PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO PARA MICROORGANISMOS CON AGAR EOSINA- AZUL DE METILEN (EMB) Meza Ortega Nataly Yisel,

Melo Guerrero Mara Camila, Portilla Jaime *maria.camy28@hotmail.com Programa de Ingeniera Agroindustrial Cuarto semestre FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL Universidad de Nario, San Juan de Pasto Agosto 24 de 2011

INTRODUCCIN. Los medios de cultivo tienen gran importancia en la identificacin (bacterias de acuerdo a sus propiedades bioqumicas y fisiolgicas) y crecimiento de microorganismos tales como las bacterias, hongos y paracitos; uno de los sistemas ms importantes para este propsito es observar su crecimiento en sustancias alimentarias artificiales como las preparadas en el laboratorio. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y adems deben estar exentos de todo microorganismo contamnate. El modo en que las bacterias son cultivadas, y el propsito de los medios de cultivo, varan ampliamente. Los medios lquidos son utilizados para el crecimiento de lotes de cultivos puros mientras que los medios slidos son ampliamente utilizados para el aislamiento de cultivos puros, para la estimacin de poblaciones de bacterias viables, y una variedad de otros propsitos.[1] Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. El agar es el agente glido ms utilizado para medios slidos o semislidos es un polisacrido que se obtiene de la pared celular de varias especies de algas de los gneros Gelidium,Euchema y Gracilaria. El agar es utilizado por sus propiedades fsicas nicas (se funde a 100 grados y permanece lquido hasta enfriarse a 40 grados, la temperatura a la que se vuelve gel) y porque no puede ser metabolizado por la mayora de las bacterias. Por lo tanto, como un componente del medio es relativamente inerte, simplemente mantiene (geliza) los nutrientes que se encuentran en la solucin acuosa.[1] El agar Eosina- azul de metileno o comnmente conocida EMB-AGAR fue usado por primera vez para diferenciar las colonias fermentadoras de lactosa y no fermentadoras de microbios, actualmente es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram Negativos contra gran positivos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales permite el desarrollo de todas las especies de la familia de las enterobacterias[2]

Agar EMB se utiliza en las pruebas de calidad de agua para distinguir coliformes y coliformes fecales que indican la posible contaminacin microorganismo patgeno en muestras de agua. El agar EMB tambin se utiliza para diferenciar los organismos en el grupo de colon-tifoidea-disentera: colonias de Escherichia coli crecer con un brillo metlico con un centro oscuro, aerogenes colonies Aerobacter tienen un centro marrn, y nonlactose de fermentacin de bacterias gram negativas aparecen de color rosa [3]. El EMB AGAR posee un medio que es selectico y a la vez diferencial; la combinacin de la eosina y dos colorantes azul de metileno inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas, permitiendo que muchos organismos Gram negativos crezcan. Adems de peptonas,EMB contiene lactosa (tambin puede contener sacarosa). [4] PROCEDIMIENTO. 1. A cada uno de los grupos se le asigna el agar necesario para la preparacin del cultivo, en este caso nos fue asignado Eosina- azul de metileno (EMB). 2. Se examino muy cuidadosamente el agar identificando color, textura y olor. 3. Se procedi a pesar la cantidad exacta del medio deshidratado de EMB agar para prepara el medio de cultivo se pesaron.. 4. Se procedi a medir la cantidad de agua necesaria para poder disolver la solucin granulada de EMB-AGAR. 5. Disolver la porcin pesada de gar en la cantidad de agua establecida anteriormente. 6. Medir el pH de la solucin y comprobarlo con el pH estipulado en el frasco de agar. 7. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a una temperatura de 121C132C en un tiempo de 15 minutos 8. Para finalizar se saca el cultivo de la autoclave al culminar los 15 minutos y se lo almacena en refrigeracin por un periodo aproximado de 12 horas para terminar por completo con el cultivo.

RESULTADOS Medio de cultivo Cantidad preparada Cantidad pesada clculos EMB-Agar 200 mL 7,2 g

ASPECTO DEL MEDIO DE CULTIVO: Es granulado y de color purpura, su olor es fuerte y desagradable. Despus del proceso de esterilizacin al medio de cultivo, toma un color naranja. ESTADO FISICO: solido

TIPO DE MEDIO DE CULTIVO: Segn la naturaleza de los ingredientes: es sinttico, debido a su composicin, pues son aquellos que contienen exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida5. Segn el propsito de uso: es selectivo y diferencial, ya que se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli5.

DISTRIBUCION: en cajas Petri, es el material que tiene mayor regin de cultivo dando lugar a que los microorganismos consuman y consigan alimentos rpidamente. CONDICIONES DE ESTERILIZACION: Se trata en autoclave aproximadamente 15 minutos a 121C, a 15 libras de presin. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO: se almacena en un lugar seco y en recipientes bien cerrados, el lugar de almacenamiento debe estar entre 15C y 25C.

FOTOGRAFIAS

CUESTIONARIO 1. Cul fue el aporte de los medios de cultivos en el establecimiento de la microbiologa como ciencia. el estudio de los microorganismos en medios de cultivo ha sido de gran importancia para la microbiologa ya que la manipulacin y e estudio detallado de hongos y bacterias mediante el aislamiento de cultivos puros de bacterias para el conocimiento de sus caractersticas, este aporte hecho por Robert Koch a encaminado a la microbiologa al estudio de los microorganismos patgenos aportando a la ciencia mdica muchas soluciones a las enfermedades, como tambin en otros campos industriales ya que la variedad de microorganismos es muy elevada y mediante el estudio en medios de cultivo se puede incrementar su control como su utilidad. 2. Qu ventajas ofrecen los medios slidos para el cultivo de microorganismos. Una de la ventaja puede ser que permite detectar los diferentes tipos de bacterias que puedan encontrarse en una sola muestra es decir sera ms selectivo ya que no todas las bacterias pueden crecer bajo las propiedades de fusin del solidificante. 3. Qu es el solidificante de un medio. Es la sustancia que se aade a los medios de cultivo una vez se han disuelto los nutrientes para el cultivo se utilizan para preparar medios de cultivo slidos y semislidos, agar-agar es el agente solidificante ms comn, el agar es un polisacrido obtenido de cierto tipo de algas de la clase Rhodophyceaeel cual se debe procesado para reducir al mximo su contenido en pigmentos, sales e impurezas, este solidificante presenta un elevado punto de solidificacin 40 oC y es lquido a 100 oC,el Agar es una mezcla compleja de sales de polisacridos, fundamentalmente, galactsidos, las grandes molculas que lo constituyen determinan sus cualidades sobresalientes. Adems de ser muy estable y es degradado por muy pocas bacterias. 4. Explique tres tipos de esterilizacin utilizados en la preparacin de medios de cultivo. Auto clavado: Exposicin durante 15 minutos a 121C. Con este tratamiento mueren las clulas vegetativas y las endosporas bacterianas. Sin embargo, los medios que contienen hidratos de carbono, deben esterilizarse a temperaturas no superiores a los 116-118C, para prevenir su descomposicin y la posible formacin de compuestos txicos que inhiban el crecimiento bacteriano. Filtracin: Es el medio ms habitual cuando existen productos lbiles. Habitualmente el producto a esterilizar se filtra a travs de una membrana de acetato de celulosa o nitrocelulosa de un poro de 0,22 m. Las soluciones de antibiticos, las de carbohidratos, las vitaminas, etc., se suelen esterilizar por este mtodo y aadir al medio de cultivo ya esterilizado, cuando ste est a temperatura no superior a los 45-50C.

Tindalizacin: Exposicin a 100C durante 30 minutos. Con este tratamiento mueren las clulas vegetativas, pero no las endosporas. Cuando el medio esta fro, se incuba bajo condiciones de germinacin de las endosporas, y si ello ocurre, se repite el tratamiento Trmico. El aparato utilizado en este tipo de esterilizacin es el Arnold. 5. Explique y de ejemplos de los tipos o clases de medios de cultivo. Segn su estado fsico (consistencia). 1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin. 2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante los ms utilizados son la gelatina y el agar, este ltimo es el ms utilizado ya que no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y tampoco es atacado por las que cresen en l. 3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias Segn su utilizacin. 1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo 2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de aditivos como la sangre u otros productos biolgicos (suero, leche, huevo, bilis, etc.) que contribuyen al crecimiento del cultivo, en ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo como conPolivitex, Isovitalex, y otros. 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin poli microbiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de entero bacterias. 4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor, los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada, un

medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos. 5) Medios diferenciales: ayuda a diferenciar la especies de cultivo que se est realizando, se puede utilizar un azcar fermentable o un sustrato metabolizable. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. 6) Medios de identificacin: se utilizan para comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, pueden ser ejemplos. 7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. 8) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies, Cary-Blair, etc. Atendiendo a su composicin. 1) Medios complejos: preparados a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados. 2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida. 3) Medios semi sintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, y otras.

Segn su origen: a) sintticos: son los medios que contienen una composicin qumica definida cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. b) naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente. c) semisintticos: son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

BIBLIOGRAFA. [1]. Kenneth Todar. 2000. Medios de cultivo para el crecimiento de bacterias.

University os Wisconins-Madison
[2]. Madigan, MT, Martinko JM y J. Parker. 2006. Brock biologa de los microorganismos: una edicin internacional, 11 ed. Prentice-Hall International, Inc., Upper Saddle River, Nueva Jersey. [3]. Jacobs, MB, MJ y Gerstein. 1960. Manual de microbiologa. D. Van Nostrand Company, Inc., Princeton, NJ. [4]. Leboffe, MJ, y BE Pierce. 2005. Un atlas fotogrfico para el laboratorio de microbiologa, 3 ed. Morton Publishing, Englewood, CO. [5]. Clasificacin de medios de cultivo, http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo [6]. Sambrook, J.,E.,F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning a

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[7]. . Ausubel, F.,M.,R. Brent.,R. E.Kington,.D.Moore, J.G. Seidman., J.A. Smith,

and K Struhl. 1994. Current protocols in molecular biology.

CONCLUSIONES se aprendi a preparar medios de cultivo y la importancia de estos en el estudio de la microbiologa. los medios del cultivo son sistemas que tienen nutrientes, humedad, oxgeno y un pH adecuado que permiten el crecimiento de un microorganismo. se pudo identificar los distintos tipos de cultivos que pueden desarrollarse en el laboratorio teniendo en cuenta de que materiales o sustancias pueden ser hechos, dependiendo del propsito de uso, ya que cada tipo de microorganismo requiere un tipo de medio de cultivo particular. Los tubos de ensayos permiten variar el rea de regin de cultivo hacindolas ms eficientes al momento de inclinarlas. Los mecheros tienen un radio de esterilidad que garantiza que el microorganismo no se contamine.