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Precipitación de proteínas

Precipitación de proteínas

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Precipitación de proteínas globulares, a partir de agentes precipitantes tales como:
Metales pesados (Hg, Fe, Ag.....)
pH ácido (HCL)
pH básico (NaOH)
Precipitación de proteínas globulares, a partir de agentes precipitantes tales como:
Metales pesados (Hg, Fe, Ag.....)
pH ácido (HCL)
pH básico (NaOH)

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Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología
Precipitación
Sergio Huerta Ochoa
UAM-Iztapalapa
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación
En la precipitación se concentra el soluto de una solución convirtiéndolo en sólido
mediante la acción de un agente precipitante.
Teóricamente la precipitación debe producir un soluto concentrado y puro, por
lo que es una operación que se utiliza al inicio de un proceso de bioseparación
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Ventajas
1. Operación que se adapta fácilmente a gran escala
1. Puede realizase en forma continua
2. El equipo que se utiliza es sencillo
3. Se dispone de diversos agentes precipitantes y en muchos casos éstos
son baratos
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Fundamentos
Principio Agente precipitante
Disminución de la solubilidad Sales (Sulfato de amonio)
pH (precipitación isoeléctrica)
Solventes (etanol) Solventes (etanol)
Polímeros no iónicos
Desnaturalización selectiva Temperatura
pH
Solventes
Afinidad Ligandos
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación por disminución de la solubilidad
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
-
-
Al agregar un agente
precipitante
Las proteínas con mayor
hidrofobicidad superficial
precipitan primero
Precipitación de
proteínas por
disminución de la
solubilidad
Precipitación con sales
Precipitación isoeléctrica
Precipitación con solventes
Precipitación con polímeros no iónicos
+
+
+
+ +
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
Regiones hidrofóbicas
precipitan primero
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación con sales
Insolubilización
por salado
Solubilización
por salado
S
(Salting-out) (Salting-in)
[Sal]
Mecanismo
La adición de sales elimina el agua de la proteína
hidratada, dejando las regiones hidrofóbicas en
libertad de combinarse intermolecularmente
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación por incremento de la fuerza iónica
(“Salting-out”)
Proteína total
Proteína de interés
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
ó
n

r
e
l
a
t
i
v
a

(
%
)
80
100
Concentración de Sal (% Saturación)
0 20 40 60 80 100
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
ó
n

r
e
l
a
t
i
v
a

(
%
)
0
20
40
60
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Ecuación de la precipitación con sales
| | Sal log m A S − =
Donde:
S = Solubilidad de la proteína a un valor dado de concentración salina.
A = Constante que depende fuertemente del pH y la temperatura. Esta constante
usualmente toma un valor mínimo en el punto isoeléctrico, es característica de
cada proteína e independiente del tipo de sal.
m = Pendiente de la curva de solubilización por salado. Ésta es independiente del
pH y la temperatura, pero varía con el tipo de sal y de proteína. Las sales que
contienen aniones polivalentes tales como sulfatos y fosfatos tienen valores de m
mayores que las sales univalentes. Los cationes polivalentes como el calcio y el
magnesio disminuyen el valor de m.
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Naturaleza de la sal
1. Los aniones son más efectivos en el siguiente orden (Series de Hofmeister):
− − − − − − −
− − − − − −
> > > > > >
> > > > > >
I ClO O Br ClO Cl COO CH
PO H IO F SO
4 3 3 3
4 2 3
2
4
2 3
tartrato citrato
2. Los cationes son efectivos en el siguiente orden:
3. Seleccionar una sal que sea barata debido a las altas concentraciones que
requiere el método.
4. Seleccionar una sal que produzca un precipitado cuya densidad sea
diferente a la de la solución para facilitar su separación.
5. Añadirla sal en forma sólida y no como solución, para minimizar la dilución.
> > > > > > I ClO O Br ClO Cl COO CH
4 3 3 3
+ + +
> > a K H
4
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación isoeléctrica
Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad en el punto isoeléctrico
Mecanismo
Las proteínas por su naturaleza anfotérica presentan una carga neta negativa a
pH altos y una carga neta positiva a pH bajos. Existe un pH llamado pH
isoeléctrico al cual la carga neta de la proteína es cero. A este pH la molécula
es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
- -
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Repulsión
Atracción
Baja interacción
en el punto
isoelécrico
Efecto de las fuerzas
electrostáticas sobre la proteína
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación con solventes
Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad mediante la adición de un
solvente orgánico ligeramente polar
Mecanismo
El agua se caracteriza por su alta constante dieléctrica, lo cual significa que los iones en
solución acuosa presentan interacciones más débiles que con otros medios.
La adición de un solvente orgánico (etanol o acetona) produce agregados de moléculas
proteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una
Mecanismo
proteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una
constante dieléctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en las
fuerzas de atracción entre cargas opuestas y una disminución en el grado de ionización
de los radicales de las proteínas, y en consecuencia una disminución en la solubilidad de
ésta.
Líquido D
Agua 80.0
Matanol 33.0
Etanol 24.0
Acetona 21.4
Benceno 2.3
Hexano 1.9
Constantes dieléctricas de algunos líquidos a 20⁰C
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Ecuación de la precipitación con solventes
donde:
S = Solubilidad de la proteína
2
0
log log
S
D
K
S S + =
S = Solubilidad de la proteína
D
S
= Es la constante dieléctrica de la mezcla solvente-agua, misma que varía
dependiendo de la cantidad de solvente agregada.
K = Es una constante que toma en cuenta la constante dieléctrica original del
medio acuoso.
S
0
= Es la solubilidad extrapolada
Selección
del solvente
El solvente debe ser completamente miscible en agua
No debe reaccionar con las proteínas
Debe ser un buen agente precipitante
Debe ser seguro (flamabilidad del solvente)
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación con polímeros no iónicos
La precipitación de proteínas también puede realizarse utilizando polímeros
neutros como el polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes.
El mecanismo no está claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos
Mecanismo
Ogston y Laurent sugieren que los polímeros excluyen a las proteínas de parte
de la solución y reducen la cantidad efectiva de agua disponible para su
solvatación.
El modelo de Ogston se basa en la teoría termodinámica y concluye que los
sistemas pueden ser explicados en términos de los coeficientes de interacción
proteína-polímero, y proteína-proteína de las especies presentes.
El modelo de Laurent se basa en un mecanismo de exclusión geométrica de
regiones hidratadas de la proteína por el polímero.
El mecanismo no está claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos
propuestos.
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Ecuaciones de la precipitación con solventes
Modelo de Laurent:
KC k S − = log log
S = Solubilidad de la proteína
C = Concentración del polímero
k = constante de proporcionalidad
3
|
|

|
+
=
p s
r r
v
K
= Volumen parcial específico del polímero
r = Radio de la molécula de proteína
v
303 . 2
|
|
¹

\
+
=
p
p s
r
r r
v
K
r
S
= Radio de la molécula de proteína
r
P
= Radio del cilindro del polímero
Modelo de Ogston:
aC X S − = log
S = Solubilidad de la proteína
C = Concentración del polímero
a = coeficiente de interacción proteína-polietilen glicol
RT
X
i i
0
µ µ −
=
= Potencial químico de la proteína en presencia del polímero
= Potencial químico de la proteína en el estado estándar
R = Contante de los gases ideales
T = Temperatura absoluta
i
µ
0
i
µ
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación de proteínas por desnaturalización
selectiva
El objetivo de la desnaturalización selectiva es crear las condiciones en las cuales
la proteína de interés no se desnaturaliza o su desnaturalización es mínima la proteína de interés no se desnaturaliza o su desnaturalización es mínima
Si la proteína que se desea purificar presenta estabilidad en condiciones extremas
de temperatura, pH, o en solventes orgánicos, puede utilizarse esta propiedad en
las primeras etapas del proceso de purificación
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Desnaturalización por temperatura
El proceso de desnaturalización de la proteína por efecto de la temperatura puede
ser descrito como un proceso de primer orden
| |
| | P k
dt
P d
− =
[P] = Concentración de la proteína disuelta
t = tiempo t = tiempo
k = Velocidad específica de desnaturalización
|
¹
|

\
|

=
RT
E
k k exp
0
La dependencia del proceso de desnaturalización con la temperatura está dado por:
| |
| | P
RT
E
k
dt
P d
|
¹
|

\
|

− = exp
0
k
0
= Constante característica
E = Energía de activación de la desnaturalización
R = Constante de los gases
T = Temperatura
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Desnaturalización por pH
Debido a que ciertas proteínas son estables a pH’s extremos, se ha utilizado esta
propiedad para purificarlas mediante su precipitación por desnaturalización selectiva de
las proteínas contaminantes.
La velocidad de desnaturalización a pK’s extremos ya sea ácidos o básicos depende del
tiempo que tarde la proteína en abrirse y perder su conformación.
Desnaturalización por solventes orgánicos
tiempo que tarde la proteína en abrirse y perder su conformación.
La estabilidad que presentan algunas proteínas en una solución con solventes orgánicos
es una propiedad que ha sido utilizada en procesos de purificación, mediante la
precipitación de proteínas contaminantes.
El pH y la temperatura de la solución deben definirse y manejarse cuidadosamente con
el fin de maximizar el rendimiento y la pureza de la proteína de interés, y de lograr la
máxima precipitación de las proteínas contaminantes.
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación por afinidad
La precipitación de proteinas por afinidad es un método de preciptación selectivo que
se basa en la capacidad que tienen las proteínas para unirse con ligandos por medio
de sus sitios activos.
En el caso de la afinidad bioespecífica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o En el caso de la afinidad bioespecífica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o
un anticuerpo.
En el caso de la pseudoafinidad los ligandos utilizados son colorantes o metales.
Nota: La simple adición de ligandos a una solución proteica generalmente no es suficiente
para que ocurra la precipitación. Es necesario que el ligando propicie un estado de agregación
de los complejos ligando-proteína.
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Equipos de precipitación
La operación de precipitación puede llevarse en diferentes tipos de reactores entre los
que se encuentran los:
Intermitentes Continuos tipo
tanque agitado
Alimentación
Producto
Alimentación
Producto
Tubulares
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Diseño de Precipitadores
Precipitación a gran escala
En el diseño de un proceso de precipitación debe tomarse como base el comportamiento
cinético de las partículas en solución. El conocimiento de este comportamiento permite
hacer la selección adecuada de la geometría en la que se realizará el proceso.
“Gran escala” significa procesos los cuales son 10 veces o más que los métodos de
laboratorio existentes. En otras palabras se está interesado en el escalamiento.
La solubilidad de un soluto particular en un proceso a gran escala no es diferente al del
proceso a pequeña escala. Lo que se puede cambiar en un proceso a gran escala es la
cinética. Se desea que ambas cinéticas sean las mismas.
Se demuestra que la precipitación se obtiene con mejor éxito a una potencia por unidad
de volumen constante (P/V).
Precipitación a gran escala
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Se puede idealizar la precipitación como un mecanismo de 6 etapas:
1. Mezclado inicial: La alimentación conteniendo el soluto es mezclada con el
no-solvente o la sal
2. Nucleación: Aparecen pequeñas semillas e inicia la precipitación
3. Crecimiento limitado por difusión: El precipitado crece por difusión 3. Crecimiento limitado por difusión: El precipitado crece por difusión
4. Crecimiento influenciado por flujo: Nuevo crecimiento es ayudado por mezclado
5. Floculación: Partículas coloides se agregan en flóculos grandes
6. Centrifugación: Los flóculos son separados por los métodos ya descritos
Alguno de estos procesos ocurrirán simultáneamente, pero se discutirán como si
ocurriesen secuencialmente
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Mezclado Inicial:
El tiempo requerido para producir homogeneidad puede ser estimado de la ecuación:
D
l
t
4
2
=
donde: l es el tamaño promedio de los “eddies” turbulentos causados por el mezclado y donde: l es el tamaño promedio de los “eddies” turbulentos causados por el mezclado y
D es el coeficiente de difusión del soluto.
El tamaño de estos “eddies” puede ser estimado de la ecuación:
4
1
3
/
|
|
¹
|

\
|
=
V P
l
ρν
donde: ρ es la densidad de la solución, ν es la viscosidad cinemática, y P/V es la potencia
por volumen de la agitación.
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Departamento de Biotecnología
Nucleación:
La nucleación es la parte del proceso donde pequeñas partículas aparecen y empiezan a
crecer:
En sistemas inorgánicos, la nucleación puede ser lenta y la sobresaturación puede
persistir por largos periodos
Para sistemas coloides, este proceso es efectivamente instantáneo
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Departamento de Biotecnología
Crecimiento limitado por difusión (Crecimiento Pericinético):
Después de la nucleación, las partículas del precipitado crecen cuando el soluto disuelto
difunde hacia ellos de la solución circundante. Este crecimiento usualmente sigue un
proceso de segundo orden:
2
i
i
ky
dt
dy
− =
dt
donde: y
i
es la concentración de partículas de soluto, y k es la constante de la tasa del
proceso.
La constante k es una función del coeficiente de difusión D:
DdÑ k π 8 =
donde: d es el diámetro del soluto, y Ñ es el número de Avogadro.
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
La ecuación de segundo orden puede ser fácilmente integrada:
kt
y y
i i
+ =
0
1 1
donde: y
io
es la concentración inicial de soluto.
Sin embargo, frecuentemente es más difícil medir y
i
que determinar el peso molecular Sin embargo, frecuentemente es más difícil medir y
i
que determinar el peso molecular
promedio del precipitado. La ecuación anterior se puede escribir en términos del peso
molecular mediante un balance de masa
M
0
0
M y M y
i i
=
donde: es el peso molecular del soluto inicial.
Combinando las dos ecuaciones previas:
0 M
( ) kt y M M
i
0
1
0
+ =
Así las mediciones del peso molecular promedio contra el tiempo provee valores de la
constante k.
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Departamento de Biotecnología
Crecimiento influenciado por flujo (Crecimiento o agregación ortocinética):
La difusión limita el crecimiento de pequeñas partículas pero es menos importante que el
crecimiento de partículas grandes.
Para estas partículas grandes, el crecimiento usualmente involucra coalisión entre
especies las cuales son barridas junto con el mezclado.
El crecimiento en esta región obedece a una cinética de segundo orden:
2
i
i
ky
dt
dy
− =
donde la constante de la tasa está dada por:
2 / 1
3
/
3
2
(
¸
(

¸

=
ρν
α
V P
Ñd k
donde: α es un coeficiente de pegamiento, un factor insertado para considerar el hecho
de que no todas las coaliciones producen crecimiento .
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
La integración directa de esta ecuación es complicada por el hecho de que el diámetro de
la partícula y la constante de la tasa k son función del tiempo.
Se puede resolver la complicación considerando una fracción de volumen del soluto ψ
Ñ y d
i
|
¹
|

\
|
=
3
6
1
π ψ
Esta fracción de volumen es independiente del tiempo. Así podemos reescribir las Esta fracción de volumen es independiente del tiempo. Así podemos reescribir las
ecuaciones anteriores en términos de ψ
i
i
y
V P
dt
dy
|
|
¹
|

\
|
(
¸
(

¸

= −
2 / 1
/ 4
ρν
αψ
π
Integrando encontramos:
|
|
¹
|

\
|
|
|
¹
|

\
|
(
¸
(

¸

− = t
V P
y
y
i
i
2 / 1
/ 4
exp
0
ρν
αψ
π
Ejemplo 9.3
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Floculación:
Los flujos altos para el crecimiento de partículas pequeñas puede destruir los flóculos
más grandes, así esta etapa es algunas veces llevada a cabo en tanques no agitados.
Los polielectrolitos sintéticos pueden algunas veces ayudar a la floculación, tal como
ocurre en la filtración.
Nota: Recuerde que si el precipitado es el producto deseado, el polielectrolito debe ser
removido después.

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