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TCNICAS DE COLORACIN DE MICROORGANISMOS

M.C Gabriela Quintero

Objetivo:

Realizar las diferentes tcnicas de coloracin e identificar las estructuras y morfologas bacterianas y diferenciar microscpicamente las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.

1. Observacin en fresco Preparacin en fresco simple


2. Observacin con tinciones
Tincin simple: un solo colorante. Tincin diferencial: ms de un colorante

Procedimiento para un preparado en fresco

1. Colocar una gota de


agua en un porta

2.- Tomar la muestra con el


asa de siembra o un gotero

Muestra

Porta objeto

Colorantes

Son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por algn componente. Los colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste

bsicos: Consisten en un catin coloreado unido a un anin incoloro. Tien la clula bacteriana uniformemente (cidos nucleicos y los polisacridos cidos )
(cromatina nuclear de pro y eucariotas) (ms usados en citologa bacteriana). Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta

cidos: Tienen el catin incoloro unido a un anin


coloreado. No tien la clula bacteriana, pueden usarse como color de contraste. Tien estructuras citoplasmticas de las clulas eucariotas
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina cida y el rojo Congo.

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA


a) Frotis o (extensin)

b) Secado
c) La fijacin d) Coloracin.

Extensin de una fina capa de clulas sobre el porta

Adicin del colorante lavado y secado


Secado al aire

Fijacin por flameado del porta

Se coloca una gota de aceite de inmersin sobre el porta y se observa con el objetivo de 100X

La fijacin: Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas) TIPOS CON CALOR (O MTODO DE KOCH) FIJACIN QUMICA: alcohol metlico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y ter)

Metanol

Coloracin. Simple

Lunes

Tincin simple de azul de metileno.


Frotis y fijacin

1.- Poner una gota de agua en un porta

2.- Tomar la muestra con el asa de siembra

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

Tincin

1.- Cubrir la preparacin con Azul de Metileno 5

2.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio Micrococcus luteus

Coloracin. Diferencial o compuesta Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE ZIEHL- NEELSEN, ESPORAS.

La membrana celular
Funciones:
Transporte selectivo de sustratos. Participa en la generacin de energa y en la divisin celular.

Estructura:
Bicapa fosfolipdica con protenas *en Archaea, membranas adaptadas a condiciones extremas - teres de alcohol isoprenoide, algunas monocapas.

Diferencias en la pared celular

Tincin de Gram
Tincin del frotis Paso 1
Previamente fijado al calor, con cristal violeta Durante 1 minuto. Todas las clulas se tien de color azul-violeta.

Paso 2

Aadir Lugol, dejar actuar 2 minutos Todas las clulas siguen de color azul-violeta.

Gram +

Decolorar con alcohol Paso 3


Las clulas Gram + siguen de color azul-violeta. Las Gram negativas se decoloran.

Tincin de contraste
Con safranina 2 minutos. Las clulas G+ se ven azul-violeta.

Paso 4

Las G- rosas o rojas.

Gram -

Lunes

Tincin de Gram Cocos Gram Bacilos Gram -

FORMA DE LAS BACTERIAS

cocos

bacilos

espirilos

COLORACIN DE ZIEHL- NEELSEN

Fundamento de esta tcnica diferencial se basa en la propiedad de la pared celular (acidos miclicos) Resiste la decoloracin con alcohol y cido fuerte Mycobacterium

Coloracin de Ziehl- Neelsen

Tincin de esporas.
Tincin Frotis y fijacin

1.-Poner una gota de agua en un porta

2.-Tomar la muestra de un cultivo de Bacillus

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

1.-Cubrir la preparacin con Verde Malaquita

2.-Calentar, con un hisopo de algodn empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero, hasta la emisin de vapores. Mantener caliente durante 5 minutos.

3.-Lavar con agua

4.-Teir con Safranina 1

5.-Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Esporas

Bacterias

Clostridium botulinum