Temperaturas cardinales 2-8 Tiempo reduccin decimal 2-12 Transferencia gen tica 1-15 Transporte de electrones respiracin aerbica 3-16 respiracin anaerbica 3-20 fotosntesis bacteriana 3-28 Transporte de solutos 2-3 Va de cetodesoxifosfogluconato 3-15 fructosa difosfato 3 -14 pentosas 3-15 Viroides 1 -15 Virus 1-14 Vitaminas 2-3 Xenobiticos 3 -5