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Factores que Influyen la Microbiología en los Alimentos

Dr. Esther Z. Vega Microbiología Aplicada

Bosquejo
• Métodos de detección y cuantificación • Factores internos y ambientales que controlan el crecimiento bacteriano • Cinética de crecimiento bacteriano • Fisiología y metabolismo de microorganismos de origen alimentario

Ecosistemas, homeostasis y tecnología de defensa
• Ecología “the study of the interactions between the chemical, physical, and structural aspects of a niche and the composition of its specific microbial population”
Commission on Microbial Specifications for Foods

nutrientes) • Factores extrínsecos (temperatura. ambiente gaseoso.Ecosistemas. presencia de otras bacterias) • Preservación por manipulación de los factores – Los alimentos pueden contener múltiples microambientes . Aw. homeostasis y tecnología de defensa • Los alimentos son ecosistemas – Organismos – Ambiente • Factores intrínsecos (pH.

diferencial Método número más probable Técnicas de enriquecimiento Células dañadas Viable no cultivable Factores intrínsecos que influyen en el crecimiento microbiano – Factores extrínsecos que influyen en el crecimiento microbiano • Homeostasis y tecnología de defensa • Cinética de crecimiento .Microbiología clásica y sus limitaciones • Limitaciones en la detección y métodos de enumeración – – – – – – – Contaje de placas Medio selectivo.

NO como bacterias totales .Limitaciones de contaje de placas • Asume – Cada célula forma una colonia – Cada colonia proviene de una sola célula bacterial – Algunas colonias puede ser originadas de una “agrupamiento”de bacterias • Se reporta como .Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo ó ml. .

Limitaciones de contaje de placas • Factores que afectan la formación de colonias por una célula – Estado fisiológico de la célula – Medio de cultivo utilizado en la enumeración – Temperatura de incubación .

Limitaciones del contaje de placas • Sólo se consideran organismos aeróbicos • No se sabe el tipo de bacteria • El medio de cultivo permite el crecimiento de ciertas bacterias • Limitaciones visuales/Errores humanos • Difícil de distinguir entre partículas de alimentos y bacterias • No se debe utilizar en alimentos fermentados • Las colonias podrían ser muy pequeñas para verse .

Tipos de muestra • Líquidas – Líquidos no viscosos se miden con pipetas – Líquidos viscosos se pesan • Sólidas – Pesar asépticamente • Hisopo – Tomar muestra pasando un hisopo por un área definida • Ambientales y de envases – Enjuage el interior del envase – Abra una placa para tomar una muestra del aire – Placas RODAC .

Protocolo para Contaje en Placas • Prepare un homogenado de la muestra – Dilución 1:10 – 1 parte de la muestra a 10 partes del volumen total • Mezcle en licuadora o “stomacher”por 2 minutos 10 g/ml muestra 90 ml of diluyente 1:10 Dilución – 10-1 .

Protocolo para contaje en placas • Prepare diluciones seriadas – Diluya hasta que obtenga colonias separadas entre 25-250 en una placa – Utilice una pipeta estéril entre cada dilución – Ponga la pipeta usada en el área designada • Mezcle cada botella de dilución 25 veces en un arco de 90 grados por 7 segundos • Use amortiguador de fosfato ó peptona para diluir .

Diluciones Sample Homogenate Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10-1 (1:10) 10-2 10-3 (1:100) (1:1000) 10-4 (1:10000) 10-5 (1:100000) .

Placas Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml .

microaerófilico) – Temperatura • Enumeración – Número de colonias promedio por placa • Placas entre 25 y 250 colonias . – Atmósfera (aeróbico. a la placa petri – El agar no puede estar muy caliente porque mata las bacterias • • • • Método estándar ó agar de placa (Plate Count Agar) Mueve 10x en cada dirección Deje que solidifique Incube las placas invertidas a 35-37oC por 48 horas. anaeróbico.Protocolo Contaje de placas • Añada 18-20 ml de agar (45-50oF).

Contaje de placa aeróbica • Provee un estimado general de bacterias aeróbicas vivas • Evalúa calidad • Predictor de “shelf-life” • Monitoreo ambiental • Excluye – Anaerobos obligados – Microaerofílicos .

Resultados del Contaje de placa aeróbica • • • • Evalúa la sanitación de una producto Predice la durabilidad (Shelf-life) Indicador de seguridad (Safety) Monitorea el ambiente .

Medio microbiológico • Provee nutrientes para el crecimiento de los microorganismos – Caldo • Usualmente se utiliza para crecer cultivos puros • Utilizado para enumeración a través de la técnica de MPN .

sólido a temperatura ambiente •Células bacteriales están atrapadas en el agar tal que puedan ser enumeradas •Utilizado para aislar •Puede ser no-selectivo.Medio microbiológico •Agar sólido •Agar. selectivo o diferencial .agente gelatinizante sin valor nutricional •Líquido a 45oC.

e.Medio selectivo y diferencial • Selectivo – Se añade un ingrediente al medio para inhibir el crecimiento de ciertos tipos de organismos y ayudar el crecimiento de otros • Diferencial – Se le añade algo para diferenciar entre organismos diferentes i. cambio en color .

Métodos de Número más Probable (MPN) • MPN – Basado en probabilidad estadística – NO es contaje directo – Técnica líquida .

0 bacteria/gm .Métodos de Número más Probable (MPN) • Estima número de organismos en muestra cuando se encuentran en bajas concentraciones • Se utiliza comúnmente para E. coli y coliformes • Se añaden agentes selectivos • Método de 3 ó 5 tubos • Límite más bajo de sensitividad (3 tubos) <3.

2.1 – Nuestra combinación • Determine el MPN utilizando la tabla de MPN .Continuación El objetivo es “diluir el organismo • Seleccione la muestra más diluída con todos los tubos positivos y los próximos dos – 3.MPN .

Técnicas de enriquecimiento • Cero tolerancia – Salmonella – Listeria monocytogenes – E. coli O157:H7 • ¡No se necesita enumeración! • Detección – Medio de pre-enriquecimiento con medio selectivo enriquecido – Se pone en placa en medio selectivo – Confirmación bioquímica y genética .

ácidos o agentes sanitizantes. . radiación. Resultado: Menor resistencia a agentes selectivos o aumento en sus requerimientos nutricionales.Células dañadas Una célula puede ser dañada en lugar de matada por niveles sub-letales de calor.

3 Valor D55C. Figura 2.Células dañadas Tabla 2.tiempo requerido para eliminar 90% de la población a 55oC.3 .

Células dañadas: Causas ambientales • Calor subletal • Congelamiento subletal • Secado “freeze drying” • Secado • Radiación • Químicos – – – – – – – – Tintes Sodium azide Sales Metales pesados Antibíoticos Aceites esenciales EDTA Compuestos sanitizantes .

Células dañadas: Factores influyentes La acción de dañar una célula es un proceso complejo. . monocytogenes crecida a <28 C expuesta a 52 C reducción por muerte de 3-4 log. influeciado por: • Tiempo • Temperatura • Concentración de agente • Cepa de organismo • Metodología experimental L. o o Crecida a 37 o 42oC. 2-3 logs de daño cuando se exponen a 52oC.

Células dañadas: Características de las células • Aumento en el tiempo de la fase lag de crecimiento (efecto de reparación) • Aumento en la sensitividad a la variedad de agentes selectivos en el medio de cultivo – Pérdida de la habilidad de formar colonias en medio selectivo .

Células dañadas: Efecto de estresores ambientales en las células • Membrana celular – Daños en los componentes lípidos • Enzimas de ciclo TCA • Otras enzimas – Coagulasa – Nucleasa termoestable • Ribosomas – Pérdida de Mg+2 • DNA • RNA .

g. sal . valor D menor • Recuperación de patógenos dañados en alimentos – Problemas de seguridad – Problemas de contaminación • Agentes selectivos pueden ser ingredientes comunes de los alimentos e.Células dañadas: ¿Qué significa? • Imposible recuperar la cantidad verdadera de patógenos – Eficiencia del procesamiento del alimento es sobreestimada • E.g.

crecer y producir enterotoxina.5% NaCl. . aureus dañadas por ácido durante la fermentación para la producción de embutidos puede crecer en TSA. Estas células pueden reparse en el embutido si se mantiene a 35oC (pero no a 5oC).Células dañadas: S. aureus Células de S. pero no en TSA 7.

g. piruvato.Células dañadas: Detección • Pre-enriquecimiento no selectivo seguido de placas con medio selectivos – Agentes que reparan (e. oxirasa) • Placas de medio no-selectivo y medio selectivo – No-selectivo: dañadas y no-dañadas – Selectivo: no-dañadas . catalasa.

Organismos viables pero no cultivables (VBNC): características de las células • Organismos que no son cultivables con medio no selectivo • Activos metabólicamente – Presencia de enzimas metabólicas • Síntesis de nuevas proteínas • Cambios en los lípidos celulares – “Nutrient uptake” • Cambios morfológicos – VNBC Campylobacter jejuni .

Organismos viables pero no cultivable (VBNC): Detección • Metabolismo de nutrientes radioactivos o fluorogénicos para viabilidad (acridina anaranjada:DNA:RNA) • Sondas de ácidos nucléicos – No provee información de viabilidad • Contaje directo de células viables por microscopía .

Organismos viables pero no cultivable (VBNC): Detección Patógenos de origen alimentario pueden convertirse a VBNC cuando el alimento es puesto a temperaturas frías en un medio rico nutritivamente. Resucitación de células VNC es demostrado por un aumento en cultivilidad pero no en un aumento en el número de células. .

Organismos viables pero no cultivables (VBNC): Teorías • Teoría original: parte del ciclo normal de la bacteria • Resultados recientes: inducido por estrés – Bajas temperaturas (<15oC) – Falta de nutrientes • Reversión a una forma cultivable – Real? – Pocas células cultivables se multiplican .

7 .Organismos viables pero no cultivables (VBNC): Vibrio vulnificus • Figura 2.

Organismos viables pero no cultivables (VBNC): Significado • • • • • • Campylobacter jejuni Escherichia coli Vibrio vulnificus Salmonella enteritidis Shigella Vibrio cholerae ¡Un patógeno que no se detecta! .

características inherentes al alimento pH Contenido de humedad (Aw) Potencial de oxidación-reducción (Eh) Contenido nutricional Constituyentes antimicrobiales Estructuras biológicas .Factores intrínsecos que influyen en el crecimiento microbiano • • • • • • Factores intrínsecos.

0-6.Rangos de pH óptimos para crecimiento microbiano • pH Optimum Bacteria Hongos Levaduras 6.0 8.5 4.5 1.5-6.0-8.5-7.5 Maximum 9.5 .5 1.0 8.8 4.5-3.0-11.5 Minimum 4.5-3.

pH • El pH de un alimento es la medida de la “acidez” o “alcalinidad” de ese producto. Un pH inferior a 7 es ácido. . La escala del pH abarca valores que oscilan entre 0 y 14. un pH de 7 es neutro y un pH superior a 7 es alcalino o básico.

H2O Actividad de agua (Aw ) H2O • Actividad de agua (Aw) proporción de agua presente en un alimento.0 (agua pura) H2O H2O H2O H2O . También se conoce como la humedad relativa. • Rango: 0-1.

Aw Staphylococcus aureus puede crecer hasta un Aw de 0.86 .

54-0.95-1.Aw de alimentos • • • • • • Frutas y vegetales – 0.94 Miel – 0.97-1.75-0.0 Queso – 0.00 Carnes – 0.0.0 Mermeladas.68-1.0 Pan – 0.95-1.75 .

Potencial de oxidación-reducción (Eh) • Oxidación – pérdida de electrones • Reducción – ganancia de electrones • Potencial de oxi-reducción – facilidad en que un sustrato en particular gana o pierde electrones (mV) – Eh negativo: sistema anaeróbico – Eh positivo: sistema es aeróbico • Un producto oxidado es +. uno reducido es - .

Potencial oxi-reductor (O-R) • El potencial oxi-reductor de los alimentos está influenciado por: –Composición química del alimento –Tratamiento que se aplica al procesarlo –Condiciones de almacenaje .

Eh de algunos alimentos • Origen vegetal: +400 mV • Queso: -20 a -200 mV • Carnes – Pre-rigor: +250 mV – Post-rigor: +10 a -130 mV – Carne molida: +300 mV .

¿Cuál de las siguientes representa un Eh + ? .

Rango de crecimiento microbiano en relación a Eh Organismo aerobios Anaerobios facultativos anaerobios Rango de Eh De +500 a +300 mV De +300 a +100 mV De +100 a -250 mV .

Nutrientes • Los microorganismos muestran diversidad en sus requisitos nutricionales. • ¿Qué necesitan? – – – – – – Agua Fuente de energía Fuente de nitrógeno Vitaminas Factores de crecimiento Minerales .

Factores antimicrobiales naturales • • • • • Lisozima en el huevo Aglutinina en la leche Lacteninas en la leche Eugenol en los clavos Ácido benzoico en los arándanos .

Factores extrínsecos que afectan el crecimiento microbiano • Temperatura de almacenamiento • Humedad relativa del ambiente • Presencia y concentración de gases en el ambiente • Presencia y actividades de otros organismos .

Temperatura .

Humedad relativa • Muy alta: condensación. crecimiento • Muy baja: pérdida de humedad. inhibición de crecimiento .

Presencia y concentración de gases • Oxígeno o aire • Atmósfera anaeróbica • CO2 • Ozono .

Presencia y actividades de otros organismos • General – No específica – Inhibición o destrucción de un organismos por otro – Mecanismo • No está claro – Número de inhibidores > organismos blanco – Variedad de inhibidores » Competencia por nutrientes » Alteración no-favorable del ambiente » Combinación de factores .

Presencia y actividades de otros organismos • Antagonismo por lactato – Sustancias con actividad antimicrobiana de bacterias productoras de ácido láctico • • • • • • • Metabolitos de oxígeno Acidos orgánicos CO2 Diacetil Acetaldehído Bacteriocinas Antibíoticos .

Cinética de crecimiento

Fisiología microbiana y metabolismo
• Fermentaciones de alimentos • Daño de alimentos • Seguridad alimentaria

Fisiología microbiana y metabolismo
• Bacterias aeróbicas
– Glucosa…CO2 (oxidación) – Oxígeno…H2O (reducción) – 38 ATPs
• Fosforilación oxidativa en el sistema de transporte de electrones • Oxígeno es el aceptador final de electrones

Fisiología microbiana y metabolismo • Bacterias anaeróbicas – No tienen sistema de transporte de electrones – Reducción de compuestos a través de fermentación – 1-2 ATP/mol de hexosa – Fosforilación a nivel de sustrato • P de compuestos orgánicos es transferido a nucleótidos de adenina para formar ATP .

Glucólisis.Flujo de carbón y fosforilación a nivel de sustrato fosfofructocinasa aldolasa Embden Meyerhof pathway .

Ruta EMP • 2 ATP/mol glucosa • Bidireccional • Enzimas claves: – Fosfofructocinasa – Aldolasa .

Ruta Entner-Doudoroff Zymomonas y Pseudomonas 1 ATP/mol glucosa 1 3C para biosíntesis .

Lactobacillus • Basado en catabolismo de pentosas • 1 ATP/mol hexosa Ruta heterofermentativa .Catabolismo heterofermentativo • Leuconostoc.

Catabolismo homofermentativo Lactococcus. algunos Lactobacillus Bacterias homolácticas utilizan Ruta EMP para producir piruvato . Pediococcus.

Ciclo TCA • Utilizado por todos los aeróbicos • Genera NADH2 and FADH como sustrato para fosforilación oxidativa • Genera ATP por medio de fosforilación a nivel de sustrato • Relacionado a biosíntesis de amino ácidos .

Aeróbicos: regeneración de NAD y respiración • Aeróbico – NADH2…NAD (oxidación – O2 es el aceptador final de e• Azufre y nitrito en “respiración anaeróbica – Transporte de e…gradiente de protones…ATP .

es un compuesto orgánico .Anaerobos: regeneración de NAD y respiración • Anaerobos – Metabolismo fermentativo • El aceptador final de e.

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