ÍNDICE DE CONTENIDO

GENERALIDADES DE LA MICROBIOLOGÍA ____________________________ 4
Membrana citoplasmática bacteriana _________________________________________ 4 Pared bacteriana___________________________________________________________ 4 Endospora bacteriana ______________________________________________________ 4 Metabolismo microbiano ____________________________________________________ 5 Crecimiento microbiano_____________________________________________________ 5

INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL __________________ 6 MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL _______________________ 7 MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS INDUSTRIALES ______________________________________________________ 9 BÚSQUEDA DE NUEVOS METABOLITOS ______________________________ 10 MEJORA DE CEPAS DE INTERÉS INDUSTRIAL ________________________ 12 SUSTRATOS PARAMICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL _____________________ 15
Sustratos usados como fuentes de carbono ____________________________________ 15 Sustratos usados como fuentes de nitrógeno ___________________________________ 16

MÉTODOS DE FERMENTACIÓN A GRAN ESCALA______________________ 17
Modos de operación del biorreactor __________________________________________ 17 Biorreactores_____________________________________________________________ 17 Tipos de biorreactores _____________________________________________________ 18 Instrumentación y control del proceso ________________________________________ 18 Escalado_________________________________________________________________ 19 Técnicas de esterilización___________________________________________________ 19
Del medio de cultivo _____________________________________________________________19 Del aire de fermentación __________________________________________________________19

Proceso fermentativo ______________________________________________________ 19

RECUPERACIÓN DE PRODUCTOS FINALES ___________________________ 20
Separación de las células ___________________________________________________ 20
Filtración ______________________________________________________________________20 Centrifugación __________________________________________________________________20

Rotura celular ____________________________________________________________ 20 Aislamiento preliminar ____________________________________________________ 21 Purificación ______________________________________________________________ 21 Secado __________________________________________________________________ 21 Recuperación de productos de ADN recombinante______________________________ 21 Rendimiento _____________________________________________________________ 22

PRODUCCIÓN DE ALCOHOLES ______________________________________ 23

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Procesos de producción de etanol ____________________________________________ 23
Preparación del sustrato___________________________________________________________23 Fermentación ___________________________________________________________________23 Purificación ____________________________________________________________________24

Producción de acetona/butanol ______________________________________________ 24

PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS _______________________________ 25
Ácido cítrico _____________________________________________________________ 25
Medio nutricional _______________________________________________________________25 Procesos de producción ___________________________________________________________26 Procesos en superficie (o koji, del japonés). _________________________________________26 Procesos sumergidos o en profundidad. ____________________________________________26 Purificación ____________________________________________________________________26

Ácido acético _____________________________________________________________ 26
Producción_____________________________________________________________________27 Método Orleans _______________________________________________________________27 Método alemán _______________________________________________________________27 Generadores por goteo o reactor Frigs______________________________________________27 Procesos sumergidos ___________________________________________________________27

Ácido láctico _____________________________________________________________ 27 Ácido málico _____________________________________________________________ 27 Ácido fumárico ___________________________________________________________ 28

PRODUCCIÓN DE NUCLEÓTIDOS, AMINOÁCIDOS Y VITAMINAS________ 29
Nucleótidos ______________________________________________________________ 29
Hidrólisis enzimática del ARN._____________________________________________________29 Hidrólisis química del ARN. _______________________________________________________29 Fermentación del IMP. ___________________________________________________________29 Fermentación del GMP.___________________________________________________________29 Síntesis indirecta:______________________________________________________________29 Síntesis directa________________________________________________________________30

Aminoácidos _____________________________________________________________ 30
Glutamato _____________________________________________________________________30 Otros aminoácidos _______________________________________________________________30

Vitaminas________________________________________________________________ 30
Riboflavina (B2)_________________________________________________________________31 Cobalamina (B12)________________________________________________________________31 Ácido ascórbico (C)______________________________________________________________31

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS _________________________________________ 32
Producción comercial ______________________________________________________ 32
Selección de cepas_______________________________________________________________32 Procesos de producción ___________________________________________________________32 Sobre sustrato sólido (procesos Koji) ______________________________________________32 Procesos en biorreactores _______________________________________________________32 Aplicaciones ___________________________________________________________________33 Detergentes.__________________________________________________________________33 Producción de quesos. __________________________________________________________33 Procesado del almidón__________________________________________________________33 Industria papelera. _____________________________________________________________33 Elaboración de zumos.__________________________________________________________33 Elaboración de vinos. __________________________________________________________33 Industria textil ________________________________________________________________34 Síntesis orgánica.______________________________________________________________34

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PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS __________________ 35
Antibióticos β-lactámicos ___________________________________________________ 35
Penicilinas _____________________________________________________________________35 Cefalosporinas __________________________________________________________________36 Nuevos productos _______________________________________________________________36

Antibióticos peptídicos _____________________________________________________ 36 Antibióticos carbohidratados _______________________________________________ 36 Antibióticos macrolídicos___________________________________________________ 37 Tetraciclinas _____________________________________________________________ 37 Antibióticos aromáticos ____________________________________________________ 37
Cloranfenicol ___________________________________________________________________37 Griseofulvina ___________________________________________________________________37

PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA DE VACUNAS _______________________ 38
Métodos de producción ____________________________________________________ 38
Sistemas tradicionales ____________________________________________________________38 Vacunas de subunidades (técnicas de ADN recombinante) _______________________________38 Vacunas peptídicas ______________________________________________________________39

PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS _____ 40
DNAsa __________________________________________________________________ 40 Eritropoietina (EPO) ______________________________________________________ 40 Somatropina _____________________________________________________________ 40 Insulina _________________________________________________________________ 40 Interferón _______________________________________________________________ 41 Interleuquinas ____________________________________________________________ 41 Activador del tejido plasminógeno ___________________________________________ 41 Colágeno ________________________________________________________________ 41

PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA DE SCP ____________________________ 42
Producción de proteína unicelular ___________________________________________ 42
Sustratos ______________________________________________________________________42 Procesos de producción ___________________________________________________________43

Producción de levadura para panadería ______________________________________ 43

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GENERALIDADES DE LA MICROBIOLOGÍA
Microorganismo es todo organismo vivo que no es visible a simple vista: bacterias, algas, hongos, protozoos,... Se subdividen según los tipos de estructura celular: • Procariotas, que son las bacterias y arqueas (consideradas como bacterias simples y, por tanto, las menos evolucionadas). • Eucariotas, que son hongos, levaduras, protozoos, algas,... Los virus merecen una mención aparte dentro de esta clasificación, ya que no pueden ser considerados seres vivos en el sentido estricto (no poseen metabolismo, son incapaces de autorreplicarse, etc.) La principal diferencia entre procariotas y eucariotas es que los procariotas, a diferencia de los eucariotas, no poseen ninguna estructura nucleada que agrupe el material genético en una sola región, sino que éste se halla disperso por el citoplasma bacteriano. Además, los procariotas poseen una menor información genética y carecen de estructuras membranosas que delimiten orgánulos internos de funciones diferenciadas. Así, constan de una única macroestructura que desempeña múltiples funciones.

Membrana citoplasmática bacteriana
La estructura y composición son casi las mismas que en el caso eucariota. Sus funciones son: • Transporte de moléculas, efectuado por proteínas transportadoras embebidas en la membrana. • Contiene la cadena de transporte electrónico, que permite la fosforilación oxidativa y la producción de ATP. • Interviene en fenómenos de quimiotaxis (movimiento inducido por ciertos compuestos químicos, llamados quimioefectores), debido a que contiene receptores para los quimioefectores. • Juega un papel fundamental en la biosíntesis de moléculas como lípidos o polisacáridos. • Excreta proteínas que cumplen determinadas funciones en el exterior celular.

Pared bacteriana
Su principal función es dar rigidez a la bacteria, previniendo efectos osmóticos adversos, como la plasmólisis, además de preservarla de otras condiciones adversas. De hecho, una bacteria sin pared sólo puede sobrevivir en un medio isotónico con su citoplasma. La pared celular es una estructura tridimensional basada en la repetición de dos azúcares (Nacetilglucosamida y N-acetilmurano –NAG y NAM-), así como de un tetrapéptido. La principal diferenciación aplicada a las bacterias atiende al tipo de pared bacteriana: grampositivas o gramnegativas, o sea, sensibles o no a la tinción de Gram. En bacterias grampositivas, la estructura repetitiva es de gran tamaño y compacta, con pocas moléculas de otro tipo embebidas en la pared; mientras que en las gramnegativas es de tamaño notablemente menor, poseen muchas moléculas embebidas y presentan un denominado espacio periplásmico entre la pared bacteriana y la membrana plasmática. Así, una pared gramnegativa posee más funciones que una grampositiva.

Endospora bacteriana
Ciertas bacterias poseen dos estados en su ciclo vital: como célula vegetativa y como espora, no dándose ambos estados simultáneamente. El proceso de esporulación (formación de la espora) es bastante largo (810 horas). A diferencia con otras formas de vida, la espora no es un medio de reproducción, sino un cambio fisiológico. Las características más importantes de la espora son: - Presentan una mayor resistencia a condiciones extremas: altas temperaturas, compuestos químicos, desecación, radiaciones,... - Presenta una actividad metabólica casi nula. - Presenta una serie de capas de recubrimiento características: el exosporio, 3 cubiertas y el córtex. El exosporio y las cubiertas son proteicas, mientras que la otra es similar a la pared celular. - Prácticamente carece de agua, lo que le dota de resistencia térmica. - Contienen ácido dipicolínico, que asociado a iones calcio, permite mantener la estructura. Esta sustancia es típica de la endospora, ya que no se presenta en la célula vegetativa.

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Contiene pequeñas proteínas ácido-solubles (SASP’s), que unidas al material genético, disminuyen los daños causados en éste por las radiaciones ultravioletas y disminuyen las mutaciones. El estado de espora, causado por la aparición de condiciones adversas en el medio, puede mantenerse por un tiempo ilimitado, hasta que un medio favorable induzca la germinación de la espora (proceso muy rápido, ya que dura sólo unos minutos). La esporulación presenta dos aplicaciones fundamentales: - En la rama sanitaria, ya que dota a las bacterias de mayor resistencia a los tratamientos, por lo que, por ejemplo, la esterilización debe realizarse en condiciones más críticas. - En la industria, se usan para sintetizar productos de interés.

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Metabolismo microbiano
La diversidad en cuanto a rutas metabólicas entre las bacterias es enorme. Así, pueden obtener la energía de la luz (fototrofos) o de reacciones de ciertos compuestos químicos (litótrofos o quimiotrofos). Asimismo, la fuente de carbono puede ser compuestos inorgánicos (autotrofos) u orgánicos (heterotrofos). De este modo, los microorganismos pueden ser fotoautotrofos, quimioautotrofos o quimioheterotrofos (son muy raros los microorganismos fotoheterotrofos). Existe un metabolismo muy importante, el del nitrógeno, ya que son ciertas bacterias los únicos organismos capaces de efectuar las reacciones que permiten fijar el nitrógeno atmosférico y convertirlo en las formas en que pueden asimilarlo el resto de los seres vivos. La forma de obtención del ATP por parte de los microorganismos es muy variada: • los organismos fotosintéticos obtienen el ATP por fosforilación, bien sea cíclica para organismos que no producen oxígeno, o acíclica para organismos que sí lo producen. • Los organismos respiratorios obtienen el ATP por fosforilación oxidativa, ya sean aerobios o anaerobios. • Los organismos fermentativos obtienen el ATP a través de fosforilaciones a nivel de sustrato, por procesos oxidativos parciales.

Crecimiento microbiano
Se refiere al aumento del número de células de un cultivo. Este proceso se caracteriza por el tiempo de generación, que es el necesario para que la población se duplique. Este tiempo es variable según la especie y los factores ambientales y nutricionales. Independientemente del tiempo de generación, la curva de crecimiento microbiano es siempre la misma, dividiéndose en cuatro fases: - Fase Lag, de retardo o de adaptación. Representa un tiempo variable dependiente de las condiciones del medio, y representa el tiempo que tardan los microorganismos en adaptarse a las condiciones del medio. Cuando finaliza, la célula está preparada para desarrollar su actividad y multiplicarse utilizando los recursos que el medio le ofrece. - Fase de crecimiento. Consiste en el periodo de mayor actividad de las células, así como una explosión demográfica debido a las condiciones favorables del medio. - Fase estacionaria. Debido a la acumulación de excreciones tóxicas al medio por la gran población microbiana, así como el paulatino descenso de los nutrientes del mismo, las células van muriendo, hasta alcanzarse un equilibrio entre el número de células que nacen y las que mueren, por lo que el número de células permanece aproximadamente constante. - Fase de muerte. El equilibrio entre células que nacen y células que mueren se rompe, de modo que va disminuyendo el número total de células hasta alcanzar un mínimo aproximadamente constante.

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INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Desde tiempos ancestrales se han obtenido productos en cuya fabricación han intervenido los microorganismos, aunque no se haya tenido conciencia de ello, como ocurría con la fabricación de queso, vino, yogur, cerveza, etc. La primera prueba de la existencia de microorganismos se debe a los "animálculos” que Leuweenhoek observó gracias a su sistema de lentes en el siglo XVIII. Sin embargo, no fueron estudiados hasta el siglo siguiente por Pasteur. Los primeros procesos industriales que aprovecharon la acción de microorganismos fueron procesos de obtención de alcohol y ácidos láctico y cítrico, entre otros, a principios del s. XX. La Primera Guerra Mundial potenció la fabricación de otros productos necesarios para la guerra por vía microbiana, como glicerol o acetona. Sin embargo, es en la Segunda Guerra Mundial donde la necesidad de antibióticos, descubiertos poco antes, da el impulso definitivo al estudio de las capacidades industriales de los microorganismos. Así, en los años 70 se perfeccionan las técnicas de inmovilización de células para aumentar el rendimiento económico de los cultivos (en medios sólidos, la vida media de los cultivos es mucho mayor, además de que facilita la separación del producto), así como los cultivos en continuo y el conocimiento en procesos anaerobios. La Biotecnología surge a finales de los 70 como punto de unión de diversas ciencias con el fin común de aprovechar los organismos vivos y sus cualidades para obtener beneficios económicos. Se aplica fundamentalmente a microorganismos, debido a sus peculiares características: • Elevada tasa de desarrollo, o sea, que en poco tiempo de cultivo son capaces de iniciar la producción al máximo de sus capacidades. • Toman como base para su crecimiento sustratos económicos. • Contemplan una amplia diversidad metabólica, lo que supone un alto número posible de productos y sustratos. • Sencilla manipulación genética, debido al relativamente pequeño tamaño de su ADN. Esto permite que, por tecnologías de ADN recombinante, se pueda mejorar la producción, o incluso incorporar a los microorganismos de la maquinaria enzimática suficiente como para producir sustancias ajenas a ellos, como hormonas humanas. También con estas técnicas se pueden obtener cepas capaces de degradar productos xenobióticos (productos no degradables de origen humano), entre los que destacan los Pseudomonas. Dentro de la biotecnología, destacan dos ramas principales: • La Biotecnología tradicional, que se basa en la mejora de procesos ya establecidos, como la producción de etanol, ácidos orgánicos o antibióticos. • La nueva biotecnología, que se basa en técnicas de ingeniería genética para obtener nuevos productos, o bien para obtener productos ya conocidos por vías alternativas. La biotecnología, sin embargo, supone un problema ético y legal importante, ya que la modificación del material genético de los microorganismos puede conducir a consecuencias inesperadas y potencialmente peligrosas. Por ello, la legislación impone unas restrictivas medidas de seguridad con el fin de impedir la liberación de cepas modificadas al medio ambiente, dado que se desconocen sus efectos a largo plazo. Existe una amplísima diversidad de microorganismos, entre los que se puede llevar a cabo casi cualquier reacción metabólica. Sin embargo, y a pesar de su abundancia, sólo unas pocas presentan actualmente interés industrial, por lo que la búsqueda de una determinada especie con unas ciertas características es bastante compleja. Además, las necesidades industriales son demasiado elevadas, por lo general, para los microorganismos. Es por ello que las cepas salvajes son sometidas a diversas alteraciones con el fin de inculcar a éstas las características buscadas. Por ello, las cepas industriales pueden ser muy diferentes de las salvajes originales, y deben patentarse en alguna de las colecciones de cultivo existentes por el mundo.

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MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL
La principal característica de los microorganismos es su elevada razón superficie / volumen (debido a su reducido tamaño). Esto supone una gran capacidad de absorción y sintetización de sustancias; en definitiva, una mayor tasa metabólica. Otras características importantes de los microorganismos usados en industria son: Disponibilidad de cultivos axénicos (o sea, de una especie pura, sin presencia de otras células de otras especies diferentes). Son estables genéticamente en el tiempo, a pesar de que hayan sido modificadas genéticamente en el proceso de obtención de la cepa industrial. Esta característica es importante, ya que una vez que se altera el material genético, son frecuentes las mutaciones. Dado que las condiciones del medio de cultivo son variables (por tratarse de cultivos a gran escala), las cepas han de ser capaces de crecer aunque las condiciones no sean las óptimas ideales. Por lo general, son especies capaces de producir esporulación, lo que facilita su manejo e inoculación, además de que facilita su conservación al hacerlas más resistentes. Son de rápido crecimiento, lo que permite iniciar la producción en periodos cortos de tiempo. Pueden crecer en medios líquidos de bajo coste, que por lo general son residuos de otras industrias, como melazas. Sin embargo, esto presenta a su vez un inconveniente: son sustratos complejos y difíciles de metabolizar, lo que requiere una modificación genética adicional de las cepas. Las cepas utilizadas han de carecer de carácter patógeno, para minimizar los riesgos en caso de que alguna célula viva escapara del fermentador al medio ambiente o al consumo. Es preferible que el tamaño de las células sea el mayor posible, ya que esto facilita la separación de las células del producto. Esto se debe a que los procesos de separación son, por lo general, filtraciones o centrifugaciones, por lo que cuanto mayor sea el tamaño, más facilitada está la separación. Deben ser más o menos fáciles de manipular genéticamente, lo que permite una mayor facilidad de obtención de las cepas industriales buscadas. Así, ciertas especies, como Esclerichia coli, son bastante más fáciles de manipular que otras. Los principales usos de las distintas clases de microorganismos son: Industria panadera Bebidas alcohólicas Fuente de vitaminas y de proteína unicelular (SCP, importante complemento dietético de bajo coste, de Levaduras gran importancia en zonas con carencias de alimentos). Síntesis de proteínas de origen no microbiano, tales como ciertas hormonas. Setas, derivados de soja y ciertos quesos Producción de diversas enzimas, como pectinasas (útiles para la elaboración de zumos). Hongos Síntesis de ácidos orgánicos (sobre todo, cítrico y filamentosos láctico). Síntesis de antibióticos, como la penicilina. Síntesis de alcaloides, con diversos fines terapéuticos. Lácticos Embutidos y conservas Bacterias lácticas (el Probióticos (productos Bacterias grupo más importante) de efectos beneficiosos para la salud) Ácido láctico

Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces fragilis

Aspergillus niger (sobre todo en síntesis de ácidos orgánicos) Penicillium notatum

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Actinomicetos (similares a hongos por morfología y tipo de crecimiento, presentes en suelos) Bacillus

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Antibióticos Enzimas Inhibidores enzimáticos

Corinebacterias, utilizadas en industria quesera y en síntesis de potenciadores de sabor

Clostridium (organismos estrictamente anaerobios)

Antibióticos peptídicos Bacillus thuringiensis Enzimas proteasas Insecticidas Síntesis de disolventes Degradación de sustratos complejos en combinación con otras especies de microorganismos

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MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN MICROORGANISMOS INDUSTRIALES

DE

Dado el alto coste de obtención de las cepas industriales, se requiere la adopción de técnicas de conservación apropiadas que permitan preservar sus propiedades. No existe un único método, ya que cada especie presenta sus preferencias de conservación: Subcultivo. Consiste en el paso de un inóculo de un cultivo agotado en otro fresco (preferentemente, sólido). No es la más apropiada para la industria, ya que presenta tres grandes inconvenientes: El tiempo de persistencia de las células es, por lo general, bastante bajo. Este tiempo puede aumentarse por refrigeración a unos 4 ºC. Se puede producir contaminación fácilmente, dada la alta frecuencia de manipulación. Debido a la manipulación continua, aumenta el riesgo de variabilidad genética en la cepa. Desecación. Consiste en la eliminación de agua del microorganismo, reduciendo así el metabolismo. Para evitar que el proceso de desecación dañe las células, se añaden compuestos protectores. El proceso se produce a temperatura ambiente una vez añadidos los protectores. Finalizado el proceso, se sella el cultivo y se conserva en refrigeración. Un método alternativo es el del L-secado. Consiste en pequeños discos gelatinosos que se impregnan con el cultivo líquido y se secan por un proceso activo (temperatura, etc.). Al igual que antes, al finalizar el proceso, se sella y se lleva a refrigeración. Congelación. Según la técnica empleada, la temperatura de congelación varía. Se usan congeladores normales (unos –30 ºC), industriales (-70 ºC) o nitrógeno líquido (hasta –200 ºC). Cuanto más baja sea la temperatura, mejor es la conservación, pero también es mayor el coste. Para evitar la formación de cristales en el interior de las células, que pueden producir daños en sus estructuras, se usan dos técnicas: Adición de compuestos protectores, como dimetilsulfóxido. Congelación lenta, de modo que se formen primero los cristales en el medio exterior. Esto provocará la pérdida de agua de la célula por ósmosis. El inconveniente de este método es el gran aumento de la concentración de sales en el proceso de descongelación, a la que las células pueden ser muy vulnerables. Para evitarlo, se usan medios de congelación poco salinos. Liofilización. Se hace una congelación previa antes de pasar al liofilizador. En él, el agua se sublimará por bajada de presión y el cultivo microbiano queda en el seno de una matriz porosa protectora (que por lo general es leche descremada o sacarosa). Debido a las características del método, se sella a vacío. Este método, junto con la congelación, es el más valorado, ya que permite unos tiempos de conservación bastante altos. Subcultivo Desecación Congelación Liofilización Escasa supervivencia y Saccharomyces - Para levaduras, 50 % - Para levaduras, hay una de supervivencia y alta supervivencia aceptable alta variabilidad cerevisiae. y alta estabilidad genética. - Para esporas de mohos estabilidad genética. y también - Para mohos, se usa la genética. congelación en - Para esporas de mohos, actinomicetos, da buenos resultados suspensiones en tierra, nitrógeno líquido. Actinomicetos y arena estéril o silica gel. - En bacterias lácticas, - En tierra o arena da buenos resultados en clostridios. líquido estéril, da resultados nitrógeno de una intermedios en precedida actinomicetos y desecación. Actinomicetos y clostridios. clostridios

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BÚSQUEDA DE NUEVOS METABOLITOS
Es costosa la búsqueda de nuevos productos o microorganismos capaces de producirlos; ya sean especies nuevas o especies modificadas. El potencial del mundo microbiano en este aspecto es enorme: sólo el 1% aproximadamente de las especies microbianas es conocido con cierta profundidad como para conocer sus intereses potenciales. Así, por ejemplo, cuando sometemos una cepa salvaje a mejora genética para obtener la cepa optimizada para su uso industrial, no todas las células sufren el proceso de mutación, y las que lo siguen, no lo hacen todas de la forma deseada. Por ello, es necesario emplear programas de selección, que permiten separar las células que nos interesan del resto del cultivo. Por definición, la selección o screening consiste en la aplicación de procedimientos altamente selectivos para detectar y aislar exclusivamente las células o metabolitos de interés a partir de una gran población de microorganismos distintos. Presenta dos problemas principales: es muy complicado identificar el producto o cepa de interés, y una vez obtenida la cepa aislada, hay que mejorarla y preservarla de futuras alteraciones. Para este proceso, existen diversas técnicas de selección (las dos primeras para seleccionar un microorganismo concreto y las otras dos para obtener un nuevo producto o una vía alternativa de síntesis de un producto ya conocido, con rendimientos más elevados y dotando a los productos de ciertas características importantes, como isómeros puros, etc.): 1. Selección ambiental. Es la más tradicional. Consiste en obtener la cepa de su hábitat común en la naturaleza. Una vez hallado el microorganismo en su hábitat, es necesario establecer los métodos de separación apropiados para obtener la cepa de interés de forma rápida y con la mayor selectividad posible. 2. Selección de cepas mejoradas genéticamente. La creación de nuevos genomas microbianos utiliza técnicas de ingeniería genética, y permite obtener cepas con nuevas características o con características propias mejoradas y potenciadas. Existen dos métodos de separación de cepas: a. Escrutinio al azar. Requiere realizar ensayos de cultivo de todas y cada una de las células tratadas, lo que supone un alto gasto económico y temporal. Este gasto puede disminuirse si se efectúa la siembra sobre discos de agar, lo que permite cultivar varias células, en discos separados, en la misma placa Petri y simultáneamente, para poder separar las que presenten la cualidad buscada (aunque no sea posible analizar cuantitativamente dicha característica, para lo que hay que pasar a cultivos líquidos individuales). b. Escrutinio racional. Consiste en la observación de alguna característica secundaria asociada a la actividad buscada y fácilmente observable, como resistencia a antibióticos o degradación de compuestos cromógenos (como por ejemplo, los mecanismos de degradación de la lactosa, a los que se pueden aplicar compuestos coloreados). A través de factores ambientales a los que sean sensibles las células que no posean la característica buscada, podremos ir eliminando las células no modificadas. La creación de los nuevos genomas puede hacerse por diversos métodos: Mutagénesis. Es una técnica aplicable a cualquier tipo de microorganismo. Consiste en la adición de una agente mutágeno, y esperar su acción sobre las células. El problema de esta técnica es que la mutación producida es al azar, por lo que puede darse cualquier tipo de variación sobre cualquier gen (o sobre varios de ellos), por lo que puede no darse si quiera la característica buscada. Así, lo que interesa, al menos, es limitar la mutación al gen que queremos modificar, lo cual no es fácil de conseguir. Reproducción sexual. Sería la más adecuada, debido a que es una fuente natural de variabilidad genética. Sin embargo, es el medio de reproducción menos frecuente entre los microorganismos, por lo que sólo puede aplicarse a ciertos hongos. Reproducción asexual. Se distinguen varios métodos, en función del microorganismo al que se pretenda cambiar el material genético. Estos procesos requieren que el DNA introducido y el celular sean de estructuras similares, y se favorece cuando hay coincidencias en la secuencia (se facilita el trabajo de las enzimas de restricción usadas en estos procesos, que son las que usan bordes complementarios en los fragmentos unidos). Dichas técnicas son: Consiste en la penetración de DNA libre presente en el medio en Bacterias Transformación el interior celular. (mecanismos que introducen material Consiste en la introducción de DNA extraño en la célula a través Transducción genético extraño en de su infección por un virus bacteriano.

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la célula)

Consiste en la formación de un puente físico entre dos bacterias (una de ellas debe tener pili para que esto sea posible). En general, se transfieren plásmidos entre las dos células; pero como en ocasiones los plásmidos están fusionados con el cromosoma Conjugación bacteriano, al producirse la escisión del plásmido, puede haber errores, intercambiándose fragmentos del DNA bacteriano entre las bacterias. Esto genera mutaciones en las dos células por recombinación del DNA. Hongos Recombinación Se debe al proceso natural de reproducción sexual que siguen filamentosos mitótica estos microorganismos. Los protoplastos son células sin pared celular, ya que dicha pared es la principal barrera al paso de DNA. Sin embargo, son células mucho más sensibles, sobre todo a fenómenos osmóticos, por lo que hay que cuidar que el trabajo sea en medios isotónicos. Se obtienen por procesos químicos o enzimáticos (más concretamente, con lisozimas). Fusión de Para que los protoplastos se fusionen, hay que disminuir las Especies con gran protoplastos repulsiones electrostáticas entre sus membranas citoplasmáticas dificultad para (con carga negativa), por lo que se hace necesario añadir agentes, modificar su como etilenglicol, que disminuyan dicha repulsión. También se material genético favorece dicho proceso adicionando Ca2+, de modo que las células pasan al llamado estado competente (mayor disposición a la entrada de DNA). Es una técnica muy rápida y de buenos resultados. Se aplican Electroporación pequeñas y breves corrientes eléctricas al cultivo, con lo que (para hongos) aparecen temporalmente poros en las cubiertas celulares, lo que facilita la entrada de DNA. 1. Modificación química. Consiste en usar un metabolito microbiano como precursor de una reacción química ajena al microorganismo, a través de la cual se convierte en producto mejorado. Biotransformación. Consiste en sintetizar un producto químico para que luego el microorganismo efectúe alguna reacción enzimática sobre él y así transformarlo en producto.

2.

Las células producen dos tipos de compuestos químicos: metabolitos primarios y secundarios. Los primarios son aquellos que la célula produce porque son imprescindibles para efectuar sus funciones vitales; mientras que los secundarios son aquellos que la célula produce y no son vitales para que ella realice sus funciones vitales, aunque en determinadas condiciones la síntesis de estas sustancias le confiera algún beneficio. En general, los productos de interés industrial son metabolitos secundarios, por lo que es importante conocer los detalles del proceso de síntesis, para poder mejorarlo y aumentar la producción. Las principales características de los metabolitos secundarios son: • Suelen ser producidos en exclusiva por un número limitado de especies, por lo general relacionadas entre sí. • Las condiciones ambientales determinan mucho su síntesis. • En general, las rutas metabólicas que los sintetizan están reguladas por mecanismos distintos a los de los metabolitos primarios y son, por lo general, más complejos. • Algunos metabolitos secundarios se obtienen como una familia de sustancias estrechamente relacionadas. La teoría más aceptada sobre el origen del metabolismo secundario es la de Zähner. Según ésta, el metabolismo secundario es un campo de pruebas de la célula. Así, cuando una determinada sustancia producida por dicho metabolismo resulta beneficiosa para la célula, se mantiene la información genética que define la ruta metabólica que la origina, dando lugar a una nueva característica de la especie. De este modo, cuando un metabolito secundario otorga a una célula una gran ventaja sobre otras que no lo tienen, éste pasa a ser un metabolito primario.

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MEJORA DE CEPAS DE INTERÉS INDUSTRIAL
No todas las especies presentan la misma disposición a la modificación genética, en función de la especie de microorganismo y la complejidad de la información genética requerida por la característica que queremos incorporar al microorganismo (número y tipo de genes; cuantos más genes estén implicados, y más dispersos se hallen en el genoma, más complicada será la regulación y control del proceso). Las principales razones que llevan a realizar los procesos de mejora genética, influyentes todos en la economía del proceso, son: • Incrementar la baja producción que se obtiene a partir de cepas salvajes. La dificultad de este proceso depende de la complejidad de modificar los genes que rigen el producto. • Adecuar las características del microorganismo a las condiciones ambientales del lugar donde se lleve a cabo la fermentación: requerimientos de oxígeno (ya que, por lo general, los microorganismos utilizados son aerobios, cuanto mayor sea el requerimiento de oxígeno, más caros y complejos son los equipos, por lo que interesa disminuir el consumo de oxígeno o, al menos, optimizarlo al máximo), disminuir el tiempo de fermentación (permite efectuar una producción mayor en menos tiempo) o aumentar la capacidad del microorganismo para nutrirse satisfactoriamente de un sustrato más barato. • Eliminar la síntesis de compuestos colaterales para aumentar la pureza del producto, o a lo sumo, disminuir la producción de éstos, para facilitar su separación. • Obtención de microorganismos capaces de sintetizar productos de interés biológico que no sean de origen microbiano, mediante las técnicas de DNA recombinante. La recombinación es el proceso que permite aumentar la variabilidad genética por medio de la unión de la información genética contenida en dos genotipos. Esto se consigue mediante: - Sustitución de alelos mutantes desfavorables tras diversos ciclos de mutación. Dado que cuanto más se manipula un microorganismo mutado, mayor es el riesgo de que la mutación degenere. Por ello, es necesario mantener células mutadas originales en reserva sin utilizar, para poder cruzarlas posteriormente con las células alteradas para recuperar las características originales. - Unión de diferentes alelos que generan cantidades crecientes de metabolito, mejorando los resultados de la mutación. Esto, sin embargo, obtiene resultados inferiores a los teóricos posibles, debido a que posiblemente se alteren otras características celulares que hacen disminuir el rendimiento posible. - Recombinación con cepas salvajes que suelen tener mejores características fermentativas. Esto se debe a que, en ocasiones, al alterar las características que nos interesan, se alteran características originales que afectaban a la eficiencia del proceso de fermentación. Así, por recombinación con células de la cepa original, dichas características pueden recuperarse. Además de alterar los mecanismos celulares para la obtención del producto que nos interese, es necesario conocer las posibilidades de regulación de la ruta que lo produce. Estos mecanismos pueden ser: 1. Regulación de la actividad enzimática. La regulación a este nivel puede producirse, a su vez, a través de varios mecanismos distintos: - Retroinhibición. Consiste en que uno de los productos de la ruta metabólica actúa como inhibidor de una de las enzimas (por lo general, de las primeras de la ruta) una vez que alcanza cierta concentración en la ruta. Cuando la ruta es ramificada, entonces puede darse de varias formas: i. El producto final de cada ruta “hija” actúa como inhibidor de la primera enzima que ya no efectúa una reacción común al resto de las rutas relacionadas. ii. La primera etapa de la parte común de la vía metabólica está regulada por distintas isoenzimas, que están reguladas de forma independiente. iii. En el caso de inhibición multivalente, la inhibición de la ruta se consigue sólo cuando todos los productos finales en los que desemboca alcanzan la concentración necesaria. iv. En el caso de la inhibición acumulativa, la inhibición sobre la ruta se produce también por todos los productos finales, pero no se requiere que

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-

todos alcancen la concentración necesaria para detener la ruta, sino que el proceso es más gradual. Carga energética. Se define la carga metabólica como:

C.E. =

ATP + 0.5ADP AMP + ADP + ATP

Cuando el valor de este cociente es próximo a 1, indica una gran cantidad de formas energéticas del ATP, por lo que se activan las rutas que lo consumen (anabólicas) al tiempo que se inhiben las que lo producen. Asimismo, cuando el valor se aproxima a 0, se inhiben las rutas anabólicas y se activan las que lo producen (catabólicas). - Degradación de enzimas. Consiste en la degradación de enzimas inducibles por medio de la acción de otras proteasas específicas. Las enzimas inducibles son aquellas que no están siempre presentes en la célula, sino sólo cuando, por determinadas circunstancias, se necesitan en un momento dado o aparece en la célula el sustrato sobre el que actúan. Este método de regulación aparece, sobre todo, en células en la etapa de crecimiento estacionario. - Modificación de enzimas. Consiste en la activación o inhibición de una enzima debido a cambios conformacionales reversibles causados por la unión o no de un determinado grupo químico o molécula a la enzima. 2. Regulación de la síntesis de enzimas. Existen tres mecanismos fundamentales de regulación: - La inducción consiste en que el propio sustrato actúa como activador del sistema genético que codifica la enzima. Afecta, sobre todo, a enzimas inducibles. - La represión consiste en la detención de la transcripción de enzima por la acción inhibitoria del producto final que genera. - La atenuación actúa en conjunto con los 2 sistemas anteriores. Controla la síntesis de enzima modificando el ARNm que daría lugar a su síntesis. Afecta, por lo general, a las rutas de síntesis de aminoácidos. 3. Exceso de producción de metabolitos primarios. Los procesos de regulación anteriores afectan, sobre todo, a metabolitos primarios, por lo que se usan para aumentar su producción. Hay tres procesos para ello: - Eliminación de la retroalimentación: obtención de mutantes auxotrofos. Un organismo auxotrofo para un determinado compuesto es aquel que no es capaz de sintetizar un producto que requiere para realizar sus funciones (algunos aminoácidos, vitaminas,...), por lo que han de suministrarse en el medio de cultivo. Así, si eliminamos la capacidad de la célula para sintetizar una sustancia que actúa como inhibidor del proceso que nos interesa, impedimos la inhibición de la ruta. Así, hemos de añadir el compuesto eliminado al medio de cultivo en cantidad suficiente como para que no se detenga el crecimiento celular pero tampoco la ruta deseada. - Obtención de mutantes resistentes a antimetabolitos. Un antimetabolito es una sustancia de estructura tan similar a la de un metabolito que es capaz de unirse a la enzima, pero ésta no es capaz de usarlo como sustrato para su reacción. Así, el producto de interés debe ser anterior en la ruta al punto de inserción del antimetabolito. Para evitar la detención del crecimiento celular, podemos hacer que la célula no requiera el producto final de la ruta o bien dotarla de capacidad para actuar sobre el antimetabolito. - Convertir una enzima inducible en constitutiva. Este proceso permite que un producto que no es siempre requerido por la célula salvo cuando aparece el sustrato en el medio esté siempre activo. 4. Regulación y superproducción de metabolitos secundarios. Estos metabolitos son más complejos de regular, ya que están controlados por cuatro tipos de genes. A pesar de ello, se regulan por los mismos mecanismos que los primarios, destacando la obtención de cepas auxotrofas y la eliminación de compuestos colaterales. Los genes implicados son: - Estructurales, que codifican las enzimas implicadas en la síntesis del compuesto. - Regulatorios, que están implicados en el metabolismo primario, pero pueden tener ciertos efectos laterales sobre el secundario. - De resistencia, que dan resistencia a la célula frente a la acción del metabolito secundario (en el caso de que éste presentara actividad antimicrobiana). - De permeabilidad, que controlan el transporte de sustancias hacia y desde la célula.

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Para evitar desechar cepas que puedan presentar características interesantes, es aconsejable efectuar tratamientos cíclicos con distintos agentes mutágenos sobre las cepas mutadas. Para hacer una selección de mutantes selectiva, podemos adicionar antibióticos o antimetabolitos a los que sólo la cepa mutada es resistente, por lo que sólo ellas permanecen activas en el cultivo. Para el caso de auxotrofos se aplica la técnica de los dobles cultivos: uno en medio completo (contiene todas las sustancias que pueda requerir la célula) y otro en medio mínimo, que no contiene los nutrientes necesarios para las especies auxotrofas (por lo que éstas no se desarrollarán). La técnica consiste en que las colonias de microorganismos estén en el mismo sitio en ambos medios; para ello, se usa un taco de madera de igual forma que el fondo del cultivo y recubierto de terciopelo. Una vez efectuado el cultivo sobre el medio completo, se impresiona éste en el terciopelo y se inocula éste en el medio mínimo. Por comparación tras la incubación de ambos cultivos, localizamos en el medio completo las colonias que no se han desarrollado en el mínimo, y que son las colonias auxotrofas. Para reducir el número de pruebas de este proceso y aumentar el número de auxotrofos de partida, es frecuente tratar primero la muestra con penicilina en medio mínimo. Como la penicilina actúa sólo sobre células en crecimiento, las cepas auxotrofas (que no se desarrollarán en medio mínimo) no se verán afectadas, mientras que el resto morirán. Otra forma de detectar los mutantes deseados es alterar algún carácter enzimático que origine una propiedad fácilmente observable, lo que se consigue a través de mecanismos genéticos. La ingeniería genética aplicada a la microbiología industrial permite introducir secuencias específicas de DNA en una célula. Para ello, las etapas a seguir son: • Obtener la secuencia genética a clonar. Esto se realiza por acción de las endonucleasas de restricción. Una vez delimitado el gen a clonar en el genoma, se hacen coincidir las zonas adyacentes al gen con las secuencias de corte de las distintas enzimas de restricción, eligiendo la que mejor se ajusta al proceso. • Inserción del gen en un plásmido, un fago o un cósmido (plásmido que contiene los genes que codifican la síntesis de la cápsida de un fago λ). Éstos serán los vehículos a través de los cuales se introducirá el DNA en la célula. • Introducción en la célula hospedadora. Para facilitar este proceso, se aumentará la competencia por presencia de iones calcio y/o electroporación. • Selección de mutantes. Las técnicas de ingeniería genética tienen diversas aplicaciones, sobre todo en biotecnología (prevención de enfermedades génicas, obtención de medicamentos,...) y protección ambiental (degradación de productos xenobióticos, etc.).

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SUSTRATOS PARAMICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Las características de los procesos microbianos a escala industrial presentan grandes diferencias con los procesos a escala de laboratorio. Esto es particularmente crítico en lo referente a sustratos: en laboratorio, están perfectamente definidos en cuanto a composición, pureza, etc.; mientras que a escala industrial esto no es posible por no ser económicamente viable, por lo que se utilizan generalmente residuos de otras industrias. Estos residuos han de cumplir los siguientes requisitos para poder ser usados como sustrato: • Contener una fuente de carbono y nitrógeno suficientemente rica. Han de presentarse en formas asequibles por las células (no son válidas todas las formas). • Cierto contenido en oligoelementos y sales minerales, básicos para que los microorganismos efectúen sus funciones. • Tamponadores de pH. Debido a la actividad microbiana, el pH del medio puede sufrir grandes variaciones, lo que puede llegar a inhibir el crecimiento microbiano. Para minimizar estos efectos, se añaden tampones. • Su composición ha de ser lo suficientemente equilibrada: sin exceso ni limitación de ningún nutriente necesario. Si no fuese así, el metabolismo del microorganismo puede desequilibrarse hacia procesos que no son los habituales, lo que puede interesarnos o no, en función de si los productos producidos son los que buscamos. Los sustratos industriales presentan el gran inconveniente de que, por lo general, su composición es desconocida y variable. Los sustratos se escogen, además de por su composición, por cercanía a la zona, ya que así se disminuyen los costes de transporte.

Sustratos usados como fuentes de carbono
- Composición muy variable, según origen Presenta formas asimilables (caña o remolacha) y cultivo de la materia Residuos de las de carbono y nitrógeno, así prima (zona, clima, condiciones, etc.). plantas como sales y - Puede contener compuestos tóxicos de azucareras oligoelementos suficientes. microorganismos. Dada su composición, se pueden producir condensaciones de Maillard durante el Proviene como Presenta fuentes de carbono proceso de esterilizado. Estas reacciones residuo del fácilmente asimilables se producen entre grupos amino y malteado de la (azúcares sencillos), y carboxilo de proteínas y azúcares, dando cebada en la variadas y ricas fuentes de compuestos de degradación muy fabricación de nitrógeno (aminoácidos, complejos. La consecuencia es la cerveza proteínas y pépticos) disminución de los nutrientes asimilables por los microorganismos. Es necesario degradarlos cuando los Son polímeros de azúcares microorganismos carecen de las amilasas: que requieren la presencia por adición de amilasas al medio de de amilasas específicas para cultivo, por hidrólisis química u obtención su degradación. de mutantes capaces de producir amilasas. Muchos de ellos son Al igual que el almidón, la celulosa directamente aprovechables requiere de un sistema enzimático especial por los microorganismos, para su degradación. Si el microorganismo pero otros, como la no lo posee, es necesario proporcionarlo en celulosa, requieren el medio, efectuar una hidrólisis química o tratamiento especial. usar cepas mutadas capaces de degradarla. No son válidos como única fuente de carbono, aunque sí como complemento de medios con bajo contenido en carbono. Son pocos los microorganismos capaces de utilizarlo. Se usa en Metanol producción de proteína unicelular y de ciertas vitaminas. Se usa principalmente para la obtención de ácido acético, aunque se Etanol están adaptando procesos para sintetizar diferentes sustancias usándolo como sustrato.

Melazas

Extracto de malta

Almidón y dextrinas

Desechos de madera e industrias papeleras Aceites vegetales Alcoholes de bajo número de carbonos

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Alcanos de 12 a 18 carbonos

Son subproductos del petróleo, por lo que su mayor inconveniente es que su precio está determinado por el precio del petróleo. Sólo son válidos para unos pocos microorganismos.

Sustratos usados como fuentes de nitrógeno
En ocasiones, lo que se hace es enriquecer los sustratos con especies químicas ricas en nitrógeno, como urea o nitrato amónico. - Es el extracto más usado Se obtienen de levaduras, para el aporte de nitrógeno. Presentan los mismos Extracto de por plasmólisis (debido a la - Contienen una gran inconvenientes de adición de gran cantidad de variedad en fuentes de composición que las levadura NaCl) o termólisis. nitrógeno (aminoácidos, melazas. péptidos,...) y carbohidratos. - Son bastante caras. Estados intermedios de Son más homogéneas en su - Su composición varía Peptonas degradación de proteínas composición que el extracto según el origen, pero dentro de diversos orígenes. de levadura. de una misma clase, hay pocas diferencias. Se usan mucho como sustratos para la producción de Harina de soja antibióticos, ya que son muy indicadas para los hongos y actinomicetos que efectúan dichos procesos Líquidos de Procede de industrias Contiene fuentes muy ricas de nitrógeno fácilmente maceración del alimentarias asimilables. maíz

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MÉTODOS DE FERMENTACIÓN A GRAN ESCALA
Es preciso conjugar los aspectos microbiológicos del sistema de producción con los puramente técnicos. A tener en cuenta: Aspectos microbianos Aspectos técnicos - Coeficientes de rendimiento de producción. - Eficiencia de la conversión del sustrato en - Velocidad de crecimiento del microorganismo (en producto (búsqueda de las condiciones óptimas). muchas ocasiones, predominante sobre el - Productividad lo más elevada posible. rendimiento). - Obtención del producto en la mayor concentración - Tasa de producción. posible, lo que facilita la recuperación y purificación. - Transferencia de materia y calor, de gran importancia, ya que diferencias mínimas pueden alterar gravemente la producción.

Modos de operación del biorreactor
1. Discontinuo. Es el más utilizado por su sencillez. Se trata de sistemas cerrados en los que no se varían externamente las condiciones iniciales (lo que supone que la composición del medio va variando continuamente en el tiempo conforme se desarrolla el cultivo), con la excepción de: a. Adición de antiespumantes, debido a que la espuma puede generar diferencias de temperatura y concentraciones dentro del tanque. b. Adición de oxígeno. c. Adición de buffers, para evitar las variaciones de pH originadas por la actividad microbiana, que pueden alterar el desarrollo microbiano y la producción. Semicontinuo. El sustrato se aporta de forma secuencial (no todo el sustrato es añadido al principio). Se debe a que, en ciertos procesos, la concentración de nutrientes ejerce efectos inhibitorios sobre el proceso o el crecimiento del microorganismo; lo que se evita haciendo un aporte secuencial de los nutrientes. Continuo. Se retiran productos y sustrato agotado al mismo tiempo que se aporta la misma cantidad de sustrato fresco. Para ello, cuentan con diversos sistemas que permiten conocer cuándo se obtiene el nivel de producción adecuado, para poder empezar a retirar caldo fermentativo e introducir sustrato fresco. Las células que quedan actúan como inóculos. Aunque teóricamente es el régimen de trabajo ideal, presentan numerosos inconvenientes técnicos. Estos inconvenientes son, entre otros, que sólo podemos conocer el nivel de crecimiento del microorganismo, y ciertos productos sólo se sintetizan en la fase estacionaria, por lo que no sabemos cuándo se habrá alcanzado el nivel de producción deseado. Además, las condiciones óptimas para el crecimiento y para la producción serán diferentes, lo que complica aún más el proceso.

2.

3.

Biorreactores
Están fabricados en materiales capaces de mantener las condiciones óptimas de presión, temperatura, etc., que en la mayoría de los casos es acero inoxidable. Los criterios básicos de diseño de un biorreactor son: Características bioquímicas del cultivo a realizar. Características hidrodinámicas del reactor: es necesario minimizar los fenómenos de transporte en el reactor, para evitar gradientes de nutrientes, temperatura,... Cinética de crecimiento y producción del microorganismo. Asegurar la estabilidad genética del microorganismo, impidiendo que se estimulen mutaciones. Esterilización lo más barata posible, hasta el punto de que, a pesar de su importancia, y según el proceso, se llega a obviar. Control de las condiciones ambientales. Diseño y modo de operación. Potencial para el escalado creciente de producción. Inclusión de sistemas de oxigenación adecuados a las exigencias del microorganismo.

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Sistemas de muestreo para determinar las condiciones internas del biorreactor. Adopción de refrigeradores, para mantener constantes las condiciones de temperatura (la actividad microbiana genera una gran cantidad de calor, que puede afectar negativamente a la producción). Materiales no tóxicos (ni para el microorganismo ni para el consumo). Capacidad para soportar altas presiones. Resistencia a la corrosión.

Los principales inconvenientes de la producción en continuo: En ocasiones, la demanda del producto es estacional, por lo que la producción en continuo genera grandes cantidades en stock. La vida útil del producto puede ser limitada, por lo que no es viable el almacenamiento por tiempo indefinido. Es más difícil obtener concentraciones altas, necesarias para la recuperación y purificación. Favorecen la mutación de las cepas, ya que un grupo de células puede participar en varios ciclos de producción.

Tipos de biorreactores
1. De lecho fijo o empaquetado. Los microorganismos se encuentran en una matriz empaquetada. Por lo general, la alimentación se produce de forma vertical en sentido ascendente. En columna de burbujas. El sustrato es el medio líquido en el que están inmersas las células, aportándose éste por la parte inferior del reactor. Se insufla gas comprimido por la parte inferior que, junto con una serie de bucles externos, permite homogeneizar el interior del reactor, suprimiendo posibles gradientes. De lecho fluidizado. No son muy corrientes, dados su alto coste y complejidad. El microorganismo permanece suspendido (debido a burbujeo continuo, lo que no es fácil de conseguir) en el fermentador, como consecuencia del sustrato líquido ascendente. De lecho de goteo. Son los más tradicionales (similares a los de lecho fijo). El sustrato se hace pasar lentamente por la matriz empaquetada que contiene al microorganismo (un proceso semicontinuo, aunque permiten trabajar también en discontinuo), lo que supone la consideración de un tiempo de residencia en dicha matriz. De enzimas o células inmovilizadas. Son los más interesantes y novedosos. Los de enzimas presentan grandes ventajas, pero es difícil aislar la enzima que nos interesa. Permiten reutilizar continuamente el biocatalizador, disminuyendo los costes. Dicha inmovilización puede efectuarse por medios físicos (adsorción, el más usado, o atrapamiento mecánico en matriz o membrana) o químicos (enlaces covalentes). Presentan el inconveniente de que, dado que las células pueden participar en varios procesos fermentativos, aumenta la inestabilidad genética.

2.

3.

4.

5.

Instrumentación y control del proceso
La información aportada por estas variables permite conocer la marcha del proceso fermentativo, y por lo tanto permite conocer las condiciones óptimas para la producción. 1. Temperatura. Influye en la cinética de las reacciones, y la estabilidad y actividad enzimáticas. En grandes fermentadores, es aconsejable disponer de diversos medidores. 2. pH. Afecta a la permeabilidad de la pared celular y al grado en que se producen las reacciones catalizadas por las enzimas presentes en ella. Los medidores son sencillos de manejar. 3. Oxígeno disuelto en el caldo de fermentación. Los aparatos instrumentales son de difícil esterilización y baja fiabilidad, por lo que se mide como diferencia entre los flujos de entrada y salida. 4. CO2. Se usan electrodos de membrana o técnicas espectrofotométricas o cromatográficas. 5. Sondas de enzimas inmovilizadas. Informan sobre el nivel de producción de un determinado metabolito. Se usan sensores situados cerca de las enzimas inmovilizadas de interés. 6. Biomasa. Se obtiene indirectamente por balances de materia. La información suministrada por el procesado de los datos obtenidos permitirá controlar el proceso de forma más eficiente, aumentando la productividad, producción y rendimiento.

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Escalado
Es el proceso de conversión de un proceso productivo de pequeña escala a escala industrial. Las condiciones de producción a pequeña escala no son, por lo general, extrapolables a la escala industrial, debido a que la fluidodinámica del sistema, los procesos de transporte y el comportamiento celular son diferentes. Por ello, se aplica un proceso gradual, manteniendo una velocidad de transferencia de oxígeno constante, así como la potencia consumida por unidad de volumen, al tiempo que el tamaño del cultivo se va aumentando en proporción 1:10.

Técnicas de esterilización
Del medio de cultivo
Se usan preferentemente métodos térmicos y filtros. 1.- Esterilización discontinua. Consiste en la inyección de vapor a la camisa del fermentador o los serpentines internos, o bien la aplicación directa del vapor sobre el medio de cultivo. Requiere grandes periodos de tiempo, es de alto coste (si no se puede reaprovechar el agua) y altera la composición del medio. 2.- Esterilización continua. Consiste en la obtención de altas temperaturas (140 oC) durante 120 s por inyección de vapor (intentando evitar su dilución) o cambiadores de calor (evitando la formación de depósitos de sales insolubles). Sus ventajas son que permiten reutilizar el agua y no alteran la composición del medio.

Del aire de fermentación
Se usan filtros profundos de lana de vidrio o de cartucho de fibra.

Proceso fermentativo
1. Preservación del inóculo por medio de prácticas de conservación que permitan que las cepas mantengan su capacidad biosintética. Éstas son, principalmente, el almacenamiento a baja temperatura (poco útil), congelación (aunque rápida, no es viable) o liofilización (consigue un mayor número de células viables al usar agentes protectores). Crecimiento del inóculo, que consiste en la recuperación de las células conservadas en condiciones adecuadas para su aplicación industrial. Precultivo, que consiste en obtener la cantidad suficiente de células para poder usar como inóculo en la fase de producción. Si esto no se consigue, se producen menores concentraciones de producto y unos mayores tiempos de retardo de los esperados. Estas cantidades son entre 0.1 y 3% para bacterias, de 5 a 10% para hongos y actinomicetos y de 1 a 500000 esporas por litro de cultivo. Producción. Se coloca el inóculo en contacto con los nutrientes que le servirán de sustrato y las condiciones en las que crecerá, estando éstas en los rangos: • Temperaturas para mesófilos (de 20 a 45 oC) y para sicrófilos (de 5 a 20 oC). • Entre 0.25 y 1 vvm de O2. • Sobrepresión (de 0.2 a 0.5 atm sobre la atmosférica), lo que evita las contaminaciones. • Agitación en función del tamaño del fermentador, ya que permite homogeneizar el medio de cultivo, pero si es demasiado alta puede inhibir el crecimiento bacteriano.

2. 3.

4.

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RECUPERACIÓN DE PRODUCTOS FINALES
Al finalizar la fermentación, el producto de interés se encuentra en el caldo de fermentación junto con numerosos compuestos que, en muchas ocasiones, presentan propiedades similares a éste, lo que complica la purificación del compuesto final. Estas características de los fluidos biológicos son: 1. Alta viscosidad y comportamiento no newtoniano del fluido, lo que dificulta la predicción de propiedades. 2. Baja filtrabilidad, pobre sedimentación y alta retención de agua. 3. Baja estabilidad térmica y química. 4. Tendencia a formar emulsiones. Así, los procesos de filtración constaran, generalmente, de las siguientes etapas: • Separación y rotura de células para el caso de que el producto se genere de forma intracelular; si no es así, no es necesario. • Aislamiento del producto. No se efectúa de un modo muy estricto, por lo que sólo consigue elevar en parte la concentración del producto. Permite facilitar la posterior purificación. • Purificación, donde se obtienen ya altas concentraciones de producto. • Acondicionamiento, esto es, desecación,... para comercializar o conservar el producto.

Separación de las células
Filtración
Se pueden usar dos tipos de filtros: de placa y malla (para volúmenes pequeños) o continuos de tambor rotatorio a vacío (para volúmenes grandes). También hay que tener en cuenta el diámetro de las partículas; así, se usa la ósmosis inversa para partículas de 10-4 a 10-3 µm o tamaño molecular inferior a 1000; la ultrafiltración para partículas de entre 10-3 a 0.1 µm o tamaño molecular superior a 1000; y microfiltración para tamaños de partícula de entre 0.2 y 10 µm. Las características de los filtros utilizados son: • Resistentes, selectivos y de un determinado tamaño de poro. • Que permitan una alta velocidad de flujo. • Con posibilidades de esterilización.

Centrifugación
Es más versátil, ya que se puede aplicar a más casos y condiciones que la filtración. Se usan sobre todo en panadería y producción de proteína unicelular (SCP). Los tipos de centrífuga más usados son: De filtro de criba. En ellas, las suspensiones se proyectan sobre un material filtrante, lo que impulsa la filtración a través de la membrana. De cámara y disco, que separan las partículas en función de su gravedad específica. Como las células son las más pesadas, se depositan en la parte inferior. La gran ventaja de este tipo de centrífugas es que, además, permiten efectuar separaciones líquido-líquido en función de la densidad.

Rotura celular
El proceso a seguir es: 1. Se diluyen las muestras en tampón. 2. Se efectúa entonces la rotura: a. Técnicas mecánicas (molienda). Consiste en molinos de cuchillo, bolas,...

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Técnicas físicas: ultrasonidos (rompen la estructura celular), desecación violenta, homogeneizadores de alta presión o procesos cíclicos de congelación-descongelación. c. Técnicas químicas: choque osmótico (plasmólisis de la célula al sumergirla en una solución muy salina), detergentes, ácidos, antibióticos, solventes,... d. Enzimas: lisozimas, autolisis (la célula sintetiza enzimas que degradan las cubiertas, lo que les provoca la muerte) o bacteriófagos (provocan la lisis celular al infectar la célula). Las características fisiológicas de cada organismo determinan el método más adecuado para su lisis (las bacterias Gram-, las levaduras y las células en fase estacionaria son más resistentes); aunque en industria se prefieren los molinos de bolas y los homogeneizadores de alta presión.

b.

Aislamiento preliminar
Se aplican tres métodos principalmente: 1. Extracción. Permite separar el producto en función de su solubilidad en diferentes líquidos inmiscibles. Dichos disolventes han de ser económicos, de baja volatilidad y viscosidad, no corrosivos y no alteren el producto. 2. Precipitación. Consiste en la adición de alguna sustancia en alta concentración o modificar las condiciones, de modo que se provoca la precipitación de compuestos. Así, por ejemplo, los polisacáridos pueden precipitar por adición de alcohol, las proteínas por alteración del pH más allá del punto isoeléctrico y en ocasiones por temperatura, aunque puede provocar alteraciones sobre el producto. 3. Adsorción. Se usa para metabolitos hidrofílicos (con capacidad para ionizarse). Consiste en hacer pasar el caldo de fermentación por resinas de intercambio iónico.

Purificación
Se utilizan principalmente técnicas cromatográficas, que aunque son caras, son muy eficientes e inertes para los compuestos. Los tipos de cromatografía usados son: • De exclusión molecular. • De afinidad (adsorción selectiva). • De inmunoadsorción, que usa el carácter antigénico de los productos y una matriz de anticuerpos específicos, lo que le permite una altísima selectividad. • De isoelectroenfoque, que consiste en modificación del pH hasta alcanzar el punto isoeléctrico de la proteína, que al no disociarse se fija a la fase estacionaria de la columna cromatográfica.

Secado
Es el punto final de la purificación en la mayoría de los casos. En el proceso no debe haber pérdida de actividad. El caso más extendido es el uso de calor húmedo, para posteriormente desprender la humedad por una corriente de gas. En el caso de que se requiera la presencia de células en el producto, se usa la liofilización.

Recuperación de productos de ADN recombinante
Los productos obtenidos por este tipo de técnicas muestran características que dificultan su recuperación, debido a que los mecanismos para obtenerlos son construidos de forma artificial, no han sufrido todas las transformaciones o tratamientos a los que serían sometidos en una célula normal, lo que obliga a un tratamiento posterior. Así, son procesos de separación muy complejos y costosos, pero dado el alto valor de los productos, son altamente rentables. Aun así, los microorganismos y condiciones de la fermentación deberían ser tales que se minimice la complejidad del proceso.

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Rendimiento
Las pérdidas producidas en la purificación del producto dependen del número de etapas de la purificación y la sensibilidad del producto frente a este tratamiento. Aun así, el coste del proceso de purificación suele ascender al 20% del total.

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PRODUCCIÓN DE ALCOHOLES
Dado que los residuos agrícolas son buenos sustratos para producir etanol (excepto el destinado a la alimentación), los países con grandes superficies cultivadas son los principales productores de etanol por vía microbiológica (EE.UU., Canadá, Brasil,...). A nivel industrial, se sintetiza por levaduras y bacterias: Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces fragilis o Zymomonas mobilis. Específicamente, la síntesis de etanol requiere de medios anaerobios, pero el crecimiento de las levaduras productoras necesita del oxígeno. Por ello, es necesario efectuar primero el crecimiento de las células en un medio aerobio para luego introducirlas en otro anaerobio y así comenzar la producción. Bioquímicamente, la síntesis se produce por acción de la enzima alcohol-deshidrogenasa sobre el acetaldehído obtenido por reacción del piruvato. Teóricamente, el rendimiento de la reacción es elevado: 0.5 g de alcohol por gramo de glucosa, con una efectividad del 91-95%. El etanol puede inhibir el crecimiento celular cuando se alcanzan concentraciones del 5%, o incluso el proceso de síntesis (cuando la concentración es del 10%). Para evitarlo, se puede efectuar destilación a vacío o limitar los nutrientes.

Procesos de producción de etanol
Preparación del sustrato
• • • • Si se usa Saccharomyces cerevisiae y se proporciona un sustrato almidonado, hay que adicionar amilasas o hidrolizar dicho almidón (este microorganismo no puede hacerlo). Otros materiales azucarados, como melazas, jugos azucarados,... son adecuados, pero se usan más para otros procesos. Celulosa: son difícilmente hidrolizables. Se usan cultivos mixtos sobre el sustrato sólido de la levadura en cuestión con Clostridium thermocellum, Clostridium thermosaccharalyticum o Trichoderma reesei, capaces de efectuar dicha degradación. Si se usan sueros lácticos, no se puede usar Saccharomyces, ya que es incapaz de degradar la lactosa. Se usan entonces cepas modificadas de Torula cremoris y Candida pseudotropoçicalis.

Fermentación
Se dan principalmente procesos discontinuos en tres fases: 1. Desarrollo celular: se somete el cultivo a fuerte oxigenación durante 12-24 horas. 2. Síntesis. Se reduce la oxigenación, lo que produce la reducción del crecimiento celular y el inicio de la producción durante 24-36 h. Como consecuencia del proceso, se libera calor, que puede elevar la temperatura hasta los 40 oC. 3. Se detiene la síntesis por aumento de la oxigenación, lo que vuelve a aumentar el crecimiento celular. Se puede prolongar hasta 72 horas. Las condiciones de operación en este proceso son: 30-35 oC pH = 4.5 3% de inóculo 600m3 Aumentos de temperatura y cantidad de inóculo, pueden reducir el tiempo de fermentación hasta lo 2 o 3 días. Debido a las condiciones anaeróbicas, se puede producir contaminación con bacterias lácticas, en particular, Leuconostoc, que sintetiza dextrano (un polisacárido), lo que aumenta la viscosidad y genera gradientes en el seno del caldo de fermentación. También se han desarrollado procesos en continuo (en desarrollo), siendo las condiciones en este caso: Se produce un mayor control de la temperatura y el pH. Se usan cantidades limitantes de glucosa (< 1g/l). Condiciones de microaerofilia (0.25-0.5 l/g de células). En estas condiciones, el proceso de producción continuo dura unas 18 horas.

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Purificación
El alcohol se obtiene por destilación. Primero, han de extraerse las células por sedimentación (generalmente) o centrifugación y se elimina el CO2 tras etapas de lavado. Entonces, se destila el caldo en columnas de rectificación.

Producción de acetona/butanol
Aunque descubierta por Pasteur, fue Weizmann poco antes de la 1ª G.M. quien estableció el proceso de producción microbiano, al estudiar la producción de butadieno para obtener caucho sintético. Durante la guerra, se usa esta acetona de origen microbiano en la producción de TNT, aunque tras la 2ª GM se prefiere la síntesis química. Los microorganismos usados para la síntesis de butanol generan también acetona, por lo que se obtienen ambos compuestos conjuntamente. Las especies usadas son todas del género Clostridium, caracterizadas por ser: • Bacterias anaerobias estrictas. • Generan esporas. Sintetizan butanol y otro compuesto (convertible en etanol), dependiendo de la especie usada: C. acetobutylicum Butanol + acetona C. butylicum Butanol + isopropanol C. butyricum Butírico + acético En la actualidad, la producción se efectúa con C. Butylicum en fermentadores de 12 · 90 m3, usando CO2, que además de proporcionar agitación, desplaza al oxígeno, generando condiciones de anaerobiosis. El proceso es de 36 horas de duración, y se produce en tres fases: 1. Formación de ácidos acético y butírico (18 h), lo que causa una drástica bajada del pH hasta 5.2. 2. Conversión de dichos ácidos en acetona y butanol (18 horas), con lo que sube el pH. 3. Finalización del crecimiento y estabilización del pH (5.8): otras 18 horas. Se extraen los productos por destilación fraccionada. Se pueden producir contaminaciones por bacterias lácticas, en especial Lactobacillus (lo que supone una disminución del rendimiento) o por bacteriófagos, que son más complicadas de tratar, ya que matan las células y detienen el proceso.

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PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS
Son ampliamente usados en alimentación, como acidulantes, saborizantes o ingredientes químicos. Así también, pueden producirse por vía microbiológica, síntesis química o extracción de productos naturales. La mayoría de los obtenidos microbiológicamente proceden del ciclo de Krebs, por lo que, en teoría, son muchísimos los microorganismos capaces de sintetizarlos, aunque sólo unos pocos en cantidades adecuadas para la aplicación industrial. Así también, sólo unos pocos de estos ácidos son más rentables producidos por vía microbiológica que por vía química. Los más importantes son: Ácido cítrico El más importante, ya que se obtiene únicamente por vía microbiológica. Ácidos acético y Son los segundos en importancia. Se pueden obtener tanto microbiológica como láctico químicamente. Ácidos málico y Son de escasa demanda e importancia. fumárico Ácidos itacónico Se prefiere la síntesis química, más sencilla y económica, ya que es más fácil obtener y glucónico de los microorganismos las enzimas que catalizan su formación que el producto en sí. Se obtiene en la fermentación del vino. Actualmente, está en desarrollo la producción Ácido tartárico a partir de Aspergillus o la bacteria Alcaligenes.

Ácido cítrico
Es el más importante, ya que sólo se obtiene por vía microbiológica y además es el más utilizado. Su sabor agradable y elevada solubilidad hacen que tenga diversidad de usos: • Alimentación: como acidulante, aromatizante, antioxidante y saborizante para productos dulces, como caramelos, helados, zumos,... • Farmacia: como preservante de la sangre, debido a sus propiedades antioxidantes. • Cosmética, como integrante de diferentes preparados. • Metalurgia, ya que muchos metales se extraen más fácilmente como citratos. • Detergentes, como sustituto de los polifosfatos. Esto es importante porque los polifosfatos son causantes de la eutrofización de las aguas dulces. La abundancia de N y/o P favorece un altísimo desarrollo de las algas, lo que causa una disminución enorme de oxígeno en el agua y, por tanto, la muerte de los organismos de dichas aguas. Al producirse la descomposición anaerobia de toda esa materia orgánica, los ríos y lagos se acaban convirtiendo en pantanos. Por ello, se prefiere el ácido cítrico (aunque más caro). • Química, como antiespumante y en la industria textil. Los procesos de fermentación se llevan a cabo con cepas modificadas genéticamente para aumentar la producción y disminución de compuestos colaterales, como los ácidos oxálico y glucónico. Las especies usadas son: • Aspergillus niger usando como sustrato sacarosa o melazas, hidrolizados de almidón, sueros lácteos, etc. Las condiciones de este sustrato son: o Limitación del fosfato. o Ausencia de cationes metálicos, ya que éstos pueden limitar la producción al superar los niveles traza. Esto se consigue por adición de ferrocianatos (con lo que los cationes precipitan como complejos) o usando resinas de intercambio iónico. • Candida lipolytica con parafina como sustrato, aunque está poco implantado.

Medio nutricional
• • La fuente de carbono ha de tener una concentración de azúcares del 15-25%. Para ello, se usan almidón de patata o hidrolizados de almidón (ambos requieren hidrólisis enzimática), jarabe de caña de azúcar, melazas o sacarosa. Minerales en las concentraciones adecuadas, sobre todo hierro, requiriendo unas condiciones diferentes para la fase de crecimiento y la de producción. Si no se dan las concentraciones adecuadas, la morfología del hongo no será la óptima y la producción se verá afectada.

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• •

Los requerimientos de pH varían de la fase de crecimiento (trofofase, pH de 5) a la idiofase (de producción, pH inferior a 3). Debido a las diferentes condiciones para idiofase y trofofase es difícil establecer un proceso de producción en continuo.

Procesos de producción
Procesos en superficie (o koji, del japonés).
Son más sencillos, pero requieren más mano de obra. Como sustrato sólido: • Trigo u otro cereal • Se dispone en capas delgadas (3-5 cm) donde se colocan las esporas • Se mantiene a pH entre 4 y 5 y 28 oC durante 90 horas. • Se procede a la extracción del ácido cítrico mediante 5 volúmenes de agua caliente. Como sustrato líquido: • Se usan sacarosa o melazas, complementadas con H2KPO4, MgSO4 y ZnSO4. • Se inoculan las bandejas con esporas (2-5 ·107 esporas / m2) • Se procede a incubación a 30 oC con pH entre 4 y 5. • Es necesario aportar suficiente oxígeno como para desplazar al CO2 producido, ya que éste inhibe la producción por encima del 10% de concentración. • Se mantiene la etapa de crecimiento durante 30 horas, y la de producción entre 8 y 14 días.

Procesos sumergidos o en profundidad.
Es más complejo, pero permite una mayor mecanización. Se opera en discontinuo o semicontinuo con alimentación fraccionada. Se usan fermentadores pequeños (menos de 250 m3), agitados o de columna de aire, construidos en materiales capaces de resistir pH’s ácidos sin liberar cationes metálicos (por lo general, se construyen en acero inoxidable). Dos factores importantes a tener en cuenta son: • La relación Fe/Cu ha de ser más controlada que en procesos koji para que el micelio adopte la forma adecuada. • Los niveles adecuados de oxígeno son menores (0.2-1 vvm).

Purificación
Se efectúa en pasos: • Se retira el micelio del hongo. Como el ácido cítrico estará atrapado en el micelio (debido a la alta densidad de éste), se efectúa un lavado previo a la precipitación o filtración para retirar dicho micelio. • Adición de cationes calcio a pH 3, lo que hace que precipite oxalato cálcico. • Extracción del ácido cítrico a pH neutro con temperaturas entre 70 y 90 oC, lo que hace que se pierdan los componentes volátiles interferentes. • Al adicionar ahora calcio, precipita citrato cálcico. • El citrato se purifica mediante resinas de intercambio iónico, lo que permite obtener el ácido cítrico.

Ácido acético
Es el principal componente del vinagre. Es sintetizado por dos géneros de bacterias: Acetobacter aceti Acetobacter Son cepas superoxidantes, capaces de oxidar el producto hasta CO2 y agua. pasteureanus Acetobacter peroxidans Gluconovçbacter Finalizan el proceso con la obtención del ácido acético, sin una oxidación oxydans mayor.

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Producción
Método Orleans
Es el más tradicional. Son los más costosos, y su producción es baja.

Método alemán
Basado en procesos tradicionales, su producción es poco satisfactoria.

Generadores por goteo o reactor Frigs
Se usan capas de virutas de haya sobre las que se adhieren las bacterias (en cierto modo, es precursor de los sistemas de células inmovilizadas). Sobre dichas capas de virutas se gotea el sustrato El sustrato usado es: • Un líquido de alto contenido alcohólico (vino, malta o sidra de baja calidad). • Hidrolizados de patatas o cereales, o bien alcohol técnico, que dado que son deficitarios en otros nutrientes, necesitan suplementos: o fosfato amónico o sulfato magnésico o citrato y pantotenato cálcicos o hidrolizado de cereal Es de reducido coste y ocupamiento del espacio. Aporta un buen rendimiento (14%).

Procesos sumergidos
En este caso, son menos interesantes que para el ácido cítrico. Requiere unos fuertes niveles de oxigenación, lo que constituye su principal problema, ya que el proceso se detiene si el nivel de oxígeno es inferior al 5%. Presenta la ventaja de que con un coste mínimo obtiene una elevada eficacia. Las células se eliminan por filtración. Posteriormente, se añade ferrocianuro potásico, lo que permite sustraer los subproductos responsables de colorear el ácido acético.

Ácido láctico
Fue el primer ácido obtenido por fermentación. Se usa principalmente en alimentación (acidulante y saborizante, además de hallarse de forma natural en productos lácteos) y en farmacia. Según las características metabólicas de los microorganismos productores, se distingue entre homofermentadores (sólo producen ácido láctico, por lo que son preferibles) y heterofermentadores (producen, además, otras sustancias). Las especies utilizadas preferentemente son: Lactobacillus Usa residuos líquidos de la industria papelera (licor de cocción del sulfito) como pentosus sustrato. Lactobacillus Usa sueros o suero desproteinizado procedentes de la industria láctea, sobre todo bulgaricus de la producción de quesos. Se usan procesos continuos, discontinuos y con células inmovilizadas, manteniendo altas temperaturas (45-50 oC) y pH entre 5.5 y 6.5.

Ácido málico
Se usa en alimentación como acidulante. Se obtiene por síntesis química (preferentemente, ya que es más barata) o enzimática (tradicionalmente, a partir de extractos de zumo de manzana, dada su riqueza en este compuesto) a partir de ácido fumárico. La síntesis microbiológica usa: Aspergillus Con glucosa, sales y carbonato cálcico. Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium flavum

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Ácido fumárico
Debido a su baja higroscopicidad (tendencia a captar agua), se usa en bebidas deshidratadas y revestimientos de golosinas (evita la entrada de agua a alimentos), como colorante (fija el color de la carne), emulsificante, suavizante, acidulante y saborizante. Paralelamente, su baja solubilidad limita otras aplicaciones (lo que se evita por adición de compuestos que aumentan su solubilidad). Se obtiene a partir del hongo Rhyzopus oryzae usando como sustratos derivados de soja o arroz.

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PRODUCCIÓN DE NUCLEÓTIDOS, AMINOÁCIDOS Y VITAMINAS
Su principal uso se da en alimentación, como potenciadores del sabor (nucleótidos y aminoácidos) y para aumentar la calidad nutricional. Su importancia es creciente, debido a la tendencia a sustituir los aditivos químicos por otros naturales. Por ello, aunque los productos microbianos son más caros, se usan con preferencia. Estos productos también podrían obtenerse de los vegetales, con una producción similar; sin embargo, la vía microbiana presenta la ventaja de ser más fácil de mejorar y optimizar. Así, los esfuerzos se centran en incrementar la competitividad de las fermentaciones por mejora de procesos de fermentación y purificación.

Nucleótidos
Por sí mismos no confieren sabor, pero incrementan los sabores presentes (lo que se conoce como efecto umami). Sin embargo, no todos presentan esta cualidad, sino sólo los derivados de la purina (las pirimidínicas no tienen esta propiedad), en concreto, el IMP (inosin-mono-fosfato) y el GMP (guanosin-mono-fosfato).

Hidrólisis enzimática del ARN.
Es la más utilizada, sobre todo en Japón. Se usan levaduras con alto contenido en ARN, que se cultivan hasta el final de la fase logarítmica de crecimiento (principio de la fase estacionaria), ya que entonces detienen la biosíntesis estructural. Las cepas usadas son principalmente Candida utilis o Saccharomyces cerevisiae. Se extrae el ARN usando agua caliente de pH alto (con lo que el ARN pasa a la disolución), y posterior adición de HCl (preferentemente) o etanol, lo que provoca la precipitación de este ARN. Entonces se deshidrata el producto. Se produce entonces la hidrólisis enzimática, con lo que tenemos los nucleótidos sueltos en disolución. Adicionamos carbón activo, con lo que se adsorben sobre éste. Por elución selectiva con una solución de metanol-amonio, eliminamos los nucleótidos pirimidínicos, con lo que nos quedamos con AMP y GMP. El GMP es producto, y el AMP se desamina por cultivo con Aspergillus oryzae, con lo que se obtiene IMP. Se separan los nucleótidos por cromatografía de intercambio iónico.

Hidrólisis química del ARN.
El ARN se obtiene igual que en la hidrólisis enzimática. Se degrada el ARN hasta obtener los nucleótidos mediante Ca(OH)2 y 130 oC durante 3-4 horas. El resto del proceso es similar, con la salvedad de que es preciso efectuar una fosforilación posterior.

Fermentación del IMP.
Se produce la inosina usando auxotrofos de Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes y Microbacterium que tienen bloqueada la síntesis de nucleótidos. Este proceso es de un alto rendimiento (se obtienen 30-35 g/L). El hecho de usar auxotrofos que sólo sintetizan inosina es para evitar la regulación por producto final. La inosina producida se somete a pH básico (aprox. 11), con lo que precipita y cristaliza. Se produce la fosforilación, con lo que se obtiene el IMP.

Fermentación del GMP.
Síntesis indirecta:
Se obtiene AICAR (5-amino-4-imidazol carboxamida ribosa) con cepas auxotrofas para la purina y mutadas en determinadas actividades enzimáticas (lo que facilita la acumulación sin inhibición). Se favorece la excreción del AICAR (intracelular) al caldo fermentativo: • Adición de una fuente de purina, lo que permite que se siga sintetizando AICAR hasta que la célula lo va expulsando por exceso.

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Adición de un inhibidor ante la esporulación (como ácido butírico o reducción del oxígeno, que evita un rápido agotamiento de los nutrientes, por lo que evita la esporulación).

Síntesis directa
Es el menos usado. Se usan mutantes de Bacillus subtilis en los que se ha aumentado el número de copias del gen que codifica la enzima del paso limitante de la ruta de producción de guanosina (con lo que aumenta el número de enzimas del proceso y la producción aumenta). Se obtiene guanosina, lista para el consumo tras fosforilarla.

Aminoácidos
Se usan sobre todo en alimentación (potenciadores de sabor, antioxidantes, edulcorantes, complemento nutricional,...) y en algunos productos cosméticos y farmacéuticos. Todos se pueden obtener por vía microbiana, destacando glutamato, metionina y lisina.

Glutamato
Se usa mucho como potenciador de sabor para la comida china. El proceso de producción es: 1. Se usa Corynebacterium glutamicum (el más usado) y Brevibacterium flavum, usando glucosa y sacarosa como fuentes de carbono. 2. En el caso del Corynebacterium, es incapaz de completar el ciclo de Krebs, lo que supone que muchos de los productos que de él se derivan siguen rutas alternativas y, como consecuencia, se acumula ácido α-cetoglutárico. Debido a su similitud estructural, se transforma fácilmente en ácido glutámico, precursor del glutamato. 3. Se facilita la excreción de ácido glutámico por adición de biotina al medio, con lo que se puede extraer el ác. glutámico y purificar. 4. El proceso se realiza en discontinuo, a 38 oC y pH de 7.8. Con una duración de 30-35 horas se obtienen del orden de 100 g/L.

Otros aminoácidos
Aspartato Alanina Cisteína Fenilalanina combinado con aspartato Triptófano combinado con histidina Metionina Lisina Treonina Triptófano Otros Se usan como potenciadores del sabor y edulcorantes, ya que endulzan pero no dan aporte calórico (sobre todo para zumos). Se usa sobre todo como antioxidante en zumos. Forman el aspartamo, un dipéptido usado como edulcorante sin proporcionar aporte calórico. Se usa como antioxidante de la leche en polvo.

Se usan como suplementos en derivados de cereales o en complejos nutricionales.

Se obtienen: • A partir de hidrolizados de proteínas, aunque poco rentable, la única vía para obtener cisteína, cistina, leucina, asparagina y tirosina. • Por síntesis química, que requiere de separación enzimática posterior, ya que se obtienen mezclas racémicas y sólo una de las formas es la activa. • Biotransformación enzimática. • Fermentación microbiana con mutantes de Corynebacterium, Brevibacterium y Esclerychia coli, para permitirles degradar sustratos baratos (como glucosa, hidrolizados de almidón o n-parafinas) y mejorar la producción.

Vitaminas
Hay muchos microorganismos capaces de sintetizar todas las vitaminas necesarias para los humanos, pero sólo B2 y B12 son de síntesis microbiana rentable frente a la síntesis química.

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El organismo las utiliza principalmente como coenzimas en la mayoría de los casos, por lo que son indispensables para muchos procesos.

Riboflavina (B2)
Interviene en reacciones metabólicas redox y del metabolismo energético. Se encuentra en lácteos, verduras, hígado y suplementos nutricionales. Se emplea en suplementación de derivados de cereales y productos dietéticos. Hay tres vías de síntesis: 1. Síntesis química completa. 2. Síntesis mixta (el más usado), usando Bacillus subtilis como productor de ribosa, que se transforma químicamente en riboflavina. 3. Síntesis microbiana. a. Con Ashbya gossypii (hongo), usando aceite de soja o maíz complementados con glicina y purinas (estimulan la producción). Es la más tradicional, con rendimientos de 6-7 g/L. b. Con otros microorganismos (Candida flareri, Saccharomyces cerevisiae o Bacillus subtilis), se adaptan a una fuente de carbono concreta, con lo que los procesos se hacen muy específicos, y la producción es muy variable (de 21 g/L de Candida a 4.5 g/L de Bacillus).

Cobalamina (B12)
Sólo se obtiene por vía microbiana, ya que la síntesis química es muy compleja y poco rentable. Químicamente, presenta una estructura central fija, pero los sustituyentes constituyen varias formas, de las que la activa es la cianocobalamina. 1. Propionibacterium. a. Primera fase: anaeróbica. En ella se sintetizan los precursores de la vitamina. b. Segunda fase: aeróbica. En ella se sintetiza la cobalamina siempre que se aplique el adecuado tratamiento térmico en presencia de cianuro. 2. Pseudomonas denitrificans. Se obtiene el mayor rendimiento. Sin embargo, está sujeto a patentes, por lo que no es rentable. 3. Bacillus megaterium, en experimentación.

Ácido ascórbico (C)
Se utiliza como suplemento en bebidas y como antioxidante de productos envasados. La síntesis más usada es: 1. La glucosa se convierte químicamente en sorbitol. 2. El sorbitol es transformado en sorbosa por acción del Acetobacter suboxydans. 3. La sorbosa es modificada químicamente hasta obtener ácido ascórbico. Hay microorganismos capaces de sintetizar la vitamina completamente (el alga Chlorella pyrenoidosa y la levadura Candida norvegensis), pero son menos rentables que los procesos químicos. En la actualidad, se están ensayando procesos en los que obtener intermediarios a partir de desechos contaminantes como sustrato.

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PRODUCCIÓN DE ENZIMAS
El interés por los procesos enzimáticos se debe a varios factores: • No necesitan condiciones especiales de temperatura y presión (los valores ambientales). • Requieren menos energía (tecnologías sencillas y ahorro al no necesitar altas temperaturas ni presiones). • Presentan una mayor especificidad y con mayores rendimientos frente a estereoisomería, ausencia de compuestos colaterales, etc. • Permiten el trabajo en sistemas no acuosos. • Son de bajon impacto ambiental, ya que no generan ni compuestos colaterales ni residuos de riesgo. Se clasifican en: Oxidorreductasas Efectúan procesos redox y transferencias de O, H o electrones. Transferasas Transfieren grupos químicos. Hidrolasas Hidrolizan moléculas. Liasas Rompen enlaces en procesos no redox ni hidrolíticos. Isomerasas Interconvierten isómeros. Ligasas Forman enlaces mediante el gasto de ATP. Pueden tener distintos orígenes, pero es preferible el microbiano, ya que su producción es mayor y más económica, y con menos problemas de purificación. Los principales usos de las enzimas son: detergentes, lácteos, procesado del almidón, textil, papel, investigación biotecnológica (enzimas de restricción, clonación,...).

Producción comercial
Selección de cepas
Los métodos de selección utilizados deben permitir diferenciar las especies capaces de producir una enzima basándose en determinados medios de cultivo, dando información sobre las características de la enzima (condiciones óptimas de funcionamiento: temperatura, pH,...) y sus niveles de producción. El grupo microbiano más usado al respecto son los microorganismos termófilos o termorresistentes, que necesitan altas temperaturas para crecer (70-90 oC), por lo que sus enzimas son de gran interés, ya que pueden ejercer su función a estas temperaturas. Dentro de este grupo, es preferible buscar microorganismos de calidad GRAS, que son las autorizadas legalmente para utilizarse en alimentación y medicina, dada su inocuidad para el organismo humano y el medioambiente. Hay que tener en cuenta la mejora y adecuación de las características del proceso de producción al microorganismo, sobre todo si la enzima producida no es de origen microbiano. Por ello, es necesario recurrir a manipulación genética para favorecer los inductores de la producción (se prefiere intentar que la modificación consiga obtener la enzima sin necesidad de presencia de inductores) e inhibir la producción de otras enzimas y procesos.

Procesos de producción
Sobre sustrato sólido (procesos Koji)
No son muy apropiados, salvo para procesos con hongos, ya que el control de temperatura, aireación y humedad es difícil, además de que son muy propensos a las contaminaciones. Se usa como sustrato salvado, paja de trigo, cáscara de arroz, pulpa de caña de azúcar o bagazo (medios sólidos o semisólidos porosos y sin agua libre), dispuestos en bandejas.

Procesos en biorreactores
Son más fáciles de automatizar al tratarse de medios líquidos y, por lo tanto, será más fácil el controlar las variables ambientales. Se usan sustratos de bajo coste, como melazas, cereales, hidrolizados de almidón o lactosa, junto con soja, cacahuete, hidrolizados de levadura o geletina complementados con P, S y Ca. Para el control del pH, se adiciona algún tamponador, por lo general, solución de fosfato (que a la vez acúta como suplemento de fósforo).

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Aplicaciones
Detergentes.
Se usan proteasas principalmente, paa aumentar la eficacia del detergente para atacar manchas con componentes proteicos. Otras ventajas son la disminución de los costes energéticos (al requerir temperaturas menores) y su carácter biodegradable, a diferencia de los fosfatos, por lo que minimizan el impacto ambiental. Este uso de las enzimas comenzó en los 50, aunque actualmente las utilizadas son más resistentes a la temperatura y el pH. Las enzimas más utilizadas son: • Subtilisina (una proteasa), procedente de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis. • Amilasas. • Lipasas.

Producción de quesos.
La enzima utilizada es la renina o quimosina. Produce la proteolisis parcial de la leche, que conduce a la formación de la cuajada y, posteriormente, al queso. Anteriormente, se obtenía a partir del rumen de los rumiantes, con uan producción bastante baja. Los microorganismos permiten obtener enzimas de las mismas características que las animales, obteniéndose principalmente de hongos (Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusilis, Aspergillus nidulans o Aspergillus niger), debido a su mayor facilidad para la manipulación genética. Actualmente, se estudian procesos usando Esclerichia coli o Kluyveromyces lactis. Se utilizan también distintas lipasas, que al degradar ácidos grasos generan compuestos que otorgan sabor a los lácteos.

Procesado del almidón
Los hidrolizados de almidón se utilizan en alimentación como edulcorantes y en clínica, sobre todo. Los tipos de enzimas más utilizados son: • α-amilasa, que degrada el almidón en glucosa, maltosa y maltotriosa, por lo que se usa para la fabricación de siropes y en las industrias cervecera y panadera. Se obtiene principalmente de hongos y Bacillus. • Glucoamilasa, que hidroliza el almidón totalmente hasta glucosa. Se obtiene a partir de Aspergillus niger y Rhizopus. • Glucosa isomerasa, que convierte la glucosa en fructosa, por lo que se usa para producir edulcorantes bajos en calorías y jarabes de alto contenido en fructosa (HFCS). Se obtiene de Bacillus y Streptomyces. • Invertasa, que hidroliza la sacarosa en fructosa y glucosa, y se usa para producción de siropes y chocolates. Se obtiene de Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger y Aspergillus oryzae. • β-galactosidasa, que degrada la lactosa en glucosa y galactosa, por lo que se usa en la fabricación de alimentos para personas no tolerantes a la lactosa, edulcorantes y helados. Se obtiene de Kluyveromyces marxianus, Aspergillus niger y Aspergillus oryzae.

Industria papelera.
Se usan para degradar los principales componentes de la madera, lo que permite reducir el impacto ambiental de esta actividad (se generan residuos muy contaminantes) y mejoran la textura y aspecto del papel. Se usan celulasas, hemicelulasas, pectinasas y lipasas.

Elaboración de zumos.
Se trata de pectinasas, que actúan sobre la pectina, uno de los principales componentes de la materia vegetal, clarificando y licuando el zumo. Se obtiene de Aspergillus niger y Penicillium.

Elaboración de vinos.
• • • β-glucanasas. Eliminan los β-glucanos aparecidos en la fermentación de vinos procedentes de uva infectada por Botrytis cinerea. Celulasas y glicosidasas. Degradan la materia sólida presente en el caldo de fermentación del vino (pellejos, restos de pulpa,...), mejorando el color y el sabor, respectivamente. Glucosa oxidasas evitan daños sobre vinos, cervezas y zumos por acción del oxígeno. Se obtiene de Aspergillus niger y Penicillium.

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Industria textil
• • • Amilasas y celulasas se usan en el tratamiento de tejidos vegetales, para retirar el almidón. Celulasas se usan para dar el aspecto de lavado a la piedra de vaqueros. Proteasas y lipasas se usan para el procesado de pieles: lavado, pelado, desengrasado y pelado.

Síntesis orgánica.
Se usan para la síntesis de compuestos quirales puros, al obtener productos estereoquímicamente puros, evitando la separación de mezclas quirales y compuestos colaterales, y aumentando la pureza. También son muy útiles para la obtención de productos farmacéuticos.

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PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA DE ANTIBIÓTICOS
Un antibiótico es una sustancia producida por microorganismos, y derivada de su metabolismo secundario, capaz de inhibir el crecimiento de otros microorganismos en concentraciones relativamente bajas. Si el producto tiene el mismo efecto, pero no es de origen microbiano, se le llama quimioterápico. Se descubrieron accidentalmente hacia los años 20, fecha en que Alexander Fleming descubrió la penicilina por contaminación de un cultivo de Streptococcus con Penicillium. Sin embargo, fue Florey quien, más tarde, se propuso investigarlos. Durante la 2ª G.M. se produjo un importante desarrollo, que ha ido ampliando el número de antibióticos conocidos, hasta llegar a los 8000 que se conocen hoy día. Sólo 123 se obtienen actualmente por vía microbiana; la mayoría se obtiene por modificación química de productos microbianos. Las principales especies productoras son bacterias (Bacillus), hongos (Aspergillus y Penicillium) y actinomicetos (Streptomyces). Los usos más típicos de los antibióticos son: • Control de actividades infecciosas: o En plantas, no se suele usar porque es más factible y económico el uso de agroquímicos y fitosanitarios. o En animales, aparecen resistencias. Debido a las características reproductivas de los microorganismos, pueden aparecer mutaciones que otorguen a los microorganismos resistencia frente a la acción de los antibióticos, que se extiende rápidamente. • Control de tumores, debido a la capacidad de algunos antibióticos de controlar el crecimiento de las células tumorales. • Alimentación, para evitar el deterioro de los alimentos. Sin embargo, esto puede hacer más acusada la aparición de resistencias, por lo que se impone una legislación restrictiva. Por ello, se están sustituyendo por bacteriocinas de origen microbiano, que son menos agresivas y, por tanto, crean menos resistencias. • Investigación bioquímica, para selección de poblaciones. • La búsqueda de nuevos antibióticos es cada vez más difícil y costosa, pero continúa siendo rentable por la ausencia de compuestos efectivos frente a ciertas especies patógenas.

Antibióticos β-lactámicos
Se caracterizan por contener un anillo de ácido β-lactámico, lo que los dota de actividad frente a bacterias gram+ por inhibición de la síntesis de la pared celular. Sus principales características son: • Presentan una baja toxicidad para el organismo, por lo que los efectos secundarios son inexistentes o muy leves. • Presentan dos problemas acusados: 1. En condiciones ácidas no son efectivos. 2. Ciertas especies son capaces de sintetizar β-lactamasas, por lo que son resistentes a este tipo de antibióticos, ya que hidrolizan el anillo, la estructura activa principal de la molécula.

Penicilinas
Se obtienen de cepas de Penicillium y Aspergillus. En función de su origen, se clasifican en: 1. Naturales, obtenidas directamente de la fermentación microbiana. 2. Biosintéticas, caracterizadas por el aumento de la actividad por medio de la incorporación de grupos químicos al anillo central. Se obtienen añadiendo precursores del grupo a incorporar al antibiótico en el caldo de fermentación. 3. Semisintéticos, obtenidos por modificación química del producto microbiano. El proceso de síntesis más destacado es el de las penicilinas G y V, obtenidos por vía biosintética, pero diferenciados por la cadena lateral (ácido fenilacético para G y ácido fenoxiacético para V). Las características del proceso (discontinuo) son: 1. Los volúmenes de los biorreactores son pequeños, debido a que los microorganismos demandan una gran cantidad de oxígeno en la fase de crecimiento; los valores más usuales son un volumen de 40 a 200 m3 con una oxigenación de 0.5-1 vvm. 2. Recuperación del Penicillium chrysogenum esporulado y liofilizado. Esta etapa es importante, ya que de ella depende el compactamiento o no del micelio: si el micelio es compacto, disminuyen los rendimientos en la fase de producción. 3. Fermentación, realizada en dos etapas:

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4.

Fase de crecimiento. Se aporta un gran volumen de oxígeno durante unas 40 horas. Producción. Durante 120-160 horas. El sustrato es principalmente: i. lactosa y líquidos de maceración del maíz (o, en su defecto, glucosa o melazas y harina de soja, extracto de levadura o suero). ii. pH 6.4 y ácido fenilacético (G) o fenoxicético (V). Extracción del producto con acetato de amilo o acetato de butilo, a 0 oC y pH de 2.5-3.

a. b.

Cefalosporinas
Se descubrieron primero en Cephalosporium acremonium, aunque se obtienen también de Paecilomyces, Streptomyces (el más usado actualmente) y Nocardia. Su principal característica es, además de su similitud con las penicilinas, su amplio espectro de aplicación. En la actualidad, se usan derivados semisintéticos de 2ª y 3ª generación (una o dos modificaciones químicas, respectivamente, lo que permite aumentar la eficiencia o recuperar una actividad perdida por aparición de resistencias). El proceso de producción es: • El sustrato es glucosa y sacarosa, líquidos de maceración del maíz, extracto de carne (complemento) y acetato amónico. • La fermentación se produce a 24-28 oC y pH 7, con una fase de crecimiento de 90 horas con alta aireación, seguida de otra de producción de 90-160 horas.

Nuevos productos
Se obtienen por adición de compuestos que confieren protección al anillo frente a las enzimas, manteniendo su actividad o reforzándola. Destaca el ácido clavulánico, usado con la amoxicilina. Aunque no es un antibiótico en sí, este compuesto confiere resistencia a la degradación. Se obtiene de Streptomyces clavuligerus.

Antibióticos peptídicos
Destacan los lineales y cíclicos, sintetizados mayoritariamente por Bacillus y Streptomyces. Sus características son: • Son activos frente a gram- por inhibición de la síntesis de la pared celular. • Son tóxicos, por lo que su uso está restringido a casos concretos. Destaca la bacitracina, producida por Bacillus licheniformis en procesos de superficie antiguamente, aunque ahora se sigue un proceso más complejo. 1. Cultivo de mantenimiento a 37 oC durante 18-24 horas. 2. Recuperación de las esporas. Se usan recipientes de 1 L con sólo 200 mL de medio líquido (peptonas), debido al alto requerimiento de oxígeno necesario (aunque es una especie anaerobia facultativa, o sea, capaz de crecer anaerobiamente). Se aplica durante 6 horas. 3. Prefermentación. Se pasa a reactores de 800 L con una fuerte agitación (proporciona oxigenación) con el mismo medio de cultivo. 4. Segunda prefermentación. Se efectúa en reactores de 3000 L, pero se usa como sustrato sacarosa, harina de soja, sulfato amónico y carbonato cálcico. 5. Fermentación con el mismo sustrato anterior (con el doble de glucosa), en fermentadores de 90 m3 durante 30 horas.

Antibióticos carbohidratados
Los más destacados son los aminoglucosídicos (oligosacáridos unidos a aminosacáridos). Se caracterizan por: • Son muy comunes: estreptomicina, ... • Son específicamente activos frente a gram- por inhibición de la síntesis proteica. • Son tóxicos, y pueden causar daños en riñón y oído. • Desarrollan resistencias rápidamente. El proceso de producción es: 1. Se usa glucosa complementada con almidón o dextrinas y harina de soja, además de NaCl, Co, Zn o Mn, según el antibiótico. 2. Fermentadores de 150 m3, 0.5-1 vvm oxígeno, 28-30 oC y pH neutro durante 4-7 días.

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3.

El producto es extracelular, por lo que se separa por columnas de intercambio iónico. Si está adherido a las células, se separa por adición de ácido sulfúrico hasta pH 2-2.5.

Antibióticos macrolídicos
Contienen un anillo lactónico, lo que les da su carácter hidrofóbico y básico. Son eficaces frente a gram+ y son poco tóxicos, pero son poco demandados porque se prefieren las penicilinas de tercera generación. Actúan inhibiendo la síntesis de proteínas. Destaca la eritromicina. El proceso de producción es: • El sustrato es glucosa, harina de soja, sulfato amónico, cloruro sódico y carbonato cálcico, aunque se puede emplear extracto de levadura, aceites o almidón. • El proceso es aerobio y sumergido, usando Streptomyces erithreus. • Por lo general, se efectúan a pH básico durante 3-7 días a temperaturas de 25-28 oC, con excepción de la eritromicina (33 oC).

Tetraciclinas
El primero descubierto fue la tetraciclina, descubierta de Streptomyces viridofaciens, aunque actualmente se usa más S. aureofaciens. Por lo general, se obtienen por procesos biosintéticos. Son activos frente a gram+ y gram- por inhibición de la síntesis proteica. La producción se efectúa en fermentadores agitados de 150 m3 con glucosa o almidón y alta oxigenación (1vvm) durante las primeras 12 horas. Es importante limitar el fosfato en el medio, ya que actúa como inhibidor.

Antibióticos aromáticos
Cloranfenicol
Es muy activo y eficaz, pero puede causar lesiones en la médula ósea, por lo que su uso está restringido. Tiene un amplio espectro de aplicación, debido a que detiene el proceso de traducción (síntesis de proteínas). Sus usos más destacados son: • Tratamiento de las salmonelosis. • En biología molecular, ya que detiene la traducción, pero no la replicación del DNA. • En medios de cultivo para hongos, evitando el crecimiento de las bacterias.

Griseofulvina
Es uno de los pocos antibióticos efectivos contra hongos. Se obtiene de Penicillium patulum por procesos aeróbicos. El sustrato es rico en glucosa, con nitrato de sodio y cloruro potásico. El proceso se efectúa durante 7-9 días, a 25 oC, pH neutro y 1 vvm.

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PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA DE VACUNAS
Fueron descubiertas por Jenner hacia el siglo XIX por estudios de incidencias de la viruela en personas afectadas de vacuna, una enfermedad similar pero que afectaba a las vacas, de efectos más leves. Esto supuso la aparición de una idea intuitiva de inmunización frente a la viruela por padecer dicha enfermedad. La utilización de las vacunas presenta ciertas ventajas frente a los quimioterápicos, debido a que es más barata su aplicación en masa para prevenir que la de los quimioterápicos para curar; y además permiten controlar la enfermedad de una forma mucho más eficaz, pudiendo incluso erradicarla.

Métodos de producción
Sistemas tradicionales
Consisten en la obtención de la vacuna mediante el cultivo del patógeno. 1. Vacunas vivas. Son células con la capacidad patógena atenuada, obtenidas bien por conservación durante largo tiempo o por cultivo en medios no apropiados. Presentan un importante inconveniente: el acceso del patógeno al organismo puede desencadenar la enfermedad si, por alguna razón, recupera su capacidad patógena, debido a que el sistema inmunitario del hospedador sea demasiado sensible o el microorganismo esté poco atenuado. 2. Vacunas muertas. Consisten en células muertas o proteínas tóxicas (toxoides) desactivadas. El principal inconveniente es la posibilidad de aparición de reacciones (más leves que en vacunas vivas), debidas a: a. Posibilidad de que no todas las células estén muertas. b. La enfermedad no sea causada por la actividad de las células, sino por alguna sustancia de su estructura, como por ejemplo los lipopolisacáridos de las bacterias gram-. Los principales problemas de estos sistemas son: • No todos los patógenos se pueden cultivar en laboratorio. • En las vacunas vivas existe el riesgo de la reversión (recuperación de la capacidad patógena), lo que ocasiona la enfermedad. Ésta también puede producirse si se introducen otras especies patógenas (sobre todo en vacunas víricas, donde la contaminación es muy difícil de controlar) o el hospedador presenta inmunodepresión (sistema inmune débil). • En las vacunas muertas, las endotoxinas de las bacterias gram- pueden provocar reacciones.

Vacunas de subunidades (técnicas de ADN recombinante)
En muchos casos, la capacidad para provocar la respuesta inmune no es la célula completa, sino una parte de su estructura (por lo general, proteínas, de una o varias subunidades). El fundamento de estas vacunas es que, obteniendo dichas subunidades de las proteínas, sería posible provocar la respuesta inmune sin necesidad de inocular el microorganismo entero. Este método presenta ventajas: 1. Evita riesgos para el personal de producción, debido a que no es necesario manipular organismos patógenos vivos. 2. Se pueden obtener mejores resultados que con las tradicionales, por efectos colaterales de otras sustancias. 3. Permite obtener vacunas para patógenos que no se pueden cultivar en laboratorio, ya que sólo se requiere de ellos su material genético. Sin embargo, presenta ciertas dificultades importantes: • No se pueden obtener grandes cantidades de producto, debido a la baja traducción del material genético patógeno. • Las proteínas obtenidas no son suficientemente activas. Esto se debe a que las proteínas obtenidas presentan plegamientos inadecuados, lo que origina una modificación de la estructura original. Para evitarlo, se recurre al uso de hibridomas, que consisten en un híbrido entre una célula tumoral y otra de un tipo determinado. Esto supone una alta concentración de proteína activa (ya que se genera en el interior de una célula viva, no en laboratorio, lo que facilita que su estructura se acerque a la real), debido al rápido y constante crecimiento del hibridoma.

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En ocasiones, generan una escasa respuesta inmune, corta y débil, por lo que no constituyen una vacuna efectiva. Para paliar este efecto: i. Aumento de la concentración de antígenos, mediante el uso de adyuvantes. Éstos son sustancias portadoras del antígeno (en general, un adyuvante es una sustancia que favorece la acción de otro compuesto). En muchos casos, se usan estructuras del propio patógeno, ya que la unión entre ambas estructuras está más favorecida. ii. Tembién se puede aportar el antígeno usando un virus o bacteria atenuados. Esto favorece la multiplicación del antígeno, generando una mayor respuesta inmune. Sin embargo, vuelve a presentar el inconveniente del trabajo con patógenos vivos.

Vacunas peptídicas
Por lo general, el sistema inmune reconoce a los patógenos no por una estructura completa, sino por una pequeña secuencia peptídica, denominada epítope. Éstas, como secuencia de aminoácidos, se puede construir, lo que permitiría generar la respuesta inmune sin necesidad de usar el antígeno completo, con la evidente ventaja de la reducción de los efectos secundarios por la inoculación de la vacuna. Presenta, sin embargo, varios problemas: • La identificación del epítope es compleja. Para ello, se usan hibridomas de linfocitos B, que reconocen el antígeno e inician la síntesis de anticuerpos monoclonales. Tembién se recurren a perfiles de hidrofobicidad, que permiten situar la proteína en una zona específica de la célula. • Es difícil producirlos en grandes cantidades. Por un lado, es difícil que los epítopes adquieran la estructura necesaria sin interaccionar con otras estructuras (con las que interacciona al ser sintetizado por una célula); y por otro lado, al ser una secuencia pequeña, es muy sensible frente a las mutaciones, dada la alta especificidad que se requiere para su identificación.

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PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA TERAPÉUTICAS

DE

PROTEÍNAS

Las proteínas terapéuticas son producidas de forma natural por el organismo humano, pero ciertas enfermedades pueden disminuir la producción de dichas proteínas, generando enfermedades. Anteriormente, se usaban proteínas obtenidas de origen animal, con dos problemas principalmente: su producción era escasa (lo que las encarecía) y suelen provocar efectos secundarios. Con las técnicas de ADN recombinante, se posibilitó la producción microbiológica de proteínas humanas (ya que los microorganismos no las producen naturalmente, se tuvo que introducir en su genoma la maquinaria necesaria para ello, proveniente de información genética humana). Las proteínas obtenidas, al basarse en genes humanos, carecen de efectos secundarios (es prácticamente idéntica a la proteína humana) y se puede obtener en altas cantidades.

DNAsa
Es una enzima capaz de degradar el ADN, usada en el tratamiento de la fibrosis quística. La fibrosis quísteca es una enfermedad genética degenerativa, de diferente gravedad según el órgano afectado. En los pulmones, el caso más grave, genera el aumento de la producción de mucosidad, taponando las vías respiratorias y favoreciendo las infecciones. Ante ello, el sistema inmune responde destruyendo las células, con la consiguiente liberación de su ADN. Éste aumenta la viscosidad y densidad de la mucosidad, creándose un círculo vicioso. La DNAsa actúa hidrolizando el ADN liberado, disminuyendo la viscosidad de la mucosidad. Los preparados comerciales son muy específicos y eficaces (pulmozina de Genentech), pero sometidos a patentes farmacéuticas.

Eritropoietina (EPO)
Es una hormona glicoproteica producida en el riñón que interviene en la producción de eritrocitos. Su carencia genera la caída del número de glóbulos rojos, y su abuso un aumento (problemas de “dopping” en deportistas). Se obtiene mediante técnicsa de ADN recombinante, y se usa para tratar enfermedades que causen inmunodepresión (cáncer, sida,...) anemias e infecciones renales que afecten a su producción.

Somatropina
Es la hormona del crecimiento, producida en la glándula pituitaria y usada en casos de enanismo por déficit hormonal y en enfermedades relacionadas con el envejecimiento. Inicialmente se obtenía de cadáveres humanos, pero presentaba problemas: • Se requerían muchos cadáveres para tratar un solo paciente, lo que disparaba el precio. • Hay indicios de asociación con la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (encefalopatía espongiforme), provocada por priones y asociada al canibalismo (ingesta de cerebro humano, con la consiguiente transmisión del prión). Posteriormente, se obtuvo de animales, pero se obtenían bajas eficacias. Usando recombinación genética sobre Escherichia Coli (por transformación con un plásmido que contiene el ADN de la hormona), se obtiene una somatropina idéntica a la humana (sólo se diferencian en un aminoácido). Actualmente se investiga su producción con otras especies (Bacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa).

Insulina
Es una hormona polipeptídica producida por el páncreas, relacionada con el metabolismo de la glucosa y la regulación de su cantidad en sangre. Su carencia origina la diabetes. Tradicionalmente, se usaba isulina de origen animal (ovejas y cerdos), pero daban problemas de abastecimiento (baja producción) y de pureza (por lo que solían producir efectos secundarios). Fue el primer producto obtenido por métodos de ADN recomibnante aprobado para su empleo terapéutico, en 1981. El proceso de producción consiste en la producción de las subunidades proteicas que la componen por hospedadores diferentes (Saccharomyces cerevisiae, E. coli) y de forma separada. Tras la síntesis, se combinan químicamente las subcadenas independientes.

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Interferón
Es una proteína de la familia de las citoquininas que itnerviene en la regulación de la respuesta inmune. En humanos, existen tres tipos diferentes, usados en enfermedades que debilitan el sistema inmunitario: 1. El interferón α, usado en casos de hepatitis C y tumores, como leucemia, cáncer renal, melanoma, mieloma múltiple o tumor genital. Se obtiene de E. coli. 2. Los interferones β y γ, usados en procesos de esclerosis múltiple (el primero) y otros cánceres (el segundo). Se obtienen también de Escherichia coli.

Interleuquinas
Son un grupo de citoquininas formado por 15 sustancias distintas. Sólo una está comercializada actualmente, y se usa en el tratamiento de carcinomas renales.

Activador del tejido plasminógeno
Es una proteína constituyente del complejo implicado en la dilución de coágulos sanguíneos, en concreto, activa el plasminógeno, que al transformarse en plasmina destruye la fibrina que mantiene unido el coágulo. Se comercializa desde 1987, para tratar enfermedades con riesgo de bloqueo de vasos sanguíneos, como ataques cardiacos, embolias, trombosis y contusiones.

Colágeno
Se usa en suturas quirúrgicas. Actualmente, se obtiene de cadáveres y vacas, aunque hay procesos en investigación de producción con levaduras (Pichia augusta y Pichia pastoris) que eviten los riesgos de contaminación por virus y priones.

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PRODUCCIÓN MICROBIOLÓGICA DE SCP
Se usa principalmente para la producción de piensos animales, cultivos iniciadores par alimentación (levaduras para panadería) y consumo humano (poco extendido en occidente). Usa residuos de otras industrias como sustrato, lo que se explica teniendo en cuenta que su origen no fue la obtención de la SCP, sino el tratamiento de residuos contaminantes. El producto en sí es una torta compacta de células muertas completas, de alto contenido proteico (de ahí el nombre).

Producción de proteína unicelular
Las características más destacables del producto son: • Rápida velocidad de crecimiento y elevada productividad. • Alto contenido proteico (30-80%). • Capacidad para utilizar una amplia variedad de fuentes de carbono. • Posibilidad de alteración genética y selección de cepas de forma relativamente sencilla. • Ocupación de suelo baja. • No es dependiente del clima ni la estación. • El producto es, en general, de alta calidad. • Se aplica desde los 70, sobre todo, en países en vías de desarrollo y como complemento dietético, así como ingrediente de piensos animales. Las características de los microorganismos usados son: • Crecimiento a partir de sustratos de muy bajo coste. • Tolerancia al pH y la temperatura. • Buenas características de requerimientos de oxígeno, generación de calor y formación de espuma. • Estabilidad genética. • Facilidad para la recuperación de las células. • Estructura y composición del producto final: contenido proteico, perfil aminoacídico, sabor, aroma, color, textura y (muy importante) nivel de ARN (la degradación de los ácidos nucleicos genera purinas, que se transforman en ácido úrico, que puede generar enfermedades por acumulación). Se prefieren, sobre todo, especies aeróbicas (los fermentadores son más baratos), y cada grupo microbiano presenta sus ventajas e inconvenientes: • Las bacterias son de crecimiento más rápido, pero son más sensibles frente al pH (prefieren pH neutro). • Las levaduras son de crecimiento más lento, pero pueden trabajar a pH ácido, lo que, además, disminuye los riesgos de contaminación. • Los hongos son los qua más fácil se recuperan del cultivo, pero presentan problemas durante el proceso. Los problemas a subsanar de este tipo de productos son, además del contenido en ácidos nucleicos: 1. En ciertos hongos (Aspergillus,...), regular la presencia de aflatoxinas. 2. Es necesario eliminar las sustancias tóxicas y/o cancerígenas que pudieran generarse en el proceso.

Sustratos
Aunque son muchos los sustratos que pueden utilizarse, se elige el más adecuado en función del precio de éstos. 1. Residuos de otras industrias (residuos agrícolas, sueros lácteos o la industria maderera), con el fin de reducir los problemas ambientales que podrían causar. 2. Alcoholes, muy empleados al principio, pero después fue más rentable usar residuos de otras industrias. Actualmente, se está recuperando. A la hora de buscar nuevos sustratos, se siguen los siguientes criterios: • Baratos • Alta producción de biomasa. • Su degradación exija poca oxigenación.

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• •

No generen calor al degradarse, lo que favorece la no necesidad de utilizar cambiadores de calor, disminuyendo el coste. Fácil eliminación de compuestos tóxicos, lo que también repercute en el precio.

Procesos de producción
Existe una gran cantidad de plantas piloto, pero hay pocas plantas industriales, debido a que surgen problemas de escalado por la diferencia de condiciones: requerimientos de oxígeno, aparición de gradientes térmicos y nutricionales, influencia del CO2 o la presión hidráulica. El empleo de sustratos más económicos, mejora de la eficacia, incremento del valor nutricional del producto, disminución de los costes de purificación o acoplado de procesos secundarios pueden contribuir a la extensión de estos procesos. En general, las etapas de estos procesos son: 1. Aplicación de tratamientos previos al sustrato para su adecuación. 2. Es uno de los pocos procesos que operan en continuo, manteniendo las condiciones límite (óptimas) de crecimiento del organismo. Los biorreactores utilizados son pequeños. 3. Se efectúan procesos de filtración y purificación, seguidos de tratamientos para reducir el contenido en ácidos nucleicos (choque térmico y adición de RNAsa) y acondicionamiento (pasteurización, deshidratación y empaquetado). Los procesos más comunes son: - Parte de suero lácteo con Kluyveromyces lactis o K. marxianus. - Se debe ajustar el contenido en lactosa del sustrato a 34 g/l, y complementarlo con La SCP obtenida se destina a consumo minerales. Bel - Las condiciones de fermentación son: humano y animal Biorreactores de 22 m3. 38 oC y pH de 3.5. Aireación de 1700 m3/h. - Se produce entre 0.45 y 0.55 g por g de lactosa. - Desarrollado en Suecia, utiliza Candida utilis (levadura). Se utiliza para disminuir los efectos - El sustrato contiene gran cantidad de almidón, ambientales de los residuos de patata, que que Candida no puede degradar, lo que exige un Symba necesitan un alto consumo de oxígeno tratamiento previo con Saccharomyces fibuligera. para degradarse. - Se obtiene un producto con un 45 % de proteínas y el poder contaminante del sustrato se reduce un 90 %. El primer proceso con hongos, partiendo - Destinado a la producción de piensos, el Finlandés de residuos de papeleras y madereras. producto contiene un 59 % de proteínas. - Los microorganismos metanógenos son sólo Importante en Noruega, donde los unas pocas especies, principalmente arqueas. El Con campos de gas del Mar del Norte más utilizado es Methylococcus capsulatus. metano proporcionan el sustrato. - El producto contiene un 70 % de proteínas, y se destina a la producción de piensos. - Se efectúa en condiciones asépticas y con nutrientes de grado alimentario. - Se emplea Fusarium venenatum por sus El primero aprobado para el consumo características de estructura y textura. humano, el único destino de este ICI - El inconveniente del Fusarium es su alto producto. contenido en ARN, lo que obliga a la realización de un tratamiento de eliminación a 64 oC durante 30 minutos.

Producción de levadura para panadería
El iniciador en los productos de panadería es Saccharomyces cerevisiae. Su producción se efectúa en discontinuo: 1. Los liófilos se recuperan en medio sólido, y por medio de un proceso de escalado en diferentes etapas (hasta 8) se llega a los cultivos líquidos.

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El sustrato utilizado son principalmente melazas provenientes de industrias azucareras, complementadas con compuestos nitrogenados (principalmente, sales de amonio) y aminoácidos (que a su vez actúan como factores de crecimiento), así como sales minerales. 3. Se efectúa a pH ácido (4-4.5). 4. Se requiere un gran aporte de oxígeno, durante media hora tras finalizar el proceso para adecuar las características de la célula (proceso de maduración). 5. Las células se purifican por centrifugación, lavado, enfriado (2-4 oC), desecado y conservación en refrigeración. Las características principales del producto son: • Elevado poder glicolítico (capacidad para procesar azúcares). • Alta generación de CO2. • Altos niveles de osmotolerancia. • Perfil metabólico adecuado, lo que lleva a la producción de sabor y aroma.

2.

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