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Introducción
 Significa "Escribir en Colores“.
Los componentes de una mezcla pueden presentar una tendencia diferente a permanecer en cualquiera de las fases involucradas.

Cromatografía

 Es la separación de dos o más compuestos químicos en un medio.

Aspectos históricos de la cromatografía
 La técnica de cromatografía aparece en 1850.
 El químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un material poroso, como papel.

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 Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937.  Permite separar los distintos componentes de una mezcla.  Los químicos Khun. Aspectos históricos de la cromatografía  A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial. Tipos de cromatografía  Cromatografía plana: La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. líquido o fluido supercrítico).  En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Las principales técnicas son:  Cromatografía en papel  Cromatografía en capa fina  Posee:  Fase móvil: consiste en un fluido (gas. permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. obtuvo el premio Nóbel por sus trabajos en 1948.  Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. desarrollo por elusión y desarrollo por desplazamiento.1/26/2010 Aspectos históricos de la cromatografía  En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía de columna para separar extractos vegetales coloreados. Conceptos generales  La cromatografía se basa en un conjunto de técnicas asociadas al principio de retención selectiva. 1939 respectivamente.  En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal.  Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía. 1938.  Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:  Cromatografía de líquidos  Cromatografía de gases  Cromatografía de fluidos supercríticos`  Los componentes de la mezcla interaccionan en forma diferente con la fase estacionaria y con la fase móvil.  Para el mismo tiempo la cromatografía comienza a aplicarse en el campo de la bioquímica.  Fase estacionaria: se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica. 2 .  Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados.  Cromatografía en columna: La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.

Términos relacionados con el proceso  Matriz de la columna  Longitud de la columna  Volumen de la columna: volumen total de gel. Es una técnica sencilla y presenta la ventaja de poder utilizar cantidades pequeñas de muestra (miligramos y microgramos). su hidrofobicidad. su tamaño o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. Stahl estandarizó el método para elaborar capas finas por métodos mecánicos.  Se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna.  Se pueden separar de acuerdo a su carga. Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía  Cromatografía en capa fina Fue originada en 1938 por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y Schraiberen.  Lograron separar mezclas de tinturas farmacéuticas. Cromatografía de columna  Consiste en la aplicación de una muestra compleja a una columna de cristal.  Contiene una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. Tiene como soporte un papel de celulosa. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte (silica).  La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.1/26/2010 Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía  Cromatografía en papel Fue desarrolla por Martin.  ‘Run Throught’: volumen de muestra mas solvente.  Las diferentes mezclas se van retrasando de manera distinta según sus interacciones con la matriz. 3 .

 La carga de la matriz de la columna así como la carga de la muestra dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones).  Se usa en la separación de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cromatografía de intercambio iónico  Se realiza sobre matrices que tienen una carga neta. neutralizando de este modo la fuerza que retiene a la muestra en la columna.  Tenía la finalidad de separar los elementos alcalinotérreos y los elementos de transición.  Carga negativa: intercambio de cationes  Carga positiva: intercambio de aniones Cromatografía de intercambio iónico  Funcionamiento En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las muestras que tengan una carga complementaria a la de la matriz de la gel. Para eluir las muestras retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la muestra de interés o el de la matriz.1/26/2010 Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía  Cromatografía de intercambio iónico Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial.  Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos. siendo eluidas las restantes. En 1938 Taylor y Urey utilizan este método para separar isótopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. 4 . En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de intercambio iónico.

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 Las muestras de mayor tamaño migran a lo largo de la columna con mayor velocidad que las de tamaño pequeño.  Tener bajo contenido en grupos iónicos. separa las muestras en base a su tamaño.  Los compuestos utilizados pueden ser derivados de: Dextranos (Sephadex) Agarosa (Sepharosa) Acrilamidas (Biogel P) Esferas de vidrio  Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos.  La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. etc. entran en los poros y se mueven a lo largo de la columna lentamente porque tienen que atravesar los laberintos que se encuentran en el interior de las bolas de polímero en su marcha a lo largo de la columna.  Uniformidad de poro y tamaño. 6 .1/26/2010 Aspectos históricos de los distintos tipos de cromatografía  Cromatografía de gel-filtración  Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles se puede separar polímeros sintéticos de alto peso molecular. Cromatografía de exclusión  La cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel. Características de las matrices  Deben ser estables. Cromatografía de exclusión  Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna.  Ha revolucionado el campo de la química analítica.  Es una de las técnicas más utilizadas e importantes.  Porath en 1967 utiliza un péptido o proteína unida covalentemente a un ligando y la utiliza para la separación de moléculas proteicas. determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta.  Cromatografía de gas.  Cromatografía de afinidad.  Las muestras de menor tamaño.

como los anticuerpos .  Después de que las muestra que no se unen al ligando son lavadas o eluídas a través de la columna.1/26/2010 Cromatografía de afinidad  Permite la separación de mezclas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. que se enlazan reversiblemente a un solo soluto.  Actuación . y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. como las lectinas y nucleótidos.  Las muestras que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna.  Se clasifican según su:  Naturaleza . 7 .pueden ser macromoléculas biológicas o bien moléculas de bajo peso molecular.  Ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos. la muestra de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye (se libera) mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína Ligandos de afinidad  Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte.se fundamenta en la selectividad de la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad. Se distinguen dos grandes grupos:  Ligandos específicos .

1/26/2010 Electroforesis 8 .

 Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un ión. por otro lado. las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. tamaño y forma.  Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico.  Gana el Premio Nóbel en 1948 por los trabajos realizados.  El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos.  La electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinético basada en el movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un determinado medio a través de una matriz o soporte reticulado como resultado de la aplicación de un campo eléctrico. estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta.  Una forma común de hacer esto es formar un gel. Conceptos generales  La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución. Conceptos generales Conceptos generales  Los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo.  El comportamiento de la molécula viene dado por su movilidad electroforética:  La movilidad depende de la carga. La fricción con el solvente dificultaran este movimiento originando una fuerza que se opone .  Las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo). 9 .  Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento.1/26/2010 Introducción  La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco Arne Tiselius.

 Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente.  Se aplican pequeñas cantidades de la muestra a un soporte sólido. a la resistencia que le ofrece el medio. Tipos de soportes  papel (celulosa)  almidón  poliacrilamida  agarosa  acetato de celulosa 10 . dada su alta aplicabilidad en diferentes campos.  Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. V = q E / f Métodos electroforéticos zonales  Son los más comunes.1/26/2010 Conceptos generales  La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma de la molécula. o sea.

5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel. cuando éstas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta.1/26/2010 Electroforesis de gel  La electroforesis en gel se utiliza en la detección.  La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas. caracterización. cuyas disoluciones (típicamente de 0. Electroforesis de gel  Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida.N. como el agar-agar.N.  Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y química. pero de composición homogénea). cuantificación (por comparación con controles). hormonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolución. semisólido al enfriarse.N'tetrametilnediamina) Iniciador: ión persulfato que se añade en forma de persulfato amónico 11 . control de pureza.  Ha sido un método muy útil para la separación de proteínas (enzimas. Electroforesis de poliacrilamida  Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de: Agente entrecruzador ('cross-linking'): bisacrilamida Catalizador: TEMED (N. preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de diferentes moléculas.  La electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación: por la relación carga/tamaño por tamaño Electroforesis de agarosa  Permite separar moléculas de DNA.

 Surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado. un detergente.  Se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un diámetro interno inferior a 0.  El agente desnaturalizante más empleado es el sodiododecilsulfato o SDS.  La migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma.  Electroforesis nativa  Es la que somete a las proteínas a migración sin desnaturalización. 12 . SDS-PAGE Electroforesis capilar  Es una técnica alterna a la electroforesis convencional.1/26/2010 Clasificación  Electroforesis desnaturalizante  La más común: somete a las proteínas a migración asegurando la completa desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional).  Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias.  El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos.  Las proteínas migran en función de su carga.1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. de su tamaño y de su forma.

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