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DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS COMO AZUCARES TOTALES POR EL METODO DE FENOL SULFURICO

OBJETIVOS Aplicar uno de los procedimientos estudiados en clase. Conocer el porcentaje de azcares totales en una muestra de miel. Calcular la absorbancia de la muestra. FUNDAMENTO Los carbohidratos abarcan uno de los mayores grupos de compuestos orgnicos encontrados en la naturaleza, y juntamente con las protenas forman los constituyentes principales del organismo vivo, adems de ser la mas abundante y econmica fuente de energa para el hombre. La glucosa es el monosacrido mas importante y constituye la polisacridos de mayor importancia. El mtodo de Dubois y cols. (1956) fue el utilizado para la cuantificacin de los azcares totales: A alcuotas de 0.4 ml de muestra se le aadieron 0.4 ml de fenol al 5% y posteriormente 2 ml de H2SO4 concentrado, agitndose la mezcla. A los 30 minutos de acabado el proceso se midi la absorbancia a 490 nm. La recta de calibrado se realiz con distintas concentraciones de glucosa. Los cidos urnicos generan una respuesta menor que la glucosa al test del fenol-sulfrico. Por ello las fracciones enriquecidas en cidos urnicos daban resultados minusvalorados del contenido en azcares totales. Para solucionar este problema, especialmente unidad estructural de los

importante en las fracciones pcticas, se realiz una curva patrn con cido galacturnico para el test del fenol-sulfrico y los resultados se rectificaron del siguiente modo: Con el contenido en cidos urnicos de la muestra, obtenido por el mtodo de Blumenkratz y Asboe-Hansen (1973), se calcul la absorbancia a 490 nm que daran de estar solos en ella. A la absorbancia a 490 nm de la muestra problema se le resta la que daran sus urnicos. De este modo obtuvimos la absorbancia de los azcares neutros, y por lo tanto su contenido. Ahora solo qued sumar las cantidades de cidos urnicos y azcares neutros para obtener el total de azcares presentes.

MATERIALES Muestra de alimento(miel de abeja). Balanza analtica. Glucosa anhidra p.a Agua destilada Solucin de fenol al 5%(bi destilada). cido sulfrico concentrado. Espectrofotmetro.

PROCEDIMIENTO Se sigue de acuerdo al flujo de preparacin de la muestra mostrado mas adelante. Tambin de acuerdo al modelo de la curva padrn que se muestra para la elaboracin de la muestra.

CURVA PADRN: (MTODO DE FENOL SULFRICO- AZCARES TOTALES) A partir del padrn dc glucosa, cuya concentracin es: 0,01 % (0,1 g/ 1000 ml) (glucosa) se prepara la curva padrn conforme los datos indicados a bajo. En forma semejante se hace las lecturas de las absorbancias de la muestra problema. Para ello se toman alcuotas de 0,1; 0,2 ml de filtrado y se completa a volumen para 1,0 mL con agua destilada. Seguidamente se hacen las lecturas a 490 nm.

Nmer o de tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Blanco

Padrn de glucos a 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.0

H2O Fenol (ml (5%) ) (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

H2SO
4

(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

Concentraci n [ ] g/ml 100,2100 200,2850 300,4600 400,7500 500,85 ? ? ? ? ? ?

Absorvanci a (490nm) ? ? ? ? ? ? ? 0.189 0.239 0.270 ?

Despus de agregar el Fenol, debe adicionarse el H2SO4 Esperar 30 minutos y realizar las lecturas de absorbancia

PREPARACIN DE LA MUESTRA
Pesar 5,0 gr de

muestra Disolver 100 ml H2O

Bao Mara 5 min.

Filtracin

Completar a 100 ml

Filtrado (lquido)

Residuo (descartar)

1/100 ml de Filtrado 12.5/50 ml

Fenol sulfrico (1 ml)

RESULTADOS Y CLCULOS Muestra de Miel Para ello: Se pes 5.028g, se disuelve en 100ml con H2O. Luego llevamos a bao mara por 5 minutos. Se filtra. Se extrae 1ml y enrasamos a 100; de esta mezcla extraemos 25ml y nuevamente enrasamos a 100ml Determinamos la concentracin Entonces: 1000ml 0.1ml X = 0.1 x 0.1 1000 X = 10ug/ml # de Tub o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Muestra Padrn (ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1g. glucosa X

Muestra de Miel (ml) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.2 0.5

Agua Destilada (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 1.0 0.9 0.8 0.5

Fenol (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

cido Sulfrico (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

El tubo # 1 presenta un color claro amarillo. En el resto del tubo naranja claro de mayor a menor hasta #11. Luego medimos la absorvancia: a 490nm Nmer o de tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Blanco Padrn de glucos a 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.0 H2O Fenol (ml (5%) ) (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2SO
4

(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

Concentraci n [ ] ug/ml 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Absorvanci a (490nm) 0.110 0.220 0.355 0.375 0.550 0.590 0.680 0.189 0.239 0.270

Obtenemos los valores de: A = 0.0409 B = 0.0094 R2 = 0.99 Absorvancia de la muestra: del tubo #10 = 0.55 Y = A +Bx 0.55 = 0.0409 + 0.0094x x = 54.1606383 Para de determinar: 54.16 x 0.5ml 100ml 25ml

x = 10832.1ug = 10.8321mg 10.8321 x

100ml 1ml

x = 43.3285mg 43.3285 x 100

x = 4332.85mg = 4.33285g Entonces: 4.33285 x 100g 5.07g

Azcares totales = 85.46% Otra manera: 5.07 4.33285 x = 85.46% En 5 gramos de miel, hay 4.33285 gramos de azcares totales, lo que representa el 85.46%. 100% x

DISCUSIN La reaccin que se produjo en los tubos de la curva padrn con los de la muestra fueron exotrmicas, debido al calentamiento excesivo de estas, teniendo que esperar 10 minutos para su enfriamiento. El fenol sulfrico deshidrata el azcar formando:
Pentosas Hexosas Metil furfural Hidroximetil furfural

CONCLUSIONES Hay que tener cuidado de la cantidad de muestra diluda ya que esta depende del resultado ptimo de la prctica. El azcar es deshidratado debido a la presencia del cido fenol-sulfrico. La temperatura de las soluciones influye positivamente o negativamente, segn los otros compuestos. En la miel se encuentra la fructuosa libre acompaada siempre de glucosa y sacarosa

BIBLIOGRAFA Norman Potter, Tecnologa de los alimentos R. Matissek, F.M. Schnepel, G. Steiner, 1992 Anlisis de los Alimentos, 2da Edicin, Editorial Acribia S.A. Zaragoza- Espaa.

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