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PONTIFICA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO

FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

ICB-690 Laboratorio de Bioprocesos INFORME DE LABORATORIO: FERMENTACIÓN PILOTO

Alumnos: Blanca Araya A. Ernesto González R. Francisco Mesa L. Felipe Scott C. Fabrizio Venturini E. Profesores Guía: Raúl Conejeros Oscar Romero

Mayo - 2009

RESUMEN
El siguiente informe resume los resultados de las actividades realizadas durante el desarrollo del primer laboratorio del curso ICB-690. Se cultivó la levadura K. marxianus en un fermentador con 100 L de caldo con medio complejo con lactosa como sustrato limitante para determinar el efecto de suspender la aireación en un cultivo en crecimiento. Para la fase de cultivo aireada se determinaron valores de velocidad específica de crecimiento de 0,42 h-1 para las mediciones de la concentración celular realizadas mediante peso seco y de 0,48 h-1 para las mediciones realizadas mediante turbidimetría. Para esta misma fase se obtuvieron rendimientos de lactosa en células de 0,40 g/g (peso seco) y 0,42 g/g (turbidimetría) para ambas metodologías de medición de la concentración celular. Para la fase no aireada la velocidad de crecimiento y el rendimiento de sustrato en células cayeron drásticamente obteniéndose valores de 0,013 y 0,011 para la velocidad específica de crecimiento determinada por peso seco y turbidimetría respectivamente. Los valores de rendimiento de sustrato en células fueron iguales a 0,02 g/g para ambos métodos de determinación de la concentración celular. En conclusión la suspensión del suministro de aire lleva a la transformación de la fuente de carbono en otros metabolitos, presumiblemente etanol, en la cepa utilizada la cual es caracterizada debido a su capacidad de fermentar el disacárido lactosa como Kluyver negativo.

i

ÍNDICE
1 2 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 4 4.1 4.2 4.3

pág.

Introducción.............................................................................................................. 1 Revisión Bibliográfica ............................................................................................... 2 Materiales y métodos ............................................................................................... 4 Preparación de la muestra ....................................................................................... 4 Determinación de biomasa ...................................................................................... 4 Medición de sustrato por el método de DNS ............................................................ 5 Cultivo del inóculo para el reactor piloto................................................................... 6 Fermentación Piloto ................................................................................................. 6 Resultados ............................................................................................................... 8 Cultivo de propagación en reactor Biolafitte ............................................................. 8 Evolución de la concentración de células y sustrato durante el cultivo piloto ........... 8 Determinación de la velocidad específica de crecimiento y el rendimiento de

sustrato en células........................................................................................................... 10 5 6 7 Discusiones ............................................................................................................ 15 Conclusión ............................................................................................................. 17 Referencias bibliográficas ...................................................................................... 18 Mediciones de Biomasa y Sustrato ............................................................. 20 Curva de Calibrado de Biomasa .................................................................. 23 Curva de Calibrado de Sustrato .................................................................. 24 Diseño del Buffer del Reactor de Propagación ............................................ 26

Apéndice .I Apéndice .II Apéndice .III Apéndice .IV

.................... 20 Tabla 7: Medición de la concentración celular realizadas mediante turbidimetría (M1................... Tabla 1: Datos cinéticos obtenidos desde bibliografía .......................................................................... 7 Tabla 4: Valores obtenidos de la velocidad específica de crecimiento para las fases con y sin aireación del cultivo piloto........................... 12 Tabla 5: Valores obtenidos de rendimiento de lactosa en células durante las fases con y sin aireación del cultivo piloto ................. .......ii ÍNDICE DE TABLAS pág...................................................................................................................... 2 Tabla 2: Composición del medio de cultivo para la fermentación en el reactor Biolafitte.............................. 24 Tabla 10: Especies químicas consideradas para el diseño del buffer..................................M6) denotan mediciones realizadas sobre la misma muestra........... .................................................. 27 ............ 27 Tabla 12: Resultados del diseño del buffer . 21 Tabla 8: Medición de la concentración celular determinada mediante peso seco... .... 26 Tabla 11: Datos del proceso de fermentación ................... 22 Tabla 9: Datos obtenidos para la realización de la curva de calibrado de lactosa ... M2.............................................................................................. 6 Tabla 3: Composición del medio de cultivo utilizado en el reactor piloto................................. ..... 13 Tabla 6: Mediciones de sustrato realizadas durante la experiencia de fermentación en el reactor piloto...............

.............................................. ........ Biomasa determinada mediante turbidimetría ()....5-7... Biomasa determinada mediante peso seco ()........... Biomasa determinada mediante peso seco ().... turbidimetría (□). biomasa determinada mediante pág........ El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag................................................ 11 Figura 5: Representación de la concentración de lactosa [g/L] versus la concentración celular [g/L] para la zona exponencial aireada.......................................... ........ 12 Figura 6: Representación de la concentración celular [g/L] versus la concentración de lactosa [g/L] para la zona exponencial no aireada...... Biomasa determinada mediante turbidimetría (□)... Biomasa determinada mediante peso seco ().............................. biomasa determinada mediante turbidimetría (■)...... El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag...... Biomasa determinada mediante peso seco ()................ 9 Figura 3: Logaritmo natural de la concentración celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (1-5............... biomasa determinada mediante peso seco ()................5 h) para la zona exponencial aireada.. 25 ......... ........................................... 13 Figura 7: Curva de calibrado biomasa.............iii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Curva de crecimiento de la biomasa en función del tiempo.............. 10 Figura 4: Logaritmo natural de la concentración celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (5................ ......................5 h) para la zona exponencial no aireada....................... biomasa determinada mediante turbidimetría (■)............. 8 Figura 2: Concentración de lactosa [g/L] versus tiempo de cultivo [h] .....

.

intentando simular una falla fortuita en el suministro de aire. se presenta la conclusión obtenida en función del objetivo planteado. Las posibles consecuencias de una falla en el sistema de suministro de aire se presentan en el Capítulo 2: Revisión Bibliográfica. donde además se presenta la información nutricional referente a la levadura que fue utilizada en el desarrollo del medio de cultivo. se realiza un análisis crítico de los resultados obtenidos en vista de la revisión bibliográfica. con lo que esperamos poder evaluar las posibles pérdidas que esto provocaría al proceso de producción de biomasa. En el Capítulo 4: Resultados. En el Capítulo 6: Conclusión. este objetivo fue definido considerando el uso de K.1 1 INTRODUCCIÓN El objetivo de la experiencia es estudiar las consecuencias de la interrupción abrupta del suministro de aire en un cultivo de Kluyveromyces marxianus. junto con las condiciones en las que se realizó el cultivo de propagación y el cultivo piloto. . marxianus en cultivos industriales. En el Capítulo 3: Materiales y métodos. se muestran los procedimientos realizados durante el laboratorio y las metodologías experimentales. En el Capítulo 5: Discusiones. se presentan los resultados obtenidos durante la experiencia.

2005).06 0. marxianus CBS 7894 Kluyver (+) es incapaz de hacerlo (Pinheiro et al. En general Kluyveromyces spp es utilizado en la industria láctea para la reducción de la DQO de los efluentes. en cambio la cepa K.15 0. (2000) Pinheiro et al. marxianus FII 510700 K.37 – 0. fragilis K. (2005) Krzystek y Ledakowicz (2000) Acevedo et al. marxianus ATCC10022 es Kluyver(-). wikenii no se diferencian mucho desde el punto de vista genético de K. 1998).37 0. 2000). por ejemplo K.28 0.35 – 0. marxianus lo que ha motivado a la inclusión de estas especies bajo el nombre común de Kluyveromyces marxianus (Fonseca et al. no presentando efecto Crabtree (Walker. con la concomitante generación de biomasa microbiana de interés comercial (Lukondeh et al. marxianus es catalogada como una especie insensible a la glucosa. bulgaricus.. marxianus CBS 7894 K.04 – 0. fragilis K. es decir. es capaz de fermentar disacáridos en condiciones anaerobias. 2008).. 1996).2 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Resulta difícil la caracterización de la cepa.37 0.35 – 0.59 0.43 0. K. (2005) .47 0. (2000) Lukondeh et al.22 Velocidad específica de crecimiento [h-1] 0. (1996) Zafar et al..40 Referencia Pinheiro et al. puesto que las nuevas clasificaciones taxonómicas muestran que Kluyveromyces fragilis. K..38 – 0. K. En la Tabla 1 se presenta una recopilación de parámetros obtenidos desde bibliografía Tabla 1: Datos cinéticos obtenidos desde bibliografía Cepa K. marxianus ATCC10022 K.24 – 0.10 – 0. cicerisporus y K.49 – 0. marxianus MTCC 1288 Rendimiento biomasa [g/g] 0. Con respecto a la incapacidad de fermentar otro glúcido distinto de glucosa en condiciones anaerobias (conocido como efecto Kluyver) existen diferencias dependiendo de la cepa.52 0. También se ha reportado el uso de Kluyveromyces fragilis para la síntesis de lactasa a partir de suero de leche (Acevedo et al.

sobre los 1. esto debido a la capacidad de la cepa de generar etanol y a cambios morfológicos de algunas cepas bajo condiciones de estrés (O’Shea y Walsh. El modelamiento del crecimiento con lactosa como fuente de carbono debe considerar la concentración de etanol y lactosa. 2000). 2005). en el caso de lactosa. sobre los 16 g/L y con respecto al etanol.25 g/L (Zafar et al.3 Se ha reportado que el efecto de la aireación junto con otros parámetros ambientales afecta de manera importante tanto la velocidad específica de crecimiento como el rendimiento de sustrato en biomasa. puesto que ambos compuestos generan inhibición.. .

a todas las muestras se les realiza el siguiente proceso:        Eliminar 100 ml como premuestra. Tomar la muestra desde el fermentador (30 ml). Luego para determinar el sustrato se toma una alícuota del vial. sustrato y etanol. Para la determinación de biomasa por turbidimetría se toma una alícuota directamente de la muestra inicial. lo que permite tomar decisiones casi instantáneamente. La determinación por turbidimetría necesita de una curva de calibrado que ha sido construida anteriormente comparando los resultados del análisis turbidimétrico con el de peso seco (según se muestra en el Apéndice . Centrifugar por 20 minutos a 4000 rpm. 3. pero en última instancia si los resultados de ambas mediciones fueran significativamente distintos es el peso seco el que determina el crecimiento real del microorganismo.1 Preparación de la muestra Para realizar los análisis de biomasa. mientras que el pellet se mantiene en el tubo de centrífuga. mediante turbidimetría y por peso seco. Para la determinación de biomasa por peso seco se emplea el pellet.2 Determinación de biomasa La determinación de biomasa se realiza por dos métodos. Tomar 10 ml de la muestra inicial que se depositan en un tubo de centrifuga de 15 ml con tapa. Del vial tomar 4 ml que son filtrados. Verter el sobrenadante en un vial con tapa. Esto debido a que la medición por turbidimetría es rápida.II). Para llevar a cabo el análisis turbidimétrico se realiza el siguiente protocolo:  Se toma la muestra inicial y se mide su absorbancia a 600 nm teniendo como blanco medio de cultivo sin inocular. y depositados en tubos eppendorf para la determinación de etanol. Mientras que para cuantificar etanol por cromatografía gaseosa se usa el contenido del eppendorf.4 3 MATERIALES Y MÉTODOS 3. .

Para su aplicación se necesita una curva de calibrado donde se aplica este método a soluciones de lactosa de concentración conocida (véase Apéndice . Luego la concentración se calcula como el cuociente entre la diferencia en masa de los capachos y el volumen de muestra inicial centrifugado (10 ml). Esta mezcla es depositada en un capacho de papel aluminio previamente secado en la estufa a 105°C y pesado. Si la absorbancia está fuera del rango de la curva de calibrado. para que esté en el rango de la curva de calibrado.5 g/L de lactosa. de modo que la muestra a tomar luego tenga entre 0. Volver a centrifugar por 20 minutos a 4000 rpm.  Tomar 1 ml de muestra y depositarla en un tubo de ensayo con tapa para posteriormente agregar 1 ml de DNS y agitar. El capacho se introduce en la estufa a 105°C hasta que registre peso constante.III). . se realiza una dilución que permita que la muestra presente una absorbancia en el rango de dicha curva.3 Medición de sustrato por el método de DNS Para determinar la cantidad de lactosa en el medio se utiliza el método de DNS. 3.15 y 1. Este método procede según lo descrito a continuación:  Diluir el sobrenadante de la centrifugación de la muestra tomada desde el fermentador (contenido en el vial). se realiza el siguiente protocolo:          Tomar el pellet obtenido en la preparación de la muestra. El sobrenadante es descartado y se agregan nuevamente aproximadamente 5ml de agua. Este enjuague se realiza 2 veces. se calcula la concentración celular. Agregar una mínima cantidad de agua al tubo de centrífuga y enjuagar.5   Con esta medida de absorbancia y la curva de calibrado construida. Para la determinación de biomasa por peso seco. y añadir aproximadamente 5ml de agua. Resuspender el pellet y centrifugar por 20 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se descarta nuevamente y el pellet es resuspendido en una mínima cantidad de agua. vertiendo el contenido en el capacho.

42 vvm.6 g/L de biomasa una vez transcurridas 15 h de cultivo debían agregarse 160 ml si se consideraba una velocidad específica de crecimiento máxima de 0. El medio de propagación del inóculo para el fermentador piloto se resume en la Tabla 2.93 0.13 3. la agitación se disminuyó a 50 rpm.6   Luego poner durante 15 min el tubo en agua a ebullición. .11 2. Luego. Para la fase de cultivo aireado la agitación fue ajustada en 250 rpm y el flujo de aire por volumen de medio fue de 1.36 h-1.5 Fermentación Piloto El cultivo comienza con el bombeo del inóculo desde el reactor Biolafitte (10 L) al reactor piloto con 90 L de medio de cultivo esterilizado con la composición mostrada en la Tabla 3. Compuesto Lactosa (NH4)2SO4 MgSO4·7H2O CaCl2·2H2O K2HPO4 FeSO4·7H2O Extracto de levadura Concentración [g/L] 31. Finalmente agregar 10 ml de agua destilada al tubo. 3. Tabla 2: Composición del medio de cultivo para la fermentación en el reactor Biolafitte. en el momento que se cortó la aireación.50 0.19 0.4 Cultivo del inóculo para el reactor piloto Para el reactor Biolaffitte se utilizó un inóculo de 1.87 g/L. y para lograr 6. Una vez transcurrido dicho tiempo traspasar el tubo a agua con hielo y dejar allí por 2 min. agitar y medir absorbancia a 540nm.46 4.36 3. Sin embargo por seguridad se agregaron 200 ml.

14 1. Compuesto Lactosa (NH4)2SO4 MgSO4·7H2O CaCl2·2H2O K2HPO4 FeSO4·7H2O Extracto de levadura Concentración [g/L] 32.62 0.58 0.86 0.21 4.09 .56 5.7 Tabla 3: Composición del medio de cultivo utilizado en el reactor piloto.

8 4 RESULTADOS 4.5 .2 Evolución de la concentración de células y sustrato durante el cultivo piloto El resultado de las mediciones llevadas a cabo durante la experiencia piloto se resume en la Figura 1 para la biomasa y en la Figura 2 para la concentración de lactosa. 4.24 g/g.5 h se suspendió el suministro de aire. biomasa determinada mediante turbidimetría (□).08 g/L y una concentración final de lactosa de 0. lo que se tradujo en una drástica reducción en la velocidad específica de crecimiento hasta el final del cultivo transcurridas 8. Biomasa determinada mediante peso seco (). La Figura 1 muestra una fase lag de una hora para continuar con un crecimiento exponencial hasta las 6.45 g/L. Luego de 6.5 h de cultivo tanto para la biomasa medida mediante peso seco y turbidimetría. 12 10 Biomasa [g/L] 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tiempo [h] Figura 1: Curva de crecimiento de la biomasa en función del tiempo. El rendimiento global de la propagación fue de 0.1 Cultivo de propagación en reactor Biolafitte Se alcanzaron luego de 15 h de cultivo una concentración celular de 7.

0 Tiempo [hr] Figura 2: Concentración de lactosa [g/L] versus tiempo de cultivo [h] La Figura 2 representa el consumo de lactosa por la población de K.0 8.0 30. Las muestras de biomasa obtenidas mediante peso seco entre el inicio del cultivo y las 2.0 2. esto debido a errores en el procedimiento de centrifugación y lavado de las muestras. o que al menos se correlacionara con el crecimiento observado durante ese periodo. La concentración inicial de lactosa medida fue muy similar a los 32.9 h.0 9. Las líneas discontinuas representan la proyección del crecimiento celular en ambas fases del cultivo (con y sin aireación) a partir de los valores calculados.5 h fueron descartadas por estar muy por encima de la masa de células esperable.0 0.0 7.0 Sustrato [g/L] 20.0 4.I: Mediciones de Biomasa y Sustrato. marxianus durante el cultivo. Este hecho será tratado en el Capítulo 5: Discusiones. y cuyos promedios se presentan en la Figura 1 y Figura 2.0 10.2 g/L esperados en base a la dosificación del medio de cultivo.3: Determinación de la velocidad específica de crecimiento y el rendimiento de sustrato en células).0 5. 35. Luego del corte en el suministro de aire se aprecia una disminución en la velocidad de consumo de sustrato.0 0.0 25. de velocidad específica de crecimiento y concentración celular inicial (véase Sección 4.0 3.0 6.0 1.0 5. pueden ser consultados en el Apéndice . . Los datos recolectados durante la experiencia piloto. Además durante las primeras 3 h de cultivo no hubo un consumo apreciable.0 15. mediante la Ecuación 1.

2.00 ) utilizando la Ln(Biomasa[g/L]) 1. . Biomasa determinada mediante turbidimetría (). se procedió a calcular el valor de la velocidad específica de crecimiento μ y el rendimiento de lactosa en células Ecuación 1 y en la Ecuación 2.5 h) para la zona exponencial aireada.3 Determinación de la velocidad específica de crecimiento y el rendimiento de sustrato en células A partir de los datos obtenidos en la experiencia piloto. El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag.10 4. Las linealizaciones para ambos métodos de medición de la concentración celular en la fase aerobia se muestran en la Figura 3. biomasa determinada mediante peso seco ().00 -0. Ecuación 1 Ecuación 2 ( ) ⁄ ⁄ mediante las linealizaciones mostradas en la ( ⁄ ) Para realizar la linealización los datos de concentración celular fueron llevados a un gráfico de logaritmo natural de la biomasa [g/L] versus tiempo de crecimiento ( siguiente transformación lineal: Ecuación 3 Donde TC es el tiempo de cultivo y TL la duración de la fase lag (1 hora).00 0.50 2. presentados en la Figura 1 y en la Figura 2.50 0.50 0 1 2 3 Tiempo [h] 4 5 6 Figura 3: Logaritmo natural de la concentración celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (1-5.50 1.

5 h de tiempo de cultivo. se excluyeron los datos iniciales ya que no se cuenta con datos confiables antes de las 2. .20 2. .5 h a las 6. esto porque presentaban una alta desviación con la tendencia observada.17 2.5 8 Tiempo [h] Figura 4: Logaritmo natural de la concentración celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (5.5 h de cultivo (final del cultivo aireado).11 La linealización para la fase aireada con la concentración celular obtenida por peso seco se extiende desde las 2.19 2. Para la concentración celular obtenida por turbidimetría. Biomasa determinada mediante peso seco ().5-7.16 2. 2.5 6 6.5 7 7. biomasa determinada mediante turbidimetría (■).22 Ln(Biomasa[g/L]) 2.14 5. Los valores de velocidad específica de crecimiento y coeficientes de correlación (r2) calculados mediante la regresión lineal (Ecuación 1) de los datos obtenidos se presentan en la Tabla 4. La Figura 4 representa las linealizaciones realizadas para la fase de crecimiento sin suministro de aire.5 h) para la zona exponencial no aireada. en esta se eliminó la medición de peso seco correspondiente a 8 h de tiempo de cultivo y la medición por turbidimetría realizada a las 7 h de tiempo de cultivo.5 h de tiempo de cultivo. El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag.23 2.18 2. la linealización abarca desde el inicio del crecimiento (1 hora de cultivo) hasta las 6.15 2.21 2.

0 Figura 5: Representación de la concentración de lactosa [g/L] versus la concentración celular [g/L] para la zona exponencial aireada. 9 8 7 Biomasa [g/L] 6 5 4 3 2 1 0 15. Datos Peso seco. .0 35.48 0.0 20.991 Para calcular el rendimiento de lactosa en células ( ⁄ ) se linealizaron los datos de concentración celular obtenidos por turbidimetría y peso seco con la concentración de lactosa según la Ecuación 2.5 y 6.994 0.12 Tabla 4: Valores obtenidos de la velocidad específica de crecimiento para las fases con y sin aireación del cultivo piloto.42 0. F.011 0.908 0. no aireada Turbidimetría. aireada Peso seco.0 25. F. Para la fase aireada se consideraron.995 0. F.0 Sustrato [g/L] 30.013 0. las muestras medidas entre las 2. Biomasa determinada mediante peso seco (). aireada Turbidimetría.5 h de cultivo. no aireada 0. para ambos métodos de medición de la concentración celular. F. Biomasa determinada mediante turbidimetría (□). La linealización así obtenida puede apreciarse en la Figura 5.

6 8. aireada Peso seco. Tabla 5: Valores obtenidos de rendimiento de lactosa en células durante las fases con y sin aireación del cultivo piloto Datos Peso seco. biomasa determinada mediante turbidimetría (■). F.40 0.0 5.9 8.13 El rendimiento de lactosa en células para la fase sin aireación se calculó con los datos comprendidos entre las 6.1 Biomasa [g/L] 9 8.0 15.947 0.44 0.02 0.973 0.8 8.974 0.7 8. así como los coeficientes de correlación (r2) se presentan en la Tabla 5. F.2 9. Esto puede apreciarse en la Figura 6.0 Sustrato [g/L] Figura 6: Representación de la concentración celular [g/L] versus la concentración de lactosa [g/L] para la zona exponencial no aireada.5 h (corte del suministro de aire) y el final del tiempo de cultivo para ambos métodos de determinación de la concentración celular. 9. Biomasa determinada mediante peso seco ().02 0. no aireada ⁄ 0.989 . Los valores del rendimiento de lactosa en células calculados para ambas fases del cultivo.3 9. F.0 10. no aireada Turbidimetría. aireada Turbidimetría.5 0. F.

. sin embargo se espera contar con ellas durante la primera semana de mayo y agregar esta información a una posible futura presentación. Al momento de entregar este informe aun no se disponía de los resultados de dichas mediciones.14 Durante el transcurso de la experiencia se prepararon 10 muestras de caldo centrifugado y filtrado para la determinación de etanol mediante cromatografía.

013 h-1 y 0.2 g/L estimados en base al rendimiento de sustrato en células de la fase aerobia (0. mientras que la concentración de lactosa en el medio disminuía ininterrumpidamente (véase Figura 1 y Figura 2). Sin embargo dado que no fue posible monitorear la concentración de oxígeno disuelto en el caldo no es correcto asegurar con certeza que la cepa es Kluyver negativo.40-0.16 h-1 (Acevedo et al.4 y 13.48 h-1 según la medición realizada por turbidimetría. Esto repercute en que cuando se suspende el suministro de aire. la hermeticidad del fermentador y la presión positiva de CO2 generada por la fermentación). un corto tiempo de análisis y la dificultad de realizar adecuadamente las altas diluciones . dado que es capaz de fermentar la lactosa en condiciones anaerobias (supuestas en base a la ausencia de aireación.04 h-1 para 40 y 10 g/L de lactosa respectivamente (Pinheiro et al.011h-1 respectivamente. 1996) y 0. la cepa degrada la lactosa sin crecer significativamente. 2000). marxianus utilizada en la experiencia es Kluyver negativa. La velocidad de crecimiento en la fase aerobia. Si la cepa hubiese sido Kluyver positivo la concentración de lactosa no habría disminuido y. Estos hechos indicarían que la variedad de K. Esto es claro al comparar la concentración celular cercana a 9 g/L alcanzada versus una concentración celular máxima de entre 12.5 h de cultivo se observó una notable disminución en la velocidad específica de crecimiento.42 h-1 de acuerdo a la medición de biomasa mediante peso seco y 0. lo que se traduce en un desperdicio de sustrato si este estaba destinado a la generación de biomasa. Valores menores a los reportados en bibliografía los que varían entre 0.02 h-1 a 0. se piensa que el sustrato podría haber sido aprovechado siempre que la maquinaria celular no hubiese resultado dañada por la falta de aire. 0. una vez reanudado el suministro de aire.44) y la concentración celular alcanzada al momento de cortar el suministro de aire. Cabe cuestionar la validez de la velocidad específica de crecimiento para la zona anaerobia ya que se combinan los hechos de disponer de pocas mediciones.15 5 DISCUSIONES Luego del la interrupción en el suministro de aire a las 6. Para la etapa sin suministro de aire la velocidad de crecimiento específica calculada a partir de las mediciones de biomasa mediante peso seco y turbidimetría son 0. se encuentra dentro de lo esperado según la recopilación bibliográfica realizada (véase Tabla 1).

.5 para cultivo aerobio (Pinheiro et al.40 y 0. se observa que la biomasa aumenta pero que el sustrato no disminuye proporcionalmente. Los valores calculados se encuentran por debajo del rendimiento de lactosa en células estimado en base al rendimiento teórico máximo y el uso del factor para cultivo aerobio y 0. 2000) y 0. ya que durante las primeras horas de cultivo la alta concentración de lactosa obliga a utilizar elevadas diluciones (1:30). Esto puede deberse a los errores cometidos durante la dilución de la muestra para la determinación de la cantidad de sustrato. 2000). Durante las primeras 3 h de cultivo. lo que aumenta el error en la medición.1996).1 para cultivo anaerobio): (0.4 y 0.16 necesarias para la determinación de la biomasa mediante turbidimetría para un cultivo con una concentración celular de alrededor de 9 g/L.06 para un cultivo sin aireación (Acevedo et al.02 por ambos métodos de medición) se encuentran cerca de los valores reportados en bibliografía: entre 0. Los valores de rendimiento de lactosa en células para la fase aerobia (0.6 El porcentaje de carbono en células se obtuvo desde bibliografía (Krzystek y Ledakowicz.44 para la biomasa determinada mediante peso seco y turbidimetría) y anaerobia (0.

con nitrógeno. . la que es capaz de degradar sustrato en estas condiciones sin presentar una velocidad de crecimiento significativa. marxianus resultaría severamente perjudicado si se interrumpe el suministro de aire durante el transcurso del mismo.17 6 CONCLUSIÓN Un cultivo industrial cuyo fin sea la producción de biomasa de K. esto si se trata de una cepa Kluyver negativa. una vez suspendido el suministro de aire. Para establecer fehacientemente si la cepa estudiada corresponde al tipo Kluyver negativa o positiva se recomienda instalar un medidor de oxigeno disuelto o desplazar el oxígeno en el fermentador. De esta forma se aseguran las condiciones anaerobias en el caldo.

26:756-762. Development of a pilotplant fermentation process for the production of yeast lactase. M. .18 7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Acevedo F. Walsh. Ashbolt. Rogers. Husain. 2005. M. 1996. Mota. 32:284-288. M. y P. N. Owais. pages 216 . Saleemuddin. Zafar S. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. . . E. N. Ledakowicz. Gentina. 79:339-354. First edition. Lukondeh T. 2000. y P. Belo. y A. 1998. Reyes. O'Shea D. 75:1110-1118. . Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. . 40: 579-604. The effect of culture conditions on the morphology of the dimorphic yeast kluveromyces marxianus var. Torres. J. 53:316-322. Fed-batch fermentation for production of kluyveromyces marxianusii 510700 cultivated on lactosed-based medium. Enzyme and Microbial Technology. Krzystek L. 799:559-562. 2000. Batch kinetics and modelling of ethanolic fermentation on whey. Pinheiro R.217. 2005. Wittmann. Yeast: physiology and Biotechnology. . Bojorge. Fonseca G. L. C. y S. International Journal of Food Science and Technology. I. Applied Microbiology Biotechnology. Chichester: John Wiley and Sons. Air pressure effects on biomass yield of two different kluyveromyces strains. Heinzle. Applied Microbiology Biotechnology. 2008. Annals of the New York Academy of Sciences. I. 2000. J. Walker G. Stoichiometric analysis of kluyveromyces fragilis growth on lactose. The yeast kluyveromyces marxianus and its biotechnological potetial. Gombert. C. y S. marxianus nrrly2415: a study incorporating image analysis. y M. y A.

24 Diseño del Buffer del Reactor de Propagación……………………………… 26 .I Apéndice .IV pág..19 INDICE DE APÉNDICES Apéndice .III Apéndice . Mediciones de Biomasa y Sustrato………………………………………….. 20 Curva de Calibrado de Biomasa……………………………………………… 23 Curva de Calibrado de Sustrato……………………………………………….II Apéndice .

5 2.5 Medición 1 [g/L] Medición 2 [g/L] E E E 31.02 5.36 31.7 31.9 26.2 30.0 8. Tiempo 0.20 APÉNDICE .5 8.9 29.3 21.0 6.9 30.0 7.3 13.9 31.9 22.20 5.0 2.0 4.58 E Las mediciones marcadas con E fueron eliminadas ya que no se encontraban en el rango de la curva de calibrado La concentración celular determinada mediante turbidimetría durante el transcurso del cultivo en el reactor piloto se presenta en Tabla 7.4 24.6 27.5 4.97 8.7 9.5 6.5 1.4 26.5 3.4 12. En ambos casos se entrega el valor de absorbancia transformado en concentración celular o concentración de lactosa mediante la Ecuación 4 y la Ecuación 5 respectivamente.4 29.6 26.7 18.86 8.0 5.2 9.61 3.0 23. A medida que aumentó la concentración celular .9 28.5 5.I MEDICIONES DE BIOMASA Y SUSTRATO A continuación se presentan los resultados de las mediciones realizadas durante el transcurso de la fermentación en el reactor piloto para la concentración de células y lactosa. Tabla 6: Mediciones de sustrato realizadas durante la experiencia de fermentación en el reactor piloto.0 1.5 7.0 3.6 31.7 18.9 29.

5 2.0 4.01 9.29 9.90 2.85 9.90 8.53 M2[g/L] M3[g/L] M4[g/L] M5[g/L] M6[g/L] .78 9.5 6.37 3.90 2.5 8.5 4.5 7. Tiempo [h] 0.38 3.78 0.48 1.49 5.78 6.5 5.58 9.0 6.21 también aumentó la variación entre duplicados de la misma muestra haciendo necesario repetir hasta 6 veces la medición.5 3.0 1.88 1.38 6.0 3.81 0.75 0.37 7.10 1.11 1.12 9.36 7.45 1.39 6.5 M1[g/L] 0.31 5.10 9.5 1.03 8.0 8. Tabla 7: Medición de la concentración celular realizadas mediante turbidimetría (M1.71 9. M2…M6) denotan mediciones realizadas sobre la misma muestra.28 4.0 7.35 4.0 5.39 9.71 3.11 9.0 2.75 9.81 9.35 5.87 1.16 6.

94 8.66 1.83 . Se eliminaron las muestras comprendidas entre el inicio del cultivo y las 1.16 5.62 2.5 1.12 2.5 4 4.1 6.5 7 7.72 8.5 6 6.62 3.5 1 1.71 8.5 3 3.5 8 8.5 2 2.58 8.34 4.12 7.5 h debido a errores cometidos en la ejecución del protocolo.22 La Tabla 8 muestra el resultado de las mediciones de concentración celular determinadas mediante peso seco.39 8.5 5 5. Tabla 8: Medición de la concentración celular determinada mediante peso seco Tiempo cultivo Masa de células 0 0.

el sobrenadante es descartado y el pellet se somete al protocolo de determinación de biomasa por peso seco.23 APÉNDICE . del que se debe conocer su concentración celular por peso seco. Ecuación 4 donde: : absorbancia : concentración de biomasa ⁄ . 2.422 y 0.17 g/L (promedio de 2. Esto permite construir las siguientes expresiones que relacionan la concentración y la absorbancia. registrando valores de 0. Para esto se toman alícuotas que se centrifugan por 15 minutos a 10000 RPM. Se construye la curva de calibrado donde se correlaciona la absorbancia registrada con la concentración celular de peso seco.II CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA Se necesita un caldo de cultivo crecido. Siguiendo lo anterior.11. se tiene que el caldo empleado posee una concentración celular de 2.293 respectivamente. Del caldo se preparan distintas diluciones y se mide su absorbancia comparando con un blanco de medio de cultivo estéril.510. 1:15.25 g/L). 0. 1:20 y 1:30 a las que se le mide la absorbancia. 0. Luego se realizan diluciones 1:10.706.15 y 2.

040 0.5 g/L. a las cuales se les aplicó el método de DNS y se midió su absorbancia respectiva a 540nm.122 0. A partir de esta solución se dispuso de una batería de diluciones desde 0 g/L a 1.562 0.50 0.040 0.538 0.409 0.276 0.725 El grafico obtenido entre absorbancia y concentración de lactosa del total de los datos expuestos se presenta en la Figura 7.20 1.III CURVA DE CALIBRADO DE SUSTRATO Para la determinación de la curva de calibrado para la detección de lactosa mediante el método DNS se preparó una solución estándar de concentración conocida de 1.415 0. Los datos formulados se exponen en la Tabla 9.900 1.263 0.600 0.5 g/L por duplicado.742 Absorbancia 2 0.150 0. Tabla 9: Datos obtenidos para la realización de la curva de calibrado de lactosa Muestra 1 2 3 4 5 6 Volumen Solución Estándar [ml] 1 2 4 6 8 10 Volumen Agua Concentración Absorbancia Destilada[ml] [g/L] 1 9 8 6 4 2 0 0.113 0. .24 APÉNDICE .300 0.

6 0.2 0.4 0.4 1.8 1 1.25 0.5 0.2 0.1 0 0 0.4 0.6 Concentración de lactosa (g/L) Figura 7: Curva de calibrado biomasa La correlación obtenida con presentados en la Tabla 9 es: Ecuación 5 Donde: : absorbancia : concentración de lactosa entre absorbancia y concentración para los datos .8 0.7 0.2 1.6 Absorbancia 0.3 0.

IV PROPAGACIÓN DISEÑO DEL BUFFER DEL REACTOR DE Para diseñar el tampón se utilizará ácido cítrico monohidrato y se ajustará el pH con hidróxido de sodio.. 1996). Tabla 10: Especies químicas consideradas para el diseño del buffer Especie química [g/L] Citrato total agregado Citrato estado de oxidación 0 Citrato estado de oxidación -1 Citrato estado de oxidación -2 Citrato estado de oxidación -3 Ion hidróxido Protones Ion Sodio Ion Sulfato Símbolo Balance de masa de las especies del citrato al comienzo de la fermentación: Ecuación 6 Balance de cargas al inicio del cultivo: Ecuación 7 Balance de masa de las especies del citrato al final de la fermentación: Ecuación 8 Balance de cargas al final del cultivo: Ecuación 9 .26 APÉNDICE .5 al comienzo y 4 al final de la fermentación. Para realizar el diseño se consideraron las especies químicas de la Tabla 10. El pH al que se realizará la fermentación será entre 4. considerando los subíndices i para la concentración al inicio de la fermentación y f para el final de la fermentación. Se trabajará con pH ácido debido a que esto genera una presión de selección para levaduras. se escogió este rango debido a que ha sido utilizado con éxito en otros trabajos con Kluyveromyces (Acevedo et al.

Ecuación 8 y Ecuación 9. : Expresado como Hidróxido de Sodio Finalmente. Ecuación 7. para la preparación de 10 L de medio de cultivo se deberá agregar 242 g de ácido cítrico monohidrato. Experimentalmente esto se debe realizar agregando una solución de hidróxido de sodio mientras se mide el pH. . Ecuación 10 Despejando las variables: Ecuación 11 ( ) ( ) Resolviendo el sistema de ecuaciones al remplazar la Ecuación 11 en la Ecuación 6.3 g de hidróxido de sodio. Tabla 11: Datos del proceso de fermentación Especie química Concentración [M] Tabla 12: Resultados del diseño del buffer Especie química Concentración [M] Concentración [g/l] : Expresados como Ácido Cítrico monohidrato. y posteriormente se deberá ajustar el pH con 64. y considerando el equilibrio del agua tenemos los resultados de la Tabla 12. de acuerdo a las ecuaciones de equilibrio químico. utilizando los datos del proceso expuestos en la Tabla 11.27 Cada una de las especies del citrato puede ser expresada en función de la concentración de protones y la concentración de citrato con estado de oxidación cero .

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