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Cromatografía

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1/26/2010

Introducción
 Significa "Escribir en Colores“.
Los componentes de una mezcla pueden presentar una tendencia diferente a permanecer en cualquiera de las fases involucradas.

Cromatografía

 Es la separación de dos o más compuestos químicos en un medio.

Aspectos históricos de la cromatografía
 La técnica de cromatografía aparece en 1850.
 El químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un material poroso, como papel.

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 Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía.  Fase estacionaria: se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Las principales técnicas son:  Cromatografía en papel  Cromatografía en capa fina  Posee:  Fase móvil: consiste en un fluido (gas. 1938. Tipos de cromatografía  Cromatografía plana: La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.  Permite separar los distintos componentes de una mezcla.  Cromatografía en columna: La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.  Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados. permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.  Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica. Conceptos generales  La cromatografía se basa en un conjunto de técnicas asociadas al principio de retención selectiva. obtuvo el premio Nóbel por sus trabajos en 1948. 2 .  En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo. 1939 respectivamente.1/26/2010 Aspectos históricos de la cromatografía  En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía de columna para separar extractos vegetales coloreados. líquido o fluido supercrítico). Aspectos históricos de la cromatografía  A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial.  En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal.  Los químicos Khun. desarrollo por elusión y desarrollo por desplazamiento.  Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937.  Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:  Cromatografía de líquidos  Cromatografía de gases  Cromatografía de fluidos supercríticos`  Los componentes de la mezcla interaccionan en forma diferente con la fase estacionaria y con la fase móvil.  Para el mismo tiempo la cromatografía comienza a aplicarse en el campo de la bioquímica.

En este tipo de cromatografía la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte (silica). Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía  Cromatografía en capa fina Fue originada en 1938 por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y Schraiberen.  Contiene una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. su hidrofobicidad.  Lograron separar mezclas de tinturas farmacéuticas.  La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.  Se pueden separar de acuerdo a su carga.  Se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Términos relacionados con el proceso  Matriz de la columna  Longitud de la columna  Volumen de la columna: volumen total de gel. Tiene como soporte un papel de celulosa. su tamaño o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. Stahl estandarizó el método para elaborar capas finas por métodos mecánicos. 3 . Es una técnica sencilla y presenta la ventaja de poder utilizar cantidades pequeñas de muestra (miligramos y microgramos).1/26/2010 Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía  Cromatografía en papel Fue desarrolla por Martin. Cromatografía de columna  Consiste en la aplicación de una muestra compleja a una columna de cristal.  Las diferentes mezclas se van retrasando de manera distinta según sus interacciones con la matriz.  ‘Run Throught’: volumen de muestra mas solvente.

1/26/2010 Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía  Cromatografía de intercambio iónico Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial.  Tenía la finalidad de separar los elementos alcalinotérreos y los elementos de transición.  Se usa en la separación de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos).  Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos. Cromatografía de intercambio iónico  Se realiza sobre matrices que tienen una carga neta. En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de intercambio iónico. neutralizando de este modo la fuerza que retiene a la muestra en la columna. 4 . siendo eluidas las restantes.  Carga negativa: intercambio de cationes  Carga positiva: intercambio de aniones Cromatografía de intercambio iónico  Funcionamiento En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las muestras que tengan una carga complementaria a la de la matriz de la gel.  La carga de la matriz de la columna así como la carga de la muestra dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). Para eluir las muestras retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la muestra de interés o el de la matriz. En 1938 Taylor y Urey utilizan este método para separar isótopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita.

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determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta. Cromatografía de exclusión  Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. separa las muestras en base a su tamaño. etc. 6 . Cromatografía de exclusión  La cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel.  Ha revolucionado el campo de la química analítica.  Es una de las técnicas más utilizadas e importantes.1/26/2010 Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía  Cromatografía de gel-filtración  Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles se puede separar polímeros sintéticos de alto peso molecular. entran en los poros y se mueven a lo largo de la columna lentamente porque tienen que atravesar los laberintos que se encuentran en el interior de las bolas de polímero en su marcha a lo largo de la columna.  La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados.  Cromatografía de gas.  Porath en 1967 utiliza un péptido o proteína unida covalentemente a un ligando y la utiliza para la separación de moléculas proteicas.  Las muestras de mayor tamaño migran a lo largo de la columna con mayor velocidad que las de tamaño pequeño. Características de las matrices  Deben ser estables.  Las muestras de menor tamaño.  Tener bajo contenido en grupos iónicos.  Uniformidad de poro y tamaño.  Los compuestos utilizados pueden ser derivados de: Dextranos (Sephadex) Agarosa (Sepharosa) Acrilamidas (Biogel P) Esferas de vidrio  Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos.  Cromatografía de afinidad.

 Después de que las muestra que no se unen al ligando son lavadas o eluídas a través de la columna. la muestra de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye (se libera) mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína Ligandos de afinidad  Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte. que se enlazan reversiblemente a un solo soluto. como los anticuerpos .1/26/2010 Cromatografía de afinidad  Permite la separación de mezclas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando.  Ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos. como las lectinas y nucleótidos.  Se clasifican según su:  Naturaleza .se fundamenta en la selectividad de la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad.  Actuación . y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos.pueden ser macromoléculas biológicas o bien moléculas de bajo peso molecular. 7 . Se distinguen dos grandes grupos:  Ligandos específicos .  Las muestras que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna.

1/26/2010 Electroforesis 8 .

por otro lado.  Las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo). 9 .  Una forma común de hacer esto es formar un gel.  Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico.  La electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinético basada en el movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un determinado medio a través de una matriz o soporte reticulado como resultado de la aplicación de un campo eléctrico.  Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un ión.1/26/2010 Introducción  La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco Arne Tiselius.  El comportamiento de la molécula viene dado por su movilidad electroforética:  La movilidad depende de la carga.  Gana el Premio Nóbel en 1948 por los trabajos realizados. La fricción con el solvente dificultaran este movimiento originando una fuerza que se opone . estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta. Conceptos generales Conceptos generales  Los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo. las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión.  Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Conceptos generales  La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución. tamaño y forma.  El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos.

V = q E / f Métodos electroforéticos zonales  Son los más comunes. o sea. a la resistencia que le ofrece el medio.  Se aplican pequeñas cantidades de la muestra a un soporte sólido.1/26/2010 Conceptos generales  La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma de la molécula.  Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas.  Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente. dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Tipos de soportes  papel (celulosa)  almidón  poliacrilamida  agarosa  acetato de celulosa 10 .

N.  Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y química.N. control de pureza.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel. caracterización. preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de diferentes moléculas. Electroforesis de gel  Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida.  La electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación: por la relación carga/tamaño por tamaño Electroforesis de agarosa  Permite separar moléculas de DNA. cuando éstas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. cuantificación (por comparación con controles).  Ha sido un método muy útil para la separación de proteínas (enzimas.  La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas. hormonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolución. semisólido al enfriarse. Electroforesis de poliacrilamida  Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de: Agente entrecruzador ('cross-linking'): bisacrilamida Catalizador: TEMED (N.N'tetrametilnediamina) Iniciador: ión persulfato que se añade en forma de persulfato amónico 11 . como el agar-agar. pero de composición homogénea). cuyas disoluciones (típicamente de 0.1/26/2010 Electroforesis de gel  La electroforesis en gel se utiliza en la detección.

 Electroforesis nativa  Es la que somete a las proteínas a migración sin desnaturalización. un detergente. SDS-PAGE Electroforesis capilar  Es una técnica alterna a la electroforesis convencional.  Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias.  El agente desnaturalizante más empleado es el sodiododecilsulfato o SDS.  Surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado.1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m.  El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos.  Las proteínas migran en función de su carga.1/26/2010 Clasificación  Electroforesis desnaturalizante  La más común: somete a las proteínas a migración asegurando la completa desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). 12 .  La migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma. de su tamaño y de su forma.  Se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un diámetro interno inferior a 0.

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