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PCR Polymerase Chain Reaction

Es la amplificacin de DNA in vitro por medio de la polimerizacin en cadena de DNA utilizando un termociclador. El propsito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA. Se realiza la amplificacin de un segmento especfico de DNA, teniendo poco material disponible.

Polimerasa Chain Reaction: Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Fue diseada por el Dr. Kary Mullis en 1987. Gan el premio Nbel de Qumica en 1993 por su invento. Utilizo el PCR para amplificacin del gen de hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

Termociclador
La

PCR se realiza en un Thermo Cycler Termociclador.


Es

una mquina que calienta y enfra la reaccin en periodos cortos de tiempo.

La reaccin en cadena de la Polimerasa o PCR es una alternativa a la clonacin bacteriana para inflar y amplificar una determinada regin de ADN, la PCR puede amplificar una simple copia de una regin de ADN entre miles de millones de otras en una mezcla compleja obtenida de ADN de tejidos aqu de muestran de color azul. En la siguiente imagen esta la secuencia que queremos amplificar o secuencia target que se muestra de color verde. Con la PCR podemos hacer millones de copias en la regin target sin la necesidad de purificar previamente.

En el primer ciclo se eleva la temperatura a 95 para separar las cadenas o desnaturalizarlas, luego se baja la temperatura a 60 para que se unan los primers especficos a cada una de las cadenas complementarias, estos primer sirven de molde para que la TAQ Polimerasa sintetize ADN hacia el extremo 3 usando nucletidos libres a una temperatura de 72. Solo esta regin ser amplificada por la TAQ Polimerasa ya que solo puede sintetizar ADN a partir de primers especficos. En algunas cadenas no se detendr hasta que se descarrile. Al final del Ciclo 1 se han formado 2 cadenas doble hlice a partir de una.

En el segundo ciclo los 3 pasos se repiten desnaturalizacin a 95, unin de los primers a 60 y la sntesis de la Polimeraza es necesario elevar la temperatura a 72 de modo tal que la polimerasa sintetiza en dereccion 5- 3, obteniendo 4 cadenas con un extremo 3 mas largo.

Al principio del ciclo 3 se repiten nuevamente los 3 pasos 95 para desnaturalizar, 65 para el pegado de los primers y 72 para la sntesis al final obtendremos solo 2 molculas doble cadena cortas especificas o target y 6 molculas doble cadena con extremos 3 mas largos. A medida que avanzan los ciclos la cantidad de molculas crecer exponencialmente.

En el cuarto ciclo se repiten los 3 pasos y se obtienen 8 molculas cortas y 8 molculas con un extremo 3 mas largo.

En el quinto ciclo se repite nuevamente los pasos dando finalmente unas 22 molculas blanco y solo 10 molculas cuyo extremo 3es mas largo.

Al final del ciclo 30 el numero de molculas target ha crecido exponencialmente obtenindose mas de mil millones de molculas y solo 60 molculas largas permanecen en la reaccin. Entonces as como en el clonado bacteriano la PCR amplifica selectivamente una cantidad de molculas especificas de ADN dentro de mezcla de ADN genmico.