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CITOMETRIA DE FLUJO: NUEVAS APLICACIONES

DR. PEDRO ARAUCO NAVA

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MÉDULA ÓSEA NORMAL Eosinófilos Neutrófilos Monocitos CD34+ HPC Rojos nucleados Linfocitos .

9  1.1-2.9) 9.6-6.6 (0.5 (0.01-0.03) 0.1-3.4) 0.7 (<0.2  4.4 (0.9  1.2 (0.6-18) 2.2  0.3-2.5) 2.DISTRIBUCIÓN DE POBLACIONES EN MÉDULA ÓSEA NORMAL SUBPOBLACIONES MO % CD34+ % CD34+ y/o CD117+ % Eritroide % Neutrófilos % Monocitos % Eosinófilos % Basófilos % Mastocitos % Plasmáticas % Linfocitos B maduros % Linfocitos B precursores % Linfocitos T % Linfocitos NK % NORMAL MO 1.7  2.1  0.01 (<0.3  1.6) 2.3) 0.7-5) .8-5) 0.5) 2.1 (2-9) 67  6.8  1.4  0.1 (57-80) 4.5 (2.5 (1.3 (0.02  0.6-6) 4.5  1.2  1.4 (0.4 (2-6.

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ANTÍGENOS Y LINAJES .

CAMBIOS FENOTÍPICOS DE DIFERENCIACIÓN NEUTROFÍLICA NORMAL MYELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO METAMIELOCITO SEGMENTADO CD15 CD64 CD13 MPO CD65 CD35 CD11b 102 CD13 103 CD33 CD16 101 CD10 CD34 HLA-DR CD117 CD54 .

CAMBIOS INMUNOFENOTIPICOS DURANTE LA MADURACION NORMAL DE NEUTROFILOS MIELOBLASTOS PROMIELOCITOS MIELOCITOS METAMIELOCITOS CAYADOS / SEGMENTADOS CD13 103 CD11b 102 CD16 101 .

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DIFERENCIACIÓN MONOCÍTICA EN MO NORMAL CD64-PE CD14-PE CD36-FITC IREM-2 FITC HLADR CD64 CD36 CD14 IREM2 .

CAMBIOS FENOTÍPICOS DE MADURACIÓN NORMAL DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PLASMACITOIDES EN MO ESTADÍO I ESTADÍO II ESTADÍO III ESTADÍO IV CD 123 PE 103 CD 36 FITC HLA DR PERCP CD 117 APC 102 BDCA4 PE BDCA2 PE CD 34 APC CD 33 APC 101 .

CAMBIOS FENOTÍPICOS DURANTE LA DIFERENCIACIÓN NORMAL DE MASTOCITOS CD117 cytG4 (Triptasa) CD203c cytB12 (Tryptase) HLA-DR cytG3 (Triptasa) FceRI CD34 .

CAMBIOS FENOTÍPICOS DURANTE DIFERENCIACIÓN DE BASÓFILOS CD123 CD203 CD34 HLA-DR CD117 2D7 FceRI .

coexpresando CD34.Secuencia de maduración de los linfocitos B en la MO normal :  Los progenitores B más inmaduros serían CD19. TdT y CD22. respectivamente  .15 y 0. y corresponden aproximadamente al 0.07 % del total en la celularidad medular en niños y adultos.

 Posteriormente. CD20-) supone aproximadamente el 0. Dentro de las células precursoras B que ya expresan el antígeno CD19 en la MO normal.7 % del total de las células nucleadas de MO normal en el niño y el 0.15 % en el adulto . CD10intenso . pueden diferenciarse claramente tres estadios madurativos mayoritarios cuyas proporciones y números absolutos varían con la edad . CD34 + . La subpoblación CD19 + más inmadura (CD19débil . CD45débil . el precursor B incrementaría la expresión de TdT y coexpresaría CD10 y CD19. TdT + . probablemente en esta secuencia. CD22débil . CD38intenso .

TdT-. Algunos autores sugieren la existencia de pequeñas subpoblaciones con fenotipo de transición entre estas dos subpoblaciones (CD10intenso . CD20-. CD34-) .5 % del total de células nucleadas de la MO normal en el niño y el 0. La subpoblación CD19 + en un estadio intermedio de diferenciación (CD19 + . CD34-. CD38intenso . CD45 + . CD20débil ) supone aproximadamente el 6. CD22débil . CD10 + .8 % en el adulto. TdT-.

CD20intenso ) supone aproximadamente el 2. CD38débil . CD45intenso . Por tanto. La subpoblación CD19 + más madura (CD19 + .5 % del total de células nucleadas de la MO normal tanto en el niño como en el adulto . CD10-. CD34-. TdT-. la MO del niño es muy rica en células B inmaduras mientras que en el adulto predominan habitualmente los linfocitos B maduros . CD22intenso .

 Así. ocurre aproximadamente a la edad de 15 años. mientras que en el adulto la población que predomina es la más madura (70 % del total de células B). las células B inmaduras o en estadio intermedio de diferenciación suponen aproximadamente el 70 % de todas las células B de la MO normal en individuos menores de 15 años. La transición entre estos dos patrones fenotípicos. de niño a adulto. debido fundamentalmente a la reducción de las dos poblaciones de células CD19 + más inmaduras .

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Fenotipos aberrantes Intensidad fluorescente anormal por Ac  Ausencia o sobreexpresión de Ac  Expresión asincrónica madurativa  Maduración/compartimento biológico  Curva de maduración anormal  Expresión antigénica de varios linajes  .

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Critical Rew in Oncol 2005 . Et al.Inmunofenotipos leucémicos Kern W.

Introducción. Blood 2001 EMR después del tratamiento de Inducción . Puntos de corte * *LAIP: fenotipo leucémico aberrante San Miguel JF et al. ERM en LMA adultos.

Inmunofenotipos Leucémicos (1) LAIPs LLA-T (n=4) 3 IL/ paciente NUM LLA-B (n=43) Entre 1 y 5 IL/ paciente Cross-Lineage CD19+CD33+ CD19+CD13+ CD19+CD15+ total Asincronismos CD19+CD22++CD34+ CD19+CD22++CD20CD20+TdT+ IgMc+TdT+ total Hiperexpresión CD34+++ CD10+++ total Fenotipos infrecuentes CD19+CD45CD19+CD34+CD10CD19+CD34-CD10++ CD19+CD20-CD10Total NUM 13 7 3 23 5 5 1 2 13 4 16 20 22 9 6 5 42 FSC/ SSC Hight FSC/ SSC total Asincronismos TdT+CD5+ total Fenotipos ectópicos CD1a+ CD3-CD4+CD8+ CD3dimCD7+ CD3dim/-CD4-CD8total Fenotipos infrecuentes CD34+CD7+ Total Pérdidas antigénicas CD5Total 1 1 1 1 2 2 1 2 7 1 1 1 1 (1) No incluidos KOR-SA ni NG2 .

Puntos de corte  Coustan-Smith E et al. ERM en LLA niños. Blood 2000 EMR POST-TRATAMIENTO DE INDUCCIÓN .Introducción.

Volume 15. Pages 1185-1192 BIOMED-1 concerted action report: flow cytometric immunophenotyping of precursor B-ALL with standardized triple-stainings .Leukemia August 2001. Number 8.

Aplicabilidad ERM por CMF Laips Nº pacientes 4 8 10 4 23/27: 87.5% LAIP ≥ 2 Combinaciones 4 fluorocromos 1 2 3 4 5 1 .

FRECUENCIA DE FENOTIPOS ABERRANTES POR CITOMETRIA DE FLUJO LA Bifenotípica LLA-T LLA-B DLPC-B Gammapatía monoclonal LMA DLPC-T SMD/SMP % 100 99 95 95 90 75 NA NA .

Aplicabilidad CMF  LLA LMA virtualmente 100% 3 colores 4 colores 60% 80% aprox  .Introducción.

q23) (MLL-AF4) m-RNA Adulto Niños 3-6% 3% Infant t(1. Aplicabilidad en LLA-B.22)(q34.21)(p13.p13) (E2A-PBX1) m-RNA Adulto Niños >75% <5% 5-8% t(12.ERM.q22) (TEL-AML1) m-RNA Adulto Niños <1% 30% 30-35% Niños 40-45%Adultos .q11) (BCR-ABL) RNA Adulto Niños 30-35% 5-8% t(4.19)(q23. PCR Alteración genética tipo de muestra Aplicabilidad t(9.11)(q21.

q11) (RHOM1-TCRd) DNA t(1.ERM. PCR Alteración Tipo de muestra Aplicabilidad TAL1 del (SIL-TAL1) DNA 10-25% 3-5% 1-3% 1-3% t(11.14)(q24.q11) (TAL1-TCRd) t(10.q11) (HOX11-TCRd) DNA DNA Total: 10-25% .14)(p32. Aplicabilidad en LLA-T.14)(p13.

PCR Alteración PML-RARα AML1-ETO CBFβ-MYH11 tipo muestra Aplicabilidad m-RNA m-RNA m-RNA Total: 7-8% 7-8% 7-8% 21-24% MLL-PTD RNA/DNA 5-11% FLT3-ITD RNA/DNA Total: 28-33% 33-44% . Aplicabilidad en LMA.ERM.

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VALOR PREDICTIVO DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN LA DETECION DE ANOMALIAS CITOGENETICAS .

 . Buen pronóstico.Solo blastos La más frecuente de las translocaciones (25% de los casos).

30% en adultos y 5% niños Mal pronóstico CD19PeCY5 .

Inmunofenotipo de LLA-B con fenotipo BCR/ABL Normal BM CD34+ B-cells 100 10 1 102 10 3 104 100 10 1 10 2 103 104 CD10 -> AP36452.006 DNA aneuploid Bcr/abl+ ALL 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 10 2 103 104 CD10 -> RFR7690.008 CD34 -> HG30672.002 CD13 -> HG30672.003 CD13 PE -> UVJ39869.007 CD34 -> RFR7690.008 CD13 -> RFR7690.008 CD34 -> RFR7690.002 103 10 4 100 10 1 102 103 104 CD34 -> MO21489004 DNA diploid Bcr/abl+ ALL 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 10 2 103 104 CD10 -> HG30672.011 .004 100 10 1 102 CD34 PE -> UVJ39869.010 CD34 -> HG30672.

21) 11q23/t(4.CD56+ CD56+.CD19-/lo.AL: GENOTYPIC-PHENOTYPIC ASSOCIATIONS Diagnosis B-ALL Genetic t(9.17) Inv(16) t(8.CD2-/+ .CD13lo CD34+.CD10+.CD10-.CD38lo.CD15+ AML t(15.7.1+.CD13lo CD34het.CD13het MPOhi.7.CD15-/lo.CD2-/lo CD19+.CD10+.1-/+.CD20-.CD2-/lo.21) 11q23 CD34-/+.22)* t(12.11) Aberrant immunophenotype CD34hi.

Favorable.GENÉTICA Y LEUCEMIAS     AML-M2 con t(8. CD15-.21) AML1/ETO: 2/3 de novo CD19+ . CD33-. Leukemia 2002.117(3)] AML-M3 con t(15. CD13-. O y Porwit-MacDonald. [Arber. 1233-1258 .D. AML-M3 con CD56+: recaída temprana y/o resistencia a ATRA.17) PML/RAR: HLA-DR-. periodo corto de remision y disminucion de sobrevida.CD15. AJCP Ene2002. CD14AML-M7 con t(1. CD34.CD41.22) OTT/MAL: Hrusak.HLA-DR con MPO-. y usualmente CD34+.  CD61.21) : 1/2 de novo expresan CD56. Favorable. Sep16. AML-M2 con t(8. CD117-.

APC .PCy5 CD4 / CD19 PCy5 CD8 / sIg lambda .FITC CD3 .PE CD4 / CD19 .FITC CD8 / sIg lambda .DETECCIÓN RÁPIDA DE NEOPLASIAS MALIGNAS EN ASPIRADOS DE GANGLIOS LINFÁTICOS Transformed SSC CD3 .APC CD56 / sIg kappa .

DETECCIÓN RÁPIDA DE NEOPLASIAS MALIGNAS EN ASPIRADOS DE GANGLIOS LINFÁTICOS CD56 / sIg kappa .APC NORMAL CD3 .PE CD8 / sIg lambda .PE CD4 / CD19 .FITC CD4 / CD19 .PCy5 CD3 .FITC .PCy5 CD8 / sIg lambda .APC B-DLPC CD56 / sIg kappa .

Los resultados de inmunohistoquímica y citometría de flujo no son comparables Citometría: antígeno nativo (no modificado): mas sensible / menos específica (Alto VPN) Inmunohistoquimica: Antígeno modificado (Alto VPP) .

EL PORCENTAJE ESTIMADO DE INFILTRACION MEDULAR SIEMPRE ES MAYOR EN LA BIOPSIA QUE EN LA CITOMETRIA DE FLUJO Y NO GUARDAN UNA RELACION CONSTANTE .

Sindromes linfoproliferativos
COMPARACION DEL % DE INFILTRACION MEDULAR POR MORFOLOGIA Y CITOMETRIA DE FLUJO
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52

n = 200

PORCENTAJE

55

58

CASOS MORFOLOGIA CITOMETRIA

61

N = 200

BIOPSIA: FALSOS NEGATIVOS: 9%

CITOMETRIA DE FLUJO: FALSOS NEGATIVOS: 5,5%

La detección de neoplasias linfoides mediante citometría de flujo puede tener limitaciones

•Linfomas de células grandes •Linfomas anaplásicos •Enfermedad de hodgkin

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expresión aumentada tras la activación de la plaqueta.anticuerpos para el complejo GPIIb/IIIa. la unión a la superficie de la plaqueta de anticuerpos monoclonales para diferentes epítopos del complejo GPIb/IX/V disminuye. LJ-CP3 y LJ-P9. tales como 7E3. en los que se ha demostrado un aumento de su unión después de la activación de la plaqueta  GPIIb/IIIa y GPIV.  . AP-3.

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Estudios realizados en sangre entera demuestran que la trombina induce una disminución acentuada de la unión de los anticuerpos monoclonales 6D1, específico para el factor de Von Willebrand ( vWF) ligado a GPIb; FMC25, específico para GPIX y AK1 específico para el complejo. Otros agonistas, tales como el ADP, adrenalina y colágeno ejercen un efecto similar sobre la expresión de GPIb/IX/V, pero en menor grado

Estados conformacionales de GPIIb/IIIa y de sus ligandos: El anticuerpo PAC-1 se dirige al lugar de unión del fibrinógeno en el complejo GPIIb/IIIa Después de la activación del complejo GPIIb/IIIa, éste se une a moléculas de adhesión (fibrinógeno, vWF, vitronectina y fibronectina) y esta unión puede ser monitorizada con anticuerpos específicos para cada uno de los ligandos

Inmunofenotipaje de trombastenias La citometría de flujo puede ser usada junto con anticuerpos monoclonales para cuantificar el número de complejos GPIIb/IIIa y GPIb/IX/V y así, evaluar la homozigosia o heterozigosia en la enfermedad de Bernard Soulier y en la Trombastenia de Glanzmann

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IFN-y) implicados en la colaboracion con las celulas B.CD69) o de factores solubles (IL-2. . lo que puede estar directamente afectando a la capacidad de produccion de inmunoglobulinas por parte de estas ultimas.TNF-a. CD4+ y CD8+ T evaluación funcional. mediante su capacidad para inducir moleculas de superficie (CD154.

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MORFOLOGÍA Y CITOQUÍMICA CITOGENÉTICA DIAGNÓSTICO CITOMETRÍA DE FLUJO CLÍNICA BIOLOGÍA MOLECULAR .

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