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LA COLORACIÓN DE GRAM

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LA COLORACIÓN DE GRAM I.

Introducción El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Si se desea simplemente aumentar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos que usan unos solo colorantes llamados de tinción simple. Sin embargo, a menudo se utilizan métodos que no tiñen de igual modo todas las células, es el proceso denominado tinción diferencial. Uno muy usado en microbiología es la tinción Gram. Basándose en su reacción a la tinción Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos: gram positivas y gram negativas. Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias. Mientras que las bacterias gram negativas son constantes en su reacción, los microorganismos gram positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas condiciones (son gram lábiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias gram positivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tiñen por la safranina apareciendo como gram negativas. Análogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecución de la técnica. Por este motivo, es preciso atenerse, en la práctica, al procedimiento establecido. Para explicar el mecanismo de la tinción de gram se han propuesto varias hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos. Aquí puedes ver las diferencias estructurales y químicas de los dos tipos de pared bacteriana:

Pared Gram+ capa densa y uniforme de 200 a 800 A) ácidos teicoicos polisacáridos proteínas (pocas veces) glicopéptido (50% del peso seco) Pared Gram capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta por capas externas de densidad menor) lipopolisacáridos lipoproteínas proteínas glicopéptido (10% del peso seco)

El mecanismo de la tinción Gram es el reseñado en el siguiente esquema:
Productos que se utilizan 1) Cristal violeta 2) Lugol solución iodada 3) Alcohol

Reacción y coloración de las bacterias

GRAM + Células color violeta

GRAM Células color violeta

Se forma el complejo CV-I. Las células continúan teñidas de color violeta. Se deshidratan las paredes celulares. Se contraen los poros. Disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las células que continúan teñidas de color violeta. Células no decoloradas; Quedan teñidas de color violeta.

Se forma el complejo CV-I. Las células continúan teñidas de color violeta. Eliminación por extracción de grasas de las paredes celulares. Aumenta la porosidad. El complejo CV-I se separa de la célula.

4) Safranina

Células decoloradas; Se tiñen de color rosado.

II.

Objetivos  Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram  Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad clínica de la tinción.

III.

Fundamento teórico

La tinción de Gram o coloración de Gram Es un tipo de tinción diferencial empleado en Bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre

al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella. La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen microscópico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden detectarse con este método. Las únicas excepciones son: Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las células huésped (p. ej., clamidias).Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el microscopio óptico (p. ej., espiroquetas).Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los colorantes (p. ej., mycobacterias) El cristal violeta sirve como colorante básico uniéndose a la pared celular bacteriana, con ayuda del mordiente (lugol) que refuerza la unión del colorante. Las bacterias Gram positivas, debido a la estructura y composición bioquímica de su pared celular retienen el complejo cristal violeta-lugol y aun después del tratamiento con el decolorante conserva el colorante básico, por lo que se observan de color púrpura o violeta al microscopio. Las bacterias Gram negativas pierden el colorante básico cuando son tratadas con el decolorante debido a que

el alcohol disuelve el contenido lipídico de la pared celular (lo que aumenta la permeabilidad celular), dando como resultado la pérdida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razón por la cual estas bacterias se observan de color rojo al microscopio. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina). TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA. Preparación del extendido: Los métodos de tinción se utilizan en forma directa con las muestras del paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los microorganismos en cultivos. Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de líquido aspirado. El material que se va a teñir se coloca en forma de una gota (si la muestra es líquida) o se rota (si la esta e un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco.

Es importante evitar la contaminación de los medios de cultivo; por lo tanto, una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estéril no debe utilizarse para la inoculación posterior de medios de cultivo. Para la tinción de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad del cultivo desarrollado en un medio solido a la superficie del portaobjetos. Este material se emulsiona en una gota de agua o solución salina 0.9% estéril sobre el portaobjeto. En caso de cantidades pequeñas que puedan perderse incluso en una gota de solución fisiológica se puede utilizar n aplicador de madera estéril para obtener el material; luego este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teñir se deja secar y se fija al portaobjeto mediante su colocación sobre una platina caliente (a60⁰C) durante por lo menos 10 minutos o cubriéndolo con metanol al95% durante 1 minuto. Para examinar los microorganismos que crecen en medio líquido se aplica una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y se fija antes de la tinción. La preparación de los frotis varía de acuerdo con el tipo de muestra que se va a procesar y con los métodos de tinción que se van a utilizar. No obstante la regla general para la preparación de frotis es que debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciarlos microorganismos. Por último, el método de tinción que se debe utilizar está determinado por el tipo de microorganismo buscado.

IV.

Materiales, equipos y reactivos  Microscopio óptico  Porta objetos  Agua destilada  Pipetas Pasteur  asa o asa de siembra  Mechero

 Cristal Violeta  Lugol  Alcohol acetona  Safranina

V.

Diseño experimental

Esterilización del asa de siembra. Aplicación de colonia bacteriana en el portaobjetos. Re-suspender muestra en el portaobjetos. Secar al mechero. La gota de agua debe Se debe calentar por 5 ser pequeña min aproximadamente, hasta que toda el agua se seque. Secado de la muestra sin aproximar demasiado a la llama para no estropearla fijación de la muestra para que sea posible su tinción.

Después de la fijación el primer paso en la tinción de Gram es laaplicación del colorante principal cristal violeta (metil rosanilina ovioleta de genciana) Esperar que transcurra 3 minuto. Escurrir y enjuagar.

Luego debe agregarse el lugol. Este debe aplicarse como el cristal violeta y también debe cubrir la muestra por 1 min. Luego se lava con agua corriente.

El cubrir la muestra con alcohol acetona para decolorarla es el paso más crítico del procedimiento. Este debe cubrir la muestra y la reacción debe ser detenida con el lavado con agua corriente. El tiempo debe ser el mismo para todas las muestras. Al ser tiempos por lo general muy cortos, se recomienda agregar el alcohol mientras ya se tiene la llave del agua corriendo, listo para el lavado.

El último paso consiste en agregar una tinción de contraste, para teñir las bacterias que pierden el cristal violeta. Para esto se agrega safranina cubriendo la muestra por 2 min, dependiendo. Luego se lava con agua corriente y secar con el flameado.

Secado de la preparación con cuidado de no estropearla. Aplicación de aceite de inmersión para objetivos de 100 aumentos. Adherirlo sobre el portaobjetos sin ponerle cubreobjetos. Colocación de la preparación en el microscopio observarla con el objetivo de 100 aumentos aproximar lo máximo.

VI.

Resultado

Se visualizaran las bacterias gram positivas de color violeta y las bacterias gram negativas de color rosado o rojizo. Bacterias gram positivas: Corresponden a las bacterias que mantienen la coloración del cristal violeta después del alcohol acetona, lo que les da un color violeta/morado. streptococcus pneumoniae bacteria gram positiva, desde cultivo bacteriano en agar sangre. Bacterias gram negativas: Corresponden a las bacterias que pierden la coloración del cristal violeta después del alcohol acetona y se tiñen con el colorante de contraste (safranina), lo que les da un color rosáceo/rojizo. Escherichia coli bacteria gram negativa, cultivo desde agar macconkey

Gram positivos

Gram Negativos

VII.

Conclusión

El tamaño de las bacterias dificulta su visión al microscopio, por eso la tinción de estas en la microbiología es un apartado sumamente trascendente. La técnica de tinción tiene como finalidad crear un contraste entre la célula y el medio que la rodea, y una de las más importantes, tanto por su aplicación clínica para hacer una identificación preliminar de la bacteria causal de la infección y por su practicidad, es la tinción de Gram. Es por eso que esta técnica se vuelve fundamental en el estudio de la microbiología, y el conocimiento de su correcta realización es prácticamente obligatorio para todo aquel que se encuentra en el aprendizaje las ciencias médicas. El estudio de la literatura acerca de la tinción de Gram nos permite tener un preámbulo para poder diferenciar frente al microscopio los diferentes tipos de microorganismos, .Sin embargo, no hay que pasar por alto que es de suma importancia tener un completo estudio previo de los organismos y su reacción a la tinción para poder dar una respuesta certera ante el cuestionamiento de la naturaleza de un microorganismo.

VIII.

Bibliografía  Jawetz E., et al. “Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg”. Editorial Manual Moderno, 19a Ed. México 2008; 702-703.  Murray PR, et al. “Microbiología Médica”. Editorial Elsevier Mosby. 6a Ed. España 2009: 158-159.  Caldas A. L., “Guía de Microbiología y Parasitología básico clínica”. Disponible en:http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/ Tencion_de_gram.pdf.

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