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Unidad 2

Duplicación o Replicación del


DNA
Debido a la temporalidad de
los seres vivos, para que una
especie no se extinga ha de
haber al menos un momento en
el que la información biológica
(características morfológicas y
fisiológicas) se replique y a
partir de esas copias aparezcan
La duplicación es la
capacidad que tiene el ADN
de hacer copias o réplicas
de su molécula. Este
proceso es fundamental
para la transferencia de la
Características de la replicación
•Es semiconservativa - al final cada molécula de ADN
nueva presenta una cadena original y una cadena nueva.

•La replicación siempre se realiza adicionando nucleótidos


en dirección 5' → 3'

• Es semidiscontinua - en una de las cadenas se sintetizan


filamentos bastante grandes y de forma continua,
mientras que en la otra (cadena retardada) la síntesis es
discontinua, ya que se van sintetizando fragmentos
pequeños que se disponen de manera separada.

• Es bidireccional - a partir de un punto dado, la


duplicación progresa en dos direcciones.

•El proceso de duplicación del DNA es controlado


enzimáticamente, asegurando así una alta fidelidad en la
información que contiene la copia.
1. Replicación semiconservativa
El modelo semiconservativo
propuesto por Watson y Crick
(1953) proponía que el ADN de
doble hélice separa sus dos
cadenas y cada una sirve de
molde para sintetizar una
nueva siguiendo las reglas de replicación

complementariedad de las
bases nitrogenadas. Dicho
modelo fue demostrado por
Meselson y Stahl en 1957, el
nombre de semiconservativo,
es debido a que las dos dobles
hélices recién sintetizadas
poseen una cadena vieja (una
mitad vieja) y otra nueva
2. Adición de nucleótidos endirección

Unión a través del


grupo fosfato del
nucleótido nuevo con
el grupo hidroxilo (OH)
libre del nucleótido
anterior

La enzima que cataliza la adición de los


nucleótidos se denomina Polimerasa de ADN
Inicio de la replicación

•El sitio de inicio de la replicación


(origen de replicación o replicón)
consiste en secuencias específicas
de nucleótidos reconocidas por
proteínas específicas (polimerasas,
helicasas, primasas).

•En el origen de replicación las


cadenas que conforman la doble
hélice son separadas y da inicio la
replicación en ambas cadenas.

•A medida que la replicación


continúa la horquilla de replicación
se mueve a través del ADN.
3. Replicación semidiscontinua y
asimétrica

cadena
retardada
cadena
líder cadena
líder

Debido al antiparalelismo del ADN y a que las ADN polimerasas


solamente sintetizan en la dirección 5'- 3', la síntesis de una de
las cadenas se puede realizar de forma continua, mientras que la
otra se sintetiza de manera discontinua (cadena retardada), a
base de fragmentos cortos (fragmentos de Okazaki) .
4. Replicación bidireccional
A partir de un punto de origen progresa en dos direcciones
opuestas, existiendo dos puntos de crecimiento u horquillas de
replicación. Si se observan simultáneamente las dos horquillas
de replicación, a un lado del origen la hélice de nueva síntesis
se polimeriza de forma continua, mientras que al otro lado del
origen se polimeriza de forma discontinua.

Cadena Cadena
líder retardada
Las ADN polimerasas solamente sintetizan ADN en la
dirección 5' – 3’.

Para que puedan iniciar la síntesis de ADN necesitan un


extremo 3' OH al que ir añadiendo nucleótidos, y ese
extremo lo suministra un ARN de tamaño pequeño que se
denomina ARN cebador o "primer".

La síntesis de ADN comienza, por tanto, sintetizando


un corto segmento de ARN denominado primer, el cual es
sintetizado por una enzima denominada Primasa.

ADN
3´ 5´ cadena vieja

3´ - OH cadena nueva
primer ARN ADN
La Primasa es una ARN polimerasa que utiliza
como molde ADN.

Primasa actúa:
• 1 vez sobre la cadena líder (1
primer)
• Múltiples veces sobre la cadena
retardada:
1 vez/fragmento Okazaki generado
Primer de RNA: 23-30 nucleótidos (E.
coli)
10 nucleótidos
(eucariotas)

Tasa error DnaG: 1/104nucleótidos


Los errores de ARN no son heredados
porque el primer siempre es
sustituido por ADN
Todos los fragmentos de
Okazakicomienzan por un primer.
Posteriormente, la ADN
polimerasa III lleva a cabo la
síntesis del fragmento de ADN
correspondiente hasta llegar al
siguiente primer.

En ese momento, la ADN


polimerasa I sustituye a la
polimerasa III. La ADN polimerasa
I se encarga de retirar el ARN
(primer) mediante su actividad
exonucleotídica 5'- 3' OH y al
mismo tiempo rellena el hueco
sintetizando ADN.

Por último, los dos fragmentos de


Okazaki tienen que unirse, por lo
que es necesario enlazar el
extremo 3'OH de un fragmento
con el 5'P del siguiente
fragmento. Dicha labor de sellado
Mecanismo de acción de las
ligasas

unen fragmentos de ADN adyacentes a través de enlaces


fosfodiester
Resumen de la síntesis de cadena
retardada

Síntesis de primer
RNA (primasa)

Extensión para formar


fragmentos de Okazaki
(Polimerasa III)

Síntesis de un
nuevo fragmento de
Okasaki

Remplazo del oligo de


RNA por DNA
(Polimerasa I)

Unión de los
fragmentos (ligasa)
Otras proteínas
involucradas en

Helicasas
Enzimas dependientes
de ATP encargadas de
separar la doble
cadena, desempeñan
un papel fundamental
para que se puedan
sintetizar los primers
en la cadena
retardada.
Proteínas de unión a ADN de cadena
sencilla (SSB, single strand binding)
Previenen la formación de estructura secundaria y
apareamientos internos en la cadena sencilla (paterna), evita
el reensamblajedel dúplex mientras ocurre la síntesis de la
cadena hija. Además protege a la cadena sencilla del ataque
de nucleases. La unión de esta proteína favorece la unión de
las siguientes.
Problemas topológicos en la
replicación
La separación de la doble hélice produce
superenrollamientos (enrollamientos del eje de la
doble hélice)
La “relajación” del superenrollamiento requiere
roturas de la doble hélice

Topoisomerasas:
Clase I y II
Topo I:
Cortan 1 cadena
DNA
Topo II:
Cortan las 2 cadenas
DNA
Topoisomerasa
ADN

Corte en una Liberar


topo1 cadena, formar el tensión y
enlace ADN- resellar las
fosfotirosina cadenas

Enlace covalente:
5’P(DNA)-Tyr
Horquilla de replicación: Actividades participantes
(Resumen)
Desenrollamiento doble hélice
(topoisomerasa)

Separación de las (Mantenimiento de las


cadenas (helicasas)
cadenas separadas)
Previenen la formación de
Primosoma - unión de helicasa
estructura secundaria (prot.
y primasa en cadena retrasada
de unión a cadena sencilla)
(Síntesis del RNA primer)

Primasa
(Eliminación primer,
Síntesis relleno)
Polimerasa III

Polimerasa I

Ligasa
cadena líder
cadena
retardada
Tarea
:MODELOS DE REPLICACIÓN CONSERVATIVO Y DISPERSIVO
Modelo Conservativo: cuando el ADN doble hélice se replica
se producen dos dobles hélices, una de ellas tiene las dos
hebras viejas (está intacta, se conserva) y la otra doble hélice
posee ambas hebras de nueva síntesis.

Modelo Dispersivo: Cuando el ADN doble hélice se replica se


originan dos dobles hélices, cada una de ellas con hebras que
poseen tramos viejos y tramos de nueva síntesis en diferentes
proporciones.

semiconservativ conservativo dispersivo


o
Recapitulando…..
•La replicación es la capacidad que tiene el ADN de hacer
copias de su molécula.

•Es un proceso de alta fidelidad (casi no se cometen


errores).
menos de 1 error/109 nucleótidos

•El replicón es la unidad del ADN en la cual ocurren actos


individuales de replicación. El replicón contiene un origen
donde comienza la replicación y un final donde ésta se
detiene, además contiene todos los elementos de control
necesarios. para la

•La replicación es semiconservativa, semidiscontinua,


bidireccional y siempre ocurre en dirección 5‘→ 3‘.

•Durante el proceso de replicación intervienen diversas


enzimas: Topoisomerasas, Helicasas, Prot. de unión a
cadena retardada Cadena líder
Polimerasas en E. coli
dna polimerasa i
2. Actividad polimerasa (síntesis en dirección 5’ 3’)
3. Actividad correctora (revisora) por su función de exonucleasa
(remoción de nucleótidos erróneos).
4. Actividad reparadora, retira los primers de ARN (función de
exonucleasa) y rellena el hueco con su actividad de
polimerasa.
 
dna polimerasa ii
Actividad correctora , el papel que juega en la replicación del ADN
es desconocido.

dna polimerasa iii


Es la enzima que realiza la mayoría de la replicación del ADN, el
corazón catalítico del enzima lo constituyen las subunidades 
(encargada de la polimerización),  (realiza la función correctora
Las principales características de las ADN Polimerasas
de E. coli, se pueden resumir en la siguiente tabla:
El proceso de síntesis de ADN tiene que producir dos moléculas
exactamente iguales, cualquier error que se cometa se
convertirá en una mutación. Las ADN polimerasas deben ser
bastante fieles copiando el ADN. Para ello poseen una función
correctora de pruebas que retira el último nucleótido introducido
de forma incorrecta. Esta función se realiza debido a la actividad
de exonucleasa 3´– 5´.
Función correctora (actividad exonucleasa
3´- 5´)
cadena
templad error
apareamient
o o

Sitio actividad
exonucleasa
3´ -- 5´

Polimerasa ADN
(I, II y III)
Actividad polimerasa Actividad exonucleasa
Función elongación (3´)
Función correctora
ADN Polimerasa III (E. coli)

Posee muchas cadenas o subunidades polipeptídicas. Es un dímero asimétrico,


una mitad del dímero se encarga de sintetizar la cadena retardada y la otra mitad
sintetiza la cadena líder. El corazón catalítico lo conforman las subunidades 
(alfa),  (épsilon) y  (teta). La subunidad  (tao) interviene en la unión del dímero. El
complejo - (gama-delta) produce la unión al ADN molde. La subunidad  (beta)
La tendencia de la enzima a permanecer unida al molde en lugar de
disociarse y reasociarse se le conoce como procesividad. Se puede
definir como el numero de nucleótidos incorporados por evento de
unión entre la enzima y el DNA. Se considera que la estructura tipo
rosca que forma la subunidad  de la polimerasa III desempeña un
papel clave en la procesividad de la enzima.

Como regla general el incremento en la procesividad disminuye la


probabilidad de reducir errores.
Replicación en E. coli
(I)
Enzimas que participan en la iniciación:
•Dna B (helicasa– separa las dos cadenas)
•SSB (Prot de unión a cadena sencilla – evita
la formación de estructura secundaria y
reensamblaje del duplex)
•Dna G (primasa – síntesis de primer ARN)
•Topo I, III y girasa (topoisomerasas - libera
estrés torcional generado por el
desenrrollamiento de la cadena de ADN)
•Otras enzimas
Dna A - reconoce el origen de
replicación y contribuye a separar las
cadenas.
Dna C - actúa conjuntamente con la DNA
B

Enzimas que participan en el


alargamiento:
DNA polimerasa I y III
Ligasa – unión de los fragmentos de Okazaki

Enzimas que participan en la


terminación:
•TUS - frena a la horquilla de replicación
Terminación de la replicación
Una vez que ha comenzado la replicación, las dos horquillas de
replicación avanzan en sentidos opuestos y con una misma
velocidad, hasta encontrarse en un punto diametralmente
opuesto a origen (OriC ) donde se desensambla el complejo de
replicación.

Existen además sitios específicos de terminación (sitios Ter) que


son reconocidas por la proteína Tus (Terminus Utilization
Substance). La unión de la proteína Tus a la secuencia frena a la
horquilla de replicación correspondiente mediante una actividad
Replicación en E.
coli (II)
El origen de
replicación en E. coli
(Ori C) tiene 245 pb
de longitud, 3
secuencias (13pb) y 4
secuencias (9pb) casi
idénticas repetidas en
tandem
Replicación en eucariotas
• Velocidad de alargamiento: La velocidad de polimerización en
eucariotas es mucho menor que en procariotas
E. coli = 500 nt/s
levaduras = 60 nt/s; Drosophila = 40 nt/s y ratón = 30 nt/s

• Origen de replicación: En eucariotas existen múltiples


replicones (múltiples orígenes de replicación)
levadura = 500, Drosophila= 3500, ratón = 25000 y plantas
= 35000

• En eucariotas la división celular tiene lugar una vez que el


ADN se ha replicado, dicha replicación tiene lugar durante la
fase S del ciclo celular (8 h aproximadamente)

• En eucariotas los fragmentos de Okazaki son más cortos


Procariotas =1000 a 2000 nucleótidos
Eucariotas = 100 a 200 nucleótidos

• El control es más complejo


Ori C burbuja de
replicación
Número de orígenes de replicación
Escherichia coli 1 origen de replicación
Saccharomyces cerevisiae 300 orígenes de replicación
Células humanas 20 000 orígenes de replicación

origen origen

horquilla de burbuja de
replicación replicación

replicón replicón
Polimerasas en eucariotes
Para la replicación de ADN en células eucariotas se utilizan dos
polimerasas diferentes, una para sintetizar la hélice conductora y
otra para producir la hélice retardada. La ADN polimerasa 
sintetiza la cadena retardada mientras que la ADN polimerasa 
sintetiza la cadena líder, ambas enzimas tienen función correctora
(exonuleasas 3´– 5´).
Control de la Replicación durante el ciclo
celular
El control de la replicación está
íntimamente ligado al ciclo celular,
cada célula hija ha de tener la misma
cantidad de DNA que la madre.

Debe haber un acoplamiento entre


replicación y división celular de
manera que solo puede iniciarse una
ronda de replicación por división
celular.

Deben existir controles para que:


• Solo ocurra replicación en la fase S.
• Determinar cuantos orígenes estén
activados a la misma vez. Primero se replica la
• Los orígenes de replicación que se cromatina activa (menos
están activando lo hagan siguiendo condensada ) y al final la
un patrón determinado para cada heterocromatina o forma
tipo de célula (primero se activan inactiva (fuertemente
empaquetada )
1. En la fase G1 se comprueba que las
condiciones ambientales son favorables y
le permiten continuar a fase S.

2. En G2 es donde se comprueba que la


célula esta bien, que el DNA se ha
replicado completa y correctamente y la
célula entra en mitosis. La célula no se
divide hasta que se asegura que la
descendencia va a estar en condiciones
adecuadas.

Las cinasas dependientes de ciclina (CDKs) y las ciclinas son proteínas


que controlan puntos clave de regulación en la fase G1 y en las fase G2
(el comienzo de la fase M o de la fase S).

La ciclinas se unen a las CDKspara activarlas. En su forma activa éstas


disparan determinados mecanismos que están relacionados con el
comienzo de la fase S o M. Los niveles de ciclinas, varían a lo largo del
ciclo celular.
Ciclinas G1 (fase G1) ---- max (punto Start) da inicio de
la fase S
CiclinasG1 (fase s) y Ciclinas mitóticas ---- max da inicio de la
fase M
Los cromosomas ADN
eucarióticos son moléculas 5´

3´ cadena vieja

de DNA lineales, con 5´ - OH cadena nueva

ADN primer
extremos especializados ARN
llamados telómeros ADN
(estructuras que confieren 5´ 3´ cadena vieja

estabilidad al cromosoma). 5´ - OH cadena nueva

ADN primer
ARN
Todas las polimerasas
conocidas extienden la
cadena de ADN en
dirección 5’- 3’ y para
iniciar la síntesis se
requiere un primer.

La síntesis de la cadena
líder se completa hasta el
final, PERO, la cadena
discontinua (retardada) se
iría acortando en cada
ronda de replicación
5´ …_ GGGGTT GGGGTT GGGGTT GGGGTT 3´
3´ …_ CCCCAA CCCCAA 5´

La enzima que evita este


3´ AACCCCAAC 5´
acortamiento en las cromátidas
ARN molde
hijas en cada ciclo celular es
telomera
llamada telomerasa. sa

La telomerasa es un complejo de
ribonucleoproteina
(RNA+proteínas) que sintetiza
un fragmento de DNA a partir de
un RNA molde. Añaden en los
extremos 3´segmentos lineales
+
de ADN. No necesitan molde ya
primasa
que intrínsecamente poseen un
Este ARN de la enzima se posiciona sobre el ADN y a partir del extremo
3‘OH comienza la síntesis de secuencias en tandem TTGGGG. Una vez
añadido algunos nucleótidos la enzima se transloca (actuando así como
molde movible) para comenzar otra vez y así se van sintetizando las
secuencias repetidas del telómero. Esto mecanismo permite el
alargamiento del extremo protuberante 3’ OH.
Replicación de
•Plásmidos
•Virus (cadena doble, sencilla, lineales o
circulares)
•ADN mitocondrial
Elementos genéticos lineales

1. Algunas ADN
polimerasas añaden la
primera base
(nucleótido) a un OH de
proteínas específicas
que se unen a los
extremos de los
cromosomas lineales.

3. Estas proteínas tienen


como función el
reconocimiento de los
extremos
cromosómicos.

5. Estas proteínas no son


eliminadas y están
Circularización de los elementos
lineales
circularización por
ADN lineal extremos cohesivos

círculo estructura 
rodante (teta)
Modelo replicativo tipo
teta
Replicación bidireccional a
partir de un origen, da lugar
a intermediarios replicativos
que asemejan a la letra
griega .
forma replicativa origen
(doble cadena))

Modelo
enzima de ruptura
replicativo del
ruptura círculo rodante
ADN circular de cadena sencilla
(Fago X174)
ruptura
punto de
crecimiento

cadena
desplazada

punto de
crecimiento

ADN circular de cadena doble


una vuelta (Fago lamda)
completa
Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)
La técnica de Reacción en Cadena de la
Polimerasa o PCR ( de sus siglas en inglés
Polymerase Chain Reaction) es una técnica
para la síntesis "in vitro" de secuencias
específicas de ADN.

Kary Mullis en 1983 presentó la


PCR
Premio Nobel de Química (1993)
La técnica se basa en la replicación del ADN realizada por la ADN
polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena
complementaria de ADN (5´- 3´) usando un molde (cadena sencilla), a
partir de una región de doble cadena. Para sintetizar la región dada se
usan unos primers (iniciadores) que son complementarios a cada uno de
los extremos 3´del fragmento de ADN que se desea amplificar.
Región de doble cadena de interés
molde de cadena
sencilla (templado)

Primer
1
Primer
2

síntesis del
fragmento por la
polimerasa
La reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se basa
en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:

3. Desnaturalización del ADN doble cadena –


separación de las dos cadenas por incubación a 93-
97ºC. La renaturalización se producirá cuando la
temperatura disminuya.

5. Hibridación de los primers (iniciadores) a cada una


de las cadenas - los primers se unen a las zonas 3´
complementarias que flanquean el fragmento que
queremos amplificar. La hibridación ocurre a una
temperatura entre los 45-60º C (temperatura que
favorece el apareamiento por complementariedad entre
los primers y la cadena molde)

7. Extensión (elongación)- se produce la síntesis de una


cadena sencilla en la dirección 5´- 3´ mediante la ADN
polimerasa (produciéndose un fragmento de doble
94°C, 30 s – desnaturalización
1 ciclo 45-60 °C, 30 s – alineamiento
72°C, 1 min –extensión (1000pb)*

*El tamaño del fragmento a amplificar rige el tiempo


necesario para la extensión.

Es importante no realizar un número alto de ciclos para


evitar errores de replicación y productos no específicos.
Procurar utilizar el menor número de ciclos posibles.
A partir del ciclo 3 la
acumulación del ADN
ocurrirá en forma
exponencial

Después de 25 ciclos
(30 millones de veces)
Elementos que componen la
reacción
Elementos esenciales:

§DNA polimerasa termoestable


§Un par de oligonucleótidos (primers)
§dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
§Cationes bivalentes: La concentración de Mg (MgCl2) resulta fundamental
para la polimerasa. Además bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad
de la reacción

§Buffer (Tris-HCl pH 8.0)


§Cationes monovalentes:
concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización de secuencias cortas
concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de secuencias largas

§DNA molde (0.01 – 0.1g)


Propiedades y aplicaciones de las polimerasas termoestables
Consideraciones para el diseño de oligonucleótidos
(primers):
§ contenido G+C 40% - 60%
§ longitud 18-25 nucleótidos
§ evitar secuencias invertidas repetidas
§ evitar complementariedad entre los
oligonucleótidos
§ Tm de los oligos no debe diferir más de 5°C
§ procurar extremo 3’OH sea G o C