INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

SERIE DE NORMAS TÉCNICAS Nº 00

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)

Instituto Nacional de Salud
Calle Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú Apartado Postal 471, Teléfono: (0511) 471-9920 Fax: (0511) 471-0779 Correo electrónico: revmedex@ins.gob.pe Página web: www.ins.gob.pe

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

SERIE DE NORMAS TÉCNICAS Nº 00

Lima, 2005

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Ministerio de Salud

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)

ELABORACIÓN: Bióloga Silvia Vega Chirinos Doctor César Náquira Velarde Laboratorio de Leishmaniosis y Chagas Centro Nacional de Salud Pública-INS

Catalogación hecha por el Centro de Documentación e Información del INS

Vega Chirinos, Silvia ; Náquira Velarde, César Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de la trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas) / Elaborado por Silvia Vega Chirinos y César Náquira Velarde. — 2ª. Ed. — Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2006. 106 p.: 14.5 x 21 cm. — (Serie de Normas Técnicas; 26) 1. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO 2. ENFERMEDAD DE CHAGAS I. Náquira Velarde, César II. Vega Chirinos, Silvia III. Instituto Nacional de Salud (Perú) IV. Perú. Ministerio de Salud

1ª. edición, 1999 ISBN 9972 – 857 – 26 – 3 (O.C.) ISBN 9972 – 857 – 30 – 1 (N°26) (2da. ed.) ISSN 1607 – 4904 Hecho el Depósito Legal Nº 1501132002-5854 © Ministerio de Salud, 2006 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jesús María, Lima, Perú Teléfono: (511) 431-0410 © Instituto Nacional de Salud, 2006 Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, Perú Teléfono: (511) 471-9920 Fax: (511) 471-0179 Correo electrónico: postmaster@ins.gob.pe Página Web: www.ins.gob.pe Publicación aprobada con R.J. Nº 164 – 2006 –J–OPD/INS Portada: Observación microscópica de formas móviles del Trypanosoma cruzi. Aspectos de identificación y diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Se autoriza su reproducción total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

CONTENIDO
Resolución jefatural ................................................................................. 5 Presentación ............................................................................................. 7 Introducción ............................................................................................... 9 CAPÍTULO I Trypanosoma cruzi ................................................................................... 11 CAPÍTULO II Diagnóstico de laboratorio ....................................................................... 21 CAPÍTULO III Obtención de la muestra sanguínea ....................................................... 29 CAPÍTULO IV Examen de la sangre: en fresco, gota gruesa, frotis .............................. 33 CAPÍTULO V Técnicas de concentración: microconcentración, concentración de Strout .................................................................................................... 37 CAPÍTULO VI Hemocultivo .............................................................................................. 41 CAPÍTULO VII Xenodiagnóstico ....................................................................................... 47 CAPÍTULO VIII Hemaglutinación indirecta (HAI) .............................................................. 51 CAPÍTULO IX ELISA ......................................................................................................... 57

CAPÍTULO X Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ......................................................... 63 CAPÍTULO XI Control de calidad .................................................................................... 69 CAPÍTULO XII Bioseguridad ............................................................................................. 73 Referencias bibliográficas ...................................................................... 77 Anexo 1: Preparación de reactivos y medios de cultivo ......................... 79 Anexo 2: Aislamiento y mantenimiento del Trypanosoma cruzi en el laboratorio ............................................................................... 87 Anexo 3: Preparación de antígenos ........................................................ 89 Anexo 4: Conservación y envío de muestras Examen de laboratorio solicitado según tipo de muestra ..................... 93 Anexo 5: Solicitud para el diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Anexo 6: Solicitud de control del diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Anexo 7: Registro de muestras para investigación y monitoreo de casos de enfermedad de Chagas Anexo 8: Protocolo para la detección de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi por ELISA Anexo 9: Protocolo para la detección de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi por inmunofluorescencia indirecta (IFI)

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

6

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

PRESENTACIÓN

La trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas es una infección parasitaria producida por Trypanosoma cruzi y transmitida por insectos hematófagos de la familia Reduvidae. La presencia de estos insectos infectados ha sido demostrada en todo el país, por lo que la transmisión vectorial de la infección está establecida en el territorio nacional. Al lado de la transmisión vectorial ocurre la no vectorial, principalmente por transfusión sanguínea, en forma congénita y también por transplante de órganos. Se sabe que las manifestaciones clínicas de la enfermedad no son características, por lo cual muchos casos pasan desapercibidos. Los métodos de diagnóstico incluyen pruebas tan simples como los exámenes de sangre en fresco, frotis, gota gruesa y más complicadas como el hemocultivo, el xenodiagnóstico, las pruebas serológicas y moleculares. El presente manual hace una descripción de los métodos más frecuentes e incluye el fundamento, el procedimiento y la lectura de los resultados. En el fluxograma se señalan las pruebas que pueden desarrollarse en los laboratorios locales, intermedios y regionales de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pública, así como los canales de envío de muestras e información. Se han añadido los capítulos de bioseguridad, control de calidad y anexos, el cual se refiere a los reactivos y la preparación requerida para los métodos de diagnóstico. El manual está especialmente dirigido para ser usado en todos los laboratorios de la red por el personal encargado del diagnóstico parasitológico y serológico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas. Cabe puntualizar que el avance en la búsqueda de métodos más específicos y sensibles, permitirá disponer de técnicas más eficientes y que en su oportunidad serán incorporados a los que usa la red.

El comité de redacción

MPR - INS - 002

7

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

8

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Chagas o trypanosomiosis americana constituye un problema de salud pública en la mayoría de países latinoamericanos; es endémica desde México hasta el sur de Chile y Argentina. Se ha calculado que por lo menos 90 millones de personas están expuestas a contraer la infección y que 18 millones están infectadas (Organización Mundial de la Salud, 1991). Esta enfermedad metaxénica es causada por el protozoario flagelado, Trypanosoma cruzi y transmitida al ser humano, al igual que a otros mamíferos, por insectos hematófagos conocidos como triatominos. Afecta diversos órganos, sistemas y aparatos, especialmente el corazón y tubo digestivo. Otras formas de contraer la infección son la transfusión sanguínea, la vía transplacentaria o transmisión congénita y el transplante de órganos. En el Perú, el mayor impacto en la salud de los pobladores, ocurre en la zona sur occidental (Ica, Arequipa, Moquegua, Tacna, valles interandinos de Ayacucho y Apurímac), con la presencia del vector Triatoma infestans, comúnmente conocido como "chirimacha", cuyo hábitat es domiciliario y en la zona nororiental (Cajamarca, Amazonas, San Martín), con los vectores de los géneros Triatoma, Pastrongylus y Rhodnius, de hábitat peridomiciliario y silvestre. En estas áreas, se estima en 24 170 el número de infectados por T. cruzi, de los cuales 1209 corresponden a formas agudas u oligosintomáticas y 22 962 a formas crónicas de la enfermedad. Se calcula que 3142 casos corresponden a niños menores de cinco años. La infección por sexo es equitativa y el grupo de edad más afectado está entre los 20 a 50 años (MINSA,1998). El presente manual tiene por objeto guiar al personal de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pública, en el diagnóstico parasitológico y serológico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas, utilizando procedimientos uniformes y comparables. El manual desarrolla los procedimientos de obtención, procesamiento, envío de muestras y medidas de bioseguridad que deben seguirse durante el trabajo en el laboratorio.

MPR - INS - 002

9

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

10

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO I

Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi agente causante de la enfermedad de Chagas, es un protozoario flagelado que durante su ciclo de vida, utiliza dos hospederos: insectos de la familia Reduvidae, que hacen las veces de vector, y mamíferos, incluyendo al ser humano, como reservorio. El parásito presenta tres formas evolutivas (figura 1): a) Trypomastigote: Es la forma infectante para los mamíferos y el insecto vector. Se caracteriza por ser de aspecto fusiforme, mide 20 micras, presenta núcleo central y cinetoplasto subterminal del cual emerge una membrana ondulante que recorre el parásito en toda su longitud y cuyo borde libre lleva un flagelo que emerge por el extremo anterior. Se le encuentra en la sangre de mamíferos y en las heces del vector. No se divide. b) Amastigote: Es la forma intracelular del parásito, se aloja principalmente en los tejidos del músculo cardíaco y del sistema neurovegetativo del tubo digestivo. Es de forma redondeada, mide de dos a cuatro micras, posee núcleo y cinetoplasto. Se dividen y forman seudoquistes conocidos como "nidos de amastigotes". c) Epimastigote: Es la forma libre que se multiplica por fisión binaria en el interior del tubo digestivo del vector. Es de aspecto fusiforme, mide 2030 micras, presenta núcleo y cinetoplasto ubicados en la parte central del parásito, forma que también se desarrolla en medios de cultivo.

1.1. CICLO BIOLÓGICO El ciclo biológico del Trypanosoma cruzi (figura 2) se inicia cuando el triatomino libre de infección se alimenta de sangre humana o de animales infectados que contiene los trypomastigotes. Los trypomastigotes se diferencian en epimastigotes en la parte anterior del tubo digestivo del triatomino, los que se multiplican y mantienen en el intestino medio durante toda la vida del insecto. En el recto del triatomino, se transforman en trypomastigotes llamados metacíclicos y son eliminados con las heces.

MPR - INS - 002

11

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

AMASTIGOTE (INTRACELULAR EN EL MAMÍFERO)

TRYPOMASTIGOTE (EN SANGRE CIRCULANTE DEL MAMÍFERO Y HECES DEL INSECTO)

EPIMASTIGOTE (EN PARTE ANTERIOR DEL TUBO DIGESTIVO DEL INSECTO Y EN CULTIVOS)

Figura 1

MPR - INS - 002

12

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Figura 2

MPR - INS - 002

13

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Cuando el insecto infectado pica o succiona la sangre al reservorio, defeca y deposita sobre la piel las heces que contienen trypomastigotes metacíclicos, formas infectantes para el mamífero. Los trypomastigotes atraviesan la piel erosionada por el rascado a causa de la picadura y en ocasiones, por la conjuntiva. Se introducen en las células adyacentes y se transforman en amastigotes; después de multiplicarse rompen la célula que los hospeda y se diseminan en la sangre como trypomastigotes e invaden los tejidos de órganos, sistemas y aparatos importantes como el corazón y plexos nerviosos del tubo digestivo, donde se reproducen como amastigotes.

1.2. MECANISMOS DE TRANSMISIÓN a) VECTORIAL El principal mecanismo de transmisión se produce por contacto de la piel abierta o mucosas con las heces de los triatominos infectados. Generalmente esto ocurre en forma mecánica al rascarse después de la picadura del insecto. El período de incubación es aproximadamente de 4 a 15 días. En el Perú todas las regiones naturales registran especies de triatominos (figura 3). De las 19 especies descritas hasta el momento, Triatoma infestans, Pastrongylus herreri (figura 4), Rhodnius ecuadorensis, Triatoma carrioni y Pastrongylus chinai, serían los más importantes que han sido hallados infectados naturalmente (figura 5). b) NO VECTORIAL Otras formas de adquirir la infección son: • Transfusión sanguínea. • Transmisión transplacentaria. • Transplante de órganos. • Accidentes en el laboratorio.

MPR - INS - 002

14

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

DISTRIBUCIÓN DE TRIATOMINOS EN EL PERÚ

Fig. 3. Distribución de los vectores de la enfermedad de Chagas. Fuente: Lumbreras H. (1972), Calderón F.(1982), Guillén Z.(1992), Cáceres et al. (2002).

MPR - INS - 002

15

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

A

B

Fig. 4. Triatominos vectores de la enfermedad de Chagas. A) Triatoma infestans espécimen adulto (hembra). B) Pastrongylus herreri espécimen adulto (hembra).

Fig. 5. Izq.: Epimastigotes en división en el intestino del triatómico infectado, se observa el cinetoplasto anterior al núcleo y agrupados en colonias. Giemsa 1000 X. Der.: Trypomastigote metacíclico en heces de triatómico infectado. Se observa el cinetoplasto en el extremo posterior, forma que infecta al hombre. Giemsa 1000 X.

MPR - INS - 002

16

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

1.3. ACCION PATÓGENA Las formas clínicas más conocidas de la efermedad de Chagas o trypanosomiosis americana son: Forma aguda Se hace evidente después de las primeras semanas de ocurrida la adquisición del parásito, con un cuadro febril y presencia o no del chagoma de inoculación como nódulo o úlcera, generalmente en cara o miembros superiores. Ocasionalmente se observa el signo de Romaña, que consiste en edema bipalpebral unilateral y ganglio preauricular aumentado en volumen (Figura 6).

Fig. 6. Paciente que presenta chagoma de inoculación en el ojo izquierdo. Los trypomastigotes invaden la piel periorbitaria o conjuntiva, produciendo el complejo oftalmo-ganglionar conocido como signo de Romaña (cortesía Dr. A. Guillén).

MPR - INS - 002

17

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Las manifestaciones generales más importantes son concomitantes con síntomas cardíacos, alteraciones electrocardiográficas e insuficiencia cardíaca secundaria a miocarditis aguda. Menos frecuentes son las manifestaciones de otros órganos. En estas formas son abundantes los trypomastigotes en sangre y los amastigotes en tejido (Figura 7).

Figura 7. Arriba: Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en sangre circulante. El núcleo se observa en posición central y el cinetoplasto subterminal. Giemsa 1000 X. Abajo: Amastigote de Trypanosoma cruzi en corte histológico del corazón. Formas redondeadas muy pequeñas, presentan núcleo y cinetoplasto. Se les observa agrupadas en el interior de las fibras musculares (nidos de amastigotes). Hematoxilina-Eosina 1000 X.

MPR - INS - 002

18

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Forma crónica Se hace evidente después de meses o años de ocurrido el ingreso del parásito. Las manifestaciones más frecuentes son de naturaleza cardíaca (insuficiencia cardíaca), nerviosa y digestiva (megaesófago, megacolon). En estas formas son escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. Forma indeterminada o de portador Se trata de personas aparentemente sanas, en las que la inoculación del parásito y los síntomas de las formas agudas o crónicas no son reconocidos por el portador del parásito. La situación del portador se evidencia, generalmente, cuando la persona desea donar sangre y el tamizaje demuestra serología positiva para Trypanosoma cruzi. Un portador puede ser asintomático toda la vida o presentar manifestaciones clínicas aun después de muchos años de haberse infectado. En esta forma, son muy escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. Forma congénita Corresponde a niños que nacen infectados por pasaje del parásito a través de la placenta de la madre. Se trata de niños prematuros que presentan generalmente hepatoesplenomegalia con gran cantidad de trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos.

MPR - INS - 002

19

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO II

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
Para realizar el diagnóstico del laboratorio, existen distintos procedimientos técnicos. Los directos o parasitológicos, que se basan en la demostración de la presencia del parásito en sangre circulante y excepcionalmente en biopsias y los inmunológicos, que detectan la presencia de anticuerpos antiTrypanosoma cruzi (figura 8). 2.1. TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS PARA LA DEMOSTRACIÓN DIRECTA DE LA PRESENCIA DEL PARÁSITO • • • • • • • • Gota fresca. Gota gruesa-frotis. Concentración de Strout. Microconcentración. Hemocultivo. Xenodiagnóstico. PCR. Biopsia.

Su empleo está indicado principalmente cuando existe sospecha clínica o epidemiológica de la forma aguda. Durante las dos a ocho primeras semanas después ocurrida la infección, existe un gran número de trypomastigotes circulando en el torrente sanguíneo y pueden detectarse mediante el examen en fresco, gota gruesa-frotis, microconcentración, concentración de Strout, hemocultivo y xenodiagnóstico. Se usan también en la investigación de Chagas congénito. El xenodiagnóstico es una técnica bastante sensible que consiste en hacer picar al posible portador del parásito con el vector libre de infección. Es aplicable tanto en la forma clínica aguda y congénita como en la crónicaportador y permite la multiplicación del parásito in vivo el cual se detecta examinando las heces del insecto a partir del 30.º día de su alimentación. El PCR o reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica que amplifica fragmentos de ADN del parásito y se detecta mediante hibridación con cebadores (fragmentos de DNA) conocidos del Trypanosoma cruzi. Actualmente está siendo ensayada por su alta sensibilidad y especificidad, principalmente en la forma congénita de la infección y en el seguimiento del tratamiento.

MPR - INS - 002

21

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

La biopsia de músculo esquelético, ganglio etc., permite la observación de los "nidos de amastigotes". Esta técnica está limitada a casos especiales de estudio por lo que no se desarrollará en el presente manual. El resultado parasitológico positivo confirma la infección, pero el resultado negativo no la descarta.

2.2. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA Trypanosoma cruzi Las técnicas más empleadas en nuestro medio son: • • • Hemaglutinación indirecta (HAI). Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Técnicas inmunoenzimáticas: ELISA.

Son de mayor aplicación durante la forma clínica crónica-portador cuando la parasitemia en el torrente sanguíneo es baja o nula y las técnicas directas no pueden evidenciar la presencia del parásito. Detectan anticuerpos a partir de la segunda o tercera semana de iniciada la infección. Las técnicas inmunológicas, además de aplicarse en el dignóstico individual de la enfermedad, son de utilidad en la selección de donantes de sangre, los estudios de prevalencia de anticuerpos específicos en poblaciones para conocer la epidemiología de la enfermedad y la evaluación del impacto de las medidas de control. En la actualidad se están ensayando fracciones antigénicas del parásito que permitirán la interpretación del estadio clínico del paciente. Así mismo, técnicas inmunocromatográficas basadas en proteínas recombinantes o péptidos sintéticos para un diagnóstico rápido de la infección (18). Los métodos son seleccionados dependiendo de la forma clínica por investigar (Figura 9).

MPR - INS - 002

22

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

ALGORITMO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Y SU SEGUIMIENTO

ANTECEDENTE EPIDEMIOLÓGICO TRANSMISIÓN VECTORIAL TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA TRANSMISIÓN CONGÉNITA TRANSPLANTE DE ÓRGANOS NO INFECCIÓN POCO PROBABLE

SINTOMÁTICO

ASINTOMÁTICO ( PORTADOR) SOSPECHA

FORMA AGUDA : BÚSQUEDA DE TRYPANOSOMAS EN SANGRE MÉTODOS PARASITOLÓGICOS : EXAMEN EN FRESCO, GOTA GRUESA CONCENTRACIÓN DE STROUT MICROCONCENTRACIÓN HEMOCULTIVO , XENODIAGNÓSTICO, PCR
NEGATIVO

FORMA CRÓNICA: DETECCIÓN DE ANTICUERPOS EN SUERO MÉTODOS SEROLÓGICOS: HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO ELISA OTROS
NEGATIVO

DIAGNÓSTICO IMPROBABLE

POSITIVO EN DOS PRUEBAS

XENODIAGNÓSTICO PCR

NEGATIVO

SEGUIMIENTO CLÍNICO

POSITIVO

POSITIVO

DIAGNÓSTICO CONFIRMADO

Figura 8

MPR - INS - 002

23

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO

FORMAS CLÍNICAS DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS AGUDA CRÓNICA PORTADOR CONGÉNITA

GOTA FRESCA

+
++ +++ +++ +++ +++
++++

+/+ ++ +++

+ ++ +++ +++ +++ +++ ++++
IgG +: Ac de la madre IgM +: Ac del recién nacido hasta los seis meses

GOTA GRUESA

MICROCONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN DE STROUT HEMOCULTIVO XENODIAGNÓSTICO

PCR

PRUEBAS SEROLÓGICAS (HAI, ELISA, IFI)

- Al inicio +++ Después de 20 días

+/+
Ac

: No útil
: :

Utilidad relativa Util : Anticuerpos

Figura 9. Utilidad de las técnicas de diagnóstico en las formas clínicas.

2.3. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO EN LA RED NACIONAL Los laboratorios de la red pueden realizar la diferentes técnicas según sus posibilidades (figura 10). 2.3.1. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO. Para el diagnóstico de laboratorio de la infección chagásica, con mayor frecuencia, se aplican las técnicas que detectan anticuerpos específicos contra el parásito ya que tienen la capacidad de evidenciarlos a partir de la tercera semana de ocurrida la infección (figura 11). Siguiendo las recomendaciones de la Organización Panamericana de la Salud, que considera necesaria la detección de anticuerpos anti T. cruzi con por lo menos dos técnicas de principio diferente, empleamos las técnicas de ELISA e IFI, la primera altamente sensible para el tamizaje de la infección y la segunda de elevada especificidad que complemente y ratifique el resultado reactivo obtenido en el tamizaje. En conjunto ambas pruebas alcanzan el 95-98% de sensibilidad y especificidad.

MPR - INS - 002

24

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA ACTIVIDADES POR NIVELES

LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL

COMPONENTE PARASITOLÓGICO MICROCONCENTRACIÓN , CONCENTRACIÓN DE STROUT, HEMOCULTIVO HAI, ELISA, IFI , INMUNOBLOT CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA Y MOLECULAR DE T. cruzi DESARROLO DE TÉCNICAS BIOMOLECULARES: PCR COMPONENTE ENTOMOLÓGICO XENODIAGNÓSTICO CONFIRMACIÓN TAXONÓMICA DE LOS VECTORES INVESTIGACIÓN DE INFECCIÓN NATURAL DE TRIATOMINOS SUSCEPTIBILIDAD DE LOS TRIATOMINOS A LOS INSECTICIDAS TÉCNICAS ALTERNATIVAS DE CONTROL VECTORIAL ESTUDIOS MORFOMÉTRICOS Y DE VARIABILIDAD GENÉTICA

INFORMACIÓN Y MUESTRAS

CAPACITACIÓN

CONTROL DE CALIDAD

LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL

ENVIO

COMPONENTE ENTOMOLÓGICO IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA, INVESTIGACIÓN DE INFECCIÓN NATURAL DEL TRIATOMINO DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD POBLACIONAL DEL VECTOR E ÍNDICE TRIPANO - TRIATÓMINICO

CAPACITACIÓN

CONTROL DE CALIDAD

LABORATORIO DE NIVEL LOCAL

EXAMEN DE GOTA FRESCA , GOTA GRUESA – FROTIS CONCENTRACIÓN DE STROUT , MICROCONCENTRACIÓN OBTENCIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO RECONOCIMIENTO DEL HÁBITAT Y CAPTURA DE TRIATOMINOS

Figura 10. Fluxograma de estudio de la enfermedad de Chagas en la red

MPR - INS - 002

25

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

ENVIO

EXAMEN DE GOTA FRESCA , GOTA GRUESA - FROTIS CONCENTRACIÓN DE STROUT , MICROCONCENTRACIÓN HEMOCULTIVO HAI, ELISA, IFI

DE

DE

RESULTADOS

MANUAL

FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN LA RED
LABORATORIO REFERENCIA REGIONAL LABORATORIO REFERENCIA NACIONAL

MPR - INS - 002
ELISA (Tamizaje) ELISA e IFI

LABORATORIO LOCAL

OBTIENE MUESTRA SANGRE

Resultado Resultados

REPORTA NO REACTIVO

-y+
Discordante

+y+

REGISTRA INFORMACIÓN

REPORTA REACTIVO

+yREPORTA NO REACTIVO

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

26
IFI
Resultado

OTRA PRUEBA (HAI o IB)

SEPARA EL SUERO O PLASMA

Envía muestra

I

Resultado

Envía muestra

+
REPORTA REACTIVO

+
REPORTA REACTIVO

I NSTITUTO N ACIONAL

- : No reactivo +: Reactivo + y +: Reactivo en ELISA y reactivo en IFI + y -: Reactivo en ELISA y no reactivo en IFI

DE

Figura 11. Las muestras con resultado indeterminado, se vuelve a examinar. Si persiste el resultado se solicita y se examina una nueva muestra.

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNÓSTICO E INVESTIGACIÓN DE LA FORMA CLÍNICA AGUDA EN LA RED
LABORATORIO LOCAL
OBTENCIÓN DE MUESTRA DE SANGRE (Persona con sospecha clínica o epidemiológica )

LABORATORIO REFERENCIA REGIONAL
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO

LABORATORIO REFERENCIA NACIONAL

HEMOCULTIVO GOTA GRUESA MICROCONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN STROUT

BIOLÓGICA Y MOLECULAR DE TRYPANOSOMAS

NO SE CONFIRMA EL CASO

-

Resultado

Resultado

+
Envía cultivo

Una prueba +
CASO CONFIRMADO

Envía muestra de sangre (5mL)

+

AISLAMIENTO DEL PARÁSITO

Figura 12. El resultado positivo en la gota gruesa o microconcentración, confirma la infección, pero el resultado negativo no asegura que está libre libre de ella; en este último caso, se examina una nueva muestra y simultáneamente se investiga la presencia de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi.

2.3.2. DIAGNÓSTICO E INVESTIGACIÓN DE LA FORMA CLÍNICA CONGÉNITA En el recién nacido, hijo de la gestante chagásica, proceder a examinar simultáneamente la presencia del parásito por las técnicas de microconcentración o PCR y el nivel basal de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi por ELISA e IFI (Figura 13). Antes de los seis meses, no es posible distinguir si los anticuerpos (IgG) específicos detectados son propios o adquiridos vía transplacentaria de la madre por lo que es de importancia realizar el seguimiento de la evolución del título serológico al tercer mes, a los seis meses y al año de vida. Si el examen parasitológico en el recién nacido resulta negativo, la elevación o mantenimiento del título de anticuerpos con relación al nivel basal certificaría la infección, y, por el contrario, si este disminuye la descartaría. Por otro lado, si el examen parasitológico en el recién nacido resulta positivo, el título de anticuerpos permitirá monitorizar el tratamiento. La detección de anticuerpos IgM como respuesta de infección temprana tiene baja sensibilidad.

MPR - INS - 002

27

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

GESTANTE CHAGÁSICA

RECIÉN NACIDO

Búsqueda del parásito
MICROCONCENTRACIÓN PCR

Basal de Ac IgG

+

-

ELISA e IFI
Titulación de suero

+
DIAGNÓSTICO CONFIRMADO (Tratamiento)

Control serológico a los 3, 6 y 9 meses

ELISA e IFI
Titulación de suero
IgG < Basal Resultado IgG > Basal DIAGNÓSTICO CONFIRMADO (Tratamiento)

NO CONFIRMA EL CASO

Figura 13. Se considera gestante chagásica cuando presenta serología reactiva en dos técnicas de principios diferente o cuando es positiva a alguna de las técnicas que demuestren la presencia del parásito.

MPR - INS - 002

28

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO III

OBTENCIÓN DE MUESTRA SANGUÍNEA
En el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, empleamos: • • • Sangre capilar para el examen directo en fresco, gota gruesa, frotis y microconcentración. Sangre venosa total para el examen por concentración de Strout y el hemocultivo (aislamiento e identificación del parásito). Suero sanguíneo para detección por HAI, ELISA, IFI.

Antes de iniciar el procedimiento de obtención de la muestra de sangre: a) Completar el formato de solicitud de diagnóstico de laboratorio (anexo 5). b) Colocar sobre la mesa de trabajo el material necesario para obtener la muestra. c) Lavarse las manos y colocarse los guantes.

d) Rotular el tubo donde se colectará la muestra con los siguientes datos: nombre, código y la fecha de obtención de la muestra. 3.1. OBTENCIÓN DE SANGRE CAPILAR 3.1.1. Materiales • • • • • • • • • • • Guantes. Algodón. Alcohol. Lancetas estériles descartables. Láminas portaobjetos (examen en fresco, gota gruesa, frotis). Laminillas cubreobjetos. Capilares heparinizados (microconcetración). Plastilina. Depósito para descarte de lancetas. Lejía al 3-5%. Plumón indeleble.

MPR - INS - 002

29

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

3.1.2. Procedimiento a) Sostener la mano izquierda del paciente con la palma hacia abajo y seleccionar el dedo medio, hacer que el paciente extienda y flexione los demás (en niños pequeños usar el dedo pulgar del pie o talón). b) Limpiar el dedo con una torunda de algodón ligeramente humedecida en alcohol para desinfectar, retirar la suciedad y la grasa de la yema del dedo. c) Pinchar directamente la yema del dedo con una lanceta estéril. Hacerlo con un movimiento rápido.

d) Desechar la primera gota de sangre, limpiando el dedo con una torunda seca de algodón. e) Colectar gotas de sangre para la gota gruesa, frotis y examen en fresco en láminas portaobjetos. f) Colecta en tubos capilares heparinizados para microconcentración: acercar el capilar al lugar de la puntura en posición horizontal y dejar que la sangre ingrese por capilaridad y llene el tubo. Sellar con plastilina uno de los extremos del capilar y mantenerlo en posición vertical hasta su procesamiento, que deberá ser inmediantamente o dentro de las tres horas posteriores para asegurar el rendimiento de la prueba. Obtener la muestra de sangre en tres o cuatro capilares heparinizados. Para rotular los capilares se recomienda sujetarlos con cinta adhesiva a una lámina portaobjeto o cartón, que servirá como soporte y brindará espacio para anotar el nombre, procedencia y fecha.

3.2. OBTENCIÓN DE SANGRE VENOSA La muestra sanguínea se puede obtener mediante el empleo de jeringa descartable o tubos al vacío. Se recomienda su uso de vacutainers para conservar la esterilidad de la muestra y por medidas de seguridad.

MPR - INS - 002

30

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

3.2.1. Materiales • • • • • • • • • • Jeringas y agujas descartables 21 1/2 G Tubos de ensayo o tubos al vacío sin anticoagulante (serología). Tubos de ensayo o tubos al vacío con /EDTA (hemocultivo). Ligadura de jebe 2,5 mm de diámetro. Algodón. Alcohol. Guantes. Lejía al 3-5%. Depósito de metal o vidrio para descarte de agujas y jeringas. Plumón indeleble.

3.2.2. Procedimiento a) Solicitar al paciente que se siente y coloque el brazo sobre la mesa de trabajo, con la palma de la mano hacia arriba. b) Colocar la ligadura dos dedos por encima de la flexión del codo, ajustarla lo suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar las venas, sin apretarla tanto, de modo que reduzca el paso de sangre por las arterias. c) Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatación de las venas.

d) Con el dedo índice de la mano izquierda palpe la vena en la que introducirá la aguja. e) Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un pedazo de algodón embebido en alcohol.

MPR - INS - 002

31

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

f)

Introducir la aguja insertada en el tubo al vacío en el centro de la vena (1 a 1,5 cm aproximadamente) y extraiga la sangre.

g) Si usa jeringa: Aplique una porción seca de algodón sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Retirar la aguja con movimiento rápido por debajo de la pieza de algodón. h) Si usa tubo al vacío:Retirar el tubo primero,y luego proceder a sacar la aguja con movimiento rápido por debajo de la torunda de algodón. I) Si la muestra no va a ser sembrada inmediatamente después de la extracción, conservarla en refrigeración (4-8 ºC). Si no se cuenta con los materiales y condiciones de esterilidad adecuadas, trasladarla inmediatamente al laboratorio de referencia regional de su jurisdicción (figura 10).

3.3. OBTENCIÓN DE SUERO SANGUÍNEO Una vez extraída la sangre, ya sea con jeringa descartable o tubo al vacío sin anticoagulante: a) Dejarla en posición vertical aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para que la sangre coagule. b) Centrifugar la muestra a 2000-2500 rpm por 15 minutos. c) Separe el suero y deposítelo en un frasco o vial estéril con tapa.

d) Rotular el vial con los siguientes datos: • Nombre/Código. • Fecha de obtención de la muestra. e) Conservar el suero hasta el momento de uso de la siguiente manera: • En refrigeración (4-8 ºC) hasta cinco días. • En congelación (-20 ºC) más de cinco días. 3.4. REGISTRO DE MUESTRAS Los datos de las fichas de diagnóstico deben registrarse en el cuaderno de laboratorio o base de datos.

MPR - INS - 002

32

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO IV

EXAMEN DE SANGRE: FRESCO, GOTA GRUESA, FROTIS
4.1. EXAMEN DE SANGRE EN FRESCO Consiste en examinar directamente con el microscopio una gota de sangre de la persona con sospecha de infección. Es la prueba más sencilla, rápida y económica que permite demostrar la presencia del parásito en la forma aguda o congénita de la enfermedad de Chagas. El rendimiento del examen es bueno,y la prueba es útil cuando la parasitemia es elevada. 4.1.1. Materiales • • • • • • • Guantes. Lanceta estéril. Algodón. Alcohol corriente. Láminas portaobjetos limpias y desengrasadas. Laminillas cubreobjetos. Cámara húmeda (Anexo 1).

4.1.2. Procedimiento a) Rotular tres láminas portaobjetos. b) Obtener la muestra de sangre capilar en lámina, según 3.1. c) Colocar una gota de sangre sobre cada lámina portaobjeto rotulada.

d) Cubrir la muestra con una laminilla. e) Conservar las preparaciones en cámara húmeda hasta su lectura. 4.1.3. Lectura Observar al microscopio con objetivo de 10X y 40X reduciendo la abertura del condensador. Buscar formas móviles (trypomastigotes) del parásito. Si

MPR - INS - 002

33

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

el resultado es negativo repetir el examen interdiario por lo menos durante una semana. Algunas veces no se puede observar al parásito, sin embargo el movimiento de los glóbulos rojos indica su presencia, por lo que se recomienda hacer láminas con gota gruesa y frotis en forma simultánea y colorear con Giemsa para la confirmación.

4.2. GOTA GRUESA La gota gruesa consiste en concentrar y defibrinar la gota de sangre de la muestra, la que posteriormente será deshemoglobinizada y teñida con Giemsa durante 30 minutos. 4.2.1. Procedimiento Obtener la muestra de acuerdo con lo indicado en 4.1 a) Colocar una gota de sangre sobre la superficie limpia de una lámina portaobjetos. b) Empleando la esquina de otra lámina, realizamos movimientos circulares, desde el centro de la gota, de modo que la sangre se distribuya uniformemente (en un área de 1cm2). c) Dejar secar a temperatura ambiente.

d) Colorear con Giemsa. 4.2.2. Coloración Giemsa 4.2.2.1. Materiales • • • • Solución Giemsa stock (Anexo 1). Solución amortiguadora (Anexo 1). Probeta 10 mL. Varilla de coloración.

4.2.2.2. Procedimiento a) Colocar las láminas sobre la varilla de coloración. b) Preparar el volumen necesario de solución Giemsa diluida, aproximadamente 2 mL por lámina.

MPR - INS - 002

34

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

• En la probeta colocar 0,1 mL (2 gotas) de solución Giemsa stock por cada mL de solución amortiguadora. • Homogeneizar la solución colorante. c) Cubrir la muestra con la solución Giemsa diluida, (figura 14).

d) Dejar actuar el colorante durante 30 minutos. e) Lavar con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente.

Figura 14. La coloración Giemsa, facilita la identificación del parásito en base a sus características morfológicas tintoriales.

4.3. FROTIS El frotis es el extendido de una gota de sangre en una lámina portaobjetos seguida de la fijación de la muestra y posterior tinción con Giemsa (Figura 15). 4.3.1. Procedimiento Obtener la muestra de acuerdo con lo descrito en el ítem 3.1. a) Colocar una gota de sangre en el extremo de la superficie de una lámina portaobjetos limpia. b) Acercar a la muestra el borde de otra lámina portaobjetos, posesionándola de tal manera que formen un ángulo de 45º y dejar que la muestra se distribuya en el borde de la lámina. c) Conservando el ángulo de 45º, deslizar la lámina auxiliar sobre la superficie de la lámina con la muestra. El extendido de sangre o frotis debe ser una película fina.

d) Dejar secar a temperatura ambiente.

MPR - INS - 002

35

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

e) Fijar la muestra con metanol absoluto P.A durante un minuto f) Colorear con Giemsa.

4.4. LECTURA DE LA GOTA GRUESA Y FROTIS Enfocar con el objetivo de 10X, luego, colocar una gotita de aceite de inmersión sobre la muestra y examinar con el objetivo de inmersión 100X. Examinar toda la lámina en el microscopio. Resultado Informar la presencia o ausencia de formas trypomastigotes de Trypanosoma cruzi.

Figura 15. Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en preparaciones de frotis y gota gruesa de sangre circulante. Se observa el cinetoplasto posterior al núcleo central, la membrana ondulante y el flagelo.

MPR - INS - 002

36

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO V

TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN
5.1. MICROCONCENTRACIÓN La técnica consiste en concentrar los parásitos de una muestra de sangre colectada en tubos capilares heparinizados por centrifugación. Los elementos de la sangre se separan por gradiente de densidad, concentrándose los glóbulos rojos en la parte inferior del capilar, sobre ella se ubica un anillo blanquecino de 1 mm de altura conformado por los glóbulos blancos y en la parte superior líquida transparente constituida por el plasma. Los tripanosomas presentes en la muestra se ubicarán entre los glóbulos blancos y el plasma.

Figura 16. Separación de los elementos sanguíneos por gradiente de densidad.

5.1.1. Equipos y materiales Microscopio con objetivos de 10X y 40X. Microcentrífuga o centrífuga. Tubos capilares heparinizados. Láminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos.

5.1.2. Procedimiento a) Obtener la sangre en los capilares heparinizados según ítem 3.1.2. b) Centrifugar la muestra durante un minuto a 5000 rpm.

MPR - INS - 002

37

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

c)

Sujetar el capilar a una lámina portaobjetos con cinta adhesiva (Figura 16) .

d) Conservar el capilar en forma vertical hasta el momento de la lectura.

5.1.3. Lectura Observar directamente en el microscopio la zona del plasma aproximadamente a 10 mm de los glóbulos blancos. Focalizar inicialmente con el objetivo de 10X de aumento y luego buscar las formas trypomastigotes móviles del parásito con el objetivo de 40X (Figura 17).

Figura 17. Microconcentración.

También se puede realizar la lectura colocando la muestra entre la lámina y laminilla, para ello, con el borde de una lámina portaobjetos hacer una marca en la zona donde se ubican los parásitos y luego quebrar el capilar con cuidado. Dejar caer la muestra sobre un portaobjetos, cubrirla con una laminilla y observar el microscopio.

5.1.4. Resultado Positivo: Se observan formas flageladas móviles de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi. Negativo: No se observan formas de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi.

MPR - INS - 002

38

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

5.2. CONCENTRACIÓN DE STROUT Esta técnica se basa en la concentración de los parásitos en la muestra sanguínea por centrifugación y examen del sedimento al microscopio en busca de trypomastigotes móviles de Trypanosoma cruzi. Es una técnica simple y de buena sensibilidad en casos agudos de enfermedad de Chagas y en el seguimiento de congénitos. El suero se debe conservar para ser examinado por técnicas inmunológicas.

5.2.1. Equipos y materiales Microscopio. Centrífuga. Jeringa hipodérmicas estéril o sistema de tubos al vacío sin anticoagulante. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Tubos de centrífuga. Láminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Asas microbiológicas.

5.2.2. Procedimiento a) Extraer 5-10 mL de sangre venosa en un tubo sin anticoagulante, según ítem 3.3. b) Dejar a temperatura ambiente hasta que se coagule. c) Separar el suero.

d) Centrifugar este suero a 160g (800 rpm) durante dos minutos para descartar los glóbulos rojos. e) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 300-600 g (2000-2500 rpm), durante diez minutos. f) Separar el sobrenadante (suero) y conservarlo a 4 ºC para el análisis serológico.

MPR - INS - 002

39

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

g) Colocar una alícuota del sedimento obtenido en una lámina portaobjetos. h) Cubrir la muestra con una laminilla y proceder a la lectura.

5.2.3. Lectura Observar en el microscopio la presencia de trypomastigotes móviles de Trypanosoma cruzi, con objetivos de 10X ó 40X de aumento. Es aconsejable observar cuidadosamente varias preparaciones en busca de formas móviles del parásito.

MPR - INS - 002

40

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO VI

HEMOCULTIVO

Consiste en sembrar una muestra de sangre en medio de cultivo artificial o celular, con la finalidad de amplificar el número de parásitos presentes y confirmar el diagnóstico. Presenta una sensibilidad alta en los casos agudos y congénitos. El cultivo en medio artificial es factible de realizar en cualquier laboratorio bacteriológico, no así en medio celular que requiere de laboratorio mejor equipado. La limitación de la prueba está en el prolongado tiempo de incubación que se requiere (hasta dos meses) para emitir el informe del resultado. El cultivo en medio artificial requiere: 6.1. EQUIPO Estufa 28 – 30°C. Centrífuga. Microscopio óptico 10x, 40x, 100x de aumento y ocular 10x. Cabina de flujo laminar o cubículo. Balanza. Refrigerador. Micropipeta 5 – 50 uL, 50 – 1000 uL.

6.2. MATERIALES Y REACTIVOS (Figura 18) Tubos al vacío heparinizados. Agujas para tubos al vacío. Portaobjetos. Cubreobjetos 22 x 22 mm. Gradillas para tubos de ensayo. Asa de siembra. Puntas amarillas y azules estériles. Tubos con medio de cultivo agar sangre (Anexo 1). Solución salina estéril (Anexo 1). Solución de antibióticos (Anexo 1).

MPR - INS - 002

41

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Figura 18. Materiales y reactivos empleados en el hemocultivo.

6.3. MUESTRA. 5 mL de sangre de la vena del brazo obtenido en tubo heparinizado según 4.2.

6.4. PROCEDIMIENTO (Figura 19) Trabajar en condiciones de esterilidad bajo la cabina de flujo laminar o en un cubículo con luz UV o mechero. a) Retirar los tubos conteniendo medio de cultivo del refrigerador. b) Rotularlos con un marcador tinta indeleble la fecha y código de muestra. Cinco tubos por cada muestra. c) Adicionar la solución salina estéril (0,5 mL) a cada tubo. d) Sembrar 1 mL de la sangre heparinizada en cada tubo. e) Colocar los tubos en estufa graduada a 28 °C. Agitarlos una vez al día. f) A los siete días revisar el cultivo. Con el asa de siembra extraer una gota del cultivo, colocarla entre lámina y laminilla y observar al microscopio con objetivo de 10 X.

MPR - INS - 002

42

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

HEMOCULTIVO

SANGRE OBTENCIÓN DE MUESTRA

CONCENTRACIÓN POR CENTRIFUGACIÓN 5 MIL rpm x 15minutos

CULTIVO

28 °C

LECTURA 7° DÍA

EN FRESCO Observación al microscopio 10 x ó 40 x Formas móviles del parásito

15° DÍA

COLORACIÓN GIEMSA Formas típicas, con citoplasma, azul claro, núcleo y cinetoplasto de color azul violeta SUBCULTIVO CADA 15 DIAS

28 °C

LECTURA FINAL 60° DÍA

EN FRESCO Observación al microscopio 10 x ó 40 x Formas móviles del parásito

COLORACIÓN GIEMSA Formas típicas, con citoplasma, azul claro, núcleo y cinetoplasto de color azul violeta

Figura 19. Pasos para el hemocultivo.

MPR - INS - 002

43

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

6.5. LECTURA a) El movimiento característico de los epimastigotes (figuras 20 y 21) permite detectarlos con facilidad, sin embargo, es necesario colorearlos para confirmar su morfología. b) Realizar un extendido con el asa de siembra, luego fijar con metanol durante tres minutos y colorear con Giemsa. c) Observar en el microscopio la forma típica, el núcleo de color azul violeta y el cinetoplasto más denso y oscuro. Se les visualiza aislados o agrupados a manera de rosetas. d) Si no se observan formas móviles continuar la incubación a 28 °C y repetir la lectura a los siete días. e) Cada 15 días repicar 0,5 mL de los cultivos negativos en medio fresco. (resiembra a ciegas). f) El tiempo que se requiere para demostrar la positividad del cultivo, depende de la densidad parasitaria de la muestra sembrada y de la adaptabilidad del parásito al medio. Generalmente esto ocurre después de uno a dos meses. g) Antes de realizar la lectura final, centrifugar el sobrenadante del cultivo y observar en el sedimento, la presencia o ausencia del parásito.

Figura 20. Observación directa de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en alícuota de cultivo positivo. Se caracterizan por ser de aspecto fusiforme y presentar movimiento ondulante (1000X).

MPR - INS - 002

44

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Figura 16. Epimastigote de Trypanosoma cruzi en medio de cultivo. Giemsa 1000 X.

6.6. RESULTADO Cultivo positivo: Se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi. Cultivo negativo: No se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma. cruzi.

MPR - INS - 002

45

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

46

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO VII XENODIAGNÓSTICO
Es una técnica que permite la multiplicación del parásito in vivo y consiste en hacer picar a la persona sospechosa de infección por el vector libre de infección, de preferencia la especie de triatomino de mayor importancia en la región. Es aplicable tanto en la forma clínica aguda como en la crónica portador.

7.1. Equipos Microscopio con objetivo de 20X de aumento.

7.2. Material biológico Ninfas de III o IV estadio de triatominos que proceden de criaderos en laboratorio.

7.3. Materiales Cajas de madera o plástico apropiadas (Figura 22). Tul. Bandas elásticas. Sujetadores de tela. Pollos para alimentación de triatominos. Pinzas punta fina. Láminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos.

MPR - INS - 002

47

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Figura 22. Caja para xenodiagnóstico.

7.4. Procedimiento a) Colocar en cada caja de cinco a diez ninfas de triatominos del III y IV estadio, los que deben estar en ayuno por lo menos 15 días. b) Cubrir la caja con tul, asegurándolo con una banda elástica. c) Rotular la caja con el número de muestra, nombre y fecha de aplicación.

d) Sujetar la caja sobre el brazo del sospechoso de infección mediante una venda de tela, permitiendo que los triatominos se alimenten por 20 minutos o hasta observar que las ninfas hayan aumentado su volumen por la sangre ingerida (Figura 23). e) Conservar la caja con los triatominos a temperatura del laboratorio 25º-30 ºC y 70% de humedad relativa. f) Alimentarlos cada 15 días, sujetando las cajas con las ninfas sobre la piel desnuda de un ave (pollo, paloma u otro).

g) A los 30 días, examinar en el microscopio una muestra de heces de los triatominos. Obtener la muestra sobre una lámina portaobjetos por presión del abdomen del insecto con una pinza. h) Cubrir la muestra con una laminilla para examinarla en el microscopio. Se puede realizar el examen individual de cada triatomino o una alícuota del pool de las muestras fecales. i) De ser negativo, examinar otra alícuota del contenido digestivo del triatomino a los 60 días.

MPR - INS - 002

48

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Se aconseja la aplicación de por lo menos cuatro xenodiagnósticos para alcanzar su mayor sensibilidad en los casos de infección crónica o portador.

Figura 23. Aplicación del xenodiagnóstico.

7.5. Lectura Examinar la muestra en el microscopio (objetivo de 20X de aumento), buscando formas móviles: epimastigotes o trypomastigotes metacíclicas del parásito que son identificadas por el movimiento ondulante característico (Figura 24).

Figura 24.

MPR - INS - 002

49

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

7.6. Resultado Xenodiagnóstico positivo: Se observan formas trypomastigotes o epimastigotes de Trypanosoma cruzi. Xenodiagnóstico negativo: No se observan tripanosomas o epimastigotes. De ser la prueba positiva, se puede realizar el aislamiento del parásito sembrando la muestra en medios de cultivo o inoculando experimentalmente en ratones (anexo 2) para posteriores estudios de caracterización e identificación.

MPR - INS - 002

50

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO VIII

HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI)
La hemaglutinación indirecta emplea glóbulos rojos de carnero, previamente tratados con ácido tánico, como soporte de extractos solubles del parásito (antígeno). Es una prueba altamente sensible y específica. En la figura 17 se muestra un diagrama de la prueba. Los kits comerciales simplifican la ejecución de la técnica, proporcionando el antígeno absorbido a los glóbulos rojos.

8.1. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • • • • • • • Placas de poliestireno con fondo en U. Micropipeta de 5 a 50 µL. Micropipeta multicanal de 5 a 50 µ. Puntas para micropipeta. Solución Alsever (Anexo 1). Sangre de carnero. Suero fisiológico (Anexo 1). Buffer fosfato salino pH 7,2 (Anexo 1). Buffer fosfato salino pH 6,4 (Anexo 1). Ácido tánico (Anexo 1). Solución diluyente (Anexo 1). Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Antígeno de Trypanosoma cruzi (Anexo 3).

8.2. MUESTRA: Suero problema.

MPR - INS - 002

51

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

8.3. SUSPENSIÓN DE GLÓBULOS ROJOS a) Obtener sangre estéril de carnero mediante punción de la vena yugular en un recipiente también estéril que contiene igual volumen de Alsever. b) Lavar los glóbulos rojos por tres veces con suero fisiológico, centrifugando a 3000 rpm durante diez minutos. c) Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 2,8% buffer fosfato pH 7,2. Ej: para preparar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos, tomar 0,14 mL del sedimento de glóbulos rojos y resuspenderlo en 4,86 mL de buffer fosfato pH 7,2.

8.4. ADSORCIÓN DE ANTICUERPOS HETERÓFILOS a) A 0,1 mL de suspensión de glóbulos rojos, adicionar 0,5 mL del suero problema. b) Incubar 30 minutos a 37 ºC (baño María). c) Mantener durante dos horas a 4ºC.

d) Centrifugar por diez minutos a 2000 rpm Separar el suero absorbido de los glóbulos rojos. 8.5. TANIZACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS a) Mezclar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos con 5 mL de ácido tánico diluido 1/20 000 e incubar por 10 minutos a 37 ºC. b) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm. c) Descartar el sobrenadante.

d) Resuspender el sedimento en 10 mL de buffer fosfato pH 7,2. e) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm. f) Descartar el sobrenadante.

g) Resuspender el sedimiento en 5 mL de solución salina. 8.6. SENSIBILIZACIÓN a) Tubo N.° 1: Colocar 5 mL de Antígeno (diluido 1/20 en buffer fosfato pH 6,4). Adicionar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos tanados. Tubo N.° 2 (Control): Colocar 5 mL de buffer pH 6,4. Adicionar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos tanados.

MPR - INS - 002

52

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

b) Incubar los tubos durante 20 minutos a 37 °C. c) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm.

d) Eliminar el sobrenadante. e) Lavar el sedimento con 10 mL de solución diluyente. f) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm.

g) Descartar el sobrenadante. h) Resuspender el sedimento en 5 mL de solución diluyente.

HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
TANIZACIÓN

+
HEMATÍES

ÁCIDO TÁNICO

HEMATÍES TANADOS

SENSIBILIZACIÓN

+
HEMATÍES TANADOS ANTÍGENO DE T. cruzi HEMATÍES SENSIBILIZADOS

DESAROLLO DE LA PRUEBA

+
HEMATÍES SENSIBILIZADOS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS HEMAGLUTINACIÓN

Figura 25

MPR - INS - 002

53

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

8.7. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA a) Rotular una placa de microtitulación para realizar diluciones de los sueros a evaluar al doble, incluyendo los sueros controles positivo y negativo. Iniciar en la dilución ¼ hasta 1/512. Seguir el esquema adjunto (Figura 26). b) Se recomienda colocar la placa de microtitulación sobre un papel, toalla o franela humedecida para prevenir el efecto de la electricidad estática. c) Colocar en los pozos de la fila A, 75 uL de la solución diluyente y 50 uL en los pozos de las filas B, C, D, E, F, G y H.

d) Agregar a cada pozo de la fila A, 25 uL del suero a evaluar, homogeneizar aspirando y expeliendo varias veces con la pipeta. e) Luego realizar diluciones sucesivas al doble. Con la ayuda de una micropipeta multicanal tomar 50 uL de la dilución ¼ de cada suero por evaluar y verterlo en los pozos de la fila siguiente, homogeneizar y repetir igual con la siguiente fila. f) Agregar 50 uL de la suspensión antigénica en cada pocillo.

g) Agitar con suaves golpes en los bordes de la placa. h) Dejar la placa en reposo sobre una superficie plana. i) Realizar la lectura después de una hora y a las 24 horas.

Cuando se evalúan muchos sueros (Figura 27) es apropiado, primero, realizar el tamizaje con la dilución de valor diagnóstico (¼). De esta manera, seleccionar los positivos y, en un segundo ensayo, proceder a titularlos realizando las diluciones correspondientes. 8.8. LECTURA (Figuras 26 y 27). La falta de reactividad (negativo), se manifiesta por la sedimentación del antígeno en forma de botón. La reactividad del suero (positivo), se manifiesta por la formación de una malla de bordes irregulares que cubre al 50-100% del fondo del pocillo. Se considera positiva la muestra a partir de la dilución ¼ y se informa con el título de la última dilución positiva.

MPR - INS - 002

54

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

8.9. RESULTADO Reactiva: Se detecta la presencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. Título: según lectura.

No reactiva: Ausencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.

HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA

DILUSIÓN DEL SUERO

Figura 26

MPR - INS - 002

55

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
Tamizaje de sueros en la dilución de valor diagnóstico 1/4

CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi CGR: CONTROL DE GLÓBULOS ROJOS

En esta placa los pozos D4, G12 y H12 corresponden a sueros reactivos (positivos)

Figura 27

MPR - INS - 002

56

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO IX

ELISA
La técnica ELISA emplea antígenos solubles de Tripanosoma cruzi, adheridos a soportes inertes (placa de microtitulación) y antiglobulinas humanas conjugadas con enzimas, como detectores de la reacción antígenoanticuerpo (Figura 28). Es un método de gran sensibilidad, pero cuya especialidad está sujeta a la calidad de los antígenos y reactivos empleados por lo que exigen una rigurosa estandarización. Los kits comerciales contienen las placas con antígeno y reactivos. La reacción suele hacerse positiva después de 20 días de infección. 9.1. EQUIPOS E INSTRUMENTOS • • • • • • • • • Estufa de incubación 37 °C. Reloj. Balanza de precisión. Refrigeradora. Lector ELISA. Lavador de placas ELISA. Micropipeta de 0,5 a 10 µL y 10 a 100 µL. Micropipeta multicanal de 50-200 µL. Potenciómetro.

9.2. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • Placas con fondo plano, sensibilizadas con antígeno de Trypanosoma cruzi (ver anexo 3). Antigammaglobulina G humana conjugada con peroxidasa (titulado). Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Suero control interno. Peróxido de hidrógeno 30%. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2 (Anexo 1). Buffer de lavado. PBS pH 7,2 - Tween 20 al 0,05% (Anexo 1).

MPR - INS - 002

57

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

• • • • •

Solución de bloqueo (PBS pH 7,2 - BSA 3%) (Anexo 1). Solución diluyente (PBS pH 7,2 - BSA 1%) (Anexo 1). Solución estabilizadora para el sustrato. Cromógeno: Orto-phenilendiamina (OPD). Ácido sulfúrico 2,5 M.

ELISA
MÉTODO INDIRECTO PARA LA DETECCIÓN Y MEDICIÓN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi

Figura 28

MPR - INS - 002

58

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

9.3. PROCEDIMIENTO (Figura 28). 9.3.1. Retirar del refrigerador la placa sensibilizada con el antígeno y dejar que tome la temperatura ambiente. • Lavar los pozos adicionando a cada uno de ellos 300 µL de PBS Tween 0,05%. Repetir el lavado por tres veces. • En el último lavado eliminar por completo el líquido residual, invirtiendo la placa sobre papel absorbente (aplicar golpes firmes). 9.3.2. Bloqueo de sitios inespecíficos mediante la adición de 100 µL de PBS - BSA 3% en cada pozo. • Dejar una hora a temperatura ambiente. • Lavar al igual que en 9.3.1. 9.3.3. Incubación de los sueros: • Rotular la placa de acuerdo con el esquema de distribución de suero (Figura 29). Se aconseja realizar duplicados. • Incluir en cada ensayo dos controles positivos y tres controles negativos, un control interno y un blanco de reactivos. • Colocar 100 µL por pocillo, de las diluciones de los sueros (1/100). Mezclar aplicando suaves golpes en las paredes laterales de la placa. • Incubar 30 minutos en estufa a 37 ºC, con la placa tapada para evitar la evaporación. • Retirar el líquido de los pozos con la ayuda de una micropipeta y descartar dicho líquido en un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 5%. • Lavar los pozos al igual que en el punto 9.3.1. 9.3.4. Incubación del conjugado: • Colocar 100 µL por pozo del conjugado preparado de acuerdo con el título obtenido previamente. • Incubar 30 minutos en estufa a 37 ºC. • Lavar al igual que en 9.3.1. 9.3.5. Reacción con el sustrato: • Preparar minutos antes de su uso la solución del sustrato más cromógeno (OPD) ver anexo. • Colocar 100 µL en cada pozo. • Dejar en oscuridad y a temperatura ambiente durante 15 minutos. • Detener la reacción adicionando 100 µL de ácido sulfúrico 2,5 M, por pozo. 59

MPR - INS - 002

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

9.4. REACTIVOS COMERCIALES (KITS) En caso de usar kits, seguir estrictamente las instrucciones del inserto contenido en la caja tanto en el procesamiento, como para determinar la validez del ensayo y calcular el valor de corte. 9.5. LECTURA Para que el examen tenga validez, los controles positivo, negativo y control interno deben reaccionar como tales, es decir que la absorbancia de cada uno de ellos corresponda al valor predeterminado. 9.5.1. Con lector de ELISA La presencia o ausencia de anticuerpos anti Tripanosoma cruzi se determina, relacionando la absorbancia de la muestra a 450 nm respecto al valor del corte. Se ha definido el valor del corte (VC) como el punto de cruce entre el promedio de las lecturas de los sueros controles no reactivos y reactivos más dos desviaciones estándar (DS). VC = CN + 2 DS El valor de corte promedio encontrado en nuestro laboratorio es de 0,320 Reactivo: Muestras con absorbancias mayores de 0,384. No reactivo: Muestras con absorbancias menores de 0,256. Indeterminado: Se consideran así aquellas cuyas absorbancias caen entre ±20% del valor de corte. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente, si el resultado persiste solicitar una nueva muestra luego de un mes, tiempo suficiente para que el nivel de anticuerpos sea mayor en caso de tratarse de una infección reciente. 9.5.2. Lectura visual: Si se opta por este método de interpretación debe considerarse: Reactiva: Muestra con coloración netamente amarillo-naranja. Colores tenues mayores que el del control negativo, requieren la interpretación instrumental. No reactiva: Toda muestra que no presente coloración o que ésta sea igual que la de los controles negativos. 9.5.3. Titulación Para obtener el título de las muestras reactivas en el tamizaje, se realiza diluciones dobles de los sueros a partir de 1/100 y se procede de acuerdo con el punto 9.3.

MPR - INS - 002

60

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

9.6. INFORME E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS • Reactivo: Se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi. Título: el título de la muestra es la dilución del suero en la que la absorbancia resulta mayor o igual que el valor de corte. No reactivo: No se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi.

Figura 29

MPR - INS - 002

61

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

62

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO X

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
La técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), emplea como antígeno epimastigotes de Trypanosoma, obtenidos de cultivo y fijados en láminas sobre las que se realiza la reacción antígeno-anticuerpo. La formación de este complejo es evidenciada por una antiglobulina humana marcada con fluoresceína (Figura 30). Los kits comerciales proporcionan la lámina preparada y los reactivos. Prueba altamente sensible y específica.

10.1. EQUIPO • • • • • • • Microscopio para fluorescencia. Estufa graduada a 37 °C. Balanza de presición. Potenciómetro. Reloj. Refrigerador. Secadora o ventilador.

10.2. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • Placas para microtitulación, fondo en U. Couplin o recipientes para lavado de láminas. Puntas de 10-100 µL y de 0,5-10 µL. Pizetas. Papel, toalla o secante. Laminillas cubreobjetos de 24 x 48 mm. Cámara húmeda.

MPR - INS - 002

63

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

• • • • • • •

Solución de azul de Evans. Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Láminas IFI impregnadas con Trypanosomas (Anexo 3). Conjugado Anti lgG humana - FITC, titulado (Anexo 1). Buffer fosfato salino pH 7,4 (Anexo 1). Glicerina tamponada pH 8,5 (Anexo1).

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

PRIMERA ETAPA

+
ANTÍGENO DE TRYPANOSOMA ANTICUERPO COMPLEJO Ag-Ac

SEGUNDA ETAPA

+

COMPLEJO Ag-Ac

ANTIGLOBULINA MARCADA CON FLUORESCEINA

COMPLEJO Ag-Ac MARCADO

Figura 30

MPR - INS - 002

64

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

10.3. PROCEDIMIENTO Elaborar el protocolo de trabajo en el fomato del anexo 9, asignar un casillero para cada suero por evaluar y anotar en él su código.

En cada corrida se debe incluir el control positivo (CP), control negativo (CN), control interno para IFI (CI) y control de reactivos o blanco (B). a) Retirar del congelador las láminas IFI fijadas con Trypanosomas y dejarlas secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador. b) En una placa para microtitulación, realizar la dilución 1/32 de cada suero y de los controles. Para ello, dispensar en cada pozo 155 µL de buffer diluyente y 5 µL de cada suero por evaluar. c) Homogeneizar el suero diluido absorbiendo y expeliendo con la micropipeta varias veces, luego siguiendo el protocolo elaborado, dispensar 15 uL de la dilución 1/32 de cada suero sobre el área del círculo correspondiente en la lámina IFI. d) Colocar la lámina en una cámara húmeda y llevarla a incubar a la estufa 37 °C durante 30 minutos. e) Retirar la lámina de la estufa y lavarla por tres veces consecutivas con PBS-Tween 80 al 1% de la siguiente manera: la primera vez con la ayuda de una pizeta retirar los sueros de la lámina, la segunda y tercera vez en un frasco Coplin mantenido en agitación suave durante ocho minutos cada vez. f) Colocar la lámina sobre papel secante y dejar secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador.

MPR - INS - 002

65

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

g) Agregar 15 uL del conjugado Anti IgG humano marcado con fluoresceína (titulado), en cada área circular e incubar a 37 °C por 30 minutos. h) Retirar la lámina de la estufa y lavar al igual que en el ítem e, después del último lavado, enjuagar con agua destilada y dejar secar al igual que en el ítem f. i) Agregar 15 uL de la solución diluida de azul de Evans en cada pocillo y dejar durante cinco minutos a temperatura ambiente. j) Enjuagar la lámina con agua destilada, empleando una pizeta. Luego, dejarla secar a temperatura ambiente. k) Colocar una gotita de glicerina tamponada y sobre ella una laminilla cubreobjetos l) Conservar la lámina en oscuridad hasta la lectura, se recomienda que sea el mismo día del procesamiento para evitar la pérdida de fluorescencia.

10.4. LECTURA La lectura se realiza en microscopio para fluorescencia, con objetivo de 20X. Primero revisar los controles, en el control positivo debe observarse la superficie y el flagelo de los parásitos de un color verde manzana fluorescente. (Figura 31) y en el control negativo al igual que en el blanco de reactivos, debe observarse el parásito de color rojizo opaco, sin fluorescencia. Si los controles responden como tales, la corrida es válida y se continua con la lectura de las muestras examinadas De acuerdo con la intensidad o ausencia de fluorescencia que muestran los trypanosomas se registran las lecturas como: REACTIVO (+). Cuando la superficie o los bordes de los parásitos fluorescen francamente de un color verde manzana. NO REACTIVO (-). Si los parásitos se observan opacos entre rojizos y marrones oscuros INDETERMINADO (I), se observa una débil fluorescencia no homogénea en los parásitos.

MPR - INS - 002

66

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Figura 31: Epimastigotes de T. cruzi en la prueba de Inmunofluorescencia Indirecta. a) Suero Reactivo, b) Suero No reactivo

10.5. INFORME E INTERPRETACIÓN DE DE RESULTADOS El título de valor diagnóstico en el laboratorio es 1/32 REACTIVO: Se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi. NO REACTIVO: No se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi. INDETERMINADO: No concluyente. Es necesario repetir el ensayo y de persistir el resultado se debe evaluar una nueva muestra, obtenida tres semanas después de la primera, tiempo necesario para que el nivel de anticuerpos sea mayor y detectable en caso la infección sea reciente.

10.7. TITULACIÓN DE SUERO REACTIVO Realizar la titulación del suero reactivo 1/32, de acuerdo con el esquema siguiente.
DILUCION 1 1/32 S6 2 1/64 3 1/128 4 1/256 5 1/512 6 1/ 1024

SUERO

S6

CN

B

CI

CP

7

8

9

10

11

12

CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi

CI: SUERO CONTROL INTERNO B: BLANCO (control de reactivos)

MPR - INS - 002

67

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Efectuar el procedimiento de la técnica IFI evaluando cada suero en diluciones seriadas al doble a partir de 1/32 Se considera el título a la mayor dilución que presente franca fluorescencia en la superficie del parásito.

10.8. INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS IgM Para investigar la presencia de anticuerpos IgM anti T. cruzi, se seguirá el procedimiento descrito en 9.3, 9.4 y 9.5, seguir los mismos pasos, la diferencia está en el uso, en este caso, de conjugado anti IgM humano.

MPR - INS - 002

68

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPITULO XI

CONTROL DE CALIDAD
La evaluación de la calidad del diagnóstico de laboratorio o proceso de aplicación de medidas de control de calidad interno y externo, permiten determinar la fiabilidad de los resultados que emite el laboratorio. CONTROL DE CALIDAD INTERNO El objetivo del control de calidad interno es asegurar que los procesos se ejecutan correctamente, desde que la muestra ingresa al laboratorio hasta la emisión de los resultados y que los equipos e instrumentos usados tengan óptimo desempeño. Una de las actividades del control de calidad interno en el diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas, consiste en la inclusión de un Suero Control Interno (CI), en el trabajo diario, además de los habituales controles positivos y negativos. El CI es un suero caracterizado como reactivo débil a la detección de anticuerpos (IgG), anti Trypanosoma cruzi, con título conocido y cercano al valor de corte, es específico para cada técnica o kit y debe ser tratado al igual que las demás muestras por examinar. Permite monitorizar la calidad del procedimiento ya que su resultado refleja objetivamente las variaciones ocurridas en cada ensayo y facilita la toma de decisión oportuna para corregir fallas o errores. Las lecturas diarias de absorbancia del CI se anotan en la gráfica de Levey Jennings y se analizan e interpretan de acuerdo con las reglas de Shewart (9). (Figura 32). Cuando la lectura de absorbancia del suero control interno cae fuera de los límites permitidos (+/- 2 desviaciones estandar), se debe repetir el ensayo y si se reitera el resultado se procederá al análisis para detectar las posibles causas de error. Recomendaciones generales • Las muestras de suero por procesar no deben presentar hemólisis ni contaminación (turbidez). Deben estar rotuladas con el código y fecha de obtención de muestra y ser conservadas en refrigeración (4-8 °C), hasta su procesamiento. 69

MPR - INS - 002

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

DO/VC

Valores de Absorbancia / Valor de Corte

+ 3 ds

+ 2 ds

0,3

x
- 2 ds

- 3 ds

Ensayos
1 4 8 12 16 20

Figura 32. Gráfico de Levey y Jennings. X : media ds: desviación estándar

• •

No usar reactivos o kits con fechas vencidas. Emplear equipos e instrumentos en óptimas condiciones, con mantenimiento y calibración (balanza, potenciómetro, lector ELISA, lavador de placas, microscopio para inmunofluorescencia, micropipetas). Seguir los instructivos de uso de cada equipo. Tener en cuenta la rutina básica de mantenimiento requerido por cada equipo (8). Chequear los filtros del lector ELISA antes de iniciar los ensayos y llevar el registro de tiempo de uso de la lámpara del microscopio para inmunofluorescencia. Realizar el control diario de la temperatura ambiente del laboratorio y de los siguientes equipos: refrigerador donde se conservan los kits, estufa empleada para los pasos de incubación 37 °C y congeladora donde se conservan los sueros controles y otros reactivos. En el procesamiento de las muestras se debe seguir estrictamente las instrucciones descritas en el manual de procedimientos o en los insertos proporcionados por el fabricante de reactivos comerciales (kits), en uso. Incluir en cada ensayo el CI además de los controles positivo, negativo, y blanco de reactivos propio de cada técnica.

MPR - INS - 002

70

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Analizar la validez del ensayo considerando los parámetros establecidos en el kit y el resultado del control interno.

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO O EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO La participación en programas de evaluación externa, permite evaluar el desempeño del laboratorio, esta actividad la desarrolla el Laboratorio de Referencia Nacional del Instituto Nacional de Salud mediante un panel de sueros caracterizados, remitidos a los laboratorios de la red nacional anualmente. A su vez, el Laboratorio de Referencia Nacional del INS, participa en programas de evaluación externa internacional.

CONTROL DE CALIDAD INDIRECTO Para fines de control indirecto del diagnóstico parasitológico y serológico de la enfermedad de Chagas, los laboratorios de referencia regionales, envian al Laboratorio de Referencia Nacional, todas las láminas positivas y sueros reactivos examinados durante el trimestre y 10% de las láminas negativas y sueros no reactivos, seleccionados aleatoriamente. Es indispensable adjuntar el formato de solicitud de control de diagnóstico (Anexo N° 6), con los datos y resultados de las muestras y reactivos empleados.

MPR - INS - 002

71

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

72

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO XII

BIOSEGURIDAD
Las medidas de bioseguridad son indispensables para proteger la salud y seguridad del personal que trabaja en laboratorios donde se manipulan productos biológicos. Sangre, suero sanguíneo, biopsias y material fecal de triatominos, son productos biológicos que se procesan en las pruebas de diagnóstico parasitológico e inmunológico de la enfermedad de Chagas. Los laboratorios que procesan las muestras mencionadas, son de nivel de bioseguridad 2, es decir, se trata de laboratorios que cuentan con cámaras de bioseguridad y otros dispositivos para la protección personal. 12.1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la hepatitis B. Al momento de extraer la sangre: • • • Vestir mandil, usar guantes, jeringas y agujas descartables o tubos al vacío. Nunca extraer sangre solamente con la aguja. El cabello largo debe conservarse sujetado o usar gorro. No usar brazaletes ni collares.

El personal que va a manipular al parásito ya sea cultivo, material fecal de triatominos infectados o sangre de individuos infectados, debe: • • • • Inicialmente trabajar bajo supervisión cercana. Conocer aspectos biológicos del parásitos. Someterse a evaluación serológica por lo menos una ves al año. Practicar las normas de bioseguridad y conocer el procedimiento que se debe seguir en caso de accidente.

MPR - INS - 002

73

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

12.2. DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO a) Las paredes deben ser lisas, preferiblemente enchapadas con mayólica y los pisos de marmolina o cemento. Esto facilitará la limpieza con soluciones desinfectantes. b) Los pisos deben limpiarse todos los días con soluciones desinfectantes (pinesol, cresol, etc.). No se debe barrer en seco ni encerar. c) Al sistema de desague, sólo se debe eliminar los agentes biológicos o químicos, previamente descontaminados, neutralizados o inactivados.

d) El ambiente debe estar adecuadamente ventilado e iluminado y los servicios de agua, luz y gas deben funcionar satisfactoriamente. e) Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material sólido, con superficies lisas, impermeables de fácil limpieza resistentes a las sustancias corrosivas. Uso de cabinas de seguridad: Clase I y II: • Cabina clase I: Son de frente abierto, presión negativa y con filtros HEPA (alta eficiencia en filtrado de partículas). Se puede usar con ventanas a medio abrir. Cabina clase II: Son de flujo laminar vertical, similar a la anterior, pero con aire filtrado por HEPA circulando.

12.3. MANIPULACIÓN Y ELIMINACIÓN DE SANGRE Y SUS PRODUCTOS a) La extracción, centrifugación y separación de suero debe hacerse usando guantes. b) Las agujas usadas no deben devolverse al capuchón de plástico. Antes de ser eliminadas colocarlas junto con las jeringas usadas en un recipiente que resista la esterilización en autoclave o hervido. c) El operador es el responsable de desinfectar el área de trabajo antes y después de su uso con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante, dejándolos actuar durante 30 minutos.

d) El coágulo y suero innecesarios deben eliminarse en un recipiente con lejía. e) Los tubos de prueba, pipetas y láminas de microscopio pueden descontaminarse sumergiéndolas en mezcla sulfocrómica o lejía antes de lavarlas.
MPR - INS - 002

74

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

12.4. EN CASO DE ACCIDENTES La forma celular infectante de Trypanosoma cruzi al hombre es el trypomastigote, éste se encuentra en la sangre de los pacientes chagásicos y de animales infectados experimentalmente en el laboratorio, en las heces de los triatominos y en cultivos de parásitos. El personal que trabaja con estos materiales está expuesto a infecciones accidentales. Los mecanismos son variables, entre ellos tenemos la autoinoculación con agujas, ingesta de aerosoles o gotitas en mucosas, ojos o piel. 12.4.1. Inoculación accidental, cortes o abrasiones, quemaduras pequeñas • • • • La persona accidentada debe lavarse la zona afectada con jabón, alcohol o desinfectante. Informar el accidente al jefe inmediato y concurrir al servicio médico más cercano. Solicitar el examen de una muestra de sangre (microconcentración) en busca de parásitos a partir del quinto día de producido el accidente. En caso de resultar negativo solicitar el examen de nuevas muestras de sangre cada semana durante dos meses, asímismo la evaluación serológica para la detección o el seguimiento del nivel de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. Si la probabilidad de adquirir la infección es alta, el accidentado debe recibir tratamiento preventivo inmediato con Nifurtimox o Benznidazol.

12.4.2. Ingestión de material peligroso Acudir al servicio médico más cercano para el tratamiento adecuado. 12.4.3. Contacto con material infectado con virus de la hepatitis B o virus del VIH (sangre, suero, fluidos corporales) a) Se debe lavar la zona afectada con agua y jabón. En caso de herida, favorecer el sangrado de la lesión y, si es necesario, cubrir la herida con un apósito. b) Se concurrirá al servicio médico más cercano para determinar la gravedad del caso e informar del accidente a las autoridades competentes. c) Se tomará una muestra de suero del accidentado para descarte de infección de hepatitis B y VIH. También debe examinarse la muestra del paciente, posible contaminante.

MPR - INS - 002

75

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

d) Si la muestra es negativa para VIH, este examen debe repetirse mensualmente hasta el sexto mes. La continuidad negativa de la muestra indica que el trabajador no se ha contaminado. 12.5. DESINFECCIÓN, LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN 12.5.1. Desinfección a) Los procedimientos para eliminar elementos causantes de infecciones virales, bacterianas, micóticas y parasitarias, dependerán de la naturaleza del agente presente en el material de vidrio u otro. b) Los más comunes son: agentes químicos en estado líquido (mezcla sulfocrómica, lejía, etc.) y los agentes físicos como el calor, hervido, autoclave, irradiación ultravioleta, etc. 12.5.2 Lavado Después de la eliminación de los agentes infecciosos (desinfección), el material de vidrio sucio debe ser lavado, recomendándose el uso de detergentes. 12.5.3.a Autoclave (vapor saturado a presión) Permite controlar la temperatura (121 ºC) y la presión (15 atmósferas). Se usa para soluciones, material de goma, plástico, vidrio o metal. Material de vidrio con medio de cultivo. Se puede emplear también una olla a presión provista de una rejilla. 12.5.3.b Horno (calor seco) Suele ser eléctrico y permite el control de la temperatura (180-200 ºC) Por este sistema no puede esterilizarse papel, material plástico, de goma, etc.). 12.5.3.c Agentes físicos Para reactivos biológicos degradables por calor seco o húmedo, se emplean membranas de filtración (0,22 µm).

MPR - INS - 002

76

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. 2.

Atias A, Neghme A. (1979). Parasitología clínica. Primera edición editorial Inter. Médica. Buenos Aires. p. 216-227. Cáceres A, Troyes L, Gonzáles A, Llontop E, Bonilla C, Murias E, Heredia N, Velásquez C, Yáñez C. (2002). Enfermedad de Chagas en la region nororiental del Perú. I. Triatominos (Hemiptera, Reduviidae) presentes en Cajamarca y Amazonas. Red Peru Med Exp Salud Publica. 19(1); 17-23. Cornejo A. (1958). Enfermedad de Chagas. Estado actual en el Perú. Anales de la Facultad de Medicina, tomo XLI-N.º 3 - Tercer trimestre. pp. 421-453. Doctrina, normas y procedimientos para el control de la enfermedad de chagas en el Perú. MINSA, 1998. Enfermedad de chagas y otras parasitosis. (1996). Instituto Nacional de Chagas. Dr. Mario Fatala Chaben. Manual de laboratorio. Octava edición. Buenos Aires p. 60. Guillén A, Beltrán M, Quispe N, Valverde A, Zavaleta A (1996). Manual de normas de bioseguridad. (Zavaleta A, Carrillo C, Cabezas C, Chang J, eds.) Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Serie de normas técnicas nº 18, Lima, art. Lautrec, 61 págs. Guillén Z, Cáceres et al. (1977). Triatominos del Perú, infección natural por tripanosomas. IV Congreso Peruano de Microbiología y Parasitología. p. 143. Lumbreras H. (1972). El problema de la enfermedad de Chagas en los diferentes departamentos del Perú. Tesis de la Facultad de Medicina - Universidad Peruana Cayetano Heredia. Manual de mantenimiento para equipos de laboratorio. Organización Panamericana de la Salud, Washington DC, 2005. Manual de procedimientos de control de calidad para los laboratorios de serología de los bancos de sangre. Organización Panamericana de la Salud. Febrero 1994.

3.

4. 5.

6.

7.

8.

9. 10.

MPR - INS - 002

77

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

11.

Margini R.A. (1996) Inmunología e inmunoquímica. Fundamentos. Editorial Médica Panamérica. Quinta edición. Buenos aires. p. 198, 800. Náquira C, Guillén A, Palacios R, Guevara M, Guerra H, (1995). Manual de procedimientos de laboratorio para la obtención y envío de muestras (I). (Zavaleta A, Carrillo C, Cabezas C, Chang J, eds.) Ministerio de Salud , Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Serie de normas técnicas nº 15, Lima, art. Lautrec, 98 págs. Ponce C, et al. (2005). Validation of a rapid and reliable test for diagnosis of Chagas disease by dectection of Trypanopsoma cruzi specific antibodies in blood of donors and patients in Central America. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10); 5065-68. Roitt I. (1988). Essential Inmunology Sixth Edition, Blackwell Scientific Publications Boston. P. 286. Schmunis G.A. (1994). American Trypanosomiasis as a public health problem. 23 págs. Solari A, Lorca M. (1998). Tecnologías aplicadas al diagnóstico e investigación de enfermedades parasitarias. Network for research and training in parasitic diseases in the southern cone of Latinoamérica SIDA/SAREC. Santiago de Chile. p. 50. Wendel S, Brenner Z, Camargo M.E. (1992). Chagas disease (American Tripanosomiasis): Its impact on transfusión and clinical medicine. Sao Paulo. Cart. Graf. Editorial. 270 págs. WHO. (1991). Control of Chagas disease. Report a WHO Expert Committee, Geneva. WHO Technical Report Series 811 95 págs. Zaman V. (1997). Atlas color de parasitología clínica. Segunda edición. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires. p. 82. Validation of a rapid and reliable test for diagnosis of Chagas’disease by detection of Trypanosoma cruzi-specific antibodies in blood of donors and patients in Central America. Carlos Ponce et al. Journal of Clinical Microbilogy. Vol 43, Nº 10, p 5065 - 68. 2005.

12.

13.

14. 15. 16.

17.

18. 19. 20.

MPR - INS - 002

78

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

ANEXO 1

PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
1. COLORACIÓN GIEMSA 1.1. Solución Giemsa stock Colorante Giemsa en polvo, certificado ................................... 0,75 g Metanol puro (sin acetona) ........................................................ 65,00 mL Glicerina pura ............................................................................. 35,00 mL En un frasco ámbar que contiene perlas de vidrio, mezclar los reactivos agitándolos vigorosamente varias veces al día. Generalmente el colorante está listo al tercer día cuando, en el ensayo de tinción, los parásitos muestran los colores apropiados. Filtrar la solución Giemsa stock con papel de filtro y conservarla en frasco oscuro a temperatura ambiente.

1.2. Solución diluyente (agua amortiguada) Fosfato disódico anhidro (Na2HPO4) ........................................ 4,0 g Fosfato monopotásico (KH2PO4) ............................................... 5,0 g Mezclar las sales a homogeneidad. Diluir un gramo de la mezcla de sales en un litro de agua destilada, agua de lluvia o de caño. El rango de pH apropiado oscila entre 6,6 y 7,2.

1.3. Solución Giemsa diluida Preparar el volumen necesario en una probeta. Colorante Giemsa stock ............................................................ 0,10 mL Solución diluyente ..................................................................... 0,90 mL Otra forma de preparar la solución Giemsa diluida es agregando dos gotas de Solución Giemsa stock por cada mililitro de solución diluyente.

MPR - INS - 002

79

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

2. CULTIVO 2.1. Solución de estreptomicina: (500 mg/mL) Diluir 5 gr de sulfato de estreptomicina en 10 mL de agua destilada estéril. La concentración final del antibiótico en el medio de cultivo o solución salina debe ser 500 µg/mL. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0,1 mL de la solución de estreptomicina.

2.2. Solución de penicilina G sódica : (200 000 UI/mL) Diluir 1 millón de unidades de penicilina en 5 mL de agua destilada estéril. La concentración final del antibiótico en el medio de cultivo o solución salina debe ser 200 000 UI/mL. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0,1 mL de la solución de penicilina.

2.3. Solución de 5-fluorocitosina (500 mg/mL) Diluir 5 gr de 5-fluorocitosina en 10 mL de solución salina estéril. Concentración final: 500 µg de 5-fluorocitosina por cada mililitro de medio de cultivo o solución salina. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0,1 mL de la solución de 5-fluorocitosina. Nota: Esterilizar las soluciones por filtración (0,22 µ de porosidad). 2.4. Obtención de sangre desfibrinada de conejo 2.4.1. Materiales y reactivos • • • • • • Conejo adulto. Matraz o balón que contenga perlas de vidrio (estéril). Aguja N.º 18 y jeringa de vidrio de 50 mL (estéril). Tijeras. Alcohol yodado y algodón. Mechero Bunsen o de alcohol.

MPR - INS - 002

80

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

2.4.2. Procedimiento a) Sujetar al conejo en posición cúbito dorsal. b) Ubicar la zona de punción (latido cardíaco), cortar con una tijera el pelaje y desinfectar con alcohol yodado el área elegida. c) Obtener por punción al corazón de 20 a 40 mL de sangre.

d) Muy cerca al mechero, para conservar la esterilidad de la sangre, vaciar la sangre a un matraz o balón estéril, el cual contiene perlas de vidrio. e) Agitar suavemente con movimientos rotatorios para desfibrinar la sangre durante cinco minutos.

2.5. Medio de cultivo agar sangre 2.5.1. Materiales y reactivos Medio base para agar sangre ................................................... 4 g Agua destilada ........................................................................... 100 mL Solución de estreptomicina ...................................................... 0,1 mL Solución de penicilina ............................................................... 0,1 mL Sangre desfibrinada de conejo ................................................ 15 mL Tubos de prueba de 13 x 100 2.5.2. Procedimiento a) En un balón de 500 mL diluir el agar (baño María 80 ºC) en 100 mL de agua destilada y autolavar a 121 ºC por 15 minutos. b) Dejar enfriar a temperatura ambiente hasta, aproximadamente, 46 ºC y aun estando el agar licuado, agregar 15 mL de sangre desfibrinada de conejo, en ambiente de esterilidad. c) Agregar las soluciones de antibióticos 0,1mL de la solución de estreptomicina y 0,1 mL de penicilina.

d) Revertir 1,5 mL del medio en tubos de prueba con tapa rosca. e) Controlar la esterilidad del medio a 37 ºC durante 18 horas. f) Guardar a 4 ºC hasta el momento de uso.

MPR - INS - 002

81

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

3. HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA 3.1. Solución de Alsever Glucosa anhidrida ..................................................................... 18,66 g Cloruro de sodio ........................................................................ 4,18 g Citrato de sodio .......................................................................... 8,00 g Ácido cítrico ................................................................................ 0,55 g Agua destilada ........................................................................... 1000 mL

3.2. Solución salina tamponada - buffer fosfato salino (PBS) 0,15 mL Preparar: Solución 1: KH2PO4 ...................................................... 2,04 g H2O destilada .................... 100 mL

Solución 2: NA2HPO4 .................................................. 2,13 g H2O destilada .................... 100 mL
REACTIVOS Solución 1 Solución 2 NaCI Agua destilada PBS ph 7,2 7 mL 18 mL 2,1 g 250 mL PBS ph 6,4 18,4 mL 6,7 mL 2,1 g 250 mL

3.3. Solución diluyente Suero humano negativo al 1% en PBS pH 7,2 Ejemplo: 0,5 mL suero humano 45 mL de PBS pH 7,2

MPR - INS - 002

82

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

3.4. Ácido tánico solución stock al 1% Ácido tánico ................................................................................ 10 mg Solución salina .......................................................................... 1 mL Solución de trabajo 1/20 000 Ácido tánico solución stock ....................................................... 100 µL Solución salina .......................................................................... 20 mL

4. ELISA 4.1. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2 KCI .............................................................................................. 0,2 g Na2HPO4 anhidro ....................................................................... 1,148 g Na H2PO4 anhidro ...................................................................... 0,2 g NaCI ............................................................................................ 8,0 g Agua destilada ........................................................................... 1000 mL Conservar a 4 ºC.

4.2. Buffer de lavado Buffer fosfato salino + Tween 20 al 0,05%.

4.3. Solución de bloqueo Buffer fosfato salino + seroalbúmina bovina al 3%

4.4. Solución diluyente Buffer fosfato salino + seroalbúmina bovina al 1%

4.5. Conjugado Antiinmunoglobulina humana marcada con peroxidasa Para determinar el título del conjugado ejecutar el procedimiento de la técnica ELISA con sueros controles positivo (con título conocido), negativo y control de inespecificidad y evaluar diluciones dobles del conjugado mayores y menores a la dilución propuesta por el laboratorio fabricante.

MPR - INS - 002

83

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Considerar como título del conjugado a la mayor dilución con la que se obtiene la lectura de la absorbancia esperada en los sueros control.

4.6. Solución estabilizadora para el sustrato pH 6 Ácido cítrico ................................................................................ 3,0 g Na2HPO4 anhidro ....................................................................... 10,7 g Agua destilada ........................................................................... 100 mL Ajustar el pH a 6 Antes de su uso, diluir la solución estabilizadora del sustrato (8 mL) con agua destilada (17 mL).

4.7. Solución del sustrato Solución estabilizadora para el sustrato .................................. 25 mL Orto-phenilendiamine ............................................................... 10 mg Peróxido de hidrógeno al 30% .................................................. 10 µL 4.8. Ácido sulfúrico 2,5 M Ácido sulfúrico ............................................................................ 1,4 mL Agua destilada ........................................................................... 8,6 mL

5. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) 5.1. Buffer fosfato salino (PBS) 0,001 M pH 7,4 Para preparar un litro de PBS, pesar: NaCI ............................................................................................ 8,1g Na2HPO4 12 H2O ........................................................................ 2,6 g Na2HPO4 1 H2O ........................................................................... 0,3 g Diluir las sales en 900 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH 1 M

MPR - INS - 002

84

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

En una probeta, enrasar a un litro con el agua destilada. Conservar en refrigeración (4 ºC).

5.2. Buffer diluyente (PBS + tween 80 al 1%) PBS ............................................................................................. 99 mL Tween 80 .................................................................................... 1 mL

5.3. Solución de azul de Evans Preparar la solución stock de la siguiente manera: Azul de Evans ............................................................................. 100 mg PBS - tween 80 ........................................................................... 100 mL Conservar en refrigeración (4 ºC)

Preparar la solución de trabajo antes de usarla Solución stock ............................................................................ 1 parte PBS tween 80 ............................................................................. 9 partes

5.4. Buffer carbonato - bicarbonato 0,5 M pH 8,5 Solución A Na2CO3 ........................................................................................................................................................ 5,3 g Agua destilada c.s.p. ................................................................. 100 mL

Solución B NaHCO3 ..................................................................................................................................................... 4,2 g Agua destilada c.s.p. ................................................................. 100 mL Mezclar 0,4 mL de la solución A con 10 mL de la solución B. Verificar o ajustar el pH a 8,5. Utilizar la solución A si está por debajo de 8,5 y la solución B si está por encima de este valor.

MPR - INS - 002

85

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

5.5. Glicerina tamponada Buffer carbonato - bicarbonato 0,5 M, pH 8,5 ........................... 1 mL Glicerina bidestilada .................................................................. 9 mL

5.6. Titulación del conjugado antiinmunoglobulina humana asociada a isocianato de fluoresceína El fabricante estima el título del conjugado, sin embargo, antes de su uso corroborarlo o determinarlo evaluándolo en diluciones dobles mayores y menores al título indicado. Emplear en la evaluación un suero control positivo de título conocido y un suero control negativo. Elaborar el protocolo de trabajo siguiendo el esquema siguiente y efectuar el procedimiento de la técnica IFI,

TÍTULO RECOMENDADO

CONJUGADO

1/50
1

1/100
2

1/200
3

1/400
4

1/800
5 6

CP

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

B

CN

1 /32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

B
12

7

8

9

10

11

CP : SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi CN : SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi

CI: SUERO CONTROL INTERNO B: BLANCO (control de reactivos)

El título del conjugado es la mayor dilución del conjugado en la que fluoresce el suero positivo en su título conocido. Titular cada lote nuevo del conjugado; asimismo, cuando se cambia el lote de antígeno, los controles o alguno de los reactivos de la batería IFI.

MPR - INS - 002

86

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

ANEXO 2

AISLAMIENTO Y MANTENIMIENTO DE Trypanosoma cruzi EN EL LABORATORIO
1. AISLAMIENTO El parásito se puede aislar a partir de: 1.1. Pacientes, por hemocultivo o xenodiagnóstico 1.1.a. Hemocultivo: • • • Sembrar la muestra de sangre heparinizada de un paciente chagásico agudo en medio de cultivo bifásico agar sangre - suero fisiológico. Proceder igual que en el hemocultivo para el diagnóstico. Generalmente, la parasitemia en sangre circulante es baja por lo que, a mayor volumen de sangre sembrada, mayor posibilidad de éxito en el aislamiento.

1.1.b. Xenodiagnóstico: • • Aplicar el xenodiagnóstico a un paciente chagásico agudo. Seguir el procedimiento que se detalla para el aislamiento a partir de los vectores.

1.2. Vectores Procedimiento: • • Desinfectar el insecto positivo a la infección por T. cruzi sumergiéndolo durante un minuto en una solución alcohólica al 70%. Cortar la parte terminal del abdomen del insecto con la ayuda de unas pinzas y tijeras finas desinfectadas retirar el tubo digestivo y colocarlo sobre una lámina porta objetos. Sembrar el material fecal y el tubo digestivo en medio de cultivo bifásico agar sangre-suero fisiológico e incubar a 28 ºC.

MPR - INS - 002

87

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

2. MANTENIMIENTO 2.1. En medio de cultivo • Los parásitos aislados se mantienen en cultivo por repiques semanales en nuevos tubos con agar sangre. Es recomendable mantener dos tubos del mismo cultivo y manipular solamente uno de ellos, esto permitirá continuar los cultivos en caso de contaminación.

2.2. En animales • La lar za en inoculación en animales de experimentación es otra forma de aisy mantener el parásito. Se usa ratones jóvenes y el control se realiexaminando periódicamente la parasitemia en una gota de sangre, fresco, obtenida por corte en la porción terminal de la cola.

El traspaso de animal a animal se hace por inoculación intraperitoneal de sangre positiva. Así se conserva la capacidad de infección del parásito.

2.3. Criopreservación Es la conservación de los parásitos a -80 ºC, este procedimiento mantiene las características nativas del parásito. Se realiza colocando una suspensión de parásitos procedentes de cultivo en medios de conservación con glicerol a diferentes concentraciones.

MPR - INS - 002

88

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

ANEXO 3

PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS
1. ANTÍGENO PARA LA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Las láminas empleadas para la prueba de inmunofluorescencia indirecta, se preparan con epimastigotes de Trypanosoma cruzi obtenidos en medio de cultivo y tratados con formol. Se emplean cultivos de cuatro días (fase exponencial del crecimiento). Los parásitos deben estar aislados para fijarse en las láminas, evitar las rosetas.

1.1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • 5 mL de cultivo de epimastigotes. Tubos de centrífuga 10 mL, 1,5 mL con tapa. Láminas para inmunofluorescencia. Buffer fosfato salino (PBS) 0,01 mL pH 7,4 (Anexo 1). Solución formolada: PBS + formol al 2% V:V. Acetona. Centrífuga. Cámara de Newbauer

1.2. PROCEDIMIENTO PARA OBTENER LA SUSPENSIÓN DE PARÁSITOS a) Filtrar el cultivo a través de una capa fina de gasa o lana de vidrio. b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante diez minutos. c) Retirar el sobrenadante, en el sedimento se encuentran los parásitos

d) Lavar los parásitos por tres veces de la siguiente manera: - Resuspender los parásitos en 5 mL de PBS, 0,01 M pH 7,4. - Centrifugar a 4000 rpm por diez minutos. - Retirar el sobrenadante. - Repetir el lavado.

MPR - INS - 002

89

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

e) Resuspender el sedimento en 0,50 mL de PBS 0,01 M pH 7,4. f) Adicionar 0,50 µL de solución formolada y dejarlo durante una hora en refrigeración (4%C). Luego proceder al lavado al igual que en el punto d.

g) Resuspender el sedimento en 0,25 mL de PBS 0,01 M pH 7,4. h) Colocar una alícuota de la suspensión de parásitos en una cámara de Newbauer y realizar el contaje de parásitos en el microscopio a 40X. i) Diluir la suspensión con PBS hasta obtener de 25 a 40 parásitos por campo microscópico a 40X.

1.3. FIJACIÓN DE LOS PARÁSITOS A LAS LÁMINAS • • • • Depositar 25 µL de la suspensión diluida de parásitos sobre el área de los círculos de la lámina IFI. Dejar secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un secador o ventilador. En un frasco couplin que contiene acetona fría, sumergir las láminas para fijar el parásito. Mantenerlo en refrigeración (4 ºC) durante diez minutos. Las láminas fijadas envolverlas en papel aluminio o guardarlas en una caja portaláminas, sellando los bordes con esparadrapo para evitar la humedad. Conservarlas en congelación (-4 a -20ºC) hasta el momento de su uso.

MPR - INS - 002

90

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

1.4. RECOMENDACIONES • Emplear láminas limpias, libres de grasa, para facilitar la fijación uniforme de la suspensión de parásitos a la lámina y para evitar los artefactos que dificultan la lectura. Proceder de la siguiente manera para la limpieza: En un frasco couplin o frasco con tapa, que contiene alcohol acetona V:V, sumergir las láminas IFI nuevas, durante 1 a 24 horas. Secarlas con una gasa limpia y conservarlas envueltas con papel hasta el momento de su uso. Las láminas IFI usadas, lavarlas previamente con detergente y luego proceder al igual que con las nuevas. Los cubreobjetos dejarlos en un recipiente que contenga alcohol al 70% durante 30 minutos, luego secarlos con gasa limpia una a una. Conservarlas en su caja o en una placa Petri hasta su uso.

-

2. ANTÍGENO PARA LA HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA El antígeno es un extracto acuoso de epimastigotes de Tripanosoma cruzi, obtenido de cultivo in vitro.

2.1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • • • 50 mL de cultivo de epimastigotes. Tubos de centrífuga, 50 mL y 10 mL con tapa. Buffer fosfato salino pH 7,4 (PBS) (Anexo 1). Solución NaCL 1,7%. Merthiolate 1:10 000. Solución salina estéril. Gasa. Centrífuga. Congeladora -20 ºC. Baño María.

MPR - INS - 002

91

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

2.2. PROCEDIMIENTO a) Filtrar el cultivo a través de una capa de gasa o lana de vidrio. b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos. c) Retirar el sobrenadante, en el sedimento se encuentran los parásitos.

d) Lavar los parásitos de la siguiente manera: -Resuspender el sedimento en 5 mL de PBS. -Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos. -Retirar el sobrenadante. e) Repetir el lavado. f) Resuspender los parásitos en agua destilada (1:10).

g) Congelar (-70 ºC) y descongelar (37 ºC) por seis veces sucesivas. h) Agregar un volumen igual de solución Nacl al 1,7%. i) j) k) Centrifugar durante 30 minutos a 4000 rpm y 2 ºC. El sobrenadante constituye el antígeno. Agregar la solución de Merthiolate al 1:10 000. Conservar en congelación (-4 a -20 ºC) hasta el momento de su uso.

3. ANTÍGENO PARA ELISA El antígeno es un extracto soluble acuoso de epimastigotes lisados mecánicamente (por presión o congelamiento y descongelamiento sucesivo), o por ultrasonido (sonicación). Los epimastigotes son obtenidos de preferencia en medio líquido LIT; el cual contiene infusión de cerebro y corazón, caldo de infusión de hígado, extracto de levadura y como suplemento hemina, suero fetal bovino. La suspensión antigénica alicuotada se conserva a -20 ºC hasta su uso.

MPR - INS - 002

92

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

ANEXO 4

CONSERVACIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS
El laboratorio enviará las muestras de sangre o suero y la ficha correspondiente (anexo 5) al laboratorio del nivel inmediato superior para realizar el estudio de láminas, el hemocultivo o el examen serológico, cuando lo considere necesario. Al realizar el embalaje, considerar las temperaturas adecuadas de conservación de las muestras: • • Suero en congelación (<0 ºC). Sangre en capilares y en tubos en frío (4-8 ºC).

Procedimiento: a) Colocar las muestras en una bolsa plástica, luego acondicionarlos en un contenedor secundario (recipiente de cartón grueso o plástico, rodeado con hielo seco o cubos de hielo). b) El recipiente secundario debe ser colocado en una caja de «tecnoport» (poliestireno) u otro material que conserve las temperauras bajas. Incluir la ficha de solicitud de examen en bolsa plástica sellada. c) Cerrar y sellar herméticamente la caja térmica.

d) Rotular la caja térmica con los siguientes datos: destino dirección y nombre del laboratorio al que se envia las muestras, ejemplo.

URGENTE MATERIAL BIOLÓGICO PERECIBLE DESTINO: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DIRECCIÓN: CALLE CÁPAC YUPANQUI 1400 JESÚS MARÍA - LIMA 11 TELEFONOS: 471-9920 / 471-2529 ATENCIÓN: LABORATORIO DE LEISHMANIOSIS Y CHAGAS

MPR - INS - 002

93

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Anotar en lugar visible la temperatura de conservación de la muestra, refrigeración (4-8 ºC) o congelación (0 - 20 ºC). Colocar una flecha indicando la posición en la que debe mantenerse la caja. La vía de transporte debe ser la más rápida posible. En caso de contar con contenedores prefabricados, seguir las instrucciones que indica el envase.

MUESTRA EXAMEN DE LABORATORIO OBTENCIÓN DE SANGRE CARACTERÍSTICAS PROCESAMIENTO

TIPO

CANTIDAD

CONSERVACIÓN

TRANSPORTE

GOTA GRUESA

Sangre capilar Sangre capilar

En láminas

2 Láminas

Homogénea Evitar las burbujas de aire en el capilar

Temperatura ambiente Temperatura ambiente y en posición vertical

Inmediato

Temperatura ambiente

MICROCONCENTRACIÓN

En capilares con EDTA

4 - 6 tubos capilares

Antes de las cuatro horas

Con refrigerante

CONCENTRACIÓN STOUT Y HEMOCULTIVO

Sangre venosa

En tubo 5 mL vacutainer sin anticoagulante

Refrigeración Esteril (4 - 8 ºC )

Inmediato o antes de siete días

Con refrigerante

ELISA IFI HAI IB

Suero o En tubo plasma 1 - 2 mL vacutainer sanguíneo sin anticoagulante

No hemolizado No contaminado

Hasta 5 días: Refrigeración 4-8 ºC Mediato Mayor de 5 días: Congelación -20 a - 80 ºC

Con refrigerante

MPR - INS - 002

94

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

Anexo 5
Solicitud para diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas

Establecimiento de salud

Dirección Regional de Salud

Banco de sangre
No Sí

I. DATOS PERSONALES
Apellidos y Nombres Dirección
Calle y N° Localidad Distrito

Fecha
Edad
Años

_____/_____/_____
Día Mes Año

Sexo
Meses Fem Masc

Provincia

Departamento

II. ANTECEDENTES Diagnóstico clínico
Sintomático Agudo Asintomático Signo de Romaña Chagoma de inoculación Fiebre Manifestaciones cardiacas Crónico Insuficiencia cardiaca Disfagia Estreñimiento Megaesófago Megacolon Congénito Aumento de ganglios Prematuro Hepato-esplenomegalia Recibió transfusión sanguínea
No Sí Hace cuánto tiempo

Aspectos epidemiológicos
Presencia de chirimachas en su vivienda Vivienda rociada con insecticida
No Sí Hace cuánto tiempo Código de vivienda No Sí Hubo Dónde Cuándo

Familiar con Dx . de Chagas
No Sí Quién

Vivió o visitó área endémica
No Sí Lugar / Hace cuánto tiempo

Antecedente de Uta o Espundia
(Leishmaniosis ) No Sí Hace cuánto tiempo

Gestante
No Sí Fecha última regla Fecha probable parto

Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido
No Sí Fecha Donde se realizó el dx . Técnica empleada /Nombre reactivo Abs. ELISA: OTRA: Valor de corte

Parasitemia positiva Serología reactiva

Recibió medicamento
No Sí Hace cuanto tiempo Nombre del medicamento

Completó el tratamiento

No

III. EXÁMENES DE LABORATORIO SOLICITADO
Diagnóstico Confirmación del diagnóstico Seguimiento del tratamiento

Examen parasitológico
Fecha obt . muestra Fecha recep. muestra Resultado

Examen serológico
Fecha obt. muestra Fecha recep. muestra Resultado Abs. V. de C Título

Gota gruesa - frotis Microconcentración Concent. Strout Hemocultivo Xenodiagnóstico

ELISA HAI IFI IB

Responsable de solicitud de diagnóstico
Nombres y apellidos Firma

Responsable del diagnóstico
Nombres y apellidos Firma

INSTRUCTIVO DE LA SOLICITUD PARA DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
Llenar los casilleros con los datos solicitados. I. DATOS PERSONALES En el casillero dirección, anotar el lugar de residencia habitual II. ANTECEDENTES Diagnóstico clínico Sintomático: marcar con X si hay alguna sintomatología compatible con la enfermedad. En caso de infecciones agudas o crónicas, identificar con una X el casillero correspondiente a los síntomas presentes. Asintomático o indeterminado: marcar con una X cuando no hay sintomatología pero hay antecedentes epidemiológicos que hacen sospechar de la infección. Aspectos epidemiológicos Llenar o marcar con una X los casilleros correspondientes. Precisar en lo posible las fechas de los datos solicitados. Áreas endémicas: Arequipa, Moquegua, Tacna, Ica, Cajamarca, Amazonas y San Martín. Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido Marcar el casillero que corresponda. Anotar la fecha, el nombre del establecimiento que realizó el diagnóstico, la técnica y nombre del kit usado, en caso de ELISA absorbancia (Abs) de la muestra y el valor de corte (Vc) correspondiente. III. EXAMEN SOLICITADO Los exámenes solicitados serán los apropiados para confirmar el diagnóstico presuntivo y estarán de acuerdo a la situación clínica de la persona: agudo, crónico portador, congénito. Marcar con una X el casillero confirmación del diagnóstico, en caso de tener resultados de laboratorio anteriores y el de seguimiento cuando se solicita el examen de laboratorio de persona con tratamiento. Debe colocarse las fechas según el momento del proceso: al obtener la muestra y al ingresar al laboratorio que efectuará el examen. Dejar en blanco los casilleros de resultados hasta el momento de emitirlos. El solicitante será el responsable del laboratorio local o regional.

Anexo 6
Solicitud de control del diagnóstico de laboratorio de la trypanosomiosis americana
DIRECCIÓN REGIONAL DE SALUD ESTABLECIMIENTO DE SALUD RESPONSABLE DEL DIAGNÓSTICO ACTIVIDAD EN CONTROL NOMBRE DE LA ACTIVIDAD (Lugar) PERIODO N° Muestras evaluadas N° Muestras Reactivas/Positivas Vigilancia serológica Diagnóstico de laboratorio Proyecto de investigación Otro

N.°

Código Laboratorio

Nombres y Apellidos

Resultados Laboratorio Referencia Regional Gota ELISA IFI HAI V.c. Abs . 1/32 gruesa

Observaciones

: Nombre de reactivos o kits empleados por el laboratorio de referencia regional

NOTA: Enviar todas las láminas o sueros positivos y 10% de los negativos examinados en el trimestre (láminas coloreadas con Giemsa de exámenes de sangre por gota gruesa, concentración). Adjuntar el presente formato con la información solicitada empleando una hoja para cada actividad y el formato de solicitud de diagnóstico de las muestras positivas o reactivas .

Lugar y fecha

Nombres y apellidos del responsable del laboratorio

Firma

ANEXO 7

REGISTRO DE MUESTRAS PARA INVESTIGACIÓN Y MONITOREO DE CASOS DE ENFERMEDAD DE CHAGAS
N.º FECHA
CÓDIGO DE LABORATORIO

NOMBRES Y APELLIDOS

EDAD SEXO PROCEDENCIA

SOLICITA (*)

GG

EXAMEN DE LABORATORIO CONC. CULT. HAI ELISA IFI

OBSERVACIONES

(*) D CD M

: : :

Diagnóstico Confirmación diagnóstico Monitoreo o seguimiento de caso

GG : CONC. : CULT. :

Gota gruesa Concentración Cultivo

HAL ELISA IFI

: : :

Hemaglutinación indirecta Ensayo inmunoenzimático Inmunofluorescencia indirecta

ANEXO 8

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR ELISA

Ejecutor del ensayo Nombre del kit

Fecha

Valor de corte

1 A
1 1 1 1 1 1

2 3 4 5 6

7
1 1

8
1

9
1

10

11

12

1

1

B
1 1 1 1 1

1

1

1

1

1

1

1

C
1 1 1 1

1

1

1

1

1

1

1

1

D
1 1 1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

E
1 1 1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

F
1 1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

G H
1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

NOMBRE DEL KIT Lote N° Fecha de vencimiento

Día

Mes

Año

CONJUGADO Título Fecha de vencimiento Código N° Suero control negativo a T.cruzi Suero control negativo a T.cruzi Suero control negativo a T.cruzi Suero control positivo a T. cruzi Suero control positivo a T. cruzi Suero control interno Blanco de reactivos
CN CN CN CP CP CI B

CONTROLES

Lectura (Abs)

VALIDACION DE LA CORRIDA

No

CALCULO DEL VALOR DE CORTE

Valor de corte

(Vc):

OBSERVACIONES

Firma Responsable del control interno Fecha
Día Mes Año

ANEXO 9
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR IFI
Ejecutor del ensayo 1 2 3 4 5 Fecha 6

1

1

1

1

1

1

7 1

8 2

9 3

10 4

11 5

12 6

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

7 1

8 2

9 3

10 4

11 5

12 6

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

7 OBSERVACIONES

8

9

10

11

12

ANTIGENO IFI Lote N° Fecha de vencimiento
Día Mes Año

CONJUGADO Lote N° Título

CONTROLES Código N° Suero control positivo a T.cruzi Suero control negativo a T.cruzi Suero control interno Blanco de reactivos
CP CN CI B
Sin suero

Título 1/ 1/ 1/
-

Lectura

LECTURA E INTERPRETACIÓN Título de valor diagnóstico: 1/32 Leyenda de lecturas: Fluorece francamente No fluorece Fluorece débilmente Validez de la corrida
Sí No

Leyenda de resultados:

+

Reactivo No reactivo Indeterminado

R
NR

+/-

I

OBSERVACIONES

Firma Responsable del control interno Fecha
Día Mes Año

CEPREDIM

SE TERMINÓ DE IMPRIMIR POR ENCARGO DEL INS EN EL MES DE ABRIL DE 2006,
EN LOS TALLERES GRÁFICOS DEL

CENTRO DE PRODUCCIÓN EDITORIAL E IMPRENTA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS JR. PARURO 119. LIMA 1. TELÉFONO: 619-7000, ANEXO: 6009 / FAX: 6015 E-MAIL: CEPEDIT@UNMSM.EDU.PE TIRAJE: 1000 EJEMPLARES

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful