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PRACTICA 15 RECUENTO DE HONGOS EN ALIMENTO I.-OBJETIVOS II.-FUNDAMENTO TEORICO Los hongos microscópicos pudren y malogran materias primas y productos manufacturados (incluidos los distintos alimentos), como el empleo de estos organismos en fermentaciones industriales y en el campo de la biotecnología. Se trata de organismos fúngicos que muestran diferencias considerables en su estructura. Pertenecen a grupos taxonómicos muy diversos y, si bien se pueden observar a simple vista, no obstante producen estructuras diminutas, reproductoras y vegetativas, que no es posible estudiar sin la ayuda del microscopio. Comúnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares filamentosos, dotados de un micelio verdadero, microscópicos, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta concepción, es inseguro establecer el límite entre los mohos y ciertos microorganismos encuadrados en las especies esporógenas y productoras de micelio de las levaduras. Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de células independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargadas o casi cilíndricas. En algunos casos, forman cadenas de células alargadas, adheridas de modo suelto, semejantes a un micelio, por lo que se las denomina seudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de verdadero micelio, con frecuencia ramificado. De acuerdo con lo expuesto, y según se ha comentado ya, no existe un límite de separación definida entre levaduras y otros hongos que forman un micelio típico. De la amplia dispersión de los hongos en todos los estratos bióticos e inertes se desprende su fácil y frecuente aparición como contaminantes en productos alimentarios, ya que estos, constituidos por sustancias inorgánicas y orgánicas más o menos complejas, constituyen excelentes medios para la sustentación y reproducción de gran número de especies fúngicas. Además, como sucede con las bacterias, diversos factores (pH, Eh, aw, Hr, temperatura, elementos nutritivos, estructuras biológicas, etc.) influyen en la proliferación fúngica sobre los alimentos. El significado de la contaminación fúngica de los alimentos, especialmente por mohos, viene no solo del potencial de los hongos para deteriorarlos, sino también del potencial de mucho de ellos para producir una gran variedad de micotoxinas a las que el hombre tiene susceptibilidad, así como su capacidad para provocar infecciones e, incluso, reacciones alérgicas en personas hipersensibles a los antígenos fúngicos. Para averiguar la carga micológico de un alimento, se emplea la técnica usual del recuento en placa de agar a partir de la “serie de diluciones decimales” del producto. III.-MATERIALES Tubos de ensayo de 16 x 160mm. Gradillas Pipetas graduadas estériles de 1 y 10ml Estufa de cultivo Matraces Erlenmeyer de 250ml. Probetas de 100ml • MEDIOS DE CULTIVO Caldo de triptona soja (TSB) Agua de triptona Solución de ringer Solución de tween  Composicion: Tween 80: Agua destilada: 0,1 ml 1.000ml • Agar extracto de Levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGYE) Composicion: Extracto de levadura Dextrosa Bilis de buey desecada Agar Oxitetraciclina Agua destilada 5g. 20g 5g. 15g. 100ml 1.000ml. IV.-PROCEDIMIENTO Caldo de triptona soja (TSB)  COMPOSICION: * Triptona * Soja * Dextrosa * Cloruro sódico * Fosfato dipotásico * Agua destilada 17g 3g 2.50 g 5g 2.50 g 1.000 ml Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,3. Distribuir en matraces de 100 ml a razón de 9ml. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Agar extracto de Levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGYE) Disolver los ingredientes por calentamiento y agitación hasta ebullición, salvo la oxitetraciclina. Ajustar el pH a 6,5 _+ 0,2. Distribuir en matraces a razón de 200ml. Esterilizar en autoclave a 115ºC durante 10 minutos. Luego Atemperar el medio a unos 45ºC y añadir 20ml de solución de oxitetraciclina por cada 200ml de medio. • Luego en cada placa con la respectiva muestra, añadir 20ml de solución de oxitetraciclina por cada 200ml de medio. TECNICA Preparado de la muestra del alimento: La mezcla se suspende en la proporción 1/9 en Caldo de triptona soja (TSB). Tras mantener la dilución inicial de la muestra (1:10) durante 2 horas a temperatura ambiente, partiendo de esta dilución, se realizan diluciones decimales seriadas (1:100, 1:1.000, 1:10.000, etc.), en agua de triptona, solución de tween 80 al 0.01 por 100 ó solución de Ringer. La siembra de las placas de recuento se lleva a cabo en masa, depositante 1ml de cada una de las diluciones decimales en placas de Petri estériles que midan 90mm de diámetro, adicionar seguidamente el medio de recuento (OGYE), atemperado a 45 ºC, en cantidad aproximada de 20ml por placa. Es importante dispersar homogéneamente la muestra en el medio de recuento para obtener valores correctos. Dejar solidificar horizontalmente a temperatura ambiente. Incubar en estufa de cultivo a 25ºC durante 5-7diás. Pasado este tiempo, se procede al recuento de las colonias crecidas, si bien la lectura se comienza al tercer día para observar la formación de micelios aéreos invasores. El recuento se establece a partir del numero de colonias aparecidas en una sola dilución, concretamente la dilución que proporcione que proporcione un valor medio de colonias fúngicas entre 0 y 30 (0 a 50). El número de colonias contadas se multiplica por el factor de dilución de la placa y se obtiene así el recuento total de unidades formadores de colonia de mohos y/o levaduras por gramo o mililitro de alimento. ufc/ ml = ufc/placa x factor de dilución x alicuota (si hubiera) Contador de colonias Selección de las placas y recuento de las colonias: a) Después del periodo de incubación, seleccionar aquellas que presentan de 30 a 300 colonias no difusas. b) Contar las colonias con ayuda de amplificación, preferiblemente con un contador de colonias tipo Québec de campo oscuro, provisto de una placa guía marcada en centímetros cuadrados. Deben contarse las colonias incluyendo las puntiformes, que no deben confundirse con partículas de medio no disueltas o sustancias precipitadas. c) Multiplicar el numero total de colonias por él reciproco de la dilución correspondiente, haciendo la aproximación hasta el segundo digito que se sigue de tantos ceros como sean necesarios para indicar la dilución correcta. Por ejemplo, sí el conteo de una placa cuya dilución es de 10 -3 muestra el desarrollo de 128 colonias, el resultado se expresara “Recuento estándar en placas por mL = 130.000”. No deben expresarse los resultados como “numero de bacterias por mL”. d) Cuando se preparan placas de la misma dilución en duplicado, se debe tomar el promedio de los recuentos obtenidos. Si solo una de las placas presenta 30-300 colonias, debe promediarse ese resultado con el otro aunque se salga de dichos valores. e) Cuando se observa ausencia de placas con 30-300 colonias, se debe contar aquella cuyo recuento se aproximan más a 300 colonias. f) Si él número de colonias observado es excesivamente alto y por lo tanto difícil de contar, se puede calcular contando solamente 13 cuadros (centímetros cuadrados) representativos diferentes y multiplicando el resultado por el factor 5. Si él número de colonias por centímetros cuadrados es mayor de 10, se pueden contar solamente las colonias presentes en 5 cuadros y multiplicar el resultado por 13. g) Cuando ninguna placa presenta mas de 30 colonias, se debe contar aquellas de menor dilución señalándose como menos de 30 veces la dilución correspondiente; así, en el caso de la dilución 10-2, el resultado se expresará “Recuento estándar en placas = menos de 3.000”. h) Si se observan colonias difusas, el recuento total puede estimarse contando áreas representativas bien distribuidas pero libres de dichas colonias. Sin embargo esto solo puede hacerse cuando el área cubierta por esas colonias no es superior a la mitad de la placa. Equipo para conteo de colonias Para el recuento de colonias se emplean equipos que consiste en una pantalla iluminada la cual posee una gran lente de aumento; pueden ser: contadores de colonias en los cuales la caja de Petri se ajusta en una plataforma y se ilumina por debajo y al mismo tiempo la lente aumenta 1.5 veces el tamaño del objeto. También existe un contador electrónico de colonias en el cual la caja de Petri se ubica en una platina iluminada, luego se presiona la varilla de cuenta y el número exacto de colonias se proyecta instantáneamente en una pantalla digital. http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/3_4_3recuento.h tm V.-DISCUSIÓN a).-Empleando un medio de cultivo de revivificación: El caldo triptona de soja (TSB) es un medio líquido idóneo para la revivificación de propágulos, posiblemente estresados por las condiciones de los productos analizados. Este paso de revivificación antes del recuento es necesario, para que todas las unidades formadoras de las colonias existentes en el alimento se encuentren en condiciones de originar una colonia de crecimiento, y así conseguir un recuento fiable. b).- Utilizando medios de recuento VI.-BIBLIOGRAFIA 1.- MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA metodología analítitca para alimentos y bebidas, M.a del rosario Pascual Anderson y Vicente Calderon y Pascual, 2000 2.VII.-ANEXOS