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Guia de Laboratorio 1

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MicroB.

YULY JAZMIN SANCHEZ URAZAN DOCENTE MICROBIOLOGIA

TALLER DE BIOSEGURIDAD EN EL LABOTARIO DE MICROBIOLOGIA
FIGURA

1.

SÍMBOLO INTERNACIONAL DE PELIGRO BIOLÓGICO

SESIÓN ACTIVADORA

En los laboratorios destinados a trabajos microbiológicos deben seguirse normas de seguridad e higiene en que garanticen la protección contra infecciones del personal que labora en ellos, así como su extensión a la comunidad y al medio ambiente y que además aseguren la calidad de las técnicas y la confiabilidad de los resultados.

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1. ¿En qué consisten las cabinas de seguridad?:

SESIÓN DE CONSTRUCCIÓN TEÓRICA Teniendo en cuenta la patogenicidad de los microorganismos presentes en las muestras procesadas en el laboratorio, el Centro de Control de Enfermedades (CDE), y el Instituto Nacional de Salud han establecido 4 niveles de seguridad biológica y determinado normas específicas para el trabajo en cada uno de ellos. En el nivel 1 se trabaja con microorganismos no patógenos bien conocidos y con patógenos oportunistas, como los estudiados en laboratorios de fundamentos de microbiología. En el nivel 2 se trabaja con microorganismos y muestras con un potencial de riesgo que va de moderado a alto, como los estudiados en laboratorios de enseñanza, en diagnóstico microbiológico, y laboratorios de microbiología en un centro de atención primaria. En el nivel 3 con microorganismos y muestras de alto riesgo, como los estudiados en laboratorios de diagnóstico especializado. En el nivel 4 con microorganismos de altísimo riesgo o que son exóticos en el país y requieren máxima seguridad. Los especímenes estudiados contienen un número relativamente pequeño de microorganismos oportunistas o francamente patógenos, los cuales se cultivan para obtener poblaciones millones de veces mayores que la de la muestra original; por consiguiente, el microbiólogo está expuesto permanentemente a graves contaminaciones, al no cumplir con las normas de bioseguridad establecidas.

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL PRIMER NIVEL En este nivel se trabaja con microorganismos no patógenos o patógenos oportunistas, se cumplirán las siguientes normas: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Utilizar bata y gorro. Trabajar con la puerta del laboratorio cerrada No comer, beber, masticar chicle, ni fumar. Mantener el puesto de trabajo sólo con el material necesario. Trabajar cerca al mechero prendido. No poner ningún elemento de trabajo en contacto con el cuerpo. Evitar al máximo transitar por el laboratorio. Evitar la formación de aerosoles.

9. Descartar el material contaminado en las bolsas o recipientes destinados para tal fin. 10. Esterilizar el material contaminado antes de desecharlo. Pipetear aspirando con dispositivos adecuados y nunca con la boca directamente 11. Evitar el uso de joyas durante el trabajo. 12. Informar inmediatamente cualquier accidente como cortaduras y quemaduras. En caso de rompimiento de tubos con cultivos microbianos, cubrir el tubo con hipoclorito de sodio al 2% o fenol al 5%, tapar con una hoja de papel periódico y dejar sedimentar los aerosoles durante media hora, luego recoger el material, envolverlo en papel, y llevarlo a esterilización antes de descartarlo. 13. Lavar las manos antes de salir del laboratorio. 14. No deambular con la bata de trabajo fuera del laboratorio. 15. Lavar la bata y gorro independiente de otra ropa. 16. Trapear el piso del laboratorio con un detergente, no barrer en seco, para evitar dispersar en el ambiente los microorganismos sedimentados.

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SESIÓN DE CONSOLIDACIÓN Registre los datos solicitados en la siguiente tabla: TABLA! . NIVELES DE BIOSEGURIDAD. Nivel de seguridad Biologica Tipo de Laboratorio Microorganismos procesados

2

3

4

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FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA Diga si en el nivel de seguridad con el que se trabaja en la asignatura de fundamentos de microbiología se deben cumplir las siguientes normas y porqué. Uso de: 1. Batas abiertas en la espalda.

2.

Gorro y guantes.

3.

Cabinas de seguridad I, II o III.

4.

Tapabocas

5.

Mascarillas rígidas

6.

Filtros HEPA

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NORMAS DE TRABAJO EN EL LABOTARIO DE MICROBIOLOGIA

INTRODUCCIÓN Para trabajar en microbiología se deben seguir cuidadosamente las normas de seguridad biológica, poner en práctica los conceptos teóricos y concentrar la atención en los procesos realizados, para obtener resultados confiables y evitar accidentes microbiológicos. Antes de comenzar el trabajo se debe tener en cuenta lo siguiente: 1. Desinfectar con un detergente el área de trabajo.

2. Poner una hoja de papel en el área desinfectada, sobre la cual se ubica el mechero y la gradilla con los elementos de trabajo necesarios. La hoja se descarta al terminar el trabajo en la bolsa establecida para material contaminado. 3. Prender el mechero antes de comenzar a trabajar. Al utilizar el asa para siembras, debe calentarse el alambre de ferroniquel en toda su extensión al igual que la base del mango, a la llama del mechero hasta que se ponga roja, este proceso debe realizarse antes y después del uso; el flameado o proceso de esterilización por incineración destruye cualquier forma de vida sobre la superficie del asa o de las agujas de disección (Véase figura 2.1).
FIGURA 2.1 ESTERILIZACIÓN DEL ASA.

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1. Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapón en la mano derecha sostenido entre el dedo meñique y la palma de la mano, cerca a la llama del mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo índice y el pulgar (Véase figura 2.2 ).
FIGURA 2.2 MANEJO DE TUBOS.

Del correcto manejo de los tubos depende el éxito de los cultivos y por consiguiente de los resultados microbiológicos. Obsérvese cómo se sostiene el tapón del tubo destapado, entre el dedo meñique y la palma de la mano derecha, realizando el trabajo cerca de la llama del mechero. 2. Flamear la boca de los tubos después de quitarles el tapón y antes de volverlos a tapar para evitar la formación de aerosoles o la contaminación del contenido del tubo con bacterias del medio ambiente. (Véase figura 2.3).
FIGURA 2.3 MÉTODO CORRECTO DE SOSTENER LOS TUBOS MIENTRAS SE HACE UNA RESIEMBRA O PASE BACTERIANO.

3. Destapar las cajas de Petri manteniendo la base y la tapa simultáneamente en la mano izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero. Para tener esta posibilidad la caja debe estar sobre la mesa con el medio hacia arriba, esta se debe coger con la mano izquierda y voltear para destaparla con el dedo pulgar de la misma mano (Véase figura 2.4).

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FIGURA

2.4

MANEJO DE CAJAS DE PETRI.

4. Los bajalenguas y escobillones se deben quemar en la llama del mechero, dejar enfriar y descartar. Si con ellos se han procesado muestras de tuberculosis, antes de quemarlos se deben sumergir en un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 2% y arena, para evitar la formación de aerosoles y posibles contaminaciones. 5. Todo el material que se use en microbiología debe estar libre de toda forma de vida, es decir estéril. 6. Las láminas deben estar -limpias y desengrasadas (Véase detalles en limpieza de cristalería. Lab. 4). 7. El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora. Las cajas de Petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las superficies de los cultivos (Véase figura 2.5).
FIGURA 2.5 MARCACIÓN DE CAJAS DE PETRI.

En este primer laboratorio se asignará el sitio permanente de trabajo, el microscopio y se revisará el siguiente material que fue solicitado ocho dias antes en la plenaria: 1 lonchera para guardar el material 10 láminas 10 laminillas 1 caja de colores 1 sobre de papel para lentes

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1 rollo de cinta de enmascarar 1 asa recta y 1 con argolla 2 agujas de disección 1 tijera 1 pinza 6 frascos plásticos marcados así: cristal violeta, lugol, alcohol acetona, fucsina de Gram, azul de metileno y Wayson, puestos dentro de una bolsa marcada con el nombre del alumno 10 tubos de 13 x 100 con tapa de rosca 1 lupa grande 1 frasco de jabón líquido y 1 toalla de manos 1 caja de fósforos 1 mechero de alcohol - 10 palillos Durante el trabajo de laboratorio los alumnos usarán bata blanca, totalmente apuntada y un gorro que cubra todo el cabello. Llevarán un frasco de boca ancha con hipoclorito de sodio (decol) para descartar las láminas utilizadas en el laboratorio, las cuales permanecerán allí durante la noche y luego serán lavadas con un detergente líquido para ser reutilizadas. OBJETIVOS 1. Aplicar las normas de bioseguridad establecidas en el laboratorio anterior. 2. Practicar el manejo de material empleado en microbiología.

MATERIAL 2 1 1 1 tubos de ensayo con agua, tapados con algodón en rama asa con argolla caja de Petri hoja de papel blanco

PROCEDIMIENTO 1. Practicar el proceso de esterilización del asa. 2. Hacer pases de una muestra de un tubo a otro. 3. Hacer pases de un medio líquido a una caja de Petri 4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un círculo de papel de 8 cms, para colocarlo en el fondo de la caja de Petri (Véase figura 2.6)

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FIGURA 2.6 TÉCNICA DE AISLAMIENTO DE COLONIAS.

5. Practicar el manejo de la caja de Petri, realizando movimientos de siembra, deslizando el asa sobre las líneas dibujadas en la hoja, colocada ésta en el fondo de la caja de Petri. CUESTIONARIO 1. ¿Qué se entiende por resiembra o pase bacteriano?

2. ¿Cómo se regula el calor de la llama del mechero Bunsen? ¿Cuál es la llama ideal para trabajar y por qué?

3.

¿Cuál es la utilidad del asa recta y curva?

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4.

¿Qué

características tiene el algodón utilizado

en microbiología?

5. ¿Qué características debe tener el vidrio con el cual se elabora el material utilizado en microbiología?

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PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL MICROBIOLÓGICO
INTRODUCCIÓN Para trabajar en microbiología, el material que se utiliza debe estar completamente libre de células microbianas vivas, por lo tanto éste debe ser lavado rigurosamente con detergentes, enjuagado repetidamente, secado, envuelto en papel kraft y tapado el orificio de entrada de los recipientes con algodón en rama para luego ser sometido a esterilización, de acuerdo con las características de cada elemento. Hay varios métodos de esterilización, a saber: Calor Seco. Este método utiliza el horno eléctrico a temperatura de 160°C durante 1 a 2 horas (Véase figura 4.1)
FIGURA 4.1 UN TIPO DE HORNO DE ESTERILIZACIÓN PARA MICROBIOLOGÍA

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Calor húmedo. Se emplea el autoclave, a temperatura de 121°C. 15 libras/ pulgada2 de presión, durante 15 a 30 minutos (Véase figura 4.2). Realizar el dibujo del autoclave, identificando cada una de sus partes.
FIGURA 4.2. AUTOCLAVE UTILIZADA EN MICROBIOLOGÍA.

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Esterilización en frío. Utilizando óxido de etileno, formaldehído o peróxido de hidrógeno, en cámaras especiales. (Véase figura 4.3).
FIGURA 4.3. AUTOCLAVE PARA ÓXIDO DE ETILENO, DEBAJO DE LA PUERTA DE ACERO SE OBSERVAN LOS RECIPIENTES PARA EL GAS Y UNA ENTRADA DE AGUA PARA MEZCLARSE CON EL GAS ANTES DE INGRESAR A LA CÁMARA DEL AUTOCLAVE.

Radiaciones ionizantes. Son rayos gamma provenientes de una fuente de cobalto 68 o cesio 139. Rayos catódicos. Provenientes de generadores y aceleradores de electrones, Rayos X. Mortales para todas las células. Son muy utilizados en la industria en artículos que no soportan calor aunque son radiaciones costosas, en especial para los laboratorios clínicos. Luz ultravioleta. Es bactericida desde la longitud de onda de 333 nm, aumentando su efectividad a longitudes menores. Se utiliza frecuentemente para reducir el número de bacterias aerotransportadas en quirófanos, bioterios y laboratorios, donde se maneja material altamente infeccioso. En material de laboratorio es poco efectiva debido a su poca penetrabilidad.

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FILTRACION Este método emplea tres tipos de filtros. Filtro de profundidad. Consiste en placas de papel, asbesto, o fibra de vidrio, cuyas fibras se superponen y en ellas quedan atrapadas las partículas. Filtros de membrana. Elaborados especialmente de acetato o nitrato de celulosa, conocidos como filtros Millipore. Pueden obtenerse con dimensiones de poros muy diversos, que van desde 0.45 hasta 0.01 mieras. Las membranas porosas se colocan dentro del recipiente, en el cual se pone el líquido que se va a esterilizar y éste pasa a través del filtro, recogiéndose en una ñola con presión negativa para acelerar el paso del líquido a través del filtro (Véase figura 4.3).
FIGURA 4.3 FILTROS DE MEMBRANA

Filtros de huella de nucleación. Elaborados con delgadas películas de policarbonato de 10 (i de espesor, tratadas con radiación nuclear y después grabadas con una sustancia química. La radiación causa daños localizados en la película y la sustancia grabadora amplía estos sitios causando agujeros. El tamaño de estos se puede graduar dependiendo del tiempo que se deja actuar el grabado y de la fuerza de la solución de grabado. Esos filtros son empleados especialmente en microscopía electrónica. OBJETIVOS 1. Hacer el reconocimiento de los principales elementos utilizados en microbiología. 2. Preparar para esterilización el material empleado en microbiología. 3. Realizar los procesos de esterilización

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MATERIALES 1 asa bacteriológica 1 caja de Petri 1 balón 1 fióla tubo de ensayo de 13 x 100, 16 x 150, Khan pipeta de 5 mi. y 1 mi. 1elemento de caucho o plástico Escobillones 2 bajalenguas 1 elemento de tela gasa para elaborar tapones piola algodón en rama 1 lámpara de luz ultravioleta 1 autoclave 1 equipo de filtración PROCEDIMIENTO 1. DISCUSIÓN SOBRE LIMPIEZA Y LAVADO DEL MATERIAL. El éxito en el diagnóstico microbiológico y la confiabilidad de los resultados dependen, en gran parte, del proceso de lavado y esterilización del material utilizado, por consiguiente es importante seguir las recomendaciones establecidas para este propósito. Material de vidrio nuevo. Los recipientes de vidrio que no se han utilizado anteriormente son ligeramente alcalinos. Para neutralizarlos se deben sumergir en una solución al 2% de ácido clorhídrico, durante 24 horas, después se enjuagan abudantemente con agua del chorro y luego con agua desmineralizada, para, finalmente, secarlos y esterilizarlos. Material de vidrio usado. Cuando los recipientes de vidrio contienen medios de cultivo contaminados se deben esterilizar en autoclave con las tapas flojas, para que pueda circular el vapor dentro de los recipientes. - Dejar en remojo, en agua con detergente, de 2 a 3 horas, luego cepillar. - Enjuagar abundantemente con agua del chorro, dejar durante 30 minutos en un recipiente con agua limpia para quitar cualquier resto de detergente y hacer el enjuague final. Dejar las pipetas contaminadas en un recipiente con fenol o

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hipoclorito de sodio al 2%, durante 24 horas, y luego continuar con el procedimiento anterior. - Dejar escurrir todo el material con la boca hacia abajo en canastillas metálicas, luego secar ya sea en el horno a 60°C o en un sitio soleado cubierto con una tela delgada. - Taponar la boca de los recipientes con algodón en rama y envolver las cajas y las pipetas en papel kraft, para llevarlos al horno a esterilización. Láminas nuevas. Se deben dejar separadas dentro de un recipiente con agua y detergente durante 24 horas. • • • • Enjuagarlas con abundante agua del chorro. Sumergirlas en alcohol de 95% por unos minutos. Secarlas con un pedazo de tela de hilo que no suelte pelusa. Envolverlas en papel en grupos de diez.

Láminas sucias. Quitar el aceite de inmersión con papel periódico y si tienen laminilla, quitarlas con la punta de una aguja y ponerlas separadas dentro de un vaso de precipitado con hipoclorito de sodio al 2%. • Poner las láminas en remoj o en una solución con decol al 2% durante 24 horas. • Pasarlas a una solución con detergente y frotarlas con un algodón. • Coger cada lámina por los bordes y enjuagar abundantemente en el chorro y continuar con el proceso realizado a láminas nuevas. Laminillas usadas. Dejarlas en remojo de dos a tres horas en una solución de hipoclorito de sodio al 2%, moviéndolas suavemente de vez en cuando. • • • Enjuagarlas abundantemente en el mismo vaso, agitando suavemente. Escurrirlas colocándolas de punta sobre una pieza de gasa doblada. Conservarlas en una caja de Petri.

Precaución. La vidriería debe estar libre de restos de detergente para iniciar el proceso de esterilización. Material de plástico. Debe tenerse en cuenta la clase de plástico con el que están elaborados los elementos, para seguir el proceso de limpieza y esterilización adecuados. Las características del material plástico son las siguientes:

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Polipropileno ..................... translúcido Policarbonato .................... claro Poliestireno .................... claro Nitrato de celulosa ............ claro Politetrafluoroetileno (teflón). . . . opaco Polietileno ......................... opaco Nilón ................................ opaco El material translúcido y claro no se puede autoclavar ni someter a calor intenso. El material opaco, como las pipetas probetas, tubos de centrífuga y de ensayo, es reutilizable y tolera la esterilización. Otros pueden reutilizarse pero no autoclavarse como: frascos, vasos de precipitado, botellas para lavado y buretas, los cuales se emplean cuando no es necesaria la esterilidad. Los frascos de polietileno pueden utilizarse para guardar en el congelador a menos 50°C.

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Los plásticos descartables se esterilizan con óxido de etileno o con calor seco, según la termoestabilidad recomendada por la casa comercial. Los productos preempacados y preesterilizados permanecen estériles por lo menos un año mientras que el paquete permanezca sellado. 2. ELABORACIÓN DE TAPONES

Cortar, presionar y enrollar longitudinalmente la tira de algodón en rama. Los tapones para recipientes de boca grande como balones y fiólas se envuelven en gasa, haciendo un nudo para que tengan mayor consistencia, se cubren con papel krafty se sujetan con piola (Véase figura 4.4) FIGURA 4.4 ELABORACIÓN DE TAPONES.

3. ENVOLTURA DE MATERIAL Para envolver pipetas de 1 y 5 mi se recortan tiras de papel kraft, de 60 cm de largo x 5 cm de ancho y para pipetas de 10 mi, tiras de 60 cm de largo x 5 cm de ancho. Se comienza a envolver por la punta, la cual debe quedar totalmente protegida. La pipeta se va rotando sobre la tira de papel de manera que éste cubra firmemente la totalidad de la pipeta. Al finalizar, en la boquilla de la pipeta se enrolla el papel para evitar que se desenvuelva. Este mismo proceso se realiza con los baj alenguas y escobillones, cortando tiras de papel de 30 cm x 5 cm (Véase figura 4.5).

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FIGURA 4.5 PROCESO DE ENVOLTURA DE PIPETAS.

Las cajas de Petri, el material de caucho, el plástico, la tela y demás también deben ser envueltos en papel kraft antes de someterlos al proceso de esterilización, para protegerlos de la contaminación ambiental después de realizado el proceso. Llevar el material de vidrio al horno y el resto al autoclave, en las condiciones establecidas anteriormente. Precaución. El material de caucho y de plástico se debe llevar al autoclave a 110°C a 10 libras de presión y por 10 minutos. Los medios de cultivo que contienen polisacáridos se deben esterilizar por filtración. MANEJO DEL AUTOCLAVE El autoclave consta de dos recipientes metálicos, adaptado uno dentro del otro. • Llenar el recipiente externo con una tercera parte de agua, y en el interno, poner el material que se va a esterilizar en forma ordenada y sin sobrecargarlo para permitir el adecuado flujo de vapor. Cerrar el autoclave, teniendo presente que la flecha que se encuentra en el borde de la tapa coincida con la ranura que está en el borde de la olla externa y, además que el tubo conductor de vapor que está adherido a la tapa, encaje en la canal del recipiente interno. Ajustar las llaves que están en la tapa, por parejas, tomando una frente a la otra, para ejercer la misma fuerza y así permitir un cierre nivelado de la tapa evitando que se escape vapor y por consiguiente el fracaso del método de esterilización. Aplicar calor al autoclave, ya sea por medio del mechero o de electricidad. En este momento la válvula de escape debe estar abierta y permanecer así hasta cuando el vapor desaloje el aire, lo cual se percibe cuando se produce un chorro continuo de vapor a través de la válvula, seguidamente cerrar la válvula para permitir la concentración de vapor y el consecuente aumento de la temperatura y la presión, factores que deben ser controlados por medio del manómetro, que se encuentra ubicado sobre la tapa del autoclave.

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Las condiciones establecidas que garantizan una verdadera esterilización son: 121°C, presión de 15 libras/pulgada2 y tiempo de 15 a 30 minutos. • Cumplido el tiempo de esterilización, se deja enfriar el autoclave hasta cuando la aguja del manómetro descienda a cero. Precaución. Abrir la válvula de escape después de que la aguja del manómetro esté en cero para evitar quemaduras graves y derrame de medios dentro del autoclave CUESTIONARIO 1. ¿Cómo se esterilizan los medios que contienen antibióticos?

2. ¿Por qué la esterilización en horno requiere más tiempo que en el autoclave, siendo la temperatura del horno mayor?

3. ¿Qué utilidad tiene la esterilización en frío?

4. ¿Cómo se esterilizan elementos con filo como tijeras, cuchillas, etc.?

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