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Química Combinatoria

Química Combinatoria

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Publicado porRony J. Letona
Informe final del trabajo sobre Química Combinatoria. Se da un breve repaso sobre la historia de la química combinatoria y su uso en química medicinal (en tamizaje molecular de alto rendimiento), y finalmente se termina con un pequeño experimento de laboratorio en el que se intentó derivatizar eugenol para lograr cambiar su actividad biológica.
Informe final del trabajo sobre Química Combinatoria. Se da un breve repaso sobre la historia de la química combinatoria y su uso en química medicinal (en tamizaje molecular de alto rendimiento), y finalmente se termina con un pequeño experimento de laboratorio en el que se intentó derivatizar eugenol para lograr cambiar su actividad biológica.

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10/21/2014

Química Combinatoria

SÍNTESIS DE DERIVADOS DEL EUGENOL E IDENTIFICACIÓN DE SU ACTIVIDAD MICROBIOLÓGICA

Rony J. Letona (200960024) | Química Orgánica IV | May 6, 2013

Índice
Introducción ........................................................................................................................................................... 2 Marco Teórico ........................................................................................................................................................ 2 Química combinatoria en el desarrollo de nuevos fármacos a partir de productos naturales .................. 2 El eugenol y su actividad microbiológica ........................................................................................................ 4 Extracción y Aislamiento del Eugenol ............................................................................................................. 5 Posibles Reacciones sobre el Eugenol.............................................................................................................. 8 Pruebas Microbiológicas de Aceites Esenciales y eugenol ............................................................................ 9 Estudios previos sobre el Eugenol con Química Combinatoria .................................................................... 9 Práctica Aplicada ................................................................................................................................................. 10 Título ................................................................................................................................................................ 10 Objetivos .......................................................................................................................................................... 10 Procedimiento.................................................................................................................................................. 10 Extracción .................................................................................................................................................... 10 Purificación del eugenol a partir del aceite esencial .................................................................................. 10 Síntesis ........................................................................................................................................................... 11 Purificación de los productos ....................................................................................................................... 11 Pruebas microbiológicas............................................................................................................................... 12 Evaluación de Resultados ................................................................................................................................ 12 Identificación del eugenol ............................................................................................................................. 12 Identificación de los productos de reacción ................................................................................................ 12 Identificación y cuantificación de la actividad bactericida ........................................................................ 13 Reactivos, Materiales y Equipo....................................................................................................................... 14 Reactivos........................................................................................................................................................14 Materiales ..................................................................................................................................................... 16 Equipo ........................................................................................................................................................... 16 Resultados de la Práctica Aplicada ..................................................................................................................... 17 Tablas de Resultados ........................................................................................................................................ 17 Principales Resultados Obtenidos ................................................................................................................. 18 Conclusiones ........................................................................................................................................................ 19 Bibliografía ........................................................................................................................................................... 20 Anexos.................................................................................................................................................................... 21

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Introducción
El proyecto constó en la síntesis de 3 derivados del eugenol, un producto natural, para simular la síntesis de nuevos fármacos en la industria vía química combinatoria. Se partió de un compuesto cuya actividad biocida y anestésica ya se conoce: el eugenol. Para obtenerlo se comenzó extrayendo el aceite esencial por hidrodestilación con un aparato de Clevenger. El rendimiento obtenido con este método fue el mejor comparado con lo reportado. Posteriormente se extrajo el eugenol en buen porcentaje y se aisló para después llevar a cabo las reacciones. Para la derivatización se llevó a cabo sustituciones nucleofílicas tipo 2 sobre halogenuros de alquilo a modo de sintetizar éteres. Los halogenuros de alquilo utilizados fueron: 1-bromo-2-cloroetano para dar el Producto No. 1, 1,3dibromopropano para dar el Producto No. 2 y 1,2-dibromopropano para dar el Producto No. 3. Los porcentajes de rendimiento obtenidos (19%, 57%, 38% respectivamente) no fueron tan altos como se esperaba, y fueron apenas suficientes para lleva a cabo el análisis microbiológico. Para este análisis se sembró Escherichia coli y Staphylococcus aureus en cajas con agar Müller-Hinton. Se colocó discos de 6mm de diámetro impregnados con el aceite esencial, eugenol y cada producto en las cajas y se dejó incubar las bacterias por 24h. Los halos de inhibición hallados mostraron que solo el Producto No. 2 tuvo actividad. Con esto se pudo concluir que el fenol es la parte importante de la molécula de eugenol como bactericida y que alterar este grupo llevará a la pérdida de esa actividad.

Marco Teórico
QUÍMICA COMBINATORIA EN EL DESARROLLO DE NUEVOS FÁRMACOS A PARTIR DE PRODUCTOS NATURALES

En el área de química medicinal, esta época se ha caracterizado por el enfoque en la construcción de bibliotecas de moléculas para el posterior desarrollo de fármacos o compuestos líder. Estas bibliotecas son colecciones de moléculas sintéticas o a veces biológicas que serán tamizadas en diferentes formas a modo de obtener una que presente actividad biológica elevada sobre un receptor determinado. (Pandeya & Thakkar, 2004) El tamizaje molecular de alto rendimiento (o HTS por sus siglas en inglés) ha sido ampliamente criticado. Desde la elaboración de las bibliotecas de compuestos sintéticos hasta el análisis de su actividad sobre receptores determinados, se ha buscado muchas razones para vincularlo con el descenso en la productividad de la industria farmacéutica. Por el contrario, la generación de estas bibliotecas y las
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pruebas realizadas han mostrado tener muy alta calidad, estar bien validadas, no ser costosas ni lentas y tener porcentajes de acierto mayores al 60%. El único problema que se le ve a esta técnica es que es todavía muy joven. (Macarron, y otros, 2011) La química combinatoria ha sido la herramienta principal para esto en las últimas 3 décadas. Mediante ella se producen las bibliotecas a través de la síntesis de nuevas moléculas o derivatización de algún compuesto conocido. Considerando esto, se puede decir que la química combinatoria es la síntesis rápida y paralela de grandes colecciones de compuestos para facilitar la identificación de nuevos compuestos bioactivos por medio de HTS. (Pandeya & Thakkar, 2004) Los métodos y las técnicas de la química combinatoria ya no se limitan a la síntesis sobre superficies sólidas o en zeolitas, como se había comenzado en los años 60. Esta se ha expandido a diversas técnicas que comprenden desde síntesis en húmedo hasta in silico. Se ha mejorado las técnicas de purificación de los compuestos y finalmente se ha perfeccionado también las técnicas para la identificación de las estructuras producidas. Estas técnicas van ahora desde análisis colorimétricos hasta por espectrometría de masas. (Carell, y otros, 1995) Todas estas técnicas han hecho posible la obtención de mejores bibliotecas de compuestos, llevando a un mejor tamizaje molecular que resulta en mejores y más diversos fármacos o compuestos líderes a ser producidos. (Silverman & Hergenrother, 2006) El desarrollo de bibliotecas y el tamizaje molecular de alto rendimiento han sido técnicas utilizadas generalmente por las grandes farmacéuticas, mientras que en el ámbito académico, sólo se cubría los principios básicos ya que no se tenía acceso a la información. Recientemente se ha comenzado a crear alianzas entre el ámbito académico y la industria para realizar los tamizajes moleculares, ya que estos se han aprobado como un método legítimo para el desarrollo de nuevos fármacos. Por esta razón, en los últimos años el ámbito académico ha comenzado a jugar un papel clave en el desarrollo de fármacos. Las plataformas ofrecidas por las universidades han comenzado a ser desde competitivas hasta las mejores y finalmente, la línea de división entre la academia y la industria se ha ido borrando progresivamente ocupándose así de las necesidades médicas. (Frearson & Collie, 2009) (Dove, 2007) A pesar de sus grandes logros en el desarrollo de nuevos moléculas bioactivas, la química combinatoria ha sido muy criticada por su incapacidad de generar compuestos líderes y fármacos. Esto ha llevado a la reconsideración de un campo

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que se había hecho de menos en la década de los 80s y 90s: los productos naturales. (Boldi & Dragoli, 2006) Los productos naturales han sido objeto de estudio desde que la humanidad notó que estos podían curar muchos de sus males. Recientemente, alrededor de 1980, el uso de productos naturales para el desarrollo y descubrimiento de nuevos fármacos fue dejado por un lado a cambio del tamizaje de bibliotecas de compuestos sintéticos. Esto dio paso e impulsó a la química combinatoria. Los tamizajes probaron ser más rápidos, menos costosos y daban resultados más fáciles de sintetizar que los productos naturales. Sin embargo, cerca del 2000, se observó que la cantidad de fármacos nuevos desarrollados a partir de las bibliotecas de compuestos sintéticos no era suficiente en comparación a lo que se descubría basándose en productos naturales. Por ello, y en estos últimos años, se ha recomenzado a usar los productos naturales pero esta vez se ha construido bibliotecas a partir de sus derivados y se han sometido estos a procesos de tamizaje también. (Ortholand & Ganesan, 2004) Una alternativa que se ha utilizado mucho recientemente en la elaboración de las grandes bibliotecas de productos sintéticos es la representación virtual de estas. El diseño de fármacos asistido por computadora es el nuevo y último avance en el área. El término in silico se ha comenzado a ver en las publicaciones científicas debido a que el manejo de estas bibliotecas (su evaluación, su almacenamiento y su transporte) es más rápido y más barato. Los métodos para producir derivados a partir de bibliotecas y la capacidad de tamizaje virtual ofrecen resultados prometedores de las evaluaciones de bibliotecas con millones de compuestos. El análisis para ello no se queda en una representación y una evaluación, sino que va más allá proponiendo una línea de pensamiento diferente que unifica varias disciplinas. (Song, Lim, & Tong, 2009)
EL EUGENOL Y SU ACTIVIDAD MICROBIOLÓGICA

Las propiedades antisépticas de las plantas medicinales o aromáticas y sus extractos se han podido reconocer desde la antigüedad. Los aceites volátiles, generalmente extraídos de las hojas o las flores de las plantas se han podido aislar mediante varias técnicas de destilación entre las que destaca la destilación por arrastre de vapor e hidrodestilación. A pesar de que los aceites hallados son en su mayoría terpenoides, se han hallado algunas otras moléculas ricas en oxígeno, nitrógeno y azufre. (Dorman & Deans, 2000) La actividad antibacterial de los aceites de especias ha sido atribuida a la cantidad de compuestos aromáticos sustituidos, como es el caso del eugenol. Este último ha

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sido de especial interés en la industria alimenticia como agente antimicrobiano debido a su actividad contra las bacterias Gram-positivas como contra las Gramnegativas. Ha sido reportado que el eugenol, en particular, inhibe el crecimiento de las bacterias Escherichia coli y Listeria monocytogenes. (Gill & Holley, 2004) El clavo (Eugenia caryophyllata) es ampliamente cultivada en Madagascar, Sri Lanka, Indonesia y el sur de China. Los bulbos, que son los que comúnmente se utilizan en cocina, han presentado actividad biológica tal como: antibacterial, antifúngica, insecticida, antioxidante y otras que los hacen atractivos como agentes saborizantes y antimicrobiales en la industria alimenticia. La actividad microbiológica se le ha adjudicado a la capacidad que tiene como fenol de desnaturalizar las proteínas y de cambiar la permeabilidad de la membrana celular de fosfolípidos. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)

Ilustración 1. Molécula del eugenol

El mecanismo de acción antibacterial del eugenol se ha mantenido oscurecido debido a que no se conoce los efectos de este último sobre la membrana bacterial. Los mecanismos propuestos hasta la fecha revelan que de alguna manera esta molécula lleva a cabo un rompimiento o lisis de la membrana celular liberando su contenido. También se ha hallado que no solo es la membrana la que ha sufrido daños, sino también la pared celular en algunos casos. (Oyedemi, Okoh, Mabinya, Pirochenva, & Afolayan, 2009)
EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO DEL EUGENOL

Se han estudiado varios métodos para la extracción del aceite esencial de clavo y posteriormente el aislamiento del eugenol. Uno de ellos es la extracción por fluido supercrítico. Esta técnica consta de la maceración de los bulbos de clavo y la extracción del aceite por medio de dióxido de carbono a presión y temperaturas

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moderadas. El método ha probado ser el más eficiente logrando extraer hasta un 16% de aceite esencial. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)

Ilustración 2. Diagrama de un equipo de extracción por fluido supercrítico

Otro método es la destilación por arrastre de vapor e hidrodestilación. Si bien ambos métodos utilizan el mismo principio, el equipo utilizado es diferente. Estos métodos son los más antiguos para la obtención de aceites esenciales y quizá no son los más eficientes, pero garantizan un alto rendimiento de aceite esencial. La extracción se lleva a cabo a temperaturas más elevadas (c.a. 100°C) y luego se requiere que el aceite sea decantado. Se pueden utilizar aparatos tan sencillos como un ensamble de destilación como un aparato de Clevenger. En el caso del eugenol, se han obtenido porcentajes de hasta el 10% de aceite esencial con esta técnica en donde el 60%-90% es eugenol. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)

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Ilustración 3. Aparato de Clevenger

Ilustración 4. Aparato de destilación por arrastre de vapor

El último método utilizado para la extracción del aceite esencial es la extracción por solvente. Para ello se utilizar un aparato de Soxhlet y algún solvente. El problema con este método es el uso de un solvente. Esto, en la industria alimenticia y de cosméticos es poco conveniente, puesto que posteriormente se debe de limpiar el aceite esencial del solvente. En el caso del eugenol el solvente más utilizado es etanol y la extracción se lleva a cabo a 50°C. El rendimiento obtenido de aceite esencial es aproximadamente de 40%, pero el aceite resulta muchas veces contaminado. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)

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Ilustración 5. Aparato de Soxhlet

Finalmente, después de extraído el aceite esencial se debe proceder a aislar el eugenol. Este procedimiento es el que requiere de muchas veces del uso de un solvente. Generalmente se realiza una extracción del eugenol haciendo uso de medios ácidos y básicos además de un solvente apolar. El resultado suele ser un líquido amarillo pálido o anaranjado/café rojizo y el porcentaje de eugenol en el aceite esencial depende mucho del método utilizado para la extracción. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)
POSIBLES REACCIONES SOBRE EL EUGENOL

Una de las reacciones más comunes sobre el eugenol es la síntesis de vainillina. Anteriormente se llevaba a cabo síntesis de vainillina a partir de eugenol, ya que este era un punto de partida más barato que la extracción de la esencia de vainilla de la misma planta que la produce. Posteriormente se comenzó a partir de fenoles, en vez de eugenol, pero el interés en esta molécula por sus facilidades sintéticas siempre ha llevado a que se considere como sustrato. (Lampman, y otros, 1977) También se comenzó a hacer uso del metileugenol en muchos productos cosméticos y alimenticios durante la última década. El problema con este es que mostró ser carcinógeno. Su síntesis se lleva a cabo a partir del eugenol con sulfato de dimetilo o con carbonato de dimetilo. Los rendimientos reportados no son nada bajos, pero este producto ya no es utilizado en la industria por la razón descrita previamente. (Sebelius, 2011) Entre otros estudios se ha intentado halogenar el eugenol directamente, pero los resultados han sido poco fructíferos. La bromación resulta en productos

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polibromados que después cuesta mucho purificar o hacer reaccionar de manera selectiva. En el caso de usar cloro, los resultados son aún peores que con bromo. Si se desea bromar el eugenol, se recomienda hacerlo muy diluido y a bajas temperaturas. (Frankforter & Lando, 1905)
PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS DE ACEITES ESENCIALES Y EUGENOL

Las pruebas microbiológicas de aceites esenciales se pueden hacer de varias maneras dependiendo de la sustancia a evaluar y de las especies de bacterias utilizadas. Sin embargo, el método más común es el de Kirby-Bauer. Este método requiere la preparación de cajas de Petri con agar Müller-Hinton para tener un medio de cultivo bacteriano de alta difusión y baja selectividad. Las bacterias se siembran rayando sobre el agar a modo de formar una capa homogénea que cubra la mayor parte del agar. Finalmente se colocan los discos de papel filtro, impregnados con una concentración conocida del antibacterial o antibiótico a ser probado. Se deja incubar la caja el tiempo necesario para el crecimiento bacteriano y finalmente se miden los halos de inhibición formados alrededor de los discos. El diámetro de los halos proporciona una manera de medir cuantitativamente la actividad de la sustancia probada. (Hudzicki, 2009) Las pruebas realizadas a varios aceites esenciales en presencia de 25 bacterias revelaron que de todos los aceites probados, los de mayor actividad antibacterial fueron los extraídos del orégano, del clavo y del tomillo. Posteriormente se analizó cada componente del aceite esencial y se pudo llegar a la conclusión que de los 21 compuestos probados, 7 mostraron alta actividad de inhibición. Uno de ellos fue el eugenol. La única especie bacteriana que no se ve inhibida por ninguno de los compuestos de los aceites esenciales fue el Leucostonoc cremoris. Fuera de eso, existe una alta sensibilidad de las bacterias Gram-negativas frente a los aceites esenciales. (Dorman & Deans, 2000)
ESTUDIOS PREVIOS SOBRE EL EUGENOL CON QUÍMICA COMBINATORIA

Existen solo algunos estudios en los que se ha llevado a cabo reacciones sobre el eugenol para obtener productos diferentes y con algún fin específico. Uno de ellos buscó sintetizar un grupo de ésteres de eugenol a modo de poder inhibir una enzima en la soya. (Sadeghian, Seyedi, Saberi, Arghiani, & Riazi, 2008) Otro buscó mejorar las capacidades antioxidantes de varios aceites esenciales, entre ellos el eugenol. (Mastelic, Jerkovic, & Blazevic, 2008) En la Universidad de San Carlos se utilizó eugenol como sustrato para sintetizar algunos análogos de las ampakinas que han mostrado actividad contra la enfermedad de Alzheimer. (Torres, 2007)

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Práctica Aplicada
TÍTULO

Práctica No. 4: Química Combinatoria Extracción de Eugenol, Derivatización por medio de Reacciones SN2 en Paralelo y Determinación de Bioactividad de los Derivados
OBJETIVOS

 

Extraer suficiente eugenol del clavo (los botones secos de Syzygium aromaticum) por medio de destilación por arrastre de vapor, como para poder realizar varias reacciones después con él. Derivatizar el eugenol, por medio de diferentes reacciones SN2 a modo de obtener una familia de compuestos con propiedades similares. Mediante pruebas microbiológicas, determinar la actividad bactericida del eugenol y sus derivados sobre las bacterias Bacilus cereus y Escherichia coli.

PROCEDIMIENTO Extracción  Pesar aproximadamente 75g de clavo y pulverizarlo por medio de maceración o picándolo finamente.  De esto, pesar 60g e introducirlos a un matraz redondo de 500mL agregando agua posteriormente hasta llenar el 50% del matraz.  Armar un aparato de destilación sencillo y calentar con manta de calentamiento.  El refrigerante debería de estar enfriado con agua enfriada con hielo idealmente.  Mantener el reflujo constante por aproximadamente 3 horas (evitando que se acabe el agua).  Permitir que todo llegue a temperatura ambiente y finalmente tomar el destilado.  Extraer el aceite esencial de la emulsión con 3 porciones de 25mL de éter dietílico en una ampolla de decantación.  Combinar los extractos etéreos y secar con 5g de sulfato de sodio anhidro.  Tarar un beaker y transferir el extracto.  Colocar el beaker en una estufa de calentamiento y lentamente evaporar el solvente.  Volver a pesar el beaker y calcular el porcentaje de rendimiento.
(O’Shea, Von Riesen, & Rossi, 2012)

Purificación del eugenol a partir del aceite esencial  Disolver el aceite esencial en 100mL de hexano y agregar a ampolla de decantación.  Agregar 50mL de NaOH al 5% y extraer la fase acuosa.  Realizar el procedimiento anterior 2 veces.

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     

Posteriormente, tomar el extracto acuoso y acidificarlo gota a gota con ácido clorhídrico 6M hasta que la solución esté ácida (tomar pH con papel pH). Agregar 50mL de hexano y extraer la fase acuosa. Separar el hexano en un Erlenmeyer, volver a introducir la fase acuosa en la ampolla de decantación y volver a extraer con 50mL de hexano. Combinar los dos extractos de 50mL de hexano y agregar 5g de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua. Evaporar el solvente (dejando en una campana por 24 horas o mediante un rotaevaporador). Almacenar el aceite en un vial y preferiblemente refrigerado.

(Miles & Smiley, 2002)

Síntesis  Agregar 1mL de eugenol y 0.5g de NaOH a 5mL de etanol en un matraz redondo de 25mL.  Agitar hasta que la mezcla se torne traslúcida y posteriormente calentar a reflujo.  Agregar 8.8mmol de halogenuro de alquilo de manera lenta (ver Tabla de Halogenuros de Alquilo).  Continuar el reflujo por 30 minutos y luego dejar enfriar.
(Esteb, Magers, McNulty, Morgan, & Wilson, 2009) Tabla 1. Halogenuros de Alquilo

Número 1 2 3 4

Nombre 1-bromobutano 1-bromo-2-cloroetano 2-bromo-1-cloropropano 1,2-dibromoetano

Estructura

Cantidad 0.95 mL 0.73 mL 0.90 mL 0.38 mL

Purificación de los productos  No existen datos suficientes para saber si los productos pueden ser recristalizados. El punto de fusión del eugenol es de -7.5°C, el del metileugenol es de -4°C. Se esperaría que los productos sí se pudieran recristalizar a 0°C.  Por facilidad de trabajo y considerando que ninguno de los productos debería presentar solubilidad en soluciones básicas, se utilizará el mismo procedimiento que se plantea para la purificación del eugenol con dos modificaciones: o Se trabajará con una cuarta parte de las cantidades allí planteadas.

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 

Los productos deberían de extraerse en la primera extracción (con hexano y NaOH 5%). El extracto orgánico debe de colocarse en un beaker tarado para la evaporación del solvente. Finalmente se vuelve a pesar el beaker y se calcula el porcentaje de rendimiento.

o

(Miles & Smiley, 2002) (Esteb, Magers, McNulty, Morgan, & Wilson, 2009)

Pruebas microbiológicas  Tomar una placa con Bacilus cereus y tomar, con un asa, un poco de la bacteria para posteriormente rayar una nueva placa con agar.  Preparar una solución (5% p/v) de eugenol (o derivados) en acetona (10mL).  Tomar un disco estéril y sumergirlo en la solución de eugenol (o derivados) y dejarlo allí por 10min.  Sacar el disco y dejarlo secar al aire y luego colocarlo contra una varilla de agitación (estéril) a que se seque por 10min.  Colocar el disco en la placa recién rayada con Bacilus cereus.  Repetir el mismo procedimiento para los derivados.  Utilizar siempre un disco como control que solo haya sido sumergido en acetona pura.  Una placa soporta hasta 6 discos, pero cuidar de trabajar solo con 4 por placa para mayor resolución.  Cerrar la placa con cinta adhesiva, identificar qué disco tiene qué compuesto y dejar incubando por 24 horas.  En el caso de Escherichia coli el procedimiento es igual, pero se debe tener mucho cuidado por la patogenicidad de la bacteria y recordar que la incubación se lleva a cabo en incubadora a 37°C.  Después de 24 horas incubándose, medir el tamaño del halo (si lo hay) de cada disco en la placa.  Dependiendo del diámetro del halo, medido con un escalímetro Vernier, es la actividad inhibitoria del compuesto que se probó.
(Miles & Smiley, 2002)

EVALUACIÓN DE RESULTADOS Identificación del eugenol  Preparar 30mL de fase móvil para TLC (acetato de etilo, hexano – 1:9)  Preparar solución estándar de eugenol en acetato de etilo (Eug: 0.159g, AE: 10mL)  Sembrar estándar, aceite esencial y eugenol extraído en una placa de sílica gel y llevar a cabo cromatografía con la fase móvil antes mencionada.  Revelar con lámpara UV a 254nm y calcular Rf.  Consultar Rf (Rf = 0.25) en el artículo en el que se basó la práctica.
(O’Shea, Von Riesen, & Rossi, 2012)

Identificación de los productos de reacción  La identificación de los productos se llevará a cabo de la misma manera en que se identificó el eugenol: por TLC y con las mismas condiciones.

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(O’Shea, Von Riesen, & Rossi, 2012) (Esteb, Magers, McNulty, Morgan, & Wilson, 2009)

Identificación y cuantificación de la actividad bactericida  La presencia del halo alrededor de los discos en la placa de Petri es una prueba confirmatoria de actividad bactericida.  El diámetro del halo alrededor de un disco es una manera de cuantificar la actividad bactericida: entre más grande sea el halo, mayor actividad tiene el compuesto probado.
(Miles & Smiley, 2002) (Dorman & Deans, 2000)

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REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO Reactivos
Cantidades No.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Reactivo/Producto
éter dietílico anhidro sulfato de sodio anhidro n-hexano hidróxido de sodio ácido clorhídrico conc. 1,2-dibromoetano 1-bromo-2-cloroetano 2-bromo-1cloropropano 1-bromobutano etanol acetona acetato de etilo eugenol

Cantidad g - mL mmol
150 mL 20.0 g 410 mL 8.0 g 20 mL 0.38 mL 0.73 mL 0.90 mL 0.95 mL 25 mL 100 mL 10 mL 1.0 mL 1430 141 3140 200 206 4.4 8.8 8.8 8.8 428 1360 102 6.5

Calidad
Para análisis Grado reactivo Para análisis Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Para análisis Para análisis Para análisis Estándar

Pureza
>99% >99% >98% >98% 37.5% >99% >99% >99% >99% >90% >98% >98% 100%

Lo provee
Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. U.A.I.

Propiedades físicas y químicas No .
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Reactivo/Producto
éter dietílico anhidro sulfato de sodio anhidro hexano hidróxido de sodio ácido clorhídrico conc. 1,2-dibromoetano 1-bromo-2-cloroetano 2-bromo-1cloropropano 1-bromobutano etanol acetona

PM -1 g mol
74.12 142.06 86.18 40 36.46 187.87 143.41 157.44 137.03 46.04 58.08

P. F. °C
-116.3 888 -95 323 -25.4 9.3 -14 N.D. -112.4 -114.1 -95.3

P. E. °C
34.6 1100 68 1388 50.5 131.4 106 116 101.4 78 56.2

Densida d -1 g mL
0.7134 2.671 0.66 2.13 1.19 2.18 1.723 1.537 1.276 0.79 0.79

Solubilidad
Poco soluble en agua Soluble en agua Insoluble en agua Muy soluble en agua. Muy soluble en agua. Poco soluble en agua Soluble en agua N.D. Insoluble en agua Miscible en agua Miscible en agua

Características
Líquido incoloro con olor etéreo. Polvo blanco amargo. Líquido incoloro con olor a gasolina. Sólido blanco. Líquido incoloro irritante. Líquido con fuerte olor a cloroformo. Líquido incoloro. Líquido incoloro. Líquido incoloro. Líquido incoloro con olor afrutado. Líquido incoloro con olor afrutado o a menta. Líquido incoloro con olor etéreo y afrutado. Líquido incoloro oleoso con fuerte olor a clavo.

12

acetato de etilo

88.11

-83

77

0.902

Soluble en agua Insoluble en agua

13

eugenol

164.2

-7.5

253.2

1.055

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Toxicidades No.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Reactivo/Producto
éter dietílico anhidro sulfato de sodio anhidro hexano hidróxido de sodio ácido clorhídrico conc. 1,2-dibromoetano 1-bromo-2-cloroetano 2-bromo-1cloropropano 1-bromobutano etanol acetona acetato de etilo eugenol

LD50 / LC50
1215 mg/kg 5989 mg/kg 25000 mg/kg N.D. 4701 mg/kg 180 mg/kg 64 mg/kg N.D. N.D. 7060 mg/kg 5800 mg/kg 5620 mg/kg 1930 mg/kg

Efectos en el Organismo
Narcótico, daños a los órganos, irritante. Irritante. Irritante y permeador. Corrosivo, irritante, permeador. Corrosivo, irritante, permeador. Carcinógeno, tóxico, potencialmente letal. Carcinógeno, tóxico, irritante. Irritante, tóxico. Irritante, tóxico. Irritante, permeador. Irritante, permeador. Irritante, permeador. Irritante, permeador.

Cuidados Especiales
NO inducir vómito, 1 administrar O2 AM NO inducir vómito, administrar O2 AM NO inducir vómito, administrar O2 AM NO inducir vómito, administrar O2 AM NO inducir vómito, administrar O2 AM NO inducir vómito, administrar O2 AM AM AM NO inducir vómito, administrar O2 AM NO inducir vómito, dar leche, administrar O2 AM NO inducir vómito, administrar O2 AM NO inducir vómito, administrar O2 AM NO inducir vómito, revisar tejidos AM

1

AM: buscar Atención Médica.

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Materiales Nombre Placas de Agar Discos para pruebas de antibióticos Clavo Equipo
Cristalería

Cantidad 2 8 75 g

Lo provee Depto. de Microbiología El estudiante El estudiante

Nombre Kit de síntesis orgánica CORNING 24/40 Kit de síntesis orgánica CORNING 19/22 Ampolla de decantación de 250mL Ampolla de decantación de 125mL Cámara para cromatografía en capa fina

Cantidad 1 4 1 4 1

Lo provee Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O.

Equipo

Nombre Manta de calentamiento Estufa de calentamiento Pipeta automática Incubadora Escalímetro Vernier

Cantidad 1 2 1 1 1

Lo provee Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Microbiología El estudiante

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Resultados de la Práctica Aplicada
TABLAS DE RESULTADOS
Tabla 2. Propiedades del aceite esencial

Propiedad Color Olor Aspecto

Observación Amarillo pálido Fuerte a clavo Aceite viscoso con densidad mayor a la del agua

Tabla 3. Propiedades del eugenol después de la extracción

Propiedad Color Olor Aspecto

Observación Anaranjado rojizo Suave, cálido, a clavo Aceite menos viscoso que el aceite esencial y más denso que el agua

Tabla 4. Propiedades de los productos de reacción

Propiedad Producto No. 1 Color Blanco, trasparente Olor Suave a eugenol Aspecto Sólido pastoso Solubilidad Hexano, acetona

Producto No. 2 Amarillento, transparente Suave a eugenol Líquido muy viscoso Hexano, acetona

Producto No. 3 Blanco, transparente Suave a eugenol Sólido cristalino Hexano, acetona

Tabla 5. Peso y porcentaje de rendimiento de diferentes fases en la práctica

Producto Aceite Esencial Eugenol Producto No. 1 Producto No. 2 Producto No. 3

Peso 6.0g 5.1g 0.2g 0.6g 0.4g

Porcentaje de rendimiento 10% 85% 19% 57% 38%

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Tabla 6. Diámetro de los halos de inhibición

Sustancia probada Blanco (acetona) Aceite esencial Eugenol Producto No. 1 Producto No. 2 Producto No. 3

Escherichia coli 14mm 16mm 6mm -

Staphylococcus aureus 12mm 13mm 10mm -

PRINCIPALES RESULTADOS OBTENIDOS
Se comenzó extrayendo el aceite esencial del clavo, el cual se obtuvo en un 10% de rendimiento como se había hallado en la literatura. El aceite, como se describe en la Tabla 1, mostró mayor densidad que el agua y se emulsificó bastante bien a pesar de no mezclarse con ella. Su color fue amarillo pálido, como se halló en la literatura, y transparente. La técnica de hidrodestilación con aparato de Clevenger dio muy buen rendimiento, sin embargo, el aceite se tuvo que estar sacando del aparato constantemente para evitar que este regresara al matraz de destilación. Su mayor densidad que la del agua dificulta la recuperación. Posteriormente se llevó a cabo la extracción del eugenol. Para ello se comenzó decantando el aceite esencial del agua. Después se extrajo el eugenol del aceite esencial por medio de hexano, medio básico y medio ácido. Finalmente se evaporó el solvente. Se obtuvo 5.1g del compuesto activo, así como se describe en la Tabla 4. El aceite extraído mostró mayor densidad a la del agua, un olor menos fuerte que el aceite esencial y un color más oscuro ( Tabla 2). Este color se notó fue oscureciendo poco a poco con el tiempo. Se puede inferir entonces que el color oscuro se debe a productos de oxidación del eugenol y que la evaporación de solvente con calor no es quizá la mejor manera de aislarlo. A continuación se llevó a cabo la síntesis. En esta parte se realizó un par de modificaciones muy importantes al procedimiento original, puesto que no se pudo trabajar con los halogenuros de alquilo solicitados. En cambio, se trabajó con 1-bromo-2-cloroetano, 1,3-dibromopropano y 1,2dibromopropano. La síntesis del primer derivado se llevó a cabo como estaba establecido en el procedimiento. Después, el tiempo de media hora de reflujo se extendió a 45 minutos para las siguientes dos reacciones con fines de aumentar el porcentaje de rendimiento. Los productos obtenidos fueron sólidos en su mayoría y de color blanco como se aprecia en la Tabla 3. Todos los porcentajes de rendimiento estuvieron debajo del 80% (lo esperado), como se puede ver en la Tabla 4. Esto indica una falta de optimización en la reacción. Al acidificar la fase acuosa después de aislar el producto, no se observó una emulsificación como se había notado al extraer el eugenol del aceite esencial. Un detalle que muestra evidencia de restos del eugenol en la fase acuosa es el color amarillo pálido que tenía esta al acidificar el medio. Finalmente, el Producto No. 2 se mostró como un líquido amarillento más viscoso como se ve en la Tabla 3. Este pudo haber contenido restos de eugenol mezclado con el producto, ya que su peso molecular no le debería de permitir ser un líquido. Para las pruebas microbiológicas se utilizó el agar Müller-Hinton debido a su baja selectividad a las moléculas y su alta capacidad de difusión de agentes biocidas y antibióticos. De las bacterias se escogió trabajar con el Staphylococcus aureus y Escherichia coli para ver los efectos de los

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productos sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas respectivamente. La única diferencia observada en los halos de inhibición en S. aureus fue que no fueron muy definidos; se mostraron difusos de las orillas. E. coli mostró halos de inhibición un poco más grandes en el caso del aceite esencial y el eugenol, pero no con el Producto No. 2 (Tabla 5). Finalmente, de la prueba microbiológica se observó que ni el Producto No. 1 ni el Producto No. 3 son activos bactericidas. El aceite esencial mostró un halo de inhibición moderado, como se había hallado en la literatura. El eugenol mostró el mayor halo de inhibición, como se esperaba. Finalmente, el Producto No. 2 mostró un pequeño halo de inhibición. Finalmente, así como se puede observar en la Tabla 5 y considerando lo hallado en la literatura, se pudo concluir que el fenol es la parte del eugenol que tiene la actividad bactericida y que modificar este grupo (quitándole su identidad) le disminuye o le quita la actividad al eugenol.

Conclusiones
 El diseño de nuevos medicamentos por medio de tamizaje molecular de alto rendimiento es un procedimiento largo que puede llevar a buenos resultados en poco tiempo. La alternativa de utilizar productos naturales y sus derivados en vez de bibliotecas de compuestos pre-existentes lleva a la posibilidad de hallar mejores alternativas y a un precio menor. El eugenol, como sustancia, presenta muchas formas de actividad y se recomienda seguir trabajando con él, ya que este no se ha utilizado tanto en química combinatoria. Las pruebas microbiológicas que se pueden realizar para determinar la bioactividad de una sustancia no son tan complicadas como se esperaba. La extracción de aceite esencial de clavo mediante hidrodestilación con aparato de Clevenger resulta muy eficiente, aunque se debe de tener cuidado por la densidad del aceite. El eugenol se puede extraer del aceite esencial de manera efectiva, pero no se recomienda calentar el eugenol para remover el solvente. Los porcentajes de rendimiento de la reacción no fueron altos, por lo que se concluye que la reacción requiere de una optimización. La extracción de cada producto de la mezcla de reacción tampoco fue la mejor por la presencia del etanol. Las características de cada producto revelaron que se trataba de diferente compuesto en cada caso y, por ende, que sí se había llevado a cabo la reacción al menos parcialmente. El S. aureus mostró halos difusos al llevar a cabo la prueba microbiológica y por ello se dificultó la toma de medidas del diámetro de cada halo. Fuera del aceite esencial y el eugenol, de los que se sabe que tienen actividad bactericida, solo el Producto No. 2 (el derivado del 1,3-dibromopropano) mostró actividad leve. Sin embargo, se pudo haber tratado de contaminantes.

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Anexos

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Ilustración 6. Aceite esencial de clavo (izquierda) y eugenol (derecha)

Ilustración 7. Aceite esencial, eugenol, Prods. 1, 3 y 2 y fase acuosa acidificada

Ilustración 8. Mezcla de reacción 2 después de 45 mins de reflujo

Ilustración 9. Aparatos de reflujo utilizados en las reacciones

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Ilustración 10. Caja sembrada con E. coli y con discos impregnados con Aceite Esencial, Eugenol y un blanco

Ilustración 11. Caja sembrada con S. aureus y con discos impregnados con Aceite Esencial, Eugenol y un blanco

Ilustración 12. Caja sembrada con E. coli y con discos impregnados con productos 1 (3), 2(1) y 3(2)

Ilustración 13. Caja sembrada con S. aureus y con discos impregnados con productos 1 (3), 2(1) y 3(2)

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