PONTIFICA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO

FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

ICB-690 Laboratorio de Bioprocesos INFORME DE LABORATORIO: FERMENTACIÓN PILOTO

Alumnos: Blanca Araya A. Ernesto González R. Francisco Mesa L. Felipe Scott C. Fabrizio Venturini E. Profesores Guía: Raúl Conejeros Oscar Romero

Mayo - 2009

RESUMEN
El siguiente informe resume los resultados de las actividades realizadas durante el desarrollo del primer laboratorio del curso ICB-690. Se cultivó la levadura K. marxianus en un fermentador con 100 L de caldo con medio complejo con lactosa como sustrato limitante para determinar el efecto de suspender la aireación en un cultivo en crecimiento. Para la fase de cultivo aireada se determinaron valores de velocidad específica de crecimiento de 0,42 h-1 para las mediciones de la concentración celular realizadas mediante peso seco y de 0,48 h-1 para las mediciones realizadas mediante turbidimetría. Para esta misma fase se obtuvieron rendimientos de lactosa en células de 0,40 g/g (peso seco) y 0,42 g/g (turbidimetría) para ambas metodologías de medición de la concentración celular. Para la fase no aireada la velocidad de crecimiento y el rendimiento de sustrato en células cayeron drásticamente obteniéndose valores de 0,013 y 0,011 para la velocidad específica de crecimiento determinada por peso seco y turbidimetría respectivamente. Los valores de rendimiento de sustrato en células fueron iguales a 0,02 g/g para ambos métodos de determinación de la concentración celular. En conclusión la suspensión del suministro de aire lleva a la transformación de la fuente de carbono en otros metabolitos, presumiblemente etanol, en la cepa utilizada la cual es caracterizada debido a su capacidad de fermentar el disacárido lactosa como Kluyver negativo.

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ÍNDICE
1 2 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 4 4.1 4.2 4.3

pág.

Introducción.............................................................................................................. 1 Revisión Bibliográfica ............................................................................................... 2 Materiales y métodos ............................................................................................... 4 Preparación de la muestra ....................................................................................... 4 Determinación de biomasa ...................................................................................... 4 Medición de sustrato por el método de DNS ............................................................ 5 Cultivo del inóculo para el reactor piloto................................................................... 6 Fermentación Piloto ................................................................................................. 6 Resultados ............................................................................................................... 8 Cultivo de propagación en reactor Biolafitte ............................................................. 8 Evolución de la concentración de células y sustrato durante el cultivo piloto ........... 8 Determinación de la velocidad específica de crecimiento y el rendimiento de

sustrato en células........................................................................................................... 10 5 6 7 Discusiones ............................................................................................................ 15 Conclusión ............................................................................................................. 17 Referencias bibliográficas ...................................................................................... 18 Mediciones de Biomasa y Sustrato ............................................................. 20 Curva de Calibrado de Biomasa .................................................................. 23 Curva de Calibrado de Sustrato .................................................................. 24 Diseño del Buffer del Reactor de Propagación ............................................ 26

Apéndice .I Apéndice .II Apéndice .III Apéndice .IV

....................................................................... 12 Tabla 5: Valores obtenidos de rendimiento de lactosa en células durante las fases con y sin aireación del cultivo piloto .......ii ÍNDICE DE TABLAS pág...................................M6) denotan mediciones realizadas sobre la misma muestra................................ ................ 2 Tabla 2: Composición del medio de cultivo para la fermentación en el reactor Biolafitte.... 22 Tabla 9: Datos obtenidos para la realización de la curva de calibrado de lactosa ....................... 27 ........... 20 Tabla 7: Medición de la concentración celular realizadas mediante turbidimetría (M1............. 6 Tabla 3: Composición del medio de cultivo utilizado en el reactor piloto.. 13 Tabla 6: Mediciones de sustrato realizadas durante la experiencia de fermentación en el reactor piloto................................ M2... ........ ................................................................. ................................................................................. 21 Tabla 8: Medición de la concentración celular determinada mediante peso seco........................... 26 Tabla 11: Datos del proceso de fermentación ................................................ 27 Tabla 12: Resultados del diseño del buffer .................................... 24 Tabla 10: Especies químicas consideradas para el diseño del buffer.......... Tabla 1: Datos cinéticos obtenidos desde bibliografía .............................. 7 Tabla 4: Valores obtenidos de la velocidad específica de crecimiento para las fases con y sin aireación del cultivo piloto..........................................

.............5 h) para la zona exponencial aireada................................... 25 ....................... Biomasa determinada mediante peso seco (). 13 Figura 7: Curva de calibrado biomasa............................. biomasa determinada mediante peso seco ().......................... biomasa determinada mediante pág. 10 Figura 4: Logaritmo natural de la concentración celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (5..... ............................................... .... 9 Figura 3: Logaritmo natural de la concentración celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (1-5...........................iii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Curva de crecimiento de la biomasa en función del tiempo................ Biomasa determinada mediante turbidimetría (□)..................... Biomasa determinada mediante peso seco ()................. El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag........... Biomasa determinada mediante peso seco ()............. biomasa determinada mediante turbidimetría (■).. ....... El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag..............5-7.......... Biomasa determinada mediante peso seco ()................. 8 Figura 2: Concentración de lactosa [g/L] versus tiempo de cultivo [h] . biomasa determinada mediante turbidimetría (■).........5 h) para la zona exponencial no aireada... 12 Figura 6: Representación de la concentración celular [g/L] versus la concentración de lactosa [g/L] para la zona exponencial no aireada. Biomasa determinada mediante turbidimetría ()...... 11 Figura 5: Representación de la concentración de lactosa [g/L] versus la concentración celular [g/L] para la zona exponencial aireada... turbidimetría (□)........................................................... ....................

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1 1 INTRODUCCIÓN El objetivo de la experiencia es estudiar las consecuencias de la interrupción abrupta del suministro de aire en un cultivo de Kluyveromyces marxianus. En el Capítulo 4: Resultados. junto con las condiciones en las que se realizó el cultivo de propagación y el cultivo piloto. intentando simular una falla fortuita en el suministro de aire. donde además se presenta la información nutricional referente a la levadura que fue utilizada en el desarrollo del medio de cultivo. se muestran los procedimientos realizados durante el laboratorio y las metodologías experimentales. En el Capítulo 6: Conclusión. se presenta la conclusión obtenida en función del objetivo planteado. se presentan los resultados obtenidos durante la experiencia. marxianus en cultivos industriales. En el Capítulo 5: Discusiones. . En el Capítulo 3: Materiales y métodos. con lo que esperamos poder evaluar las posibles pérdidas que esto provocaría al proceso de producción de biomasa. este objetivo fue definido considerando el uso de K. Las posibles consecuencias de una falla en el sistema de suministro de aire se presentan en el Capítulo 2: Revisión Bibliográfica. se realiza un análisis crítico de los resultados obtenidos en vista de la revisión bibliográfica.

K.37 0. puesto que las nuevas clasificaciones taxonómicas muestran que Kluyveromyces fragilis. 1998).35 – 0. en cambio la cepa K. Con respecto a la incapacidad de fermentar otro glúcido distinto de glucosa en condiciones anaerobias (conocido como efecto Kluyver) existen diferencias dependiendo de la cepa. (1996) Zafar et al. También se ha reportado el uso de Kluyveromyces fragilis para la síntesis de lactasa a partir de suero de leche (Acevedo et al. (2000) Lukondeh et al. marxianus CBS 7894 K.37 0. K. En la Tabla 1 se presenta una recopilación de parámetros obtenidos desde bibliografía Tabla 1: Datos cinéticos obtenidos desde bibliografía Cepa K..43 0.47 0. marxianus MTCC 1288 Rendimiento biomasa [g/g] 0. no presentando efecto Crabtree (Walker.22 Velocidad específica de crecimiento [h-1] 0. bulgaricus. marxianus ATCC10022 K.28 0.24 – 0. 2005).04 – 0.40 Referencia Pinheiro et al. fragilis K.. (2000) Pinheiro et al. con la concomitante generación de biomasa microbiana de interés comercial (Lukondeh et al. marxianus FII 510700 K. marxianus CBS 7894 Kluyver (+) es incapaz de hacerlo (Pinheiro et al.49 – 0.06 0.52 0. 2000).2 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Resulta difícil la caracterización de la cepa. (2005) Krzystek y Ledakowicz (2000) Acevedo et al. es decir. fragilis K. En general Kluyveromyces spp es utilizado en la industria láctea para la reducción de la DQO de los efluentes. 2008).. cicerisporus y K.35 – 0.37 – 0.59 0. marxianus es catalogada como una especie insensible a la glucosa. K. marxianus ATCC10022 es Kluyver(-). (2005) . por ejemplo K.10 – 0.15 0.38 – 0. 1996).. es capaz de fermentar disacáridos en condiciones anaerobias. marxianus lo que ha motivado a la inclusión de estas especies bajo el nombre común de Kluyveromyces marxianus (Fonseca et al. wikenii no se diferencian mucho desde el punto de vista genético de K.

sobre los 16 g/L y con respecto al etanol. puesto que ambos compuestos generan inhibición.25 g/L (Zafar et al. en el caso de lactosa.. 2005). . esto debido a la capacidad de la cepa de generar etanol y a cambios morfológicos de algunas cepas bajo condiciones de estrés (O’Shea y Walsh. El modelamiento del crecimiento con lactosa como fuente de carbono debe considerar la concentración de etanol y lactosa.3 Se ha reportado que el efecto de la aireación junto con otros parámetros ambientales afecta de manera importante tanto la velocidad específica de crecimiento como el rendimiento de sustrato en biomasa. 2000). sobre los 1.

La determinación por turbidimetría necesita de una curva de calibrado que ha sido construida anteriormente comparando los resultados del análisis turbidimétrico con el de peso seco (según se muestra en el Apéndice . sustrato y etanol. y depositados en tubos eppendorf para la determinación de etanol. Para la determinación de biomasa por turbidimetría se toma una alícuota directamente de la muestra inicial.4 3 MATERIALES Y MÉTODOS 3. mientras que el pellet se mantiene en el tubo de centrífuga. Luego para determinar el sustrato se toma una alícuota del vial. Tomar la muestra desde el fermentador (30 ml). mediante turbidimetría y por peso seco. 3. . Mientras que para cuantificar etanol por cromatografía gaseosa se usa el contenido del eppendorf.2 Determinación de biomasa La determinación de biomasa se realiza por dos métodos.II). Del vial tomar 4 ml que son filtrados. Verter el sobrenadante en un vial con tapa. Esto debido a que la medición por turbidimetría es rápida. lo que permite tomar decisiones casi instantáneamente. Tomar 10 ml de la muestra inicial que se depositan en un tubo de centrifuga de 15 ml con tapa. Centrifugar por 20 minutos a 4000 rpm. Para llevar a cabo el análisis turbidimétrico se realiza el siguiente protocolo:  Se toma la muestra inicial y se mide su absorbancia a 600 nm teniendo como blanco medio de cultivo sin inocular. a todas las muestras se les realiza el siguiente proceso:        Eliminar 100 ml como premuestra.1 Preparación de la muestra Para realizar los análisis de biomasa. Para la determinación de biomasa por peso seco se emplea el pellet. pero en última instancia si los resultados de ambas mediciones fueran significativamente distintos es el peso seco el que determina el crecimiento real del microorganismo.

vertiendo el contenido en el capacho. El sobrenadante es descartado y se agregan nuevamente aproximadamente 5ml de agua. Volver a centrifugar por 20 minutos a 4000 rpm. se realiza una dilución que permita que la muestra presente una absorbancia en el rango de dicha curva. para que esté en el rango de la curva de calibrado. Resuspender el pellet y centrifugar por 20 minutos a 4000 rpm. Para su aplicación se necesita una curva de calibrado donde se aplica este método a soluciones de lactosa de concentración conocida (véase Apéndice . .15 y 1. El capacho se introduce en la estufa a 105°C hasta que registre peso constante.5 g/L de lactosa. Si la absorbancia está fuera del rango de la curva de calibrado. de modo que la muestra a tomar luego tenga entre 0. Esta mezcla es depositada en un capacho de papel aluminio previamente secado en la estufa a 105°C y pesado. El sobrenadante se descarta nuevamente y el pellet es resuspendido en una mínima cantidad de agua.3 Medición de sustrato por el método de DNS Para determinar la cantidad de lactosa en el medio se utiliza el método de DNS. Agregar una mínima cantidad de agua al tubo de centrífuga y enjuagar. Para la determinación de biomasa por peso seco. y añadir aproximadamente 5ml de agua. Este enjuague se realiza 2 veces. se realiza el siguiente protocolo:          Tomar el pellet obtenido en la preparación de la muestra. Este método procede según lo descrito a continuación:  Diluir el sobrenadante de la centrifugación de la muestra tomada desde el fermentador (contenido en el vial).III). Luego la concentración se calcula como el cuociente entre la diferencia en masa de los capachos y el volumen de muestra inicial centrifugado (10 ml).5   Con esta medida de absorbancia y la curva de calibrado construida.  Tomar 1 ml de muestra y depositarla en un tubo de ensayo con tapa para posteriormente agregar 1 ml de DNS y agitar. se calcula la concentración celular. 3.

11 2.13 3.46 4.19 0. Una vez transcurrido dicho tiempo traspasar el tubo a agua con hielo y dejar allí por 2 min.6   Luego poner durante 15 min el tubo en agua a ebullición. Tabla 2: Composición del medio de cultivo para la fermentación en el reactor Biolafitte. Sin embargo por seguridad se agregaron 200 ml.4 Cultivo del inóculo para el reactor piloto Para el reactor Biolaffitte se utilizó un inóculo de 1.93 0.50 0. . Para la fase de cultivo aireado la agitación fue ajustada en 250 rpm y el flujo de aire por volumen de medio fue de 1. la agitación se disminuyó a 50 rpm. en el momento que se cortó la aireación. Compuesto Lactosa (NH4)2SO4 MgSO4·7H2O CaCl2·2H2O K2HPO4 FeSO4·7H2O Extracto de levadura Concentración [g/L] 31.42 vvm. El medio de propagación del inóculo para el fermentador piloto se resume en la Tabla 2.87 g/L. Luego. y para lograr 6. Finalmente agregar 10 ml de agua destilada al tubo. 3.36 h-1.5 Fermentación Piloto El cultivo comienza con el bombeo del inóculo desde el reactor Biolafitte (10 L) al reactor piloto con 90 L de medio de cultivo esterilizado con la composición mostrada en la Tabla 3.36 3. agitar y medir absorbancia a 540nm.6 g/L de biomasa una vez transcurridas 15 h de cultivo debían agregarse 160 ml si se consideraba una velocidad específica de crecimiento máxima de 0.

56 5.7 Tabla 3: Composición del medio de cultivo utilizado en el reactor piloto.62 0.14 1. Compuesto Lactosa (NH4)2SO4 MgSO4·7H2O CaCl2·2H2O K2HPO4 FeSO4·7H2O Extracto de levadura Concentración [g/L] 32.86 0.21 4.58 0.09 .

Luego de 6.08 g/L y una concentración final de lactosa de 0. 12 10 Biomasa [g/L] 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tiempo [h] Figura 1: Curva de crecimiento de la biomasa en función del tiempo.2 Evolución de la concentración de células y sustrato durante el cultivo piloto El resultado de las mediciones llevadas a cabo durante la experiencia piloto se resume en la Figura 1 para la biomasa y en la Figura 2 para la concentración de lactosa.5 h de cultivo tanto para la biomasa medida mediante peso seco y turbidimetría.5 h se suspendió el suministro de aire.45 g/L. 4.8 4 RESULTADOS 4.24 g/g. lo que se tradujo en una drástica reducción en la velocidad específica de crecimiento hasta el final del cultivo transcurridas 8.5 . La Figura 1 muestra una fase lag de una hora para continuar con un crecimiento exponencial hasta las 6.1 Cultivo de propagación en reactor Biolafitte Se alcanzaron luego de 15 h de cultivo una concentración celular de 7. biomasa determinada mediante turbidimetría (□). Biomasa determinada mediante peso seco (). El rendimiento global de la propagación fue de 0.

0 25. y cuyos promedios se presentan en la Figura 1 y Figura 2.0 0. La concentración inicial de lactosa medida fue muy similar a los 32.3: Determinación de la velocidad específica de crecimiento y el rendimiento de sustrato en células).0 1.9 h. Además durante las primeras 3 h de cultivo no hubo un consumo apreciable. Las líneas discontinuas representan la proyección del crecimiento celular en ambas fases del cultivo (con y sin aireación) a partir de los valores calculados. Luego del corte en el suministro de aire se aprecia una disminución en la velocidad de consumo de sustrato.2 g/L esperados en base a la dosificación del medio de cultivo.0 Sustrato [g/L] 20.0 6.0 30.I: Mediciones de Biomasa y Sustrato.0 0. mediante la Ecuación 1.0 2. esto debido a errores en el procedimiento de centrifugación y lavado de las muestras. marxianus durante el cultivo. o que al menos se correlacionara con el crecimiento observado durante ese periodo. Este hecho será tratado en el Capítulo 5: Discusiones.0 9.0 3. pueden ser consultados en el Apéndice .0 5.0 4.0 15.0 7. Las muestras de biomasa obtenidas mediante peso seco entre el inicio del cultivo y las 2.0 8. de velocidad específica de crecimiento y concentración celular inicial (véase Sección 4. .0 5.0 10.0 Tiempo [hr] Figura 2: Concentración de lactosa [g/L] versus tiempo de cultivo [h] La Figura 2 representa el consumo de lactosa por la población de K. Los datos recolectados durante la experiencia piloto. 35.5 h fueron descartadas por estar muy por encima de la masa de células esperable.

50 2. Ecuación 1 Ecuación 2 ( ) ⁄ ⁄ mediante las linealizaciones mostradas en la ( ⁄ ) Para realizar la linealización los datos de concentración celular fueron llevados a un gráfico de logaritmo natural de la biomasa [g/L] versus tiempo de crecimiento ( siguiente transformación lineal: Ecuación 3 Donde TC es el tiempo de cultivo y TL la duración de la fase lag (1 hora). presentados en la Figura 1 y en la Figura 2.00 0. se procedió a calcular el valor de la velocidad específica de crecimiento μ y el rendimiento de lactosa en células Ecuación 1 y en la Ecuación 2.50 0. biomasa determinada mediante peso seco (). Biomasa determinada mediante turbidimetría (). .5 h) para la zona exponencial aireada.50 0 1 2 3 Tiempo [h] 4 5 6 Figura 3: Logaritmo natural de la concentración celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (1-5. 2.00 -0.50 1.10 4. El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag.3 Determinación de la velocidad específica de crecimiento y el rendimiento de sustrato en células A partir de los datos obtenidos en la experiencia piloto.00 ) utilizando la Ln(Biomasa[g/L]) 1. Las linealizaciones para ambos métodos de medición de la concentración celular en la fase aerobia se muestran en la Figura 3.

17 2.15 2. en esta se eliminó la medición de peso seco correspondiente a 8 h de tiempo de cultivo y la medición por turbidimetría realizada a las 7 h de tiempo de cultivo.5 h) para la zona exponencial no aireada. 2. esto porque presentaban una alta desviación con la tendencia observada.16 2. la linealización abarca desde el inicio del crecimiento (1 hora de cultivo) hasta las 6.5 h a las 6.5 7 7. Biomasa determinada mediante peso seco ().5 h de tiempo de cultivo. Los valores de velocidad específica de crecimiento y coeficientes de correlación (r2) calculados mediante la regresión lineal (Ecuación 1) de los datos obtenidos se presentan en la Tabla 4.20 2. El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag. .5 h de tiempo de cultivo.5-7.22 Ln(Biomasa[g/L]) 2.11 La linealización para la fase aireada con la concentración celular obtenida por peso seco se extiende desde las 2.14 5. La Figura 4 representa las linealizaciones realizadas para la fase de crecimiento sin suministro de aire. se excluyeron los datos iniciales ya que no se cuenta con datos confiables antes de las 2.21 2. biomasa determinada mediante turbidimetría (■).5 h de cultivo (final del cultivo aireado).5 8 Tiempo [h] Figura 4: Logaritmo natural de la concentración celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (5. .19 2.18 2.5 6 6.23 2. Para la concentración celular obtenida por turbidimetría.

F.994 0. Biomasa determinada mediante peso seco (). .48 0. 9 8 7 Biomasa [g/L] 6 5 4 3 2 1 0 15. Datos Peso seco. para ambos métodos de medición de la concentración celular.908 0. La linealización así obtenida puede apreciarse en la Figura 5. F.5 y 6.0 35. no aireada 0. las muestras medidas entre las 2. F.995 0.991 Para calcular el rendimiento de lactosa en células ( ⁄ ) se linealizaron los datos de concentración celular obtenidos por turbidimetría y peso seco con la concentración de lactosa según la Ecuación 2. aireada Peso seco.0 20.0 Figura 5: Representación de la concentración de lactosa [g/L] versus la concentración celular [g/L] para la zona exponencial aireada.42 0. F.011 0.0 25.5 h de cultivo. no aireada Turbidimetría.12 Tabla 4: Valores obtenidos de la velocidad específica de crecimiento para las fases con y sin aireación del cultivo piloto.0 Sustrato [g/L] 30. Para la fase aireada se consideraron. aireada Turbidimetría.013 0. Biomasa determinada mediante turbidimetría (□).

3 9.7 8.0 15. Tabla 5: Valores obtenidos de rendimiento de lactosa en células durante las fases con y sin aireación del cultivo piloto Datos Peso seco.2 9.1 Biomasa [g/L] 9 8.974 0.8 8.40 0.02 0.6 8.0 5. Los valores del rendimiento de lactosa en células calculados para ambas fases del cultivo.5 0.02 0. no aireada ⁄ 0. F. Esto puede apreciarse en la Figura 6.989 .0 Sustrato [g/L] Figura 6: Representación de la concentración celular [g/L] versus la concentración de lactosa [g/L] para la zona exponencial no aireada. no aireada Turbidimetría.973 0. F.5 h (corte del suministro de aire) y el final del tiempo de cultivo para ambos métodos de determinación de la concentración celular. F. aireada Turbidimetría. así como los coeficientes de correlación (r2) se presentan en la Tabla 5. Biomasa determinada mediante peso seco (). F. biomasa determinada mediante turbidimetría (■).0 10.44 0.9 8.13 El rendimiento de lactosa en células para la fase sin aireación se calculó con los datos comprendidos entre las 6. aireada Peso seco.947 0. 9.

14 Durante el transcurso de la experiencia se prepararon 10 muestras de caldo centrifugado y filtrado para la determinación de etanol mediante cromatografía. sin embargo se espera contar con ellas durante la primera semana de mayo y agregar esta información a una posible futura presentación. Al momento de entregar este informe aun no se disponía de los resultados de dichas mediciones. .

Si la cepa hubiese sido Kluyver positivo la concentración de lactosa no habría disminuido y.02 h-1 a 0. la hermeticidad del fermentador y la presión positiva de CO2 generada por la fermentación).40-0. Estos hechos indicarían que la variedad de K.44) y la concentración celular alcanzada al momento de cortar el suministro de aire.4 y 13.15 5 DISCUSIONES Luego del la interrupción en el suministro de aire a las 6. se piensa que el sustrato podría haber sido aprovechado siempre que la maquinaria celular no hubiese resultado dañada por la falta de aire.011h-1 respectivamente. Valores menores a los reportados en bibliografía los que varían entre 0. una vez reanudado el suministro de aire. se encuentra dentro de lo esperado según la recopilación bibliográfica realizada (véase Tabla 1). marxianus utilizada en la experiencia es Kluyver negativa.2 g/L estimados en base al rendimiento de sustrato en células de la fase aerobia (0. la cepa degrada la lactosa sin crecer significativamente. un corto tiempo de análisis y la dificultad de realizar adecuadamente las altas diluciones . Cabe cuestionar la validez de la velocidad específica de crecimiento para la zona anaerobia ya que se combinan los hechos de disponer de pocas mediciones.42 h-1 de acuerdo a la medición de biomasa mediante peso seco y 0.16 h-1 (Acevedo et al. Sin embargo dado que no fue posible monitorear la concentración de oxígeno disuelto en el caldo no es correcto asegurar con certeza que la cepa es Kluyver negativo. Para la etapa sin suministro de aire la velocidad de crecimiento específica calculada a partir de las mediciones de biomasa mediante peso seco y turbidimetría son 0. mientras que la concentración de lactosa en el medio disminuía ininterrumpidamente (véase Figura 1 y Figura 2).48 h-1 según la medición realizada por turbidimetría. 1996) y 0.04 h-1 para 40 y 10 g/L de lactosa respectivamente (Pinheiro et al. 0. dado que es capaz de fermentar la lactosa en condiciones anaerobias (supuestas en base a la ausencia de aireación. 2000). Esto repercute en que cuando se suspende el suministro de aire. lo que se traduce en un desperdicio de sustrato si este estaba destinado a la generación de biomasa.013 h-1 y 0. La velocidad de crecimiento en la fase aerobia.5 h de cultivo se observó una notable disminución en la velocidad específica de crecimiento. Esto es claro al comparar la concentración celular cercana a 9 g/L alcanzada versus una concentración celular máxima de entre 12.

16 necesarias para la determinación de la biomasa mediante turbidimetría para un cultivo con una concentración celular de alrededor de 9 g/L.02 por ambos métodos de medición) se encuentran cerca de los valores reportados en bibliografía: entre 0. .4 y 0. 2000). lo que aumenta el error en la medición. 2000) y 0. Los valores calculados se encuentran por debajo del rendimiento de lactosa en células estimado en base al rendimiento teórico máximo y el uso del factor para cultivo aerobio y 0. Esto puede deberse a los errores cometidos durante la dilución de la muestra para la determinación de la cantidad de sustrato.1996). se observa que la biomasa aumenta pero que el sustrato no disminuye proporcionalmente. ya que durante las primeras horas de cultivo la alta concentración de lactosa obliga a utilizar elevadas diluciones (1:30).40 y 0. Durante las primeras 3 h de cultivo.44 para la biomasa determinada mediante peso seco y turbidimetría) y anaerobia (0.1 para cultivo anaerobio): (0.06 para un cultivo sin aireación (Acevedo et al.6 El porcentaje de carbono en células se obtuvo desde bibliografía (Krzystek y Ledakowicz.5 para cultivo aerobio (Pinheiro et al. Los valores de rendimiento de lactosa en células para la fase aerobia (0.

marxianus resultaría severamente perjudicado si se interrumpe el suministro de aire durante el transcurso del mismo. esto si se trata de una cepa Kluyver negativa. .17 6 CONCLUSIÓN Un cultivo industrial cuyo fin sea la producción de biomasa de K. con nitrógeno. una vez suspendido el suministro de aire. Para establecer fehacientemente si la cepa estudiada corresponde al tipo Kluyver negativa o positiva se recomienda instalar un medidor de oxigeno disuelto o desplazar el oxígeno en el fermentador. la que es capaz de degradar sustrato en estas condiciones sin presentar una velocidad de crecimiento significativa. De esta forma se aseguran las condiciones anaerobias en el caldo.

Ledakowicz. I. O'Shea D. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. J. Gentina. 53:316-322. C. M. 2005. N. Batch kinetics and modelling of ethanolic fermentation on whey. Applied Microbiology Biotechnology. Reyes. First edition. Ashbolt. Bojorge. Husain. y S. Enzyme and Microbial Technology. 79:339-354. Walsh. Fonseca G. Chichester: John Wiley and Sons. The effect of culture conditions on the morphology of the dimorphic yeast kluveromyces marxianus var. Wittmann. Gombert. Pinheiro R. y A. Mota. Walker G. marxianus nrrly2415: a study incorporating image analysis. N. E. 2000. Krzystek L. y P. 2005. Torres. 2000. Owais. Saleemuddin. Applied Microbiology Biotechnology. 2008. 1998. . Annals of the New York Academy of Sciences. Yeast: physiology and Biotechnology. y S. Belo. C. International Journal of Food Science and Technology. y A. 26:756-762. Development of a pilotplant fermentation process for the production of yeast lactase. y M. J. Lukondeh T.217. . 799:559-562. Rogers. . Zafar S. . Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. Air pressure effects on biomass yield of two different kluyveromyces strains. M. Stoichiometric analysis of kluyveromyces fragilis growth on lactose. M. . . pages 216 . 40: 579-604. I. Fed-batch fermentation for production of kluyveromyces marxianusii 510700 cultivated on lactosed-based medium. The yeast kluyveromyces marxianus and its biotechnological potetial. y P. L. 1996. 2000. Heinzle.18 7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Acevedo F. 32:284-288. 75:1110-1118.

.I Apéndice .IV pág.III Apéndice .II Apéndice .19 INDICE DE APÉNDICES Apéndice . 20 Curva de Calibrado de Biomasa……………………………………………… 23 Curva de Calibrado de Sustrato………………………………………………. 24 Diseño del Buffer del Reactor de Propagación……………………………… 26 . Mediciones de Biomasa y Sustrato…………………………………………..

7 9.5 6.9 30.20 APÉNDICE .4 24. Tabla 6: Mediciones de sustrato realizadas durante la experiencia de fermentación en el reactor piloto.58 E Las mediciones marcadas con E fueron eliminadas ya que no se encontraban en el rango de la curva de calibrado La concentración celular determinada mediante turbidimetría durante el transcurso del cultivo en el reactor piloto se presenta en Tabla 7.5 2.5 7.5 Medición 1 [g/L] Medición 2 [g/L] E E E 31. A medida que aumentó la concentración celular .2 9.5 4.3 13. En ambos casos se entrega el valor de absorbancia transformado en concentración celular o concentración de lactosa mediante la Ecuación 4 y la Ecuación 5 respectivamente.36 31.9 29.9 31.0 3.97 8.9 22.7 31.86 8.4 26.7 18.0 6.0 2.02 5.9 28.6 31.9 29.9 26.0 8.3 21.0 23.I MEDICIONES DE BIOMASA Y SUSTRATO A continuación se presentan los resultados de las mediciones realizadas durante el transcurso de la fermentación en el reactor piloto para la concentración de células y lactosa.61 3.4 12.0 4.5 3.7 18.5 1.5 5.0 1.4 29. Tiempo 0.2 30.5 8.0 7.0 5.20 5.6 26.6 27.

45 1.16 6.29 9.28 4.39 9.11 1.31 5.0 5.03 8.38 6.0 8.85 9.5 8. Tabla 7: Medición de la concentración celular realizadas mediante turbidimetría (M1.37 3. M2…M6) denotan mediciones realizadas sobre la misma muestra.0 3.71 9.35 4.36 7.5 3.75 0.5 2.78 6.53 M2[g/L] M3[g/L] M4[g/L] M5[g/L] M6[g/L] .0 6.0 2.0 4.5 M1[g/L] 0.39 6.90 2.71 3.11 9.48 1.10 9.5 1.37 7.12 9.0 7.0 1.10 1.87 1.78 9.38 3.75 9.90 8.5 7.58 9.81 0.5 4.5 6.81 9.88 1.5 5.35 5.49 5.01 9.78 0.90 2. Tiempo [h] 0.21 también aumentó la variación entre duplicados de la misma muestra haciendo necesario repetir hasta 6 veces la medición.

71 8.5 6 6.12 2.5 1.72 8.22 La Tabla 8 muestra el resultado de las mediciones de concentración celular determinadas mediante peso seco.5 2 2.39 8.5 7 7.1 6.16 5.62 3.5 h debido a errores cometidos en la ejecución del protocolo.5 5 5.5 4 4. Se eliminaron las muestras comprendidas entre el inicio del cultivo y las 1.5 8 8.94 8.83 .12 7.34 4.5 1 1.62 2.5 3 3. Tabla 8: Medición de la concentración celular determinada mediante peso seco Tiempo cultivo Masa de células 0 0.66 1.58 8.

Siguiendo lo anterior. Se construye la curva de calibrado donde se correlaciona la absorbancia registrada con la concentración celular de peso seco.293 respectivamente.706. del que se debe conocer su concentración celular por peso seco.11.17 g/L (promedio de 2. 2. 0.23 APÉNDICE . el sobrenadante es descartado y el pellet se somete al protocolo de determinación de biomasa por peso seco. Luego se realizan diluciones 1:10. Para esto se toman alícuotas que se centrifugan por 15 minutos a 10000 RPM. Del caldo se preparan distintas diluciones y se mide su absorbancia comparando con un blanco de medio de cultivo estéril. 0.510. se tiene que el caldo empleado posee una concentración celular de 2. 1:20 y 1:30 a las que se le mide la absorbancia. registrando valores de 0.25 g/L).II CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA Se necesita un caldo de cultivo crecido.422 y 0. Ecuación 4 donde: : absorbancia : concentración de biomasa ⁄ . Esto permite construir las siguientes expresiones que relacionan la concentración y la absorbancia. 1:15.15 y 2.

276 0.562 0. Los datos formulados se exponen en la Tabla 9.538 0. .725 El grafico obtenido entre absorbancia y concentración de lactosa del total de los datos expuestos se presenta en la Figura 7.409 0.5 g/L por duplicado.900 1.5 g/L. Tabla 9: Datos obtenidos para la realización de la curva de calibrado de lactosa Muestra 1 2 3 4 5 6 Volumen Solución Estándar [ml] 1 2 4 6 8 10 Volumen Agua Concentración Absorbancia Destilada[ml] [g/L] 1 9 8 6 4 2 0 0.300 0.415 0. A partir de esta solución se dispuso de una batería de diluciones desde 0 g/L a 1.263 0.20 1.113 0.150 0.24 APÉNDICE .742 Absorbancia 2 0. a las cuales se les aplicó el método de DNS y se midió su absorbancia respectiva a 540nm.040 0.040 0.122 0.50 0.III CURVA DE CALIBRADO DE SUSTRATO Para la determinación de la curva de calibrado para la detección de lactosa mediante el método DNS se preparó una solución estándar de concentración conocida de 1.600 0.

4 0.7 0.25 0.8 1 1.2 0.2 1.4 1.2 0.6 Concentración de lactosa (g/L) Figura 7: Curva de calibrado biomasa La correlación obtenida con presentados en la Tabla 9 es: Ecuación 5 Donde: : absorbancia : concentración de lactosa entre absorbancia y concentración para los datos .1 0 0 0.4 0.3 0.6 0.6 Absorbancia 0.8 0.5 0.

considerando los subíndices i para la concentración al inicio de la fermentación y f para el final de la fermentación.26 APÉNDICE . El pH al que se realizará la fermentación será entre 4. Para realizar el diseño se consideraron las especies químicas de la Tabla 10. Tabla 10: Especies químicas consideradas para el diseño del buffer Especie química [g/L] Citrato total agregado Citrato estado de oxidación 0 Citrato estado de oxidación -1 Citrato estado de oxidación -2 Citrato estado de oxidación -3 Ion hidróxido Protones Ion Sodio Ion Sulfato Símbolo Balance de masa de las especies del citrato al comienzo de la fermentación: Ecuación 6 Balance de cargas al inicio del cultivo: Ecuación 7 Balance de masa de las especies del citrato al final de la fermentación: Ecuación 8 Balance de cargas al final del cultivo: Ecuación 9 . se escogió este rango debido a que ha sido utilizado con éxito en otros trabajos con Kluyveromyces (Acevedo et al. Se trabajará con pH ácido debido a que esto genera una presión de selección para levaduras.IV PROPAGACIÓN DISEÑO DEL BUFFER DEL REACTOR DE Para diseñar el tampón se utilizará ácido cítrico monohidrato y se ajustará el pH con hidróxido de sodio.5 al comienzo y 4 al final de la fermentación.. 1996).

Ecuación 7.27 Cada una de las especies del citrato puede ser expresada en función de la concentración de protones y la concentración de citrato con estado de oxidación cero . Experimentalmente esto se debe realizar agregando una solución de hidróxido de sodio mientras se mide el pH. de acuerdo a las ecuaciones de equilibrio químico. y posteriormente se deberá ajustar el pH con 64. . : Expresado como Hidróxido de Sodio Finalmente. utilizando los datos del proceso expuestos en la Tabla 11.3 g de hidróxido de sodio. Tabla 11: Datos del proceso de fermentación Especie química Concentración [M] Tabla 12: Resultados del diseño del buffer Especie química Concentración [M] Concentración [g/l] : Expresados como Ácido Cítrico monohidrato. Ecuación 10 Despejando las variables: Ecuación 11 ( ) ( ) Resolviendo el sistema de ecuaciones al remplazar la Ecuación 11 en la Ecuación 6. Ecuación 8 y Ecuación 9. y considerando el equilibrio del agua tenemos los resultados de la Tabla 12. para la preparación de 10 L de medio de cultivo se deberá agregar 242 g de ácido cítrico monohidrato.