BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA
MANUAL DE PRCTICAS BIOTECNOLOGA
MANUAL DE PRCTICAS DE BIOTECNOLOGA COMPILADORES: Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodrguez Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodrguez Revisado por: Academia de Biologia 2011 Ciudad Jurez, Chihuahua Universidad Autnoma de Ciudad Jurez 2009 p. 81
M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa
D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa
Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas
M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas
Aprobados por la Academia de Biologa, 2011
LaboratoriodeBiotecnologa
CONTENIDO Practica 1. Preparacion de las soluciones madre para Medios de Cultivos para plantas....3 Practica 2. Preparacion de los Agares para cultivo de plantas in vitro.....10 Practica 3. Cutivo in vitro de plantas (semilla)......15 Practica 4: Cultivo in vitr de plantas (organos vegetales)....19 Practica 5: Fermentaciones..23 Practica 6: Glicolisis anaerobica y fermentacin ..26 Practica 7: Fermentacion alcoholica...29 Practica 8. Fermentacion lactica..34 Practica 9: Analisis de tecinicas para deteccion de alimentos OGM (documental)...37 Practica 10: Extraccion de ADN eucariotico..39 Practica 11: Extraccion de ADN procariotico.43 Practica 12: Electroforesis con geles de Agarosa....46 Practica 13: Reaccion en Cadena de la Polimerasa y sus variantes (PCR) (Demostrativa y Documental)..50 Practica 14. Secuenciacion de ADN (demostrativa, Documental).53 Practica 15. Prueba diagnosticos (ELISA).55 Practica 16: Bioinformatica y Biotecnologia...58 Practica 17. Biorremediacion (documental)...60 Practica 18. Fitorremediacion......62 Practica 19. Biocombustibles...64 Practica 20. Analisis de contaminacion del agua..67
Practica 1: Preparacin de soluciones madre para los medios de cultivo Objetivo: Que el alumno obtenga un conocimiento prctico sobre los diversos mtodos de preparacin de medios de cultivo para propagar in vitro. Introduccin: Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro": por ejemplo, se encuentran las sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como macronutrientes, las vitaminas tales como riboflavina, tiamina, piridoxina, cido nicotnico, cido pantotnico, biotina, y cido flico. Aminocidos tales como L-glutamina, asparragina y cistena, los hexitoles como mioinositol, hormonas y reguladores del crecimiento, una fuente de carbono y un agente gelificante. Un mtodo de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentracin que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentracin final del medio. Su ventaja no estriba slo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino tambin la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos estn tan diluidos en la solucin final, que la pesada que habra que hacer estara por debajo de los lmites de exactitud de las balanzas de precisin. Las soluciones madre se conservan en frio y en bote color mbar durante algunos meses, desechndose ante cualquier seal de precipitacin. Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminocidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solucin. En el caso de las hormonas es mejor preparar una solucin madre de cada una de ellas y medir volmenes determinados y congelarlos. Materiales: Botes de cristal o de plstico (preferiblemente de los primeros por su transparencia), que en algunos casos habrn de ser de color mbar para proteger de la luz determinados compuestos que son fotosensibles. Balanza granataria Balanza analtica Esptulas de distinto tamao para pesar
Embudos de pesar Agitador magntico Imanes Vasos de precipitados Probetas Matraces aforados Eppendorf Compuestos qumicos Agua destilada Autoclave Termoplato Algodn Gasas Tape Cajas petri estriles Tubos de ensaye esmerilados con tapa Procedimiento: Se establecern 8 equipos de trabajo por cada grupo de prcticas (2 en cada lateral de una mesa). Normas generales a la hora de pesar Se debe comprobar los clculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre estn expresados para un litro Debe leer las caractersticas del reactivo que se va a pesar. Algunos son txicos por inhalacin o en contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones. Para medidas desde 0.01 g se utilizar la balanza granataria. Para valores inferiores la balanza analtica. Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se est haciendo la pesada. Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza, favor de colocar pesa sustancias.
4
Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que est limpia y seca. Es una precaucin que evita la contaminacin de los reactivos. Hay que tener la precaucin de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tom.
Normas generales a la hora de preparar las disoluciones Si la disolucin se va a remover con un agitador mecnico el mejor recipiente es un vaso de precipitados. Si la agitacin es manual, suele ser mejor un erlenmeyer. Antes de empezar a aadir los solutos se deber poner un 70% del volumen total de agua Cuando una disolucin incluya ms de un reactivo, estos se aadirn uno a uno y teniendo la precaucin de no aadir uno hasta que el otro est totalmente disuelto. Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer. Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren los siguientes datos: - Tipo de solucin. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc - Grado de concentracin. Ej 100 X (100 veces ms concentrada que la solucin final) - Componentes con frmula y peso en g/l - Fecha de preparacin - Nombre de los integrantes del equipo
Equipo 1 Preparar 250 ml de la solucin de macronutrientes del medio MS. Equipo 2 Preparar 250 ml de la solucin de Calcio MS y 250 ml de la solucin de Hierro y EDTA MS. En este segundo caso, se deber poner en el recipiente donde se prepara la disolucin un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y adicionar la solucin de hierro. Cuando se haya disuelto, adicionar poco a poco y en agitacin las sales de EDTA hasta su total disolucin. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en frasco mbar y colocar en refrigeracin.
Equipo 3 Preparar 250 ml de la solucin de micronutrientes del medio MS. Equipo 4 Preparar 250 ml de la solucin de vitaminas del medio MS. Equipo 5 Preparar 250 ml de de cada una de las siguientes soluciones A, B, C y D del medio DKW. Equipo 6 Preparar 250 ml de cada una de las siguientes soluciones: F1, G, H y las hormonas del medio DKW. La solucin H se prepara del siguiente modo: se pone en el recipiente donde se prepara la disolucin un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y se adiciona la sal de hierro. Cuando se haya disuelto, se adicionan poco a poco y en agitacin las sales de EDTA hasta su total disolucin. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en frasco mbar en refrigeracin. Hormonas. Se prepararn 10 ml de cada una de las disoluciones. Para cada una de ellas se proceder del siguiente modo: Se pesar la hormona en el un tubo aforado. Se le aaden unas gotas de NaOH 1N y se disuelve. A continuacin se va aadiendo poco a poco y agitando, agua destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf. Se rotulan cada uno de ellos y se guardan en el congelador.
Equipo 7 Preparar 250 ml de la solucin E Equipo 8 Preparar 250 ml de la solucin F2. Primero se preparan 500 ml de la solucin de biotina. De estos 500 ml, se toman 250ml y se les aade la cantidad correspondiente a 250 ml del resto de las vitaminas.
Despus de la explicacin anterior, se prepararan las soluciones madre de las sales, vitaminas, aminocidos y hormonas necesarias para los medios DKW y MS. Veamos la composicin de cada uno de ellos:
Sales mineralesMS (Murashige and Skoog, 1962) (g/l) (NH4 )NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 FeSO4.7H2O Na2EDTA. 2H 2O MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Mioinositol Tiamina HCl Acido nicotnico Piridoxina HCl Glicina 1.650 1.900 0.440 0.370 0.170 0.0278 0.0372 0.0169 0.0086 0.0062 0.00083 0.00025 0.000025 0.000025 0.100 0.0001 0.0005 0.0005 0.002 CaCl2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4 FeSO4 7H2O Na2 EDTA 2H2O K2SO4 Mn SO4 H2O Zn SO4 7H 2O BO3H3 KI Na2MoO4 2H2O Cu SO4 5H2O Co Cl2 6H2O Mioinositol Tiamina H Cl c. nicotnico Piridoxina. HCl Biotina D(+) Glutamina (base libre ) L-Cystena H Cl Pantotenato de Ca (NH4)NO3 Ca (NO3)2 3H2O Sales minerales DKW modificado (g/l) 1.416 1.811 (1.960 si es 4 H2O) 0.147 0.74 0.258 0.00676 0.0908 1.56 0.0338 0.0212 0.0124 0.00166 0.0005 0.00005 0.00005 0.1 0.001 0.001 0.001 0.00001 0.001 0.001 0.1
Lo ms normal es preparar soluciones que contengan varios componentes, de modo que la preparacin de la solucin final sea ms rpida y tenga menos margen de error. Veamos la composicin de cada una de las soluciones madre de ambos medios:
Soluciones madre del medio MS (g/l) MACRONUTRIENTES (10 X) NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 CALCIO, (10 X) CaCl2.2H2O MICRONUTRIENTES (100 X) MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O HIERRO Y EDTA (10 X) FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O VITAMINAS (20 X) Mioinositol Tiamina HCl Acido nicotnico Piridoxina HCl 2 0.002 0.01 0.01 0.04 0.278 0.372 1.69 0.86 0.62 0.083 0.025 0.0025 0.0025 4.4 16.5 19 3.7 1.7 Soluciones madre del medio DKW modificado (g/l) A (10 X) NH4NO3 CaCl2 2 H2O Ca (NO3)2 3 H2O B (10 X) KH2PO4 C(10 X) K2SO4 D (10 X) Mg SO4 7 H2O E (50 X) Mn SO4 7H2O Zn SO4 7H2O BO3H3 KI Na2MoO4 2H 2O Cu SO4 5 H2O Co Cl2 6H2O F1 (100 X) Glutamina (base libre ) L-Cistena HCl F2 (100 X) Biotina D(+) Tiamina H Cl c. Nicotnico Piridoxina Pantotenato de Ca 0.001 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 1.69 1.06 0.6.2 0.083 0.025 0.0025 0.0025 7.4 15.6 2.58 14.16 1.47 18.11 ( 19.60 g/l si es 4 H2O )
Glicina
Referencias: lvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prcticas de Biotecnologa Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz) Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hort. Science, 19(4). Murashige, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologa Plantarum, 15, 473-497. Revilla Bahillo, ngeles y Ords, Ricardo. Guiones de prcticas de Biotecnologa Vegetal. Universidad de Oviedo ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Practica 2: Preparacin de los Agares para cultivar in vitro. Objetivo: El estudiante tendr conocimiento de la preparacin de los agares para cultivar plantas in vitro a partir de las soluciones madre (practica 1), para con ello tenga mas claro el concepto de micro propagacin de plantas para mejora biotecnolgica. Introduccin: El trmino cultivo de tejido vegetal implica una amplia gama de tcnicas de cultivo tanto de rganos, como de tejidos y clulas e incluso plantas completas, entre las que se encuentra la micro propagacin; la recuperacin de embriones; la regeneracin de plantas a partir del callo y la suspensin de clulas, as como el cultivo de protoplasma, anteras y microsporas, que se utilizan sobre todo para la multiplicacin de plantas en gran escala (Segretin, 2006). Materiales: Autoclave Algodn Frascos gerber Tubos de cultivo Ligas Papel aluminio Matraz de 1000ml Moscas magneticas Termoplato Campana de flujo laminar Agua destilada Etanol Soluciones madre del MS Sacarosa Agar-Agar
10
Procedimiento: Para la preparacin de los Agares para medio de cultivo para plantas: El medio de cultivo es el Murashige & Skoogque que consta de una amplia cantidad de nutrientes los cuales se muestra en la siguiente figura:
Para su preparacin en 1000 mL se pesan las cantidades de cada uno de los compuestos o en su defecto si estos ya se tienen pre-pesados y en un frasco limpio por separado solo se agrega la cantidad adecuada segn el volumen a preparar. Agrega el agua destilada al matraz en que se preparara, disolver el medio ya pesado, agitar muy bien hasta observar cierto grado de solubilizacin. Agregar la sacarosa Ajustar el pH a 5.8 y agregar el agar-agar.
11
Someter a calentamiento con agitacin sin que llegue a la ebullicin. Proceda a vaciar el medio en frascos limpios y asegrese de llenarlos con aproximadamente 50 mL, 2/4 del recipiente o segn vea necesario. Meter a la autoclave para su esterilizacin (250F, 15 lb, 15 min). Pasado este periodo de esterilizacin, se sacan de la autoclave y se dejan enfriar y se meten a refrigeracin o bien a una alacena limpia.
Resultados: Pesado y calentado
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
12
Esterilizado
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Vaciado
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
13
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Referencias: Krikoria, A. (1990). Medios de cultivo: generalidades, composicin y preparacin. Universidad de Nueva York. New York, E.U. 1-19 Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de investigacin de Biotecnologa. Cali, Colombia. 1-22 ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
14
Practica 3: Cultivo in vitro de plantas (semillas) Objetivo: Que el estudiante se familiarice con la siembra de semillas in vitro, que aprenda las tcnicas para cultivos de tejidos, rganos vegetales y la obtencin de callos a partir de secciones de zanahoria. Introduccin: La biotecnologa vegetal es el cultivo in vitro de las plantas, en recipientes de vidrio, y supone mantener las plantas en laboratorio, fuera de su entorno natural, teniendo como sustrato un medio de cultivo. En la composicin del dicho medio se encuentran elementos minerales, agua, hormonas, sustancias orgnicas y vitaminas, siendo su porcentaje muy variable segn las especies vegetales y pudiendo faltar alguno de estos componentes. La biotecnologa actual se centra en la obtencin de frmaco y vacunas y sobre todo en la obtencin de nuevas especies y variedades con capacidad para soportar ataque de microorganismos o situaciones de estrs (salino, hdrico, etc.). Es de destacar la obtencin de nuevos hbridos vegetales, por adicin de ADN forneo, obtenindose los conocidos organismos transgnicos. Materiales: Campana de flujo laminar Estuche de diseccin; bistur, pinzas grandes, pinzas pequeas y tijeras. Frascos gerber con agar para plantas Tubos con agar para plantas Vasos de precipitados (7) Mecheros Alcohol Agua estril Cloro Probetas Cajas petri
15
Procedimiento 1: desinfeccin de semillas Para nuestra practica con semillas, se dispondrn de diversos tipos de semillas de cereales y frutos ctricos completos. Las semillas que se extraigan de los frutos ya estn estriles (luego no hay que desinfectarlas), pero las semillas aisladas si que hay que esterilizarlas (con dos agentes: cloro y alcohol). Los pasos a seguir para la desinfeccin son: 1. se deben envolver las semillas en paquetes para poder manipular con las pinzas y una vez hechos se procede a esterilizarlas. 2. Se sumergen en etanol durante 1 min 3. Se sumergen en solucin de hipoclorito de sodio o cloro al 20% por 15 min. 4. Se enjuagan en tres vasos de precipitados con agua estril, destilada, desionizada durante un par de minutos por cada vaso (7). Procedimiento 2: Siembra de semillas (rea estril) Una vez que se tienen en el 7mo vaso de precipitado de agua estril, las semillas ya estn listas para su siembra en tubos de ensayo o en frascos gerber, que tiene medio de cultivo para plantas adecuado. Para sembrar las semillas en los medios de cultivo se enciende el mechero, se lavan las manos hasta el medio brazo y despus se remojan en etanol al 10% hasta que se seque inician la manipulacin o bien utilizar guantes estriles. Despus de eso toman el paquete de material estril y las cajas de petri de vidrio, que nos servir como mesa de trabajo. Con la ayuda de unas pinzas, se pone el paquete de semillas sobre una caja de precipitados y se abre, con las pinzas se toman las semillas para depositarlas en el medio de cultivo. En el caso de los frutos de ctricos completos se procede a esterilizar el fruto entero pulverizando con alcohol y luego la flamea. En la campana de flujo laminar se abren los frutos (limn, naranja o mandarina) y se extraen las semillas con unas pinzas. Tras hacer una pequea incisin en la cubierta se siembran en tubos o frascos gerber con el medio de cultivo adecuado.
16
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
17
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Referencias: Serrano G.M, Biotecnologa vegetal, Madrid D.L Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
18
Practica 4: Cultivo in vitro de plantas (rganos vegetales) Objetivo: El alumno aprender a realizar el montaje de un cultivo de tejidos vegetales a partir de explantes nodales. Introduccin: El trmino genrico cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes tcnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (clulas desprovistas de su pared celular), clulas, tejidos, rganos y plantas completas. Mediante stas y otras tcnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo asptico (estril) en condiciones ambientales controladas. Tambin se lo conoce como cultivo in vitro de plantas por realizarse en recipientes de vidrio (hoy tambin de otros materiales). Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recin en 1922 se logr el primer experimento exitoso: la germinacin in vitro de semillas de orqudeas. Luego de la germinacin, las plntulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones aspticas, y as se mantuvieron protegidas del ataque de patgenos (hongos, virus y bacterias). Materiales: Microscopio de diseccin Microscopio compuesto Muestra de hongo desarrollado en la caja petri Asa de platino Porta y cubre objetos Azul o rojo colorantes Fibra de vidrio Etiquetas adheribles Procedimiento: Para la obtencin de explantos nodales, se deben de lavar los tallos seleccionados con abundante agua. Secar cuidadosamente con papel filtro. A continuacin se pasa a eliminar las hojas de los tallos, cuidado dejar 2 cm del peciolo unido al tallo. Igualmente deben eliminarse las espinas (si las hubiera). Acto seguido se separa los entrenudos (que deben contener al menos una yema axilar) con ayuda de unas tijeras. Debemos conseguir porciones de tallo de unos 4-5 cm aproximadamente.
19
Formol Cutex
Para la estilizacin de los explantos nodales, se envuelven en una gasa y se introduce en un bote que contenga 100 ml de la disolucin desinfectante (hipoclorito de sodio o cloro al 20%) durante 10 min (agitar espordicamente). Despus se lava 3 veces en vasos de precipitado con agua estril, ayudndose de unas pinzas largas. Una vez desinfectado el material vegetal se procede a la siembra en los frascos gerber o en tubos de ensaye con medio de cultivo. Para la siembra de los explantos nodales se enciende el mechero (todo en esterilidad) y se abre el paquete del material estril y las cajas petri que nos servir como mesa de trabajo. Con ayuda de unas pinzas, se pone el paquete de explantos nodales sobre la caja petri, se abre y se toman con las pinzas, para depositarlas en el medio de cultivo. La introduccin del material vegetal en los frasco gerber debe ser muy cerca de la llama y usando pinzas estriles.
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
20
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
21
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Referencias: Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de investigacin de Biotecnologa. Cali, Colombia. 1-22 Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp.
22
Practica 5: Fermentaciones. Objetivo: El alumno entienda el concepto de fermentaciones, demostrar la formacin del acido piruvico durante la fermentacin de la glucosa por levadura e identificarlo. . Introduccin: La fermentacin es un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un proceso de oxidacin incompleta, tpico de los organismos anaerbicos. Se realiza, pues, sin la intervencin del oxgeno. Durante la fermentacin, la energa obtenida procede, igual que en la respiracin aerobia, de las reacciones de oxido-reduccin habidas durante el catabolismo de la glucosa (gluclisis), pero en la fermentacin las coenzimas reducidas no ceden sus electrones a una cadena cuyo aceptor final es el oxgeno, sino que los ceden directamente a un compuesto orgnico que se reduce y es el producto caracterstico de cada fermentacin (lctica, alcohlica...). Materiales: Tubos de ensaye de 13 x 100 Tubos de centrifuga Tripie, rejilla, anillo, mechero. Bao mara. Pipetas de 5 ml. graduadas. Centrifuga. Vasos de precipitados de 250 y 600 ml. Pinzas para tubos de ensaye. Solucin de glucosa a diversas concentraciones 0.5, 1.0, 2.0% Suspensin de levadura al 5 % en Na2HPO4 y KH2PO4 (18 hrs de fermentacin antes de su utilizacin). cido tricloroactico al 10% Nitroprusiato de sodio.
23
2,4 dinitrofenil-hidracina. Hidrxido de amonio concentrado. Hidrxido de sodio 0.1N Sulfato de amonio slido. Nota: un da antes de la prctica llevar su levadura para fermentarla Procedimiento: Formacin de Piruvato: Se deben marcar dos series de tubos de 3 cada una y adicionar 3 ml. de las soluciones de glucosa a las diferentes concentraciones 0.5, 1.0, 2.0% a ambas series. A una de las series de tubos adicionarles 3 ml. de suspensin de levadura con fosfatos de sodio(0.213 g/100 ml) y marcarlos como A; y a la otra serie adicionarle 3 ml. de la suspensin de levadura con fosfatos de potasio(0.09 g/100 ml) y marcarlos como B. Posteriormente se colocar todos los tubos en bao mara a 37.C por 30 minutos y aadir posteriormente a cada tubo 1 ml. de TCA al 10% mezclado vigorosamente y centrifugar a 2500 r.p.m. por 10 minutos. Separar el sobrenadante y desechar el precipitado. Identificacin de Piruvato: Reaccin con nitroprusiato de sodio En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y hervirlo. Se le adicionan 0.5 gr. de sulfato de amonio slido y agitar. Posteriormente agregar dos gotas del reactivo y mezclar vigorosamente y dejar deslizar por las paredes del tubo unas gotas de hidrxido de amonio concentrado, hasta la formacin de dos capas. La formacin de un anillo verde o azul en la interfase indica afirmativo para la prueba. Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Reaccin con 2,4 dinitrofenil-hidracina.En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y adicionar 1 ml. del reactivo, agitar con fuerza y pasar a otro tubo la mitad de la mezcla formada, y adicionar 1 ml. de NaOH 0.1N. La aparicin de un color rojo indica prueba afirmativa. Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Observar la coloracin e intensidad de la misma en cada caso.
24
Referencias: Bamforth W. Charles. 2007. Alimentos, fermentacin y microorganismos. Editorial Acribia S.A. Owen P. 1991. Biotecnologia de la fermentacin Principios, procesos y productos. Editorial Acribia.
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
25
Practica 6: Glicolisis anaerobica y Fermentacion Objetivo: Observar los efectos en una situacion simulada de la fermentacion anerobia que en la realidad se efectua en los seres vivos y verificar la inhibicion ocasionada en la ruta metabolica de la glicolisis por el NaF. Introduccin: De todos los organismos vivientes solo unas pocas especies son estrictamente anaerobicas, esto es, que solamente pueden vivir en ausencia de oxigeno. La mayoria son microorganismos, en particular aquellas especies propias del amibiente que tiene poco oxigeno o que carece de el, es decir, en los intesitnos de los animales, en el suelo profundo, en sedimientos que se encuentran bajo los lagos y oceanos o en pantano donde el oxigeno esta casi totalmente ausente. Un ejemplo de estas bacterias del suelo Clostridium perfringens, que causa la gangrena gaseosa en infecciones de heridas. El producto de la fermentacoin varia de un tipo de celula o microorganismo a otro. Cuando se requiere concentracion repetida de celulas musculares, el suministro de oxigeno no tiene capacidad para mantener el paso de las demandas metabolicas de la celula. En estas condiciones ciertos tipos celulas musculares esqueleticas regeneran NAD convirtiendo piruvato a lactato (fermentacion del acido lacatico). Las celulas de levaduras han enfrentado el desafio de la vida anaerobia con una solucion metabolica diferente, convierten el piruvato a etanol (fermentacion alcoholica). Materiales: Tubos de ensayo Beakers de 300 ml Bao maria 1 hoja de papel milimetrico Levadura (fresca 5 a 10%) Glucosa (5 a 10%) Fluoruro de sodio (5 a 10%) Agua destilada
26
Procedimiento: Marcar tres tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera: Tubo A: Llene una tercera parte del tubo con suspesin de levadura y luego agregue agua destilada hasta llenarlo totalmente. Tubo B: Llene una tercera parte del tubo con suspensin de levadura y agrege solucion de glucosa hasta llenarlo totalmente. Tubo C: Llene una tercera parte del tubo con suspensin de levadura, agregue otra tercera parte con solucion de glucosa y termine de llenarlo con solucion de fluoruro de sodio (NaF). Tomar cada tubo y taparlo con un tapon de caucho (tenga cuidado que no quede muy apretado), invertir suavemente para mezclar. No debe quedar aire en la parte superior del tubo. Conectar por medio de la manguera del tapon al tuvo en U que contiene la columna del liquido a desplazar. Colocar en bao maria a 37C. Si el procediemitno estubo bien hecho, solo quedara una columna de aire en la parte superior de la manguera. Medir la altura del liquido en el tubo en U al conectar. Examinar los tubos de la siguiente manera (si es posible durante 6 lecturas). Tubo A: cada tres minuos Tubo B: cada minuto Tubbo C: cada 15 minutos Anotar los resultados en el cuadro Hacer una grafica con los datos anteriores, coocando en la ordenada el tiempo en minutos y en la abcisa la produccion de CO2 en mL. Hacer el analisis de la grafica (anovas).
27
Referencias: CORN Y STUMPF, Bioqumica Fundamental, Editorial Limusa, 1998 DEVORE G. y Muoz Mena, Qumica Orgnica, Editorial Publicaciones Culturales, Mxico 1992.
Resultados: Tubo A B C Contenido Levadura y agua Levadura y glucosa Levadura, glucosa y NaF Desplazamiento del liquido (mL)
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Realizar la grafica en papel milimetrico.
Cuestionario: 1. El ATP da el impulso iicial para inicial al glucolisis, fosforilando la glucosa. cul es la reaccin?. 2. La fructosa 1-6 difosfato origina dos triosas que pueden convertirse una en otra. cules son estas? 3. Estas triosas en ultimo termino se convierten en acido pirvico o piruvato. Represente las reacciones respectivas en esta conversin. 4. Los dos productos de la glucolisis piruvato y NADH, se pueden metabolizar siguiendo dos vas muy diferentes segn el tipo de clula en la cual se generan. cules son estas dos vas? 5. Escriba la reaccin de la fermentacin del acido lctico. Y diga dos ejemplos de clulas que la realizan. 6. Escriba la reaccin de la fermentacin alcohlica y diga dos ejemplos de clulas que la realizan. 7. Escriba la reaccin general de la respiracin celular u oxidacin aerobia.
28
8. En que lugar u organelo de las clulas procariotas y eucariotas se da la fermentacin (oxidacin anaerobia del NADH) y la respiracin celular (oxidacin aerobia) y bajo que condiciones se da cada una. 9. Qu influencia tiene el NaF en el proceso de la fermentacin y por medio de que mecanismo lo hace. Practica 7: Fermentacion alcoholica Objetivo: El alumno debe utilizar el metabolismo de las levaduras para producir alcohol etlico (etanol), a partir de un jugo enriquecido con azcares fermentables. Introduccin: Para describir la palabra fermentacin se refiri originalmente al metabolismo anaerbico de los compuestos orgnicos mediante microorganismos o sus enzimas para dar lugar a productos ms simples que la materia prima. La definicin actual es: Cualquier accin microbiana controlada por el hombre para obtener productos tiles. Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen y segregan algunos compuestos bioqumicos de importancia para el hombre; estas son las caractersticas en las que se ha basado el uso de los microorganismos como productores de fermentacin, la que de una manera esquemtica se puede representar as: Microorganismos + Nutrientes + Condiciones Ambientales Microorganismos + CO2(g) + Productos intra y extracelurares. La fermentacin se puede clasificar de la siguiente manera: Fermentacin con base al substrato. Protenas, Grasas, Carbohidratos. Fermentacin con base al producto. Alcohlica. Lctica, Acetonica, etc. Materiales: 1 Agitador de vidrio 1 Anillo de Fierro 1 Cuchillo 1 Coladera grande 1 Matraz de destilacin 1 Mechero Bunsen 100 grs. Azcar 250 grs. Cscara de Pia 200 ml de Jugo de Pia 250 grs. de Piloncillo o azucar 100 ml de solucin de Hidrxido de Bario al 2% 6 ml de reactivo de Fehling A y B Adecuadas -------
29
2 Pipetas graduadas de 5 ml 1 Pipeta graduada de 10 ml 1 Pinzas para tubo de ensayo 3 Pinzas universales 1 Pinzas Hoffman 1 Franela 1 Mortero con pistilo 1 Tela de alambre con asbesto 2 Tapones monohoradados 3 Tubos de ensayo de 16x150mm 1 Termmetro 1 Vaso de precipitado de 250 ml 45 cm de Manguera de ltex de 4mm de dimetro 1 Refrigerante 2 Soportes universales
2 lts. De Agua
1 Frasco claro con tapa, de 3 a 5 litros, de boca ancha. 1 Frasco claro sin tapa de 200 a 300 m Procedimiento: DESARROLLO DE LA PRACTICA Nota. Esta prctica se llevara a cabo en 3 sesiones de laboratorio. Primera Sesin 1. Lavar, pelar y hacer trocitos de 2.5 cm aproximadamente de la cscara y de la pulpa de la pia. 2. Se comprime la pulpa de la pia hasta obtener un volumen aproximado de 200 ml de jugo. 3. Lavar perfectamente 1 frasco claro de 3.5 lts. de boca ancha.
30
4. Efectuar en el frasco anterior la siguiente mezcla: 200 ml de jugo de pia, toda la cscara de la pia en cuadritos, 250 grs. de piloncillo, 100 grs. de azcar y 2 litros de agua. 5. A la tapa del frasco anterior que har las veces de un fermentador se le har un orificio para adaptar un tramo de 45 cm de manguera de ltex de 4 mm de dimetro a la cual se le coloca una pinza de Hoffman para evitar que escapen los gases que se forman. 6. Agitar vigorosamente la mezcla anterior y del sobrenadante se extraen con la pipeta 6 ml, de los cuales se depositan 3 ml en un tubo de ensayo y los otros 3 ml en otro tubo de ensayo. 7. Al primer tubo de ensayo se introduce una tira de papel ph, con el fin de determinar el pH de la mezcla. pH= . 8. Al segundo tubo se le agregan 1.5 ml de reactivo de Fehling A y 1.5 ml de reactivo de Fehling B. 9. Agitar, el segundo tubo. 10. Calentar suavemente con el fin de detectar la presencia de azucares reductores (precipitado de color rojo ladrillo). Reportar positivo o negativo. 11. Tapar el frasco y cerrar la pinza de Hoffman. 12. Dejar fermentar durante 24 hrs. Segunda Sesin 1. Transcurridas las 24 hrs. Sumergir la manguera de ltex del frasco en 100 ml de solucin de hidrxido de Bario al 2%, dispuesta en un frasco de 200 a 300 ml de color claro. 2. Se abre lentamente la pinza de Hoffman, con el objeto de que el gas producido entre en contacto con la solucin. 3. Anotar observaciones. 4. Se contina la fermentacin durante otros 6 das. Tercera Sesin 1. Transcurridos los 6 das, se decanta el sobrenadante en un vaso de precipitado. 2. Se filtra el sobrenadante con una franela colocada en la coladera.
31
3. El lquido obtenido contiene de 6.7 a 12 grados de alcohol etlico (tepache). 4. Se efecta nuevamente la determinacin de pH y azucares reductores (repetir los pasos 7,8,9, y 10 de la primera sesin. PH = ; Azucares Reductores ( + o -)= 5. Para separar el alcohol del jugo fermentado se lleva a cabo una destilacin (con ayuda de tu maestro armar el dispositivo de destilacin. 6. Desechar las primeras y las ltimas gotas del destilado (cabeza y cola del destilado). Nota. El alcohol destila por encima de los 78 grados centgrados.
Referencias: CORN Y STUMPF, Bioqumica Fundamental, Editorial Limusa, 1998 DEVORE G. y Muoz Mena, Qumica Orgnica, Editorial Publicaciones Culturales, Mxico 1992.
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
32
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
33
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Practica 8: Fermentacion lctica Objetivo: Obtener el yogur por medio de la fermentacin lctica y observar las bacterias causantes de dicha fermentacin.. Introduccin: Las fermentaciones son procesos de respiracin anaerobia realizados por ciertas bacterias y levaduras. En ellos, el aceptor de H+ y electrones cedidos por una molcula orgnica no es el oxgeno sino otra molcula. Dependiendo de cul sea esta molcula se obtendrn distintos productos finales. En el caso de la fermentacin lctica, la molcula aceptora es el cido pirvico y el producto resultante es el cido lctico. Esta fermentacin se emplea en la industria alimentaria para obtener derivados lcteos como el yogur. El yogur es un producto producido por la fermentacin natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentacin aadiendo a la leche dosis del 3-4 % de una asociacin de dos cepas bacterianas. El Streptococcus thermophilus, poco productor de cido, pero muy aromtico, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta preparacin se podrn, por tanto, observar dos morfologas bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupacin (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Adems, el tamao del lactobacilo (unos 30 ym de longitud) facilita la observacin aunque no se tenga mucha prctica con el enfoque del microscopio. Materiales: Microscopio Portaobjetos Asa de platino Mechero Bunsen Estufa de cultivo o cuarto de cultivo Yogurtera Matraz de 250 mL, Pipeta de 5 mL,
34
Varilla de vidrio Papel indicador de pH Xileno Cristal violeta (o azul de metileno) Frutos de hueso sanos y enfermos Procedimiento 1: obtencin del yogur por la fermentacin lctica. 1. Se colocan 100 mL de leche en el matraz y aade 1 mL de yogur. 2. Se deja incubar el matraz en la estufa durante 24 horas a 37 C. 3. Saca el matraz y observa el contenido. 4. Mueve con la varilla para homogeneizarlo e introduce una tipa de papel indicador de pH. 5. Describe lo observado en el matraz y en el papel indicador. Para realizar este experimento tambin puedes utilizar un yogurtera domstica. Procedimiento 2: Observacin de las bacterias causantes de la fermentacin. 1. Con el asa de siembra toma una gota de yogur y depostala sobre un portaobjetos limpio. Aade una gota de xileno para desengrasar y mzclala con el yogur. 2. Extiende la mezcla y djala secar completamente. Luego pasa el portaobjetos por la llama del mechero 4 o 5 veces para fijar la preparacin. 3. Aplica el colorante cristal violeta durante 2 minutos. 4. Lava despus con abundante agua destilada hasta que el lquido no salga teido y deposita sobre ella un cubre cuidando que no se formen burbujas. 5. Observa al microscopio con el objetivo adecuado (utiliza los mayores aumentos) 6. Dibuja lo que has observado. Referencias: Murray, R. 1994. BIOQUIMICA DE HARPER. Manual Moreno S.A. de C.V CORN Y STUMPF, Bioqumica Fundamental, Editorial Limusa, 1998
35
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones:
36
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Practica 9. Analisis de tcnicas para deteccin de alimentos genticamente modificados (practica documental) Objetivo: Conocer las diferentes tcnicas para determinar que un alimento ha sido modificado. Introduccin: El muestreo y la preparacin de la muestra son pasos cruciales en el proceso de deteccin de OGM. La inspeccin de una muestra es menos costosa que la inspeccin de todo un lote; sin embargo, el contenido de una muestra no siempre refleja el contenido del lote de muestreo. El procedimiento de muestreo determina la representatividad de un resultado mientras que la cantidad y calidad de los analitos puede variar dependiendo de la preparacin de la muestra. Una muestra al azar es aquella seleccionada en el proceso en la cual cada posible muestra de un lote de muestreo tiene la misma posibilidad de ser seleccionada. Esto significa que una muestra al azar produce un estimado imparcial de la medida de inters. En la prctica una muestra al azar no es siempre fcil de obtener a partir de un lote de muestreo (Asif, 2004).
Material: Revistas cientficas de alimentos Revistas cientficas de Biotecnologa Acceso a internet para accesar a las bases de datos
Procedimiento: Leer y hacer ensayo de la importancia de realizar anlisis a los alimentos transgnicos, y dar cuenta del bien o del mal que hacen no solo a la sociedad, sino tambin al ecosistema.
37
Leer y describir cada uno de los procedimientos biotecnolgicos para la formacin de un alimento transgnico. Leer y describir los fundamentos para el anlisis molecular de OGM. Leer y describir los protocolos para la deteccin molecular de OGM.
Referencias: Asif M. 2004. Sampling for Detection of GMO. In: NIBGE-FAO Workshop on GMO Detection. Capacity and Building in Biosafety of Genetically Modified Crops: GMOs Detection. Zafar Y. y Asif M. (ed). National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering. Pakistan.
Resultados: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
38
Practica 10: Extraccin de ADN eucariotico Objetivo: Utilizar tcnicas sencillas para poder extraer el ADN de un tejido animal y por el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar y confirmar que en el ncleo el ADN se encuentra replegado. Introduccin: El bioqumico suizo Friedrich Miesches fue el primero en descubrir sustancia, cidos asociados con las protenas del ncleo celular. Al estudiarlas mejor, Miesches comprendi que estas sustancias son bastante diferentes de las protenas y de otros compuestos conocidos. La unidad bsica de un cido nucleico es el nucletido, cada molcula de cido nucletido se forma como una larga cadena de 4 clases de nucletidos, a su vez lo nucletidos pueden ser fragmentados en 3 partes; una de esas partes es siempre un azcar de 5 carbonos y que son la ribosa y la desoxirribosa, los cidos nucleicos que contienen ribosa se denomina cido ribonucleico o ARN y los cidos nucleicos que contienen desoxirribosa se denominan cido desoxirribonucleicos o ADN. Materiales: Hgado de pollo Probeta Varilla de vidrio Alcohol de 96 Mortero Cloruro sdico 2M Vasos de precipitado SDS
39
Pipeta Arena Portaobjeto Trozo de tela para filtrar Colorante bsico Procedimiento: 1. Triturar medio higado de pollo en un mortero. Aadir arena para que al triturar se puedan romper las membranas de y queden los ncleos sueltos. 2. Aadir al triturado, 50 centmetros cbicos de agua. Remover hasta hacer una especie de papilla. 3. Filtrar varias veces sobre una tela para separar los restos de tejidos que hayan quedado por romper. 4. Medir el volumen del filtrado con una probeta. 5. Aadir al filtrado un volumen igual de cloruro sdico 2M. Con esto conseguimos producir el estallido de los ncleos para que queden libres las fibras de cromatina. 6. A continuacin se aade 1 centmetro cbico de SDS. (Nota: Si no se dispone de este producto puede sustituirse por un detergente de vajillas. La accin de este detergente es formar un complejo con las protenas y separarlas del ADN. As nos quedar el ADN libre de las protenas que tiene asociadas. 7. Aadir mediante una pipeta 50 ml de alcohol de 96. Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas. En la interfase, precipita el ADN. 8. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma direccin. Sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la agrupacin de muchas fibras de ADN. 9. Esta prctica puede completarse con una tincin especfica de ADN. Tenemos que tomar una muestra de las fibras que se van depositando sobre la varilla de vidrio y depositarlas sobre un portaobjeto. 10. Teir durante unos minutos con un colorante bsico. 11. Observar al microscopio.
40
Referencias: Griffith. 2002. Genetica. Mc. Graw-Hill. Carey, J., Bamshad M., Jorde L. 2010. Gentica medica. Elsevier Espaa S.A.
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
41
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
42
Practica 11: Extraccin de ADN procariotico. Objetivo: Que el alumno aprenda el fundamento para la obtencin del ADN procariotico de la tcnica ms sencilla. Introduccin: Existen diferentes mtodos para la obtencin de ADN bacteriano que varan en duracin y complejidad del procedimiento en funcin de la calidad del ADN que queramos obtener. Materiales: MTODO DE HERVIDO Cultivo bacteriano en placa de agar Asa de platino Estufa a 37 C Eppendorf de 1.5 mL esteriles Pipetas y puntillas desechables esteriles Temoplato con capacidad de alcanzar 100 C Centrifuga Soluciones Agua molecular esteril
Procedimiento: Preparar un eppendorf esteril por cada muestra al que se anaden 100 microlitros de agua molecular estril
43
Tomar con un asa de platino unas colonias de la placa de agar e introducirlas en el eppendorf, utilizando posteriormente la pipeta para obtener una suspensin homognea Calentar a 100 C durante 15 min. Anadir 900 microlitros de agua molecular estril a cada eppendorf y homogenizar. Centrifugar durante 5 min a 12000 rpm Recoger el sobrenadante en un eppendorf estril.
Referencias: Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las tcnicas de biologa molecular. Ediciones Pri. Griffith. 2002. Genetica. Mc. Graw-Hill.
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
44
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

45
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Practica 12: Electroforesis en geles de agarosa. Objetivo: Que el estudiante se familiarice con la tcnica de electroforesis en geles de agarosa para la lectura de los cidos nucreicos. Introduccin: La electroforesis es el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico. A diferencia de las protenas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los cidos nucleicos estn cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los cidos nucleicos migrarn hacia el polo positivo, es decir, el nodo. La concentracin de agarosa tpicamente utilizada para electroforesis est entre el 0.5 % y el 2%. La concentracin a usar se escoge segn el tamao del cido nucleico a analizar. Esto porque la concentracin de agarosa define el tamao de los poros de la matriz, a mayor concentracin, menor el tamao de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los cidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarn al nodo ms lentamente que cidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razn de esto es que los cidos nucleicos de alto peso tardan ms tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de cidos nucleicos no linealizados, como plsmidos circulares en conformacin nativa, la migracin no solo depender del peso molecular sino tambin de otros aspectos como el grado de superenrrollamiento que ste poseea. Generalmente en una preparacin de plsmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molcula, la forma superenrrollada, la forma semi relajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo una (s). Materiales: Marcador de peso molecular. Cmara de electroforesis y accesorios requeridos: soporte, peines, tabla niveladora, burbuja niveladora, etc.
46
Solucin amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). La solucin se prepara 5X y se utiliza 0.5X. Para preparar 1 l de una solucin 5X TBE mezclar: 54 g de Tris Base, 27.5 g de cido brico, 4.7 g de EDTA sdico, llevar a 1 l con agua y autoclavar. Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio. Precaucin: el bromuro de etidio es un agente mutagnico, utilice guantes para manipular cualquier material o solucin que contenga este qumico. Amortiguador de muestra con azul de bromofenol Tubos de 1.5 ml Beaker o erlenmeyer de 125 ml Micropipeta de 20 l con sus respectivas puntas Lmpara de UV. Precaucin: la luz ultravioleta puede daar sus ojos. NUNCA observe un gel bajo la luz ultravioleta sin el uso de anteojos que filtren dicha luz. Guantes Procedimiento: Pesar la cantidad de agarosa requerida para obtener un gel de agarosa al 1%. El volumen final es de 30 ml. Disolver la agarosa en 30 ml de amortiguador TBE 0.5x. Calentar en el microondas por 45 s, luego se agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas las partculas de agarosa translcidas. Se debe tener precaucin con los recipientes calientes ya que pueden causar quemaduras. Incorporar 1.25 l de bromuro de etidio a 10 mg/ml en la solucin caliente de agarosa y agitando con movimientos circulares. Precaucin: El bromuro de etilo es un carcingeno y debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame la disolucin o tener contacto directo con esta. La punta que contiene bromuro de etidio debe ser descartada en un recipiente especial para descartar material contaminado con bromuro de etidio. El soporte para vaciar el gel debe estar limpio y seco, se ajusta en el molde portagel o tabla niveladora y se colocan los peines que generarn los pozos para aplicar las muestras. Cuando la agarosa alcanza los 5060 C aproximadamente se vierte en el centro de la bandeja para gel evitando la formacin de burbujas. Se deja reposar, el gel tarda de 2040 minutos para solidificar a temperatura ambiente.
47
Una vez solidificado el gel se quitan los peines, sujetndolo con ambas manos y jalando cuidadosamente hacia arriba. Posteriormente se translada el soporte para el gel hasta la cmara de electroforesis, colocando los pozos mas cercanos al borde hacia el polo negativo (de color negro) debido a que las muestras migrarn hacia el nodo (de color rojo) durante la electroforesis. Se agrega TBE hasta sumergir el gel unos 2 a 6 mm.
Para preparar las muestras aada en un tubo de 1.5 ml: 5 l de agua destilada desionizada 5 l de su preparacin de plsmido 2 l de amortiguador de la muestra Para preparar el marcador del peso molecular, aada en un tubo de 1.5 ml: 7 l de agua destilada desionizada 3 l del marcador de peso molecular (MPM) 2 l de buffer de la muestra Con una micropipeta de 20 l con punta aspirar la muestra preparada previamente. Colocar la micropipeta en forma perpendicular al gel de agarosa, e introducirla hasta el fondo del pozo liberando su contenido mientras se va sacando lentamente la punta del pozo. Tome nota del orden en que se colocaron las muestras y el marcador de peso molecular. Para iniciar la corrida electrofortica, colocar la tapa, asegurndose que los electrodos estn en contacto y conectados a la fuente de poder. Encienda la fuente de poder. La Se electroforesis se realiza a 100 V, 50 miliamperios durante 30 minutos aproximadamente. Finalizada la electroforesis, apagar la fuente de poder, se destapa la cmara y se retira el soporte para gel de la cmara, sosteniendo con los dedos los bordes para evitar que el gel se caiga. Examine el gel bajo la lmpara de luz ultravioleta para determinar la posicin de las bandas en el gel. Referencias: BioRad. Manual de instrucciones de la cmara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa. Rev A
48
Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las tcnicas de biologa molecular. Ediciones Pri.
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Conclusiones:

49
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Practica 13: Reaccin en Cadena de la Polimerasa (demostrativo) Objetivo: Que el estudiante comprenda el fundamento y aplique los conceptos tericos en los cuales se basa la reaccin en cadena de la polimerasa. Introduccin: La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls) fue descrita por primera vez en 1985 por Kary B. Mullis. Esta invencin lo hizo acreedor en 1993 del Premio Nobel en Qumica, debido al gran impacto que ha tenido esta tcnica en el rea de la bioqumica. Su objetivo y funcin es la de obtener mediante amplificacin in vitro cantidades masivas de ADN incluso a partir de muestras de ADN muy pequeas. Para realizar el PCR ms sencillo, se requiere conocer las secuencias que rodean la regin a amplificar, luego se producen oligonucletidos complementarios a estas secuencias mediante sntesis qumica automatizada y estos son utilizados como cebadores (primers) en una reaccin de polimerizacin cclica catalizada por la ADN polimerasa. Material: Gradilla para tubos de 0.5ml y un tubo de 0.5ml Muestra que contenga ADN Micropipetas de 10 l y 100 l con sus respectivas puntas Mezcla maestra que contenga: amortiguador de reaccin en cadena de la polimerasa, mezcla de nucletidos (dNTPs), Taq polimerasa y cebadores. Agua libre de ADNasas Termociclador Procedimiento:
50
En un tubo de 0.5 ml, agregue las siguientes cantidades en el orden indicado (volumen final de reaccin: 50 l): 1. Agua libre de ADNasas: 18.9 l 2. Muestra: 5 l (sobrenadante del lisado de colonias de Escherichia coli, muestras de ADN obtenido en prcticas anteriores.). 3. Mezcla maestra (Fermentas buffer + primers): 27l Con la ayuda de su instructor, programe el termociclador segn las condiciones requeridas. Cuando la reaccin haya finalizado, analice el producto obtenido mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%.
Referencias: Mathews, C.K, Van Holde, K.E y Ahern, K.G. Bioqumica. Pearson Educacin. Tercera edicin, Espaa, 2003. Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las tcnicas de biologa molecular. Ediciones Pri. Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
51
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
52
Practica 14. Secuenciador ADN (documental). Objetivo: Describir el uso del secuenciador para fines prcticos de la biotecnologa en la medicina. Introduccin: La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense. Material: Acceso a internet Acceso a bases de datos Acceso a Journals
Procedimiento: Describir y desarrollar la utilizacin del secuenciador para anlisis. Describir y analizar la utilizacin del mismo en la actualidad.
53
Referencias: Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las tcnicas de biologa molecular. Ediciones Pri. Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.
Resultados: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
54
Practica 15. Pruebas diagnostico, ELISAS Objetivo: Que el estudiante se familiarice con una tcnica bsica en los estudios de inmunologa y que con ella se ha dado pauta a los avances biotecnolgicos en la medicina como ensayo de prueba. Introduccin: Los ensayos inmunoenzimaticos, por su especificidad, sensibilidad y sencillez de manipulacin, son una tcnica muy habitual en los laboratorios de investigacin y de anlisis clnicos. En este ensayo, el anticuerpo que reconoce al antgeno esta unido a una enzima con capacidad para catalizar una reaccin que da un producto coloreado. La tcnica ELISA (enzyme linked immunodsorbent assay) en el ensayo se utiliza, generalmente una membrana de nitrocelulosa sobre la que se fija el antgeno. Posteriormente se anade sobre la membrana el anticuerpo que reconoce especficamente a ese antgeno. Este anticuerpo tiene unida una enzima que al anadir su sustrato generara un producto coloreado. Este procedimiento se denomina mtodo directo de deteccin. Material: Cajas de elisa. Soporte solido Anticuerpo anti-albumina bovina Ovoalbumina Tampn fosfato salino Sustrato cromgeno (4-cloro-1-naftol)
55
Cubeta de lavado Micropipetas Puntillas Frasco lavador Control positivo de albumina bovina Control negativo de albumina ovina Muestras m1, m2. M3 Procedimiento: Tomar la caja de ELISA, aplicaar sobre cada pocillo una muestra de 2 microlitros de muestra y de control positivo y negativo. Uno por cada divisin. Dejar secar de 5 a 10 min. Durante ese tiempo se prepara la solucin de bloqueo. Para ello anadir 2.5 gr de ovoalbmina en 100ml de tampn salino. Aguitar la mezcla hasta conseguir una dilucin homognea 5% Una vez pasado el tiempo de la solucin de los pocillos, introducir la solucin de bloqueo y se deja durante 15 min. Retirar la solucin de bloqueo y lavar la caja elisa con agua destilada. Anador sobre cada punto 20 microlitos de anticuerpo anti-albumina bovina conjugando con peroxidasa, e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar con agua destilada. Anadir sobre cada pocillo 10 microlitros del sustrato cromgeno y dejar desarrollar el color.
Referencias: Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las tcnicas de biologa molecular. Ediciones Pri. Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.
56
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
57
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Practica 16. Bioinformatica y Biotecnologa. Objetivo: Introducir las bases de datos accesibles a travs de Internet de importancia en el rea biolgica. Comprender la utilidad de las mismas como herramientas de acceso a informacin y programas de cmputo actualizados. Introduccin: En las ltimas dcadas, cientficos alrededor del mundo se han dedicado a obtener las secuencias tanto protenas como de cidos nucleicos. Aunque en sus inicios estos esfuerzos fueron aislados, poco a poco la cantidad de datos generada se hizo excesiva para ser manejada por laboratorios aislados. Adems, con el advenimiento de nuevas tecnologas de secuenciacin, se generaron proyectos conjuntos entre laboratorios cuyo objetivo nico era la secuenciacin de un genoma en particular. Se hizo entonces necesaria la organizacin de bancos de datos donde las secuencias generadas pudieran ser depositadas. Desde el inicio, la comunidad cientfica estuvo de acuerdo en que estos bancos de datos deberan tener acceso libre a nivel mundial. Mucho antes de que el genoma humano se completara en el ao 2003, (http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml), existan ya decenas de este tipo de bancos de datos. Actualmente, existen bancos de datos definidos, sumamente extensos de los cuales se derivan secciones donde se puede tener acceso a informacin ms especfica. Materiales: Acceso a internet Acceso a las bases de datos geneticos
58
Procedimiento: Se visitarn diferentes sitios en Internet y su instructor le indicar las principales caractersticas de los mismos. Dependiendo del tiempo y el acceso a Internet, se revisarn los siguientes sitios:
Direccin de la pgina web
Descripcin
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pu Base de datos general, no solo bmed de secuencias de macromolculas sino tambin acceso a libros y revistas en el rea de ciencias de la salud. Adems, acceso a programas de cmputo para anlisis de secuencias de protenas, genes o genomas. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ Programa de cmputo que encuentra secuencias similares en protenas y cidos nucleicos http://www.genome.jp/kegg/ Base de datos de Japn http://www.ebi.ac.uk/embl/ Base de datos Europeo http://www.webact.org/WebACT/home Banco de datos de comparacin de genomas de procariotas, que permite la visualizacin on line de hasta cinco genomas de forma simultnea, utilizando el herramienta de comparacin Artemis, desarrollada por el Instituto Sanger. http://www.sanger.ac.uk/Software/ACT/ Herramienta de comparacin de ADN Artemis Referencias: Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in
59
fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp.
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Practica 17. Fundamentos de la Biorremediacion (documental) Objetivo: Que el estudiante comprenda las bases teoricas y practicas de la Biorremediacion. Que el estudiante explore las posibilidades de la biorremediacion, que se familiarize con los aspectos quimicos y bioquimicos y que escriba y ejecute en manera de las posibilidades una propuesta basica de biorremedicaion de suelo y agua. Introduccin: La biorremediacin es el uso de seres vivos para restaurar ambientes contaminados. Es un concepto que no se debe de confundir con depuracin. La depuracin es la eliminacin, ya sea por mtodos fsico/qumicos o biolgicos, de un contaminante antes de que ste alcance el medio ambiente. Cuando la contaminacin ya se ha producido, se precisa restaurar el ecosistema contaminado, para lo que se pueden utilizar diversas estrategias. Una de ellas es la biorremediacin. Se pueden emplear diversos organismos en los procesos de biorremediacin. Los ms usados son los microorganismos (tanto bacterias, como algas y hongos) y las plantas (en procesos llamados fitorremediacin), pero tambin se pueden utilizar otros seres vivos tales como los nemtodos (vermiremediacin). Entre los microorganismos destacan especialmente las bacterias, los seres vivos con mayor capacidad metablica del planeta. Las bacterias pueden degradar prcticamente cualquier sustancia orgnica. Si la sustancia se degrada completamente se habla de mineralizacin; este es el proceso ideal, pero no siempre ocurre. Algunas sustancias no son degradadas sino transformadas en otras (biotransformacin). La biotransformacin puede ser peligrosa, ya que la nueva sustancia formada puede ser tan nociva o ms que la de partida. Finalmente hay sustancias que no son degradadas y se las denomina recalcitrantes. stas se acumulan durante mucho en el medio ambiente, especialmente si adems son
60
resistentes a procesos fsico/qumicos como la radiacin ultravioleta o la oxidacin. Las bacterias adems pueden eliminar los contaminantes en ambientes donde hay oxgeno (llamados aerbicos), pero tambin en ambientes sin oxgeno (llamados anaerbicos), ya que pueden respirar otras sustancias diferentes al oxgeno (aceptores de electrones), como por ejemplo el nitrato, el sulfato, el hierro (III), el manganeso, el selenio y un largo etctera. Materiales: Arituclos cientificos acerca dela Biorremediacion. Acceso a las bases de datos. Acceso a internet. Trabajo en equipo. Procedimiento: La practica se llevara a cabo en equipo de 3 personas, las cuales se organizaran para la busqueda de informacion y genracion de un miniproyecto. Se utilizara el uso de las bases de datos donde los estudiantes elegiran 4 articulos deacuerdo al tema (sin repetir). Se discutiran los articulos en clase y posteriormente realizaran el proyecto escrito y una presentacion. Referencias: Breedveld, G.D and Sparrevik, M. 2001. Nutrientlimited biodegradation of PAH in various soil strata at a creosote contaminated site. Biodegradation 11: 391399 Garca H D, Sosa A, CR y SnchezYez, 2007. Biorremediacin de agua domestica contaminada con aceite residual automotriz. Revista Ingeniera Hidrulica de Mxico. 17:208219 SnchezYaez, JM et al., 2008. Biorremediacin (Antologa). Secretara de Difusin Cultural y Extensin Universitaria. Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo, Centro de Investigacin y Desarrollo del Estado de Michoacan, Bionutra, SA de CV. Morelia, Mich, Mxico. ISBN:9789709542424.
Resultados: Ensayos de los articulos. Proyecto escrito. Presentacion del proyecto.
61
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Practica 18. Fitorremediacion (documental). Objetivo: Que el estudiante comprenda las bases teoricas y practicas de la Fitorremediacion. Que el estudiante explore las posibilidades de la fitorremediacion, que se familiarize con los aspectos quimicos y bioquimicos y que escriba y ejecute una propuesta basica a medida de sus posibilidades. Introduccin: La fitorremediacin podra ser definida como el conjunto de mtodos para degradar, asimilar, metabolizar o detoxificar metales pesados, compuestos orgnicos, radioactivos y petroderivados por medio de la utilizacin de plantas que tengan la capacidad fisiolgica y bioqumica para absorber, retener, degradar o transformar dichas sustancias a formas menos txicas. Asimismo, podra definirsela como la capacidad de ciertas plantas (terrestres, acuticas, leosas, etc.) y los cultivos in vitro derivados de ellas con el fin de remover, contener o transformar productos contaminantes del entorno. Las bases conceptuales de la fitorremediacin provienen de la identificacin de plantas que hiperacumulan metales. Existen vegetales que tienen esta capacidad intrnseca pero tambin pueden obtenerse plantas con estas capacidades por tcnicas propias de la Ingeniera Gentica. Promisoriamente, las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguas contaminadas, adems, algunos procesos degradativos ocurren en forma ms rpida con plantas que con microorganismos. Es un mtodo apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminacin de reas restringidas en plazos medianamente largos. Sin embargo, es preciso considerar que el proceso se limita a la profundidad de penetracin de las races o aguas poco profundas.
62
Materiales: Arituclos cientificos acerca dela Biorremediacion. Acceso a las bases de datos. Acceso a internet. Trabajo en equipo. Procedimiento: La practica se llevara a cabo en equipo de 3 personas, las cuales se organizaran para la busqueda de informacion y genracion de un miniproyecto. Se utilizara el uso de las bases de datos donde los estudiantes elegiran 4-5 articulos deacuerdo al tema (sin repetir). Se discutiran los articulos en clase y posteriormente realizaran el proyecto escrito y una presentacion. Referencias: Garca H D, Sosa A, CR y SnchezYez, 2007. Biorremediacin de agua domestica contaminada con aceite residual automotriz. Revista Ingeniera Hidrulica de Mxico. 17:208219 SnchezYaez, JM et al., 2008. Biorremediacin (Antologa). Secretara de Difusin Cultural y Extensin Universitaria. Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo, Centro de Investigacin y Desarrollo del Estado de Michoacan, Bionutra, SA de CV. Morelia, Mich, Mxico. ISBN:9789709542424. Resultados: Ensayos de los articulos. Proyecto escrito. Presentacion del proyecto.
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
63
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Practica 19. Biodiesel a partir de aceite nuevo Objetivo: Aprender la metodologa general para la obtencion de biodiesel a partir de aceite vegetal nuevo de cocina. Introduccin: El biodisel es un biocombustible que se fabrica a partir de cualquier grasa animal o aceites vegetales, que pueden ser ya usados o sin usar. Se suele utilizar girasol, canola, soja o jatropha, los cules, en algunos casos, son cultivados exclusivamente para producirlo. Se puede usar puro o mezclado con gasoil en cualquier proporcin en motores disel. El principal productor de biodisel en el mundo es Alemania, que concentra el 63% de la produccin. Le sigue Francia con el 17%, Estados Unidos con el 10%, Italia con el 7% y Austria con el 3%. El sistema ms habitual es la transformacin de estos aceites a travs de un proceso de transesterificacin. De este modo, a partir de alcohol metlico, hidrxido sdico (soda custica) y aceite vegetal se obtiene un ster que se puede utilizar directamente en un motor diesel sin modificar, obtenindose glicerina como subproducto. La glicerina puede utilizarse para otras aplicaciones. Material: Papel filtro Termometro Varita Matraz de 500 ml Vaso de precipitados
64
Probeta Mechero bunsen Aceite nuevo de girasol Hidroxido de sodio Metanol Agua destilada
Procedimiento: 1. medimos el numero de litros de aceite con los cuales queremos experimentar (en este caso 1 litro). 2. Vertimos el aceite vegetal en el vaso de precipitados donde preparamos la mezcla. 3. Si la temperatura es inferior a 21C o si el aceite vegetal se encentra en estado solido o espeso, ser necesario calentar los reactivos antes de mezclarlos. 4. Introducimos con mucho cuidado 3.5g de sosa caustica y 0.2 litros de metanol dentro de un vaso de precipitados. 5. Removemos la mezcla hasta que la sosa haya disuelto en el metanol (se produce metoxido sdico) 6. Vertimos seguidamente el metoxido de sodio dentro del aceite vegetal. 7. Mezclamos el conjunto de forma vigorosa durante una hora, mantenindolo a una temperatura constante de aproximadamente unos 4-50C. Para esto lo colocamos sobre el bunsen siempre controlando la temperatura con un termmetro. 8. Dejamos que la mezcla repose durante 12 horas. 9. Separamos las dos capas con ayuda de un embudo de decantacin. 10. Dejamos que la glicerina, que aparece como capa oscura y espesa en la parte inferior del recipiente, se deposite en el fondo durante una semana. Pasado este tiempo se habr evaporado el resto de metanol y se obtendr un jabon de gliceria. 11. Luego procedemos al lavado del biodiesel para eliminar cualquier resto de glicerina u otras impurezas. Aadimos agua y agitamos, dejamos que esta se asiente en el fondo y desaguamos. 12. Medimos el pH y repetimos el proceso hasta que el pH sea de 6-7. 13. Al final se ha de calentar lentamente para evaporar restos de agua.
Referencias:
65
Aguejas D.L. 1996. Biocombustibles.ministerio de cultura, pesca y alimentacion. Madrid. Jarabo F.F.1999. La energia de la biomasa. SAPT Publicaciones tecnicas. Madrid.
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
66
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Practica 20. Anlisis de contaminacin de Agua Objetivo: Que el estudiante comprenda el concepto microbiologico de indicador de contaminacion. Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante el recuento de mesofilos aerobios y la busqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y E. Coli Aplicar tecnicas de cuantificacion de microorganismos totales y comparar con las tecnicas de determinacion de viables. Introduccin: La determinacin de la calidad bacteriolgica reviste gran importancia en el mbito de la salud pblica ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al consumo evitando as epidemias gastrointestinales. El agua destinada al consumo humano puede ser contaminada por las agua residuales o por desechos humanos y animales que pueden contener microorganismos patgenos (principalmente intestinales) como son los causantes de la tifoidea (Salmonella typhi), la disentera (Shigella dysenterieae) o el clera (Vibrio cholerae) entre otros). Sin embargo, la deteccin de microorganismos patgenos es poco prctica por las siguientes razones: a) No siempre estn presentes en la fuente de contaminacin (material fecal), pero pueden aparecer repentinamente b) Al diluirse en el agua, pueden quedar en concentraciones no detectables por los mtodos de laboratorio c) Sobreviven relativamente poco tiempo en el agua, por lo que pueden desaparecer antes de ser detectados d) Los resultados del anlisis bacteriolgico del agua se obtienen despus que sta ha sido consumida por lo cual si hay patgenos, la poblacin habr estado expuesta a la infeccin.
67
Materiales: Agua almacenada Material por equipo Frasco de boca ancha con tapn esmerilado Papel Kraft 1 pipeta de 1mL Solucin de tiosulfato de sodio 10% Etanol Algodn Hielo raspado (sin sabor) Bolsa de plstico con cierre (ziploc) 1 pipeta de 1mL Solucin de tiosulfato de sodio 10% Material por equipo para el anlisis 2 mecheros Tripi y tela de asbesto Gradilla Equipo Millipore estril Accesorios de equipo Millipore 1 matraz de 250mL con 150mL de Agar Cuenta Estndar. 5 tubos con 10.0mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentracin (3X) 1 caja con Agar Bilis Rojo Violeta 3 tubos con 9mL de solucin salina estril Pipetas serolgicas de 10, 5 y 1mL estriles 10 cajas petri estriles de vidrio o plstico estriles Agua de sabor (10mL) Hielo raspado (600mL) Procedimiento 1: a) Preparacin de los frascos 1. Lavar perfectamente el frasco, eliminando todo resto de jabn o detergente 2. Agregar 0.1mL de tiosulfato de sodio al 10% (0.5mL para frascos de 500mL) 3. Colocar una tira de papel kraft de 1 x 5cm entre tapn y cuello (frascos refractarios con tapn esmerilado) 4. Cubrir el tapn y el cuello del frasco con papel kraftin 5. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. b) Toma de la muestra 1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70% 2. Para grifos lo primero es desinfectar el grifo con algodn y etanol y dejar correr el agua por 3 minutos.
68
3. Generar zona asptica cuando sea posible hacerlo. 4. Destapar el frasco, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar inmediatamente. 5. Para la recoleccin de agua a partir de depsitos naturales y cuerpos receptores, retirar la cubierta de papel y sostener el frasco por la base e introducirlo en el agua 30cm. 6. Destapar y llenar contra corriente o movindolo al frente, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar inmediatamente. 7. En cada caso etiquetar el frasco y elaborar una hoja de registro de datos. 8. Llevar las muestras al laboratorio lo ms pronto posible, para analizarlas antes de que transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.
Procedimiento 2: a) Toma de la muestra

1. Comprar con un da de anterioridad 3 vasos de hielo raspado (1.5L) o granizado de los carritos y colocarlo en la bolsa plstica. 2. Cerrar inmediatamente y refrigerar (no congelar). 3. Llevar las muestras al laboratorio lo ms pronto posible, para analizarlas antes de que transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.
Procedimiento para anlisis de las muestras: a) Determinacin de mesfilos aerbios 1. Homogenizar la muestra de agua de sabor. 2. Realizar 2 diluciones decimales en SSI. 3. Depositar con pipeta 1mL de muestra o dilucin en cada caja de Petri estril. Realizar cada dilucin por duplicado. 4. Verter en cada caja aproximadamente 20mL del medio agar cuenta estndar, fundido y enfriado a 45C, homogenizar y dejar solidificar. 5. Etiquetar cada una de las cajas. 6. Verter una en una caja medio de cultivo sin muestra como control. 7. Una vez solidificadas, incubar las placas a 35C durante 24 horas. 8. Contar todas las colonias presentes, en las cajas que contengan de 25 a 250. b) Prueba presuntiva. Determinacin del NMP de coliformes en agua y hielo potables: 1. A partir de la muestra de agua inocular 20mL en cada uno de 5 tubos con caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentracin. Rotular. 2. Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
69
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms. c) Tcnica de filtracin: 1. Etiquetar la caja con Agar Bilis Rojo Violeta. 2. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un rea estril. En condiciones de asepsia instalar el equipo Millipore estril. Antes de instalar el vaso y las pinzas de pato, colocar una membrana de 0.45mm estril sobre la base del filtro conector. Las pinzas de punta roma se esterilizan con alcohol y a la flama antes de tomar la membrana. 3. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido de la muestra lquida solicitada, si presenta partculas en suspensin filtrar previamente con algodn y gasa. 4. Abrir la llave de vaco y filtrar el medio a travs de la membrana. Una vez que hubo pasado todo el medio cerrar el vaco. 5. Retirar las pinzas de pato y el vaso. 6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y colocarla en la caja de Petri con Agar Bilis Rojo Violeta. Presionar ligeramente la superficie para favorecer la adherencia de la membrana. 7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recin inoculada e incubar a 37C durante 24 horas. 8. Transcurrido el tiempo de incubacin revisar los resultados y guardar en refrigeracin. Referencias: Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American Public Health Association. 20th edition. Washington. Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo para consumo humano, envasado y a granel. Especificaciones sanitarias
70
Resultados:
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
71
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
72
73

BIOTECNOLOGIA

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

BIOTECNOLOGIA

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS BIOTECNOLOGA

M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa

Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas

M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011

Resultados: Pesado y calentado

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Conclusiones:

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

Direccin de la pgina web

Resultados: Ensayos de los articulos. Proyecto escrito. Presentacion del proyecto.

Conclusiones: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

Procedimiento 2: a) Toma de la muestra

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

También podría gustarte

Conclusiones: __

Conclusiones:

Conclusiones:

__

__

Conclusiones: __

__