TPICOS DE INGENIERA GENTICA: SOBREPRODUCCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN HONGOS FILAMENTOSOS UTILIZANDO TCNICAS DE INGENIERA GENTICA

Francisco Jos Fernndez Perrino Departamento de Biotecnologa UAM-Iztapalapa

ESTRATEGIAS DIRIGIDAS DE MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS 1. 2. 3. Modificacin de mecanismos globales Modificaciones dirigidas de las rutas conocidas Creacin de nuevas rutas y formacin de compuestos nuevos

Modificacin de mecanismos globales

MEJORA DE LOS MECANISMOS DE SECRECIN

Sobreexpresin de los genes kar2 y pdi1 en Saccharomyces cerevisiae Bloqueo de la expresin del gen pmr1 en S. cerevisiae

Modificacin de mecanismos globales

MEJORA DE LOS MECANISMOS DE OXIGENACIN

Introduccin de genes cuyos productos favorezcan la captacin de oxgeno (gen vhb de Vitreoscilla stercoraria, p.ej.)
C m
R

C o lE 1 o ri

P pU LX TR 1

T R -1 T . re se ii

pcbC P. chrysogenum b le S . h in d u s ta n u s
R

H b V itre o s c illa s p . tr p C A . n id u la n s

cyc1 S . c e re v isia e

pH AMBIENTAL
8.5 8.0 7.5

FL 7.8
pH

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5

40 35 30

FS

pH

7.0 6.5 6.0

6.4

5.5 1800
1600 1400 CPC ( g.mL ) 1200 1000 800 600 400 200 0
0 1 2 3 4 5 6

4000 3500 CPC ( g.gms )

-1

47.07 mg/mms

Consumo de O 2 (mL.h .gms )

1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

3000 2500 2000 1500 1000 500 0

0

Peso seco (mg.mL )

25 20 15 10 5 0

-1

-1

44.16 mg/mms

-1

-1

Tiempo (dias)

Tiempo (das)

pacC1F

PacC
1774 pb

pacC12

pacC2R

CO O H CH CH C O
2 2

C H C

Modificaciones dirigidas de las rutas conocidas

C oA C O O H

O S

A C E T IL -C o A

2 -C E T O G LU TA R ATO

2 -C E T O G LU TA R ATO

H 2C

N H

C H C H C H

2 2 2

H 2O
H

L IS IN A
N H
2

h o m o c itr a to s in ta s a
C o A -S H
H C O O H C H C H H O C C H
2 2 2

C O O H C O O H C C H C H N H
2 2

N A D P H + H++ N A D H + H N A D P+ + N A D

H 2C C H C H
2 2 2

s a c a ro p in a d e s h id ro g e n a s a

C O O H H

C H C

C O O H
2

C O O H

C O O H

H O M O C IT R A T O N A D P+ + N A D

S A C A R O P IN A H 2O

DESVO DE RUTAS ACCESORIAS

s a c a ro p in a d e s h id ro g e n a s a

H 2O
C O O H C H C H C C
2 2

N A D P H + H++ N A D H + H
H C CH CH
2 2 2

L -G L U TA M A T O
O

C O O H H H

CH C

N H

C O O H

CO O H

H O M O -c is -A C O N IT A T O H 2O N A D (P )+

2 -A M IN O A D IP A T O S E M IA L D E H ID O A M P + PPi G SH N A D (P )H + H
+

h o m o a c o n ita to h id ra ta s a
C O O H C H C H H HO C C
2 2

AT P
C O O H C H C H
2 2 2

2 -a m in o a d ip a to re d u c ta s a

C O O H H H

C H C

N H

C O O H

C O O H

P e n ic ilin a G

H O M O IS O C IT R A T O N A D
+

L -2 -A M IN O A D IP A T O 2 -C E T O G LU TA R ATO P y rP
+

h o m o is o c itr a to d e s h id ro g e n a s a

M g++ N A D H + H
C O O H C H C H
2 2

2 - a m in o a d ip a to tra n s a m in a s a
C O O H C H C H C H C
2 2 2

L -G L U T A M A T O CO M g++
2

C e fa lo s p o rin a C

C C

C O O H O

h o m o is o c itr a to d e s h id ro g e n a s a

C O O H

C O O H

O X A LO G LU TA R ATO

2 -C E T O -A D IP A T O

C e fa m ic in a C

H
2

L -A A

CO O H

O H H
2

N H
2

AC

V CO O

sin t

et H Is O N

CO as a H

S H H

Lcis t
pc bA B

en a
H
2

H
2

H
2 2

H
-A A

N N N sin CO O ta sa O H O N O N C H pc bC C NH

6AP A
N O O N Fe ni C OO H oA lac et ilC S

op en ici l in a

SH

Lv
O OH

CO

ali na LL DAC V

Is ac o p e il t ni ra cil ns in fe a N ra pe nD sa E

Co A

OH

Fe n Co O O N H
L -A

iso pe ni cil in aN
ila ce t A
A

ilC

oA

pe ni ci

Modificaciones dirigidas de las rutas conocidas

lin a

MEJORA A NIVEL DEL NMERO DE COPIAS DE LOS GENES (AUMENTO DE DSIS GNICA)
XhoI E coR I

E coR I E coR I E coR I XbaI XhoI S a lI N c o I S a lI N c o I S a lI

XhoI XhoI N coI N coI

XbaI E coR I XhoI N coI XbaI XhoI XbaI S a lI S a lI N c o I S a lI N coI N coI E coR I

pcbA B

P cb C

penD E

1 kpb

S a lI H in d III A ccI

P s tI H in d III AvaI XhoI SphI Xm nI

P s tII B s tE EcoRV Bam H I P s tI N coI A paI A ccI H in c II A ccI N coI Xm nI B s tE B g lII AvaI Sm aI A ccI SacI A paI Xm nI

pcbC

penD E 1 kpb

EcoRV A ccI H in c II S a lI

SacI P s tI XbaI N coI H in c II

H in c II

H in c II

H in c II

EcoR I SacI

XbaI

A paI AvaI

Ssp I Sc a I

P v u II

Xm nI

Ssp I

Ssp I

P v u II

C m

f1 (+ ) ori

cos
c o lE 1 ori
P v u II H in d III S a lI Xh o I Kp n I Ec o RV S tu I Sm a I N c o I P s t I* Sa c I X b a I* Ap a I

N heI Xb a I

Iz ta p a C o s 8 .3 k p b
b le

cos

cyc1

pcbC

Modificaciones dirigidas de las rutas conocidas

MEJORA A NIVEL TRANSCRIPCIONAL

Sustitucin de promotores por otros ms eficientes Eliminacin de elementos reguladores negativos Amplificacin de elementos reguladores positivos

Modificaciones dirigidas de las rutas conocidas

MEJORA A NIVEL POSTRANSCRIPCIONAL

Utilizacin de ADNc Optimizacin del uso de codones

L - c is t e n a L - - a m i n o a d p ic o

Creacin de nuevas rutas y formacin de compuestos nuevos

C O O H C O O H C O O H

L - -A A

H 2N C O O H

H 2N

SH

H 2N

L - v a l in a

p c b A B
H 2N C O O H O O H N

A C V s in te ta sa
SH NH C O O H

L L D -A C V

p c b C
H 2N

I s o p e n ic ilin a N s in t a s a
H N S O N C O O H H 2O

L
O

is o p e n ic i li n a N
F e n ila c e til-C o A C oA L - -A A

I s o p e n ic ilin a N e p im e r a sa c e fD
H 2N H N O O N C O O H

C O O H

D
C O O H

S p e n ic i li n a N

L - -A A 6 -A P A

p e n D E
F e n ila c e til-C o A

I s o p e n ic ili n a N a c ilt r a n s f e r a s a

c e fE F

D A O C /D A C s in ta s a

C oA

H N O O p e n ic ilin a G N

H 2N C O O H O

H N O N

d e s a c e t ilc e f a lo s p o r in a C (D A C ) O H

C O O H

C O O H

P e n ic illiu m A s p e rg illu s
A c e til- C o A C oA

c e fG

D A C a c e t ilt r a n s f e r a s a

H 2N C O O H O

H N O N

S O C O C H3 C O O H

C e fa lo s p o rin a C

A c r e m o n iu m

L - c is t e n a L - - a m i n o a d p ic o

L - -A A

H 2N C O O H C O O H

H 2N C O O H

SH

H 2N C O O H

L - v a l in a

p c b A B
H 2N C O O H O O H N

A C V s in te ta sa
SH NH C O O H

L L D -A C V

p c b C
H 2N

I s o p e n ic ilin a N s in t a s a
H N S O N C O O H H 2O

L
O

is o p e n ic i li n a N
F e n ila c e til-C o A C oA L - -A A

I s o p e n ic ilin a N e p im e r a sa c e fD
H 2N H N O O N C O O H

C O O H

D
C O O H

S p e n ic i li n a N

L - -A A 6 -A P A
F e n ila c e til-C o A

STOP

p e n D E

I s o p e n ic ili n a N a c ilt r a n s f e r a s a

c e fE F

D A O C /D A C s in ta s a

C oA

H N O O p e n ic ilin a G N

H 2N C O O H O

H N O N

d e s a c e t ilc e f a lo s p o r in a C (D A C ) O H

C O O H

C O O H

P e n ic illiu m A s p e rg illu s
A c e til- C o A C oA

c e fG

D A C a c e t ilt r a n s f e r a s a

H 2N C O O H O

H N O N

S O C O C H3 C O O H

C e fa lo s p o rin a C

A c r e m o n iu m

Creacin de nuevas rutas y formacin de compuestos nuevos

C e f a lo s p o rin a C
A D N c D -a m in o c id o o x id a s a F u s a riu m s o la n i A D N c e fa lo s p o rin a a c ila s a P s e u d o m o n a s d im in u ta

7 -A C A

Creacin de nuevas rutas y formacin de compuestos nuevos

Aunque es una molcula relativamente pequea, el taxol posee una estructura compleja

La biosntesis de taxol implica 19 pasos enzimticos, desde el GGPP

EQUIPO DE TRABAJO
Estudiantes: Jessica Yasmn Cruz Ramn (Doctorado) Alberto Cristian Lpez Calleja (Doctorado) Facundo Rafael Muiz Paredes (Doctorado)

Profesores: Dr. Francisco Fierro Fierro Dra. Araceli Tomasini Campocosio

fjfp@xanum.uam.mx

TPICOS DE INGENIERA GENTICA: SOBREPRODUCCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN HONGOS FILAMENTOSOS UTILIZANDO TCNICAS DE INGENIERA GENTICA

Francisco Jos Fernndez Perrino Departamento de Biotecnologa UAM-Iztapalapa