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Cromatografia

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República Bolivariana de Venezuela Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanálisis Cátedra: Análisis Instrumental

Técnicas Cromatográficas

Maracaibo, 24 de Julio de 2008

Enumere los tipos de Detectores usados en HPLC 5.  Enumere las características de la Fase Estacionaria  Enumere las características de la Fase Móvil  Establezca las características del soporte ideal en la fase est5acionria de HPLC. Enumere las características de la Fase Estacionaria y Fase Móvil en Cromatografía de Gases 6. Establezca diferencias entre los métodos de Cromatografía de Gases  Cromatografía de Gases  Cromatografía de Líquidos 3. Clasifique los diferentes detectores utilizados en Cromatografía de Gases. 5. Establezca diferencia entre separación isocrática y separación con gradiente 6. Enumere las aplicaciones de la HPLC . Como es normalmente un Cromatógrama en Gases. 4. 7. Identifique los componentes generales de un Cromatógrafo de Gas y estudie la función de cada una de ellas. Estudie las definiciones y términos siguientes  Cromatografía  Cromatograma  Elusión  Fase Móvil  Tiempo de Retención  Ancho de base  Fase Estacionaria  Altura del plato teórico.  Eluyente  Resolución  Tiempo muerto  Números de platos teóricos 2. 4. Elabore un esquema con los componentes esenciales de un Cromatógrafo líquido. Como afecta los siguientes parámetros en la Resolución de la columna: 7. Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la Cromatografía de Gases Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) 1. Describa el fundamento de HPLC 2. y estudie la función de cada uno de ellos. Establezca la clasificación de los tipos de HPLC 3.Cromatografía de Gases: 1.

Fase Estacionaria: Es la que recubre la columna cromatográfica.. este directamente relacionado con la .5. Los tiempos de retención no son reproducibles.Ancho de Base: Es la separación de la longitud de las bases interceptado por agentes delongados en el detector.Tiempo de Retención: Es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima intensidad. La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria.8. 1. Registro producido por el cromatógrafo de gas / líquido. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa. frente al volumen de efluente o al tiempo.Cromatograma: Es una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector. ni siquiera en una misma columna cromatográfica.Elución: Es el procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta.. la cual puede ser sólida o líquida.6.. 1.2. 1. pequeñas y con una superficie microporosa.. 1.7. de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. 1. 1.Altura del Plato Teórico: Se utiliza como una medida de la eficiencia de la columna.3.. generalmente sólidas. La fase estacionaria consiste en partículas. Es también una medida del funcionamiento del instrumento. interiormente sin desplazarse.Cromatografía: Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es que no se conoce su composición. 1. como una pequeña cantidad en un tiempo breve.1..1.4...Fase Móvil: Puede ser un líquido o un gas que recorre la columna cromatográfica transportando los componentes de la mezcla a través de dicho sistema.-Estudie las definiciones y términos siguientes: 1. la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente.

11...   La cromatografía gas-sólido (CGS): Tiene una fase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los analitos debido a la adsorción física sobre la superficie del sólido. 3. 1. 1. entre los métodos de En cromotografía de gases se incluyen todos los métodos cromatográficos en los que la fase móvil es un gas (gas portador). La cromatografia gas-líquido (CGL): Se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte (soporte) o en las paredes interiores de la columna. y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes..Establezca las diferencias Cromatografía de Gases..9.Resolución: Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. si ésta es capilar.. 1.Eluyente: Es aquella sustancia que se pone en contacto con la fase estacionaria y permite que se desplace la muestra. 2. tRA y tRB son los tiempos de retención de los componentes A y B.Identifique los componentes generales de un Cromatógrafo de Gas.varianza.Número de Platos Teóricos: Se utiliza como una medida eficiente de la columna. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes. por ello resulta convenientemente medir la eficiencia de la columna en los términos de varianza y longitud de la columna. y estudie la función de cada una de ellas: .Tiempo Muerto: Es el tiempo de retención del componente inerte o gas portador.10.12. Esta técnica ha tenido una aplicación limitada debido a la tendencia de los picos de elución a formar colas y a la retención semipermanente de gases activos sobre la fase estacionaria. 1. siendo la fase estacionaria un líquido (CGL) o un sólido (CGS). Se define como: Donde Rs es la resolución.

La fase estacionaria se depositada sobre las paredes interiores del tubo capilar. . El sistema de detección genera una señal cuando un componente de la mezcla completa el recorrido del sistema de separación. donde se accede mediante una jeringa adecuada o con una válvula de inyección. Cada columna se diseña para aprovechar alguna propiedad de los diferentes componentes que resulte adecuada para generar distinta velocidades de avance para cada uno de ellos durante el recorrido de la columna. Podemos expresar que el detector son los "ojos" de un cromatógrafo. y proporcionan mayor eficacia que éstas. la temperatura del inyector ha de ser superior a la del punto de ebullición del componente de la mezcla menos volátil. nitrógeno o argón. máximo 10 componentes.000 (platos teóricos/m) y se usan para muestras complejas. La eficacia está en torno a 1. Así. Existen dos tipos: o Las columnas de relleno: Suelen ser de cobre. o Las columnas capilares: Tienen un diámetro interior inferior a 1 mm (320-250 μm) y una longitud de 5 a 50 m. acero inoxidable. generalmente helio. Cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra. También se encarga de vaporizar las muestras cuando éstas no son gaseosas. de elevado grado de pureza. Alcanzan una eficacia hasta de 4. ha de ser conocido y controlado. y crear una matriz adecuada para el detector.     Gas Portador: es un gas inerte. Columnas: El sistema de columnas cromatográficas constituyen el corazón de todo cromatógrafo. vidrio y teflón. Suelen emplearse para muestras poco complejas.000-2. El Inyector es el lugar por donde se introduce una pequeña cantidad de muestra (del orden de 1 cm3 de gas o 1 micro-litro de líquido) en medio de la corriente de gas. Detector: Es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica. Suelen construirse con sílice fundida que le dan gran resistencia física y flexibilidad. en una señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. Es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física. El caudal del mismo que pasa por la columna.000 (platos teóricos/m). Las columnas semicapilares tienen un diámetro interior de 530 μm que admiten cantidades de muestra similares a las columnas de relleno. Inyector: Es sólo una pequeña cámara colocada inmediatamente antes de la(s) columna(s) de separación. con un diámetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. no medible directamente. aluminio. Un sistema de Integración: para cuantificar la señal generada por cada componente en el Detector.

Ópticoespectroscópico. o Específicos ó Selectivos: Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un mínimo de respuesta a otras.   • 5.. es en referencia a si la muestra es destruída o no. Esta clasificación.Clasifique los diferentes detectores utilizados en la cromatografía de Gases: Estos pueden ser clasificados:  Detectores según su Grado de Selectividad : o Universales: Responde a la mayoría de los solutos que pasan por él.Enumere las características de la Fase Estacionaria y Fase Móvil en Cromatografía de Gases: . obviamente. etc. Detectores según el proceso de detección Ionización. Detectores Destructivos y No destructivos. Electroquímico. o Dependiente de la Concentración: Dan una señal proporcional a la cantidad de soluto por unidad de volúmen de gas portador que pasa a través de él.4. Detectores según su Modo de Respuesta: o Dependientes del Flujo Másico: Producen una señal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a través de él en la unidad de tiempo pero es independiente del volúmen de gas portador requerido para la elución..

Como es normalmente una Cromatografía de Gases.-Los componentes se fijan en una pequeña zona de la columna. los solutos que salen de la columna.. se introducen en la cámara de inyección.-Una vez elegida la columna y fase estacionaria.-Finalmente.Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la Cromatografía de Gases: CUALITATIVAS  Identificación Cromatográfica: o Por Datos de Retención o Por Serie Homólogas (Indices de Retención de Kovacs)  Identificación No Cromatográfica: o Análisis Clásicos o Identificación por: • Adición de Estándar • Formación de Derivados • Sustracción de un Componente  Identificación con Técnicas Auxiliares: UV. y son arrastradas hasta cabeza de columna. Cuando la señal del detector es constante (sin ruidos la línea base) se hace la inyección de la muestra. 7. así como el caudal de gas portador. MS. por equilibrios sucesivos entre fase móvil y estacionaria cada componente se desplaza por la columna a velocidades diferentes. RMN . donde se vaporizan. pasan al detector y se obtiene el cromatograma. La separación de los compuestos de una mezcla se realiza en las siguientes etapas: 1. se ajustan las temperaturas de la cámara de inyección. 2.. 4. columna y detector. IR.-Las muestras se inyectan en cantidades inferiores a 1 µl cuando son líquidas y sobre 1 ml si son gaseosas. 3.Fase Estacionaria:    Es la forma más habitual La fase estacionaria es no polar y la móvil es polar Utiliza disolventes no polares Fase Móvil    Es habitual Utiliza una fase estacionaria polar y una móvil no polar Utiliza disolventes polares 6.

Describa el fundamento de la HPLC: La cromatografía líquida es una técnica cuyo objetivo es la separación de los distintos componentes de una mezcla de sustancias..CUANTITATIVAS  Normalización de Área  Normalización de Área con Factores de Respuesta  Estandarización Externa  Estandarización Interna 1. . basándose en las diferentes retenciones que experimentan los componentes de la misma al pasar a través de una fase estacionaria.

2. . La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención. que pueden ser muy pequeñas. la separación de los componentes de la muestra se produce debido a sus interacciones entre una fase móvil líquida y una fase estacionaria sólida. sino también en factores estericos de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro.químicas frente a un sistema cromatográfico dado. carga.. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. contenida en una columna cromatográfica. uno remoto y otro próximo Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o físico químicas de los analitos: solubilidad. La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés. volatilidad.liquido. . y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico . tamaño.Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si. La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situación experimental dinámica donde exhiben dos de estas propiedades. o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía liquido . adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente divididos).cuando la muestra es eluida por una fase móvil líquida. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar. Así. y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. Por tanto. etc. reactividad química o bioquímica.El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible. en estas diferencias. se basa la separación cromatográfica. Deben cumplirse las condiciones siguientes: .Establezca la Clasificación de los tipos de HPLC:  Cromatografía de fase normal: Fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química. Para explicar el fenómeno cromatorgráfico es necesario establecer dos tipos de fundamento.

El tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del compuesto. un compuesto relativamente apolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. En general. El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula.Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía libre de la entropía asociada con la minimización de la interfase compuestodisolvente polar. otras modificaciones de la fase móvil pueden afectar la retención del compuesto. la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. por ejemplo. la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio por controlar el valor del pH. Esto modifica el coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la retención. la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial. Estos tampones controlan el pH. Aun así. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar. las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. Cromatografía de fase reversa: Consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Aparte de la hidrofobicidad de la fase móvil. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. y como que la entropía de la interfase compuestodisolvente está controlada precisamente por la tensión superficial. y una fase estacionaria apolar. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl. Por este motivo. dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17. pero también .

También es muy útil para la determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Los poros quedan conectados formando una malla o red. según su radio de Stokes. Cromatografía de intercambio iónico:  En la cromatografía de intercambio iónico. Aun así. Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar. En esta cromatografía. la columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. Algunos tipos de intercambiadores iónicos son: i) Resinas de . A los fines prácticos. La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan en solución según su peso molecular. separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros. muchas columnas de fase reversa están formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de silica subyacente. En consecuencia. Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso pero no deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del aparato de HPLC. lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta. la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. o más precisamente. pero en general mejoran la separación cromatográfica. en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar libremente. Cromatografía de exclusión molecular  También conocida como cromatografía por filtración en gel.neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. estas partículas son porosas. la retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria.

Son. El sistema de bombeo debe seguir los siguientes requerimientos: 1. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio catiònico mientras que una disminución del pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio aniònic. 3. Se producen pequeñas cantidades de muestra (0. interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals.Elabore un esquema con los componentes esenciales de un Cromatógrafo líquido. 3. 2.Bomba: Envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño. específicos y reversibles.poliestireno..Válvula Inyectora: Consiste en una válvula de seis vías que permite introducir en el flujo de solvente. En general los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones elevada carga y radio pequeño. 5. la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Un equipo para cromatografía líquida de alta resolución puede representarse por el siguiente esquema: . 4.5%) Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o Teflón) Reproducible Tipos de Bombas: • Bombas reciprocas • Bombas de desplazamiento • Bombas neumáticas .  Cromatografía basada en bioafinidad Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables.1 a 10 ml/min(con control del 0.1-100μL) - Columna: Se produce la separación de los componentes. interacciones dipolo-dipolo. Un incremento en la concentración del contraión (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retención. y estudie la función de cada uno de ellos. con una longitud de 10-30 . generalmente de acero inoxidable. Generación de presiones por encima de 6000 psi(~410 atmósferas) Flujo libre de pulsaciones Intervalo de caudales de 0. ii) intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado. generalmente de Acero inoxidable. interacciones electrostáticas.

Este que El integrador calcula además el área correspondiente a cada pico. fluorescencia etc. Para que el líquido inmovilizado sea útil debe poseer diferentes coeficient5es de participación con los solutos.Características de la Fase Estacionaria:   Puede ser alúmina. se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original.  La composición del relleno debe ser semejante a la columna analítica - Detector: Produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y esa señal es enviada al registrador..000-60.000 platos/metro.1. sílice o resinas de intercambio iónico. De 1-10μm tamaño particula-40. . Deben de tener un volumen interno pequeño para reducir el ensanchamiento de pico.) y en una propiedad del soluto (absorbancia en UV.) Registrador Integrador: Realiza un gráfico de intensidad en función del tiempo (cromatograma) que idealmente.cm y un diámetro interno de 4-10mm. densidad etc. Basados en una propiedad de la fase móvil (refracción. PRECOLUMNAS  Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión y contaminantes de las disolvente. la cual es proporcional a la cantidad de sustancia - 3.

con algunas impurezas. 4.Enumere los tipos de detectores utilizados en HPLC: Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en: • Detectores basados en una propiedad de la fase móvil .  3. Hay básicamente tres tipos: o Detector de Longitud de Onda Fija o Detector de Longitud de Onda Variable o Detector de Arreglo de Diodos • Detector de Indice de Refracción. por efecto de la gravedad. Ejemplo: Detector de Fluorescencia. Existen muchos diseños de estos detectores. pero de diferentes polaridades. se obliga a pasar a través del sólido bajo presión o bien se deja percolar a través de él. Químicamente es casi todo sílice.  Los solutos con puntos de ebullición casi idénticos. debe poseer por lo menos. retener) la fase estacionaria  La mayoría d elos soportes cromatográficos está hecha de diatomita.. una cierta compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria.3. retendrán selectivamente uno o más de los componentes por interacción dipolo o por formaciones de abducto  3. el orden de elusión generalmente sigue al orden de puntos de ebullición. cuando éstos difieren suficientemente son factibles separaciones limpias. pero solamente existen ahora dos tipos: o Tipo Deflexión o Tipo Fresnel .Características estacionaria de HPLC  del soporte ideal en la fase La función básica del soporte es la de “mantener” (sotener.Características de la Fase Móvil: Es un solvente líquido. Detector Ultravioleta Los detectores más utillizados en HPLC son: • Detector UV.  El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos..Para que un soluto presente un tiempo de residencia razonable en la columna.  El líquido. Ejemplo: Detector de Indice de Refracción • Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. el cual puede ser puro o una mezcla de solventes.  Entre solutos de polaridad similar.2..

Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización . que ayudan a la separación de los compuestos. Detector de Fluorescencia Inducida por Laser o Según la Fuente de Excitanción o Según el sistema óptico Detectores Electroquímicos. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto. conocida como elución en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. el metanol y el acetonitrilo. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. El agua puede contener tampones.Establezca diferencia entre una separación isocrática y separación con gradiente: En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatogràfica a través de la fase estacionaria (normalmente. de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. mientras que los compuestos más . El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de la fase móvil durante el análisis.• • • Detector de Fluorescencia. un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. Los disolventes más utilizados son el agua. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. Pueden ser clasificados en tres tipos: o Detector Amperométrico o Detector Conductimétrico o Detector Potenciométrico 5. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. sales.. o compuestos como el ácido trifluoroacético. En el ejemplo.

7. 6.. esteroides. drogas y un producto muy grande de otros productos farmacéuticos.  Longitud de la columna: Es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad.  Compuestos de alto peso molecular. hace falta realizar una serie de pruebas previas por tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos. las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras.  Análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto tiempo.. A menudo. como aminoácidos. plastificantes. Aparte. En cambio.hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan. pesticidas. siendo las de 5\mum de diámetro las más utilizadas. . como vitaminas. como las de tipo capilar. con un diámetro inferior a 0. Esto significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad. como polímeros. utilizadas principalmente en espectrometría de masas. Las columnas de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificación de compuestos para su utilización posterior.  Compuestos termolábiles y no volátiles.3 mm. aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho. aumentaría la resolución de la columna. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación. ácidos orgánicos.Cómo afectan los siguientes parámetros en la Resolución de la columna:  Diámetro de la partícula: La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. etc. productos naturales. hidrocarburos polinucleares. sales inorgánicas. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analítico y normalmente están asociadas a un detector UV-VIS. pero a la vez. pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. existen otros tipos de columnas. etc. Estas partículas pueden tener diferentes medidas.Enumere las aplicaciones de la HPLC  Compuestos iónicos.

ya que su finalidad no es la separación de compuestos individuales.  Determinación de esteroides. . análisis de barbitúricos. Determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos (nucleótidos. anticonceptivos. etc). sino de grupos diferentes de sustancias presentes en las mezcla.  En separaciones según el tipo químico.  El análisis de medicamentos (determinación de los componentes activos de una tableta analgésica. nucleósidos) por cromatografía de intercambio iónico.

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