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Tema 02.- Cultivo de microorganismos.pdf

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Microbiología General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Crecimiento microbiano. Cultivo de microorganismos. Medios de cultivo.

Métodos de aislamiento. Concepto de cultivo puro. Crecimiento microbiano en medio líquido. Crecimiento microbiano en medio sólido. Concepto de muerte de un microorganismo. Medida del crecimiento y enumeración de microorganismos. Crecimiento microbiano equilibrado. Cinética de crecimiento de un cultivo estanco. Factores físicos y químicos que influyen en el crecimiento. Rendimiento de los cultivos. Cinética de crecimiento en un cultivo continuo. Tipos de fermentadores. Bibliografía recomendada: Cap. 1 de la 8ª edición de Brock: Biología de los microorganismos CRECIMIENTO MICROBIANO Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un único microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demográfico de una población. En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir también para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y será tratada al final de este capítulo. Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicación del material genético, la síntesis de componentes celulares, la elongación de la bacteria para alcanzar un tamaño doble del inicial y su división por bipartición para dar lugar a dos células hijas. La duración del ciclo celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población. Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrónicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran células que acaban de dividirse, otras que están replicando su ADN, otras que están credciendo, otras que están iniciando la división celular, etc. En un cultivo sincrónico todas las células se encuentran simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrónicas.

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La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable.11O1.95N0. en ciertos casos..72H6. La fórmula elemental de un microorganismo es. podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio. nitrógeno (14%). aproximadamente. químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada.o en forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino. de NO3.035K0. el C debe estar en forma de carbono orgánico para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos. oxígeno (32%). Mg. En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la fórmula elemental más concreta es: C3. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan.017P0. En general. azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe. etc. C4H7O2N lo que supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco. los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el CO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbono orgánico. 2 .61S0.056 esta composición puede variar ligeramente en función de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. Además. MEDIOS DE CULTIVO Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. El conocimiento de la fórmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulación del medio de cultivo más adecuado para el mismo. entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados. Co. Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes números en un periodo de tiempo muy reducido. K. el P debe estar en forma de PO43-. Mn. por ejemplo. Así.Cultivo de microorganismos. el S procede de aminoácidos sulfurados o de SO42-. Puesto que el efecto de los microorganismos es en la mayoría de los casos depende de su número.Microbiología General Tema 2.o de NO2. Mb. Cu y Zn. el N en forma de NH4. es necesario añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. fósforo (3%). CULTIVO DE MICROORGANISMOS El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas.

Cultivo de microorganismos. y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofía por ejemplo). los medios pueden ser generales.1 . Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas. y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño. el medio SPS para clostridios). MÉTODOS DE AISLAMIENTO El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza. se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli). Por otra parte. de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composición genética. En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos. tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas. al desconocimiento de los requerimientos específicos de cultivo. los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar). selectivo-diferenciales cuando combinan las dos características anteriores (por ejemplo. en la mayoría de los casos. mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos.0. Los cultivos puros son 3 .. extracto de carne. Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composición química se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura. Existen procedimientos de enriquecimiento del número de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento. diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de microorganismos hemolíticos). Uno de ellos es la Columna de Winogradski que crea un microcosmos para enriquecer el número de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento. Sin embargo. no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables).). El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma que. Esto es debido a dificultades intrínsecas en el cultivo (microorganismos parásitos de otros). CONCEPTO DE CULTIVO PURO Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de microorganismos.01 % de las bacterias marinas son cultivables.Microbiología General Tema 2. selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo. etc. Se estima que en sólo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0.

3. cada vez se va conoce más sobre el funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que..Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo). en la mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido. Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. Sin embargo.Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo.Microbiología General Tema 2. 4 . esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad. La evolución del número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación.. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio.. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO Si la bacteria crece en un medio líquido. la fisiología de los microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros. por consiguiente.Cultivo de microorganismos.. 2. se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano: 1.Fase lag o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.

Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido... no hay crecimiento. parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos líquidos se presentan también en cultivos sólidos. En estos casos. 4. en liberación de toxinas. Si el número inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto. un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse. por ejemplo. CONCEPTO DE MUERTE DE UN MICROORGANISMO Desde el punto de vista microbiológico.Cultivo de microorganismos. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. 5 . se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo.Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo. Como consecuencia de esta pérdida. La cinética de crecimiento. la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un césped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio. el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. En el caso de microorganismos móviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trófico no se producen colonias aisladas sino formaciones más difusas o miceliares. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SÓLIDO Las fases. en este caso. por tanto. no se produce aumento en el número de microorganismos y. Por consiguiente. Por otra parte. se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa. un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiológico y continuar desarrollando una actividad metabólica que se traduzca. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales. hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones físicas o químicas del entorno.Microbiología General Tema 2. Sin embargo. podríamos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables.

Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo sólido adecuado para estimar el número de viables contando el número de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una célula aislada.Medida de parámetros bioquímicos tales como la cantidad de ADN. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cámaras de Petroff-Hausser. 4. La densidad de células debe ser del orden de 105 por ml. Por tanto. En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja. Este es el parámetro de medida más fácil de usar en los cultivos de laboratorio. número de células..2 µm de tamaño de poro) y posterior colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias. se enumeran a continuación: 1. Sin embargo. éstos se pueden recolectar por filtración a través de una membrana (de 0.) evolucionan en paralelo. cantidad de proteínas. CRECIMIENTO MICROBIANO EQUILIBRADO Se denomina crecimiento equilibrado a aquél en el que todos los parámetros del cultivo (biomasa. Estos sistemas no nos indican si las partículas corresponden a células vivas o muertas. es necesario contar más de 300 UFC. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de células sea del orden de 105 por ml.. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en condiciones naturales. ARN..Medida de la masa de células: el sistema se basa en que las células en suspensión dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. 3. proteínas. etc. por unidad de volumen de cultivo. 6 . pero nos pueden dar una idea del tamaño de las partículas. es útil porque permite estudiar el crecimiento microorganismos. Los principales.. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadístico. 2.Medida de actividad metabólica de las bacterias como que respiran producen una disminución del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxígeno (utilización de colorantes sensibles a oxidación-reducción tales como el azul de metileno)... de ADN.Microbiología General Tema 2.Recuento directo: consiste en la observación al microscopio de volúmenes muy pequeños de suspensiones de bacterias. 5. etc.Cultivo de microorganismos.. es principalmente un concepto de aplicación en el laboratorio (o en microbiología industrial). MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. peptidoglicano. por tanto. midiendo esta se puede estimar aquella. La turbidez depende de la masa en suspensión y.Medida del número de partículas usando contadores electrónicos de partículas. 6.

etc. Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden. con el coste que ello supone. TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO COMO PROGRESIÓN GEOMÉTRICA Las bacterias crecen siguiendo una progresión geométrica en la que el número de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de generación (τ). Esta es la forma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las bacterias.Microbiología General Tema 2. el número de células se duplica. Esto lleva a que una única célula (N0=1) creciendo con un τ = 20 min. llegue a poder producir 4. De esta forma. por ejemplo.Cultivo de microorganismos. sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto han podido duplicar su masa y su material genético. El número de generaciones se puede calcular de la siguiente forma: n=t/τ donde t es el tiempo transcurrido. Cada vez que transcurre un tiempo de generación. combinando las ecuaciones 1 y 2: N = N0 2t/τ (ecuación 3) (ecuación 2) Los tiempos de generación de bacterias creciendo en ambientes favorables pueden ser muy cortos (valores de τ de 20 min). CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO DISCONTINUO En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos que crecen aislados que no forman ningún tipo de estructura. podemos calcular el número de bacterias (N) al cabo de un número de generaciones (n) usando la ecuación siguiente: N = N0 2n (ecuación 1) siendo N0 el número de células en el momento actual. cómo va a ir consumiéndose el substrato y cómo se van a ir acumulando los productos del cultivo. Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos para predecir cómo va a evolucionar un cultivo.000 litros. cómo se va a acumular el producto. puesto que no podemos predecir qué va a pasar. por tanto. siguiendo. cuándo va a completarse el crecimiento. un incremento exponencial. Por consiguiente.. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.7 x 1021 células en 24 horas. El tiempo que tarda una célula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generación (τ) y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones óptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. 7 .

ácidos nucleicos etc.. 8 . que τ = ln2/µ. que hay una correlación inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y el tiempo de generación (τ). por ello es mejor transformarlas en otras más simples. Es decir. por consiguiente. TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO EN FUNCIÓN DE LA TASA DE CRECIMIENTO µ Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el número de células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). podemos concluir que µ = ln2/τ y. Por tanto. En este caso. Para transformar una ecuación exponencial en una recta. Las ecuaciones exponenciales son muy difíciles de manejar gráficamente. masa celular. en la ecuación anterior N puede representar cualquiera de estos factores. el crecimiento tendrá poca pendiente (será lento) y si τ es pequeño el crecimiento será rápido. Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células. proteínas.Cultivo de microorganismos. tomamos logaritmos en los dos términos y resulta: lnN = lnN0 + (t/τ) ln2 (ecuación 4) Esto es: el logaritmo del número de células crece linealmente con el tiempo a razón de una constante igual a ln2/τ. poder calcular la tasa de crecimiento µ a partir de medidas experimentales del incremento en el número de células.) evolucionan en paralelo. la ecuación que describe la cinética es la siguiente: dN/dt = µN (ecuación 5) esto es: el incremento del número de células (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al número de células presentes en el cultivo (N). o bien. acumulación de metabolitos primarios.Microbiología General Tema 2. etc. biomasa. se transforma en la siguiente función exponencial: N = N0 eµt (ecuación 6) la transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente: lnN = lnN0 + µt (ecuación 7) esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ. todos los parámetros de crecimiento (número de células. Integrando la ecuación anterior durante el tiempo de cultivo. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ. Comparando esta ecuación (7) con la similar presentada más arriba (4). Si el tiempo de generación τ es muy grande. A la constante de proporcionalidad (µ) se le denomina tasa de crecimiento. En un crecimiento equilibrado. etc. biomasa de cultivo.

Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada.45 35 . Por tanto.8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 . la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1. son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 .. la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.35 ºC). 12. Tipo de Temperatura Temperatura Temperatura microorganismo mínima óptima máxima Psicrófilo -5 +5 12 .5 y 2.47 Termófilo 40 .FACTORES FÍSICOS Y QUÍMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO. Sin embargo.75 60 .5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar. se les puede considerar como psicrófilos facultativos. Si estudiamos la variación de la velocidad de crecimiento en función de la temperatura de cultivo. aunque no tienen porqué morir. a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que la velocidad es máxima. Por encima de esta temperatura óptima. Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento mínima.. Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. podemos observar una temperatura mínima por debajo de la que no hay crecimiento.90 Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas. En términos generales.20 Psicrótrofo -5 +5 25 .30 30 .35 Mesófilo 5 . 1. se produce la muerte celular rápidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la temperatura. 9 . Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas. El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura.15 15 . La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de las proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas. Esto permite esterilizar por calor y no por frío.Cultivo de microorganismos. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos..15 30 .Microbiología General Tema 2. el metabolismo celular se enlentece y las células paran de crecer.45 55 . La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de crecimiento por la reducción de la velocidad de reacción y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. máxima y óptima. cuando la temperatura es superior a la óptima.

Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja. en muchos casos. El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR). Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl) donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la solvatación de los iones de la sal disuelta. El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente.. La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. levaduras aw>0. 10 . Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo. sin embargo. halófilos y xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas. hongos filamentosos aw >0. la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada.0 a 7. sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio.pH: Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo sólo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente.. los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (mucho más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Como puede verse. los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son. la actividad de agua es mucho menor que en el primero. a título orientativo. Los microorganismos capaces de producir infecciones son los mesófilos y algunos psicrótrofos ya que sus temperaturas óptimas de crecimiento coinciden con las corporales. En función de su tolerancia a ambientes con baja aw. psicrótrofos y termófilos pueden producir toxinas causantes de intoxicaciones alimentarias.85. El pH interno en la mayoría de los microorganismo está en el rango de 6. 2.Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0). tanto mesófilos como psicrófilos. los siguientes: bacterias aw >0. el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. La utilización de almíbares. En este último caso. la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes. La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo..Cultivo de microorganismos. respectivamente. su crecimiento se detiene.80. disminuye su actividad de agua. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que.90.Microbiología General Tema 2. De hecho. En el caso de las esporas.0. 3. salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano.

como consecuencia del metabolismo. La bajada del pH se puede deber a varios factores. 4. cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo. esto es: sus características oxidantes o reductoras. la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. En general. acético.. por ejemplo). Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entéricas. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son. hay que tener en cuenta que la acción bactericida de estos ácidos orgánicos de cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que producen. las bacterias lácticas que producen grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4. por ejemplo) y la producción de ácidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos (coles fermentadas. Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxígeno (anaerobios) que. En este sentido. aunque no el único. el pH del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. las bacterias competidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante.0 Hay que considerar que. mientras que otros necesitan ambientes reductores. llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de 11 .Cultivo de microorganismos. Así. la adición de ácido acético en forma de vinagre permite la conservación de alimentos perecederos (escabeches.Potencial redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar electrones. uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico. o como Saccharomyces cerevisiae. los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables.0 y otros alcalófilos que toleran pH=10. El efecto letal del pH ácido sobre los microorganismos tiene aplicación en la conservación de alimentos acidificándolos. es la concentración de oxígeno [O2]. Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer. sin embargo. De esta forma.. o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácticas) o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios). Esto es. distintos.5). también. Por otra parte. láctico) por ciertas bacterias. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que se produzca el crecimiento. por ejemplo. De esta forma.Microbiología General Tema 2.

las bacterias que "respiran" nitratos (NO3-). Hay microorganismos que. electrones que actúa como oxidante ambiental. no son capaces de utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermentativo (las bacterias lácticas que son anaerobias aerotolerantes. membranas y ácidos nucleicos produciendo la muerte de las células.RENDIMIENTO DE LOS CULTIVOS.) de un cultivo a lo largo del tiempo. hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo.. fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando. Por ejemplo. Definiremos el rendimiento de utilización del substrato (Ys) al valor que representa la cantidad de biomasa producida por unidad de substrato consumido: 12 . Las células se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superóxido dismutasa (SOD) y catalasa. En este cultivo. sulfatos (SO42-) u otros compuestos orgánicos oxidados (respiración anaerobia). Esto es: en presencia de oxígeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia. En el curso de ciertas reacciones metabólicas redox se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres. 13. etc. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno. El gráfico siguiente representa la variación de la biomasa (o número de células..Cultivo de microorganismos.Microbiología General Tema 2. La detección de estas enzimas tiene valor taxonómico. aunque viven en presencia de oxígeno. Por otra parte. se va consumiendo un substrato cuya concentración decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. por ejemplo). formas superóxido) que pueden dañar las proteínas.

Ys = dN/dS dN/dt = Ys (dS/dt) (dN/dt)/N = Ys (dS/dt)/N como. Evidentemente. cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido. la tasa específica de consumo de substrato (qs) la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato. o en función de la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo). de acuerdo con la ecuación (5). 1 13 . Haciendo las transformaciones que se indican a continuación sobre la fórmula que relaciona la variación de biomasa con la de substrato (8).Microbiología General Tema 2. µ = Ys qs (ecuación 11) (ecuación 8) (ecuación 9) (ecuación 10) Esto es. el rendimiento disminuye). También varía el rendimiento en función de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo (estos conceptos serán revisados más adelante). Sin embargo. Ys = dN/dS (ecuación 8) El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos. A esta relación inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur. µ = (dN/dt)/N. hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento más bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa.Cultivo de microorganismos. o alimentos. podemos calcular la cantidad de biomasa total (gramos de células. Podemos calcular el rendimiento de la utilización del substrato en función de la cantidad de substrato añadido al cultivo. llegamos a la definición de un nuevo concepto qs denominado tasa específica de consumo de substrato por el organismo. qs = Ys/µ (ecuación 12) Asimismo. Asimismo. cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor será la tasa de crecimiento (µ).. La uso porque resulta útil esta metáfora antropòmórfica para entender algunos de los conceptos relacionados con el rendimiento de cultivos. también mayor será la tasa de crecimiento. varía entre diferentes microorganismos (hay microorganismos que "engordan" más que otras comiendo lo mismo) y varía también en función de otras condiciones ambientales o fisiológicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si está sano o enfermo o si está en verano o en invierno). La expresión "3engordar" está usada de forma metafórica: las bacterias no engordan. por ejemplo) o de carbono presente en las células (aproximadamente el 50% de la masa celular corresponde a carbono). que "engordan"1 más que otros).

Para que se cumpla esta ecuación el rendimiento debe ser independiente de la concentración de substrato. sí existe ese efecto. la velocidad de crecimiento se reduce. los valores de Ks suelen ser muy bajos. Ks. de la concentración de substrato (S) y de un valor constante.). En un cultivo continuo se pretende mantener un ambiente constante durante todo el tiempo de cultivo. QUIMIOSTATO El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución (D) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelen tener valores de Km considerablemente reducidos (La Km indica la concentración de substrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de la máxima) 14. Este tipo de cultivo es también importante en los estudios de fisiología y de ecología microbiana. Esto es imposible en un cultivo estanco en el que los nutrientes se van consumiendo progresivamente y el medio se va cargando de productos de desecho. Estos parámetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación: 14 . Por último. nos falta relacionar la tasa de crecimiento (µ) con la concentración de substrato (S). pero cuando el substrato se hace limitante. En condiciones de substrato abundante. La expresión matemática que relaciona ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuación de Monod y es la siguiente: µ = µmax [S/(Ks+S)] (ecuación 13) En esta ecuación la tasa de crecimiento (µ) depende de la máxima que puede alcanzar el microorganismo (µmax). la concentración de este no afecta al valor de µ.. Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estén creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente productos de interés (biomasa. La ecuación de Monod tendrá mucha importancia al tratar de cultivos continuos. que representa la concentración de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la máxima. lo que indica que los microorganismos crecen con tasas (µ) muy próximas a las máximas (µmax) a concentraciones de substrato bajas y sólo cuando estas son extremadamente bajas.CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO CONTINUO. etc.. En un cultivo continuo se mantienen los microorganismos en crecimiento constante porque se añade de forma constante medio de cultivo fresco (que aporta nuevos nutrientes) y se elimina cultivo (medio usado con sus microorganismos correspondientes) a la misma velocidad con objeto de mantener el volumen total del cultivo constante.Cultivo de microorganismos. En la práctica. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). metabolitos secundarios. En la naturaleza un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto de procesos microbianos intestinales de todos los animales.Microbiología General Tema 2.

pequeños incrementos de la velocidad de dilución producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan más nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento (µ) según lo indicado en la ecuación de Monod (ecuación 13). Por consiguiente. Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de substrato está dentro del reactor. densidad celular o biomasa Tiempo de generación concentración de substrato Velocidad de dilución A velocidades de D muy bajas. D = f/V (ecuación 14) donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml.. A valores bajos de D la concentración de nutriente limitante (S) en el efluente es baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo que alcanzan unas poblaciones de gran tamaño creciendo a una tasa (µ) baja porque se encuentran en condiciones de limitación de nutrientes (S<Ks). El valor D indica el número de volúmenes de reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo.Microbiología General Tema 2. En una situación de equilibrio (steady state).Cultivo de microorganismos. la situación fisiológica del orga 15 . de esa forma. las dimensiones de D son [h-1]. de forma que el control de la tasa de dilución (control del flujo f) permite regular la tasa de crecimiento y. La velocidad de crecimiento aumenta (µ aumenta y τ disminuye) cuando la energía aportada por los nutrientes entrantes supera la energía de mantenimiento de los microorganismos del cultivo. velocidad de dilución D se iguala a la tasa de crecimiento µ. A valores más altos de D no todo el nutriente es consumido por los microorganismos del cultivo por lo que S en el efluente aumenta. Tanto la tasa de crecimiento µ como el nivel de población microbiana están relacionados con el valor de D.

ya que en los cáculos se partía de esta condición para poder reformular la ecuación de Monod. por consiguiente S alcanza un valor máximo (el nutriente limitante no es consumido en el cultivo y la concentración del substrato en el efluente es igual a la del substrato en el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos (µ) dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece). A valores de D> µmax.Cultivo de microorganismos. la ecuación de Monod ((13) puede reformularse en los siguientes términos D = µmax [Sr/(Ks+Sr)] (ecuación 16) donde Sr es la concentración de nutriente limitante en el efluente del cultivo continuo.. Despejando de la ecuación 16 el valor de Sr en función de los demás. Si llamamos SR a la concentración de nutriente limitante que entra en el fermentador y Sr la concentración de este nutriente en el efluente. el microorganismo no es capaz de crecer lo suficiente como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y. En el steady-state. si µ > D hay un incremento positivo de la población en el quimiostato.Microbiología General Tema 2.DX (ecuación 15) Por consiguiente. esto no es una demostración de que en el steady state las tasas de dilución y crecimiento se igualan. cuando µ = D el tamaño de la población se mantendrá estable (equilibrio) y si µ < D la población disminuirá como consecuencia de la dilución de las bacterias. La evolución de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuación siguiente: dX/dt = crecimiento . 2 16 . µ = D como se había explicado anteriormente.2 Habida cuenta de que en el estado estacionario D = µ.salida = µX . podemos calcular la producción de biomasa en el fermentador con las siguiente ecuaciones Ñ = Ys(SR-Sr) Ñ = Ys{SR-[DKs/(µmax-D)]} (ecuación 18) (ecuación 19) Estas ecuaciones nos permiten modular la cantidad de biomasa producida o la cantidad de substrato consumido regulando la tasa de dilución del fermentador. considerando que el substrato consumido en el fermentador (SR-Sr) es transformado en biomasa durante el estado estacionario (Ñ) con un rendimiento Ys. se obtiene la ecuación siguiente: Sr = DKs/(µmax-D) (ecuación 17) que permite calcular cómo varía la concentración del nutriente limitante en el efluente en función de la tasa de dilución D. como (dN/dt) = 0. TURBIDOSTATOS En realidad. nismo.

El valor D en un turbidostato.TIPOS DE FERMENTADORES Podemos distinguir dos grandes tipos de fermentadores según el estado del medio de cultivo: fementadores líquidos y sólidos. el diseño físico de los fermentadores líquidos tienen que incluir la presencia de sondas que permitan medir estos parámetros durante el cultivo y de sistemas que permitan corregir las desviaciones que se puedan producir (sistemas de refrigeración para control de temperatura. mientras que el quimiostato a valores de D bajos. etc. Por otra parte.. Por consiguiente. y la aireación. Este tipo de cultivos se denomina en ocasiones cultivo sumergido. la altura máxima de un tanque de fermentación se sitúa en los 15 m ya que por encima de esa altura se alcanzan valores de presión inhibidores. En general. Tienen especial importancia dos problemas: la agitación destinada a asegurar una mezcla correcta de los ingredientes del medio y de los microorganismos que crecen en él. en un turbidostato el medio de cultivo no contiene nutrientes limitantes. etc. 15. Por ejemplo. En un cultivo de estas características el nutriente añadido suele ser una fuente que aporte el carbono necesario para obtener energía y elementos para la síntesis de los metabolitos secundarios de interés. El diseño de un fermentador líquido requiere tener en cuenta una serie de factores que influyen en el crecimiento. pH..Microbiología General Tema 2. aireación. Los turbidostatos funcionan mejor valores de D altos. 17 . El segundo tipo de cultivo continuo es el turbidostato en el que se ajusta la velocidad de dilución de tal forma que la densidad óptica del cultivo se mantiene constante. FERMENTADORES LÍQUIDOS En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desarrollan flotando libremente en el volumen de medio de cultivo o formando agregados más o menos esféricos (pellets) en el caso de los cultivos de hongos. sistemas de ajuste de pH mediante la adición de ácidos o bases. CULTIVO SEMI-CONTINUO Un cultivo semi-continuo (feed-batch) es un cultivo estanco al que se añaden en diferentes momentos nutrientes concentrados para permitir un mayor crecimiento o una producción más efectiva de metabolitos secundarios. por tanto. la producción de penicilina se realiza mediante un cultivo de estas características. Un aspecto adicional que considerar en el diseño de un fermentador es la presión hidrostática que se alcanza en su base y que puede limitar el crecimiento de microorganismos. y en el rendimiento del proceso: temperatura.Cultivo de microorganismos.). es variable.

En este fermentador. y a partir de ahí las burbujas vuelven a crecer al ascender por la parte exterior de la cuba de fermentación. La agitación se consigue por un sistema de palas unidas a un eje y un motor y por las turbulencias creadas por un sistema de bafles adosados a las paredes de la cuba de fermentación. pero operado al revés. La aireación se consigue por un difusor de aire que emite desde la parte inferior de la cuba de fermentación. La aireación también permite reducir la cantidad de calor producida durante la fermentación. El principal problema de estos fermentadores es el elevado coste del sistema mecánico de agitación. La transferencia de oxígeno al cultivo se hace por las burbujas que van ascendiendo por el volumen de cultivo.. las burbujas de aire van aumentando de tamaño conforme ascienden por el tubo interior por lo que su relación superficie/volumen disminuye y la transferencia de oxígeno al cultivo es menor. la entrada de aire produce un convección que se canaliza por un tubo vertical interior en la cuba. En la práctica. Fermentadores en tanque Son los fermentadores más sencillos. Fermentadores Air-lift En estos fermentadores la agitación y a aireación se logran mediante la inyección de aire por la parte inferior de la cuba de fermentación. Fermentadores Deep-Jet En ellos el aire se inyecta a presión desde la parte superior de la cuba de fermentación de forma que las burbujas de aire se van haciendo más pequeñas (mejor transferencia de oxígeno) hasta llegar al final del cilindro interior. principalmente cuando se realizan cultivos de hongos filamentosos en los que la viscosidad debida al micelio aumenta mucho. 18 .Microbiología General Tema 2. es un fermentador similar al anterior.Cultivo de microorganismos.

) y también la que tiene lugar en los procesos de compostaje de residuos orgánicos. Hay varios modelos de fermentadores sólidos: 1. etc. o los microorganismos se encuentran formando agregados que se mantienen en suspensión por medio de una corriente de medio de cultivo líquido (reactores de lecho fluidificado). koji. Bandejas 3.. Es un tipo de fermentación muy aplicada en la producción de algunos alimentos (setas cultivadas. FERMENTADORES SÓLIDOS En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desarrollan en la superficie del substrato o penetrando en él. 19 .Cultivo de microorganismos. existen sistemas semisólidos en los que los microorganismos están adheridos a superficies estáticas y los nutrientes pasan por filtración o goteo a través de ellos (sistema de la producción de vinagre por goteo). Sistema de lecho (bed system) Por otra parte. Tambor 2.Microbiología General Tema 2.

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