Está en la página 1de 3

INMUNOHISTOQUMICA REACTIVOS Cmara hmeda Parafilm Citrato sdico 10mM (25 ml del stock 100mM pH 6,0 y ddH2O hasta

250 ml) Es muy importante que el pH sea exacto. Histoblock solution Se puede conservar a 4C de 7-10 das (durante ms tiempo hay riesgo de contaminacin al llevar BSA) BSA MgCl2 Tween 20 FBS PBS Cf 3% 20mM 0,3% 5% Hasta 15 ml stock 0,45 g 300 l 450 l 750 l

10%

PBS/ Tritn 0,3% (1 litro): 3 ml Tritn X100 y PBS hasta 1 l. ABC Kit DAPI PROCEDIMIENTO Cortes de parafina 1. Desparafinar Preparar 200 ml de cada una de las soluciones. Se pueden usar de 2-3 veces. 3x3 min destroza 2x3 min 2x3 min 3 min 3 min 3 min Xileno El paso del xileno al etanol ha de ser muy rpido, sino el tejido se

EtOH absoluto EtOH 90% EtOH 70% EtOH 50% EtOH 30%

3x5 min PBS 1x 2. Desenmasaramiento de antgenos (Antigen retrieval) (paso para deshacer el cross-link provocado por la fijacin con PFA) -Poner los portas en un rack (quitar el asa metlica) e introducir en una Coplin staining

jar con 250 ml de citrato sdico 10mM. Llenar otra jar con H2O e introducir ambas sin tapa en el microondas durante 15 minutos (comprobar cada 5 min si hay evaporacin de H2O y en este caso reemplazarla) - Dejar enfriar durante 20 min - Lavar 3x3 min en PBS 1x 2x10 min en PBS/ Tritn 0,3% 3. Prebloquear Incubar los portas con aprox. 200l histoblock solution usando la tcnica del parafilm en cmara hmeda, 1 hora a TA Eliminar al mximo sobre papel sin dejar que se sequen los portas. 4. Anticuerpo primario Preparar 100 l por porta (de una dilucin 1:100 para la mayora de anticuerpos, en histoblock solution) (si se hace un control en el mismo porta preparar 50 l e incubar la mitad con histoblock solution) Cubrir con parafilm. Incubar en cmara hmeda a 4C, oN. - Lavar 2x 5 min en PBS 1x 5 min PBS/ Tritn 0,3% 5. Anticuerpo secundario biotinilado Preparar 100 l por porta (de una dilucin 1:100 en PBS) Distribuir sobre todo el porta. Cubrir con parafilm. Incubar en cmara hmeda 1 hora a T.A. - Lavar 2x 5 min en PBS 1x 5 min PBS/ Tritn 0,3% Dilucin 1: 100 de Streptavidina (con fluorocromo) 1: 300 de DAPI Incubar mediante la tcnica del parafilm 1 hora a T.A en PBS Lavar 2x 5 min en PBS 1x 5 min PBS/ Tritn 0,3%