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Tecnicas de Siembra

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C.S.de Técnico de Laboratorio.

Microbiología Clínica: Técnicas de siembra

TÉCNICAS DE SIEMBRA Y RECUENTO DE BACTERIAS

1. TÉCNICAS DE SIEMBRA:
1.-INTRODUCCIÓN.2.- MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACIÓN.3.-PREPARACIÓN DE INÓCULOS.4.-TÉCNICAS DE SIEMBRA.5.- NORMAS GENERALES: 2. RECUENTO DE BACTERIAS

1 TÉCNICAS DE SIEMBRA:
1.-INTRODUCCIÓN.Para la identificación de una especie bacteriana es preciso estudiarla en un cultivo puro y para ello es necesario aislarla. El aislamiento consiste en obtener bacterias de un solo tipo, de tal forma que en su estudio no se produzcan errores, llegando a un diagnóstico falso al haber varias especies bacterianas mezcladas. Normalmente las infecciones bacterianas están ocasionadas por un solo tipo de microorganismos y es muy raro que intervengan dos o más especies, lo cual no significa que no haya otro tipo de bacterias acompañantes en la infección, ya que esta ocasiona unos cambios fisicoquímicos que facilitan la proliferación de dichas bacterias acompañantes (oportunistas). Hay que tener en cuenta los posibles microorganismos que se pueden añadir durante la manipulación en el laboratorio, por ejemplo la presencia de Staphylococcus aureus. El aislamiento es la separación de un determinado microorganismo de las poblaciones mixtas existentes en la naturaleza, hasta conseguir una sola o los descendientes de esta única bacteria. A esta bacteria separada se denomina “unidad formadora de colonias” Para realizar el aislamiento y contaje de bacterias es preciso depositarlas en un medio de cultivo apropiado, a este procedimiento se llama siembra o inoculación. El método más usual es la siembra por estrías en placa, utilizando el asa de siembra, mediante la cual y a partir de una pequeña cantidad de muestra se separan e inmovilizan las células bacterianas sobre un medio nutritivo sólido. Después de un tiempo y temperatura de incubación adecuados cada célula viable origina una colonia bacteriana que es visible macroscópicamente y a partir de la cual es posible obtener un cultivo puro. Cada colonia tiene unas características determinadas en cuanto a su forma, borde, elevación, tamaño, consistencia, etc.

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2 . 4. b) Si el problema está en la cantidad de microorganismo. Pipetas. Se realiza con asa de siembra. 2.. Asa de siembra. Si se adiciona a un medio de cultivo líquido se homogenizará y se incubará .01mililitros. la más usada tiene un calibre de 0. 3.1. 4. A veces al principio es necesario partir de un inóculo con un número aproximado de microorganismos.Se usan para siembras en medios sólidos y semisólidos en picadura . que no es suficiente.-PREPARACIÓN DE INÓCULOS.C.-Son asas de vidrio en forma de triangulo más o menos abierto.S. se carga ésta con muestra sólida o líquida y añadiéndose al medio liquido y agitando el asa dentro del mismo. Resiembra es el paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro. se extenderá con el asa y se incubará. se aislará por estría en placa o por agotamiento. Es desechable 5. a) SIEMBRA DEL INÓCULO EN MEDIO LÍQUIDO..-Es utilizada para la inoculación o siembra por estrías en medio sólido y para siembras en medios líquidos.MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS a) Si la muestra es sólida o semisólida se tomará con asa estéril. Se utiliza para extenderle inóculo líquido previamente adicionado a la placa con una pipeta pasteur. una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como cultivo puro. de esta forma. a) Si la muestra no es pura.Un inóculo es una cantidad suficiente y representativa de microorganismo problema.-TÉCNICAS DE SIEMBRA Siembra o inoculación es el paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo ya sea líquido o sólido. Hisopos. será necesario preparar un inóculo con el fin de obtener una cantidad microbiana suficiente y representativa para obtener resultados fiables. 2. b) Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta Pasteur. Hilos. Asas de Digrasky.MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACIÓN. Los inóculos se preparan en medios líquidos y el nº de microorganismos se cuentan por comparación con la escala de Mc-Farland.Si se añade en un medio de cultivo sólido.Pueden ser de vidrio o de plástico. de manera que si bien aparecen colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. 4. 3. Si se adiciona a un medio líquido se homogeneizará por agitación y si se adiciona a un medio de cultivo sólido se utilizarán diferentes técnicas de siembra y se incubará en ambos casos..de Técnico de Laboratorio. Se debe de partir por un lado: a) de un cultivo puro y b) de una concentración adecuada de microorganismo problema. Microbiología Clínica: Técnicas de siembra Es muy importante realizar el mayor número de estrías para diluir la muestra..Se utilizan para la toma de muestra y extender dicha muestra en el medio de cultivo. en las estrías finales deberán aparecer colonias perfectamente separadas unas de otras.

por ejemplo. b) SIEMBRA DEL INÓCULO EN MEDIO SÓLIDO. Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 mililitros de medio a una temperatura de 45 a 50 0C) en tubo. Esta técnica se usa en el estudio de antibiogramas. aunque la homogeneización en este caso es más difícil. 1. constituida la muestra.  Si se realiza con escobillón o hisopo el método es igual que con el asa de siembra. y hacer unas estrías en superficie sin apretar excesivamente sobre el medio con movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no 3 . manteniéndola vertical en el mechero bunsen.de Técnico de Laboratorio. Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. para la determinación del CMI (concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos. La mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri.4 y se homogeneiza la muestra en el tubo mediante el vibrador.C. c) Siembra por agotamiento o aislamiento en estrías. Microbiología Clínica: Técnicas de siembra  Si se realiza con pipeta se toma un volumen de muestra problema y se vierte al medio de cultivo líquido agitándose hasta su homogeneización. 5 Con la placa invertida sobre su tapa. se vierte ésta en la placa petri estéril y se dejará solidificar.1 a 0.-Si la muestra se encuentra en el tubo de ensayo.-Siembra del inóculo en placa a) Técnica de Barry.2 y 1 ml con pipeta estéril y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky estéril. utilizando el dedo meñique de la mano derecha quitar el tapón metálico o el algodón de! tubo que contiene la muestra y flamear la boca de éste. Siembra previa al vertido del medio en la placa. levantarnos el fondo y sostenerlo sobre la mano durante la inoculación.Consiste en adicionar al medio sólido un inóculo que pueda oscilar entre 0.S. Una vez. 4. b) Siembra de muestra líquida en placa con asa de Digrasky.-Flamear toda la longitud del asa de siembra hasta la incandescencia. se adicionará la cantidad de inóculo que oscila entre 0. 3. Esta técnica es utilizada.-Tomar con el asa una delgada película de la muestra. 2. 1.-Volver a poner el tapón en el tubo tras el flameado de la boca.

formándose cuatro cuadrantes.Flamear la boca del tubo. observándose en el último cuadrante las colonias más aisladas o separadas.de Técnico de Laboratorio. es decir con el medio de cultivo arriba.1. Se tomará con el asa de siembra estéril una cantidad de inóculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese cuadrante en forma de zig-zag. en la base de la placa (reverso).Introducir el asa y sembrar en estrías la parte superior dcl medio (pico de flauta). nunca en la tapadera. 6.S. 5. Microbiología Clínica: Técnicas de siembra tomándose en ningún momento nuevo inóculo y no levantándose el asa hasta concluir la siembra de toda la placa. tapar y llevar a incubación. 2. 2.Normas generales: 1.. Utilizar placas sin agua de condensación en la tapadera. se dibujan dos líneas perpendiculares que se cruzan en el centro de la placa..Flamear el asa en toda su longitud. 4. a) Siembra en tubo inclinado. b) Siembra en picadura. ni en el medio de cultivo. c) Siembra en picadura y estrías.. Con un rotulador para vidrio. 3.C. Los rótulos deben ser hechos en aquella parte de la placa que lleva el medio.-Siembra del inóculo en tubo.. en caso de que se encuentre en tubo quitar el tapón.Tomar la muestra. Marcar adecuadamente las placas de petri que contienen el medio de aislamiento. Colocar las placas en posición invertida. Finalizada la operación se tapa la placa. 2. de esta manera se evitan las contaminaciones y que el agua de condensación caiga sobre el medio.. 5. 4 ..Se lleva a incubación a la temperatura especifica para esa muestra (normalmente 370C) durante 24-48 horas.Sembrar primero en picadura y sin sacar el hilo sembrar en estrias en la superficie.Sembrar igual que en el tubo inclinado pero utilizando un hilo en lugar de un asa y se introduce con la muestra verticalmente hasta el final de tubo (aprox.. Realizaremos la misma operación sin flamear en todos los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema.Flamear la boca del tubo. d) Técnica de los cuatro cuadrantes. 1 cm del fondo).

-RECUENTO DE BACTERIAS En muchas muestras la detección de bacterias sugiere infección pero no asi en otras. Los cultivos puros son mantenidos en el laboratorio por resiembras (pase de una bacteria de un medio a otro) sucesivas. en cuyo caso se suministrarán sembrados en tubos inclinados de TSI. 9. 4. En condiciones de esterilidad. Obtenido el cultivo puro de la bacteria deseada es conveniente realizarle una tinción de Gram. Las muestras se agitarán para homogenizar su contenido antes de sembrarlos. Con el asa estéril tocar la colonia asegurándose de no rozar otras colonias vecinas. tomar una gota de la mezcla bacteriana con ayuda de un asa estéril. rodeándola con una marca. con ayuda de un rotulador. 5 . Sacar los medios del lugar de almacenamiento con anterioridad para que estén a temperatura ambiente en el momento de la siembra. 10. como por ejemplo en la orina donde siempre hay bacterias. Hacer estrías paralelas juntas pero nunca superpuestas. Para ello. para comprobar que no esté contaminado. una de las copias puede ser liofilizada para su conservación.S. se logra masa bacteriana sembrando estrías muy juntas. 13. 6. Incubar los tubos que deberán estar perfectamente rotulados con todos los datos necesarios. 11. Observar las colonias y describir los diferentes tipos encontrados. Si se trata de un cultivo puro.C. Los instrumentos de siembra cuando se esterilizan por flameado hay que dejarlos enfriar antes de la manipulación de las bacterias. (Normalmente 37º durante 24 horas). No dejar los tapones de los tubos en la mesa para evitar la contaminación. Antes de sembrar revisar el medio a inocular para ver si está contaminado. En las muestras no estériles normalmente la infección viene dada por un incremento en el número o por cambio de las especies presentes. También es aconsejable antes de proceder a la obtención del cultivo puro tomar la colonia seleccionada y hacer un segundo aislamiento. ya que estas pueden ser destruidas por el calor. avanzando sobre la superficie de agar 5. 4. a partir de cada una de las colonias distintas que se obtienen en un aislamiento de una muestra. TÉCNICA DE UN CULTIVO PURO Cultivo puro. 8. tomar la menor cantidad de masa bacteriana posible. 12. Los tubos se mantendrán inclinados para evitar la contaminación. Seleccionar una colonia perfectamente aislada. Técnica. 2. Incubar las placas seleccionando el tiempo y la temperatura de incubación adecuados para cada bacteria.de Técnico de Laboratorio. Inocular un tubo inclinado de TSI o agar nutritivo haciendo estrías muy juntas para obtener un tapiz continuo de masa bacteriana. Seleccionar 1 o 2 colonias para realizar el cultivo puro. 3. por ejemplo en un tubo de agar nutritivo. si todas las colonias de la segunda placa resultan idénticas puede usarse una de ellas para establecer un cultivo.Se trata de desarrollar un solo tipo microbiano en un medio de cultivo.1. Microbiología Clínica: Técnicas de siembra 3. 2. 7.

como por ejemplo el recuento de hematíes en los cuales hay una diferencia de conductividad al paso de una bacteria u otra partícula que se traduce en una señal que se va registrando y contabilizando. que su siembra nos va a dar tras la incubación colonias que puedan ser contadas (lo ideal entre 50 y 250 por placa) y de ahí deducir el número de bacterias. 2) Electrónicos: Consiste en un contador electrónico de partículas semejantes a otros empleados en el laboratorio. Las fracciones de muestra se pueden obtener mediante diluciones de la muestra o con un asa calibrada y sembrando en placas de la forma más homogénea posible. Por todo ello es fundamental realizar estudios que nos permitan saber el número de bacterias presentes en la muestra. Con el asa calibrada se realiza haciendo una estría longitudinal en el centro de la placa y sobre ella se realizan estrías muy juntas en distintas direcciones. Microbiología Clínica: Técnicas de siembra Así mismo los tratamientos se deben valorar como satisfactorios si han hecho desaparecer o al menos han reducido el número de bacterias.En medio sólido: se consiguen sembrando fracciones de muestras con escaso número de microorganismos.C. Técnicas de recuento: 1) Manuales: .S.de Técnico de Laboratorio. de tal modo. la primera de la cuales será perpendicular a la estría longitudinal También se pueden realizar sucesivas diluciones de la muestra en un medio de cultivo líquido y tras la incubación ver qué diluciones han presentado turbidez y calcular el número de bacterias vivas que contenía. 6 .

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