DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN MEDIA SUPERIOR

MANUAL DE PRCTICAS ANLISIS CLNICOS III

Elaborado por: QFB. EMILIA ELIZABETH BOLIO SALAZAR

Aprobado por la Academia Estatal de Anlisis Clnicos III QFB. ISABEL RUIZ SANCHEZ QFB. ALBERTO RODRIGUEZ MOYA QFB. MYRNA FATIMA RAMIREZ GARCIA QFB. EMILIA ELIZABETH BOLIO SALAZAR

SUPERVISADO POR: LICDA. LAURA ARACELI JIMNEZ COBIN LICDA. SILVIA LUZ LPEZ ALCARAZ
FEBRERO DEL 2009

INDICE
Prctica 1 Prctica 2 Prctica 3 Prctica 4 Prctica 5 Prctica 6 Prctica 7 Prctica 8 Prctica 9 Prctica 10. Prctica 11. Conocimiento y esterilizacin de los medios de cultivo ..5 Tcnicas de cultivo..8 Cultivo farngeo..12 Tincin de Gram.15 Identificacin de Staphylococcus aureus.18 Antiestreptolisinas...22 Determinacin de Factor Reumatoide.26 Protena C reactiva 29 Reacciones febriles.32 Coprocultivo.36 Identificacin de Enterobacterias a travs de

Pruebas bioqumicas (IMVIC)......39 Prctica 12. Prctica 13. Prctica 14. Prctica 15 Prctica 16. Urocultivo..43 Tincin de Ziehl- Neelsen...46 Diagnstico de Paludismo..49 Examen Coproparasitoscpico, tcnica directa..56 Examen Coproparasitoscpico, tcnica de concentracin de Faust....63

REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO

ANTES DE INICIAR SU PRCTICA: I. La asistencia a la prctica es obligatoria. II. La tolerancia para entrar al laboratorio ser la que rige el reglamento escolar. III. Acatar las instrucciones indicadas en el Reglamento General de Laboratorios de los Planteles del Nivel Medio Superior de la Universidad de Colima. IV. No dejar abrigos, carpetas u otros objetos sobre las mesas de trabajo. Cuando ms despejado este el lugar de trabajo mejor se desarrollar el experimento y menos peligro existir para nosotros y para nuestras cosas. V. Es obligatorio llevar bata para evitar manchas y quemaduras. Tambin es aconsejable traer un trapo de algodn para poder agarrar los recipientes calientes o limpiarlos y secarlos. VI. Se deben seguir a todo momento las indicaciones del profesor. No se comenzara a trabajar hasta haber recibido las instrucciones necesarias. Consultar las dudas y dificultades. VII. Es imprescindible leer por lo menos una vez la prctica antes de comenzar. VIII. Comprobar que esta todo el material necesario y en las condiciones adecuadas de conservacin y limpieza. Comunicar cualquier anomala al profesor. Cada grupo ser responsable de material asignado. IX. Por seguridad est terminantemente prohibido fumar dentro del laboratorio, as como ingerir alimentos y bebidas. DURANTE EL TRABAJO: I. No debe probarse ninguna sustancia y debe evitarse el contacto con la piel. En caso de que algn producto corrosivo caiga en la piel, se eliminar con abundante agua fra. II. Extremar los cuidados al trabajar con sustancias inflamables, txicas o corrosivas. III. Comunicar cualquier accidente, quemadura o corte, a tu profesor de laboratorio. IV. La manipulacin de productos slidos se har con ayuda de una esptula o cucharilla y para transvasar lquidos se utilizara una varilla de vidrio en los casos que sean necesarios. V. Nunca viertas el cido sulfrico concentrado al agua, debes hacerlo de manera inversa pero con cuidado. VI. Tener cuidado al manejar cidos y bases principalmente concentrados. VII. Para oler algn producto no debe acercarse la cara al recipiente, si no que se arrastrar el vaso hacia la nariz pasando la mano por encima de l. VIII. Con el fin de evitar contaminaciones, nunca se devolver al frasco los restos de productos no utilizados. IX. El material de vidrio es muy frgil, por lo que se evitara los golpes y cambios bruscos de temperatura. Se deber anotar en una hoja o cuaderno el material que se rompa y comunicarlo al profesor de laboratorio.

X. Cualquier experimento en el que se desprenda gas txico o inflamables en el que se utilicen reactivos potencialmente nocivos deber llevarse a cabo en las campanas extractoras del laboratorio. XI. Los restos slidos no metlicos deben tirarse en cestos de basura, nunca en las fregaderas. Los residuos metlicos se almacenarn en un recipiente especial. Los residuos acuosos se vertern en los fregaderos grandes, con abundante agua antes, durante y despus del vertido. En cuanto a los lquidos y disolventes orgnicos, se echaran en un recipiente de plstico, para su posterior eliminacin. AL TERMINAR: I. El lugar y el material de trabajo debe quedar limpio y ordenado, tambin se deben apagar y desenchufar los aparatos. II. Lavarse las manos perfectamente para evitar intoxicaciones con algunos reactivos. III. Entregar para su revisin el reporte de la prctica elaborada. IV. Hasta que el profesor no de su autorizacin no se considerara finalizada la prctica y por lo tanto, no podrs salir de laboratorio. Recomendaciones generales.

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis clnicos III Prctica no.1 NOMBRE DE LA PRCTICA: Conocimiento y esterilizacin de los medios de cultivo. COMPETENCIA: Conoce el uso y aplicacin de algunos medios de cultivo tiles para el cultivo de microorganismos, as como la tcnica para su esterilizacin. MATERIAL: Diversos medios de cultivo. Esptulas Vidrio de reloj Cinta testigo Agua destilada Mechero fisher Aro metlico Guantes con asbesto

Matraces erlenmeyer de 500 ml. Balanza granataria o analtica Algodn Papel aluminio o de estraza Olla de presin para esterilizar Tripie o soporte universal Tela de alambre con asbesto

INTRODUCCIN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad de medios de cultivo es tambin grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante para posteriormente esterilizarlos. Antes de su esterilizacin, los medios de cultivo ya hidratados se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces; segn se trate de caldos o agares). Existen diferentes medios de cultivo. De acuerdo a su consistencia tenemos: 1.- Medios lquidos: habitualmente nombrados caldos, y que estn contenidos en tubos de cultivo. 2.- Medios slidos o generalmente llamados agares; precisamente por contener este componente que se utiliza como agente gelificante (alrededor del 5%), para dar la solidez a ese tipo de medios de cultivo. Generalmente contenidos en cajas de petri. 3.- Medios semislidos: que contienen tambin agar (alrededor del 1%), y este les da una consistencia como natilla. Generalmente contenidos en tubos de cultivo.

De acuerdo a su utilidad tenemos: 1.- Medios generales: permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. 2.- Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. 3.- Medios selectivos: permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems. 4.- Medios diferenciales: son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que un determinado tipo de microorganismos posee. DESARROLLO 1.- Proporcionarle a los alumnos diversos medios de cultivo para que primero anoten los siguientes datos: Nombre del medio de cultivo, tipo de medio de cultivo de acuerdo a su consistencia y utilidad, para qu tipo de microorganismos se utiliza o qu pruebas se pueden realizar en el etc. 2.- Posteriormente que procedan a preparar algunos de los medios de cultivo que necesitaran para las siguientes prcticas de laboratorio: a.- Pesar la cantidad necesaria del medio de cultivo y disolverlo en el volumen adecuado de agua destilada, en un matraz erlenmeyer (en el frasco del medio de cultivo viene la relacin de polvo a pesar segn la cantidad de medio que se quiera preparar). b.- Calentar cuidadosamente el medio de cultivo hasta su disolucin completa, tener cuidado de agitar constantemente para evitar que se forme demasiadas burbujas que provoquen derrames y puedan producir quemaduras. c.- Si el medio de cultivo es un caldo, se distribuye en tubos de cultivo con tapn de rosca (baquelita) o tubos de ensaye grandes a los que les fabriques tapones de algodn (deben quedar bien fijos) para estilizarlos luego. Una vez esterilizados y fros se guardan a temperatura ambiente en un lugar fresco y seco o en el refrigerador; segn sea lo adecuado al medio preparado. d.- Si el medio de cultivo es un agar, se puede dejar en el matraz erlenmeyer, se le fabrica un tapn con algodn bien apretado en la boca del matraz y se cubre con un pedazo de papel aluminio o de papel de estraza. (Tu maestro te indicar la manera de hacerlo) y est listo para ser esterilizado. Si requieren medios para tcnicas de tubo inclinado o para picadura, el agar se distribuye en tubos. Se esterilizan con calor hmedo (15lb de presin/121C/15-20 minutos). e.- Una vez esterilizados y no muy calientes, los medios de agar se vacan (en condiciones estriles) a cajas de petri estriles y una vez que solidifiquen y enfren se guardan en refrigeracin (en posicin invertida de preferencia) para su posterior uso. Si el agar es para tubo inclinado se coloca en esa posicin hasta que solidifique y una vez fros se almacenan en un lugar fresco y seco o en el refrigerador.

NOTAS: + No olvides rotular los medios de cultivo con su nombre o siglas para poder identificarlos y de preferencia tambin la fecha de elaboracin. + Colocar un tira pequea de cinta testigo a los tubos y matraces de los medios, antes de meter a esterilizar. CUESTIONARIO 1.- Por qu se deben almacenar los medios de cultivo en posicin invertida? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Para qu sirve la cinta testigo? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3.- Por qu se tapan los tubos y matraces que contienen los medios para esterilizar? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 4.- Cmo creas rea estril para vaciar los medios de cultivo ya esterilizados a las cajas de petri? Y por qu es necesario? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Conclusiones. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realizacin:__________________________________

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.2 NOMBRE DE LA PRCTICA: Tcnicas de cultivo.

COMPETENCIA: Realiza algunas de las tcnicas de cultivo utilizadas en el laboratorio de bacteriologa: estras, picadura y agitacin. MATERIAL: Cultivos bacterianos en agares y caldos (pueden ser cultivos mixtos o de alguna especie bacteriana en particular, que hayan aislado previamente). Medios de cultivo estriles (en placa, tubo inclinado, caldo y tubo vertical). Asa bacteriana y aguja de inoculacin. Mechero Fisher. INTRODUCCIN La utilizacin de cultivos es fundamental para determinar las caractersticas fsicas, qumicas y bioqumicas de los microorganismos; en este caso, principalmente de las bacterias. Para ellos contamos con un gran nmero y tipo de ellos, as como diversas tcnicas de cultivo que nos facilitan el trabajo. El mdico, con base en un examen cuidadoso del paciente, puede sospechar que hay una enfermedad infecciosa. Entonces se recolectan muestras de los tejidos o de los lquidos infectados para anlisis microbiolgico entre otros estudios. Hay un gran inters en la importancia de identificar con precisin el patgeno, para el tratamiento apropiado de la enfermedad infecciosa. Generalmente los laboratorios clnicos son capaces de aislar, identificar y determinar la sensibilidad a antibiticos de la mayor parte de las bacterias patgenas encontradas rutinariamente dentro de las 48 horas de haber tomado la muestra. DESARROLLO 1.- Prende el mechero fisher para crear un rea estril y as evitar que te contamines o se contaminen los medios de cultivo. Coloca las placas en posicin invertida sobre la mesa de trabajo para que se facilite manipularlas mejor. TECNICA POR ESTRAS EN PLACA 2.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 3.- Ahora, toma una placa con agar estril (donde vayas a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posicin ligeramente horizontal realiza las estras (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porcin pequea del agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca.

4.- Esteriliza el asa de nuevo y djala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estras sembradas la primera vez y realiza sobre una porcin virgen del agar una segunda tanda de estras que no toque la primera. 5.- Repetir exactamente la operacin descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estras, hasta completar 3 o 4. No hagas ms presin sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgar el agar. 6.- Lleva a la incubadora y deja en posicin invertida 24 horas al trmino de las cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas. SEMBRADO POR ESTRAS EN TUBO INCLINADO 1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo de agar en pico de flauta (agar inclinado) y cerca del mechero retira el tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular y flamea la boca del tubo. 3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y empezando en el rea del fondo del agar realiza una estra hacia fuera hasta terminar en la punta del agar. Retira el asa. 4.- Flamea la boca del tubo de nuevo y coloca el tapn de algodn bien firme. Esteriliza el asa y djala enfriar. 5.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la siembra. SEMBRADO POR AGITACIN EN CALDO 1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo con el caldo estril y cerca del mechero retira el tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular, flamea la boca del tubo. 3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y por agitacin dentro del caldo, siembra el inculo. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapn de algodn firmemente. Esteriliza el asa y djala enfriar. 4.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la siembra. SEMBRADO EN PICADURA EN TUBO VERTICAL 1.- Esteriliza el filamento de la aguja de inoculacin y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre la aguja de inoculacin y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 9

2.- Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira el tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular, flamea la boca del tubo. 3.- Introduce la aguja con el inculo y sin tocar las paredes del tubo, inocula en el centro del medio de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retira la aguja de inoculacin en la misma direccin de la siembra. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapn de algodn firmemente. Esteriliza el asa y djala enfriar. 4.- Lleva a incubar y observa las caractersticas del desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la siembra.

CUESTIONARIO 1.- Menciona en qu casos se utilizan cada una de las tcnicas que desarrollaste e indica las ventajas y desventajas de cada uno de los cultivos. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

2.- Cules son las medidas de seguridad que debes manejar durante el proceso de ste tipo de tcnicas? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Conclusiones: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.3 NOMBRE DE LA PRCTICA: Cultivo farngeo COMPETENCIA: Identifica algunas especies que conforman la flora patgena que se pueden desarrollar en la regin farngea. MATERIAL: Placa de agar sangre Placas de agar salado manitol Asa bacteriolgica Abate lenguas estriles INTRODUCCIN Los cultivos de garganta se obtienen principalmente para detectar estreptococos beta-hemolticos del grupo A. Clnicamente puede sospecharse una faringitis estreptoccica si se observa una mucosa difusamente enrojecida en un paciente que experimenta dolor y dificultad para deglutir. La flora comensal est compuesta por una variedad de bacterias facultativas y ciertas levaduras. Normalmente, en la orofaringe se hallan combinaciones y concentraciones variables de estreptococos alfa-hemolticos, especies de Neisserias (no N. gonorrhoeae), estafilococos coagulasa negativos, ciertas enterobacterias etc. DESARROLLO 1.- Prende el mechero fisher para crear un rea estril y as evitar que se contaminen los medios de cultivo. Coloca las placas de agares estriles en posicin invertida sobre la mesa de trabajo para que se te facilite manipularlas. 2.- Es muy importante el mtodo apropiado para obtener garganta: una muestra de la Placa de agar eosina azul de metileno Hisopos estriles Mechero fisher

3.- Con una luz brillante desde por encima del hombro de la persona que obtiene la muestra debe enfocarse en la cavidad oral abierta para guiar el hisopo hacia la parte posterior de la faringe. Se instruye al paciente para que respire profundamente y se deprime la lengua con suavidad con un abate lenguas. 4.- Luego se extiende el hisopo entre los pilares amigdalinos y detrs de la vula. Debe tenerse la precaucin de no tocar las paredes laterales de la cavidad oral.

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5.- Hacer que el paciente diga ah sirve para levantar la vula y ayudar a reducir el reflejo de arcadas (asco). El hisopo debe moverse hacia atrs y hacia delante a travs de la parte posterior de la faringe para obtener una muestra adecuada. 6.- Tomar un segundo hisopo siguiendo las mismas instrucciones y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo. 7.- Inocula en un extremo de cada uno de los medios de cultivo (AS, EMB y ASM) con los hisopos impregnados con la muestra farngea (recuerda hacer todo el proceso cercas de la llama del mechero) y coloca los hisopos en un medio de transporte como caldo estreptocel o Stuart, y resrvalo. 8.- Esteriliza el filamento del asa de siembra en la llama del mechero y djala enfriar. Con el asa en posicin ligeramente horizontal realiza las estras (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porcin pequea del agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca. 9.- Esteriliza el asa de nuevo y djala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estras sembradas la primera vez y realiza sobre una porcin virgen del agar una segunda tanda de estras que no toque la primera. 10.- Repetir exactamente la operacin descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estras, hasta completar 3 o 4. No hagas ms presin sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgar el agar. 11.- Lleva a la incubadora y deja en posicin invertida 24 horas al trmino de las cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas. Con ayuda de tu profesor trata de identificar las colonias bacterianas desarrolladas en cada uno de los medios de cultivo. CUESTIONARIO 1.- Por qu es tan importante la deteccin de estreptococos beta-hemolticos en cultivos farngeos? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Escribe los nombres de las bacterias de la flora normal de la garganta, as como de la flora patgena, indicando en este ltimo caso el tipo de enfermedad o complicacin para el paciente infectado. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 13

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Conclusiones. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.4 NOMBRE DE LA PRCTICA: Tincin de Gram COMPETENCIA: Realiza la tcnica de tincin de Gram para clasificar las bacterias. MATERIAL: Cultivo bacteriano de 24 horas Asa bacteriana Colorante cristal violeta o violeta de genciana Solucin de yodo-lugol o yodo gram Alcohol-acetona (1:1) Colorante de safranina INTRODUCCIN Esta coloracin, ideada por Hans Chistian Gram a fines del siglo XIX, permite dividir a las especies bacterianas en dos grandes grupos: aquellas que toman el colorante bsico, cristal violeta (gram positivas) y aquellas que son decoloradas por el alcohol-acetona (gramnegativas). El procedimiento clsico de la coloracin de Gram incluye la fijacin del material, ya sea por calor en la llama del mechero o por accin del alcohol. Luego de la fijacin, el primer paso de la coloracin de Gram es la aplicacin del cristal violeta; a continuacin se agrega como mordiente la solucin de yodo de Gram que fija qumicamente el colorante alcalino a la pared bacteriana. La etapa de decoloracin permite distinguir los grmenes Gram positivos de los Gram negativos. Es probable que por el mayor contenido en lpidos de las paredes celulares de las bacterias gram negativas, el alcohol o la acetona aumenten la permeabilidad de la pared y el colorante sea eliminado. Adems, la presencia de un mayor nmero de residuos de cido teicoco con uniones cruzadas en las bacterias Gram positivas es posible que aumente la fijacin del cristal violeta. Los microorganismos gram positivos que han perdido la integridad de su pared celular debido a un tratamiento con antibiticos, envejecimiento o accin de enzimas auto lticas tambin permiten el escape del cristal violeta en la etapa de la decoloracin. A esta altura de la coloracin, los organismos gram positivos retienen el cristal violeta mientras que las gram negativas permanecen sin teir. El agregado de un colorante de contraste como safranina teir a estos microorganismos y clulas (leucocitos y eritrocitos) de un color rosado o rojo. Las levaduras tambin son gram positivas, aunque el micelio de los hongos toma la coloracin de Gram en forma variable. DESARROLLO 1.- Sobre un portaobjetos limpio y seco, se coloca una gota de solucin salina fisiolgica o una gota de agua.

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2.- Se esteriliza el filamento del asa de siembra a la llama del mechero y se deja enfriar. Se toma una pequea cantidad de un cultivo bacteriano y se resuspende en la gota de agua o solucin salina del portaobjetos. Tambin puede ser utilizada una aguja de inoculacin estril para tomar la muestra bacteriana. 3.- Se deja secar al aire y luego se fija a la llama del mechero, pasndolo de 4 a 5 veces sobre esta; teniendo cuidado de no calentar demasiado pues el portaobjetos puede romperse (no es vidrio pyrex). Tener cuidado al fijar el frotis para evitar quemaduras. 4.- Tambin se pueden realizar frotis del material directo de las muestras clnicas (exudados farngeos, heridas). Se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra sobre el portaobjetos limpio y se fija con calor para proceder a la tincin. a.- Cubrir el frotis bacteriano con cristal violeta durante 1 minuto. Enjuagar con agua. b.- Aplicar el yodo gram y dejarlo reaccionar durante 1 minuto. Escurrir. c.- Ahora, decolorar con la solucin de alcohol-acetona, agregando gota a gota en el portaobjetos inclinado sobre el fregador (o tarja), hasta que deje de salir colorante. Enjuague. d.- Finalmente cubrir el frotis con la solucin de safranina y dejarla actuar durante 1 minuto. Lavar el exceso de colorante y dejar secar al aire. e.- Coloca aceite de inmersin al frotis seco y teido para observarlo al microscopio, con el objetivo de 100X. f.- Realiza esquemas de lo observado e indica la forma, agrupacin y caracterstica tintorial de los microorganismos observados.

CUESTIONARIO 1.- Por qu es necesario fijar el frotis antes de teirlo? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Puede una bacteria Gram positiva teirse de Gram negativa? Por qu? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3.- Qu otras tcnicas de tincin son utilizadas comnmente en el laboratorio de bacteriologa? En qu casos se utilizan? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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Conclusiones. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realizacin:__________________________________

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no. 5 NOMBRE DE LA PRCTICA: Identificacin de Staphylococcus aureus COMPETENCIA: Aplica las pruebas bioqumicas de la Coagulasa y Catalasa como medios para la identificacin de S. aureus. MATERIAL: Portaobjetos Aplicadores de madera Tubos de ensaye de 13x100 Pipetas graduadas Pipetas pasteur Bao mara a 37C Mechero Fisher o Bunsen Cultivo de S. aureus en placa o en tubo reciente. INTRODUCCIN Catalasa: la catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en oxgeno y agua. Qumicamente la catalasa es una hemoprotena de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 tomos de hierro de la molcula estn en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa. La mayora de las bacterias anaerobias descomponen el H2O2 con peroxidasas semejantes a la catalasa, salvo que cada molcula contiene un solo in frrico. El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo o aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas. La catalasa transforma al perxido de hidrgeno en agua y oxgeno, como lo demuestra la siguiente reaccin: H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas) SUSTANCIAS: perxido de hidrgeno al 30% Agua destilada Solucin salina estril plasma de conejo o humano Asa bacteriolgica

La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy comnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos). Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteca de composicin qumica desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un coagulo visible en un sistema analtico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo produciendo una barrera en el sitio de la infeccin estafiloccica. Esto puede servir para localizar los organismos in vivo, en abscesos. En el laboratorio, la prueba de 18

la coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al S. aureus (coagulasa positivo) de otros estafilococos y micrococos. La coagulasa se halla en 2 formas, libre y fija, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas separadas: 1.- Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija, conocida como factor de aglutinacin, est unida a la pared celular bacteriana y no est presenten los filtrados de cultivos. Los hilos de fibrina formados entre las clulas bacterianas suspendidas en plasma (fibringeno) provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. La actividad de la coagulasa fija no es inhibida por los anticuerpos formados contra la coagulasa libre. 2.- Coagulasa libre (prueba en tubos): la coagulasa libre es una sustancia semejante a la trombina, que se haya presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezclan en partes iguales con una pequea cantidad de plasma en un tubo de ensayo, se forma un coagulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de la coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade trombina. DESARROLLO a).- CATALASA: Prueba en portaobjetos: 1.- Con una aguja de puncin o un aplicador de madera con la punta aguzada transferir clulas del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos. 2.- Aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3% (diluir la solucin al 30% con agua destilada). Se recomienda no aadir el organismo al reactivo (invirtiendo el orden), especialmente si se utilizan agujas o asas que contienen hiero, ya que se pueden producir resultados falsos positivos.

Prueba en tubos o placas de agar: 1.- Diluir 1:10 el perxido de hidrgeno al 30% en agua destilada para obtener una solucin al 3% 2.- Aadir unas gotas (aproximadamente 1 ml) del perxido de hidrgeno al 3% directamente sobre la superficie del desarrollo de una placa o pico de agar. INTERPRETACIN: La rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una reaccin positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el perxido de hidrgeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva.

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Nota: es recomendable que el perxido de hidrgeno se pruebe con organismos de control positivo y negativo, para garantizar su eficacia. b).-COAGULASA: Prueba en portaobjetos (coagulasa fija): 1.- Coloca una gota de agua destilada o solucin salina fisiolgica estril sobre un portaobjetos. 2.- Emulsionar suavemente una suspensin del organismo en estudio en la gota de agua utilizando un asa o una varilla. 3.- Coloca una gota del plasma junto a la gota de la suspensin bacteriana. Mezclarlas bien. 4.- Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formacin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. INTERPRETACIN: Una reaccin positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparicin de un precipitado granular o la formacin de grumos blancos. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin en 2 o 3 minutos. Esta prueba solo se considera presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos debido a que algunas cepas de S. aureus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba en portaobjetos. Prueba en tubos (coagulasa libre): 1.- Colocar aspticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo estril. 2.- Aadir 0.5 ml de un cultivo puro de 18 a 24 horas en caldo del organismo por investigar (caldo BHI). 3.- Mezclar por rotacin suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido. 4.- Colocar el tubo en un bao de agua a 37C. Observar la formacin de un coagulo visible. INTERPRETACIN: La reaccin se considera positiva ante cualquier grado de coagulacin visible dentro del tubo. La reaccin se observa mejor inclinando el tubo. Si es positiva, el coagulo o gel permanece en el fondo del tubo. Las bacterias fuertemente coagulasa positivas pueden producir un coagulo en 1 a 4 horas; por lo tanto, se recomienda observar el tubo a intervalos de 30 minutos durante las primeras 4 horas de la prueba. Algunas cepas de S. aureus pueden formar fuertes fibrinolisinas que disuelven el coagulo recin formado. Por consiguiente, pruebas positivas pueden pasar inadvertidas si no se observa el tubo a intervalos frecuentes. Otras cepas de S. aureus pueden producir slo suficiente coagulasa como para dar una reaccin positiva tarda luego de 18 a 24 horas de incubacin; por lo tanto, todas las pruebas negativas a las 4 horas, deben observarse despus de las 18 a 24 horas de incubacin.

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Nota: la coagubilidad del plasma utilizado puede comprobarse aadiendo 1 gota de cloruro de calcio al 5% a 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido. Se debe formar un coagulo en 10 o 15 seg. Cada ampolleta de plasma reconstituida debe ensayarse con organismos de control positivo (S. aureus coagulasa positiva) y una cepa coagulasa negativo (S. epidermidis). CUESTIONARIO 1.- Por qu en la prueba de la catalasa es recomendable manipular la muestra con un aplicador de madera y no con un asa metlica? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Por qu en la prueba de la coagulasa no se recomienda utilizar plasma citratado? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

3.- Indica 3 pruebas ms que nos permitan la identificacin plena de Staphylococcus aureus __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Conclusiones:______________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realizacin:_______________________________

___________________________ Vo.Bo. del maestro 21

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no. 6 NOMBRE DE LA PRCTICA: Antiestreptolisinas COMPETENCIA: Determina los ttulos de Antiestreptolisinas en el suero de un paciente, para detectar infecciones por estreptococos -hemolticos del grupo A. MATERIAL: Equipo de estreptolisina O de Beli Termmetro Centrfuga Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml. Tubos de ensaye de 12x75 Suspensin de glbulos rojos lavados al 5% Sangre sin anticoagulante del paciente

Bao mara a 37C Sol. Amortiguadora de pH (6.5-6.7) Pipetas pasteur Solucin salina fisiolgica Gradilla

INTRODUCCIN Es importante que el estreptococo - hemoltico del grupo A sea identificado correctamente en el laboratorio porque es necesario implementar un rpido tratamiento del paciente infectado, no slo para controlar la infeccin primaria (faringitis aguda, Hypoderma, escarlatina, erisipela o celulitis), sino tambin para prevenir las complicaciones potenciales serias, como fiebre reumtica, endocarditis y valvulitas reumtica y glomerulonefritis aguda o crnica. Entre las pruebas para su deteccin tenemos el cultivo en agar sangre con la manifestacin de la -hemlisis, sensibilidad a la bacitracina, determinacin serolgica de Antiestreptolisinas, entre otras muchas. El estreptococo pyogenes (grupo A) produce diversas sustancias y toxinas extracelulares. Las dos hemolisinas, estreptolisina O y estreptolisina S, lbil y estable frente al oxgeno respectivamente, pueden lisar eritrocitos humanos y de otras especies as como las membranas celulares de los PMNS, plaquetas y otras clulas. La estreptolisina O es antignica; es decir, estimula al paciente infectado la produccin de anticuerpos, las Antiestreptolisinas, que determinadas en el laboratorio pueden ser de utilidad para diagnosticar infecciones por este microorganismo. DESARROLLO 1.- Extraer una muestra de sangre del paciente, recolectndola en un tubo seco (sin anticoagulante) y una vez bien coagulada la sangre, centrifugar para separar el suero. Es importante que evites que se hemolice la muestra. 2.- Obtener una muestra de sangre con anticoagulante (EDTA) y preparar la suspensin de glbulos rojos lavados al 5% en sol. Amortiguadora. La sangre humana y la del conejo son igualmente satisfactorias. Una cantidad apropiada de sangre (desfibrinada o con anticoagulante) se centrifuga a 2000 rpm durante 5 min., el sobrenadante es descartado y el paquete de glbulos se lava agregando solucin salina al 0.85 %, centrifugndose nuevamente. 22

Este procedimiento es repetido 3 veces, debiendo ser claro el sobrenadante en el ltimo lavado. Lo contrario indicara que los glbulos rojos estn frgiles y no deben ser usados. Los glbulos rojos se suspenden en solucin amortiguadora a una concentracin final de 5 %. 3.- La estreptolisina O BELI se presenta en forma oxidada que es estable, pero no es activa MODO DE ACTIVARLA: a) Se reconstituye con agua destilada con el volumen indicado en la etiqueta del frasco. b) Para cada 5 ml. De estreptolisina se adiciona el hidrosulfito de sodio contenido en uno de los tubos capilares que se adjuntan. c) Se agita por inversin hasta que se disuelva, encontrndose ahora en su forma activa. Una vez aadida el hidrosulfito de sodio la estreptolisina debe ser empleada se inmediato, ya que al reoxidarse esta se inactiva. La estreptolisina reconstituida mientras no sea reducida puede conservarse en congelacin sin que su potencia se altere por periodos hasta de un mes. 4.- Las diluciones del suero problema y la suspensin de glbulos rojos deben ser preparadas con solucin amortiguadora de pH 6.5-6.7. La solucin amortiguadora puede prepararse disolviendo 7.4 grs. de NaCl, 3.7 grs. De KH2PO4 y 1.81 grs. De Na2HPO4 en 1000 ml de agua destilada ajustndose el pH a 6.5-6.7 con solucin de NaOH 0.1 N.

Diluciones del suero: las soluciones siguientes se hacen usando solucin amortiguadora como diluyente: 1:10 0.5ml de la solucin 1:10 + 4.5 ml de solucin amortiguadora 1:100 1.0 ml de suero + 9 ml de solucin amortiguadora 1:500 2.0 ml de dilucin 1:100 + 8.0 ml de solucin amortiguadora 1. La prueba se monta de acuerdo con el siguiente protocolo: DILUCIONES DEL SUERO PROBLEMA Tubos Volumen de la disolucin en ml Volumen de la solucin salina amortiguada en ml
1:10 1 2 0.8 0.2 0.2 0.8 3 1. 0.0 4 0.8 0.2 1:100 5 0.6 0.4 6 0.4 0.6 7 0.3 0.7 8 1.0 0.0 9 0.8 0.2 10 0.6 0.4 1:500 11 12 0.4 0.2 0.6 0.8 13 0 1.5 14 0 1.0

AGITAR LOS TUBOS

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Volumen de estreptolisina en ml Volumen de la suspensin de glbulos rojos en ml.

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.0

0.5

0.5

AGITAR E INCUBAR A 37 C DURANTE 15 MINUTOS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

AGITAR E INCUBAR A37 C DURANTE 45 MIN TENIENDO CUIDADO DE AGITAR LOS TUBOS DURANTE ESTE TIEMPO CADA 15 MINUTOS. CENTRIFUGAR LOS TUBOS DURANTE 1 MINUTO A 1500 RPM

Titulo en unidades Todd

12

50

100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500

INTERPRETACION: el ttulo de Antiestreptolisinas O, se expresa en unidades Todd. Estas unidades son la recproca de la dilucin ms alta del suero que neutraliza completamente la estreptolisina O. As, un suero que no representa hemlisis de los tubos 1 a 4, huellas de hemlisis en el tubo 5 hemlisis completa en todos los dems, es reportado como 125 unidades Todd. Patrn de Antiestreptolisinas.- el patrn de Antiestreptolisinas es suero o gama globulina estandarizada para ser usada como control. Despus de haber sido diluida 1:5 con solucin amortiguadora, debe ser usado como la dilucin 1: 100 del suero, en el rango de 100 a 333 en tubos 3 a 7 como se muestra en el cuadro. Debe ser un punto final equivalente a 166 unidades Todd por ml., o sea, ausencia de hemlisis en los tubos 3, 4 y 5 y hemlisis en los tubos 6 y 7. Despus de reconstituido el producto debe ser usado el mismo da. CUESTIONARIO 1.- Elabora un diagrama de flujo donde indiques el proceso completo (tcnicas y pruebas) necesario para la identificacin de una infeccin de estreptococo hemolticos desde que el paciente se presenta al laboratorio. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Explica por qu cuando se requiere aislar estreptococo pyogenes -hemoltico en agar sangre, es necesario ranurar el medio? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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3.- Explica en qu consiste la enfermedad de la fiebre reumtica y cules pueden ser sus complicaciones si no se controla? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Conclusiones:______________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realizacin:_______________________________

____________________________ Vo.Bo. del maestro

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos Prctica no. 7 NOMBRE DE LA PRCTICA: Determinacin de Factor Reumatoide COMPETENCIA: Realiza la determinacin del Factor Reumatoide, como una prueba ms para la deteccin de infecciones reumticas, como la artritis reumatoide. MATERIAL: Un equipo de Reumaclin de sanofi o similar que contiene los siguientes reactivos: REACTIVOS: 1 Reactivo de ltex sensibilizado (almacenar a Temp. De +2 a +8 C) 2 Frascos con 60 ml de solucin amortiguadora 1 Frasco con suero control positivo 1 Frasco con reactivo control negativo Laminillas con 3 reas marcadas, con fondo negro para realizar la prueba. Aplicadores de madera Jeringa, torundas con alcohol y torniquete Tubo rojo o con gel para la toma de sangre. Rotor Reloj o cronmetro INTRODUCCIN FACTOR REUMATOIDE Definicin: Inmunoglobulina presente en el suero del 50-95 por ciento de los adultos que tienen artritis reumatoide y que sirve para diagnosticar e investigar la enfermedad. El factor reumatoide (FR) es una prueba que mide la presencia y nivel de la IgM especfica contra las inmunoglobulinas IgG anormales, producidas por los linfocitos de la membrana sinovial, de las articulaciones de personas afectadas por la artritis reumatoide. La artritis reumatoide es una enfermedad crnica, que produce la inflamacin de las articulaciones principalmente de manos y pies. Cuando se originan estas inmunoglobulinas IgG y se fija la IgM, se forman inmunocomplejos IgG-IgM que activan el complemento y otros factores inflamatorios que producen secundariamente la destruccin de las articulaciones afectadas. Por ello se le llama una enfermedad autoinmune, ya que es el sistema inmunitario del individuo el que destruye tejidos del propio cuerpo. Varias pruebas para ponerlos en evidencia se basan en provocar la reaccin antigeno-anticuerpo, de modo que el suero del enfermo aglutine partculas

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hemates, ltex, bentonita, etc. A las que se ha fijado una capa de globulina gamma No es un anlisis especfico de esta enfermedad, aparece positivo en el 80% de los pacientes con artritis reumatoide, pero puede aparecer negativo. Inclusive puede aparecer positivo en otras enfermedades no relacionadas (Lupus Eritematoso Sistmico, Leucemia, Sndrome Nefrtico etc.) En personas de la tercera edad pueden aparecer niveles elevados sin repercusin clnica. DESARROLLO METODO CUALITATIVO EN PLACA 1. Dejar que los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente. 2. Preparar una dilucin 1:20 del suero problema; diluyendo 0.1 ml del suero con 1.9 ml de solucin amortiguadora. 3. Poner 1 gota (aproximada mente 0.05 ml) del suero diluido en las reas marcadas en la laminilla 4. Colocar una gota del suero control (+) y (-) en las reas marcadas del la laminilla. 5. Mezclar el reactivo de ltex Reumaclin hasta obtener una suspensin homognea y aadir 1 gota de reactivo de ltex a cada uno de los sueros controles. 6. Mezclar con aplicadores diferentes por cada rea 7. Mover en un ngulo de 45 la laminilla por 2 minutos 8. Observar inmediatamente la aglutinacin utilizando una fuente de luz directa, comparar las reacciones del suero y de los controles.

INTERPRETACION La aglutinacin de las partculas de ltex indica una reaccin positiva (+). Si es as, realizar la prueba cuantitativa. La no aglutinacin o una ligera aparicin de granulosidad que no exceda a la observada en el control (-), indica un resultado (-). Nota: la sensibilidad del reactivo de ltex es 3UI/ml.

CUESTIONARIO 1. Define qu es el factor reumatoide: _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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2. Por qu no es aconsejable trabajar con sueros con alto contenido de lpidos, o que el plasma tenga fibrina? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

3. Por qu la artritis reumatoide se considera una enfermedad autoinmune?. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________________________________________ CONCLUSIONES:___________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realizacin:_______________________________

____________________________ Vo.Bo. del maestro

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos Prctica no. 8 NOMBRE DE LA PRCTICA: Protena C reactiva COMPETENCIA: Determina y cuantifica la protena C reactiva en suero sanguneo humano que cursa con un proceso inflamatorio o necrtico. REACTIVOS: Un equipo para PCR que contiene los siguientes reactivos: un Ltex anti protena C reactiva (conservar entre 2 y 8 C) un Suero control positivo Un Suero control negativo MATERIAL: Laminillas con 3 reas marcadas, con fondo negro para realizar la prueba. Aplicadores de madera Jeringa, torundas con alcohol y torniquete Tubo rojo o con gel para la toma de sangre. Rotor Reloj o cronmetro Centrfuga Pipeta pasteur Pipetas graduadas de 5 ml Pipetas pistn de 100 y 500 micro litros Perilla de tres vas

INTRODUCCIN La protena C-reactiva es un tipo especial de protena producida por el hgado que slo est presente durante episodios de inflamacin aguda. El aspecto ms importante de la PCR es su interaccin con el sistema del complemento, el cual es uno de los mecanismos de defensa contra elementos extraos. A pesar de que ste no es un examen especfico, s advierte de forma general sobre la presencia de un proceso inflamatorio agudo. El mdico puede utilizar este examen para evaluar una exacerbacin de artritis reumatoide o de fiebre reumtica. El examen tambin puede ser til para evaluar la respuesta a la terapia. La protena C reactiva no se eleva de forma habitual en enfermedades producidas por virus. La protena C reactiva se eleva ante un problema infeccioso o inflamatorio antes que la VSG y comienza a disminuir ante la recuperacin de la enfermedad.

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Si se trata la enfermedad con aspirina o antiinflamatorios desaparece su elevacin. La protena C reactiva aparece elevada en el infarto de miocardio. Tambin puede ser de ayuda tras una intervencin de ciruga, ya que aparece elevada durante 3 4 das, para luego disminuir, si persiste elevada es que hay alguna infeccin o complicacin post-quirrgica. PROCEDIMIENTO PRUEBA CUALITATIVA 1. Extraiga sangre sin anticoagulante, Centrifuga durante 5 minutos a 2000 rpm y separe el suero. 2. Diluya el suero a probar (1:40) con solucin salina amortiguadora: 2 gotas (0.1 ml) del suero en 3.9 ml de solucin salina amortiguadora. 3. Coloque una gota de la solucin anterior en una de las divisiones de la placa de vidrio, en las otras reas coloca una gota de suero control negativo y suero control positivo. 4. Aada una gota de ltex anti protena C reactiva a cada una de las muestras. 5. Oscile suavemente la placa durante 2 minutos y observe si se presenta aglutinacin macroscpica. INTERPRETACION Positivo: Aglutinacin visible con formacin de grandes agregados y fondo claro comparable al control positivo. Si la prueba de suero sale positiva se deber realizar la prueba cuantitativa. Negativo: Suspensin uniforme sin aglutinacin visible, comparable al control negativo. En ocasiones se pueden apreciar finas granulaciones que no exceden a las observadas con el control negativo, por lo que este fenmeno no deber interpretarse como aglutinacin. PRUEBA CUANTITATIVA: 1. Prepare diluciones del suero problema en solucin salina de la siguiente manera: Coloque 5 tubos de ensayo en una gradilla, deposite 0.5 ml de solucin salina en cada uno de los tubos. Aada0.5 ml del suero diluido1:40 (ver prueba cualitativo) al primer tubo. mezcle bien y transfiera 0.5 ml de la dilucin anterior al segundo tubo. Contine efectuando la misma operacin hasta terminar con el tubo No.5. TUBO 1 1/80 2 1/160

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3 1/320 4 1/640 5 1/1280 2. Utilizando un capilar o gotero, ponga una gota de cada dilucin en las divisiones de la placa de vidrio previamente marcadas. 3. Aada una gota de ltex anti protena C reactiva a cada divisin. 4. Mezcle con un aplicador, desde la dilucin ms elevada hasta la ms baja y extienda por toda el rea del ovalo 5. Oscile suavemente la placa durante 2 minutos y observe si se presenta aglutinacin macroscpica. INTERPRETACION La dilucin ms elevada del suero que muestre aglutinacin visible, se considera como el titulo de protena C reactiva en el suero plasma.

CUESTIONARIO 1.- Para qu se realiza la determinacin de la protena C reactiva? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- En qu casos pueden elevarse los niveles de PCR?: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3.- Cules son los niveles normales de PCR?: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ CONCLUSIONES:___________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realizacin:_______________________________

____________________________ Vo.Bo. del maestro 31

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos Prctica no. 9 NOMBRE DE LA PRCTICA: Reacciones febriles COMPETENCIA: Determina y cuantifica a travs de pruebas serolgicas, los ttulos de anticuerpos contra antgenos bacterianos para evaluar la presencia de enfermedades como fiebre tifoidea, brucelosis, entre otras; que se caracterizan por provocar en el paciente un sndrome febril. REACTIVOS: Un equipo para Reacciones Febriles que contiene los siguientes antgenos: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. MATERIAL: Placa de vidrio con excavaciones para serologa. Aplicadores de madera. Jeringa, torundas con alcohol y torniquete. Tubo rojo o con gel para la toma de sangre. Rotor. Reloj o cronmetro. Centrfuga. Pipeta pasteur. Pipeta pistn de 40, 20, 10 y 5 micro litros. Tfico O (antgeno somtico) Tfico H (antgeno flagelar) Paratfico A (antgeno flagelar) Paratfico B (antgeno flagelar) Brucella abortus Proteus OX-19 Suero control positivo Suero control negativo

INTRODUCCIN Esta prueba representa un mtodo de laboratorio til para seguir la secuencia de ciertas infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacciones de aglutinacin entre los antgenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los anticuerpos contra estos antgenos presentes en el suero del paciente.

La tcnica comprende: 32

1. - Reaccin de Widal para diagnstico de la fiebre tifoidea, entrica y ondulante. La reaccin mide el ttulo de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspensin de antgenos conocidos de Salmonella typi, S.paratyphi A y S.paratyphi B. 2.- Reaccin de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B. melitensis). 3.- Reaccin de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo, tienen componentes antignicos idnticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OXK). En esta prueba se utilizan antgenos de Proteus para diagnstico de tifo. PROCEDIMIENTO 1. Extraiga sangre sin anticoagulante y una vez que se coagule bien, centrifugar 5 minutos a 3000 rev/ minuto. 2. Con ayuda de una pipeta pasteur transfiera el suero a un tubo limpio y procede de la siguiente manera: EXCAVACIN 1 2 3 4 5 6 7 8 SUERO (ml) 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.02 0.02 ANTIGENO (1 gota ) Tfico O Tfico H Paratfico A Paratfico B Brucella abortus Proteus OX-19 Suero control positivo Suero control negativo Ttulos 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20

3. Mezclar con aplicadores de madera y poner en el rotor por 7 min. Verificar que prueba te da positiva; es decir cual prueba manifiesta franca glutinacin. Realiza la observacin al microscopio con objetivo seco dbil para determinar la aglutinacin. 4. Una vez que establezcas que antgenos dan positivo, solo a estos les realizaras las pruebas con los siguientes volmenes de suero. Por ejemplo, si te dieron positivo los antgenos O y H : SUERO Tfico O SUERO (ml) Tfico H TITULOS 0.04 1 gota 0.04 1 gota 1:40 0.02 1 gota 0.02 1 gota 1:80 0.01 1 gota 0.01 1 gota 1:160 0.005 1 gota 0.005 1 gota 1:320

5. Mezclar con aplicadores de madera, agitar por 7 minutos en el rotor y verificar hasta que ttulos manifiesta franca aglutinacin, para que reportes

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el resultado final de cada prueba. Recuerda verificar la aglutinacin al microscopio con objetivo seco dbil. 6. La siguiente tabla te ayudara a realizar la interpretacin de los resultados y los controles precisamente te ayudaran para verificar el equipo y adems, como se debe ver una prueba positiva (aglutinada) de una negativa (no aglutinada).

SUERO PROBLEMA (ml) 0.08 0.04 0.02 0.02 0.005 0.02 de suero control positivo 0.02 de suero control negativo

ANTGENO 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota

TTULOS 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:80 NO AGLUTINA

CUESTIONARIO 1. Describe brevemente las enfermedades: fiebre tifoidea, paratifoidea, brucelosis, infeccin por Rickettsias. ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 2. Por qu se dice que las reacciones febriles son poco especficas? ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 3. Cmo podemos determinar si la infeccin esta activa o es por la presencia de anticuerpos de memoria?

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__________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 4. Qu resultados se espera en las pruebas si un paciente? a. Padeci anteriormente una infeccin por tifoidea, __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ b. Recibi tratamiento con antibiticos __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ c. O fue vacunado anteriormente. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 5. Qu otras pruebas se puede realizar en el paciente para verificar estas enfermedades, y que adems sean pruebas ms especficas? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

CONCLUSIONES:___________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo_______ Fecha de realizacin:_______________________________

____________________________ Vo.Bo. del maestro

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos Prctica no. 10 NOMBRE DE LA PRCTICA: Coprocultivo COMPETENCIA: Identifica Enterobacterias por medio del coprocultivo. MATERIAL: Asa bacteriolgica Mechero Fisher Estufa de incubacin a 37C Agares estriles de SS, EMB, Mc Conkey, Caldo tetrationato, agar sulfito bismuto Agar verde brillante. Una muestra de heces recolectada en frasco estril Hisopos estriles INTRODUCCIN Las Enterobacterias representan la mayor parte de la flora microbiana del tracto intestinal del hombre. En ella se incluyen grmenes comensales (Proteus y bacilos coliformes), as como patgenos del gnero Salmonella y Shigella. El vibrin colrico puede ser aislado de casos de clera. Durante las infecciones entricas, cuando se presentan patgenos tales como Salmonella y Shigella, el bacterilogo debe distinguir entre los habitantes normales del intestino y los agentes etiolgicos de enfermedad. Es importante destacar que las bacterias intestinales toman parte en los procesos digestivos tanto del hombre como de los animales. Ellos ayudan a la sntesis de vitaminas del complejo B y de la vitamina K. La materia fecal evacuada debe ser reciente y deben cultivarse lo ms pronto posible despus de haber sido recolectada. Las muestras debern obtenerse al inicio del cuadro clnico, antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano. Las muestras de heces se pueden tomar directamente en un frasco limpio de boca ancha y con tapa hermtica, de preferencia estril. Si la muestra se toma en el mismo laboratorio donde se va a realizar el aislamiento, no es necesario usar medio de transporte y hay que sembrar de inmediato. En estudios de campo o cuando el laboratorio no est cercano, la muestra se toma con un hisopo, el cual debe quedar bien impregnado de materia fecal. El hisopo se coloca en un medio de transporte como el Cary-blair. PROCEDIMIENTO 1. Introducir un hisopo estril en varios puntos de la muestra. 2. Descargar la muestra en un rea pequea de los medios de cultivo: SS, Mc Conkey y EMB y realizar el estriado. 3. Incubar las cajas a 37C durante 24 o 48 horas 4. Observar las caractersticas morfolgicas de las colonias desarrolladas indicando si existen cambios en el medio, pigmentos en la colonia etc.

36

5. Tratar de identificar si existe crecimiento de Salmonella o Shigella que se manifiestan como colonias de color blanco en Mc Conkey e incoloras en EMB. 6. Al mismo tiempo que las placas, con la muestra fecal se inocula un medio de enriquecimiento como el caldo tetrationato, colocando el hisopo impregnado con la muestra en el caldo al cual se le agreg previamente 0.2 ml de yodo por gramo de materia fecal. 7. Incubar este medio de enriquecimiento por 12 o 18 horas a 37C 8. A partir del caldo tetrationato se siembran placas con medios inhibitorios como el agar verde brillante y el agar sulfito de bismuto, este ltimo si se est buscando S. typhi. Despus de incubar a 37C durante 24 horas la placa de verde brillante y 48 horas la de sulfito bismuto, se revisan cuidadosamente en busca de colonias sospechosas. En el verde brillante Salmonella crece como colonias rojas y en sulfito de bismuto como colonias negras. 9. Para mayor seguridad en la identificacin de Enterobacterias es necesario realizar pruebas bioqumicas a las cepas aisladas en los medios de cultivo. Las ms comunes son IMVIC En el siguiente cuadro indica las caractersticas morfolgicas de las diferentes bacterias en cada uno de los medios de cultivo:

MEDIO DE CULTIVO EMB

Escherichia coli

Salmonella

Shigella

Agar SS

Agar sulfito bismuto

Agar verde brillante

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CUESTIONARIO 1.- Cules son las principales bacterias patgenas que pueden ser aisladas por medio del coprocultivo? Qu enfermedades producen cada una de stas? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Investiga el protocolo para el aislamiento e identificacin del vibrin cholerae: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3.- Explica brevemente en qu consisten las pruebas de Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato (IMVIC): __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ CONCLUSIONES:___________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realizacin:_______________________________

____________________________ Vo. Bo. del maestro 38

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no. 11 NOMBRE DE LA PRCTICA: Identifica Enterobacterias a travs de pruebas bioqumicas (IMVIC) COMPETENCIA: Realiza la prueba bioqumica del Indol, rojo de metilo, voguesproskauer y citrato para la diferenciacin de Enterobacterias, especialmente de Escherichia coli. MATERIAL: Caldo triptfano (MIO o SIM) Reactivo de Kovac Cepa reciente del organismo en estudio. Caldo RM/VP Medio de Citrato Simmons Reactivo de alfa-naftol al 5% Tubos de ensaye de 13x100 Pipetas pasteur

Reactivo de Ehrlich Indicador de pH de rojo de metilo Cloroformo KOH al 40% Pipetas graduadas de 5 ml Incubadora

INTRODUCCIN El indol, es un bencilpirrol, es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos, siendo especialmente til para diferenciar Escherichia coli (positiva) de miembros del grupo KlebsiellaEnterobacter (la mayora negativos). La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovac y ehrlich. Se debe utilizar un medio rico en triptfano. En la prctica se emplean medios combinados tales como sulfuro-indol-movilidad (SIM), movilidad-indol-ornitina (MIO) o indol-nitrato. La prueba de rojo de metilo es cuantitativa para la produccin de cido y requiere organismos positivos que produzcan cidos fuertes (lctico, actico, frmico) a partir de glucosa, por la va de la fermentacin cida mixta. Dado que son muchas las especies de Enterobacterias que pueden producir cantidades suficientes de cidos fuertes detectables con el indicador rojo de metilo durante la fase inicial de la incubacin, slo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que pueden mantener este pH bajo luego de una incubacin prolongada (48 a 72 horas), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.

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La reaccin de Voges-proskauer: el cido pirvico, componente fundamental formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, es metabolizado luego a travs de varias vas, de acuerdo con los sistemas enzimticos que poseen las diferentes bacterias. Una de dichas vas lleva a la produccin de acetona (acetilmetilcarbinol), un subproducto de reaccin neutra. Los organismos tales como los miembros del grupo Klebsiella-Enterobacter producen acetona como principal subproducto del metabolismo de la glucosa y forman cantidades menores de cidos mixtos. En presencia de oxgeno atmosfrico y de hidrxido de potasio al 40%, la acetona se convierte en diacetil y el alfa-naftol acta como catalizador para revelar un complejo color rojo. Citrato: la utilizacin de citrato por una bacteria se detecta en un medio con citrato mediante la formacin de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un anin como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la + sal de amonio, con produccin de amonaco (NH3 ) alcalinizando el medio por conversin del amoniaco en hidrxido de amonio (NH4OH). El azul de bromotimol, amarillo a pH menor a 6 y azul a pH mayor de 7.6 es el indicador. DESARROLLO a.- Prueba de Indol 1.- Inocular caldo triptfano (u otro medio con indol) con el organismo en estudio e incubar a 35-37C. 2.- Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. Si se emplea reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por la adicin de 1 ml de cloroformo. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac. INTERPRETACIN El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo (o en la capa de cloroformo) segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. NOTA: Es aconsejable probar los reactivos con controles positivos (Escherichia coli) y negativos (Klebsiella pneumoniae). b.- Prueba de Rojo de Metilo 1.- Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro del organismo en estudio. Incubar a 35C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas). Finalizado este perodo, aadir directamente al caldo 5 gotas de reactivo de rojo de metilo.

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INTERPRETACIN: El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la produccin de cido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden producir cantidades menores de cido a partir del sustrato, es posible el desarrollo de un color naranja intermedio entre el amarillo y el rojo. Esto no indica una prueba positiva. Nota: no olvidar probar medios y reactivos con controles positivos y negativos. c.- Prueba de Voges-proskauer 1.- Inocular un tubo de caldo RM/VP con un cultivo puro del organismo en estudio. Incubar durante 24 horas a 35C. Al finalizar este periodo, transferir 1 ml de caldo a un tubo de ensayo limpio. Aadir 0.6 ml de alfa-naftol al 5% y 0.2 ml de KOH al 40%. Es esencial adicionar los reactivos en ese orden. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 o 15 minutos. INTERPRETACIN: Una prueba positiva est indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de aadir los reactivos, revelando la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona. Las pruebas no deben leerse luego de ms de 1 hora, ya que cultivos de voges-proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, con la consecuente posibilidad de una interpretacin falsa positiva. d.- Prueba de Citrato 1.- Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario e inocularla en una sola estra en el pico de agar citrato de Simmons. Incubar a 35C durante 24 a 48 horas. INTERPRETACIN: El desarrollo de un color azul intenso en 24 a 48 horas indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formacin de productos alcalinos. CUESTIONARIO 1. Por qu es importante que las cepas de los organismos en estudio sean recientes para estas pruebas? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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2.- En la prueba de Indol, por qu utilizas cloroformo cuando usas el reactivo de Ehrlich? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

3.- Por qu se recomienda la utilizacin de controles para cada una de las pruebas? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Conclusiones:______________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno:______________________________ 6to sem. Gpo._______ Fecha de realizacin:______________________________________

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.12 NOMBRE DE LA PRCTICA: Urocultivo COMPETENCIA: Identifica la diferente flora patgena que puede desarrollarse en el tracto urinario. MATERIAL: SUSTANCIAS: Muestra de orina tomada en frasco estril Agar EMB Agar sangre Agar Mc Conkey Agar Salado manitol Agar nutritivo

Asa bacteriolgica Porta objetos Cubre objetos Centrfuga Microscopio Incubadora Mechero Fisher Cajas de Petri estriles Pipetas de 1ml estriles Tubos de ensayo conteniendo 9 ml de agua peptonada, estriles

INTRODUCCIN Las infecciones urinarias pertenecen al grupo de los procesos infecciosos ms frecuentes de la patologa mdica. Su importancia radica en el dao que pueden ocasionar sobre la funcin renal. Las vas urinarias normalmente son estriles por encima del nivel de la uretra distal. Los microorganismos que infectan las vas urinarias altas son comensales localizados en reas vecinas. En esta colonizacin intervienen varios factores predisponentes que pueden ser de origen local o general. Los primeros incluyen la contaminacin fecal del meato urinario, el cateterismo, la patologa urinaria congnita o adquirida y el reflujo vesical. Entre los factores generales estn la diabetes mellitus, el embarazo y la terapia con frmacos de amplio espectro. Las bacterias que con mayor frecuencia se aslan de la orina de pacientes ambulatorios con infeccin urinaria son: Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticcus, Proteus sp, Klebsiella sp, Enterococcus faecalis etc. Para lograr que el cultivo de orina realmente sea veraz, requiere que las muestras sean obtenidas en condiciones ptimas. PROCEDIMIENTO El Urocultivo incluye: 1) Aislamiento e identificacin de microorganismos 2) Cuenta viable 3) Antibiograma para los grmenes patgenos aislados e identificados 43

1) Aislamiento e identificacin de los microorganismos a) Mezclar perfectamente el frasco con la muestra de orina y depositar aproximadamente entre 5 y 10 ml de orina en un tubo. b) Centrifugarla durante 5 minutos a 3500 r.p.m. c) Se desecha el sobrenadante dejando solo unas gotas de orina residual para emulsionar el sedimento. d) Con la suspensin del sedimento se lleva a cabo el estudio microscpico directo, tomando una gota del sedimento que se deposita en un portaobjetos, colocndole un cubreobjetos. e) Observarlo al microscopio con el objetivo seco fuerte, e identificar lo observado. f) Mediante un asa de platino se hacen siembras por aislamiento en estras del sedimento, obtenido al centrifugar una muestra de la orina colocada en tubo estril y centrifugada. La siembra se realiza en los siguientes medios de cultivo. AS, Mc Conkey, ASM y EMB g) Los medios inoculados se incuban a 37C entre 24 y 48 horas. h) Observar las caractersticas de cultivo de las colonias desarrolladas en los diversos medios. Si es necesario, realizar pruebas bioqumicas para confirmacin de la especie bacteriana. i) Preparar frotis para realizar una tincin de Gram para el estudio de morfologa microscpica. 2) Cuenta viable a) Realizar diluciones de la orina de la siguiente manera: Colocar 5 tubos estriles conteniendo 9 ml. de agua peptonada. La cantidad de tubos utilizada depender de la carga bacteriana observada en el examen microscpico del sedimento urinario Tomar 1ml. de la orina problema con una pipeta estril, y agregarlo al tubo No.1. (dil. 1:10), agitar el tubo y tomar de este 1ml. para pasarlo al tubo No.2, (dil 1:100) realizar el mismo paso las veces que sea necesario rotulando el tubo con la dilucin correspondiente. Recuerda que el nmero de diluciones depender de la carga bacteriana. b) Colocar 1ml de cada dilucin en diferentes cajas de Petri estriles y rotularlas con la correspondiente dilucin. c) Vaciar en estas cajas de 15 a 20 ml de Agar nutritivo fundido a Bao Mara previamente enfriado hasta que alcance una temperatura que soporte la piel de tu mano (debes evitar que solidifique). d) Mezclar perfectamente por rotacin suave este agar con la dilucin y dejar que solidifique. Incubar las cajas a 37C durante 24 a 48 horas e) Contar el nmero de colonias desarrolladas, para esto seleccionar para su lectura, la placa que muestre entre 30 a 300 colonias. 44

f) Reportar la cuenta bacteriana de la siguiente manera: Nmero de colonias contadas X el factor de dilucin de la caja en la que se observa y cuentan las colonias bacterianas = Unidades Formadoras de Colonias por ml. (UFC/ml).

CUESTIONARIO 1.- Realiza un diagrama de flujo que indique los pasos a seguir para el Urocultivo: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Cules son las principales bacterias que pueden presentarse infectando las vas urinarias? Por qu? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3.- Explica detalladamente las tcnicas de recoleccin de muestras de orinas para Urocultivo, tanto en adultos como en lactantes. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ CONCLUSIONES:___________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realizacin:_______________________________

___________________________ Vo.Bo. del maestro

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.13 NOMBRE DE LA PRCTICA: Tincin de Ziehl- Neelsen COMPETENCIA: Identifica las Bacterias Alcohol Acido resistentes (BAAR), como las del Gnero Mycobacterium, utilizando la tincin de Ziehl-Neelsen. MATERIAL: Aplicadores de madera Mechero Fisher Papel de estraza Portaobjetos nuevos Muestra de expectoracin

Colorante de carbolfucsina o Fucsina fenicada Alcohol cido Colorante de azul de metileno Fenol

INTRODUCCIN La propiedad tintorial que presentan numerosas bacterias de resistir la decoloracin con cidos fuertes, despus de teirlas con soluciones de fucsina caliente, permite reunirlas bajo la denominacin general de bacterias acidorresistentes o alcohol acidorresistentes. Es caracterstica del gnero Mycobacterium, junto con su tamao y forma caracterstica, constituyen una ayuda valiosa para la deteccin temprana de infecciones y para el control del tratamiento de enfermedades micobacterianas. La presencia de bacilos cido-alcohol resistentes en el esputo, en combinacin con antecedentes de tos, prdida de peso y una radiografa de trax que muestra un infiltrado pulmonar, todava es evidencia presuntiva de tuberculosis. Se ha estimado que cuando se emplean las tcnicas de concentracin estndar, se necesitan aproximadamente 10,000 bacilos cido-alcohol-resistentes por mililitro de esputo para ser detectados microscpicamente. Los pacientes con enfermedad extensa albergan gran nmero de micobacterias con una buena correlacin entre frotis positivos y cultivos positivos puede ser slo de 25% a 40%. Los extendidos con esta coloracin tambin son tiles para seguir la respuesta del paciente al tratamiento. Despus de comenzar con las drogas antimicobacterianas, los cultivos se tornan negativos antes que los extendidos, lo que sugiere que los microorganismos no son capaces de replicarse pero pueden unirse al colorante. Con tratamiento continuado, ms microorganismos son destruidos y muy pocos permanecen de modo que evaluando el nmero de microorganismos en el esputo durante el tratamiento se puede tener una medida objetiva de la respuesta. Si despus de iniciado el tratamiento el nmero de microorganismos no disminuyera, deber considerarse la posibilidad de resistencia a la droga, caso en el cual habr que realizar cultivos adicionales y estudios de susceptibilidad.

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PROCEDIMIENTO 1.- Colocar papel de estraza sobre la mesa para trabajar. Colocar un frasco con fenol al 5% para desechar aplicadores usados. 2.- Usar guantes y cubre bocas 3.- Prender el mechero Fisher y tomar el frasco que contiene la muestra. Abrir el frasco y pasar la boca por la llama del mechero. Es importante trabajar siempre atrs de la llama del mechero. 4.- Romper la punta de un aplicador de madera y con la punta aguzada tomar muestra del esputo. 5.- Descargar la muestra sobre un portaobjetos nuevo, realizando un frotis cuyas dimensiones sean de 20 mm de largo por 10 mm de ancho. Preferentemente en el centro del portaobjetos. 6.- Desechar el aplicador contaminado en el frasco con fenol al 5%. Recuerda la importancia de trabajar por atrs del mechero. 7.- Dejar secar el frotis al aire y fijar con la llama del mechero. Proceder a teir con la tcnica de Ziehl-Neelsen de acuerdo al siguiente protocolo: a. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar 5 minutos a emisin de vapores con ayuda de hisopos de algodn y gasa con alcohol. b. Agregar ms colorante si este empieza a secarse. Es importante evitar la ebullicin c. En forma inclinada lavar con agua destilada el frotis y decolorar agregando alcohol cido de 1 a 2 minutos, dependiendo del grueso del frotis. d. Lavar nuevamente, y quitar el exceso de agua e. Colorear con azul de metileno por 1 minuto. f. Volver a lavar y dejar secar a temperatura ambiente. g. Leer con objetivo de inmersin, en el sentido de las manecillas del reloj 100 campos y contar los BAAR por campo. h. Los bacilos aparecen como bastoncillos delgados, ligeramente curvos, teidos de rojo, generalmente con grnulos ms coloreados en su interior, aislados, en parejas o en grupos, sobre el azul claro de la tincin de contraste.

REPORTE DE RESULTADOS No se encontraron bacilos cido-alcohol resistentes en 100 campos observados 1-9 BAAR Informar el nmero de bacilos observados en 100 campos POSITIVO (+) Menos de 1 bacilo por campo en promedio, en 100 campos observados POSITIVO (++) MS DE 100 De 1 a 10 bacilos por campo en promedio, en 50 campos observados POSITIVO (+++) Ms de 10 bacilos por campo en 20 campos observados NEGATIVO

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CUESTIONARIO 1. Qu microorganismos pueden ser detectados por la tcnica de tincin de Ziehl-Neelsen? Qu enfermedades producen? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2. Por qu es importante trabajar atrs del mechero durante todo el proceso? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3. Por qu es poco prctico el aislamiento y cultivo del bacilo de la tuberculosis? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Conclusiones. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realizacin:__________________________________

___________________ Vo.Bo. del maestro

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.14 NOMBRE DE LA PRCTICA: Diagnstico de Paludismo COMPETENCIA: Realiza las tcnicas de gota gruesa y frotis delgado de sangre para bsqueda e identificacin de parsitos sanguneos, como el Plasmodium, que causa el paludismo en el hombre. MATERIAL: Lancetas estriles Portaobjetos nuevos Agua tamponada a pH de 7.2 Portaobjetos nuevos Piseta Colorante de Giemsa al 10% Alcohol metlico Microscopio Aceite de inmersin

INTRODUCCIN El paludismo, tambin conocido como malaria, es la principal enfermedad parasitaria causante de anemia en el hombre, la ms frecuente dentro de las enfermedades transmitidas por artrpodos y un constante flagelo del hombre en su historia. En Mxico, principalmente el agente etiolgico del paludismo es P. vivax y alrededor del 1% es causada por P. falciparum. El diagnstico por el laboratorio no es una tarea fcil, ya que las parasitemias que se alcanzan son pobres, lo que dificulta su hallazgo. Sin embargo, existen metodologas como la gota gruesa que favorecen su hallazgo. La diferenciacin de las dos especies ms frecuentes en Mxico se basa en la presencia de granulaciones, alteraciones al eritrocito parasitado y caractersticas morfolgicas. ANTECEDENTES HISTRICOS Malaria, paludismo, fiebres paldicas, fiebres intermitentes, fiebres veraniegas, son nombres distintos para una misma enfermedad. El nombre de Malaria fue dado en Italia en 1847 por Torti, porque se crea que era causada por el aire malo (en italiano, mal aria) o miasmas que se desprendan de las aguas estancadas y de los terrenos pantanosos; y el de Paludismo o fiebres paldicas, porque las fiebres predominaban entre los pobladores de las zonas cercanas a pantanos, cuyo nombre en italiano es palude y en latn palus. Livio, Galeno, Celso, Varrn, Vitrubio y Columela describieron perfectamente la enfermedad desde la ms remota antigedad, e Hipcrates se refiere en sus escritos a las fiebres paldicas (an no se le conocan con este nombre) clasificndolas en tres grupos: cotidianas, ternarias y cuaternarias, reconociendo la influencia de las estaciones, las lluvias y las aguas estancadas en la proximidad de los pueblos. Platn, 184 aos A.C., hace referencia del bazo abultado de los 49

enfermos de malaria. El parsito productor del paludismo fue descubierto con la ayuda del microscopio por el mdico francs Charles Louis Alphonse Lavern en el hospital militar de Constantine (Argelia) el da 6 de noviembre de 1880. Al principio crey que se trataba de un alga a la que llam Oscillaria malariae, sin embargo rectific luego denominando al parsito hematozoario. Lavern march a Italia y convenci de su descubrimiento a los malarilogos Marchiafava y Celli, quienes erigieron el gnero Plasmodium. En 1897, Welch descubri el Plasmodium falciparum productor de la forma tropical y en 1922, Stephens encontr el Plasmodium ovale en el frica Oriental. El ciclo evolutivo se descubri gracias a Sir Ronald Ross (1857-1932) mdico ingls quien en 1898 demostr el papel del mosquito intermediario (no lo ubic taxonmicamente) en el ciclo del paludismo en aves (gorriones y alondras), obteniendo el premio Nbel en 1902 por sus descubrimientos; sin embargo fue el zologo italiano Gian Batista Grassi quien demostr el papel del mosquito como transmisor de la malaria en los humanos, sealando que el insecto del gnero Anopheles es el nico vector del paludismo.

Anopheles

PROCEDIMIENTO La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad de sangre, facilitando la deteccin de parasitemias bajas y un ahorro de tiempo en el examen, aunque al romperse los eritrocitos resulta difcil la identificacin de la especie. 1.- Realizacin del frotis y de la gota gruesa. La toma de muestra se realiza mediante la puncin con una lanceta estril, normalmente en la yema del dedo. Se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza la extensin en capa fina. 50

2.- Para la gota gruesa se recogen 3 o 4 gotas sobre un portaobjetos y con la esquina de otro de unen en movimientos rpidos, extendindose en una capa gruesa y uniforme; hasta formar una gota gruesa de 1 cm de lado o de dimetro. La sangre no debe ser excesivamente revuelta, es suficiente con 3 a 6 movimientos. De preferencia, realizar el homogeneizado de la muestra en una sola direccin, en forma concntrica (de adentro hacia fuera o viceversa).

3.- Secar la lmina con la gota gruesa en una superficie plana y protegida de polvo, calor e insectos.

COLORACIN DE LAS MUESTRAS Antes de proceder a la coloracin de la gota gruesa, fije el frotis sumergindolo en metanol, por tres segundos y djelo secar, la gota gruesa no la fijes con metanol. Secas ambas preparaciones procedes a teirlas PROCEDIMIENTO a. Coloque las varillas de vidrio sobre un lavatorio o recipiente de tal forma que facilite la eliminacin de los lquidos que se usarn en la coloracin y coloque las lminas que debe colorear sobre las varillas, espacindola de tal forma que pueda manipularlas con seguridad. b. Vierta colorante de Giemsa al 10% sobre ambas preparaciones (gota gruesa y frotis delgado), cubrindolas por completo. Haga esto suavemente, a una distancia corta de la lmina y deje actuar el colorante por 30 minutos. La experiencia le puede indicar la necesidad de modificar este tiempo de espera. c. Descarte el exceso de colorante diluido y lave la lmina con agua corriente, usando una piseta, hasta que el agua no desprenda colorante. Se recomienda utilizar agua tamponada a pH de 7.2 (tanto en la dilucin del colorante como en los lavados) para facilitar la observacin de los grnulos de Schuffner, tan importantes para la diferenciacin de especies 51

d. Acomode las lminas en una gradilla, de modo que queden inclinadas y con la gota gruesa hacia abajo. Deje secar las lminas en esta posicin.
EXAMEN DE RUTINA DE LA GOTA GRUESA Y DEL FROTIS

El examen de la gota gruesa es recomendable para detectar la presencia de los parsitos de malaria, mientras que el frotis sirve como herramienta auxiliar para determinar la especie de Plasmodium en caso de que no sea posible hacerlo en la gota gruesa.
Examen de la gota gruesa

El examen de rutina de la gota gruesa requiere observar 100 campos microscpicos ptimos a un aumento final de 1000x, con lente de inmersin. Una lmina puede declararse como negativa, slo despus de observar 100 campos microscpicos sin haber encontrado parsitos. Si se encuentran parsitos, deben examinarse tambin los 100 campos microscpicos; esto asegura detectar la posibilidad de infeccin mixta (ms de una especie presente en una muestra de sangre). En lo posible, debe identificarse la(s) especie(s) a la(s) que pertenecen los parsitos.

RECORRIDO DE LA GOTA GRUESA DURANTE SU OBSERVACIN AL MICROSCOPIO

Examen del frotis de sangre Este examen requiere mayor tiempo de observacin en comparacin con la gota gruesa, debido a que la concentracin de los elementos sanguneos es mucho menor. Examinar el mayor nmero de campos microscpicos (300) para determinar si la muestra de sangre es positiva o negativa para malaria. Si el diagnstico es dudoso deber examinar de 400 a 500 campos microscpicos

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RECORRIDO DEL FROTIS DURANTE SU OBSERVACIN AL MICROSCOPIO

4.- Realiza dibujos de lo observado

FROTIS DE SANGRE PARASITADO CON PLASMODIUM

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CUESTIONARIO 1.- Adems de el diagnostico del Plasmodium, qu otros parsitos pueden ser diagnosticados con estas tcnicas? Indica adems del parsito, la enfermedad que producen. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

2.- Qu ventajas y desventajas tienen las tcnicas de gota gruesa y frotis delgado para el diagnostico de parsitos hemticos? Explica. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3.- Por qu se sugiere utilizar agua tamponada con pH 7.2 en vez de agua de la llave al preparar la dilucin del colorante de Giemsa y lavar las preparaciones al teirlas? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 4.- Qu otras tinciones pueden ser utilizadas con el mismo fin? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Conclusiones. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

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Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realizacin:__________________________________

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.15 NOMBRE DE LA PRCTICA: Examen Coproparasitoscpico, tcnica directa COMPETENCIA: Realiza un examen Coproparasitoscpico (cps), a una muestra de heces con el fin de buscar e identificar formas parasitarias. MATERIAL: Aplicadores de madera Portaobjetos Solucin de lugol Microscopio

Papel de estraza cubreobjetos tubos de ensaye de 13x100 sol. Salina fisiolgica

INTRODUCCIN Un examen Coproparasitoscpico es el estudio de la materia fecal para la bsqueda e identificacin de formas parasitarias. Los mtodos Coproparasitoscpico, se pueden dividir en: cualitativos y cuantitativos; los primeros se usan para saber que formas parasitarias existen y los segundos en qu numero se encuentran; estos ltimos se utilizan sobre todo en las helmintiasis Los mtodos cualitativos pueden ser de dos tipos: los mtodos de concentracin y el examen directo. El examen directo es el ms antiguo que se conoce por los datos histricos que se tienen en relacin a los primeros microscopios, probablemente Antonio Van Leewenhoek en el siglo XVIII, fue de los primeros en utilizarlo, al encontrar y observar en sus propias heces fecales trofozotos de Giardia lamblia. El mtodo tiene entre sus caractersticas, la sencillez y rapidez para llevarlo a cabo, adems de lo econmico que resulta realizarlo, pues es el que requiere menos material Ha sido el mtodo indicado como excelente para la bsqueda de trofozotos. En la prctica ha demostrado su eficacia cuando se utiliza lugol, para la bsqueda e identificacin de quistes, huevecillos y larvas. Pero tiene una limitante: la muestra utilizada es tan pequea, que es poco representativa. PROCEDIMIENTO 1. En un portaobjetos se colocan, separadamente (en cada extremo), una gota de solucin salina fisiolgica y otra de lugol. 2. Con uno o dos aplicadores de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcla con la solucin salina, haciendo una suspensin homognea. 56

3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos. 4. Se coloca el cubreobjetos. 5. Se efecta la misma operacin en la gota de lugol. 6. Se observa al microscopio, primero con objetivo seco dbil y despus con el seco fuerte. 7. La preparacin con solucin salina, sirve para identificar y reportar el hallazgo de trofozotos. La preparacin con lugol sirve para reportar el hallazgo de quistes, huevos y larvas. 8. Realiza el dibujo de lo observado. 9. RECUERDA: la materia fecal es potencialmente infectante, por lo que se tendrn los cuidados necesarios para su manejo que garanticen la correspondiente bioseguridad.

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CUESTIONARIO 1. Explica que son los protozoarios, estadios que presentan y cules son las especies patgenas ms comunes para el hombre ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 2. Indica la clasificacin de los helmintos, sus caractersticas principales y los que parasitan con ms frecuencia al hombre ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Por qu se dice que la preparacin con solucin salina fisiolgica sirve para identificar trofozotos de los parsitos? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 4. Adems del intestino, donde ms pueden los parsitos infectar al hombre? Da algunos ejemplos ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 5. A qu se refiere cuando decimos que el inconveniente de esta tcnica es que es poco representativa? Explica e indica cmo podemos disminuirla ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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Conclusiones. ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____

Fecha de realizacin:__________________________________

___________________ Vo.Bo. del maestro

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Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.16 NOMBRE DE LA PRCTICA: Examen Coproparasitoscpico, tcnica de concentracin de Faust COMPETENCIA: Realiza un examen Coproparasitoscpico (cps), de concentracin utilizando la tcnica de Faust; con el fin de buscar e identificar formas parasitarias, en una muestra de heces. MATERIAL: Aplicadores de madera Papel de estraza Portaobjetos cubreobjetos Solucin de lugol tubos de ensaye de 13x100 Microscopio agua de la llave Asa bacteriolgica vaso de precipitados de 100 ml Gasas gradilla Centrifuga mechero bunsen o Fisher Embudo densmetro de 1.100 a 1.200 Sulfato de zinc con densidad 1.18 (aprox. 33%)

INTRODUCCIN Desde 1938 cuando fue descrito este mtodo, fue bien recibido, es uno de los ms utilizados en todo el mundo. Es parecido al que describi Lane en 1924, aunque l utiliz solucin saturada de cloruro de sodio, como este mtodo es poco eficaz para quistes; se utiliza ms el de Faust que es muy eficaz para estas formas parasitarias. La tcnica de Faust, hace una buena concentracin de quistes, huevos y larvas; es la tcnica preferida por la generalidad de los laboratorios. Las formas parasitarias son encontradas con facilidad pues las preparaciones quedan con pocos artefactos. Su limitacin es que es poco eficaz para huevos pesados como los de Taenia spp; Faciola heptica y de Ascaris lumbricoides. Este mtodo se utiliza solucin de Zinc, cuya densidad especfica es de 1.180g/ml (33%), que conforma un medio de densidad ms alta que la de los huevos: Necator 1.055 g/ml, Tricocfalo 1.150 g/ml, Ascaris frtil 1.110 g/ml y facilita que los huevos livianos de estos helmintos, con menor peso especfico que la solucin, se concentren y floten.

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La concentracin adecuada aconsejada es la que usa como reactivo una solucin acuosa de sulfato Zinc al 33% con una densidad al 1.180 g/ml. El agua utilizada diluye y lava la materia fecal. El filtrado con gasa doblada y evita que los detritos gruesos traspasen las paredes, la centrifugacin enriquece en delgada pelcula la superficie del lquido centrifugado con los huevos livianos de algunos helmintos.

PROCEDIMIENTO 1) Mezclar bien una porcin de materia fecal para preparar una suspensin homognea con 1 a 2 g de materia fecal en 10 ml de agua destilada. 2) Filtrar la suspensin a travs de una gasa doblada en cuatro, sobre un tubo de centrfuga, ayudndose con un embudo pequeo. 3) Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1 min.

4) Decantar el lquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Resuspender el sedimento. 5) Repetir el procedimiento 2 veces hasta que el lquido sobrenadante est listo. 6) Decantar nuevamente el lquido sobrenadante reemplazndolo por igual cantidad de solucin de sulfato de Zinc al 33%. Mezclar bien la solucin con el sedimento. Centrifugar durante 1 minuto a 1500 rpm. 7) Tomar 3 a 4 gotas de las partculas que flotan en la superficie del lquido. Colocarlas en portaobjeto y mezclarla con 1-2 gotas de lugol, colocar cubreobjeto. (Te puedes ayudar con el asa limpia o flameada, para recoge la muestra de la pelcula superficial, durante 2 o 3 ocasiones sucesivas y se deposita en el portaobjetos) 8) Examinar al microscopio y reporte sus resultados. 9) Realiza el dibujo de lo observado. 10) Para ayudarte a identificar a los parsitos que puedas encontrar; recurre a los dibujos de los diversos parsitos mostrados en las grficas de la practica anterior. NOTA: Recuerda, la materia fecal es potencialmente infectante, por lo que se tendrn los cuidados necesarios para su manejo, que garanticen la correspondiente bioseguridad.

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CUESTIONARIO 1.- Por qu es importante cuidar la preparacin del sulfato de zinc y checar su densidad cada vez que se utilice? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2.- Esta tcnica de flotacin me permite ver a todos los huevos de helmintos? Y a los trofozotos de amibas? Por qu? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 3.- En todo examen de heces es importante realizar una evaluacin fsica de la muestra. Qu fin tiene este? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Conclusiones: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

Nombre del alumno: ___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realizacin: __________________________________

___________________ Vo.Bo. del maestro

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Manual de Prcticas de laboratorio de Anlisis Clnicos III, fue aprobado por la Academia Estatal de Anlisis Clnicos III, con la participacin de los profesores titulares de la materia: QFB. Isabel Ruiz Snchez, QFB. Emilia Elizabeth Bolio Salazar, QFB. Myrna Ftima Ramrez Garca y QFB. Alberto Rodrguez Moya. Supervisado por la Licda. Silvia Luz Lpez Alcaraz y Licda. Laura Araceli Jimnez Cobin. Vigente a partir de febrero de 2009.

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