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LABORATORIO DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS PRÁCTICA # 8 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE COMPONENTES QUÍMICOS DE FRUTAS Y HORTALIZAS DETERMINACIÓN DE AZÚCARES INTRODUCCIÓN En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el sabor está dado básicamente por un balance entre azúcares y ácidos orgánicos. El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la gran variación en composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por los polisacáridos estructurales. Es importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metabólica, ya que durante la maduración se producen cambios intensos en donde los azúcares son los sustratos preferidos para la biosíntesis y suministro de energía pues son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido pirúvico, el cual a su vez, por descarboxilación oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando lugar a la formación de CO 2, H2O y ENERGÍA la cual queda disponible para la biosíntesis de otros componentes (otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, proteínas, nucleótidos azucarados,

La regla específica que relaciona la cantidad de radiación absorbida por una substancia con la concentración de esa misma substancia se llama Ley de Beer y se puede establecer como sigue: Log Io = abc I En donde: Io = Radiaciòn incidente o radiaciòn transmitida por el blanco. Esta técnica se llama Espectrofotometría. Benedict. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. por lo tanto. aunque algunos azúcares sean utilizados como sustratos para la actividad respiratoria. I = Radiaciòn transmitida por la muestra.). comparándola después con la radiación absorbida por un blanco. el contenido de azúcares aumenta casi invariablemente básicamente por hidrólisis que experimentan los polisacáridos. Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su determinación: Fehling. Se puede utilizar el espectrofotómetro para determinar la longitud de onda de la radiación necesaria para las determinaciones de la cantidad de azúcar en las muestras bajo estudio. los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag +. pero todos ellos se basan en el mismo principio: Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas. Hg+. Lane-Enyon. Durante todo este proceso.2/8 glucósidos.y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Cu2+ y Fe(CN)63. etc. Somogy. Log Io = absorbancia de la muestra . etc. dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes. Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma. Hagerdorn-Hensen..

. Papel sanitario blanco (proporcionado por el estudiante). y de la aplicaciòn de curvas estàndar utilizando el mètodo de Nelson y Ting. 1 tabla para cortar la fruta (proporcionada por el estudiante). 1 baño María simple. Fruta: 3 ejemplares por especie por equipo. c = concentraciòn de la muestra en las unidades apropiadas. OBJETIVOS El estudiante explicará por escrito el fundamento del método empleado para la determinación de azúcares en las muestras de frutas que se le asignarán. 2 círculos de 10 cm de diámetro de papel filtro Whatman # 1. 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml. I En esta práctica se empleará la técnica colorimétrica de Nelson y Ting para determinar glucosa. 1 cuchillo de cocina (proporcionado por el estudiante). 6 pipetas de 10 ml. 1 gradilla. El estudiante se concientizarà del concepto y los instrumentos de mediciòn utilizados en la espectrofotometrìa. Algodón o gasa . El estudiante relacionará los contenidos de azúcares determinados en las muestras de diversos frutos. 2 vasos de precipitados de 250 ml. 2 matraces volumétricos de 500 ml con tapón. 5 celdas de espectrofotómetro. MATERIAL 6 matraces volumétricos de 100 ml con tapón.3/8 I En donde: a = coeficiente de absorbancia (absortividad) – las unidades dependen de las unidades utilizadas para la determinaciòn de la concentraciòn. fructosa y sacarosa. En el caso del melón con 1 ejemplar basta (proporcionados por el estudiante). b = longitud de la celda usualmente en centìmetros. 2 matraces volumétricos de 250 ml con tapón. 2 pipetas de 1 ml. 2 pipetas de 5 ml. 1 embudo de vidrio.

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1 espectrofotómetro Spectronic 20'® a 515 nm. de H2O y añada una gota de H2SO4.3 g Na2CO3 · H2O).Disuelva 12. Reactivo de Nelson B. H2SO4 2N.5 g) ó Na2CO3 monohidratado. CuSO4 · 5H2O disuelto en 50 ml.5/8 EQUIPO: 1 extractor de jugos. MÉTODO PREPARACIÓN DE REACTIVOS Reactivo de Nelson A. NaOH 10N.Mezcle 25 ml del reactivo de Nelson A + 1. Tartrato de potasio (12.Disuelva 25 g de (NH4)6Mo7O24 · 4H2O (molibdato de amonio tetrahidratado) en 450 ml..1N.. HCl 1:1 (Vol/Vol). Solución de Arsenomolibdato (25 g). 1 licuadora o mortero. 1N y 0. Glucosa (300 µg/ml)..Elaborar una solución stock de glucosa en agua que contenga 300 µg/ml. REACTIVOS Solución alcalina de Ferricianuro. del reactivo de Nelson B.3 g de tartrato de potasio. de H2O.3 g). Na2SO4 anhidro disuelto en 35º ml de agua destilada. 12. (12.Disuelva 7. Preparar una serie de diluciones desde 300 hasta 30 µg/ml. de agua destilada.5 g de CuSO4 · 5H2O en 50 ml. 10 g de NaHCO 3 y 100 g de Na2SO4 anhidro en 350 ml de H2O y afore a 500 ml. . Reactivo Alcalino de Nelson. (14. 1 potenciómetro. Curva de la Glucosa..0 ml. Na2CO3 anhidro. Reactivo de Arsenomolibdato.5 g Na2CO3 anhidro (ó 14.3 g). 1 baño María con control de temperatura y agitación.. NaHCO3 (10 g).

Colóque los tubos en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos y enfríelos al chorro de agua fría. 75 y 30 µg/ml. aforados. 4.6/8 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES Prepare una serie de diluciones a partir de la solución stock de glucosa.Mezcle una vez más el contenido de los matraces.. del jugo diluido en un matraz volumétrico de 250 ml. 5.. Las concentraciones deberán ser de 300. 8. Utilice matraces volumétricos aforados con tapón y márquelos con la concentración correspondiente. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES 1. 9.. . y añada 5 ml.Enfríe los matraces inmediatamente bajo el chorro de agua fría. 4. Mezcle bien por un períodode 5 min. 2.... (para disolver el Cu 2O para reducir el aresnomolibdato).. Grafíque la absorbancia contra la concentración (µg/g).. con agua destilada y mezcle.Afore a 100 ml. 7. Mezcle. Añada 1 ml. 3. de arsenomolibdato. Pipetee 1 ml. de solución de ácido sulfúrico 2N. 2. 6. de arsenomolibdato. Utilice esta curva estándar para determinar la concentración de glucosa en las muestras de frutas. Lea la absorbancia a 520 nm. 150.Tome una celda del espectrofotómetro y transfiera ahí el contenido de cada matraz (uno por celda). del jugo diluido a un matraz volumétrico aforado de 100ml.Diluya el jugo de la muestra con agua destilada (1:49)..Neutralice el contenido de los matraces con 10 ml. 1. 7.Colóque los matraces en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.. de cada solución estándar de glucosa y agua destilada como blanco en tubos de ensayo con capacidad de 25 ml. 3... y afore con agua destilada. 5. 6.Transfiera 1 ml. 3. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCORES TOTALES 1. Añada 1 ml. con agua destilada. Afore a 25 ml.Mezcle los contenidos de los matraces suavemente hasta que no emanen más gases. de reactivo alcalino de Nelson.Extraiga el jugo de la fruta asignada mediante un extractor de jugos. de reactivo de ferricianuro.Colóque 5 ml. 2.Añada 4 ml.

c = Concentración de azúcares reductores en gramos/100 ml. D = Factor de dilución. En donde: S = Concentración total de azúcares reductores de la muestra en gramos/100 ml de jugo. DETERMINACIÓN DE FRUCTOSA NOTA: Esta determinación no se realizará en esta sesión de laboratorio). Ésta es ligeramente más alta que el contenido real de fructosa en la muestra.eg. La proporción de Kg a Kf ó Q se utiliza para el cálculo real de glucosa y fructosa de la muestra con las siguientes ecuaciones simultáneas: . la cual puede ser calculada usando las fórmulas adecuadas. la velocidad de oxidación de la glucosa es considerablemente menor que la de fructosa.7/8 10. No olvide ajustar el espectrofotómetro con agua destilada al principio. 55°C .con el reactivo alcalino de ferricianuro.. Los valores de Kf y Kg de fructosa y glucosa respectivamente. CÁLCULOS: A partir de la curva estándar se calcula el valor k para la determinación de azúcares reductores totales mediante la siguiente fórmula: k = c/a En donde: k = El factor por unidad de absorbancia o pendiente de la curva.A. de la forma descrita para K. Al calentar una mezcla de glucosa y fructosa a cierta temperatura . K = Pendiente promedio de la curva. El contenido total de azúcares reductores. S. excepto que se cambia la temperatura y el período de calentamiento a 55°C por 30 minutos.. Los valores k a diferentes concentraciones de azúcar se promedian y se designan como K. oxidados a 55°C se obtienen a partir de las curvas estándar de estos dos azúcares. excepto la muestra de jugo de fruta bajo estudio.Efectúe la lectura en el espectrofotómetro a 520 nm. a = Absorbancia de la solución a esa concentración. El blanco constará de todos los reactivos antes mencionados. de la muestra se calcula de la fórmula: S = K. El resultado obtenido es conocido como fructosa aparente. El procedimiento para la determinación de esta fructosa aparente es el mismo que para el cálculo de los azúcares reductores totales.D.

S = Porcentaje de azúcares reductores totales (Suma de G y F). y se sigue el procedimiento descrito para la determinación de azúcares reductores totales. y se añaden 10 ml.Se añaden 5 ml. se utiliza como una constante en los cálculos del valor real de la glucosa.95. L = Porcentaje aparente de fructosa.Se deja reposar esta mezcla durante 18 horas a temperatura ambiental.Se colocan 50ml.. .. 2. multiplicada por el factor de 0. procedimiento se describe a continuación: El 1.Se calcula la cantidad de sacarosa de la diferencia entre el contenido de azúcares reductores antes y después de la inversión. de ácido clorhídrico (1:1). La fructosa aparente L se calcula a partir de la fórmula S = K... sustituyendo L por S y K f por K.8/8 G+F=S G/Q + F = L En donde: G = Porcentaje de glucosa en la muestra.D. de solución de hidróxido de sodio 10N y los contenidos se ajustan a un pH de entre 5 y 7 con una solución de hidróxido de sodio 1N mediante el uso de un potenciómetro. Q = Proporción entre Kg y Kf (Kg/Kf) En una mezcla de glucosa y fructosa se asume que ambos azúcares presentes son fructosa. F = Porcentaje de fructosa en la muestra...L) X Q Q-1 El cociente q/(Q-1). 5.Los contenidos se transfieren a un matraz volumétrico aforado de 100ml y se afora con agua destilada. 6. 3. del jugo diluido en un vaso de precipitados de 150 ml. 4. Se obtiene la siguiente fórmula para el porcentaje de glucosa en la muestra: G = (S . DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES Y SACAROSA Nota: Esta determinación no se llevará a cabo en esta sesión de laboratorio) La sacarosa de la muestra es invertida con el ácido clorhídrico. El valor real de la fructosa se obtiene por diferencia.A.Se toma una alícuota de 1 ml de esta solución y se pipetea en un matraz volumétrico de 100 ml..

V. Ed. CUESTIONARIO: 1.O. Washington.¿Para qué se utiliza el cobre en el reactivo de Nelson? BIBLIOGRAFIA: A. Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous Determination of Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. S. Food Chem.C. 13 th.9/8 Elabore un reporte comparando los diversos valores obtenidos para cada especie de futas estudiadas en la sesión de laboratorio. Official Methods of Analysis. Ting..A. . 1980. 1956.¿Por qué la sacarosa no se considera como un azúcar reductor? 2. (ed). Horwitz W. Vol. 4(3) 263-266.A.. Agric.S. U.

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