Prctica de La materia de Bioqumica I, tercer semestres de La Carrera de ing. Bioqumica, semestre 2009-2010. Practica 2.

Enzimas: Catalasa y alfa-amilasa

Dra. America Pech y Ak

Enzimas: Catalasa y alfa-amilasa

Objetivos General. Que el alumno conozca, comprenda y pueda observa y valorar la accin de las enzimas en los alimentos y pueda comprender cada uno de los conceptos relacionados con las enzimas como son la catalasa y alfa amilasa en las practicas a realizar en diferentes alimentos y le permita alumno comprender el proceso para poder aplicarlo en la adquisicin de conocimientos bsicos y en los procesos industriales e investigacin particulares 1. Observar la presencia de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales. 2. Comprobar la accin de la temperatura sobre la actividad de las enzimas. 3. Comprobar la accin hidroltica de la amilasa en los alimentos.

Las enzimas son protenas que sirven como catalizadores. Ellas son las encargadas de regulas la catlisis, incrementando o disminuyendo la velocidad de las reacciones qumicas, una enzima acta sobre un sustrato especfico, son sustancias que participan sin consumirse durante la reaccin, son vitales para el funcionamiento del cuerpo en la digestin, ellas son las que hacen posible los procesos que normalmente podran no ocurrir solo a temperaturas altas. Las enzimas son protenas que trabajan agrupadas con otro componentes noprotenicos llamados coenzimas. Los cofactores pueden ser: Grupos orgnicos que son permanentemente unidos a la enzima (grupo prosttico), Cationes iones metlicos cargados positivos (activadores), los cuales se unen temporalmente al sitio activo de la enzima dando una intensa carga positiva a la protena de la enzima, una molcula orgnica, generalmente vitaminas o hecho de vitaminas (coenzimas), los cuales no permanecen unidos a la molcula de la enzima, pero se combina con el complejo enzima-sustrato temporalmente. En las reacciones qumicas las sustancias conocidas como reactivos actan con otros para formar nuevas sustancias, llamadas productos. La energa es un componente muy importante en la reaccin qumica, por que sirven como un

almacn de energa, y requieren de una energa de activacin para llevarse a cabo. Muchas de los procesos que se llevan a cabo en el cuerpo humano normalmente requieren temperaturas muy altas, temperaturas que no son sostenibles en para la vida humana. Las protenas en enzimas son generalmente globulares. Los enlaces intra e intermoleculares que mantienen a las estructuras secundarias y terciarias son modificadas o desnaturalizadas por la temperatura y cambios por el pH . este efecto cambia la forma y la actividad del sitio cataltico de una enzima, los cuales son muy sensibles a el pH y la temperatura. La catalasa es una enzima comn encontrada en los organismos vivos, donde funcionan como catalizadores en las reacciones de descomposicin del peroxido de hidrgeno(H2O2) en agua y oxigeno. La catalasa tiene uno de los recambios mas altos de todas las enzimas. Una molcula de catalasa podra convertir millones de molculas de peroxido de hidrgeno a agua y oxigeno por segundos. La catalasa es un tetramero de cuatro cadenas polipeptidicas, cada una larga cadena con 500 aminocidos. contiene cuatro grupos hemo porfirinicos (hierro) que llevan a la enzima a reaccionar con el peroxido de hidrgeno. El pH optimo para la catalasa es aproximadamente de 7, la temperatura varia por especie

La reaccin de descomposicin del peroxido de hidrgeno 2 H2O2 2 H2O + O2 H2O2 + Fe(III)-E H2O + O=Fe(IV)-E(.+) H2O2 + O=Fe(IV)-E(.+) H2O + Fe(III)-E + O2
Material Tubos de ensayo

Ay B Bistur

Bao Mara

Material biolgico: los alumnos de cada equipo los proporcionan Hgado de pollo, cerdo, res Frutas y verduras, tomate, manzanas , peras , etc La catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos animales y vegetales. La funcin de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molcula txica que es el perxido de hidrgeno, H2O2 (agua oxigenada).

Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y oxgeno, por lo que se soluciona problema. La reaccin de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente:

Reaccin A

La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patgenas son anaerobias (no pueden vivir con oxgeno), mueren con el desprendimiento de oxgeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos acta sobre el agua oxigenada

CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES La catalasa (perxido de hidrgeno: perxido de hidrgeno oxidorreductasa, EC 1.11.1.6) es una de las enzimas ms abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente distribuida en el organismo humano, aunque su actividad vara en dependencia del tejido; sta resulta ms elevada en el hgado y los riones, ms baja en el tejido conectivo y los epitelios, y prcticamente nula en el tejido nervioso. A nivel celular se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos, donde se encuentra en el citosol.2 Esta enzima es una metaloprotena tetramrica, cuyo peso molecular se encuentra en el rango de 210-280 kD. Consta de 4 subunidades idnticas que se mantienen unidas por interacciones no covalentes. Cada subunidad contiene un grupo prosttico de protoporfirina IX y el contenido protohmico y el de hierro representan un 1,1 % y 0,09 % respectivamente del peso molecular total de la enzima.3 En algunas especies la CAT contiene molculas de nicotinamn adenn dinucletido fosfatado en su forma reducida (NADPH) ligadas estrechamente a la enzima; as se ha demostrado que la CAT humana y la de res estn ligadas a 4 molculas de NADPH, 1 en cada subunidad y que no existe interaccin directa entre el grupo hemo y el NADPH.4 En la figura aparece la representacin de una subunidad de la enzima. El NADPH unido a la enzima no est involucrado en su actividad cataltica o peroxidativa. Esta molcula puede intervenir en la prevencin y reversin parcial de la inactivacin de la CAT por su propio sustrato txico y estabiliza a la enzima por tener un efecto alostrico sobre su conformacin. Adems, la CAT constituye un reservorio de NADPH, lo cual juega un importante papel durante el estrs oxidativo. FUNCION ENZIMATICA La CAT como parte del sistema antioxidante est involucrada en la destruccin del H2O2 generado durante el metabolismo celular. Esta enzima se caracteriza por su alta capacidad de reaccin pero relativamente poca afinidad por el sustrato. Presenta 2 funciones: la cataltica y la peroxidativa. Ambas se pueden representar por la ecuacin:

H2O2 + H2R

2H2O + R

sustrato donador CAT La reaccin general entraa la reduccin del sustrato tomando los tomos de hidrgeno aportados por el donador, y los productos finales seran el sustrato reducido y el donador oxidado. En la funcin cataltica, el donador es otra molcula de H2O2. Esta funcin slo puede ser realizada por la enzima en su forma tetramrica.6 H2O2 + H2O2 2H2O + +O2

En la reaccin peroxidativa la enzima puede utilizar como donadores de hidrgeno al metanol, etanol, cido frmico, fenol y formaldehdo. 7 Esta funcin se puede realizar con monmeros, dmeros y tetrmeros.6 La actividad de la CAT puede ser inhibida por el cianuro, la azida, el sulfuro, la hidroxilamina, el paracetamol, la bleomicina, la adriamicina, la benzidina y el paraquat.

Materiales y Mtodos En esta practica vamos a demostrar la existencia de la catalasa en cada una de las muestras. 1. Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hgado. 2. Aadir 5 mililitros de agua oxigenada. 3. Se observar un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxgeno. Figura 1 (Observa la reaccin A) Figura 1 Desnaturalizacin de la catalasa Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de protenas, que es la desnaturalizacin. Ya que la catalasa qumicamente es una protena, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Puedes recordarlo en la prctica de protenas. Al perder la estructura terciaria, perder tambin la funcin y como

consecuencia su funcin cataltica, por lo que no podr descomponer el agua oxigenada y no se observar ningn tipo de reaccin cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos.

1. Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hgado. 2. Aadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos. 3. Despus de este tiempo, retirar el agua sobrante. 4. Aadir el agua oxigenada. 5. Observar el resultado. Figura 2

Figura 2

Cuestionario

1.En que alimentos se encuentra la enzima catalasa? 2.En que forma se encuentra la catalasa en cada unos de los alimentos en los que se encuentra en mayor cantidad ? 3 En que unidades se reportan? 4. Cual es la temperatura optima de la catalasa? 6. Cual es el pH optimo de la catalasa? 7. a que temperatura se desnaturaliza la catalasa? 8. en que alimentos se encuentran en mayor cantidad y como se encuentran ?

Amilasa
La amilasa, denominada tambin ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la funcin de digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples, se produce principalmente en las glndulas salivares (sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene un pH de 7. Cuando uno de estas glndulas se inflama aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautiz en un principio con el nombre de diastasa. -Amilasa (Nombre glucogenasa) alternativos: 1,4--D-glucano-glucanohidrolasa;

Las -amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en maltotriosa y maltosa desde la amilosa o maltosa, glucosa y dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.0. En fisiologa humana tanto la procedente de la saliva como la pancretica son -Amilasas. Puede encontrarse en algunas plantas, hongos y bacterias.

Hidrlisis del almidn

Ver la actividad de la enzima, la amilasa o ptialina, presente en la saliva. Esta enzima acta sobre el polisacrido almidn, hidrolizando el enlace Oglicosdico, por lo que el almidn se terminar por transformar en unidades de glucosa. Es importante que recuerdes las reacciones caractersticas de glcidos para comprenderla prctica. Las reacciones que nos sirven para identificar polisacridos (almidn) y las que nos permiten identificar monosacridos (glucosa). Mtodo

1. Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1 al 4. 2. Aadir en cada tubo 5 mililitros de una solucin diluida de almidn. 3. A los tubos 3 y 4 aadir una pequea cantidad de saliva. Figura 3 Para ayudarte y formar ms saliva, piensa en un limn o en algo que te apetezca mucho comer... As favoreces que formes ms saliva. Figura 3

En el tubo 1, haz la Reaccin de Fehling. Figura 4 En el tubo 2, realiza la Reaccin de Lugol. Figura 5 Los resultados son los esperados para un polisacrido como el almidn.

Figura 4

Figura 5

Figura 7 Figura 6

Figura 8

Los tubos 3 y 4 que contienen el almidn, al que le hemos echado la saliva, ponerlos en un vaso de precipitados al bao Mara, controlando la temperatura del agua para que no hierva, ya que lo que intentamos, es que la enzima de la saliva trabaje a unos 37: C. Dejarlo unos 15 minutos Figura 6 .

A continuacin realizar las siguientes reacciones: En el tubo nmero 3, realizar la Reaccin de Fehling. Figura 7. En el tubo nmero 4, realizar la Prueba del Lugol. Figura 8 El resultado positivo obtenido en el tubo de ensayo 3, nos dice que no hay ya almidn, porque la amilasa de la saliva ha hidrolizado el almidn transformndolo en glucosa, por eso la reaccin de Fehling es ahora positiva.

De una manera similar, podemos interpretar el resultado del tubo de ensayo 4, ahora nos da la reaccin de polisacridos negativa, ya que el almidn( polisacrido) se ha hidrolizado.

Cuestionario De que manera acta la catalasa? y por que libera oxigeno? La catalasa de las muestras estn en las mismas concentraciones? Cual es la diferencia entre las catalasas animales y vegetales de las muestras que trabajaron?

Cuales es la reaccin de la alfa amilasa sobre los componentes de los materiales empleados? Es una enzima especfica para almidones? Que tipo de polimeros contienen las muestras que trabajaron? Que tipo de azucares tienen estas muestras? Argumente sus conclusiones de las prcticas

. Bibliografa

Estructura y mecanismos de las enzimas

Fersht, A. Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. W. H. Freeman, 1998 ISBN 0-7167-3268-8 Walsh, C., Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company. 1979. ISBN 0-7167-0070-0 Page, M. I., and Williams, A. (Eds.), 1987. Enzyme Mechanisms. Royal Society of Chemistry. ISBN 0-85186-947-5 M.V. Volkenshtein, R.R. Dogonadze, A.K. Madumarov, Z.D. Urushadze, Yu.I. Kharkats. Theory of Enzyme Catalysis.- Molekuliarnaya Biologia, (1972), 431439 (en ruso, sumario en ingls) Warshel, A., Computer Modeling of Chemical Reactions in enzymes and Solutions John Wiley & Sons Inc. 1991. ISBN 0-471-18440-3

Cintica e inhibicin

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Funcin y control de las enzimas en las clulas

Price, N. and Stevens, L., Fundamentals of Enzymology: Cell and Molecular Biology of Catalytic Proteins Oxford University Press, (1999), ISBN 0-19850229-X Nutritional and Metabolic Diseases

Convenciones para asignar nombres a enzimas

Enzyme Nomenclature, Recommendations for enzyme names from the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology.

Aplicaciones industriales

History of industrial enzymes, artculo en ingls sobre la historia de las enzimas industriales, entre finales del siglo XX y el presente.