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LABORATORIO DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS PRÁCTICA # 8 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE COMPONENTES QUÍMICOS DE FRUTAS Y HORTALIZAS DETERMINACIÓN DE AZÚCARES INTRODUCCIÓN En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el sabor está dado básicamente por un balance entre azúcares y ácidos orgánicos. El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la gran variación en composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por los polisacáridos estructurales. Es importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metabólica, ya que durante la maduración se producen cambios intensos en donde los azúcares son los sustratos preferidos para la biosíntesis y suministro de energía pues son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido pirúvico, el cual a su vez, por descarboxilación oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando lugar a la formación de CO 2, H2O y ENERGÍA la cual queda disponible para la biosíntesis de otros componentes (otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, proteínas, nucleótidos azucarados,

etc. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma. I = Radiaciòn transmitida por la muestra. por lo tanto. aunque algunos azúcares sean utilizados como sustratos para la actividad respiratoria. Durante todo este proceso. Lane-Enyon. comparándola después con la radiación absorbida por un blanco..2/8 glucósidos.). Hg+. Hagerdorn-Hensen. los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag +. Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su determinación: Fehling. Cu2+ y Fe(CN)63.y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes. Se puede utilizar el espectrofotómetro para determinar la longitud de onda de la radiación necesaria para las determinaciones de la cantidad de azúcar en las muestras bajo estudio. Esta técnica se llama Espectrofotometría. Benedict. La regla específica que relaciona la cantidad de radiación absorbida por una substancia con la concentración de esa misma substancia se llama Ley de Beer y se puede establecer como sigue: Log Io = abc I En donde: Io = Radiaciòn incidente o radiaciòn transmitida por el blanco. etc. Log Io = absorbancia de la muestra . el contenido de azúcares aumenta casi invariablemente básicamente por hidrólisis que experimentan los polisacáridos. Somogy. pero todos ellos se basan en el mismo principio: Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas.

2 pipetas de 1 ml. 6 pipetas de 10 ml. 1 gradilla. 2 círculos de 10 cm de diámetro de papel filtro Whatman # 1. 1 embudo de vidrio. c = concentraciòn de la muestra en las unidades apropiadas. El estudiante relacionará los contenidos de azúcares determinados en las muestras de diversos frutos. 1 cuchillo de cocina (proporcionado por el estudiante). 2 vasos de precipitados de 250 ml. 2 matraces volumétricos de 250 ml con tapón.3/8 I En donde: a = coeficiente de absorbancia (absortividad) – las unidades dependen de las unidades utilizadas para la determinaciòn de la concentraciòn. 2 matraces volumétricos de 500 ml con tapón. El estudiante se concientizarà del concepto y los instrumentos de mediciòn utilizados en la espectrofotometrìa. . 1 baño María simple. Fruta: 3 ejemplares por especie por equipo. MATERIAL 6 matraces volumétricos de 100 ml con tapón. Algodón o gasa . 1 tabla para cortar la fruta (proporcionada por el estudiante). Papel sanitario blanco (proporcionado por el estudiante). b = longitud de la celda usualmente en centìmetros. 5 celdas de espectrofotómetro. 2 pipetas de 5 ml. I En esta práctica se empleará la técnica colorimétrica de Nelson y Ting para determinar glucosa. y de la aplicaciòn de curvas estàndar utilizando el mètodo de Nelson y Ting. En el caso del melón con 1 ejemplar basta (proporcionados por el estudiante). 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml. OBJETIVOS El estudiante explicará por escrito el fundamento del método empleado para la determinación de azúcares en las muestras de frutas que se le asignarán. fructosa y sacarosa.

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10 g de NaHCO 3 y 100 g de Na2SO4 anhidro en 350 ml de H2O y afore a 500 ml. HCl 1:1 (Vol/Vol). (12. Preparar una serie de diluciones desde 300 hasta 30 µg/ml. Tartrato de potasio (12. 12.... 1 potenciómetro.Disuelva 12. (14. 1 espectrofotómetro Spectronic 20'® a 515 nm. Curva de la Glucosa.3 g). H2SO4 2N. de H2O.3 g). Reactivo Alcalino de Nelson.5 g) ó Na2CO3 monohidratado. Glucosa (300 µg/ml). de agua destilada.Disuelva 7. NaOH 10N.1N. NaHCO3 (10 g). Solución de Arsenomolibdato (25 g).5 g de CuSO4 · 5H2O en 50 ml..3 g de tartrato de potasio.. del reactivo de Nelson B. Na2CO3 anhidro.3 g Na2CO3 · H2O). .5/8 EQUIPO: 1 extractor de jugos. MÉTODO PREPARACIÓN DE REACTIVOS Reactivo de Nelson A.Mezcle 25 ml del reactivo de Nelson A + 1. CuSO4 · 5H2O disuelto en 50 ml. REACTIVOS Solución alcalina de Ferricianuro.Elaborar una solución stock de glucosa en agua que contenga 300 µg/ml. 1N y 0.Disuelva 25 g de (NH4)6Mo7O24 · 4H2O (molibdato de amonio tetrahidratado) en 450 ml. Reactivo de Arsenomolibdato. 1 baño María con control de temperatura y agitación. Na2SO4 anhidro disuelto en 35º ml de agua destilada. Reactivo de Nelson B. 1 licuadora o mortero. de H2O y añada una gota de H2SO4.0 ml.5 g Na2CO3 anhidro (ó 14.

Mezcle una vez más el contenido de los matraces. Pipetee 1 ml. Lea la absorbancia a 520 nm. del jugo diluido en un matraz volumétrico de 250 ml. con agua destilada. Grafíque la absorbancia contra la concentración (µg/g). PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCORES TOTALES 1.Enfríe los matraces inmediatamente bajo el chorro de agua fría. con agua destilada y mezcle. 5. 75 y 30 µg/ml. 7. 6.Diluya el jugo de la muestra con agua destilada (1:49).Neutralice el contenido de los matraces con 10 ml... 9.. Utilice matraces volumétricos aforados con tapón y márquelos con la concentración correspondiente. 2. 3. 2. aforados...Mezcle los contenidos de los matraces suavemente hasta que no emanen más gases. Afore a 25 ml. de reactivo de ferricianuro. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES 1. Utilice esta curva estándar para determinar la concentración de glucosa en las muestras de frutas. de cada solución estándar de glucosa y agua destilada como blanco en tubos de ensayo con capacidad de 25 ml..Extraiga el jugo de la fruta asignada mediante un extractor de jugos. 4. Las concentraciones deberán ser de 300. y añada 5 ml. 8. 150.Afore a 100 ml.Tome una celda del espectrofotómetro y transfiera ahí el contenido de cada matraz (uno por celda). 3. de reactivo alcalino de Nelson.. del jugo diluido a un matraz volumétrico aforado de 100ml.Añada 4 ml.Colóque 5 ml.Transfiera 1 ml. (para disolver el Cu 2O para reducir el aresnomolibdato). . de arsenomolibdato. Mezcle bien por un períodode 5 min. Colóque los tubos en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos y enfríelos al chorro de agua fría.Colóque los matraces en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.. 7. 3. de arsenomolibdato.6/8 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES Prepare una serie de diluciones a partir de la solución stock de glucosa. 1.. Añada 1 ml. de solución de ácido sulfúrico 2N... y afore con agua destilada.. Añada 1 ml. 5. 2. 6. Mezcle. 4.

55°C . K = Pendiente promedio de la curva. la velocidad de oxidación de la glucosa es considerablemente menor que la de fructosa. Los valores k a diferentes concentraciones de azúcar se promedian y se designan como K.7/8 10. de la muestra se calcula de la fórmula: S = K. oxidados a 55°C se obtienen a partir de las curvas estándar de estos dos azúcares. DETERMINACIÓN DE FRUCTOSA NOTA: Esta determinación no se realizará en esta sesión de laboratorio). El resultado obtenido es conocido como fructosa aparente.A. excepto la muestra de jugo de fruta bajo estudio.eg. c = Concentración de azúcares reductores en gramos/100 ml. No olvide ajustar el espectrofotómetro con agua destilada al principio. de la forma descrita para K. CÁLCULOS: A partir de la curva estándar se calcula el valor k para la determinación de azúcares reductores totales mediante la siguiente fórmula: k = c/a En donde: k = El factor por unidad de absorbancia o pendiente de la curva. La proporción de Kg a Kf ó Q se utiliza para el cálculo real de glucosa y fructosa de la muestra con las siguientes ecuaciones simultáneas: .. El procedimiento para la determinación de esta fructosa aparente es el mismo que para el cálculo de los azúcares reductores totales. la cual puede ser calculada usando las fórmulas adecuadas.. D = Factor de dilución.Efectúe la lectura en el espectrofotómetro a 520 nm. En donde: S = Concentración total de azúcares reductores de la muestra en gramos/100 ml de jugo. S. Al calentar una mezcla de glucosa y fructosa a cierta temperatura . Ésta es ligeramente más alta que el contenido real de fructosa en la muestra. excepto que se cambia la temperatura y el período de calentamiento a 55°C por 30 minutos. Los valores de Kf y Kg de fructosa y glucosa respectivamente.D. El blanco constará de todos los reactivos antes mencionados.con el reactivo alcalino de ferricianuro. a = Absorbancia de la solución a esa concentración. El contenido total de azúcares reductores.

D. de ácido clorhídrico (1:1). 4... F = Porcentaje de fructosa en la muestra..8/8 G+F=S G/Q + F = L En donde: G = Porcentaje de glucosa en la muestra. S = Porcentaje de azúcares reductores totales (Suma de G y F). 3.Se colocan 50ml.Los contenidos se transfieren a un matraz volumétrico aforado de 100ml y se afora con agua destilada. del jugo diluido en un vaso de precipitados de 150 ml.. Se obtiene la siguiente fórmula para el porcentaje de glucosa en la muestra: G = (S .Se añaden 5 ml. . DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES Y SACAROSA Nota: Esta determinación no se llevará a cabo en esta sesión de laboratorio) La sacarosa de la muestra es invertida con el ácido clorhídrico.. La fructosa aparente L se calcula a partir de la fórmula S = K.L) X Q Q-1 El cociente q/(Q-1)..95. Q = Proporción entre Kg y Kf (Kg/Kf) En una mezcla de glucosa y fructosa se asume que ambos azúcares presentes son fructosa. El valor real de la fructosa se obtiene por diferencia. multiplicada por el factor de 0. L = Porcentaje aparente de fructosa. 6. y se añaden 10 ml. se utiliza como una constante en los cálculos del valor real de la glucosa. de solución de hidróxido de sodio 10N y los contenidos se ajustan a un pH de entre 5 y 7 con una solución de hidróxido de sodio 1N mediante el uso de un potenciómetro. procedimiento se describe a continuación: El 1.A. sustituyendo L por S y K f por K.Se calcula la cantidad de sacarosa de la diferencia entre el contenido de azúcares reductores antes y después de la inversión. 2. y se sigue el procedimiento descrito para la determinación de azúcares reductores totales.Se deja reposar esta mezcla durante 18 horas a temperatura ambiental..Se toma una alícuota de 1 ml de esta solución y se pipetea en un matraz volumétrico de 100 ml. 5.

Horwitz W. Official Methods of Analysis. Ed. (ed).C. Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous Determination of Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices.S.9/8 Elabore un reporte comparando los diversos valores obtenidos para cada especie de futas estudiadas en la sesión de laboratorio. 13 th. CUESTIONARIO: 1. Vol. U.A. Food Chem. Washington. 4(3) 263-266.¿Para qué se utiliza el cobre en el reactivo de Nelson? BIBLIOGRAFIA: A. Agric. Ting.V. 1980.A. S. .¿Por qué la sacarosa no se considera como un azúcar reductor? 2..O.. 1956.