Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
ME IV Medio
Sin lugar a dudas uno de los conceptos ms importantes existentes en la biologa moderna, es el dogma central de la biologa molecular. Sin embargo, durante los ltimos aos han aparecido numerosas excepciones, y da a da la pregunta sobre el mensaje oculto en el DNA se hace ms profunda y difcil de alcanzar. Para continuar los intentos de responderla, es fundamental la comprensin a cabalidad de las principales molculas involucradas.
http://www.puntajenacional.cl
Esta gua fue escrita con el objetivo de complementar el video presente en la plataforma puntajenacional.cl y el trabajo de la profesora Javiera Brierley.
. Se recomienda fehacientemente leer la gua del mdulo comn Las biomolculas para complementar y hacer ms fcil la comprensin de esta gua. El objetivo de esta gua es describir cmo funcionan estas molculas, detallar toda la dinmica enzimtica que rodea el proceso de la expresin gnica, abarcar el concepto ligado al ancestro evolutivo comn a travs del cdigo gentico de la sntesis proteica y describir las tcnicas bsicas utilizadas en la ingeniera gnetica y sus ventajas hacia el desarrollo de la biologa y sus ciencias derivadas.
El DNA, el sentido dextrgiro de su enrollamiento. En amarillo se representan las bases nitrogenadas y en azul los grupos fosfato junto con las desoxirribosas.
Los nucletidos que componen el DNA se ordenan de tal manera que siempre la Adenina forma enlaces de hidrgeno con la Timina y la Guanina con la Citosina
La timina con la adenina forman dos enlaces de hidrgeno, mientras que la guanina con la citosina forman tres. Esto es importante de comprender pues este ltimo enlace es ms fuerte que el primero.
nicamente es posible encontrar DNA en: Ncleo eucarionte Nucleoide procarionte Plsmidos procariontes Mitocondrias y cloroplastos Virus DNA
El DNA es una molcula dinmica, que puede alterar su condensacin y sentido de giro dependiendo de las condiciones del medio. As, es posible distinguir tres tipos de DNA: DNA A: Es un DNA ms condensado, habitualmente encontrado en estados en que hay baja concentracin de agua. La hlice es dextrgira. DNA B: Es el DNA estndar de los sistemas biolgicos. Es dextrgiro. DNA Z: Es un DNA atpico que es laxo y levgiro. Puede darse ocasionalmente en el centro de estructuras B-DNA, donde abundan secuencias G-C (dependiendo de la atraccin electrnica de las secuencias presentes).
(derecha) DNA Z. (centro) DNA B. (izquierda) DNA A. En esta gua utilizaremos mucho los nmeros de orientacin en el DNA y RNA (5; cinco prima. 3; tres prima). El 3 se refiere al lado de la cadena donde existe el OH del azcar del nucle tido respectivo. Desde este OH se enlaza el grupo P del nucletido siguiente en la cadena. El 5 se refiere al lado de la cadena donde existe un grupo fosfato unido al nucletido. Este grupo fosfato acta como anclaje para el nucletido siguiente.
La primera vez que se aisl una sustancia desconocida obtenida desde los ncleos de clulas inmunitarias provenientes de apsitos sucios con pus fue en los experimentos de Miescher en 1869, la cual fue llamada nuclena.
Posteriormente fue Levene quien caracteriz la estructura del nucletido (pentosa + fosfato + base nitrogenada). En 1930 Levene y Kossel probaron que la nuclena era un acido desoxirribonucleico formado por cuatro bases nitrogenadas diferentes, unidas por su grupo fosfato . Chargaff propuso la ley de equimolecularidad, que establece que el nmero de bases pirimdicas presentes en el DNA es igual al nmero de bases pricas, en base a la ley de complementariedad de bases (A=T y C=G).
El experimento de Griffith
Pese al enorme avance de Levene y Kossel, aun no se conoca la funcin del DNA. En 1928, Frederick Griffith trabajaba estudiando cepas S (lisas) y R (rugosas) de la bacteria Streptococcus pneumoniae. La diferencia entre S y R era la virulencia (capacidad de producir enfermedad, siendo la cepa S mortal). Se inyectaron cepas S y R en ratones. Los que recibieron S fallecieron y los R sobrevivieron. Sin embargo, si se calentaba la cepa S y se inyectaba no pasaba nada (porque las bacterias moran), pero si se inyectaba la cepa S muerta mezclada con R viva, los ratones moran y se podan aislar luego cepas S vivas dentro del ratn.
Las bacterias S sobrevivan al calor? Las bacterias S pudieron revivir luego de ingresar al husped? NO. Lo que plante Griffith revolucion la gentica de la poca, proponiendo la existencia del factor transformante: Pudieron las cepas R transformarse en virulentas utilizando alguna sustancia que liberaban las bacterias S al momento de morir? No fue hasta dentro de 15 aos aproximadamente que se logr comprobar mediante tcnicas moleculares que dicha sustancia transformante no era un lpido, polisacrido ni protena. Hoy en da se sabe que dicho factor transformante corresponda a los plsmidos de virulencia. Aquel momento fue el nacimiento de la gentica molecular.
En 1962 recibieron el Premio Nobel en Fisiologa o Medicina, en base a su artculo publicado en Nature (1953): Molcular Structure of Nucleic Acids: A structure for Deoxyribose Nucleic Acid.
DATO PUNTAJE
Sabas que el genoma mitocondrial de todas las mujeres del mundo tiene una similitud de aprox. un 70-80%?
El DNA es un largo pergamino que contiene todas las instrucciones para confeccionar protenas en los ribosomas, y as poder desarrollar un individuo completo y toda su dinmica bioqumica, biolgica, ontognica y fenotpica. Si lo pudisemos estirar y medir, su longitud sera de dos metros aproximadamente por cada clula eucariota animal. La informacin que contiene el DNA est escrita, como en cualquier idioma, por letras. Estas letras son los nucletidos, que se agrupan en tres para formar los tripletes (palabras), y varios tripletes diferentes forman los genes: secuencias capaces de codificar protenas. El largo del DNA se mide en pB (pares de bases), y debido a su gran longitud, no es infrecuente encontrar la medida KpB (miles de pares de bases). De toda esa informacin, solo un 1.5% aproximadamente codifica protenas. Un gran porcentaje codifica RNAs reguladores y casi un 99% son secuencias no-codificantes. La especie humana solo posee 21.000 genes, por lo tanto una pregunta interesante a hacerse es La complejidad de un organismo radica en la cantidad de secuencias no codificantes o es efecto de la evolucin basada en intercambio gnico que solo un 2% de todo el DNA codifique nuestro fenotipo? Es acaso responsabilidad de todo el porcentaje no codificante la manera en que el 1.5% codificante constituye nuestro fenotipo? El DNA presente en cloroplastos y mitocondrias, as como en bacterias, es mucho ms corto que el de las clulas eucariotas, estando organizado en un solo cromosoma circular (pueden existir varias copias de dicho cromosoma). En los ncleos eucariotas existen varias molculas de
DNA lineal, mucho ms largo y complejo, de las cuales al condensarse aparecen los diferentes cromosomas. De esa manera han quedado descritas las principales caractersticas bioqumicas del DNA, necesarias para comprender los procesos que se describirn a continuacin. Recuerda que las investigaciones en este tpico estn muy avanzadas, y no es difcil encontrar material de alta complejidad que puede llegar a confundirte. Lo que necesitas para rendir la PSU respecto a este tpico, es lo que se encuentra en esta gua.
A travs del experimento de Meselson y Stahl se pudo concluir que el proceso de replicacin del DNA segua un esquema semiconservativo . El experimento consista en lo siguiente: Se realiz un cultivo de E coli en un medio enriquecido con N-15, un istopo pesado (primera generacin). Luego del crecimiento de las bacterias, se transfirieron a un medio con N-14, d onde se esper que crecieran (segunda generacin). Luego, se generaron bacterias crecidas en N-14 (tercera generacin). A travs de la purificacin y centrifugacin del DNA de la primera generacin se obtuvo una nica banda de DNA, con densidad intermedia. En la segunda generacin, se obtuvieron dos bandas (una liviana y otra intermedia). De la tercera generacin se obtuvieron dos bandas, una liviana (75%) y otra intermedia (25% restante). Cmo se interpretan esos resultados? La banda intermedia representa una molcula de DNA que contiene una cadena con N-15 (pesada) y otra con N-14 (liviana), las bandas livianas representan cadenas nicamente con N-14.
Por qu no es conservativa? Porque aparecera siempre una banda pesada y el resto livianas. Por qu no es dispersiva? Porque solo apareceran bandas hbridas Por qu es semiconservadora? Porque aparecieron bandas hbridas solo al transferir las bacterias a un medio con N-15, desde un medio con N-14. Las que no fueron afectadas mostraron cadenas livianas.
10
10
La replicacin del DNA se define como un proceso activo, enzimtico, en el cual se sintetiza una hebra de DNA a partir de un molde de DNA previo. Para que este proceso ocurra se requieren los siguientes elementos: 1. Una hebra de DNA molde 2. El pool enzimtico para la replicacin del DNA. Las enzimas involucradas en la replicacin del DNA corresponden a: Nombre DNA polimerasa I Funcin Eliminacin de los primers (exonucleasa) y actividad de sntesis de DNA (endonucleasa) 53 Eliminacin de nucletidos mal posicionados y adicin de nucletidos correctos. Polimeriza una hebra de DNA nueva en sentido 53. Principal polimerasa. Sintetiza los enlaces 5-3 fosfodiester entre los fragmentos de Okazaki de la hebra discontinua Desenrolla el DNA Rompe los enlaces de hidrgeno en el DNA, abriendo la hebra. Sintetiza un primer (RNA cebador) en el sitio de iniciacin de la sntesis. Protenas que se unen a las cadenas abiertas del DNA para mantenerlo separado.
DNA polimerasa II DNA polimerasa III DNA Ligasa Topoisomerasa (o girasa) Helicasa RNA primasa SSBP (Single Stand DNA Binding Proteins)
El proceso de replicacin del DNA est dividido en tres etapas: Iniciacin, Elongacin y Terminacin. La reaccin bioqumica de la replicacin del DNA se expresa a continuacin:
Debido a que una cadena, al momento de romper los enlaces de hidrgeno, tendr un sentido 5 a 3 y la otra sentido 3 a 5, la primera podra sintetizar la cadena complementaria de manera continua y la otra deber hacerlo de manera discontinua (o retardada). Esto porque las DNA polimerasas solo poseen actividad endonucleasa (sntesis) en sentido 5 a 3. El proceso en bacterias (exactamente E coli) ocurre de la siguiente manera: 1. Iniciacin: La topoisomerasa, helicasa y las SSBP se unen a una secuencia consenso (secuencias en el DNA que son seales para las enzimas) en el DNA llamado Origen de la Replicacin. La topoisomerasa desenrolla la hebra, la helicasa rompe los puentes de hidrgeno y las SSBP estabilizan las dos cadenas de DNA monocatenario obtenidas. 2. Elongacin: a. Cadena continua (sntesis 53): La RNA primasa sintetiza un primer o RNA cebador (o partidor), que es un RNA de 10-15 nucletidos que se unen de manera complementaria a la cadena molde. Desde este partidor la DNA polimerasa III comienza la replicacin en sentido 53, hasta llegar a la zona de trmino. Mientras tanto, la DNA polimerasa I retira el primer y sintetiza en su lugar DNA. La
DNA ligasa sella las uniones de estos fragmentos de DNA y la DNA polimerasa II busca posibles errores en la replicacin, para repararlos. b. Cadena discontinua (sntesis 35): Como la DNA polimerasa III puede sintetizar solo en sentido 53, y la hebra molde discontinua brinda una polarizacin 3-5, la RNA primasa sintetiza una serie de primers intercalados, para que entre ellos se genere un sentido 5-3. La DNA polimerasa III sintetizar DNA entre los primers. Posteriormente la DNA polimerasa I retirar los primers, quedando una apariencia fragmentada o discontinua de la nueva hebra. Dichos fragmentos de DNA neosintetizados son conocidos como Fragmentos de Okazaki. La DNA polimerasa I llega el espacio entre los fragmentos de Okazaki, la DNA ligasa crea los enlaces 53 fosfodiester correspondientes y la DNA polimerasa II revisa los posibles errores, y los corrige. 3. Terminacin: Al momento de que el replisoma (pool de enzimas antes descritas) se encuentra con las secuencias de terminacin (cerca del origen de la replicacin, corriente arriba), las enzimas se liberan, quedando dos molculas de DNA exactamente iguales.
11
Enzimas accesorias
Enzimas polimerasas
12
12
Uno de los pilares ms fuertes durante muchos aos fue el llamado dogma central de la biologa molecular, el cual estableca lo siguiente:
DNA
RNA
Protena
La informacin gentica contenida en el DNA, debe ser copiada a un RNA mensajero para poder expresarse en una protena funcional. Hoy por hoy se sabe que este dogma posee excepciones. Los retrovirus son partculas que poseen en su interior una enzima llamada transcriptasa inversa, la cual permite copiar la informacin gentica contenida en un RNA a una molcula de DNA, para luego ser integrada al cromosoma de la clula husped. De ese modo, para poder expresar la informacin contenida en el DNA, se deben llevar a cabo los siguientes procesos, en el orden descrito: 1. Transcripcin de un RNA heterogneo nuclear 2. Splicing del RNAhn (procesamiento del pre-RNAm) 3. Traduccin
Los cidos ribonucleicos (ARN, RNA) son biomolculas formadas por los nucletidos AMP (Adenina), UMP (Uracilo), CMP (Citosina) y GMP (Guanina), ordenados en diferentes estructuras, todas lineales, de larga o corta longitud. Son cadenas similares al DNA (poseen enlaces 5-3 fosfodiester y pueden formar enlaces de hidrgeno) pero no son dobles cadenas en hlice, sino que por lo general son monocatenarios (una sola cadena). Los nucletidos constituyentes del RNA poseen todos las mismas bases nitrogenadas del DNA con excepcin del Uracilo, y a diferencia del DNA poseen ribosa en su estructura.
13
Fig. 18. (Izquierda) Diagrama de la estructura de un mRNA (RNA mensajero). (Derecha) Diagrama molecular del esquema adyacente.
Las funciones de los cidos ribonucleicos son muy variadas. Se pueden englobar en molculas concebidas para poder utilizar un mensaje gentico sin exponer la fuente principal del mismo (debido a que los RNAs actan principalmente en el citoplasma). Existen al menos 20 tipos de RNAs diferentes, los cuales tienen variadas funciones. A continuacin detallaremos los principales. 1. RNA mensajero (RNAm) Es un RNA lineal, que en su extremo 5 posee un nucletido especial llamado CAP (o 7metil guanosina), cuya funcin radica en la identidad como RNAm en el ribosoma y el camuflaje ante las RNAsas. En el extremo 3 posee una secuencia de aprox. 200 adeninas llamada cola poli-A, cuya funcin es proteger el resto del RNA de las RNAsas (enzimas degradadoras de RNA en el citoplasma).
Estructura de un RNA mensajero. UTR: Regiones no traducidas. Todo el resto del RNAm contiene uno o varios genes, que sern ledos en el ribosoma. Los tripletes encontrados en el DNA existen en el RNA, donde son llamados codones. Cabe destacar que un codn codifica un determinado aminocido. Al ser un RNA cuya funcin es llevar un mensaje al ribosoma para ser traducido , no posee secuencias no codificantes, las cuales son extradas en un proceso previo llamado splicing (vase ms adelante). Un RNAm puede ser ledo varias veces en el citoplasma antes de ser degradado.
14
2. RNA ribosomal (RNAr) Es un largo RNA, que en muchas zonas puede complementarse consigo mismo dando la apariencia de hlice bicatenaria (como el DNA) y en otras zonas que no existe complementariedad se generan cavidades. Se encarga de formar las dos subunidades de los ribosomas (junto a protenas y enzimas).
14
Se sintetiza en el nuclolo de las clulas eucariotas (nucleoide de procariotas), y existen diferentes tipos de acuerdo al coeficiente de sedimentacin o Svedberg (unidad para medir la sedimentacin): 5S, 5,8S, 18S y 28S (eucariotas) y 5S, 16S y 23S (procariotas) Es el RNA ms abundante de las clulas eucariotas. 3. RNA de transferencia (RNAt) Es un RNA pequeo que posee una estructura en hoja de trbol, teniendo tres brazos diferentes (ms uno pequeo variable). El detalle de 5 a 3 es el siguiente: o o o o o Extremo 5 Brazo TC: Posee el nucletido extrao Pseudouridina. Loop pequeo variable Brazo anticodn: Posee una secuencia complementaria a un codn especfico de un RNA mensajero. Brazo D: Posee el nucletido extrao D-Hidrouracilo.
Extremo 3: Posee la secuencia ACC, donde existe un OH- libre, en el cual puede crearse el enlace aminoacil-RNAt en base a la enzima aminoacil-RNAtsintetasa (existen 20, una para cada aminocido). En pocas palabras, es el lugar donde se une el aminocido correspondiente al RNAt.
15
4. RNA heterogneo nuclear Corresponde al pre-RNA mensajero. Es un transcrito primario (recin transcrito desde el DNA) sin la extraccin de secuencias no codificantes ni la adicin de la cola poli-A. 5. RNAs reguladores. Son RNAs que tienen la facultad de poder conjugarse con protenas o actuar de manera solitaria regulando muchos procesos y funciones celulares. Ejemplos de estos tipos de RNA son el RNApi (piwi interacting), el RNAsn (small nuclear), RNAsno (small nucleolar), RNA 7-s y las ribozimas.
La transcripcin se define como un proceso activo en el cual se sintetiza una hebra de RNA complementaria a una cadena molde de DNA. Este proceso, al igual que la replicacin del DNA, requiere de un pool proteico enzimtico y de secuencias de iniciacin en el DNA. Las etapas de la transcripcin corresponden a la iniciacin, elongacin y terminacin.
1. Iniciacin
16
Existen 21.000 genes en la especie humana, por lo que existen secuencias especiales para poder transcribirlos. La secuencia que denota el lugar donde debe iniciarse la transcripcin se conoce como promotor. Para que las enzimas necesarias puedan llevar a cabo la transcripcin desde el promotor, debe formarse un complejo proteico que recorre el DNA de manera similar a un tren, que va leyendo seales. Este complejo proteico es conocido como complejo de iniciacin de la transcripcin, y est formado por las siguientes protenas (que NO son importantes de aprender para la PSU): o o TF2A, B, D y E: Son factores de transcripcin que forman el complejo encargado de reconocer el promotor. El principal es el TF2D. TBP (TATA box binding protein): Es un factor de transcripcin que reconoce la secuencia consenso TATA Box, previa al promotor.
16
Algunas de las secuencias consenso importantes en la transcripcin son: o o o o o o CAAT Box: Es una secuencia que se encuentra 75-80 pB corriente arriba del promotor. TATA Box: Es una secuencia que se encuentra 25 pB corriente arriba del promotor. En esta zona se completa el complejo de iniciacin de la transcripcin. Promotor: Es una zona pre-gnica en donde el DNA es abierto por una helicasa y las enzimas responsables de la transcripcin comienzan la sntesis de RNA. Unidad de transcripcin: Corresponde a toda la zona del DNA que ser transcrita. Secuencia trmino: Indica a las enzimas correspondientes que la transcripcin del/los genes termina all. Secuencias enhancers (potenciadoras) y silencers (inhibidoras): Son secuencias que regulan la expresin de la unidad de transcripcin.
Las enzimas encargadas del proceso de transcripcin corresponden a: o o o RNA polimerasa I: Encargada de transcribir RNA ribosomal RNA polimerasa II: Encargada de transcribir RNA mensajero RNA polimerasa III: Encargada de transcribir RNA de transferencia
En procariotas, existe solo una RNA polimerasa que transcribe un gran RNA, el cual sufre un proceso de clivaje resultando los diferentes tipos de RNA. La iniciacin de la transcripcin en ellos requiere de un factor llamado Sigma (). Luego de que el complejo de iniciacin de la transcripcin, junto con una RNA polimerasa II (analizaremos el caso del RNA mensajero, debido a su rol en la expresin gnica ), reconocen el promotor, comienza la sntesis de un RNA heterogneo nuclear. 2. Elongacin Desde el nucletido siguiente al promotor comienza la sntesis de RNA complementario a la cadena molde de DNA. Al momento de iniciar la transcripcin se agrega el CAP al RNAhn. De esa manera, la elongacin contina hasta que la RNA polimerasa II se encuentra con una regin de trmino. 3. Terminacin
Cuando la RNA polimerasa II se encuentra con la regin de trmino, la enzima se libera, el DNA vuelve a enrollarse y el RNAhn ya est completo. En procariotas, existe otro factor del cual depende la liberacin de la RNA polimerasa, llamado Rho (). Recomendamos visualizar el siguiente video, para clarificar el proceso de la transcripcin (est en ingls): http://www.youtube.com/watch?v=WsofH466lqk
17
18
Es vlido destacar que algunos RNAhn guardan algunos intrones luego del splicing, lo cual puede otorgar variaciones en la pauta de lectura en la traduccin, ampliando aun ms la cantidad de protenas posibles de formar con un solo gen.
18
En el extremo 3, existen secuencias que orientan un complejo encargado de r econocer y cortar dicho extremo del RNAhn, para luego dejar que la poli-A polimerasa sintetice una cadena de aprox. 200 adeninas. Ahora, el RNAhn pasa a ser un RNA mensajero, que es transportado hacia el citoplasma a travs de filamentos y protenas, adems del transporte a travs del complejo del poro nuclear. Recomendamos visualizar el siguiente video, para clarificar el proceso de modificaciones del RNAhn (est en ingls): http://www.youtube.com/watch?v=YjWuVrzvZYA y splicing: http://www.youtube.com/watch?v=FVuAwBGw_pQ&feature=related
o o
Subunidad menor: Formada por RNAr de 18S en eucariotas + protenas. Su funcin es identificar el sitio de inicio de la traduccin. Subunidad mayor: Formada por RNAr de 5S, 5,8S y 28S en eucariotas. Posee cmaras especiales, del ancho de un codn, muy importantes para comprender el proceso de traduccin. Cmara P (peptidil): Es la primera cmara donde se posiciona un codn (53). En esta cmara se encuentra una enzima llamada peptidil transferasa. Cmara A (aminoacil): Es la segunda cmara donde se posiciona otro codn. Cmara E: Cmara por donde se libera el RNA mensajero ya ledo.
19
Secuencias de iniciacin de RNAs mensajeros: Secuencia de Kozak: Es una secuencia ubicada antes del codn de inicio en eucariotas. Secuencia de Shine-Dalgarno: Es una secuencia ubicada antes del codn de inicio en procariotas.
El cdigo gentico
El cdigo gentico corresponde al lenguaje que existe para poder traducir la informacin gentica a protena. Se mencionaba al inicio de esta gua que los nucletidos del DNA corresponden a las letras del mensaje y los tripletes a las palabras. Estas palabras del DNA son copiadas a RNA mensajero, pasando a llamarse codones. Cada codn tiene un significado universal (con mnimas variaciones) a uno de los 20 aminocidos que forman protenas. Solo tres codones tienen una traduccin no aminoacdica (que se ver ms adelante). Que todos los organismos vivos de la naturaleza utilicen este cdigo es la prueba ms verdica que todos descienden de un ancestro primitivo comn, que concibi la maquinaria bioqumica necesaria para poder almacenar informacin y expresarla como protenas (desde las bacterias hasta los seres humanos).
20
20
A raz de dicha tabla se puede decir que el cdigo gentico es degenerado, lo que significa que ha sido modificado por la naturaleza de manera que varios codones puedan significar un mismo aminocido. Eso es un mecanismo de proteccin ante mutaciones puntuales que pudiesen afectar los aminocidos ms abundantes en las protenas.
El proceso de traduccin.
Igualmente que la replicacin del DNA y la transcripcin, la traduccin se divide en tres etapas: Iniciacin, elongacin y terminacin.
1.
Iniciacin
La iniciacin comienza cuando la subunidad menor del ribosoma recorre el RNA mensajero buscando la secuencia de iniciacin (mediada por protenas y RNAr). Una vez encontrada, un RNA de transferencia correspondiente al codn AUG (codn de inicio) se posiciona en l, cargando el aminocido metionina. Finalmente la subunidad mayor se posa sobre la subunidad menor, quedando el metionil-RNAt dentro de la cmara P. El codn adyacente a AUG est posicionado dentro de la cmara A. El aminoacil-RNAt correspondiente a dicho codn se posicionar y comenzar la elongacin.
2.
Elongacin
La peptidil transferasa crear un enlace peptdico entre los aminocidos adyacentes. Con la formacin de aquel dipptido, el ribosoma avanzar en el sentido 5 -3 una distancia equivalente a un codn, desplazando el metionil-aminoacil-RNAt que estaba en la cmara A hacia la cmara P. El RNAt que traa el aminocido metionina sale del ribosoma para ser cargado nuevamente por la metionil RNAt sintetasa. En este momento, entrar a la cmara A otro RNAt correspondiente, y
nuevamente la peptidil transferasa creara un enlace peptdico entre el dipptido mencionado y el nuevo aminocido. Con esta accin, nuevamente el ribosoma se desplazar un codn en sentido 5-3, repitiendo los eventos antes mencionados.
3.
21
Terminacin
A esta altura, probablemente en la cmara A (luego del actuar de la peptidil transferasa) se encuentre un RNAt cargado con MET-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA(n)-RNAt. Si en la cmara A aparece uno de los tres codones de detencin ( UGA, UAA, UAG), una protena llamada factor de liberacin entrar a la cmara A. Tras ello, el ribosoma se desacoplar, el pptido se liberar del RNAt y la traduccin concluir. En este caso se habra formado el pptido MET-AA1-AA2-AA3AA4-AA5.
22
Recomendamos visualizar el siguiente video, para clarificar el proceso de traduccin (est en ingls): http://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ
22
Existen familias de antibiticos que son capaces de interferir en el proceso de traduccin bacteriana. Estos frmacos no interfieren en la traduccin eucariota, debido a la diferencia que existe entre ribosomas bacterianos (70S) y eucariotas (80S). Las tetraciclinas bloquean la cmara A de la subunidad mayor del ribosoma. La estreptomicina interfiere en el margen de lectura del RNA mensajero. Los macrlidos y lincosamidas interfieren en el actuar de la peptidil transferasa, unindose a la subunidad de 50S del ribosoma bacteriano.
c) Cmo sera el RNA mensajero de aquel gen, sabiendo que la TATA box es TATTAA y el promotor corresponde a CAG?
5-CAP-GUGUGAUGCA(A)GUCAGUCAAGACGCGGAUGUUGGUAAGUGA-AAAAAAAAAAAAAA-3
23
d) Cmo sera el polipptido primario producto de la traduccin de aquel RNAm? 5-CAP-GUGUGAUGCAGUCAGUCAAGACGCGGAUGUUGGUAAGUGAA-AAAAAAAAAAAAA-3 AUG|CAG|UCA|GUC|AAG|ACG|CGG|AUG|UUG|GUA|AGU|GAA| Met-Gln-Ser-Val-Lis-Thy-Pro-Met-Leu-Val-Ser-Glu-Lis-Lis-Lis-Lis-Lis(no hay codn de detencin)
SIN: Met-Gln-Val-Ser-Gln-Asp-Ala-Asp-Val-Gli-Lis CON: Met-Gln-Ser-Val-Lis-Thy-Pro-Met-Leu-Val-Ser-Glu-Lis-Lis-Lis-Lis-Lis (traduccin de la cola poli A) Este tipo de daos son muy graves, y es por eso que deben evitarse los agentes mutgenos que puedan generar este tipo de mutaciones, que pueden ser muy letales. Este tipo de alteracin es conocida como alteraciones del marco de lectura de la sntesis proteica.
En muchas ocasiones los cientficos trabajan con cantidades muy pequeas de DNA, sea para poder identificar, manipular o solamente multiplicar dicho fragmento. Para ello se emplea la Reaccin en cadena de la polimerasa, a modo de amplificar la muestra de DNA. Para poder utilizarla, se necesitan los siguientes elementos: 1. Una muestra de DNA
24
2. Pool de replicacin del DNA (dNucletidos, enzimas y primers) 3. Controladores de temperaturas El fundamento principal de la PCR es desnaturalizar una hebra de DNA para que las DNA polimerasas puedan replicar dichas cadenas, luego naturalizarlas, y posteriormente volver a desnaturalizar. En la actualidad estos ciclos de temperatura lo lleva a cabo un aparato llamado termociclador. Existen varios tipos de PCR (RT-PCR, que utiliza la transcriptasa inversa. La qPCR, etc), las cuales son elegidas en pos del objetivo del investigador. A modo de sntesis: 1. 2. 3. 4. Se desnaturaliza (abre) la hebra molde de DNA. Se aade el pool replicativo Se naturalizan las hebras nuevas Se vuelve a desnaturalizar y se agrega nuevamente el pool replicativo
24
De esa manera, se amplifica exponencialmente la cantidad de DNA obtenida, lo cual puede ser sumamente til, por ejemplo, en anlisis forense.
El DNA recombinante es un DNA sintetizado in vitro que contiene secuencias de dos especies (o secuencias artificiales) que normalmente no se encuentran juntas, que pueden otorgar caractersticas nuevas si son inoculados a especies vivas. Las protenas expresadas desde este tipo de DNA son llamadas protenas recombinantes. Cmo se realiza? Para recombinar DNA, se requiere identificar una fuente, extraer su DNA, amplificarlo a travs de PCR y finalmente transferirlo a travs del uso de vectores. Los vectores que generalmente se utilizan suelen ser virus (por ejemplo, los Fagos T4 para la transferencia del gen de la insulina recombinante). Qu ventajas ha traido? La especie de tomate larga vida y la ciruela europea poseen genes que mejoran su resistencia a pestes y plagas (alimentos transgnicos). La insulina de uso mdico es sintetizada a travs de este tipo de tcnica (y sigue avanzando hacia otros caminos aun ms avanzados). Sin embargo existe una gran controversia, pues no existen estudios con evidencia estadstica poderosa que puedan concluir la inocuidad de este tipo de productos. Se puede
suponer (y se ha visto) que no ha habido mayores daos, pero aun falta mucho por profundizar. Por ejemplo, en la resistencia del uso de algunos antibiticos (la ltima lnea en la que se ha estado investigando).
25
El ELISA (Enzime-Linked InmunoSorbent Assay) es una tcnica muy empleada en las ciencias de la salud. Si bien no es directamente una tcnica asociada a genes, es una importante tcnica utilizada en los estudios biomoleculares asociado al diagnostico directo (deteccin de antgenos) o indirecto (deteccin de anticuerpos) de enfermedades. El principio bsico del ELISA consiste en utilizar anticuerpos ligados a una enzima, la cual es capaz de cambiar el color de la solucin, en caso de ser positiva. El Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirido (SIDA) causado por el VIH (virus de inmunodeficiencia humana) es detectable (en ciertas fases de la infeccin) por el ELISA. Algunas parasitosis tambin pueden ser detectadas por ELISA, as como la cuantificacin de algunas Inmunoglobulinas G y M (vase en el tpico de inmunidad).
26
El procedimiento para efectuar el ELISA es el siguiente: 1. Se conjuga un anticuerpo con una enzima especfica (peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc). 2. Se agrega este anticuerpo a los pocillos con solucin antignica (ELISA directo) o con anticuerpos (ELISA indirecto). 3. Se espera a que se formen las capas de inmunocomplejos (Antgeno + Anticuerpo antiantgeno + Anticuerpo marcado con enzima). 4. Se agrega el sustrato enzimtico a los pocillos y se espera el tiempo necesario de la enzima para ver los resultados.
26
Electroforesis
La electroforesis es una tcnica que se fundamenta en la movilidad elctrica de biomolculas en un gel, slido o lquido especializado. Es empleado muy a menudo luego de una PCR, para poder establecer patrones de correlacin entre diferentes molecular (p. ej. En gentica forense se utiliza para correlacionar el DNA de sospechosos con el encontrado en una escena del crimen).
Habitualmente se realiza la electroforesis en gel, utilizando un gel de poliacrilamida. Dependiendo del peso molecular de la biomolcula analizada, la marca se desplazar hasta cierto nivel de la placa, otorgando un resultado caracterstico. Veamos un ejemplo prctico del uso de electroforesis y PCR en gentica forense. Ocurre un caso de un cuasi-intento de homicidio a una mujer desconocida en un departamento. La Polica de Investigaciones logra identificar en el momento a un sospechoso, que posee una pequea mancha de sangre en su chaqueta (de 2mm de dimetro). Dicha sangre es enviada a los laboratorios forenses de la PDI, mientras el sospechoso alega que es sangre propia. Una vez en el laboratorio, dicha sangre es purificada para obtener leucocitos. Los leucocitos son tratados para obtener su DNA. A travs de PCR se amplifica la escasa muestra de DNA obtenida. Finalmente, se realiza una electroforesis en gel, tomando como referencia la sangre de la vctima y la encontrada en el sospechoso. El resultado de la izquierda muestra que los alelos encontrados en S (sangre encontrada en sospechoso, analizada dos veces) y de la victima son las mismas. La sangre con S negra muestra la sangre del sospechoso, que tiene un perfil diferente a las otras. Con ello se concluy la culpabilidad del sospechoso.
27
28
las secuencias enhancers, silencers, factores de transcripcin e incluso metilaciones e hidroxilaciones del DNA podran alterar la forma de la expresin gnica. Adems de los genes retrovirales integrados a nuestro genoma, los tramposones y retrotramposones (genes saltarines) y otras secuencias, el PGH abre una nueva puerta de investigacin, acerca de cul es realmente la evolucin que ha tenido nuestro DNA, la importancia de las secuencias no codificantes e intentar descifrar cul es realmente los secretos que esconden las instrucciones que conforman nuestro ser. Se espera que se logren identificar a plenitud los genes involucrados en muchas enfermedades, para lograr corregirlos in utero, evitando de esa manera la alta prevalencia de enfermedades que, hasta ahora, se consideran incurables. Las secuencias codificantes se encuentran en una proporcin muy parecida a la materia blanca (la materia que nosotros podemos ver, sentir y experimentar) en el universo. Posiblemente dicha distribucin de informacin, al igual que las proporciones aureas basadas en el nmero Phi, siguen los equilibrios entrpicos caractersticos de la materia biolgica.
28
29
30
30
La respuesta correcta en este caso es la alternativa a). Las pistas para saber la alternativa correcta, es conocer el proceso de replicacin del DNA, en el que se agregan nucletidos trifosfatados (1), que todos los nucletidos poseen una pentosa (2) (fijarse en el diagrama gris, que tiene 5 lneas, que indican los 5 carbonos) y que la base indicada con el nmero 3 est apareada con una Guanina, por lo que corresponde a citocina (no es necesario saberse de memoria la estructura molecular de la citocina).
31
Tip PSU
Este es un tpico bastante complejo, con muchos nombres y procesos un poco difciles de memorizar y aprender. Para la PSU lo ms importante es saber los procesos ms que los nombres (los nombres importantes son los nicos que debes saber). Es muy importante conocer el flujo de la informacin gentica, para ser expresada desde el DNA hasta las protenas. Recuerda tambin la importancia de las tcnicas de la ingeniera gentica y otras tcnicas biomoleculares, al igual que las conclusiones y puertas entregadas por el proyecto genoma humano.