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Crecimiento Microbiano

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD: F.I.I.S. ESCUELA: ING. AGROINDUSTRIAL

MICROBIOLOGIA I

MTODOS DE ESTUDIO DEL CRECIMIENTO MICROBIANO 1ra. parte 1 DEFINICIONES

Una poblacin microbiana es definida por dos parmetros que suelen referirse a unidad de volumen de medio, la Densidad Microbiana o masa celular y la Concentracin Celular o nmero de clulas. El aumento de estos dos parmetros constituye el fenmeno del crecimiento.

La Densidad microbiana y la concentracin celular son parmetros esenciales distintos a nivel celular, la masa aumenta de forma continua durante el crecimiento, mientras que la multiplicacin es un proceso discontinuo. Cualquier factor cuya falta determina la interrupcin del crecimiento recibe el nombre de Factor Limitante. El crecimiento por lo tanto puede quedar limitado por agotamiento de cualquiera de las fuentes trficas esenciales (energa, carbono, nitrgeno, sales minerales, o un factor de crecimiento en el caso de organismos auxotrofos) o bien por un cambio en las condiciones fsicas o fisicoqumicas, por lo tanto en los estudios cuantitativos del crecimiento es fundamental que se identifiquen con exactitud el factor limitante.

2 MEDIDA DE LA DENSIDAD MICROBIANA

La Densidad Microbiana expresada en peso seco de clula por unidad de volumen debe determinarse en principio pesando los organismos desecados hasta un peso constante a 100-110, aunque este mtodo es exacto tiene el inconveniente de ser largo y laborioso y de que hay que operar con masas importantes de organismos.

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Por ello en la prctica es preferible determinar la densidad microbiana por mtodos indirectos: valorando el nitrgeno proteico celular (microkjeldhal) o midiendo la turbidez.

Las suspensiones microbianas cumplen cuantitativamente la Ley de BeerLambert:

Densidad ptica (d.o) = Log Io = Kdc I Donde: Io: Intensidad del rayo luminoso incidente. I : Rayo luminoso transmitido. d: Distancia recorrida por la luz a travs de la suspensin. c: Densidad microbiana. k: Constante

3 MEDIDA DE LA CONCENTRACIN CELULAR.

El nmero total de clulas puede determinarse con ayuda del microscopio contando los organismos en un hemocitmetro o en una cmara de tomas, mtodo laborioso por la pequeez de los microorganismos y sobre todo de las bacterias, es necesario utilizar objetivos de gran aumento y por lo tanto de poca profundidad de campo. Existen dispositivos electrnicos de cuenta automtica, estos permiten no solo contar con rapidez las clulas sino adems establecer una distribucin estadstica de los tamaos en la poblacin.

El mtodo ms utilizado es el cmputo mediante el cultivo en placas petri. Utilizando medios selectivos es posible aplicar este mtodo para contar un determinado microorganismo en una poblacin mixta. Estos mtodos son el empleo de colorantes vitales o colorantes no txicos que penetran solo en la clulas vivas.

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Otra tcnica consiste en esparcir una muestra de la poblacin bacteriana, diluida en una capa de vidrio con un medio slido extendido.

EXPRESIN Y ANLISIS MATEMTICO DEL CRECIMIENTO.

Una poblacin cuya densidad microbiana o concentracin celular inicial es X0 va creciendo por duplicaciones sucesivas del modo siguiente:

Despus de una duplicacin X1 = 2 X0 Despus de dos duplicaciones X2 = 2.2 X0 = 2 X0 Despus de n duplicaciones Xn = 2 X0

Sea r la tasa de crecimiento, la poblacin se convierte en: rT XT = 2 X 0

Forma logartmica de la ecuacin anterior. Log2 XT = rT X0 Log2 XT Log 2X0= r T

Log 2 X = Log 10 X = 3322 Log 10 X Log 10 2

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Representacin semilogaritmica del crecimiento.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBACTERIANO.

El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologas. Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tiene las clulas individuales, esto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para determinar el nmero total de microorganismos en una muestra:

Recuento microscpico de partculas. Recuento electrnico de partculas.

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Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que slo se tiene en cuanta el nmero de microorganismos viables, esto es, capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias. Mtodo del Nmero Ms Probable.

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la sntesis de los

componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

Determinacin de peso hmedo Determinacin de peso seco Determinacin de nitrgeno Determinacin qumica de un cido nucleico

Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia del incremento de la biomasa.

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Recuentos Directos.
Recuento Microscpico: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente Cmaras de Recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y

transparentizadas o teidas con colorantes fluorescentes (naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproducibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas.

Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono).

Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos.

Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.

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Tipo de cuadro Cuadrado Total Cuadrado Grande Cuadrado Pequeo

rea (cm)
-2

Volumen (ml)
-5

Factor (1/ Volumen)

4

1.00 x 10
-4

2.00 x 10
-7

5.00 x 10
6

4.00 x 10
-5

8.00 x 10
-8

1.25 x 10
7

2.50 x 10

5.00 x 10

2.00 x 10

Nmero total de microorganismos = Bacterias contadas. 1 ml ______________________Dilucin_________ Nmero de cuadrados. Volumen del cuadrado

1/ Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento. Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que se utilizaron para contar el nmero de bacterias. Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la Cmara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realiz el recuento.

-8

Por ejemplo, cada pequeo tiene un volumen de 5 x 10 ml

4 3 -8

(50 m x 50 m x 20 m = 5 x 10 m = 5 x 10 ml).

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Recuento Electrnico:

Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y

microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de un pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuacin. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzado a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto, en un muy breve intervalo de tiempo.

Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartiendo, la resistencia de ste se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeas producen cambios en la resistencia que son comparables al ruido generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse clulas que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un breve periodo de tiempo va ser tomado como una clula ms grande. Es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.

MEDIDA DE LA BIOMASA.
La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad metablica, o de un constituyente metablico o qumico. Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud.
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PESO HMEDO
Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el

diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular.

Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextrano) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.

PESO SECO
El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de bacterias.

La desventaja de ste mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

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DETERMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS

Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado cido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la poblacin.

DETERMINACIN DE NITRGENO
Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Existen distintas tcnicas para determinar la cantidad de nitrgeno que contiene una muestra en relacin al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrgeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrgeno proteico mediante absorcin en UV. Reaccin de Biuret, Reaccin de Lowry, o el nitrgeno total mediante la digestin de Kjeldahl.

INCORPORACIN DE PRECURSORES RADIACTIVOS

Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. En esta tcnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la clula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la poblacin.

DISPERSIN DE LA LUZ
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La Nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La Turbidimetra mide la luz como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. En relacin a la longitud de onda y al tamao

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de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular).

TURBIDIMETRIA.
La turbidimetria mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco.

Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embrago, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse la curva de calibracin con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismo totales o con UFC.

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K: Constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/ Wo).

Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-mg/ml).

La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la Ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por bajo nivel de absorcin.

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Nmero de Microorganismos Totales

En estos grficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo nmero de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensin es distinta.
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CLCULO DEL TIEMPO DE GENERACIN

Tiempo de generacin (G) es el tiempo requerido para que una clula se divida o una poblacin se duplique.

G= t n
Si partimos de una clula al cabo de una generacin habr duplicado su nmero y as sucesivamente en cada generacin. Como se puede comprobar el crecimiento se produce en progresin geomtrica:
1

1 generacin 2 clulas = 2
2

2 generacin 4 clulas = 2
3

3 generacin 8 clulas = 2
4

4 generacin 16 clulas = 2
5

5 generacin 32 clulas = 2

Si partimos de N clulas (en microbiologa los estudios se realizan con poblaciones), a un tiempo determinado (Ta) tenemos un nmero de clulas determinadas (Na).

En la primera generacin se duplicar el nmero de clulas (2Na) y asi sucesivamente de tal manera que al cabo de un tiempo determinado Tb el nmero de clulas determinadas ser Nb (Nb= 2n Na) donde n es el nmero de generaciones transcurridas desde Ta hasta Tb. En esta frmula (Nb = 2n Na) conocemos todos los parmetros excepto el nmero n de generaciones transcurridas por lo que aplicando logaritmos ser posible calcularlo. Una vez obtenido el nmero de generaciones n transcurridas en un tiempo t podremos calcular el tiempo de generacin G para ese microorganismo.

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Ta Na
1

1 generacin 2 Na = 2 Na
2

2 generacin 4 Na = 2 Na
3

3 generacin 8 Na = 2 Na
4

4 generacin 16 Na = 2 Na
5

5 generacin 32 Na = 2 Na

n generaciones (Tb) Nb = 2 Na

Nb = 2 Na Lg Nb= n lg 2 + lg Na n = lg Nb lg Na lg2 n= lg Nb/ Na lg2

n= 3.3 lg Nb Na G= _____ t____ 3.3 lg Nb/ Na

El tiempo de generacin de la levadura Saccharomyces cerevisiae es de 90 minutos y el de la bacteria Escherichia coli es de 20 minutos. Esta bacteria tiene un crecimiento muy rpido de tal manera que a partir de de una sola clula se obtienen al cabo de 8 horas (8 x 60 = 480 minutos; 480:20 = 24 generaciones; 224 = 2 x 106 clulas) 2 millones de clulas.

Esta misma bacteria al cabo de dos das se habra multiplicado hasta 2.2 x 1043 clulas. Una bacteria pesa aproximadamente 10-15 10-11 gramos, por lo que el peso de todas esta clulas es de aproximadamente 2.2 x 1030 gramos que equivalen a 8 veces el peso de la tierra.

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CRECIMIENTO EN UN MEDIO NO RENOVADO 1 FASE DEL CRECIMIENTO

La grafica representa coordenadas ordinarias y semilogartmica. La evolucin de la densidad microbiana en funcin del tiempo en un cultivo usual en el que el crecimiento se inicia poco despus de la siembra y cesa cuando el medio se agota, estas curvas constan de varias fases caracterizadas por el comportamiento de la tasa de crecimiento:

1. Fase de latencia en la que la tasa de crecimiento es nula (r = 0). 2. Fase de crecimiento acelerado durante la cual la tasa de crecimiento aumenta (r ).

3. Fase exponencial en la que la tasa de crecimiento es constante y mxima (r = cte). 4. Fase de c. retardado durante la cual la tasa de c. disminuye (r 5. Fase estacionaria en la que la tasa de e. es nula (r = 0). 6. Fase de declive en la que la tasa de e. es negativa (r < 0). ).

Curva de crecimiento en medio no renovado.

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2 FASE DE LATENCIA Y FASE DE CRECIMIENTO ACELERADO.

El tiempo de latencia (Ti es el retraso del crecimiento real respecto al crecimiento ideal), es decir, el crecimiento que habra observado de Tt se

determina grficamente las curvas de crecimiento Semilogaritmicas midiendo el tiempo que media entre la fase exponencial observada y la recta paralela que pasa por el origen. La latencia se puede expresar tambin cuantitativamente determinado, por el mtodo grafico que se indica en la figura de crecimiento real y el crecimiento ideal (Monod, 1949).

Las fases de latencia y de aceleracin pueden faltar, y, cuando existen, se pueden a la edad del inoculo o bien a una adaptacin enzimtica.

Fig. 82. Determinacin grfica de la latencia. Los valores logartmicos de las densidades microbianas llevados a ordenadas corresponden al inculo total (Xt), a la fraccin viable del inoculo (Xv), a la poblacin que se habra obtenido ene. Mismo intervalo de tiempo en un crecimiento ideal, es decir, sino hubiese habido latencia (X 1). L representa la diferencia del nmero de divisiones entre el crecimiento ideal y el real T1, es el tiempo de latencia. MICROBIOLOGA I

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a) Edad del inculo. La latencia que se observa cuando se siembra un medio nuevo con organismos procedentes de un medio de composicin idntica es tanto mas prologada cuando mas viejo sea el cultivo de donde procede el inculo, es decir cuado mayor sea el tiempo transcurrido desde que dicho cultivo dej de crecer. Esta influencia de la edad del inculo se explica por dos motivos, por un lado, las fases de latencia y de aceleracin expresan el tiempo necesario para reparar y reconstruir sistemas enzimticos que han experimentado una alteracin progresiva durante el tiempo que los microorganismos han permanecido sin multiplicarse. Se ha demostrado que durante la fase estacionaria del

crecimiento disminuye el nmero de ribosomas.

Por otra parte, un inculo (xt) procedente de un cultivo viejo contiene a veces una cantidad muy grande de clulas no viables de tal forma que an cuando las clulas visibles (Xr) empiecen inmediatamente ha desarrollarse

exponencialmente (fig.82), su proliferacin pasara inadvertida y no se reflejara en la curva experimental hasta despus de varias divisiones.

b) Adaptacin enzimtica.

Las causas de la latencia que acaba de describirse se eliminan utilizando un inculo procedente de un cultivo en fase exponencial. En este caso los

organismos transferidos a un medio nuevo de la misma composicin reanudan en seguida su crecimiento exponencial. Pero si el inoculo procede de un medio de distancia composicin, se puede observar una fase de latencia (fig.) que en este se debe a una adaptacin enzimtica, es decir, a la sntesis de una o mas enzimas necesarias para que las bacterias metabolizen el nuevo sustrato .

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Fig. 83 Adaptacin enzimtica y Fase de latencia. (Segn J. Monod. Am. Rev. 3, 371, 1949).

Microbiol.

Crecimiento de Escheriachia coli en medios sintticos sembrados con un precultivo en crecimiento exponencial sobre arabinosa. El subcultivo sobre glucosa empieza inmediatamente, mientras que sobre xilosa presenta un tiempo de latencia (T1) de unas dos horas y media.

3. FASE EXPONENCIAL
Durante esta fase, que en coordenadas semilogartmicas esta representada por una recta, todas las clulas se dividen con una tasa de crecimiento constante y mxima (Rmx), y la taza de de mortalidad es nula, y por tanto la

concentracin celular total es igual a la concentracin de clulas viables . Conviene sealar que, en determinadas condiciones particulares, las bacterias pueden no desarrollarse de modo exponencial, sino de forma lineal. Crecimientos lineales prolongados se observan, sobre todo cuando se cultiva un organismo en

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presencia

de

anlogos

estructurales

de

aminocidos,

como

la

p-

Fluorofeilalanina o la B-Tielalanina (Fig. 84). Tambin se han observado crecimiento lineales en mutantes que presentan un bloqueo parcial de las sntesis de un aminocido usual, como un mutante estreptomicin dependientes de Bacillus subtilis en ausencia de estreptocina. Estos crecimientos lineales se atribuyen (Monod 1949) a que el desarrollo esta limitado por una enzima cuya biosntesis esta inhibida especficamente, y por tanto, su actividad permanece constante.

Fig. 84. Crecimientos lineales de Escheriachia coli, en presencia de anlogos estructurales de aminocidos (G.N . Cohen y R. Munier, Biophys. Biochen. Acta, 31, 347, 1959.) Cultivos en crecimiento exponencial sobre maltosa (0.2 por 100). En el tiempo cero se aade en (A) DL-para-fluorofenilalanina (5.10 -4 M) y en (B) DL, b-2 fenilalanina (10 -3 M). Las curvas de crecimiento exponencial de los cultivos testigo estn trazadas con lneas punteadas.

En A. aerogenes, la velocidad de crecimiento disminuye por encima de los 37 C y se anula a los 42C. Dentro de esta gama de temperaturas , que varia de unas bacterias a otras , la parte pendiente de la recta que representa el logaritmo de r en funcin de 1/T indica la existencia de un proceso que tiene una elevada de activacin y que al parecer consiste en la alteracin trmica de una

macromolcula (protena o cido nucleico).

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La disminucin de la tasa de crecimiento por encima de la temperatura ptima va acompaada de un descenso de un rendimiento ponderal, mientras que este rendimiento permanece constante en toda la zona de temperaturas en las que se cumple la ley de Arrhenius.

4. FASE DE CRECIMIENTO RETARDADO

Esta fase se explica por lo dicho al tratar de la influencia de la concentracin del factor limitante sobre la velocidad del crecimiento .Corresponde al periodo en que el factor limitante esta a punto de agotarse, y su concentracin es inferior a la necesaria para que r sea mxima.

5. FASE ESTACIONARIA
Rendimiento ponderal y molecular del crecimiento. Cuando el factor limitante se ha agotado, el crecimiento se retiene (r = 0) y la poblacin permanece estacionaria durante varias horas, hasta que se inicia la fase de declive. La diferencia entre poblacin inicial del medio recin sembrado y la poblacin final (X-X0) es el crecimiento total (G).

Varios hechos indican que las enzimas que interviene en la degradacin de protenas y la ARN (Ribonucleosa) preexisten durante el Crecimiento Exponencial y que probablemente estn localizadas en los ribosomas.

El hecho que durante la fase estacionaria halla una constante degradacin y resntesis de protenas, sin que apenas variara su masa total, es de gran

importancia para el estudio de la diferenciacin celular, y ms concretamente para la biosntesis inducida de enzimas adaptativas en organismos no proliferantes.

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Fig. 89 Renovacin de protenas en Escheriachia coli, en crecimiento exponencial (A) y en suspensin no proliferante (B). (Segn J. M Mandelstam, Bact. Revs, 24, 289, 1960). La degradacin de las protenas se mide por la liberacin de leucina C 14 a partir de clulas marcadas con este aminocido radiactivo. En trazo punteado: logaritmo de la densidad ptica (curvas de crecimiento). Obsrvese que, en el caso de clulas en crecimiento, casi toda la degradacin de las protenas precede a la fase exponencial.

6. FASE DE DECLIVE
Despus de un cierto tiempo, que vara segn los microorganismos y las condiciones de cultivo, comienza la fase de declive, durante la poblacin decreta (r<0). Esta fase se caracteriza por dos fenmenos: 1) La mortalidad, que era nula durante el crecimiento exponencial, se manifiesta, con que disminuye el nmero de organismos viables; 2) La densidad microbiana decrece por autlisis de las clulas provocadas por enzimas proteolticas endgenas. De estos dos fenmenos, el primero comienza antes y es mucho ms rpido.

En estos ltimos aos, la supervivencia de bacterias no proliferantes ha sido objeto de estudios (Strange, 1961; Posgate y Honter, 1962), que se han
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realizado principalmente con Aerobacter aerogenes y otras bacterias Gramnegativas. La curva de supervivencia se haba considerado siempre como una curva exponencial que tenda sintomticamente a cero. Sin embargo, los citados autores han observado que en diversas condiciones, y en especial cuando el factor limitante es el sustrato de carbonado, la curva de supervivencia es lineal al principio, hasta que se ha muerto 70-80 % de los organismos, y solo despus se hace exponencial.

La prdida de viabilidad se acompaa de la liberacin de sustancias procedentes de la degradacin de los cidos nucleicos (Pentosas, fosfato, bases nitrogenadas) y la de las protenas (amoniaco, cetocidos), que quedan en el medio extracelular al alcance de los supervivientes, con lo que se produce el fenmeno de crecimiento ctrico o de canibalismo Ryan (1955). La duplicacin de un individuo superviviente corresponde a la utilizacin de sustancias procedentes de 50 individuos muertos (Postgate y Honter, 1962).

La muerte en las bacterias se acelera en presencia de un sustrato energtico (glicerol, glucosa), lo que indica que el funcionamiento de las enzimas metablicas aumenta la habilidad de las clulas. En cambio la muerte se retrasa en presencia de iones de Mg++ o cuando la concentracin celular es muy elevada.

La existencia de crecimiento energticamente desacoplados demuestra que las bacterias carecen de sistemas de regularizacin que permitan ajustar la velocidad de la produccin de la energa es funcin de su utilizacin.

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CRECIMIENTO CONTINUO
1. FUNDAMENTOS:

La teora del crecimiento microbiano continuo en medio renovado fue establecida por Monod (1959) y Sizilar (1950).

Fig. 92. Efecto de la adicin de fosfato sobre la actividad catablica de un cultivo bacteriano (Zymomonas mobilis) limitado por el fosfato. (J.C Senez y J.P Belaich, les mecanismes de rgulation des activis cellulaires chez les microorganismes, pg. 357, CNRS, 1965.) Experiencia realizada en un microcalormetro diferencial de Tian-Calvet. Ordenadas: velocidad de produccin de calor (dQ/dt) a partir del sustrato energtico (glucosa). Abscisa: tiempo. La curva muestra que el desarrollo exponencial del cultivo se detiene al agotarse el fosfato. La adicin de un exceso de fosfato (0.5 mg/ml) provoca la reanudacin inmediata de la actividad catablica, a una tasa superior, y esta diferencia permite calcular el control ejercido por la carencia de fosfato (21 por 100). El crecimiento continua entonces hasta el agotamiento de la glucosa.

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Monod ha demostrado que este valor es directa y linealmente proporcional (fig.88) a la concentracin inicial (C) del factor limitante

G= KC

Esta relacin permite conocer de modo que experimentalmente la naturaleza del factor limitante. La constante K (K=G/C), expresada en gramos (peso seco) de bacterias producidas por gramos de sustrato metabolizado, en el rendimiento ponderal del crecimiento. Esta magnitud representa la asimilabilidad del sustrato por el organismo considerado.

El rendimiento molecular se representa por la letra Y seguida de la indicacin del sustrato (Y a para la glucosa, Y gal para la galactosa, etc.). Es evidente que Y es igual al producto de K por el peso molecular del sustrato.

2. RENOVACIN DE PROTENAS Y DE CIDOS NUCLEICOS.

La interrupcin del crecimiento lleva consigo un profundo reajuste de la estructura celular y especialmente de una rpida renovacin (turnover) de las protenas y del ARN (Mandelstam, 1960).

Esta renovacin se ha demostrado y medido de forma experimental en bacterias ( E. coli y A. aerogenes) previamente cultivadas en presencia de la leucina C 14 y de ortofosfato P
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, a fin de marcar radiactivamente las protenas y los

cidos nucleicos, y despus resembrar en medios que contienen cantidades relativamente elevadas de leucina y fosfato fros. La cintica de la degradacin de las protenas y de los cidos nucleicos viene determinada por la velocidad con que aparece la radiactividad en la leucina y el fosfato libre extracelulares.

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RESUMEN DE LOS PARAMETROS Y CONSTANTES DEL CRECIMIENTO

Densidad microbiana: Masa (peso seco) de clulas por unidad de volumen. Esta magnitud se suele determinar por nefelometra (densidad ptica).

Concentracin Celular: Nmero de clulas por unidad de volumen. Esta magnitud se mide casi siempre por cmputo de bacterias visible.

Factor Limitante: El componente del medio del cultivo o la condicin FsicoQumica que limita el crecimiento.

Tasa Horaria de Crecimiento (r): Nmero de divisiones por hora.

Tasa Mxima de Crecimiento Exponencial (r mx.): Tasa de crecimiento independiente de la concentracin del factor limitante. Esta tasa de crecimiento es la que se observa durante la fase exponencial de los cultivos en medio no renovado.

Tiempo Medio de divisin o de Generacin (tg), inversa de la tasa de crecimiento (tg=1/r).

Crecimiento Total (G): Peso seco de las clulas producidas en un cultivo. Esta masa que se suele expresar en g/ml, poblacin final alcanzada al agotarse el medio.

Rendimiento Ponderal (K): Crecimiento total por unidad de masa (g) de sustrato metabolizado.

Rendimiento Molecular (Y): Crecimiento total por molcula/gramo de sustrato metabolizado.

MICROBIOLOGA I

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