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Catalisis Enzimática def

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La Catálisis Enzimática
Introducción Se denominan enzimas a los catalizadores biológicos. Esta sentencia que parece ser trivial cobra importancia cuando se tiene en cuenta que una parte significativa de la organización biológica recae sobre la denominada función enzimática. Conceptualmente lo anterior se traduce en que buena parte de la historia de la bioquímica es tratada al estudiar la historia de las reacciones enzimáticas. La historia Los primeros estudios sistemáticos sobre los enzimas se realizaron en los primeros años del siglo XIX al tratar de comprender los procesos digestivos. Sin embargo es solo hasta 1850 cuando Pasteur planteó que la fermentación del azúcar hasta el alcohol se da por medio de unos “fermentos” presentes en las levaduras, cuando se fortalece el paradigma bioquímico. Paradójicamente como consecuencia de las interpretaciones de los estudios realizados, Pasteur consideró que los “fermentos” eran inseparables de las células vivas aplicando una interpretación vitalista. Para 1897 E. Buchner logró separar los “fermentos” del material vivo obteniendo alcohol y de paso contradijo de manera contundente la sentencia vitalista de Pasteur. James Sumner en 1926 aisló y cristralizó la ureasa y el análisis químico permitió deducir que se trataba de un material exclusivamente proteico, postulando entonces que todos los enzimas eran proteínas. Esta sentencia que resultó polémica fue aceptada después de que se aislaron la pepsina y tripsina. Hoy se considera que con excepción de un pequeño grupo de RNA, la naturaleza de los enzimas es proteica y las estructuras (primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria-si existe-) son esenciales para que los enzimas tengan actividad catalítica. Generalidades El peso molecular en los enzimas puede fluctuar entre 12000 hasta más de 1 millón, algunos no requieren de otros tipos de grupos químicos para ser activos mientras que otros requieren para su actividad de la presencia de un componente químico adicional al que se denomina cofactor. La tabla y figura siguientes resumen la descripción y clasificación de enzimas y cofactores. Es así como se denominan coenzimas a complejos orgánicos u organomentálicos que son necesarios para que se dé la actividad enzimática. En algunos
Simples Solo proteína Fracción Proteica (apoenzima) Complejas (holoenzima) Cofactor Enzima
Si el cofactor está unido covalentamente a la fracción proteica se denomina grupo prostético

Proteica

Cofactor

iones Compuesto Orgánico

Coenzima Complejos Organometálicos

No Proteica

RNA

119 casos se requiere la presencia tanto de coenzima como de otro cofactor. Si la coenzima o el ion metálico están covalentemente unidos a la parte proteica del enzima se denomina grupo prostético. El sistema completo y catalíticamente activo se denomina holoenzima, mientras que la parte proteica del enzima se denomina apoenzima o apoproteina. Clasificación Los enzimas han sido incluidos en 6 diferentes grupos según los tipos de reacciones que catalizan y se resumen la tabla 12-2. Tabla 12-2

Para clasificar un enzima se recurre a dos hechos taxonómicos: El nombre sistemático y el número de clasificación. Por ejemplo, para la reacción: ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa 6-fosfato Nombre sistemático: ATP: glucosafosfotransferasa (indica que se transfiere un grupo fosforilo desde el ATP hasta la glucosa) Número de la Comisión Enzimática (E.C. number): Número de cuatro dígitos donde: Dígito 1: Indica la clase del enzima (ver tabla 12-2) Dígito 2: Indica la subclase. Dígito 3. Indica el grupo (sustituyente) involucrado en la reacción. Dígito 4. Indica el tipo de molécula sobre la que se opera en la reacción. Así para el enzima considerado en el ejemplo anterior el número sistemático es: E.C. 2.7.1.1

120 Cinética enzimática Como se deduce del sistema de clasificación, cada enzima presenta puntos críticos o regiones geográficas que son determinantes en su actividad química. En consecuencia, la región más trascendental en el enzima, para ejercer la función catalítica se denomina centro activo y se asocia a una hendidura o fisura (ubicada sobre la superficie del enzima) que se considera como complementaria topológicamente al sustrato. En este centro activo transcurre la catálisis por la interacción física entre sustrato y enzima. Esta unión puede originar modificaciones estructurales tanto en el enzima como en el sustrato. En la figura siguiente se presenta un esquema del sitio activo y de los aminoácidos involucrados.
Los aminoácidos en el centro activo se clasifican como: Aminoácidos catalíticos (identificados por la letra C), directamente implicados en los cambios covalentes del sustrato durante la reacción enzimática y que están ubicados en el centro C. Aminoácidos de especificidad o contacto (e1, e2 ), participan en la unión del sustrato al enzima, pero no intervienen en cambios covalentes (en el centro F). Aminoácidos de conformación, no están relacionados con el proceso catalítico directamente, pero son necesarios para el mantenimiento de la estructura tridimensional del enzima.

En el transcurso de una reacción enzimática operan transformaciones que se resumen en las figuras siguientes; en las que se plantean de manera esquemática los conceptos enzimáticos más representativos. Así en la parte izquierda se comparan energéticamente las reacciones catalizadas y no catalizas. Posteriormente se compara la reacción enzimática al representar los sitios activos y finalmente en la página siguiente se relaciona la constante de equilibrio con la energía libre estándar para reacciones específicas y las ratas de incremento para reacciones catalizadas enzimáticamente.

121

Se han descrito diferentes aproximaciones a la interacción enzima-sustrato entre los cuales vale la pena destacar: Modelo llave-cerradura, ajuste inducido, modelo de compresión y de distorsión. Todas estas interacciones se presentan en la figura siguiente.

Modelos para la interacción enzima-sustrato

Llave y cerradura S S E E E S

Ajuste inducido

S E

Compresión S S E E S

Distorsión

S E E

122 Deducción de la Ecuación de Michaelis-Menten Una reacción enzimática puede escribirse como:

Donde E, S y P representan el enzima, el sustrato y el producto respectivamente. Un gráfico que resume la evolución cinética de las reacciones enzimáticas se presenta a continuación.

A partir del esquema anterior y de los correspondientes equilibrios se tiene que la velocidad de catálisis es función de [ES] y k3 V = k3 [ES] La formación de [ES] = k1 [E][S] La desaparición de [ES] = (k2 + k3 )[ES] En el estado estacionario [ES] es cte. ó d[ES]/dt = 0 y además se dan dos condiciones: 1) Las concentraciones de los intermedios no cambian 2) Las concentraciones de sustrato y producto varían

Según lo anterior se pueden igualar la formación y desaparición del complejo [ES]

k1 [E][S] = (k2 + k3 )[ES] Dividiendo por k1 y despejando [ES], se tiene que [E] [S] [ES] = k2+k3/k1 KM = k2 + k3 k1

123 [E] [S] KM Redefiniendo [E] tenemos que [E] = [ET]-[ES] y al sustituir en la ecuación se obtiene que: ([ET]-[ES]) [S] [ES] = KM Reagrupando KM [ES] = ([ET]-[ES]) [S]

[ES] =

Resolviendo para [ES] se obtiene [S] [ES] = ET [S] + KM

Reemplazando [ES] en la ec. de velocidad [S] V = k3 ET [S] + KM

V max. se da cuando el enzima está saturado. Esto es [S]/[S]+KM se aproxima a 1 Vmax = k3ET Al sustituir se obtiene la ec. de Michaelis-Menten [S] V= Vmax [S] + KM

Si [S]>>>KM entonces se igualan las velocidades Si [S] = KM entonces V = Vmax/2

124 La ecuación de Michaelis-Menten puede transformarse hasta obtener una línea recta que corresponde a un doble recíproco que se denomina Lineweaver-Burk y que se presenta en el gráfico siguiente

Al realizar una aproximación más detallada a las constantes de equilibrio que están definidas en el proceso enzimático, el complejo enzima-sustrato puede ser transformado de tal manera que se obtienen dos condicines:   Una primera situación en la que el complejo ES es similar al sustrato. Una segunda circunstancia donde el complejo se asemeja al producto.

Bajo esta nueva consideración las constantes de equilibrio se tranforman hasta obtener la siguientes condiciones:

E+S

k1 k-1

ES

k2 k-2

EP

k3

E+P

Esta nueva aproximación al equilibrio permite definir al kcat que está determinada por k3 . La constante kcat o “número de producción” o “recambio” es equivalente al número de moleculas de sustrato convertidas en moléculas de producto por unidad de tiempo mediante una molécula de enzima cuando se tiene el enzima saturado. La tabla siguiente presenta los parámetros km y kcat típicos de algunos enzimas.

En esta nueva condición la ecuación de Michaelis-Menten queda de la forma:

Vo =

kcat [Et][S] km + [S]

Si se tiene la condición cinética de que [S]<< km la ecuación anterior se transforma en:

125

Vo = kcat km

[Et][S]

El factor kcat/Km es el mejor parámetro cinético para comparar la eficiencia catalítica. En la tabla siguiente se presenta un resumen de este factor reportado para diferentes enzimas.

v

Las reacciones enzimáticas están condicionadas en su actividad por factores “ambientales” tales como pH y temperatura. En este sentido la catálisis debe operarse en las condiciones más apropiadas para el enzima. En la figura siguiente se presenta un esquema del efecto que sobre la actividad enzimática tienen las variables pH y Temperatura. Las valoraciones enzimáticas emplean términos De sna específicos entre los que se tur ali pueden destacar: za v
t opt.

ció n

tér

mi ca

pH
Efecto del pH sobre la conformación del enzima

t + NH3 .. NH2- H .. NH2 COO-

+ NH3

- H+ + H+

+ NH3

- H+ + H+

- H+ + H+

+

COOH

COOH

COO-

COO-

+ H+

1. Unidad de enzima (U, mU, KU): Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1mol por minuto en condiciones normalizadas. 2. Actividad específica (U/mg prot): Unidades de enzima en términos de la proteína. 3. Kacal (kat): Cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato por segundo.

1 kat = 6 x 107 U 1U = 16,67 nkat (nanokatales)

126 Inhibición Enzimática Una característica importante de las reacciones enzimáticas es la interacción con sustancias diferentes al sustrato y que conducen a la alteración de los parámetros cinéticos que cualifican la reacción. En consecuencia, un inhibidor es cualquier ligando que se une al enzima reversible o irreversiblemente (esta última condición también denominada inactivación) disminuyendo la velocidad de reacción o bloqueando la catálisis. La inhibición enzimática se puede entender como la disminución en la capacidad catalítica de un enzima y se clasifica en dos grandes grupos: 1. 2. Inhibición reversible. Denominada así porque al eliminar el inhibidor el enzima recupera su actividad normal. Inhibición irreversible. Está mediada por la unión covalente entre enzima e inhibidor, quedando el enzima modificado sin posibilidad de regeneración.

La inhibición reversible a su vez se subdivide en: Inhibición Competitiva. El enzima se une al sustrato o al inhibidor (ES o EI) en el mismo espacio molecular (sitio activo). En consecuencia se tiene una COMPETENCIA que se evidencia experimental en el aumento en el Km. Inhibición no Competitiva (mixta). El inhibidor no se fija al enzima en el sitio activo. Tanto el inhibidor como el sustrato se unen al enzima formando un complejo terciario. La evidencia experimental es la disminución de la velocidad máxima. Inhibición incompetitiva. En este caso el competidor se une al complejo ES.

127 Mecanismos Catalíticos (tomado de voet y voet) La catálisis es un proceso en el que se aumenta la velocidad sin afectar el equilibrio. Tal como se discutió, la velocidad de una reacción es función de la energía libre de activación y un catalizador actúa rebajando la altura de esta barrera cinética. Es decir, un catalizador estabiliza el estado de transición con respecto a la reacción sin catalizar. En muchos casos, no hay nada especial en los mecanismos de catálisis enzimáticos en comparación con los mecanismos no enzimáticos. Al parecer, existen dos propiedades relacionadas que hacen que los enzimas sean unos catalizadores tan poderosos: Su especificidad en la fijación de sustrato, combinada con una conformación óptima de sus grupos catalíticos. La conformación de los grupos catalíticos y de fijación de un enzima, es el producto de eones de evolución y por tanto se tiene que la naturaleza ha tenido muchas oportunidades para afinar las funciones de los enzimas. Los tipos de mecanismos catalíticos por los cuales operan los enzimas se han clasificado en: 1. Catálisis ácido-base 2. Catálisis covalente 3. Catálisis por iones metálicos 4. Catálisis electrostática Adicionalmente dos hechos han sido considerados como definitivos para el entendimiento de los mecanismos enzimáticos: 1) Los efectos de proximidad y orientación y 2) La fijación preferencial del complejo del estado de transición En esta sección, se examinan estos diversos fenómenos, haciendo referencia a los modelos orgánicos que sustentan conceptualmente estos mecanismos. 1. Catálisis ácido-base La catálisis ácida general es un proceso en el que la transferencia parcial de un protón desde un ácido de Bronsted (especie que puede donar protones) disminuye la energía libre del estado de transición de una reacción. Por ejemplo, una reacción de tautomerización cetoenol tiene lugar de manera muy lenta debido a la elevada energía de su estado de transición, tipo carbanión (Ver figura). La cesión de un protón al átomo de oxígeno, sin embargo, reduce el carácter de carbanión del estado de transición, catalizando por consiguiente la reacción. De otro lado, una reacción también puede realizarse por catálisis básica general si su velocidad aumenta debido a la abstracción parcial de un protón por una base de Bronsted (especie que se puede combinar con un protón). Algunas reacciones pueden estar sujetas simultáneamente a ambos procesos: reacción con catálisis ácido-base general concertada. La mutarrotación de la glucosa proporciona un ejemplo instructivo de

128 catálisis ácido-base. Recuérdese que una molécula de glucosa puede adoptar cualquiera de las dos formas anoméricas cíclicas, a través de una forma lineal intermedia. En disolventes acuosos, se observa que la velocidad inicial de mutarrotación de la -D-glucosa, tal como se sigue por polarimetría, cumple una relación cuya constante de velocidad es de primer orden. La velocidad de mutarrotación aumenta con la concentración de ácidos y bases. Se ha postulado que ambos catalizan la mutarrotación según el mecanismo que se describe a continuación.

En la catálisis es determinante como se identifica el sustrato que actúa como base o como ácido en una reacción. La figura siguiente ilustra como se reconoce cada caso.

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Muchos tipos de reacciones de importancia bioquímica son susceptibles de catálisis ácida y básica. Entre ellas, se cuentan la hidrólisis de péptidos y de ésteres, las reacciones del grupo fosfato, tautomerizaciones y adiciones de grupos carbonilo. Las cadenas laterales de los restos de aminoácidos Asp, Glu, His, Cys, Tyr y Lys tienen valores de pK en o cerca del intervalo de pH fisiológico lo que, como se verá, les permite actuar en la capacidad enzimática de catalizadores ácidos o bases generales de forma análoga a los mecanismos orgánicos conocidos. Evidentemente, la capacidad de los enzimas para situar varios grupos catalíticos alrededor de sus sustratos hace que la catálisis ácido-base concertada sea un mecanismo enzimático común. La reacción de la RNAsa A representa un muy buen ejemplo de la catálisis ácido-base general. Este enzima gobierna la hidroliza del RNA a sus nucleótidos constituyentes. La reacción supone un proceso de dos etapas donde la primera involucra la His 12 que actúa como una base general al abstraer un protón del carbono 2'-OH situado en el RNA. Este ataque promueve un ataque nucleofílico sobre el grupo fosfato adyacente. La His 119 por su parte actúa como un ácido general al incidir sobre la rotura del enlace por protonación del grupo saliente. El intermedio 2',3'-cíclico que se forma es rápidamente hidrolizado por lo que podría considerarse el proceso inverso, con la excepción de que el agua reemplaza al grupo saliente. En resumen, la His 12 actúa como un ácido general y la His 119 actúa como una base general.

130 En la tabla siguiente se refieren los aminoácidos que pueden actuar como ácidos o bases en la catálisis enzimática.
Aminoácido Acido General (donador de protones) Base General (aceptor de protones)

2. Catálisis covalente La catálisis covalente implica que la disminución en la energía de activación está mediada por la formación transitoria de un enlace covalente entre el enzima y el sustrato. La descarboxilación del acetoacetato, catalizada químicamente por aminas primarias se constituye en un muy buen ejemplo de tal proceso, tal y como se muestra en la figura siguiente. La primera parte de la reacción implica que la amina ataca nucleofílicamente el grupo carbonilo del acetoacetato, formando entonces una base de Schiff (enlace imino). El átomo de nitrógeno del intermedio actúa como fuente de electrones. La base de schiff puede formarse o descomponerse rápidamente y por tanto determina la velocidad de reacción. La catálisis covalente tiene tanto pasos nucleofílicos como electrofílicos y por tanto la catálisis covalente se puede descomponer conceptualmente en dos pasos: l. La reacción nucleofílica entre el catalizador y el sustrato para formar un enlace covalente. 2. La eliminación de electrones del centro de reacción por el catalizador que, ahora es electrofílico. Los mecanismos de reacción covalente se clasifican, de manera algo arbitraria en catálisis nucleofílica o catálisis electrofílica, según cuál de estos efectos proporciona una mayor fuerza propulsora a la reacción, es decir, cuál de ellas cataliza la etapa determinante de velocidad. La descarboxilación del acetoacetato catalizada por aminas primarias es una reacción de catálisis electrofílica ya que su fase nucleofílica -formación de la base de Schiff- no es la etapa limitante de velocidad. No obstante, en otras reacciones catalizadas covalentemente la fase nucleofílica puede ser la determinante de velocidad.

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La nucleofilicidad de una sustancia está estrechamente relacionada con su basicidad. Desde luego que el mecanismo de la catálisis nucleofílica se parece al de la catálisis básica general, con la excepción de que, en lugar de abstraer un protón del sustrato, el catalizador ataca nucleofílicamente el sustrato para formar un enlace covalente. Por consiguiente, si la formación del enlace covalente es la etapa determinante de velocidad de una reacción catalizada covalentemente, la velocidad de reacción tiende a aumentar con la basicidad del catalizador covalente (pK). Un aspecto importante de la catálisis covalente es: Cuanto más estable es el enlace formado, con menor facilidad se descompondrá en las etapas finales de la reacción. Un buen catalizador covalente debe combinar, por tanto, las aparentemente contradictorias propiedades de alta nucleofilicidad y la capacidad de formar un buen grupo saliente, es decir, revertir fácilmente el paso de formación del enlace. Los grupos con elevado grado de polarización (electrones muy móviles), tales como las funciones imidazol y tiol, poseen estas propiedades y de ahí que sean buenos catalizadores covalentes. La Quimotripsina es una proteasa ampliamente estudiada en lo referente al mecanismo de reacción. Se considera como un mecanismo mixto entre catálisis acido-base general y catálisis covalente. El mecanismo general se presenta en el esquema siguiente. El mecanismo detallado de la hidrólisis del enlace peptídico plantea que el sustrato se ubica en el sitio activo del enzima y la reacción está dividida en dos partes: En la primera (que comprende las etapas 1-3) se da la formación del enlace covalente temporal entre el enzima y el sustrato denominandose fase de acilación. Las etapas 4-7 corresponden a la fase de desacilación, al final de la cual se recupera el enzima libre.

132

133 3. Catálisis por Iones Metálicos. Aproximadamente una tercera parte de las actividades enzimáticas funcionan por la mediación de iones metálicos. Los enzimas que requieren presencia de iones para su funcionamiento se pueden clasificar en dos grupos: 1. Los metaloenzimas. Que contienen iones metálicos con uniones fuertes y que normalmente corresponden a metales de transición. Ejemplos: Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ o Co3+. 2. Enzimas que se activan por metales fijados débilmente y que están presentes en disolución. Normalmente estos iones corresponden a metales alcalinos o alcalino-térreos: Na+, K+, Mg2+ o Ca2+. El efecto catalítico de los iones metálicos se da de tres modos principales: 1. Fijación al sustrato al orientar al sustrato adecuadamente para una interacción efectiva. 2. Participando en las reacciones de oxidación-reducción por cambios reversibles en el estado de oxidación del ion metálico. 3. Estabilizando o apantallando electrostáticamente las cargas negativas. Se considera que los iones metálicos, al estabilizar la carga en el sitio activo, consolidan la catálisis. En los estudios sobre las reacciones catalizadas por estos mecanismos se ha establecido que lo iones actúan de manera similar a los protones (ácido de Lewis), con la ventaja de que pueden estar presentes a elevadas concentraciones y a pH neutro y además están en capacidad de tener cargas > +l. De este hecho se desprende que en muchos casos los iones metálicos han sido denominados "superáridos”. La descarboxilación del dimetiloxaloacetato, catalizada por iones metálicos como Cu2+ y Ni2+, es un ejemplo no enzimático de catálisis por iones metálicos:

Tal y como se planteó anteriormente, una función enzimática importante de los iones metálicos se da por la posibilidad que poseen para apantallar las cargas. El ejemplo más plausible probablemente sea el de las quinasas (enzimas que transfieren grupos fosfatos) que resultan ser complejos Mg2+-ATP.

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El papel del ion Mg2+ es dual: En primer lugar logra un efecto orientador del sustrato y simultáneamente apantalla electrostáticamente las cargas negativas de los grupos fosfato de tal manera que estas cargas no logren repeler los pares electrónicos de los nucleófilos que atacan y muy especialmente de aquellos que poseen carácter aniónico. 4. Catálisis Electrostática. Cuando se da la fijación de un sustrato en el sitio activo, se da generalmente un desplazamiento o exclusión del agua. Por tanto, la constante dieléctrica del sitio activo se asemeja a la de un disolvente orgánico y por lo tanto, interacciones electrostáticas son mucho más fuertes que las que tienen lugar en solución acuosa. La distribución de carga en un medio de constante dieléctrica baja puede influir mucho sobre la reactividad química. Así, los valores de pK de las cadenas laterales de aminoácidos en las proteínas pueden desplazarse varias unidades de sus valores nominales debido a la proximidad de grupos cargados. Se ha establecido que el ion carbonio en la reacción de la lisozima está estabilizado debido a la interacción con el ion carboxilato del Asp 52, lo que equivale a un aumento de velocidad de 4x106 Efectos de proximidad y orientación Si bien los enzimas utilizan mecanismos catalíticos similares a los que se presentan en las reacciones orgánicas modelo, son catalíticamente mucho más eficientes. La diferencia en la eficiencia se estima que proviene de las condiciones físicas específicas en el sitio catalítico del enzima, que estimulan la correspondiente reacción química. Los efectos más obvios son los de proximidad y orientación: los reactivos han de entrar en contacto con la relación espacial adecuada para que tenga lugar la reacción. Por ejemplo, en la reacción bimolecular entre el imidazol y el p-nitrofenilacetato se tiene la condición cinética que se presenta en la figura del costado. En el caso presentado en el esquema se tiene que en k1 la constante de velocidad de pseudoprimer orden, es 0,0018 s-1 cuando [imidazol] = 1M (Ø = fenil). Sin embargo, en la reacción intramolecular que se presenta a continuación, da otra circunstancia:

135 La constante de primer orden k2 = 0,043 s-1, es decir, k2 = 24 k1 . Esto significa que cuando se fija el catalizador (imidazol 1M) de manera covalente al reactivo, el resultado es 24 veces más efectivo que cuando está libre en solución. En otras palabras, el grupo imidazol en la reacción intramolecular actúa como si su concentración fuese 24M. Daniel Koshland propuso un protocolo para determinar como se afecta la velocidad de una reacción por la proximidad de sus grupos reactivos y teniendo en cuenta los siguientes supuestos: 1. Las especies reactivas, es decir, los grupos funcionales, son aproximadamente del tamaño de moléculas de agua. 2. Cada especie reactiva en solución tiene 12 moléculas vecinas próximas, como esferas empaquetadas del mismo tamaño. 3. Las reacciones químicas sólo se dan entre reactivos que están en contacto. 4. La concentración de reactivo en solución es suficientemente baja, de forma que la probabilidad de que cualquier especie reactiva esté en contacto con más de una molécula del otro reactivo sea despreciable. En estas condiciones, la reacción:

A+B
d [A-B]

k1

A-B

obedece la ecuación de velocidad de segundo orden

=k1 [A][B] = k2 [A,B]pares dt donde [A,B]pares es la concentración de moléculas de A y B que están en contacto. El valor de esta cantidad es:

v=

[A,B]pares =

12 [A][B] 55,5 M

Dado que existen 12 maneras por las que A pueden entrar en contacto con B, y [A]/55,5 es la probabilidad de que una molécula de B se encuentre al lado de una molécula de A ([H2O]=55,5M en soluciones acuosas diluidas). Al combinar las ecuaciones de velocidad, tenemos que:

136 La teoría precedente es, por supuesto una simplificación extrema. Por ejemplo, no se tiene en cuenta las interacciones de unos grupos reactivos respecto a los demás. Aunque el efecto debe ser poco dado que, en el estado de transición, los grupos reactivos tienen poca movilidad relativa. De hecho, tal como demostró Thomas Bruice, las velocidades de las reacciones intramoleculares aumentan notablemente cuando se detienen los movimientos internos en una molécula (Tabla). Así, cuando un enzima pone en contacto dos moléculas en una reacción bimolecular, no solamente aumenta su proximidad sino que congela sus movimientos translacionales y rotacionales relativas. Esto implica que disminuye su entropía y por tanto aumenta su reactividad. En la tabla se indica que estos incrementos de velocidad pueden ser enormes. Otro efecto que se pasa por alto en el concepto de la proximidad es el de la orientación. Las moléculas no reaccionan desde cualquier dirección, como supone la sencilla teoría de Koshland. En realidad, sólo reaccionan si se encuentran en la orientación relativa adecuada. Efecto de la fijación del estado de transición. El incremento de la velocidad causado por los enzimas es a menudo superior a lo que se podría explicar mediante los mecanismos catalíticos y efectos mencionados hasta ahora. No obstante, no se ha considerado uno de los efectos más importantes involucrados en la catálisis enzimática: La fijación de1 estado de transición a un enzima con mayor afinidad que los correspondientes sustratos/productos. Cuando se considera en conjunto el concepto de fijación del estado de transición con los mecanismos catalíticos descritos previamente se puede explicar a satisfacción las altas velocidades enzimáticas observadas. El concepto original de la fijación del estado de transición propuso que los enzimas tensionan mecánicamente los sustratos, conduciéndolos hacia la geometría del estado de transición, mediante sitios de fijación en los que no encajarían perfectamente los sustratos sin distorsionar. Este mecanismo que coloquialmente se denomina el mecanismo del potro (en analogía con el instrumento medieval de tortura) se basó en multitud de pruebas sobre el papel que juega la tensión en las reacciones orgánicas. Por ejemplo, la velocidad de la reacción en un compuesto aromático es 315 veces más rápida cuando R es CH3, que cuando es H. Esto se sustenta en las mayores repulsiones estéricas que se establecen entre los grupos CH3 y los grupos reactivos que cuando R corresponde a H. De manera análoga, las reacciones que conducen a la apertura de anillos son considerablemente más fáciles cuando el anillo está tensionado -como es el caso del ciclopropano- en comparación con lo que sucede para anillos sin tensionar tal y como se da para el ciclohexano. Se estima que el

137 reactivo tensionado se parece más al estado de transición de la reacción que el correspondiente reactivo sin tensionar. Así, tal como se sugirió originalmente por Linus Pauling y después elaborado por Richard Wolfenden y Gustav Lienhard, las interacciones que fijan preferentemente el estado de transición incrementan su concentración y, por consiguiente, aumentan proporcionalmente la velocidad de reacción.

Para el ejemplo anterior el incremento de la velocidad de reacción por efecto estérico se resume en la tabla siguiente.
R H CH3 Vel. Vel. 1 315

138 TALLER 12 1. A continuación se presenta una tabla de datos en la cual aparecen las concentraciones de sustrato y velocidades de una reacción con y sin inhibidor, son estos datos realiza lo siguiente.
[S](mM) V, sin inhibidor (mM/min) 0,021 0,053 0,106 0,212 1,004 1,889 4,580 6,400 7,720 8,720 9,500 V, con inhibidor 3mM (mM/min) 0,017 0,043 0,085 0,169 0,802 1,508 3,660 5,120 6,180 6,980 7,600

0,010 0,025 0,050 0,100 0,500 1,00 3,00 5,00 7,00 9,00 11,00

a. Realice la gráfica de Michaelis-Menten y determine KM, Vmax con y sin inhibidor b. Defina según la forma de la gráfica el tipo de inhibidor c. Obtenga una tabla para graficar la ecuación de Lineweaver-Burrk y obtenga los valores exactos de KM y Vmax con y sin inhibidor d. Se sabe que en el experimento la concentración de enzima era 0.5mM, en otro experimento con un enzima diferente con el mismo sustrato, se determinó que KM era 6.25 mM y kcat era 27 s-1 para el nuevo enzima, determine cuál de los dos enzimas es mejor para el sustrato y por qué razón. 2. Investigue cual es el enzima E.C.1.1.1.1 3. Investigue y explique los mecanismos de reacción de los siguientes enzimas triosa fosfato isomerasa, quimiotripsina 4. Ejemplifique cada uno de los siguientes tipos de catálisis a partir de enzimas definidas a. Catálisis ácido-base b. Catálisis covalente c. Catálisis por iones metálicos d. Catálisis electrostática

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