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Recuento de Bacterias

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RECUENTO DEL NÚMERO DE BACTERIAS T. de la Rubia y J.

Martínez
OBJETIVOS El alumno aprenderá a: 1. Utilizar correctamente pipetas y micropipetas decimales seriadas de una suspensión de bacterias preparando diluciones

2. Determinar la concentración bacterias viables (entendidas como unidades vormadoras de colonias) en una muestra

Contenido: I INTRODUCCIÓN

II MÉTODOS III RESULTADOS IV AUTOEVALUACIÓN

también se refieren como unidades formadoras de colonias UFC). (métodos de determinación del peso. Iañez 1. Se puede determinar a su vez el tamaño de las células pero tampoco distingue entre viables. que generalmente es directamente proporcional al número de células.I. El procedimiento es esencialmente el mismo que para la medida del crecimiento de las poblaciones de bacterias El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante métodos de medida de la masa total celular. 1. Encontrará información más completa sobre medidas del crecimiento de bacterias en los apuntes on line del Profesor D. muertas o partículas. Principales métodos de El número de bacterias de una muestra puede recuento del determinarse directamente por recuento del número total número bacterias de células o indirectamente por la estimación del número en una muestra más probable. de productos farmacéuticos o del medioambiente entre otros). 1. se requiere conocer el número de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad. a su paso por un orificio por donde fluye la corriente eléctrica. por filtración o por el recuento de viables en placa (Células capaces de dividirse sobre o dentro de un medio sólido. E.Recuento directo con contadores electrónicos . de la actividad del cultivo o métodos turbidimétricos) o por la determinación del número de células.2. Es un método rápido del número total de células de una muestra pero no distingue entre viables o no viables.1. de agua de bebida.Recuento directo de bacterias al microscopio Es una técnica para determinar o recontar el número total de organismos de una muestra: Se utilizan cámaras de recuento (Cámara de Petroff-Hauser) y visualización al microscopio. INTRODUCCIÓN En diversos estudios microbiológicos (como análisis de alimentos. Se utiliza el contador Coulter recuenta el número de células suspendidas en un líquido.

el filtro se coloca sobre un medio de cultivo sólido y se incuba.45 µm). Se utiliza con frecuencia para determinar el número de bacterias en agua. la inoculación de la dilución en medio de cultivo sólido y la incubación durante 24-48 horas a la temperatura apropiada y en placa son métodos de estimación de bacterias viables en término de unidades formadoras de colonias (UFCs). Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Implican la dilución seriada de la muestra en agua.Recuento en placa por siembra en superficie . 2. Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilución de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. Una vez filtrada la muestra. En este método todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. El recuento del número de colonias formadas sobre el filtro determina el número total de bacterias en la muestra filtrada.3. Recuento en filtros de membrana 2. Recuento en placa por siembra en profundidad. caldo o solución salina.1. Generalmente se utiliza esta técnica para el recuento de bacterias aerobias. Es un método generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar.220.2. Es un método útil cuando el número de bacterias presentes en la muestra es muy bajo.1. Consiste en añadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50ºC sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Estos métodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las bacterias viables presentes en una muestra. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. El número de unidades formadoras de colonias de una suspensión bacteriana puede determinarse mediante dos técnicas: 2. Métodos de recuento de bacterias viables en placa En este método el recuento se realiza por filtración de un volumen de la muestra a través de un filtro de membrana de tamaño adecuado para retener a las bacterias (0.

Puntas de pipetas estériles de 1 ml • • acero • Placa con alcohol Pipeta automática de 1ml Espátula de Driglasky de 1. Técnica de recuento en placa por siembra en superficie.……. MÉTODOS RECUENTO DEL NÚMERO DE BACTERIAS VIABLES MEDIANTE EL MÉTODO DE DILUCIÓN Y SIEMBRA EN PLACA • Cultivo de Escherichia coli de 24 horas en caldo de tripticasa soja (TSB) 6 placas de TSA 6 tubos de ensayo con 4. 10-2. Obtención de diluciones seriadas del cultivo. Marcar los 6 tubos de solución salina con las diluciones 10-1.9% estériles.Material necesario • • • 2.1.II.5 ml de solución salina 0. 2.10-6 .

5 ml del cultivo de E. . 2.Utilizando la pipeta de 1 ml con punta estéril. Retirar la punta y echarla al contenedor. Mezclar la suspensión durante unos segundos con un vortex Con una nueva punta de pipeta estéril. Retirar la punta y echarla al contenedor. transferir asépticamente 0. 10-6 (2 placas por dilución). transferir 0. Repetir el paso anterior hasta obtener la dilución 10-6.5 ml al siguiente tubo de dilución (dilución 10-2). Comprobar que la superficie de las placas está bien seca.2.Siembra en placa Marcar las placas con las tres últimas diluciones 10-4.5 ml. 10-5. coli a un primer tubo de solución salina estéril de 4. (dilución 10-1).

escurrir el exceso de alcohol y pasar por la llama del mechero. RESULTADOS 2. Cada colonia representa a una unidad formadora de colonia (UFC).Cambiar el volumen de la pipeta a 0.Recuento de las colonias Tras la incubación. III. Sembrar la dilución sobre la superficie de la placa rotando y esparciendo la muestra en todas las direcciones. Incubar las placas en posición invertida a 37ºC durante 24-48 horas. Usualmente una UFC se corresponde con una célula viable. Tomar una punta de pipeta estéril y transferir 0.1 ml de cada una de las tres últimas diluciones a placas de TSA Esterilizar la espátula de Driglasky impregnándola en alcohol.1 ml. . se observan las colonias bacterianas sobre la superficie del agar.3.

Resultados 10-1 . 2.Seleccionar las placas de la dilución que haya producido un número de colonias comprendido entre 30-300 y contar el número de colonias presentes.4. En el ejemplo: 125 colonias UFC/ml= 125 x10 x10 = 125 x 10 6 7 El resultado debe expresarse como UFC/ml para ello se multiplica el promedio del nº de colonias obtenido por el inverso de la dilución final de la muestra.

10-2 10-3 10-4 .

10-5 10-6 .

Tras la incubación.5 x 106 b. los resultados del recuento de colonias fue el siguiente: Dilución 10-4 10-5 10-6 10-7 Promedio del Nº de colonias > 1000 660 250 3 ¿Cuál es el recuento de UFC/ml de la muestra? a.1 ml de una muestra a 99.IV.1 ml de cada dilución en placas de agar nutritivo que se incuban a 37ºC durante 24 horas. Si transferimos 0. Se siembran 0. 2.9 ml de solución salina estéril. 25 x 107 c. ¿Cuál es la dilución obtenida? a. 10-3 2. 10-1 b. 10-2 c. ¿Cual es el número de bacterias por ml del siguiente cultivo? . De un cultivo de Escherichia coli se hacen diluciones seriadas añadiendo 10 ml en 90 ml de solución salina estéril. 25 x 108 3. AUTOEVALUACIÓN: 1.

3 x 10 c.a. 480 x 10 5 b. 63 x 10 8 6 Los números corresponden a volúmenes o a número de colonias crecidas en cada placa . 6.

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