AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS BENFICOS DEL SUELO DE LA GRANJA FAZ - UNP Elera Ojeda Rosario Nelly1 Guerra Delgado

Marco Sergio1 ,
1

Docentes de la Escuela Profesional de Medicina Veterinaria. Facultad de Zootecnia. UNP relera14@hotmail.com; msguerra90@hotmail.com MODALIDAD POSTER

RESUMEN El presente trabajo de investigacin tuvo como objetivo iniciar estudios de aislamiento de microorganismos con actividades enzimticas de inters industrial con capacidad amiloltica, lipoltica, antimicrobiana y capacidad de sntesis de melanina a partir de una muestra de suelo de la granja FAZ-UNP. El mtodo microbiolgico empleado const de cinco etapas: (i) dilucin de la muestra; (ii) cultivo en medios de cultivo generales; (iii) cultivo en medios especficos, para la seleccin de grupos de organismos; (iv) conteo; e (v) identificacin taxonmica, mediante la evaluacin de parmetros bioqumicos, como la fermentacin de diferentes substratos. Para el aislamiento de las cepas amilolticas se utilizaron medios modificados con almidn y la positividad frente al test de lugol, utilizando medios CZAPEK, PCA (plate count agar) y MRS (Man Rogosa Sharpe). Las cepas amilolticas fueron identificadas, purificadas y cro conservadas, obteniendo un total de 100 cepas nativas, de estas, 9 cepas pertenecieron a los gneros Bacillus sp ,Clostridium sp y Kurthia sp. Se recuperaron tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y Brevibacterium sp. con actividad celuloltica. Los microorganismos mostraron 88,6% de actividad para degradar materia orgnica a las 36 horas. La capacidad lipoltica no pudo ser detectada en los microorganismos aislados. La capacidad de sntesis de melanina se encontr en: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita, Aspergillus niger, Candida albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis y Penicillium marneffei. Los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicticos como Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y Exophiala dermatitidis, resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei resistente a seis antimicticos; mientras que las bacterias y helminto, productores de melanina, encontrados mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente. Palabras claves: suelo, Bacillus, Clostridium, Kurthia sp. amilolticas, lipoltica, melanina.

ABSTRACT This research work was to begin these studies of isolation of enzymatic activities of industrial interest with capability amiloltic, lipolytic, antimicrobial and capacity for synthesis of melanin of a sample of the FAZ-UNP farm soil micro-organisms.The microbiological method consisted of five stages: (i) the sample dilution; (ii) culture media general culture, providing the conditions for growth for all micro-organisms of the sample; (iii) cultivation in specific medias for selecting groups of organisms; (iv) count; and (v) taxonomic identification through a review of biochemical parameters, as the fermentation of different substrates. For the isolation of amiloltics strains were growth on starch modified media and positivity to lugol test using CZAPEK, PCA (plate count agar) and modified MRS (Man, Rogosa, Sharpe) medias. Strains obtained amiloltics were duly purified, kid preserved and identified biochemically, obtaining a total of 100 native strains, 9 strains belonging to the genus Bacillus sp, Clostridium sp. and Kurthia sp . Also recovered three strains for Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis and Brevibacterium sp. with celuloltic activity. Fixed microorganisms were 88,6% of activity to degrade organic matter to 36 hours. Lipolytic capacity could not be detected in the isolated microorganisms. Melanin synthesis capacity was found in: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida,: Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita and fungis, Aspergillus niger, Candida albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Penicillium marneffei. The fungi synthesized melanin are resistant to some antifungals such as Aspergillus niger resistant to Amphotericin B, Candida albicans and Exophiala dermatitidis, resistant to Amphotericin B and fluconazole and Penicillum marneffei resistant six antifungal; while bacteria and helminth, producing melanin, found were shown to be sensitive to different antimicrobials and anti-parasitary, respectively. key words: soil, Bacillus, Clostridium, Kurthia sp. amiloltics, lipolytic, melanin.

INTRODUCCIN Algunas de las enzimas extracelulares producidas por los microorganismos son usadas en la industria farmacutica, alimenticia y textil. Estas actividades enzimticas son: La amiloltica; que la produce la enzima amilasa y tiene diversas funciones industriales tanto en el rea alimenticia como en la produccin de combustibles. Los usos ms importantes son: La obtencin de jarabes de maltosa y glucosa, obtencin de fructosa a travs de la hidrlisis del almidn. La actividad lipoltica degrada lpidos, la cual sirve para la creacin de detergentes y mejor absorcin de grasas. La sntesis de melanina, es til en proyectos genticos para solucionar casos en los que ste pigmento no es producido por el individuo o su sntesis es alterada, se usa sobre todo en la cosmetologa, en cremas bloqueadoras y bronceadoras. La actividad antimicrobiana es usada en la produccin de medicamentos en el rea farmacutica. De las enzimas microbianas tambin se obtienen los antibiticos que matan o inhiben el crecimiento de otros organismos y se emplean como tratamiento de enfermedades infecciosas. Los antibiticos comerciales tiles estn producidos primordialmente por hongos filamentosos y bacterias del grupo de los actinomicetos (Gonzalez y col. 2005). En pases latinoamericanos cuya biodiversidad microbiana del suelo se desconoce, as como las alteraciones provocadas por el impacto ambiental, en un escenario de trabajo con recursos e infraestructura limitada; los estudios de la calidad del suelo, a travs de la evaluacin de las alteraciones en la estructura de los ecosistemas microbianos, deberan iniciarse, con el objeto de registrar dicha biodiversidad, en trminos taxonmicos. Porque en un futuro no muy lejano esta ser una nueva forma de valoracin econmica de los suelos, dada su potencialidad en recursos biotecnolgicos. Los cuales slo podrn ser capitalizados por cada pas si son estudiados en un contexto nacional y no por empresas transnacionales. El suelo representa la fuente ms importante de microorganismos benficos y se estima que slo el 1% de los microorganismos presentes en este ambiente han sido aislados y caracterizados. A partir de stos se han identificado especies capaces de producir compuestos de inters industrial. Es por ello que este trabajo de investigacin tuvo como objetivo iniciar estos estudios de aislamiento de microorganismos con actividades enzimticas de inters industrial con capacidad amiloltica, lipoltica, antimicrobiana y capacidad de sntesis de melanina a partir de una muestra de suelo del Centro Productivo de la Granja de la Facultad de Zootecnia de la Universidad Nacional de Piura. MATERIALES Y MTODOS

Se eligieron 7 muestras al azar del exterior de los corrales. El aislamiento e identificacin de los microorganismos de las muestras de suelo tomadas del Centro Productivo de la granja de la Facultad de Zootecnia de la Universidad Nacional de Piura.se realiz en el laboratorio de Nutricin Fisiolgica de la misma Facultad y Universidad. El mtodo microbiolgico desarrollado en el estudio del suelo const de siete etapas: En la primera se tomaron aproximadamente 100 g.de muestras de suelo con guante estril, previamente identificadas; en la segunda, se realizaron diluciones seriadas y plaqueo en agar nutritivo, se incubaron a 30C por 24 horas hasta observar crecimiento. A partir del crecimiento en placas se procedi a realizar el conteo de las colonias que aparecieron en las cuadrculas del Counter coult de Queboc. En la tercera, se aislaron 100 colonias a partir de las muestras por dilucin y se sembraron en agar nutritivo por el mtodo de estras sobre agar. En la cuarta, se subcultiv las muestras de suelo sembradas e incubadas inicialmente en Caldo triptosa (medio de cultivo de enriquecimiento) en agar comn. En la quinta, se sembr en medios selectivos, para la seleccin de grupos de organismos se obtuvieron un banco de 100 colonias que se evaluaron en estos medios de cultivo selectivos, para la deteccin de las actividades de inters industrial. En la sexta etapa, se realiz la identificacin taxonmica mediante la evaluacin de parmetros bioqumicos, como la fermentacin de diferentes substratos evalundose: la actividad amiloltica en el medio agar nutritivo con almidn soluble al 1%, la actividad lipoltica en medio agar con aceite de oliva al 1% emulsificado, la actividad antimicrobiana contra una bacteria Gram-positiva, la sntesis de melanina: agar con tirosina y sulfato de cobre, la capacidad enzimtica, usando un sustrato y la enzima, con el fin de identificar los microorganismos con la mayor capacidad enzimtica. Finalmente se conservaron las cepas obtenidas, previa confirmacin de su pureza. RESULTADOS Y DISCUSIN 100 cepas tuvieron actividad amiloltica interesante con almidn y la positividad frente al test de lugol. La actividad lipoltica sali negativa, pero con actividad de sntesis de melanina positiva. Se seleccionaron 9 para su respectiva identificacin, las cuales se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Seleccin de algunas cepas amilolticas aisladas de la granja FAZ-UNP N de colonias 1 20 41 73 113 119 121 130 166 Descripcin Colonias irregulares, amarillas en forma de abanico Colonias regulares, medianas, blancas y brillantes Colonias medianas, planas, regulares y blancas Colonias pequeas, blancas y cremosas Colonias irregulares, pequeas y blancas Colonias regulares, brillantes y cremosas Colonias irregulares, grandes y blancas Colonias irregulares, medianas y blancas Colonias regulares, medianas y cremosas Lugol Tipo de M.O + + + + + + + + + Bacilos grampositivos Bacilos grampositivos Bacilos grampositivos Bacilos gramnegativos Bacilos grampositivos Bacilos grampositivos Bacilos gramnegativos Bacilos gramnegativos Bacilos gramnegativos

Las cepas amilolticas pertenecan a los gneros Bacillus sp, Clostridium sp y Kurthia sp., siendo el primero el ms predominante dentro de las cepas seleccionadas. Tabla 2: Clasificacin de las cepas amilolticas seleccionadas segn gnero. N de colonia 1 20 41 73 113 119 121 130 166 Oxidasa + Pruebas bioqumicas Catalasa + + + + + + + + Citrato + + + + + + + SIM + + + + + + + TSI + + + + + + Gnero Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Kurthia sp. Bacillus sp. Clostridium sp. Bacillus sp. Bacillus sp.

Las bacterias mas abundantes en el suelo son pequeos bacilos cocoides de morfologa variable, que dan lugar a pequeas colonias en medios con agar. En los cultivos jvenes predominan los bacilos Gramnegativos, mientras que en cultivos viejos sobre sustrato favorable, el predominio es de cocos Grampositivos (Snchez y col, 2005). Winogradsky clasific los microorganismos del suelo en autctonos o indgenas y zimgenos o fermentadores. Los zimgenos suelen ser escasos y florecen abundantemente cuando se

aade una determinada cantidad de materia orgnica y luego desaparecen al terminarse sta (Garca, 2005). Las bacterias del suelo son extremadamente resistentes a la sequa, desaparecen las formas vegetativas pero se mantienen las formas esporuladas. Azotobacter sobrevive tras 30 aos de almacenamiento en seco. Los suelos hmedos son desfavorables para muchas bacterias. El factor restrictivo es el oxgeno y no el exceso de agua (Sullivan, 2007). Las temperaturas ptimas para el desarrollo bacteriano se encuentran situadas entre los 25-35 C. La escala de pH que normalmente toleran las bacterias es la comprendida entre los valores de 4 y 10. En suelos cidos los hongos se desenvuelven mejor y la competencia por el alimento hace descender el nmero de bacterias. Durante el verano seco y clido baja la poblacin microbiana, mientras que en otoo aumenta otra vez; en invierno queda inactiva y se reanima en la primavera (Sullivan, 2007). Las modificaciones de la fuente de carbono del medio estndar seleccionado utilizando almidn, glucosa y dextrina en una cantidad de 1 g/L permitieron establecer que el comportamiento de las cepas seleccionadas cuando utilizamos un medio de cultivo con almidn o dextrina como fuente de carbono es similar a la obtenidas por Snchez y col. (2005); quines realizaron la electroforesis de las muestras de fermentaciones realizadas, observando que las protenas presentes en el medio de cultivo modificado con almidn son exactamente las mismas que se expresan en el medio de cultivo modificado con dextrina. Existen muchos factores como la temperatura, la deshidratacin, la purificacin, la congelacin etc., que pueden desnaturalizar las protenas y enzimas. La actividad de las enzimas depende de la concentracin de stas en el medio fermentado. Sin embargo, los protocolos utilizados para la determinacin de las actividades, tanto, de amiloglucosidasa como alfaamilasa requieren de una concentracin mnima de enzimas para llevar a cabo con xito la cuantificacin del microorganismo, y que estimulen la expresin de la enzima amiloltica AMG (Snchez y col., 2005).

Otras bacterias abundantes del suelo son los bacilos esporulados, que constituyen usualmente un 25% del total. Los correspondientes al gnero Bacillus alcanzan valores medios en suelos del 15 %. Las bacterias nitrificantes como Nitrosomonas y Nitrobacter tambin se

encontraron y representan menos del 1 % de la poblacin. Se recuperaron tambin tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y Brevibacterium sp . con actividad celuloltica. Los microorganismos inmovilizados mostraron 88,6% de actividad para degradar materia orgnica a las 36 horas. La actividad de las enzimas depende de la concentracin de stas en el medio fermentado. La melanina es responsable de la coloracin de plantas y animales; se encuentra en los ojos, el cabello, la piel, el plumaje, la cscara de los huevos, la cutcula de los insectos, la tinta de los cefalpodos, en la pared y citoplasma de microorganismos. En los humanos tambn se ha encontrado en neuronas y hepatocitos. En la tabla 3, se listan los MO encontrados. Tabla 3. Sntesis de melanina de microorganismos aislados del suelo de la granja FAZUNP Tipo de MO Aeromonas Mycobacterium leprae Bacillus Pseudomonas aeruginosa, P. putida Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita Aspergillus niger Candida albicans Exophiala (Wangiella) dermatitidis Penicillium marneffei N encontrado 63 68 70 72 96 5 202 151 11 15

Tabla 4. Resistencia a los antimicticos, inducida por diferentes tipos de hongos productores de melanina. Microorganismo Aspergillus niger Candida albicans Exophiala (Wangiella) dermatitidis Penicillium marneffei Antifngico Anfotericina B Anfotericina B, Fluconazol Anfotericina B, Fluconazol Anfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol, Itraconazol, Miconazol, Flucitosina La presencia de melanina en muchos microorganismos genera mayor resistencia a los compuestos antimicrobianos y principalmente a los antimicticos. En el presente estudio se ha encontrado que los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicticos como es el caso de Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y

Exophiala dermatitidis, resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei resistente a seis antimicticos (Tabla 4); mientras que las bacterias, protozoos y helmintos mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente Uran (2008) encontr que, en general, las clulas melnicas presentaban menor susceptibilidad que las clulas nativas (no melnicas) a antimicticos como ketoconazol, fluconazol, itraconazol, sulfametazol y anfotericina B; esta ltima es el antimictico menos efectivo sobre las clulas melnicas, dando dos explicaciones para estos resultados: una, que la melanina disminuye la permeabilidad de la pared celular, o dos, que la melanina disminuye el dao de la membrana celular causado por los medicamentos. Sin embargo, no todos ellos parecen ser resistentes, como es el caso de E. dermatitidis en el que la presencia o ausencia de melanina no interfiere con la actividad antimictica. Finalmente, Gonzles y col. (2005) han propuesto un modelo de cmo la melanina presente en la pared de C. neoformans, uno de los hongos ms estudiados en este aspecto, forma una especie de malla que puede presentar dos tipos de poros, unos pequeos que permitiran el paso de molculas hasta del tamao de los anticuerpos y otros que seran inaccesibles para molculas de tamaos mayores como los antimicticos. El mtodo microbiolgico clsico que se emple en este estudio del suelo, originalmente desarrollado para muestras acuosas, const de cinco etapas: (i) dilucin de la muestra; (ii) cultivo en medios de cultivo generales, que proporcionan las condiciones de crecimiento para todos los microorganismos de la muestra; (iii) cultivo en medios especficos, para la seleccin de grupos de organismos; (iv) conteo; e (v) identificacin taxonmica, mediante la evaluacin de parmetros bioqumicos, como la fermentacin de diferentes substratos (Parkinson et al., 1971; Schinner et al., 1996). Su empleo en el estudio de suelos se realiz con ciertos reparos, ya que se asuma que sus premisas no se cumplan totalmente. Primero, porque el supuesto de una dilucin homognea de la muestra en el caso de los suelos es irreal, ya que nunca se logra alcanzar dicha condicin; segundo, debido a que los organismos estn estrechamente unidos a las partculas del suelo, no se puede lograr una dilucin representativa de todas las especies; y tercero, las condiciones del medio de cultivo general, no aseguran el crecimiento de todos los microorganismos presentes en la muestra de suelo, ya que las condiciones aerbicas, as como las concentraciones de los substratos, no son las ptimas para todas las comunidades microbianas.

CONCLUSIONES Se logr obtener un cepario de 100 cepas amilolticas, de las cuales 9 presentaron mayor actividad amiloltica y pertenecen a los gneros Bacillus sp , Clostridium sp y Kurthia sp. Se recuperaron tambin tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y Brevibacterium sp. con actividad celuloltica, lo cuales degradaron la materia orgnica a las 36 horas. La capacidad lipoltica no pudo ser detectada en los microorganismos aislados. La capacidad de sntesis de melanina se encontr en las bacterias: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Streptomyces antibioticus, en el helminto: Fasciola gigantita y en los hongos: Aspergillus niger, Candida albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Penicillium marneffei. Se ha encontrado que los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicticos como Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y Exophiala dermatitidis , resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei resistente a seis antimicticos; mientras que las bacterias, protozoos y helmintos, productores de melanina, encontrados mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente Los microorganismos que se lograron aislar del suelo de la granja FAZ-UNP no causan ningn peligro al medio ambiente, ni a los seres humanos y animales. Estos microbios benficos consumen las sustancias que causan la putrefaccin, malos olores y enfermedades, eliminando la mayora de microbios patgenos por medio de la exclusin competitiva. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Chunga, J. (2001). Microbiologa de alimentos. Manual de Laboratorio. Universidad Nacional de Piura. Facultad de Ingeniera Pesquera. Piura. Per. 150 pp. Garca, A. 2005. Microbiologa del suelo. Universidad de Extremadura. Departamento de Biologa y produccin de los Vegetales rea de edafologa y qumica agrcola. Disponible en: http://www.unex.es/edafo/ECAP/ECAL6Programa.htm Gonzles, L; Ordua O y Ortiz L. 2005. Anlisis del suelo. Centro Universitario Anglo Mexicano de Morelos. Holt, E. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore. p .787

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