Artculo traducido

TEMA: El mecanismo de accin de membranas inducida en la reparacin sea AUTORES: Olli-Matti Aho, BM, Petri Lehenkari, MD, PhD, Jukka Ristiniemi, MD, PhD, Siri Lehtonen,
PhD, Juha Risteli, MD, PhD, and Hannu-Ville Leskela, MD, PhD Antecedentes: La induccin de tejido de granulacin de cuerpo extrao es una modalidad teraputica relativamente nueva en la reparacin sea. El mtodo de reconstruccin de huesos, tiene dos etapas, conocido como la tcnica de Masquelet, que combina la induccin de un tejido de granulacin sea membrana y la posterior un autoinjerto como una tcnica de dos fases que permite la reconstruccin de grandes defectos seos. Habida cuenta de su ya bien caracterizado osteognesis mejorar las capacidades de los animales, se realiz esta traslacin estudio para investigar estas membranas en pacientes

Mtodos: Catorce pacientes con fracturas complicadas y defectos de los huesos fueron seleccionados al azar para este estudio y se realiz biopsia de muestras de membranas de cuerpo extrao inducidas que se recogieron en diferentes puntos de tiempo durante los procedimientos quirrgicos programados. Las membranas fueron co-cultivadas con clulas mesenquimales del estroma, y la diferenciacin en el linaje osteoblstico se evalu mediante la medicin de actividad de la fosfatasa alcalina, propptido aminoterminal de procolgeno de tipo I la produccin (PINP), y la concentracin de CA21. Las caractersticas histolgicas se evaluaron con anlisis de imagen inversa cuantitativa la transcripcin reaccin en cadena de la polimerasa se utiliz para medir el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), interleucina-6 (IL-6), y-I Tipo de expresin de colgeno.

Resultados: Las membranas inducidos se caracterizan histolgicamente por tejido fibroso vascularizado de madurado. La vascularizacin fue mayor en las muestras de un mes de edad, y se redujo a <60% en muestras de tres meses de edad. En muestras de un mes de edad las membranas tenan la ms alta expresin de VEGF, IL-6, y Col-1, mientras que las membranas de dos meses de edad expresaron <40% de los niveles de las membranas de un mes de edad. La actividad especfica de la fosfatasa alcalina, la produccin de PINP, y CA21 concentracin se increment en co-cultivos cuando una muestra de membrana estaba presente. En las culturas de membranas de un mes de edad, la produccin de PINP fue ms de dos veces y CA21 de deposicin era cuatro veces mayor que en cultivos de las membranas de dos meses de edad.

Conclusiones: Las induccin de membranas tienen capacidades de mejorar osteognesis. Estas capacidades, sin embargo, parecen a disminuir con el tiempo. Especulamos que el tiempo ptimo para realizar la ciruga de la segunda etapa puede ser dentro de un mes despus de la implantacin de material extrao. Relevancia clnica: El mtodo de reconstruccin sea de dos etapas es una tcnica fcilmente adaptable para la reparacin de defectos grandes de hueso. Profundizar en la comprensin de la biologa de la membrana y la maduracin, en los seres humanos puede ayudar a optimizar los procedimientos actuales y mejorar su tasa de xito global.

El tratamiento de grandes defectos seos es un reto, y no hay consenso sobre el mtodo de tratamiento ptimo. Defectos limitados o pequeos por lo general pueden ser tratados con el mtodo tradicional de autoinjertos de hueso, mientras que los defectos superiores a 4 a 5 cm son ms propensos a tener complicaciones. La transferencia de un hueso vascularizado y un mtodo basado en la migracin progresiva de un segmento de hueso son dos de las tcnicas ms utilizadas en la tratamiento de grandes defectos seos. Un mtodo ms novedoso, desarrollado por Masquelet , utiliza un cuerpo extrao y que haya capacidades regenerativas. La formacin de tejido de granulacin es una parte esencial de la curacin de los tejidos blandos y tambin se puede observar mientras est presente el cuerpo extrao. Se inicia la reaccin de cuerpo extrao por una lesin en los tejidos blandos vascularizados. La lesin siempre inicia con una fase de inflamacin aguda, que puede conducir a la regeneracin de tejidos y la maduracin del tejido de granulacin en la fibrosis densa, hueso u otro tejido mesenquimal. En condiciones desfavorables, se puede desarrollar inflamacin crnica y puede influir el proceso de maduracin del tejido, el tamao, la calidad y la duracin de la reaccin inflamatoria que puede ser modificado con optimizacin de las condiciones del tejido por desbridamiento de todo el tejido muerto y la infeccin, mediante la seleccin adecuada de los biomateriales, y por suficiente vascularizacin. Tanto la inflamacin aguda y los procesos inflamatorios transitorios en la formacin de tejido de granulacin se caracterizan por una gran presencia de macrfagos , infiltracin de macrfagos y fibroblastos. La formacin de capilares y la neovascularizacin tambin son caractersticas clave del tejido de granulacin en maduracin. La granulacin, originalmente se forma a partir de la matriz extracelular, componentes de la matriz, como precursor de los tejidos, que con el tiempo se transforma en una membrana de tejido conectivo neovascularizado. Eventualmente, el tejido de granulacin encapsula el material extrao y ms tarde una cpsula madura fibrosa se forma en la etapa final de la inflamacin. Este tejido de granulacin de cuerpo extrao inducida es una herramienta til teraputica para la ciruga reconstructiva y ha sido aplicada a la reconstruccin de defectos de hueso grande. Adems, la induccin de la membrana de tejido de granulacin puede, en procedimientos como la reparacin de los nervios, ayuda a evitar que el prctico la formacin de tejido de granulacin no funcional o fibrtico. Cuando se induce la membrana especfica, el cirujano puede evitar que se de un proceso rpido de fibrosis que generalmente llena el espacio e impide la regeneracin del tejido nervioso. El uso de membranas de granulacin inducidas en tejido en la reconstruccin sea se basa en una tcnica de dos etapas de la ciruga. En la primera etapa, un antibitico espaciador de cemento se

inserta en el defecto seo. En el segunda etapa, por lo general lleva a cabo uno o dos meses ms tarde, el espaciador se sustituye con autoinjerto seo esponjoso. El espaciador de cemento induce la formacin de una cpsula fibrosa a travs de la clsica reaccin de cuerpo extrao y libera antibiticos localmente, lo que contribuye a la erradicacin de un posible infeccin. La cpsula se utiliza ms tarde para (1) confinar el rea del defecto, (2) apoyar el autoinjerto implantado, y (3) proporcionar al injerto neo vascularizacin. El tiempo total necesario seo para sanar el defecto vara de acuerdo con el defecto, ubicacin y complicaciones y factores clnicos, tales como la vascularizacin. Por ejemplo, el tiempo para la curacin de las fracturas de tibia ha oscilado veinte a setenta y nueve semanas. La medida del defecto del hueso, sin embargo, no parece afectar al tiempo necesario para la curacin. Las membranas tienen una rica vascularizacin y alta produccin de factores de crecimiento, y que pueden poseer la capacidad de diferenciar clulas mesenquimales de mdula sea clulas del estroma. Tambin se ha descrito, y los autores de un estudio inform que la mxima expresin de la protena morfogentica sea (BMP-2) se encontr en las membranas que eran de cuatro semanas de edad. Estas clulas madre llamado de granulacin-derivadas de tejido expresaron las caractersticas de ambas clulas pluripotentes embrionarias y las clulas madre adultas. Otro estudio en animales identific de unin central factor alfa 1 (Cbfa1)-positivas las clulas en la membrana inducida, lo que podra indicar que la membrana puede funcionar como un depsito de clulas osteoprogenitora. Estos hallazgos no tienen han confirmado en humanos. Como la tcnica de membrana inducida se est utilizando ms ampliamente y ms a menudo, es esencial obtener informacin sobre este proceso en los seres humanos, en quienes el proceso de curacin difiere de los vertebrados ms pequeos de muchas maneras, tales como un tiempo prolongado y un diferente proceso de curacin de inflamacin. Un estudio anterior de conejos sugiri que la membrana inducida alcanza la mayor actividad bioqumica en trminos de la regeneracin sea a las cuatro semanas despus del separador de implantacin. Este sugerira, si se confirma en los tejidos humanos, que la segunda etapa de la tcnica de dos etapas de la ciruga debe llevarse a cabo antes de lo que se pensaba anteriormente. El objetivo de la observacin actual del estudio fue evaluar las caractersticas bioqumicas e histolgicas Los datos de membranas inducida fueron recogidos por humanos durante dos etapas la ciruga tambin llevamos a cabo una serie de experimentos de cultivo celular in vitro el uso de clulas mesenquimales del estroma y las muestras de membranas para evaluar el efecto de la membrana inducida en diferenciacin con clulas estromales mesenquimales en clulas seas.

Radiografas que muestran un tratamiento para un defecto seo grande, con la tcnica de dos etapas de injerto seo. Figura 1-A un espaciador de cemento impregnado de antibitico estabilizado con fijacin interna despus de la reseccin sea. Figura 1-B Cuatro semanas ms tarde, el espaciador se retir y la cavidad de tejido de granulacin se llen con autoinjerto seo esponjoso. Figura 1-C Hueso recin formado dos meses despus de injerto seo. Materiales y Mtodos El Comit tico del Hospital del Distrito Norte Ostrobotnia aprob el protocolo de estudio para la recopilacin y el uso de las clulas humanas y tejidos. Pacientes y membranas inducida En nuestro hospital, los pacientes con grandes defectos seos segmentarios se tratan con de dos etapas de ciruga. Catorce pacientes fueron seleccionados al azar para el estudio (TablaI). TABLA I Caractersticas de los pacientes Paciente Edad (aos) sexo Ubicacin del defecto seo LONGITUD DEL DEFECTO SEO (mm) 45 20 22 0 30 29 23 47 31 63 32 0 43 Duracin del antibitico en el lugar 7.5 1 1.5 22 1.5 2 1 3 1 2 1 33 2

22 10 77 65 59 26 27 58 43 65 85 72 38

Masculino Masculino Femenino Masculino Masculino Masculino Masculino Masculino Masculino Femenino Femenino Femenino Masculino

Tibia distal Femoral distal Tibia proximal Tibia distal Tibia distal Tibia distal Tibia medial Tibia media Tibia distal Femoral distal Femoral distal Femoral proximal Tibial distal

17

Masculino

Femoral distal y tibial proximal

39

Adems, las muestras de membrana de control se obtuvieron de la superficie de material de osteosntesis de tres pacientes. En la segunda etapa de la ciruga, fueron retirados perlas de cemento de antibiticos y un injerto autgeno de hueso esponjoso se aplic al defecto seo. Despus de la eliminacin del espaciador, los extremos del hueso se desbridaron, pero las otras partes alrededor de la membrana de cuerpo extrao e conservan los granos. Para el estudio, la membrana se cosech tanto de los extremos del hueso y el cuerpo de las membranas inducidas. Las muestras de tejido subcutneo se tomaron como controles para experimentos de cultivo celular. Inmediatamente despus de la cosecha, las membranas se dividieron por los diferentes tratamientos: Formalina se utiliz para el anlisis histolgico, el nitrgeno lquido se utiliz para el anlisis de reaccin en cadena de la polimerasa, y las membranas frescas se lavaron en solucin tamponada con fosfato salino (PBS) para las piezas culture. Membrane (4. 4 mm) y muestras de tejidos subcutneos eran cultivadas con clulas del estroma mesenquimal , como se describe a continuacin Cultivos de Clulas estromales mesenquimales humanas Se extrae mdula sea humana de los pacientes que fueron operados de osteoartrosis de cadera y que fueron seleccionados al azar para este estudio. La mdula sea se obtiene a partir de la difisis femoral proximal durante la operacin, y las clulas mesenquimales del estroma se mantuvieron en cultivo como se ha descrito previamente.

Brevemente, las clulas mesenquimales del estroma de las muestras de mdula sea se pueden adjuntar a los frascos de cultivo. Despus de dos das, las clulas no unidas se lavaron de distancia y las clulas de los matraces se cultivaron durante una a dos semanas hasta casi confluencia. Las clulas estromales mesenquimales se cultivaron en un-MEM (medio esencial mnimo; GIBCO, Paisley, Reino Unido), suplementado con 10% de FBS inactivado por calor (suero bovino fetal) (Autogen Bioclear, Wiltshire, Reino Unido), 20mMHEPES (GIBCO), 100 U / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina (Gibco), y 2 mm de L-glutamina (Gibco) a 37 C en 5% de CO2 y 95% de aire.

Las clulas estromales mesenquimales humanas se separaron con el uso de solucin de tripsina-EDTA (GIBCO). Las clulas se contaron a continuacin y se sembraron a una densidad de 5 103 con una muestra de membrana (4 4 mm) en placas de veinticuatro pocillos. Las clulas utilizadas en este estudio fueron de la primera o la segunda pasaje, y el lote de suero en todos los cultivos de clulas de la misma. Los medios de cultivo se cambian dos veces por semana. Despus se eliminaron las membranas a partir del cultivo, la diferenciacin osteoblstica se evalu sobre la base de la actividad de la fosfatasa alcalina en los lisados celulares despus de tres semanas de cultivo. La formacin de hueso se evalu despus de tres semanas mediante la evaluacin de la produccin de propptido aminoterminal de procolgeno de tipo I (PINP) y la cuantificacin de la deposicin de calcio despus de cinco semanas. El medio de osteosntesis que induce utilizar por separado contena el medio anterior se describe con dexamethasone 0,1, 10 mM de b-glicerofosfato de sodio, y 0,05 mM de cido ascrbico 2-fosfato (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri).

Actividad especfica de la fosfatasa alcalina La actividad especfica de fosfatasa alcalina se determin a partir de clulas estromales mesenquimales despus de un perodo de cultivo de tres semanas con o sin membranas. Las muestras se extrajeron en un tampn de ensayo que contiene 50 mM de Tris-HCl, 0,1% de Triton X-100, y 0,9% de NaCl (pH 7,6), y el lisado se congel. Muestras de lisados fueron luego descongelados, y la actividad enzimtica se determin por duplicado con el uso de 0,1 M 4-p-nitrofenil fosfato (Sigma-Aldrich) como sustrato. Se ley la absorbancia a 405 nm en un lector de placas (Victor2; PerkinElmer Life Sciences / Wallac Oy, Turku, Finlandia). El contenido total de protenas de las clulas estromales mesenquimales cultivadas se determin por BIO-RAD Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). Las actividades enzimticas se normalizaron con la concentracin de protena y se expresaron como absorbancia por miligramo de protena.

PINP La cantidad de sntesis de procolgeno de tipo I se cuantific a partir del medio de cultivo. La concentracin de PINP se midi en duplicados con el uso de un radio inmuno-ensayo comercialmente disponible (Orion Diagnostica, Espoo, Finlandia). El ensayo se realiz en la saturacin secuencial, y que utiliza alcuotas duplicado de 100 ml de 01:20 o 01:50 medio de cultivo diluido. Cuantificacin de calcio Para la cuantificacin de calcio, los cultivos se detuvieron a las cinco semanas y se eliminaron las membranas cocultivadas. Los pocillos se lavaron tres veces con CA21 y MG21 libre de PBS y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en HCl 0,6 M para disolver el calcio depositado. La determinacin de calcio se basa en la reaccin de calcio con o-cresolftalena complexona de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La reaccin colorimtrica se ley a 570 nm en un lector de placas (Victor2).

Mtodo tricrmico de Masson y tincin hematoxilina y eosina y anlisis de imgenes de vascularidad

Las muestras de membrana se lavaron en PBS y se fijaron en formol e incrustados parafina, y se seccionaron. Secciones de 8 mm se tieron con el mtodo tricrmico de Masson. Algunas muestras de membrana tambin se tieron con hematoxilina y eosina para los propsitos de formacin de imgenes. La cuantificacin posterior de la zona de vascularizacin proporcional se realiz con un sistema de anlisis de imagen digital (MCIDM51; Imaging Research, Canad). La vascularizacin proporcional se cuantific mediante la seleccin de cinco reas representativas de tamao similar de cada membrana y contando el rea proporcional promedio de tejido vascular en contraste con membrana estroma. Extraccin de ARN y la transcripcin inversa cuantitativa. Anlisis en reaccin en cadena de la polimerasa (RT-qPCR) Piezas de membranas se congelaron inmediatamente despus de la recoleccin y se almacenaron en nitrgeno lquido hasta que se utilizaron para el anlisis de ARN.

Doscientos a 600 mg de membrana congelada se pulveriz con una mano de mortero y se homogeneiz en reactivo TRIzol (Invitrogen). RNA se aisl de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y los RNAwas aisladas purificadas an ms por el RNeasy Kit de limpieza MinElute (Qiagen, Valencia, California), despus de lo cual la cantidad de RNAwas mide espectrofotomtricamente. Un microgramo de ARN se utiliza para la sntesis de cDNA con el kit de sntesis de la cadena First Revert Aid (Fermentas, filial de Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) utilizando oligo-dT como cebador. Un microlitro del producto de cDNA se utiliz para la RT-qPCR con la tcnica SYBER Green (iQ SYBR Green; Bio-Rad Laboratories) mediante la cuantificacin del producto en cada ciclo de una manera en tiempo real. La cantidad del producto se control durante cuarenta ciclos, despus de lo cual la especificidad del producto se confirm por la curva de fusin y en algunos casos mediante la visualizacin de los productos con electroforesis en gel de agarosa. La expresin de la deshidrogenasa de gliceraldehdo-3-fosfato (GAPDH) se estudi mediante el uso de secuencias de los cebadores 59-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-39 y 59-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3 como temperatura de recocido. Las secuencias de cebadores eran 59-GGTTT CGACT TCAGCTTCCT G-39 y 59TCACCAGTCTCCATGTTGCA-G-39 para el tipo I de colgeno (Col-1), 59GGGCAGAATCATCACGAAGTG-39 y 59-ATTGGATGGCAGTAGCTGCG-39 para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y 59-GGTACATCCTCGACGGCATCT 39 y 59-GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-39 para la interleucina-6 (IL-6). La expresin de cada compuesto se relaciona con GAPDHexpression mediante el uso de la DDCT method19 considerando GAPDHas un gen de mantenimiento y la comparacin de la expresin con una muestra de control seleccionado. Anlisis estadstico El anlisis estadstico se realiz con el paquete estadstico para las Ciencias Sociales (SPSS) versin 13.0 (Chicago, Illinois). La prueba de la t de Student se utiliz para comparar dos medias. Los datos mltiples de comparacin ha sido estudiada con el anlisis de varianza de una va seguido de comparaciones post hoc (prueba de la t de dos colas). Los grficos fueron creados con el software de Origen 6.0 (OriginLab, Northampton, Massachusetts). Fuente de financiacin La Fundacin Finnish Medical y Ostrobotnia y financiacin fue utilizado del Distrito Hospitalario del Norte para gastos de laboratorio y el salario. Adems, se recibi financiacin para el sueldo del autor correspondiente (O.-MA) en el Programa de

Doctorado Nacional de Trastornos musculoesquelticos y Biomateriales (TBDP) la escuela de posgrado. Una subvencin personal para el autor correspondiente fue concedida por la Fundacin Finnish Medical. Ninguno de los patrocinadores del estudio tuvo ningn papel en la recopilacin o anlisis de datos, en la escritura manuscrita, o la publicacin de manuscrito. Resultados La induccin de la membrana de tejido fibroso y la diferencia con el tejido seo tricrmico de Masson y hematoxilina y eosina mostraron alguna reaccin de cuerpo extrao con macrfagos y clulas gigantes de cuerpo extrao con separadores de cemento. Membrana inducida incluye tejido vascular primitivo recin formada y tiene la capacidad de diferenciarse hacia tejido calcificado por osificacin endocondral. Tambin pudimos ver el tejido seo recin formado por hueso laminar maduro, incluso, en las membranas inducidas. Considerando que el tejido de granulacin era caracterstico de las membranas ms jvenes,el tejido fibroso ms uniforme domin el patrn histolgico en muestras mayores (Fig. 2).

Figura 2 Secciones histolgicas representativas de membranas inducidas teidas con tincin tricrmica de Masson y hematoxilina y eosina (aumento original 100).

Figura 2-A Un tejido de granulacin a partir de una membrana de un mes de edad. Algunas clulas gigantes de cuerpo extrao se pueden ver (flecha). Figura 2-B tejido del vaso recin formado (flechas) a partir de una membrana de 1,5 meses de edad. Figura 2-C tejido fibroso maduro de una membrana de veintids meses de edad. Slo se ven unos pocos vasos sanguneos (flechas). Figura 2-D osificacin endocondral en las membranas inducidas (las flechas indican el cartlago). Figura 2-E tejido seo recin formado puede ser visto (flecha indica hueso laminar). Figura 2-F-Cuerpo extrao de clulas gigantes (flecha) en una membrana de un mes de edad, teidas con hematoxilina y eosina.

La vascularidad de la membrana inducida disminuye durante el envejecimiento. El anlisis histolgico de las membranas mostr una diferencia clara entre las membranas jvenes y mayores. A las cuatro semanas, las membranas aparecieron ricamente vascularizado por numerosos pequeos capilares y las venas ms grandes. Con el tiempo, la tasa de disminucin de la vascularizacin. Ya a los tres meses, las membranas que tenan un mes de edad tenan vascularizacin <60% (Figs. 3-A, 3-C y 3-D).

Figura 3 El efecto de edad sobre la membrana inducida y la vascularizacin de la membrana con factores de crecimiento secretados. Figura 3-A Un rea proporcional de vascularizacin en las membranas cosechadas de diferentes edades. Los resultados se normalizaron con los valores de un mes para mayor claridad. Figura 3-B ARNm se investig con la reaccin en cadena de la polimerasa de transcripcin (PCR),Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), interleucina-6 (IL-6), y los resultados de colgeno (Col1) de tipo I se determinaron para las membranas de diferentes edades, y los valores se normalizaron frente a la media de las muestras de un mes.Figura 3-C Una membrana de un mes.Figura 3-D Una membrana de cinco meses. Las muestras fueron teidas con tricrmico de Masson. Las flechas indican los vasos sanguneos

Adems, la RT-qPCR mostr disminucin significativamente la produccin de VEGF, IL-6, y Col-1 despus de un mes:las membranas de dos meses de edad, expres <40% de los niveles de las membranas de un mes de edad. En este estudio, se utiliz un modelo previamente descrito de la diferenciacin de clulas estromales mesenquimales en osteoblastos y la medicin de su actividad como clulas formadoras de hueso. Las clulas estromales mesenquimales humanas pueden ser inducidos in vitro para diferenciarse en osteoblastos maduros por los glucocorticoides, B-glicerofosfato, y ascorbato. A la edad de cuatro semanas, las membranas cosechadas indujeron significativamente tanto la actividad de la fosfatasa alcalina especfica y la concentracin de calcio en cultivos de clulas mesenquimales del estroma. En las culturas osteo-inducidas, tanto la actividad fosfatasa alcalina especfica y la concentracin de calcio de las clulas mesenquimales del estroma fueron inducidos de manera significativa (Figs. 4-A y 4-B).

Figura 4
Figs. 4-A y 4-B Influencias de la membrana inducida sobre la formacin sea de las clulas estromales mesenquimales humanas cultivadas (MSC).

Las clulas se cultivaron durante tres semanas para determinar la fosfatasa alcalina especfica (ALP) actividad (Fig. 4-A) y durante cinco semanas para los ensayos de cuantificacin de calcio (Fig. 4-B). Figs. 4-C y 4-D La influencia de los sitios de recoleccin (msculo, mdula sea, y el hueso esponjoso de las membranas inducidos en las clulas estromales mesenquimales humanas cultivadas. Las clulas mesenquimales del estroma y las membranas se cultivaron sin medio de induccin de osteosntesis (OS), tal como se describe en Materiales y Mtodos.

Clulas estromales mesenquimales se cultivaron durante tres semanas para la medicin de propptido aminoterminal de procolgeno de tipo I la produccin (PINP) (fig. 4-C) y durante cinco semanas para el calcio cuantificacin (figura 4-D). Figs. 4-E y 4-F El efecto de la edad de membrana inducida en las clulas mesenquimales del estroma. Las clulas mesenquimales del estroma y las membranas se cultivaron sin medio de induccin de osteosntesis, tal como se describe en Materiales y Mtodos. Produccin PINP (fig. 4-E) se midi y se realiz la cuantificacin de calcio (fig. 4-F). La existencia de las clulas mesenquimales del estroma, tejido subcutneo de control (Hipodermis), membrana, y / o medio de osteosntesis inducida en el ensayo de cultivo celular se indican con (1) o (2). Cada barra representa la media y desviacin estndar (I bar). * p <0,05, ** p <0,01, y *** p <0,001

Influencia de la recoleccin del sitio de membranas inducida en clulas estromales mesenquimales cultivadas Humanos En la segunda etapa del tratamiento, las membranas cosechadas fueron recogidos en las diferentes reas del sitio de la operacin. Las membranas de los sitios de la mdula sea y el hueso esponjoso fueron significativamente mejores osteoinducidas en la membrana en el sitio del msculo tal como se mide por la produccin de PINP. La formacin de hueso medido por el contenido de calcio no cambi significativamente entre las membranas en diferentes sitios (Figs. 4-C y 4-D). Efecto del tiempo de la segunda etapa de la ciruga de la membrana inducida y co cultivadas de clulas estromales mesenquimales humanas Se estudi si el punto de la segunda etapa de la operacin de tiempo influy en la actividad y osteoinducccin de membrana en cultivos de clulas estromales mesenquimales humanas. Se cosecharon las membranas despus de un mes y dos meses, y los co-cultivadas con clulas estromales mesenquimales. Curiosamente, cuando las membranas se cosecharon a un mes despus de un espaciador de cemento se introdujo en el defecto seo, las membranas espontneamente indujeron la diferenciacin de clulas mesenquimales del estroma y la activacin como se ha demostrado por la medicin de

Sntesis de PINP y cuantificacin de calcio. En contraste, las membranas cosechadas despus de dos meses no aument la diferenciacin de clulas mesenquimales del estroma y la activacin. Niveles PINP eran ms de dos veces y CA21 de deposicin fue cuatro veces mayor en las membranas de un mes de edad (Figs. 4-E y 4-F). Discusin El tratamiento de grandes defectos seos en general sigue siendo un tema de debate. La tcnica de reconstruccin sea de dos etapas es un nuevo mtodo que ha demostrado ser exitoso para la reconstruccin de un gran defecto. En este estudio, se investig las caractersticas histolgicas y bioqumicas de las membranas inducidas utilizadas en esta tcnica. Estudios anteriores han demostrado que las membranas de cuerpo extrao inducidas contienen bien de tejido fibroso vascularizado que se conserva sobre todo durante el seguimiento. En contraste, nuestros resultados demostraron que, en las membranas humanas, la superficie proporcional de tejido vascular disminuye claramente despus del separador ha estado en vigor durante dos meses. A los dos meses, la membrana est compuesta de tejido fibroso ms maduro con abundante colgeno y un menor nmero de vasos sanguneos. Tres a seis meses despus de la implantacin espaciador, la membrana madura tiene trminos de densidad de la matriz extracelular en composicin final. Hemos observado algunos osificacin intramembranosa e incluso la formacin de cartlago en algunas muestras. Por lo que sabemos, esta no se ha descrito anteriormente, pero la reaccin cuerpo extrao en los seres humanos parece producir tejido multipotente mucofibroso inmaduro que incluso tiene algunas similitudes con el tejido mesodrmico embriognico. En estudios previos, esta membrana ha sido descrita como capaz de producir y que contiene las clulas estromales mesenquimales indiferenciadas. No esperbamos este resultado y no tratamos de obtener y aislar clulas multipotentes mesenquimales del estroma de las membranas, pero nuestra observacin alienta a hacerlo en el futuro. La expresin de VEGF en las membranas disminuye drsticamente despus de un mes. Este hallazgo est de acuerdo con la disminucin observada en la vascularizacin de las membranas de envejecimiento. Un patrn decreciente de manera ms constante de la expresin de VEGF fue encontrado en conejos mediante Pelissier . Para obtener una visin ms profunda de las primeras etapas de desarrollo de membranas de cuerpo extrao inducida y las primeras etapas de la maduracin, se midi colgeno tipo I e IL-6 en las membranas de diferentes edades. Los patrones de expresin fueron igualmente ms alta en las muestras anteriores y muy pequeos en las membranas que eran ms de dos meses de edad. Esta transicin es probablemente causado por la amortiguacin general de la inflamacin local y el proceso de maduracin en el inducido membrana. Las membranas de cuerpo extrao inducidas de animales afectan directamente a las clulas

madre y causan que sean susceptibles a la diferenciacin en el linaje osteoblstico in vitro. Los co-cultivos en nuestro estudio indican que este efecto est presente en el tejido humano tambin. Se utiliz mediciones cuantitativas de Ca 2 y PINP para evaluar la diferenciacin in vitro de clulas madre en el linaje osteoblstico y resultados obtenidos concluyentes de ambos de estos compuestos:diferenciacin osteoblstica se aument en gran medida cuando la muestra de una membrana estaba presente en el cultivo. El efecto era considerablemente mayor cuando se utiliz un medio de aumento de la osteognesis. En co-cultivos con membranas de uno y dos meses de edad, la edad de la membrana afectada en gran medida la tasa de la diferenciacin de clulas madre. Las membranas de dos meses de edad, tenan slo una fraccin de la actividad que se ve en las muestras de un mes de antigedad. Cuando se recogieron muestras de membrana, hemos prestado especial atencin a la ubicacin de la membrana en relacin con el tejido circundante para determinar los efectos sobre la membrana de desarrollo y las caractersticas. No hemos encontrado diferencias concluyentes en el anlisis histolgico. Sin embargo, las membranas que se desarrollan adyacentes a mdula sea poseen la mayor capacidad para estimular la osteognesis. La correlacin clnica para este sigue siendo inexistente y es difcil de estudiar de manera concluyente. Parece que el tejido circundante induce la capacidad de dirigir el proceso de reparacin que tiene la membrana para favorecer la formacin del mesnquima circundante de tejido seo en este caso. Las fracturas que conducen a defectos seos, que requieren medios ms complejos de tratamiento, son poco frecuentes. En un estudio prospectivo realizado en Escocia, estos casos representaron slo el 0,4% de todos los pacientes ingresados en el hospital debido a una fractura. Por lo tanto, nuestra muestra se limit a un muy selecto grupo de pacientes. El tamao de la muestra de tejido tambin se limit a no comprometer el tratamiento. Esto deteriora nuestra capacidad verdaderamente para lograr una serie representativa de la muestra deseada para el tiempo de tratamiento. Las limitaciones en el material de la muestra y la estructura del tejido en s caus otro problema en estudiar, especialmente cuando se utiliza la RT-qPCR, y por lo tanto no sirvi para medir todas las variables que se desee. Para un estudio ms exhaustivo, se necesita muchas ms muestras materiales de tejido . A pesar de estas limitaciones, creemos que no haba material suficiente para nosotros llegar a las conclusiones que aqu se presenta. Esta idea es apoyada por el hecho de que la mayora de nuestras observaciones estn respaldadas por un trabajo experimental anterior.

Nuestros resultados indican que la actividad biolgica de las membranas es un reactivo de gran alcance que no debe pasarse por alto en la ciruga sea. Nuestros hallazgos sugieren que la membrana tiene un efecto osteoinductivo local y proporciona al rea de defecto seo una rica vascularizacin y neocirculacin. Lo capacidad de la membrana al pasar el tiempo, disminuye rpidamente y bastante ya que alcanza una forma ms madura. Podemos concluir que las membranas del cuerpo extrao inducidas pueden alcanzar su mayor actividad biolgica antes del mes, transcurrido despus de la implantacin de cuerpo extrao.