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renocisrimn E> Dns: una técnica de cuantificacion de azucares reductores Utilizada en el Laboratorio de Catal is Enzimatica del TESE como ingenieros bioguimicos, irremediablemente Iegamos a enfrentamos con el montaje de técni- cas que nos permitan analizar las muestras re- sultantes de los experimentos que realizamos, y poder asi generar las conclusiones adecuadas a ese respecto, Una de las técnicas analiticas que aprendemos destle {que estamos estudiando, es la desarroliada por Miller (1959), Esta técnica sirve para cuantificar los azécares redutctores producidos durante una fermentacion o para cuantificar los productos de una reaccién enzimatica, Con el paso del tiempo y el vertiginaso desarrollo de ta tecnologia, después de casi 50 afios, esta t6enica ha suftido algunas modificaciones, sin embargo, en esen- cia sigue siendo lo mismo, Cada laboratorio que la em- plea, debe respetar la composicin del reactivo DNS, aunque puede modificar las cantidades de reactivo y de ‘muestra que emplearé. Es importante recordar que siem- pre que hagamos una modificacién, de- bbemos comprobar que no se est afec- tando la linealidad de! método. El preset te trabajo describe detalladamente lat nica utilizada por el Laboratorio de Cat lisis Enzimética del TESE, para 1a cuantificacién de aziicares reductores de las muestras generadas durante el desa- rrollo de los diversos proyectos de inves- tigacién que se trabajan. Preparacién del reactivo DNS La composicién de este reactivo, en gil s: Es importante recalear que, para po- Profesora investigadora del Laboratorio de CathlsisEneimatica del TESE. Tecnoligice de Estudios Syperiores de Fcatepee der disolver el dcido dini-trosalicilico, el hidréxido de sodio deberd estar completamente disuelto. Una vez preparado, el reactivo deberd almacenarse en un recipiente color ambar, a temperatura ambiente, Este reactivo dura aproximadamente un mes antes de mos- trar precipitacion de los reactivos 0 vestigios de des~ composicién. Debido a lo anterior, se recomienda hacer los caleulos adecuados para preparar solo la cantidad requerida de reactivos y evitar el desperticio. Elaboracién de la curva patron Segiin la ley de Lambert y Beer, laabsorbancia es directa- mente proporcional a la eoncentracién del material que absorbe la luz, al que generalmente conocemos como analito (Rubinson y Rubinson, 2000). Siempre que se utiliza un método espectrofotométrico para cuantificar la concentracién de analito presente en una muestra proble- Ca ma, es necesario relacionar Ia concentracién de dicho analito con Ia cantidad de luz que absorbe del haz que le incide. Sabiendo que ésta es una relacién aproximada- ayes Hidréxido de sodio granular 10 Acido dinitrosalicitico 10 Sulfito de sodio anhidro 85.0 Fenol 02.0 mente lineal, lo mis recomendable es preparar una soli ign estindar, con una concentracién conocida de analito ‘y hacer diversas diluciones de la misma, para poder obte- her dicha relacién y expresaria mateméticamente con la ayuda de la ecuacién de la recta, Y = mX +b, En este caso, m ser la pendiente de esta recta, b la ordenada al origen, X sera la concentracién de analito, y Y la absorbancia observada para cada concentracién. La téeni- ca de DNS cuantfica, como maximo, una concentra- cién de azicar de un mg/ml. Por lo tanto, la solucién estindar deberd tener esa concentracién. A partir de esta solucién se deberan realizar las dilucio- hes correspondientes para construir una curva patrén, con la que se determinard la concentracién del analito en la muestra problema, a partir de la ecuacién de la recta antes meneionada, Las diluciones que servirdn para la construecién de la curva deberdn realizarse por dupli- cado, a fin de construir fa curva con los promedios de las dos lecturas obtenidas por cada dilucién, Ademas, deberd indicarse dentro de la grifiea la desviacién esténdar de las lecturas, para poder asi valida la preci- sidn en el trabajo del analista. Por tal razén, cada vez que se prepare el reactivo DNS es necesario construit luna curva patrén, con la que se cuantificard el analito de las muestras tratadas con ese reactivo en especitico, Es importante mencionar que, si se tiene la sospecha de ‘que la muestra problema posee una concentracién ma- yor aun mg/ml, serd necesario realizar una dilucién de a misma, previa a la determinacién, para asegurar que las lecturas podran ser interpoladas en la curva patron, Reaccion del azucar con el DNS Todas las mucstras, tanto las que componen a la curva patrén como las que constituyen el problema, deberdin tratarse utilizando el procedimiento que se describe a continuacién: Paso I. Se deberé tener un ml total de muestra, Cuando se requiera de una dilucién, se pondré una cantidad ade- ccuada (menor a un ml) de la muestra que contiene el azicar, y se completard a un ml uilizando agua destila- da. De tal forma que, sise utilizan 0.5 ml de muestra, se deber’ agregar 0.5 ml de agua, para completar a un ml. Paso 2. Una vez completado el volumen, se agregarin tres ml del reactivo DNS y se someterin a ebullicién durante cinco minutos, Los tubos se podrin enfiar al chorro del agua o bien podrén dejarse entriar por si so- los hasta que alcancen la temperatura ambiente. Paso 3. Se deberan agregar seis mi de agua, para cam- pletar un volumen final de 10 mi, y se agitarén en el vértex. Paso 4. Los tubos deberan leerse a $50 nm, calibrando con el blanco, el cual contiene todos los reactivos, ex- cepto el problema. Fs decir, contiene un ml de agua, tres ml de DNS y seis ml de agua, Se propone un ejemplo En el Laboratorio de Catélisis Enzimatica se mont6 una prictica en la que se requerfa conocer el eomportamiento de una levadura durante una fermentacién aerobia, con Fespecto a su crecimiento y consumo de sustrato. El azi- car utiizado en el medio de cultiv fue glucosa, en una coneentracién de dos gil. Se tomaron muesras a dife- rentes tiempos y se analiz6 la cantidad de azicar presente Lo primero que se elabor® fue la curva patron, para ello se preparé una solucién de glucosa anhidra con una concentracién de cuatro mg/ml, y por duplicado se hi- cieron las diluciones indicadas en la tabla 1 A cada uno de estos tubos se les agregé tres ml del reactivo DNS y se sometieron a ebullicién durante cinco minutos. ‘Cuando los tubos aleanzaron la temperatura ambiente, se les agreg6 seis ml de agua y se leyeron en el espectro a 550 nm. La figura 1 nos muestra la relacién lineal que existe entre la concentracién de la glucosa en las mues- tras y la absorbancia obtenida. Como puede observarse, la grffca es lineal en todo el rango probado, y la desvia- cin estindar es pequeita en cada concentracién, lo que nos indica un buen trabajo del analista eee 00) 1 0208 Pace ater) 3 06 04 4 0 teem oD! 5 L000 Tabla 1. Preparaci6n de la curva pairén para cuaniificacion de azticares utilizando el reactive DNS Investigacion » Clerc «Tecnologia *Cutura EE Figura 1. Curva patron de glucosa Debido a la concentracién de glucosa en el medio de cultivo, fue necesario hacer una dilucién 1:10 de las uestras tomadas, antes de determinarles su conteni do de aziicar. Para ello se tom6 un mi de la muestra y se agregé 0.9 ml de agua, para completar un ml, Una vez hecha la dilucién, a cada muestra se aadi6 el DNS (tres ml). Los tubos se dejaron en ebullicién durante cinco minutos, inmediatamente se dejaron enftiar para agregarles seis ml de agua, completando asf el volumen 10 ml. Estos tubos se leyeron en el espectrofotometro 8550 nm, calibrando el equipo con un blanco, prepara- do con todos los reactivos, excepto el problema, La tabla 2 muestra las lecturas obtenidas después del tratamiento con DNS. 0 OAL 385 2035503897 40323 0315 6 0298 0275 #0256 0262 W024 0256 2 OI 0163 24 a.402 0.10 26 Goll 001s 28 0013 0.017 Tabla 2. Lecturas de las muestras de azitear de la cinética Las lecturas obtenidas al analizar las muestras en el es- pectro (Abs), se sustituyeron en la siguiente ecuacién: X=¥-b = Abs+0.0545 m 1.1318 ‘Con esta ecuacién, se tenia la cantidad de aziicar, en g/L Considerando la dilucién, era necesario multiplicar por 10 todos los resultados, y asf se obtuvo la concentracién de lucosa en cada tiempo de la fermentacién, La tabla 3 ‘muestra la coneentracién por cada lectura, asi como los promedios y la desviacién esténdar de los azéiares. Teenoligico de Estudios Suporiarcs de Ecatopee rorcaarien ‘Al graficar el promedio de las lecturas (Figura 2), ob- ‘servamos el consumo de sustrato de la levadura duran- te la fermentacién. 2 Sos 37610205 4 iat dae ‘ 2a dis ' 2al ren 3370260 ae SC) awaits 6810091000 Tabla 3. Calculos de fa glucasa contenida en el medio de cultivo a diferentes tiempos de la cinética Figura 2. Cinética del consumo de sustrato de Saccharomyces cerevisiae durante tuna fermentacién aerobia Agradecimientos 4 Jos alunos: Maria det Carmen Dominguez Reyes. Martha Blena Excalona Domingues Noemi Negrete Valencuela Ernesto Rocha Lines y Nancy Aurora Rosales Toledo, estudiantes del seto semesire. de Ingentera Bioguinica, quienes participaron en el desarrollo det ntbajo que se presents como ejemplo en este artical, Bibliografia Miller,G L. 1959,""Use of dnitrosalcylicreagent for peer etene terre ne ae ea Noee ieee te Analitioa Conteny