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Universidad de Guanajuato Divisin de Ciencias Naturales y Exactas

Laboratorio de Bioqumica I

Prctica No. 4 cidos Nucleicos

Presenta: Karla Elena Lara Gonzlez Roco Ivette Ortega Cuevas Mario Enrique Sandoval Vergara

28 de marzo de 2010

cidos Nucleicos

Resumen

En la sesin del laboratorio nos dedicamos al aislamiento y al anlisis de cidos nucleicos. Realizamos una metodologa de manera que obtuvimos los cidos nucleicos de un cultivo de bacterias, sin que estos sufrieran un dao mecnico o detergentes y tambin evitando que las DNA polimerasas iniciaran su actividad y degradaran el material gentico. Una vez obtenido el DNA lo cuantificamos mediante espectrofotometra para obtener una lectura que asegurara que nuestra muestra en verdad contuviera cidos nucleicos. Tambin corroboramos mediante electroforesis visto a travs de luz UV que nuestra muestra produca bandas donde se mostraba la presencia de ADN y ARN. Introduccin En un principio antes de saber la estructura del ADN, se conocan las unidades bsicas que la constituan, los cuales son 4 nucletidos, idnticas excepto por contener cada una base nitrogenada diferente. Cada nucletido contiene fosfato, azcar y una de las cuatro bases (adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C)). A y G se denominan purinas, T y C son pirimidinas. Los primeros en encontrar una estructura razonable para el DNA fueron Watson y Crick en 1953. Toda la informacin necesaria para la constitucin fisiolgica de los seres vivos se encuentra almacenada en los cidos nucleicos, ADN y ARN. En las bacterias en ADN tiene una estructura de doble cadena, circular y superenrollado, de un tamapo aproximado de 4.5kpb. Una vez aislado y purificado el ADN, este se puede visualizar analticamente, donde se puede determinar su tamao, y posteriormente en otro tipos de estudios, se pueden hacer

pruebas de clonacin de algn gen en un plsmido apropiado, lo que nos permite una posterior secuenciacin y manipulacin. El resultado de la purificacin analtica se suele someter a electroforesis en gel de agarosa teido con bromuro de etilo, esto para comprobar la integridad y calidad del ADN. De igual manera una relacin de la lectura de las absorbancias de 1.8 en las lecturas de A260/A280 nos dice que la muestra esta libre de contaminacin proteica.

Metodologa Para la obtencin de ADN fue necesario hacer crecer un cultivo de bacterias de E. Coli en un medio adecuado para su crecimiento. El cultivo es pasado a dos tubos eppendorf debidamente distribuidos y sometidos a centrifugacin (14000g). El sobrenadante es desechado con Cloralex para ser desinfectado. La fase slida es resuspendida en GTE (glucosa, Tris HCl, EDTA) de manera que le de un medio con un pH controlado y el EDTA para quelar el Magnesio, el cual es usado por las desoxirribonucleasas, las cuales son protenas que degradan el ADN. Despus se agrega NaOH en SDS los cuales son usados para realizar una lisis alcalina de las clulas del cultivo, de manera que el ADN quede suspendido en el medio, debido a que las bacterias son organismos procariotas y su ADN se encuentra disperso en su citoplasma. Se mezclan por inversin y se incuban en hielo por 5 minutos. Despus de la incubacin se agrega acetato de potasio fro, esta es una sal muy eficaz para la precipitacin de las protenas contenidas producto de la lisis alcalina, las cuales representan impurezas importantes en nuestra futura muestra final, que pueden ocasionar lecturas errneas de absorbancia. Esta mezcla se centrifuga nuevamente y el sobrenadante se pasa a un nuevo tubo limpio, eliminando el slido blanco precipitado el cual lleva consigo las protenas precipitadas con el acetato de potasio. El sobrenadante se pone en solucin de fenol-cloroformo, la cual es usada para su purificacin, ya que desnaturaliza las protenas que suprimen la solubilidad de protenas precipitandolas. Nuevamente se sentrifugan y se transfiere el sobrenadante a un

nuevo tubo, eliminando el resto de las protenas. Finalmente se precipita el ADN con una solucin de etanol al 96% agitandolo. Se centrifuga nuevamente y se elimina el sobrenadante con una micropipeta. El precipitado se lava en etanol y centrifuga nuevamente. El residuo se seca y el producto final se resuspende en agua y se almacena. Una vez obtenido el ADN la muestra se separa en dos tubos, a uno de ellos se le har la lectura de absorbancia a 280 y 260nm agregando 1ml de agua destilada estril y usando el espectrofotmetro. Con estas lecturas calculamos la concentracin de cido nucleico obtenido. Al ADN en el otro tubo se someter a electroforesis para comprobar su integridad. Primero la muestra de ADN se le agrega un amortiguador y una enzima de restriccin con la cual la molcula de ADN ser cortado en puntos especficos de su cadena los cuales migraran en el gel de la electroforesis. Se incuba la muestra. Despus se prepara la camara para electroforesis horizontal en gel de agarosa. El gel se prepara con agarosa TAE y bromuro de etilo como colorante y se deja gelificar. Se toma una pequea muestra de ADN cortado y sin cortar y se le agrega el buffer de carga, la muestra se coloca en uno de los pozos cuidadosamente, en otro poso se colocan los marcadores y se deja correr. Al terminar el tiempo de corrido, se lleva al procesador de imagen bajo luz UV.

Resultados obtenidos Lectura de absorbancia: Concentracin del ADN: 50 * A260= concentracin de DNA (gcm-3) 50 * 1.581= 79.05 A260 / A280= 1.581/ 0.834= 1.894 A260-A280= 1.58- 0.834= 0.746

Concentracin del RNA: 40 * A260= concentracin de RNA (gcm-3) 40 * 1.581= 63.24 A260 / A280= 1.581/ 0.834= 1.894 Cromatografa

En la imagen se aprecia el ADN genmico en la banda superior, ADN plasmdico en la banda intermedia yen las bandas inferiores las diversas formas de ARN. Discusin Fue utilizada una lisis alcalina para la obtencin de ADN de clulas bacterianas, donde a partir de centrifugacin y precipitacin de protenas fuimos aislando los dems componentes celulares que contaminan nuestra muestra de ADN.

La manera en la cual corroboramos que obtuvimos DNA fue mediante la lectura de absorbancia. El resultado obtenido para la concentracin de DNA fue 79.05 gcm-3. Tericamente sabemos que si el resultado de A260 / A280 es igual a 1.8 la muestra est libre de contaminacin proteica, y aunque nuestro resultado fue favorable (1.894) concluimos que an tenemos algo de protenas en nuestra muestra. Dado que A 260 / A280 no es igual a 2.0 (nuestro resultado fue 1.894) el RNA contiene impurezas.

Al observar el gel de la electroforesis, observamos que nuestra muestra efectivamente contena ADN al observar la banda superior, donde la mayora de los dems equipos tuvieron un acomodo de bandas similares excepto el del ltimo carril donde no se aprecia una banda que corresponda al ADN. Todo el proceso fue realizado correctamente, y durante todo el semestre fuimos adquiriendo tcnicas que son necesarias para llevar a cabo experimentacin en un laboratorio de este tipo, desde la elaboracin de soluciones hasta el uso preciso de micropipetas, lo que nos llev a realizar una practica con buenos resultados al final de este curso. Bibliografa.
http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/42%20AISLAMIENTO %20VISUALIZACI%C3%93N%20ACIDOS%20NUCLEICOS.pdf Gentica. Anthony J.F. Griffiths. 7ma edicin. Editorial McGraw-Hill Interamericana.