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AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS BENÉFICOS DEL SUE

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS BENÉFICOS DEL SUE

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AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS BENÉFICOS DEL SUELO DE LA GRANJA FAZ - UNP Elera Ojeda Rosario Nelly1 Guerra Delgado

Marco Sergio1 ,
1

Docentes de la Escuela Profesional de Medicina Veterinaria. Facultad de Zootecnia. UNP relera14@hotmail.com; msguerra90@hotmail.com MODALIDAD POSTER

RESUMEN El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo iniciar estudios de aislamiento de microorganismos con actividades enzimáticas de interés industrial con capacidad amilolítica, lipolítica, antimicrobiana y capacidad de síntesis de melanina a partir de una muestra de suelo de la granja FAZ-UNP. El método microbiológico empleado constó de cinco etapas: (i) dilución de la muestra; (ii) cultivo en medios de cultivo generales; (iii) cultivo en medios específicos, para la selección de grupos de organismos; (iv) conteo; e (v) identificación taxonómica, mediante la evaluación de parámetros bioquímicos, como la fermentación de diferentes substratos. Para el aislamiento de las cepas amilolíticas se utilizaron medios modificados con almidón y la positividad frente al test de lugol, utilizando medios CZAPEK, PCA (plate count agar) y MRS (Man Rogosa Sharpe). Las cepas amilolíticas fueron identificadas, purificadas y crío conservadas, obteniendo un total de 100 cepas nativas, de estas, 9 cepas pertenecieron a los géneros Bacillus sp ,Clostridium sp y Kurthia sp. Se recuperaron tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y Brevibacterium sp. con actividad celulolítica. Los microorganismos mostraron 88,6% de actividad para degradar materia orgánica a las 36 horas. La capacidad lipolítica no pudo ser detectada en los microorganismos aislados. La capacidad de síntesis de melanina se encontró en: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita, Aspergillus niger, Candida albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis y Penicillium marneffei. Los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicóticos como Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y Exophiala dermatitidis, resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei resistente a seis antimicóticos; mientras que las bacterias y helminto, productores de melanina, encontrados mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente. Palabras claves: suelo, Bacillus, Clostridium, Kurthia sp. amilolíticas, lipolítica, melanina.

ABSTRACT This research work was to begin these studies of isolation of enzymatic activities of industrial interest with capability amilolític, lipolytic, antimicrobial and capacity for synthesis of melanin of a sample of the FAZ-UNP farm soil micro-organisms.The microbiological method consisted of five stages: (i) the sample dilution; (ii) culture media general culture, providing the conditions for growth for all micro-organisms of the sample; (iii) cultivation in specific medias for selecting groups of organisms; (iv) count; and (v) taxonomic identification through a review of biochemical parameters, as the fermentation of different substrates. For the isolation of amilolítics strains were growth on starch modified media and positivity to lugol test using CZAPEK, PCA (plate count agar) and modified MRS (Man, Rogosa, Sharpe) medias. Strains obtained amilolítics were duly purified, kid preserved and identified biochemically, obtaining a total of 100 native strains, 9 strains belonging to the genus Bacillus sp, Clostridium sp. and Kurthia sp . Also recovered three strains for Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis and Brevibacterium sp. with celulolític activity. Fixed microorganisms were 88,6% of activity to degrade organic matter to 36 hours. Lipolytic capacity could not be detected in the isolated microorganisms. Melanin synthesis capacity was found in: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida,: Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita and fungis, Aspergillus niger, Candida albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Penicillium marneffei. The fungi synthesized melanin are resistant to some antifungals such as Aspergillus niger resistant to Amphotericin B, Candida albicans and Exophiala dermatitidis, resistant to Amphotericin B and fluconazole and Penicillum marneffei resistant six antifungal; while bacteria and helminth, producing melanin, found were shown to be sensitive to different antimicrobials and anti-parasitary, respectively. key words: soil, Bacillus, Clostridium, Kurthia sp. amilolítics, lipolytic, melanin.

INTRODUCCIÓN Algunas de las enzimas extracelulares producidas por los microorganismos son usadas en la industria farmacéutica, alimenticia y textil. Estas actividades enzimáticas son: La amilolítica; que la produce la enzima amilasa y tiene diversas funciones industriales tanto en el área alimenticia como en la producción de combustibles. Los usos más importantes son: La obtención de jarabes de maltosa y glucosa, obtención de fructosa a través de la hidrólisis del almidón. La actividad lipolítica degrada lípidos, la cual sirve para la creación de detergentes y mejor absorción de grasas. La síntesis de melanina, es útil en proyectos genéticos para solucionar casos en los que éste pigmento no es producido por el individuo o su síntesis es alterada, se usa sobre todo en la cosmetología, en cremas bloqueadoras y bronceadoras. La actividad antimicrobiana es usada en la producción de medicamentos en el área farmacéutica. De las enzimas microbianas también se obtienen los antibióticos que matan o inhiben el crecimiento de otros organismos y se emplean como tratamiento de enfermedades infecciosas. Los antibióticos comerciales útiles están producidos primordialmente por hongos filamentosos y bacterias del grupo de los actinomicetos (Gonzalez y col. 2005). En países latinoamericanos cuya biodiversidad microbiana del suelo se desconoce, así como las alteraciones provocadas por el impacto ambiental, en un escenario de trabajo con recursos e infraestructura limitada; los estudios de la calidad del suelo, a través de la evaluación de las alteraciones en la estructura de los ecosistemas microbianos, deberían iniciarse, con el objeto de registrar dicha biodiversidad, en términos taxonómicos. Porque en un futuro no muy lejano esta será una nueva forma de valoración económica de los suelos, dada su potencialidad en recursos biotecnológicos. Los cuales sólo podrán ser capitalizados por cada país si son estudiados en un contexto nacional y no por empresas transnacionales. El suelo representa la fuente más importante de microorganismos benéficos y se estima que sólo el 1% de los microorganismos presentes en este ambiente han sido aislados y caracterizados. A partir de éstos se han identificado especies capaces de producir compuestos de interés industrial. Es por ello que este trabajo de investigación tuvo como objetivo iniciar estos estudios de aislamiento de microorganismos con actividades enzimáticas de interés industrial con capacidad amilolítica, lipolítica, antimicrobiana y capacidad de síntesis de melanina a partir de una muestra de suelo del Centro Productivo de la Granja de la Facultad de Zootecnia de la Universidad Nacional de Piura. MATERIALES Y MÉTODOS

Se eligieron 7 muestras al azar del exterior de los corrales. El aislamiento e identificación de los microorganismos de las muestras de suelo tomadas del Centro Productivo de la granja de la Facultad de Zootecnia de la Universidad Nacional de Piura.se realizó en el laboratorio de Nutrición Fisiológica de la misma Facultad y Universidad. El método microbiológico desarrollado en el estudio del suelo constó de siete etapas: En la primera se tomaron aproximadamente 100 g.de muestras de suelo con guante estéril, previamente identificadas; en la segunda, se realizaron diluciones seriadas y plaqueo en agar nutritivo, se incubaron a 30ºC por 24 horas hasta observar crecimiento. A partir del crecimiento en placas se procedió a realizar el conteo de las colonias que aparecieron en las cuadrículas del Counter coult de Queboc. En la tercera, se aislaron 100 colonias a partir de las muestras por dilución y se sembraron en agar nutritivo por el método de estrías sobre agar. En la cuarta, se subcultivó las muestras de suelo sembradas e incubadas inicialmente en Caldo triptosa (medio de cultivo de enriquecimiento) en agar común. En la quinta, se sembró en medios selectivos, para la selección de grupos de organismos se obtuvieron un banco de 100 colonias que se evaluaron en estos medios de cultivo selectivos, para la detección de las actividades de interés industrial. En la sexta etapa, se realizó la identificación taxonómica mediante la evaluación de parámetros bioquímicos, como la fermentación de diferentes substratos evaluándose: la actividad amilolítica en el medio agar nutritivo con almidón soluble al 1%, la actividad lipolítica en medio agar con aceite de oliva al 1% emulsificado, la actividad antimicrobiana contra una bacteria Gram-positiva, la síntesis de melanina: agar con tirosina y sulfato de cobre, la capacidad enzimática, usando un sustrato y la enzima, con el fin de identificar los microorganismos con la mayor capacidad enzimática. Finalmente se conservaron las cepas obtenidas, previa confirmación de su pureza. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 100 cepas tuvieron actividad amilolítica interesante con almidón y la positividad frente al test de lugol. La actividad lipolítica salió negativa, pero con actividad de síntesis de melanina positiva. Se seleccionaron 9 para su respectiva identificación, las cuales se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Selección de algunas cepas amilolíticas aisladas de la granja FAZ-UNP Nº de colonias 1 20 41 73 113 119 121 130 166 Descripción Colonias irregulares, amarillas en forma de abanico Colonias regulares, medianas, blancas y brillantes Colonias medianas, planas, regulares y blancas Colonias pequeñas, blancas y cremosas Colonias irregulares, pequeñas y blancas Colonias regulares, brillantes y cremosas Colonias irregulares, grandes y blancas Colonias irregulares, medianas y blancas Colonias regulares, medianas y cremosas Lugol Tipo de M.O + + + + + + + + + Bacilos grampositivos Bacilos grampositivos Bacilos grampositivos Bacilos gramnegativos Bacilos grampositivos Bacilos grampositivos Bacilos gramnegativos Bacilos gramnegativos Bacilos gramnegativos

Las cepas amilolíticas pertenecían a los géneros Bacillus sp, Clostridium sp y Kurthia sp., siendo el primero el más predominante dentro de las cepas seleccionadas. Tabla 2: Clasificación de las cepas amilolíticas seleccionadas según género. Nº de colonia 1 20 41 73 113 119 121 130 166 Oxidasa + Pruebas bioquímicas Catalasa + + + + + + + + Citrato + + + + + + + SIM + + + + + + + TSI + + + + + + Género Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp. Kurthia sp. Bacillus sp. Clostridium sp. Bacillus sp. Bacillus sp.

Las bacterias mas abundantes en el suelo son pequeños bacilos cocoides de morfología variable, que dan lugar a pequeñas colonias en medios con agar. En los cultivos jóvenes predominan los bacilos Gramnegativos, mientras que en cultivos viejos sobre sustrato favorable, el predominio es de cocos Grampositivos (Sánchez y col, 2005). Winogradsky clasificó los microorganismos del suelo en autóctonos o indígenas y zimógenos o fermentadores. Los zimógenos suelen ser escasos y florecen abundantemente cuando se

añade una determinada cantidad de materia orgánica y luego desaparecen al terminarse ésta (García, 2005). Las bacterias del suelo son extremadamente resistentes a la sequía, desaparecen las formas vegetativas pero se mantienen las formas esporuladas. Azotobacter sobrevive tras 30 años de almacenamiento en seco. Los suelos húmedos son desfavorables para muchas bacterias. El factor restrictivo es el oxígeno y no el exceso de agua (Sullivan, 2007). Las temperaturas óptimas para el desarrollo bacteriano se encuentran situadas entre los 25-35º C. La escala de pH que normalmente toleran las bacterias es la comprendida entre los valores de 4 y 10. En suelos ácidos los hongos se desenvuelven mejor y la competencia por el alimento hace descender el número de bacterias. Durante el verano seco y cálido baja la población microbiana, mientras que en otoño aumenta otra vez; en invierno queda inactiva y se reanima en la primavera (Sullivan, 2007). Las modificaciones de la fuente de carbono del medio estándar seleccionado utilizando almidón, glucosa y dextrina en una cantidad de 1 g/L permitieron establecer que el comportamiento de las cepas seleccionadas cuando utilizamos un medio de cultivo con almidón o dextrina como fuente de carbono es similar a la obtenidas por Sánchez y col. (2005); quiénes realizaron la electroforesis de las muestras de fermentaciones realizadas, observando que las proteínas presentes en el medio de cultivo modificado con almidón son exactamente las mismas que se expresan en el medio de cultivo modificado con dextrina. Existen muchos factores como la temperatura, la deshidratación, la purificación, la congelación etc., que pueden desnaturalizar las proteínas y enzimas. La actividad de las enzimas depende de la concentración de éstas en el medio fermentado. Sin embargo, los protocolos utilizados para la determinación de las actividades, tanto, de amiloglucosidasa como alfaamilasa requieren de una concentración mínima de enzimas para llevar a cabo con éxito la cuantificación del microorganismo, y que estimulen la expresión de la enzima amilolítica AMG (Sánchez y col., 2005).

Otras bacterias abundantes del suelo son los bacilos esporulados, que constituyen usualmente un 25% del total. Los correspondientes al género Bacillus alcanzan valores medios en suelos del 15 %. Las bacterias nitrificantes como Nitrosomonas y Nitrobacter también se

encontraron y representan menos del 1 % de la población. Se recuperaron también tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y Brevibacterium sp . con actividad celulolítica. Los microorganismos inmovilizados mostraron 88,6% de actividad para degradar materia orgánica a las 36 horas. La actividad de las enzimas depende de la concentración de éstas en el medio fermentado. La melanina es responsable de la coloración de plantas y animales; se encuentra en los ojos, el cabello, la piel, el plumaje, la cáscara de los huevos, la cutícula de los insectos, la tinta de los cefalópodos, en la pared y citoplasma de microorganismos. En los humanos tambíén se ha encontrado en neuronas y hepatocitos. En la tabla 3, se listan los MO encontrados. Tabla 3. Síntesis de melanina de microorganismos aislados del suelo de la granja FAZUNP Tipo de MO Aeromonas Mycobacterium leprae Bacillus Pseudomonas aeruginosa, P. putida Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita Aspergillus niger Candida albicans Exophiala (Wangiella) dermatitidis Penicillium marneffei Nº encontrado 63 68 70 72 96 5 202 151 11 15

Tabla 4. Resistencia a los antimicóticos, inducida por diferentes tipos de hongos productores de melanina. Microorganismo Aspergillus niger Candida albicans Exophiala (Wangiella) dermatitidis Penicillium marneffei Antifúngico Anfotericina B Anfotericina B, Fluconazol Anfotericina B, Fluconazol Anfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol, Itraconazol, Miconazol, Flucitosina La presencia de melanina en muchos microorganismos genera mayor resistencia a los compuestos antimicrobianos y principalmente a los antimicóticos. En el presente estudio se ha encontrado que los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicóticos como es el caso de Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y

Exophiala dermatitidis, resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei resistente a seis antimicóticos (Tabla 4); mientras que las bacterias, protozoos y helmintos mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente Uran (2008) encontró que, en general, las células melánicas presentaban menor susceptibilidad que las células nativas (no melánicas) a antimicóticos como ketoconazol, fluconazol, itraconazol, sulfametazol y anfotericina B; esta última es el antimicótico menos efectivo sobre las células melánicas, dando dos explicaciones para estos resultados: una, que la melanina disminuye la permeabilidad de la pared celular, o dos, que la melanina disminuye el daño de la membrana celular causado por los medicamentos. Sin embargo, no todos ellos parecen ser resistentes, como es el caso de E. dermatitidis en el que la presencia o ausencia de melanina no interfiere con la actividad antimicótica. Finalmente, Gonzáles y col. (2005) han propuesto un modelo de cómo la melanina presente en la pared de C. neoformans, uno de los hongos más estudiados en este aspecto, forma una especie de malla que puede presentar dos tipos de poros, unos pequeños que permitirían el paso de moléculas hasta del tamaño de los anticuerpos y otros que serían inaccesibles para moléculas de tamaños mayores como los antimicóticos. El método microbiológico clásico que se empleó en este estudio del suelo, originalmente desarrollado para muestras acuosas, constó de cinco etapas: (i) dilución de la muestra; (ii) cultivo en medios de cultivo generales, que proporcionan las condiciones de crecimiento para todos los microorganismos de la muestra; (iii) cultivo en medios específicos, para la selección de grupos de organismos; (iv) conteo; e (v) identificación taxonómica, mediante la evaluación de parámetros bioquímicos, como la fermentación de diferentes substratos (Parkinson et al., 1971; Schinner et al., 1996). Su empleo en el estudio de suelos se realizó con ciertos reparos, ya que se asumía que sus premisas no se cumplían totalmente. Primero, porque el supuesto de una dilución homogénea de la muestra en el caso de los suelos es irreal, ya que nunca se logra alcanzar dicha condición; segundo, debido a que los organismos están estrechamente unidos a las partículas del suelo, no se puede lograr una dilución representativa de todas las especies; y tercero, las condiciones del medio de cultivo general, no aseguran el crecimiento de todos los microorganismos presentes en la muestra de suelo, ya que las condiciones aeróbicas, así como las concentraciones de los substratos, no son las óptimas para todas las comunidades microbianas.

CONCLUSIONES Se logró obtener un cepario de 100 cepas amilolíticas, de las cuales 9 presentaron mayor actividad amilolítica y pertenecen a los géneros Bacillus sp , Clostridium sp y Kurthia sp. Se recuperaron también tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y Brevibacterium sp. con actividad celulolítica, lo cuales degradaron la materia orgánica a las 36 horas. La capacidad lipolítica no pudo ser detectada en los microorganismos aislados. La capacidad de síntesis de melanina se encontró en las bacterias: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Streptomyces antibioticus, en el helminto: Fasciola gigantita y en los hongos: Aspergillus niger, Candida albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Penicillium marneffei. Se ha encontrado que los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicóticos como Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y Exophiala dermatitidis , resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei resistente a seis antimicóticos; mientras que las bacterias, protozoos y helmintos, productores de melanina, encontrados mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente Los microorganismos que se lograron aislar del suelo de la granja FAZ-UNP no causan ningún peligro al medio ambiente, ni a los seres humanos y animales. Estos microbios benéficos consumen las sustancias que causan la putrefacción, malos olores y enfermedades, eliminando la mayoría de microbios patógenos por medio de la exclusión competitiva. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Chunga, J. (2001). Microbiología de alimentos. Manual de Laboratorio. Universidad Nacional de Piura. Facultad de Ingeniería Pesquera. Piura. Perú. 150 pp. García, A. 2005. Microbiología del suelo. Universidad de Extremadura. Departamento de Biología y producción de los Vegetales área de edafología y química agrícola. Disponible en: http://www.unex.es/edafo/ECAP/ECAL6Programa.htm Gonzáles, L; Orduña O y Ortiz L. 2005. Análisis del suelo. Centro Universitario Anglo Mexicano de Morelos. Holt, E. (1994). Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore. p .787

Insam, H. (2001). Developments in soil microbiology since the mid 1960. Geoderma., 100: 389-402. Pedroza, A; Poutou, R; Alvarez, N. (1997). Universitas Scientiarum. 2. 130-134. Sánchez, C; Mejia, C; Figueroa, C; Esquivia, M; Agudelo, L; Zapata N. y Gómez M.2005. Estudio de cepas nativas amilolíticas. Revista de la Facultad de Química Farmacéutica. ISSN 0121-4004. Vol 12, Nº 2. Universidad de Antioquía. Medellín. Colombia. Pág. 21-28. Sullivan, P. 2007. El Manejo Sostenible de Suelos. Especialista Agrícola. ATTRA (Servicio Nacional de Información de la Agricultura Sostenible). Extraído de www.attra.ncat.org. Inglés: © NCAT 2004.Español: © NCAT 2007.

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