Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP Laboratorio N 8 Caracterizacin fenotpica de los aislados: Pruebas bioqumicas Fermentacin de manitol

Para estudiar la capacidad de un microorganismo de fermentar una determinada sustancia se utiliza un medio base al cual se le agrega el sustrato filtrado. La concentracin final del sustrato es de 0,5- 1%. El medio posee adems un indicador de pH como por ejemplo azul de bromotimol y una campana de Durham (para detectar produccin de gas). En caso que el microorganismo sea capaz de fermentar el sustrato en estudio se observar viraje del indicador hacia el color cido, para el azul de bromotimol ser amarillo. La produccin de gas se evidenciar a travs de la formacin de una burbuja en la campanita de Durham. Medio de cultivo
Extracto de carne 3 g/l Peptona 5 g/l Sc. Azul de Br Timol (16%) 1 ml Hidrato de carbono 5 g/l pH final: 7

Lecitinasa En esta prueba se estudia la accin de los microorganismos sobre un fosfoglicrido presente en la yema de huevo: la lecitina (fosfatidil colina). Las colonias con actividad lecitinsica formarn un halo opaco a su alrededor. Para el caso de Bacillus cereus, se utilizar el medio de Mossel al cual se le habr agregado una suspensin de yema de huevo al 50% en NaCl 0,85%, a razn de 1ml de suspensin por cada 9 ml de medio. Hemlisis Para la realizacin de la prueba, se incorpora sangre de oveja o carnero al 5% en un medio nutritivo slido estril, fundido y templado (55 C aproximadamente). Las placas se secan a 37C y se siembra el microorganismo en estudio. Interpretacin: a) hemlisis: destruccin parcial de los glbulos rojos acompaada por una coloracin verdosa o pardusca. b) hemlisis: destruccin total de los glbulos rojos que se observa como una zona transparente alrededor de la colonia. c) ausencia de hemlisis: no hay cambios visibles. Triple azcar hierro- Agar TSI Este medio permite determinar la capacidad de un microorganismo de degradar un hidrato de carbono especfico incorporado a un medio bsico con o sin produccin de gas y de cido sulfrico. La degradacin del azcar con formacin de productos cidos se manifiesta por un cambio de color del indicador (rojo de fenol) que vira del naranja al amarillo o al rojo en caso de alcalinizacin. El tiosulfato Peptona es de reducido casena a SH 15 2 que reacciona con la sal frrica Peptona de carnetres azcares: 5 produciendo S3Fe2 color negro. El medio contiene lactosa, sacarosa y glucosa Extracto de levadura 3 en una relacin de 10:10:1 g/ litro, respectivamente.
NaCl Lactosa Sacarosa Glucosa Citrato frrico y amonio Tiosulfato de sodio Rojo fenol Agar 5 10 10 1

0,3 0,3 0,024 12 pH final 7,4

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP Medio de cultivo (Composicin g/l)

El medio se envasa de forma tal que la zona inferior sea recta y la superior en pico de flauta. Los monosacridos en el pico de flauta son catabolizados por la va de la gliclisis hasta cido pirvico y posteriormente es degradado por medio del ciclo de Krebs para dar CO 2, H2O y energa. En la zona recta del medio de cultivo, que posee baja concentracin de O 2, los monosacridos tambin son metabolizados por la va de la gliclisis hasta cido pirvico pero luego son convertidos en diversos productos finales estables como cido lctico y/u otros cidos orgnicos, aldehdos, alcoholes, CO 2, H2 y energa. Para una correcta interpretacin de esta prueba es muy importante realizar la lectura luego de 18 a 24 hs. Lecturas prematuras o demoradas podrn conducir a interpretaciones errneas. Interpretacin: Luego de la incubacin pueden observarse: Lectura (pico de flauta/profundidad) Interpretacin
Alcalino/Acido, con o sin gas1 Acido/Acido, con o sin gas Alcalino/Alcalino o sin cambio
1

Fermenta la glucosa Fermenta glucosa y lactosa (sacarosa2) No fermentan glucosa ni lactosa (sacarosa)

La produccin de gas provoca un desplazamiento del medio del fondo del tubo o agrietamiento del medio. 2 La incorporacin de sacarosa permite el reconocimiento del gnero Proteus. Estos microorganismos no utilizan lactosa o lo hacen lentamente pero si pueden fermentar la sacarosa.

La produccin de SH2 se evidencia por un ennegrecimiento del medio. Prueba del Rojo de metilo Esta prueba permite comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Se cultiva el microorganismo en estudio en el medio de Clark y Lubs, y se incuba a 37C durante 24 hs. Medio de Clark y Lubs (Composicin en g/l)
Polipeptona Glucosa Fosfato dipotsico A.D. c.s.p. 7 5 5 1000ml

pH final

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP Para obtener un resultado vlido deber realizarse una primera lectura a las 24 hs y una segunda luego de 2 a 5 das de incubacin a 37C. Revelado: Sobre una alcuota del medio desarrollado agregar unas gotas de indicador Rojo de Metilo. Interpretacin: El rojo de metilo conserva su color rojo a valores bajos de pH ( 4,2) indicando que se han producido cidos estables capaces de vencer la capacidad buffer del medio. Si el indicador vira al amarillo la prueba de RM es negativa (pH 6). Prueba de Voges-Proskauer Esta prueba permite determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir un compuesto final neutro, el acetilmetilcarbinol, a partir de la fermentacin de la glucosa. La reaccin de VP se basa en la deteccin del acetilmetilcarbinol (acetona). En presencia de O2 (atm) y lcali los productos finales neutros acetona y 2,3-butanodiol son oxidados a diacetilo, que es el reactante para el color producido en la reaccin. El diacetilo reacciona con el ncleo guanidina (Arg) presente en la peptona, en medio alcalino, dando un color rojizo en la superficie del medio. La velocidad de desarrollo de color depende de la concentracin de acetona, por lo general el color se produce de los 2 a 5 minutos, obtenindose la mxima intensidad de color luego de una hora. El medio de cultivo utilizado es el de Clark y Lubs, el cual se siembra y se incuba a 37C durante 24 hs. Revelado: - Sobre una alcuota del medio desarrollado agregar 0.6 ml de una solucin alcohlica de naftol al 5% (acta como catalizador en la oxidacin de la acetona a diacetilo). - Luego se agregan 0,2 ml de una solucin de KOH o NaOH al 40%. Se agita el tubo suavemente favoreciendo la oxidacin de la acetona por el O 2 atmosfrico. Interpretacin: Reaccin positiva: la aparicin de color rojo-rub en la superficie del medio indica la presencia de acetona. Reaccin negativa: color amarillo o cobrizo, corresponde al color de los reactivos. Prueba del Indol Permite determinar la capacidad de un microorganismo de degradar el aminocido triptofano dando indol. En el proceso de degradacin del triptofano intervienen diversas enzimas que reciben el nombre de triptofanasas. Estas enzimas catalizan la reaccin de desaminacin, atacando la molcula de Trp en su cadena lateral y dejando intacto el anillo aromtico en la forma de indol.

Triptofanasa

+ NH3 + CH3COCOOH Indol Ac. pirvico 3

L-Trp

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Medio de cultivo: caldo triptona. (Composicin g/l)

Extracto de carne Peptona Triptona A.D. c.s.p. final 7

3 5 20 1000ml

pH

Se siembra un tubo de caldo e incuba a 37C durante 24hs. Revelado: Se utiliza el reactivo de Kovacs: p-dimetilaminobenzaldehdo en alcohol amlico y HCl. Agregar al tubo desarrollado unas gotas y agitar. Interpretacin: La aparicin de color rojo en la capa alcohlica se debe a la formacin de un compuesto de condensacin entre el p-dimetilaminobenzaldehdo y el indol. Prueba de oxidacin-fermentacin Permite determinar la capacidad de un microorganismo de oxidar o fermentar un determinado hidrato de carbono. La fermentacin es un proceso metablico que no requiere O 2. Se caracteriza por la fosforilacin inicial del hidrato de carbono y requiere de un compuesto orgnico como aceptor final de electrones. Los procesos oxidativos son estrictamente aerbicos. El proceso de oxidacin directa del hidrato de carbono, que se da en el grupo fluorescente del gnero Pseudomonas, no requiere de la fosforilacin del azcar. La glucosa se oxida a cido glucnico o 2cetoglucnico y posteriormente se fosforila y degrada a cido pirvico. Medio de cultivo OF (base) (Composicin en g/l)
Peptona 2 NaCl 5 K2HPO4 Azul de bromotimol 0,03 Agar 3 A. D. c.s.p. 1000 ml 7,1

0,3 pH final

Luego de esterilizar y enfriar a temperatura ambiente al medio base, se le aade solucin estril del azcar en agua destilada para dar una concentracin final de 1%. El medio utilizado es un agar semi-blando, que permite evidenciar movilidad y reducir la difusin y dilucin de los cidos permitiendo su deteccin aun en pequeas cantidades. A partir del cultivo puro de 24hs se inoculan con ansa recta dos tubos del medio OF. Un tubo se inocula directamente "Tubo abierto". El segundo tubo es purgado previamente para eliminar el O2 mediante el calentamiento a Bao de Mara durante 15 minutos. Luego se enfra bajo canilla sin agitar y se siembra por puncin. Inmediatamente se cubre con 1 cm de parafina o vaselina lquida estril, " Tubo sellado". Ambos tubos se incuban a 35C durante 48 hs. Algunos microorganismos requieren hasta 2 semanas de incubacin.

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP Interpretacin: Tipo de metabolismo Oxidativo Fermentativo Fermentativo Inerte** "Tubo abierto" Acidez (amarillo)* Acidez (amarillo) Neutro (verde) Neutro (verde) "Tubo cerrado" Neutro (verde) Acidez (amarillo) Acidez (amarillo) Neutro (verde)

* Como se produce una pequea cantidad de cido, suele aparecer amarillo solo la superficie del agar ** El microorganismo no metaboliza el carbohidrato

Prueba de la enzima citocromo oxidasa. Esta prueba permite determinar la presencia de la enzima citocromo c oxidasa presente, entre otras, en los gneros Pseudomonas y Aeromonas, y nos permite diferenciarlas del grupo oxidasa negativa de la familia Enterobacteriaceae. Esta enzima acta, en presencia de oxgeno, activando la oxidacin del citocromo "reducido" de la cadena transportadora de electrones.
Citocromo reducido.

oxidasa
Citocromo oxidado

O2 H2O

Un sustrato artificial (reactivo) puede sustituir al dador natural (citocromo reducido) dentro de la cadena transportadora. Existen varios reactivos que pueden actuar como dadores artificiales de electrones: indofenol, p-fenilendiamina, como ejemplo. Estos reactivos al ser oxidados dan un producto coloreado en forma inmediata, indicando la presencia de la enzima.
Reactivo reducido

O2 oxidasa

Reactivo oxidado

Para la realizacin de la prueba se utilizan discos comerciales que contienen el reactivo. Se prepara una suspensin densa del microorganismo en 0,2 ml de agua (destilada o corriente). Colocar el disco en contacto con la suspensin, la aparicin de color rosado en menos de 1 minuto indica Oxidasa Positivo. Prueba de reduccin de Nitratos Las bacterias pueden utilizar nitratos por asimilacin (reduccin del nitrato a amonaco que se utiliza como fuente de nitrgeno), desasimilacin (cuando se utiliza como aceptor final en ausencia de oxgeno, reducindose a nitrito) y desnitrificacin (cuando se convierte en productos finales gaseosos, como nitrgeno, xido nitroso u xido de nitrgeno). La reduccin de los nitratos ocurre generalmente en condiciones de baja tensin de oxgeno. Para poner en evidencia la capacidad de reducir el nitrato se emplea el siguiente medio:

H2O

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP Caldo Nitrato (Composicin (g/l))

Extracto de carne Peptona 5 NO3K

3 1

Se envasa en tubos y se coloca una campanita de Durham. Se siembra con un inculo denso y se incuba 24hs. Luego se determina la presencia de N 2 , NH3 y NO2- . Revelado e interpretacin: Presencia de N2: se verifica la presencia de gas en la campanita. Presencia de NH3: Agregar a una porcin del cultivo unas gotas del reactivo de Nessler (iodomercuriato de potasio). Este reactivo, en presencia de iones amonio se descompone con formacin de ioduro de dimercuriamonio que permite una determinacin colorimtrica de iones amonio. Si se observa un precipitado color ladrillo rpidamente, indica un resultado positivo. Presencia de NO2-: Agregar a una porcin del cultivo 2 gotas del reactivo Nit-1 (solucin actica de cido sulfanlico) y luego 2 gotas del reactivo Nit-2 (solucin actica de alfa dimetilnaftilamina).
NO3NO2- + c. Sulfanlico Sal de diazonio p sulfurobenceno azo naftilamina (color rojo)

Sal de diazonio + dimetilnaftilamina

La aparicin de un color rojo en la superficie indica reaccin positiva. En caso de que esta reaccin sea negativa, se puede verificar la presencia del nitrato propio del medio agregando una pizca de Zn a los reactantes anteriores. Dado que el Zn reduce el nitrato a nitrito, si el nitrato del medio no fue metabolizado debera aparecer el color rojo confirmando una reaccin negativa. En el caso de que el medio permanezca incoloro, la reaccin es positiva habindose metabolizado el nitrato hacia otras formas. Prueba de licuefaccin de la gelatina Permite determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas del tipo proteoltico (gelatinasas). Para poder ingresar a la clula bacteriana las protenas deben ser primero catabolizadas a compuestos ms pequeos. Las enzimas exocelulares de tipo proteoltico, gelatinasas, son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar las protenas. El catabolismo puede ser considerado en dos etapas: Protena + H2O
Proteinasas

polipptidos aminocidos
Extracto de carne Peptona Gelatina 3 5 12

Polipptidos + H2O

Peptidasas

Medio de cultivo: Gelatina nutritiva Composicin g/l

Se envasa y esteriliza por Tindallizacin. Se siembra por puncin. Luego se incuba a 37C durante 24hs a 48 hs. Antes de la lectura se debe enfriar los tubos. Observar la presencia de desarrollo y licuefaccin comparando con un tubo control.

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP Prueba de la Coagulasa La coagulasa es un enzima que acta directamente sobre el fibringeno provocando la formacin de cogulos o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana con plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del gnero Staphylococcus: (+) Staphylococcus aureus (- ) Staphylococcus epidermis Procedimiento e interpretacin: -Prueba rpida en portaobjetos: se prepara una suspensin bien homognea del microorganismo sobre el portaobjetos y se agrega una gota de plasma de conejo. Se mezclar suavemente con el ansa y despus por rotacin. La prueba se considera positiva si hay aglutinacin microscpica. -Prueba en tubo: en un tubo mezclar 0.5 ml de plasma de conejo y una ansada cargada de la bacteria a ensayar. Rotar suavemente el tubo sin sacudir. Incubar a 35C 2-4 horas y observar cada 30 minutos. PRECAUCIN: no sacudir el tubo durante la observacin, inclnelo suavemente para ver el cogulo. Si este no es visible al final de las 3 horas, djelo en la estufa por 24 hs. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en alguna oportunidad puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el cogulo luego de 18 horas de incubacin y de esta manera se produzca un test falso negativo. Prueba positiva: Cogulo completo o cogulo parcial (el cogulo no abarca completamente la columna del fluido) Prueba negativa: No hay formacin de cogulo, la suspensin permanece homognea Presencia de la enzima catalasa Esta enzima se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas. Es una hemo-protena. Uno de sus sustratos es el H 2O2 que se forma durante la degradacin de los azcares. Este compuesto es txico si se acumula en la clula. Su descomposicin puede producirse a travs de dos enzimas, catalasa y peroxidasa. La prueba se realiza a partir de un cultivo del microorganismo en caldo nutritivo, agregando unas gotas de agua oxigenada y observando la formacin de burbujas. Es importante partir de cultivos libres de sangre ya que los glbulos rojos contienen la enzima. Utilizacin del citrato de sodio Esta prueba se realiza para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de C y energa. El citrato puede ser metabolizado mediante la enzima citrato oxalacetato liasa que lo desdobla en acetato y oxalacetato (Ciclo reductivo de Krebs). Este ltimo es convertido luego en piruvato, que proporciona as materias primas para la biosntesis. Para evaluar la utilizacin del citrato se utiliza el medio de Simmons que contiene azul de Bromotimol como indicador de pH, citrato y sales de amonio. Si la bacteria crece, la degradacin de acetato hasta CO 2 y agua consume protones, eleva el pH y hace virar el indicador de verde (pH 6.6) a azul (pH 7.7).

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP Las bacterias que utilizan el citrato como fuente de C utilizarn el amonio presente en el medio de cultivo, como fuente de nitrgeno. Medio de Simmons (Composicin en g/l)
MgSO4 (NH4)H2PO4 K2HPO4 1 Citrato de Na NaCl Agar Azul de Br timol 0,2 0,1 2 5 15 0,08

Se envasa, esteriliza y deja solidificar en posicin inclinada. Se siembra por estras con ansa recta. Se incuba durante 24 hs. La aparicin de desarrollo con intenso color azul indica un resultado positivo. Hidrlisis del DNA Esta prueba permite demostrar la presencia de la enzima DNAsa producida por los microorganismos, mediante la hidrlisis del DNA contenido en el medio de cultivo. Medio de cultivo (Composicin g/l)
Extracto de carne Peptona de casena Peptona de carne NaCl DNA Agar 5 10 5 5 2 15

A partir de un cultivo de 24 hs se siembra en la superficie del medio de cultivo contenido en placa de Petri, con ansa en anillo en forma puntual. Incubar durante 24 hs a 37C. Revelado e interpretacin: Se revela con una solucin de HCl 1N, volcando unas gotas sobre el desarrollo. El HCl provocar la precipitacin del DNA intacto. Si el cultivo produce DNAsa se observar un halo transparente alrededor del desarrollo puntual, indicando un resultado positivo. Hidrlisis del almidn Esta prueba pone en evidencia la capacidad del microorganismo del hidrolizar el almidn presente en el medio de cultivo. Medio de cultivo (Composicin g/l)
Infusin de carne hidrolizado de casena almidn Agar 2 17.5 1.5 13

Se siembra el microorganismo en la superficie del medio contenido en placa de Petri, mediante una estra realizada con ansa en anillo. Se lleva a incubar 24 hs a 37C. Revelado e interpretacin: Se revela baando el desarrollo con una solucin I 2-Iodurada (Lugol al 5%).

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP El medio conteniendo almidn se teir de azul, contrastando con el halo incoloro que se observa alrededor de la estra del cultivo capaz de hidrolizar el almidn. Prueba de la Ureasa Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae . El medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrgeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros gneros. Para organismos que hidrolizan la urea lentamente, es recomendable usar el medio de Christensen (B02-10905, B02-109-06). Medio de cultivo (Composicin g/l)
Urea Fosfato monopotsico Fosfato disdico Extracto de levadura Rojo fenol pH final: 6.8 0.2 20 9.1 9.5 0.1 0.01

Incubacin A 35-37 C, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12, 24 y 48 horas de incubacin. Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar hasta 72 horas. -La gran capacidad buffer de este medio de cultivo, puede enmascarar la actividad uresica en bacterias que hidrolizan lentamente la urea. No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone fcilmente. Produccin de pigmentos Agar F: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de especies de Pseudomonas spp. en base a la produccin de fluorescena. Conocido tambin como medio King B. En el medio de cultivo, la triptena y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de pigmentos, la concentracin de fosfatos estimula la produccin de fluorescena e inhibe la produccin de piocianina y piorrubina. agar F (composicin en g/l)
Triptena Peptona de carne Fosfato dipotsico Sulfato de magnesio Agar pH final: 7.2 0.2 10 10 1.5 1.5 15

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP

Al medio, luego de esterilizado, se le agrega 10 ml de glicerina estril. A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Incubar durante 18-24 horas a 35-37C, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30C, o dejar a 22 C y observar diariamente hasta 7 das. Interpretacin de resultados Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260 nm. Se considera un resultado positivo la observacin de fluorescena, que es un pigmento de color amarillo, amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a fenmenos de difusin. Limitaciones Algunas cepas de P. fluorescens y P. putida solo producen fluorescena a temperatura ambiente, y se pueden obtener resultados falsos negativos si el medio se incuba a 3035C, por eso, ante la ausencia de crecimiento luego de incubacin a 35-37C, se recomienda dejar los tubos conteniendo el medio de cultivo a temperatura ambiente. Agar P: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de especies de Pseudomonas spp. en base a la produccin de piocianina. Conocido tambin como medio King A. En el medio de cultivo, la peptona de gelatina aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de pigmentos, las sales de magnesio y potasio estimulan la produccin de piocianina y piorrubina e inhiben la produccin de fluorescena. agar P (composicin en g/l)
Peptona de gelatina Sulfato de potasio Cloruro de magnesio Agar pH final: 7.0 0.2 20 10 1.4 15

Al medio, luego de esterilizado, se le agrega 10 ml de glicerina estril. A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Se incuba durante 18-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, re-incubar a 25-30 C, o dejar a 22 C y observar diariamente hasta 7 das. Interpretacin de resultados Un resultado positivo se verifica por observacin de los pigmentos piocianina y/o piorrubina. La produccin de piocianina se observa como una zona color azul, azulverdoso que rodea la colonia, o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusin del pigmento. La produccin de piorrubina se observa como una zona de color rojo oscuro-pardo alrededor de la colonia o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusin del pigmento. Limitaciones

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Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas - UNLP - La ausencia de piocianina no descarta que el microorganismo aislado sea P. aeruginosa. - Bajas cantidades de piocianina pueden no ser evidenciadas, por eso, ante la sospecha de su presencia, se recomienda agregar al medio de cultivo unas gotas de cloroformo, para exaltar la visualizacin del pigmento. - La presencia concomitante de piorrubina y/o piomelanina, puede afectar la visualizacin del color caracterstico de la piocianina. - La produccin de pigmento, puede aumentarse dejando los tubos conteniendo medio de cultivo a 22 C luego de haberlos incubado previamente toda la noche a 35-37 C.

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