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PARTE I Biotecnologa y Agricultura

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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IZQUIERDO, Juan

I.-Captulo1
Hacia una agricultura sustentable: las alternativas de las ciencias de la vida y de la biotecnologa
Izquierdo, Juan 1 El contexto del debate En lnea con las conclusiones de la ltima Cumbre de la Alimentacin de la FAO y diez aos despus de la Cumbre de Ro y de la adopcin de la Agenda 21, la Cumbre Mundial sobre Desarrollo Sustentable organizada en Johannesburgo, Africa del Sur, por el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA), reforz que la sostenibilidad es cada vez ms un precepto crucial, ampliamente aceptado y prioritario en el plano internacional dentro de un contexto integral que involucra la lucha contra la pobreza, el hambre y la malnutricin, la lucha contra las enfermedades infecciosas, la cooperacin tecnolgica, la educacin y la liberalizacin de los intercambios. Las previsiones indican un importante aumento de la demanda alimentaria, especialmente en los pases en vas de desarrollo, lo que implica que para poder dar respuesta a este reto una de las posibilidades es aumentar la superficie de terrenos cultivados. Sin embargo, estos terrenos adicionales, limitados por la proteccin indispensable de los entornos naturales, tan slo representaran una quinta parte del crecimiento de la produccin mundial de cereales. Por consiguiente, resulta obligatoria la mejora del rendimiento y/o la adaptacin a condiciones extremas de produccin (sequa, salinidad, fro, altas temperaturas y otras) en zonas poco aptas para la agricultura convencional que permitan intensificar a los cultivos alimenticios y diversificar, sobre la base de especies de cultivos introducidas o autctonas, alimenticias o volcadas al agroprocesamiento, la base productiva de los pases de la regin. En este desafo, en donde las ciencias de la vida y la biotecnologa tienen un rol central, deben estar juntos todos los actores del proceso del desarrollo (cientficos, legisladores, expertos en desarrollo, agricultores y

los representantes de la sociedad civil) para abordar los aspectos tecnolgicos y econmicos, ms urgentes y polmicos, relacionados con el desarrollo y utilizacin segura de las biociencias y su capacidad de ofrecer soluciones sustentables para la produccin de alimentos y la reduccin de la pobreza. En este contexto, la cooperacin entre el mundo desarrollado y el mundo en vas de desarrollo resulta crucial si se quieren lograr los objetivos relativos a la sostenibilidad. La seguridad y el uso de organismos genticamente modificados (OGM) implican a priori, situar a la ciencia en un contexto de desarrollo mucho ms amplio, tratando de asegurar que los agricultores de los pases en vas de desarrollo formen parte del proceso colaborativo de investigacin. Compartiendo el derecho de la sociedad civil a cuestionar, sobre bases bien informadas, los avances cientficos y las consecuencias que de ellos eventualmente pudieran derivar, debe tomarse nota de que un cierto grado de escepticismo es un elemento saludable y esencial del proceso de demostracin que permite dar a conocer las cuestiones cientficas apropiadas para as poder proceder a un debate en toda regla. 2 Movilizar los recursos El proceso anterior significa movilizar recursos tanto para apoyar a la innovacin y a la investigacin en biotecnologa, as como para desarrollar un marco regulatorio alcanzable dentro de las realidades de los pases de la regin, acompaado por canales de informacin tecnolgica confiables y honestos, que permitan y promuevan una percepcin pblica crtica pero realista de las ventajas que ofrecen los nuevos desarrollos de las ciencias de la vida y la biotecnologa. Este proceso es, en la actualidad, el centro vital de la cooperacin horizontal que lleva adelante la red REDBIO/FAO (http:// www.redbio.org) con ms de 12 aos de existencia y un cuerpo de laboratorios de ms de 650 instituciones de 32 pases de Amrica latina y el Caribe. Si la solucin a tal desafo dependiera en primer y nico lugar de la movilizacin de los recursos humanos y de los medios financieros, los progresos actuales y futuros de las

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ciencias de la vida y de la biotecnologa, representaran un potencial nada desdeable para el impulso de una agricultura sustentable y segura en los pases en vas de desarrollo. En concreto, dicha accin podra permitir abandonar el uso de mtodos ms agresivos para el ambiente como, por ejemplo, los mtodos mecnicos y qumicos que inciden en los costos de produccin, en sus efectos desfavorables sobre las fuentes hdricas, la fauna y la flora y sobre la salud de los agricultores. Este planteamiento no queda exento de fuertes reticencias en ciertos sectores de la opinin pblica mundial y especialmente en Europa, que expresan su desconfianza en cuanto al uso de organismos modificados genticamente en el mbito de la agricultura y la alimentacin. Estas fuerzas compuestas de variados actores de la sociedad civil representan, a su vez, un fuerte desafo que limita la movilizacin de los recursos. El tema de los OGM es ineludible pero no supone ms que una parte de la totalidad del debate. La salud de los suelos y de los cultivos, el conocimiento real del estado de la biodiversidad, las producciones vegetales en los lmites ecoclimticos y la emancipacin tecnolgica en las zonas rurales son tambin temas que revisten la misma importancia. 3 Un contexto propicio para la accin La produccin agrcola en los pases en vas de desarrollo ha de aumentar en la medida en que contine creciendo el nmero de bocas que alimentar. Este incremento se ha de lograr en gran medida con los terrenos agrcolas existentes y mediante el uso de mtodos que no agoten los recursos de la tierra o causen daos medioambientales duraderos. Las perspectivas de las generaciones venideras resultarn daadas irreversiblemente si no se emplean adecuadamente formas sustentables de cultivar la tierra. La adopcin de mtodos agrcolas sustentables es un elemento importante en todo el proceso del desarrollo rural. La Agenda 21 indica que: Con el fin de crear las condiciones para la agricultura y el desarrollo rural sustentables es preciso reajustar considerablemente la poltica agrcola, ambiental y macroeconmica, a nivel tanto nacio-

nal como internacional, en los pases desarrollados y en los pases en desarrollo. El principal objetivo de la agricultura y el del desarrollo rural sustentables es aumentar la produccin de alimentos de manera sustentable y mejorar la seguridad alimentaria. La reciente conferencia Rio+10, celebrada en Johannesburgo en septiembre de 2002, reforz el compromiso mundial con los principios del desarrollo sustentable. Entre los muchos logros importantes de la cumbre hay que destacar el mejor entendimiento de lo que representa el desarrollo sustentable y, en particular, en cuanto a la interrelacin entre la pobreza, el medio ambiente y el uso de los recursos naturales. Amrica latina y el Caribe, como regin productora y exportadora de alimentos, debe transformarse en uno de los protagonistas en el campo de las ciencias de la vida y la biotecnologa. Dentro de este inters superior por ayudar al desarrollo de nuevas tecnologas no se debe olvidar la necesidad de generar, acceder y compartir los avances con el mundo desarrollado de un modo justo y responsable. La regin debe preparar y endosar una declaracin de poltica en donde las ciencias de la vida y las biotecnologas son una opcin estratgica para los pases (http://europa.eu.int/comm/ biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf) subrayndose con claridad la necesidad de poner los medios necesarios a la disposicin de los pases en vas de desarrollo. El progreso en estos mbitos ayudar a la investigacin y a la evaluacin cuidadosa de las aplicaciones potenciales, con el fin de cubrir los temas de seguridad medioambiental y las necesidades locales relacionadas con la reduccin de la pobreza, la mejora de la seguridad alimentaria y el aumento de la calidad nutricional. El desarrollo rural sustentable y la seguridad alimentaria son componentes importantes de las estrategias regionales contra la pobreza. Habida cuenta de que el sustento de la poblacin rural depende de una agricultura sostenible, no se podr erradicar la pobreza sin una modernizacin sustancial de la produccin agrcola en los pases en vas de desarrollo. 4 Alimentar sin destruir Segn las estadsticas de la Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin

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y la Agricultura (FAO), hay alrededor de 800 millones de personas en el mundo que sufren malnutricin. Muchas ms dependen de aprovisionamientos poco fiables de alimentos a causa de problemas naturales, econmicos o polticos. Las prcticas agrcolas no sustentables tan slo vienen a sumarse a todas estas dificultades. El uso adecuado de las ciencias de la vida y de la biotecnologa puede contribuir al logro de aumentos sustentables de la produccin agrcola mediante la transferencia de prcticas de gestin mejoradas, un mejor rendimiento, la resistencia a plagas y enfermedades y el aumento de la tolerancia al estrs abitico de las cosechas, el ganado y la pesca. La seleccin adecuada de estas tecnologas reducir la necesidad de recurrir a sustancias agroqumicas, de modo que se proteger el medio ambiente y a los agricultores de sus efectos negativos. Adems, las ciencias de la vida y la biotecnologa pueden contribuir a la conservacin de la diversidad gentica. Por ejemplo, ya hay proyectos en marcha que evalan cmo se explotan y se extenan los ecosistemas a causa del uso humano de los recursos naturales. Con la informacin recopilada se puede lograr un uso ms razonable de los ecosistemas que reduzca el riesgo de prdida de especies esenciales. 5 La creacin de un dilogo responsable Organizar y promover una Plataforma de Debate sobre las Ciencias de la Vida, que permita a los cientficos participar en un debate con las diversas partes implicadas interesadas en las aplicaciones beneficiosas y en la divulgacin de los nuevos conocimientos, es parte del proceso. En este sentido se debe organizar un debate informativo y plural sobre el papel de las ciencias de la vida en un contexto de urgencia econmica y social, centrado en las necesidades de los pases en vas de desarrollo y apoyar foros de debate con la sociedad civil presentando estudios de cientficos nacionales, cada uno claramente ubicado en su contexto social y econmico. Las presentaciones deben realizarse en un lenguaje comprensible para los legos en la materia, porque se evitarn las referencias a teoras e ideologas y se prestar atencin a las soluciones prcticas a problemas con-

cretos. Estas presentaciones servirn de valiosa introduccin general a los diversos temas e irn dirigidas a un pblico amplio, con el fin de que ofrezcan una base para el inicio del debate pblico. 6 Reforzar los conocimientos Las ciencias de la vida y biotecnologa (http://europa.eu.int/comm/ biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf) son pilares en el contexto de la construccin de una sociedad y una economa basada en el conocimiento. Las inversiones en investigacin y desarrollo, en educacin y formacin y en los nuevos enfoques de gestin tienen una importancia clave para hacer frente a los desafos de la biotecnologa y las ciencias de la vida. Coherente con lo anterior, el reforzamiento de los vnculos entre la investigacin y otras polticas socioeconmicas y la necesidad de la participacin de los cientficos en el proceso de creacin de un consenso es parte de la creacin de nuevas asociaciones de investigacin entre los pases desarrollados y los pases en vas de desarrollo, a fin de aprovechar al mximo las ventajas de tecnologas prometedoras y el potencial de la biodiversidad. El libro Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, para el cual he tenido el honor de escribir este captulo, es producto del trabajo de un nmero importante de investigadores jvenes latinoamericanos. La obra representa una contribucin significativa a la realidad de las instituciones acadmicas y de investigacin en ciencias agronmicas y biolgicas al aportar conocimientos y el estado del arte y llenar el vaco temporal en la disponibilidad de un libro en espaol de consulta actual, dando seguimiento a la obra pionera Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones realizada en 1991 y llevada a cabo por el Centro Internacional de Agricultura Tropical bajo la edicin de los Drs. William Roca y Luis Mroginski. La Oficina Regional de la FAO para Amrica Latina y el Caribe colabor con la edicin de dicho libro y reafirma el inters por este tipo de material, que provee un conjunto de documentacin consolidada para el uso de estudiantes y profesionales.

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I.-Captulo 2
El papel de las nuevas biotecnologas en la produccin agropecuaria
Pagliano, Daniel 1 Introduccin La nueva economa determina que aquellas naciones que pretendan crecer y generar riqueza debern necesariamente aceptar el desafo que implica el aprender a utilizar los idiomas digital y gentico. Es as entonces que las empresas e instituciones basadas en el uso intensivo del conocimiento son fundamentales en la creacin de prosperidad. Empresas de distinto porte han evolucionado y crecido en el sector de la biotecnologa generando, directa e indirectamente, cientos de miles de puestos de trabajo en todo el mundo1 como resultado de inversiones que se realizaron tanto en el sector pblico como en el privado, y que hoy se consolidan a travs de la generacin de un modelo productor de bienes y servicios. Entender este continuum es vital. Pero el punto principal es la creacin de comunidades con visin competitiva. Es as que desde un tiempo a esta parte muchos pases desarrollados estn implementando diferentes estrategias para impulsar el sector de la biotecnologa como un rea prioritaria de su economa, no slo por lo que significa en trminos productivos sino tambin por lo que significa culturalmente. Para los pases latinoamericanos es entonces fundamental entender que hay que buscar un lugar dentro de esta nueva economa, que es una economa de conceptos ms que una economa de toneladas, y a la vez tratar de establecer parmetros de desarrollo sustentables que generen inversin, empleo genuino y valor agregado. El incremento de la demanda por factores de productividad y calidad en el producto terminado exige la utilizacin de tecnologas que introduzcan calidad en el material inicial y que la continen y expandan hasta
The economic contributions of the biotec industry of the US economy. Informe realizado por Ernst & Young, Mayo 2000. www.bio.org
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la obtencin de un producto final de mayor calidad. Considerando que los sectores productivos ms importantes son la produccin animal, de granos, hortifruticultura y forestales, la biotecnologa incide fundamentalmente desde el inicio de las cadenas productivas. Son bsicamente nuevas semillas, plantas o animales con nuevas caractersticas genticas que confieren caracteres sanitarios, de calidad o adaptativos, los que llevan un valor agregado biotecnolgico. A modo de ejemplo, si consideramos al sector lcteo, las demandas comenzaran en pasturas con especies forrajeras de alta productividad, seguiran en una gentica animal que aporte la mejor capacidad de una produccin de calidad, se continan en la industria con elaboracin de productos diferenciados y ms an, sigue en la valorizacin de los desechos industriales. Hay un continuum tecnolgico donde la suma de los valores agregados en cada tramo expande el valor agregado final. Por otra parte, la agricultura y la industria farmacutica comparten ahora una misma caja de herramientas. El desarrollo de tecnologas que pueden ser usadas en cualquier campo de la vida es un elemento dinamizador nuevo que permite que un logro en un campo pueda ser rpidamente traspasado a otro. Los cdigos usados en genmica, bioinformtica, qumica combinatoria y protemica tambin son compatibles. Por todo esto, se habla de una industria de las ciencias de la vida. Los pases de la regin poseen una especial habilidad para el agregado de valor a su produccin agropecuaria mediante la utilizacin de conocimientos de base biolgica. Los pases poseen no slo el know how (conocimiento) sino tambin la experiencia de haber llevado esos conocimientos al campo productivo, como lo demuestran las industrias lctea, forestal, citrcola, cafetera y el complejo ganadero, entre otros. Pero es necesario comprender que la actual revolucin existente en las ciencias de la vida modificar o sustituir progresivamente tecnologas existentes, permitiendo superar lmites tcnicos bsicos, haciendo viables nuevos parmetros de productividad y de calidad para productos y procesos existentes, sentando la base de nuevas industrias.

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Esto generar cada vez ms cambios sustanciales en toda la cadena productiva agroalimentaria, donde nuevos patrones tecnolgicos sern los responsables de la aparicin de nuevos productos en los mercados. Estar preparados o ser parte de estos cambios se torna una cuestin de soberana. 2 Desarrollo de una visin La sociedad de un pas, como sistema humano, se mueve en direccin a las preguntas que se formula, y acta en funcin de stas. Para el diseo de una visin, la regin debe lograr entender los cambios que en el plano mundial se estn procesando. Cualquier tecnologa compleja necesita para su desarrollo de una infraestructura sustentada en una comunidad que involucra la investigacin, el gobierno, la educacin, los negocios, las finanzas, la legislacin y otros. Se requiere de varios actores para hacer que una tecnologa pase por etapas de prueba de concepto, desarrollo, maduracin, extensin y finalmente termine con su adopcin. Es fundamental tener una capacidad de seguimiento de lo que ocurre mundialmente en el desarrollo de nuevos productos, programas marcos de investigacin, prioridades estratgicas de programas de ciencia y tecnologa, etc. Luego de tener estas tendencias mundiales es menester generar una estrategia regional de desarrollo y posicionamiento en el contexto mundial. Los ejercicios de prospectiva tecnolgica son una herramienta vlida en este sentido. De acuerdo con la definicin de la OCDE (Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico), prospectiva tecnolgica es un conjunto de intentos sistemticos para mirar a largo plazo el futuro de la ciencia, la tecnologa, la economa y la sociedad, con el fin de identificar aquellas tecnologas genricas emergentes que probablemente generarn los mayores beneficios econmicos y/o sociales. El objetivo central de una prospectiva tecnolgica es la estimacin de las tendencias futuras para llevar a cabo en forma anticipada acciones para disear el futuro deseado. En este sentido la prospectiva tecnolgica identifica aquellas tecnologas emergentes

y estima el impacto de stas sobre el mundo de los negocios y la sociedad en general. Histricamente, la regin ha invertido de forma sistemtica en programas de I+D (Investigacin y Desarrollo) en apoyo a la investigacin biolgica aplicada, lo cual ha permitido mantener y aumentar la competitividad de los sectores productivos de base natural. En la actualidad, es prioritario para los sistemas de I+D y produccin de la regin tener una visin prospectiva para poder alcanzar un nuevo paso en su nivel de desarrollo. Es prioritario que los lderes comprendan la profundidad del cambio, los cambios tecnolgicos, econmicos, culturales y que se promuevan las reformas y los cambios estructurales necesarios para lograr desarrollar sistemas de innovacin propios en biotecnologa. Esto permitir a la regin seguir liderando el desarrollo de productos y procesos de base biolgica. Las estrategias de Usuario de Biotecnologa son una posibilidad para aquellos pases que tengan importantes industrias agrcolas y agroindustriales, pero que carecen de industrias productoras de insumos biolgicos. Sin embargo, pases que quieran potenciar estas ltimas y ser parte del mercado del conocimiento, se vern forzados a acciones ms proactivas y ambiciosas. 3 Interaccin sistema acadmico y sector privado Hoy, la mayor parte de la infraestructura y de las capacidades disponibles en la regin se encuentran fuertemente orientadas a la investigacin. Esto es fundamental para avanzar hacia las etapas de desarrollo y posteriores, que permitan alcanzar los mercados con productos y servicios. Estas etapas sucesivas necesitan ser practicadas y es fundamentalmente en el sector privado donde deben articularse, contando con un sistema productivo organizado para hacer demandas al sistema cientfico. La ciencia pura es tan pertinente como la aplicada, pero en el mediano y largo plazo la nica forma de competir seriamente es a travs de productos y servicios innovadores. En la nueva sociedad del conocimiento el rol que cumplen las universidades se torna an ms clave. Es importante que las universi-

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dades de la regin puedan analizar y canalizar lo que est pasando en pases como Estados Unidos, Inglaterra, Blgica, Canad y Australia, donde existe una fuerte integracin de las carreras cientfico-tecnolgicas con escuelas de negocios, integrando la visin comercial al desarrollo de la ciencia y la tecnologa. En este sentido la regin posee una excelente capacidad cientfica-tecnolgica, pero debe complementarla con la capacidad de gestin de la tecnologa. Se requiere, por ejemplo, del marketing (mercadeo) para poder vender productos fuera de la regin, para lo cual habr que estudiar y comprender los mercados que van a recibir nuestros productos. Para esto, es menester lograr sinergias entre cientficos y empresarios, y potenciar la formacin de nuevas empresas a partir del reconocimiento de la capacidad de la biotecnologa de la regin. 4 Conclusiones Para la regin es muy importante, sin duda, continuar trabajando en el camino emprendido, buscando forjar las alianzas estratgicas entre los mbitos pblico y privado de las bioindustrias, coordinando esfuerzos en investigacin y desarrollo hacia obje-

tivos que potencien las capacidades. De esta forma se podrn lograr mejores parmetros de competitividad global que permitan continuar con la creacin de emprendimientos y puestos de trabajo altamente calificados y as contribuir al desarrollo. La regin tiene una gran oportunidad generada por la globalizacin pero, para aprovecharla, necesita entender que es indispensable involucrar a la comunidad entera y participar activamente para capturarla. Se debe promover una cultura que favorezca a los emprendimientos y genere un mayor grado de asociatividad entre las empresas y la capacidad cientfica, as como la formacin de redes de capital de riesgo que permitan la generacin de nuevos negocios. Albert Einstein afirmaba que todos los imperios del futuro van a ser imperios del conocimiento, y solamente sern exitosos los pueblos que entiendan cmo generar conocimientos y cmo protegerlos, cmo buscar a los jvenes que tengan la capacidad para hacerlo y asegurarse que se queden en el pas. Los otros pases se quedarn con litorales hermosos, con iglesias, minas, con una historia fantstica; pero probablemente no se queden con las mismas banderas ni con las mismas fronteras ni, mucho menos, con un xito econmico.

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PARTE II Herramientas Bsicas

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RADICE, Silvia

II.-Captulo 1
Morfognesis in vitro
Radice, Silvia 1 Introduccin

La embriognesis somtica y la organognesis son dos procesos morfognicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriognesis somtica es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar al embrin zigtico sin que 2 Tipos de morfognesis. Definiciones medie la fertilizacin de las gametas, mienEn condiciones de cultivo in vitro, las ctras que por organognesis pueden obtenerse tallos, races o flores. Estos rganos son lulas somticas pueden regenerar embriones inducidos a partir de una clula o de un gru- (Fig. 1) o brotes, races y/o flores (Fig. 2) como po de clulas que, segn las condiciones de respuesta a un determinado estmulo. La recultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa divisin. Esta totipotencialidad celular haba sido anunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teora de que todas las clulas vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas. Este autor, sin embargo, no pudo demostrar su hiptesis debido a que no pudo lograr la divisin celular porque los medios de cultivo que empleaba no incluan reguladores del crecimiento, an desconocidos en ese entonces. Los avances en cultivo de tejidos fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, White pudo mantener en forma ilimitada el crecimiento de races en medios lquidos a partir de pices de tomate. Al mismo tiempo se identific el cido indol actico (AIA), Figura 1: A-F) Embriognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A, C y E) que posibilit el manteni- Embriognesis somtica en diferentes fases de crecimiento observada en miento indefinido in vitro Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de BAP. B, D y F) sp a partir de callos de zanahoria y ta- Embriognesis somtica obtenida en diversos cultivares de Prunus de embriones zigticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 baco. mg l-1 de Kin con una previa induccin en MS + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las barras Posteriormente se des- representan 5 mm.

cubri el efecto de la leche de coco como estimulante de la formacin de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. Skoog y Tsui en 1948, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulacin qumica en la parte area y en la raz. Trabajos posteriores en callos de tabaco y con el agregado de cinetina , la primera citocinina descubierta, fue posible demostrar que la diferenciacin de brotes, races o de ambos, era regulada por el balance de auxinas/citocininas.

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Figura 3: Esquema de los diferentes procesos morfognicos obtenidos a partir de la siembra in vitro de diferentes explantes. Las lneas continuas expresan organognesis o embriognesis directa mientras que las lneas quebradas indican que la morfognesis se obtiene por va indirecta.

generacin es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar para los tres tipos de morfognesis citadas. De Klerk y colaboradores en 1997 denominaron a estas diferentes fases como fase de adquisicin de la competencia, fase de induccin y fase de realizacin. En la primera fase las clulas no responden al estmulo organognico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciacin. En la segunda fase o fase de induccin, las clulas son receptivas al estmulo morfognico y hay una relacin directa entre el tipo, concentracin y combinacin de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el rgano a desarrollar. En la fase de realizacin, la clula sufre las sucesivas divisiones para formar el rgano determinado. A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones adecuadas, puede inducirse la formacin de nuevos rganos de manera directa sin la formacin de callo. Si la forma-

cin es de brotes, races o flores se denomina organognesis directa. Si en cambio se induce la formacin de embriones somticos, este proceso se denominar embriognesis directa (Fig. 1 y Fig. 3). Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferacin de clulas en forma desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la produccin de callos o suspensiones celulares (Fig. 2 A y Fig. 3). La diferenciacin de rganos a partir de callos o morfognesis indirecta, estar condicionada a la previa formacin de los meristemoides. La denominacin de morfognesis directa o indirecta fue descripta por primera vez por Hicks en 1980.
Figura 2: A-E) Organognesis somtica obtenida por cultivo in vitro . A) Callo organognico obtenido en Abelia sp. (Andr) Rehder cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. B) Inicio de brotes (flechas) en hojas crecidas in vitro de Crimson Gold (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin. C) Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo de captulos florales en MS 0,05 mg l-1 de IBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3. D) Brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (Andr) Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E ) Races (flechas) crecidas de callo de Abelia sp . (Andr) Rehder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Las barras representan 5 mm.

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RADICE, Silvia

3 Histologa de la morfognesis Despus de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo adecuado, a partir de una clula epidrmica o del mesfilo foliar, como ocurre en las conferas, se suceden una serie de divisiones mitticas. As se pueden observar, a travs del estudio histolgico, pequeas masas de clulas que contienen un citoplasma denso y grandes nuclolos. Este conjunto de clulas agrupadas a modo de esferas fueron denominadas meristemoides por Torrey en 1966, y son los responsables de la diferenciacin de los nuevos rganos. Este tipo de meristema puede iniciarse en forma directa a partir de clulas diferenciadas, pertenecientes a un explante cultivado in vitro o, indirectamente, a partir de una clula o grupo de clulas diferenciadas que promueven la proliferacin celular (Fig. 4 A). Su evolucin determinar el crecimiento de un rgano como, por ejemplo, una yema adventicia (Fig. 4 B). Las clulas embriognicas son similares a las clulas meristemticas debido a que no son demasiado voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un nuclolo agrandado y pequeos granos de almidn. Estas clulas en general se agrupan y pueden variar en tamao y nmero. Dentro de un grupo de clulas embriognicas, el desarrollo de las mismas no est sincroniza-

do. Estas clulas son capaces de dividirse o de transformarse en embriones segn las condiciones del medio de cultivo. Seguidamente, las clulas que no desarrollan proembriones comienzan el proceso de diferenciacin, es decir, se vacuolizan, disminuye el volumen de ncleo y nuclolo y desaparecen los grnulos de almidn. Las experiencias demuestran que las clulas embriognicas se desarrollan slo cuando se modifican las condiciones de cultivo. En general ocurren cuando se reducen las cantidades de auxina y citocinina o cuando se elimina la auxina. Las clulas embriognicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimentales permiten que stas expresen su potencial. Pueden ocurrir dos situaciones ontognicas diferentes, es decir que su origen sea unicelular o pluricelular. En el caso de iniciarse a partir de una clula, ocurre que estas clulas embriognicas se aslan unas de otras por una importante modificacin en su pared celular, en particular por la gelificacin de la laminilla media. Esta clula, que est rodeada por un polisacrido mucilaginoso, sufre divisiones polarizadas formando un embrin globular, en donde pueden diferenciarse deposiciones de almidn en una etapa previa a la polarizacin de este proembrin. Luego ocurre la formacin de la epidermis y adquiere la simetra bilateral. Sucesivamente se observa el crecimiento de uno o ms cotiledones, el desarrollo de los tejidos provasculares, la iniciacin de los pices radicales y de tallo y una progresiva acumulacin de sustancias del tipo almidn, lpidos y protenas. En el caso de que los embriones somticos se originen de un grupo de clulas pueFigura 4: A-E) Cortes histolgicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A) Meristemoides (flechas) observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de BAP 10 x. B) yemas adventicias (flechas) en pices de Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3 4 x. C) grupo de clulas embriognicas (flechas) en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn. 20 x. D) Embriones somticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x. E) Embriognesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x.

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den observarse diversos patrones. Los embriones somticos se forman a partir de grupos de clulas epidrmicas y subepidrmicas (Fig. 4 C). Este tipo de ontogenia de origen multicelular se llama comnmente budding o embriognesis adventicia . Estas clulas pequeas tienen una alta relacin ncleo/ citoplasma, un denso citoplasma y un nuclolo voluminoso y teido. Se diferencian de las clulas embriognicas por la falta de sustancias de reserva, por su delgada pared celular y su frecuente divisin celular. Estas estructuras pueden ser denominadas como proembriones globulares (Fig. 1 A y B). En una etapa posterior, desarrollan una epidermis, un tejido provascular, acumulan material de reserva y tambin sufren la polarizacin. Estas estructuras globulares producen cotiledones y se transforman en embriones somticos con la formacin de pices de tallo y raz. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio segn las condiciones de cultivo. El desarrollo de un embrin somtico de origen unicelular es comparable a la de un embrin zigtico. En dicotiledneas, la etapa globular es seguida por una etapa corazn que se corresponde con la adquisicin de la simetra bilateral: desarrollo de la epidermis, de los estratos procambiales y, de manera sucesiva, el desarrollo del pice radical. El pice de tallo se desarrolla ms tarde en la etapa de cotiledonar. En los embriones somticos de algunas especies hay una etapa intermedia entre la globular y corazn llamada oblonga, que corresponde a la individualizacin del pice de la raz y al procambium en respuesta a la elongacin axial del embrin somtico debido al transporte de auxinas (Fig. 1 C). Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que los zigticos, as como tambin la produccin de sustancias de reserva. Sin el seguimiento histolgico detallado, la formacin del embrin somtico slo puede ser confirmado por la germinacin (Fig. 1 F). Sin embargo debido al bajo porcentaje de embriones que llegan a esta etapa, esta tarea es casi imprescindible para una correcta evaluacin de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo empleados. Los embriones somticos, comparados con los embriones zigticos de la misma es-

pecie, frecuentemente desarrollan de manera anormal o son inmaduros. La anomala ms frecuente es la formacin doble o triple del sistema vascular, causada por la pobre polarizacin del transporte de auxinas. Tambin se puede encontrar un contenido excesivamente alto, reducido o ausente de las reservas de almidn y/o proteicas, que el meristema apical o radical no estn desarrollados o que la embriognesis sea repetitiva o secundaria (Fig. 4 E). La falta del meristema apical o de una escasa deposicin de sustancias lipoproteicas observada en los embriones somticos de algunas especies, no debe ser tomada como una anormalidad sino que puede ser sntoma de inmadurez debido a la rpida formacin de los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la maduracin de las estructuras formadas permitir incrementar el porcentaje de embriones somticos capaces de germinar. 4 Factores que afectan los procesos morfognicos

Los cuatro factores principales que condicionan la obtencin y el crecimiento de nuevos rganos en condiciones in vitro son: el genotipo las condiciones qumicas seleccionadas para realizar el cultivo las condiciones fsicas seleccionadas para realizar el cultivo el explante El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfognicos desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro as como tambin para la proliferacin de callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rganos. Por esta causa, no es posible generalizar metodologas o protocolos de trabajo debido a que los medios de cultivo como las condiciones de cultivo seleccionados, deben ser especficos para cada situacin en particular. Un ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp y Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la obtencin de embriones somticos a partir de embriones zigticos, pero estos resultados no se repitieron con el cultivar Pinot Noir.

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Varios son los compuestos qumicos que influyen en los patrones morfognicos in vitro dentro de los cuales podemos considerar: 1. La composicin salina del medio de cultivo. La composicin salina ms empleada para inducir la formacin de callo, la organognesis directa o indirecta en la mayora de las especies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseadas para inducir determinados patrones morfognicos. Existe, adems, una estrecha relacin entre la composicin hormonal del explante y la concentracin de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo. 2. Reguladores del crecimiento. Estos compuestos pueden promover la morfognesis aun cuando la concentracin salina no sea la adecuada. En condiciones ptimas de cultivo pueden incrementar significativamente la diferenciacin de rganos. En muchas de las especies vegetales, para la induccin de embriones somticos, es necesario el agregado de auxinas como ocurre en Tilia spp.; sin embargo, para otras, como es el caso del crotn (Codiaeum variegatum), es suficiente con el agregado de thidiazurn. El genotipo y el tipo y concentracin de reguladores del crecimiento empleados estn estrechamente relacionados. 3. Antibiticos. En procesos de transformacin es muy comn el agregado de antibiticos del tipo cefotaxime, kanamicina y carbenicilina para la eliminacin de Agrobacterium tumefaciens. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus domestica se ha encontrado que 250 mg. L1 de cefotaxime aumentan significativamente la regeneracin de brotes mientras que 500 mg. L1 de carbenicilina promueven la formacin de callo y la kanamicina inhibe los procesos morfognicos. 4. Carbn activado. En general se usa para absorber compuestos txicos de la microatmsfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo. E.K. Pettersson y su equipo de colaboradores de la Swedish University of Agriculture, Suecia, demostraron que este compuesto puede promover la embriognesis somtica debido a ciertos compuestos que

se incorporan por difusin al medio de cultivo. 5. Agar. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. Puede emplearse como semislido o lquido. El agente gelificante ms empleado en el cultivo in vitro es el agar extrado de diversas algas marinas. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la expresin morfognica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chinensis, cultivadas en una solucin de MS con el agregado de 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP, donde se observ una respuesta morfognica diversa segn el tipo de agar seleccionado. Por ejemplo, cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar, de produccin nacional, se observ una gran diferenciacin de yemas adventicias, mientras que con el agregado de agar SIGMA R slo se indujo la proliferacin de callo. En caso de seleccionar medios de cultivo lquidos, la respuesta morfognica observada vara de manera considerable. El cultivo lquido es imprescindible cuando se busca promover la morfognesis indirecta a travs de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos en medio lquido con agitacin para permitir que las clulas se disgreguen y puedan diferenciar races, brotes o embriones somticos en forma aislada. La seleccin del medio de cultivo lquido o slido depende, adems, de la especie empleada. En Cymbidium spp, por ejemplo, se ha observado que el empleo de medio de cultivo lquido promueve una mayor diferenciacin de protocormos respecto del mismo medio gelificado. A su vez, este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos mientras que en medio de cultivo gelificado se observ que los protocormos tienden a formar tallos. 6. Atmsfera gaseosa. Es un factor determinante en los procesos morfognicos y est condicionada por el tipo y tamao de envase seleccionado as como tambin el sistema de cobertura del mismo. Las tapas usadas en cultivo in vitro varan desde el tapn de algodn, papel de aluminio, pelcula de resinite transparente o tapas rgidas de polipropileno. El intercambio gaseoso es di-

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ferente para cada tipo de tapa; en consecuencia, la atmsfera interna tambin sufrir variaciones. En condiciones in vivo la atmsfera contiene 78 % de nitrgeno; 21 % de oxgeno y 0,035 % de dixido de carbono. En cultivos in vitro se han registrado, adems, etileno y otros compuestos hidrocarbonados. El nivel de oxgeno disponible para el explante condiciona el crecimiento y los procesos morfognicos. En general se necesita una buena aireacin para obtener cualquier tipo de proceso morfognico. En alfalfa se puede obtener un buen incremento de material a partir de suspensiones celulares embriognicas cuando la solucin se satura con 70% de oxgeno en la solucin. Por el contrario, una tensin de oxgeno del 5 % estimula la produccin de plantas a partir de anteras de tabaco. La concentracin de dixido de carbono (CO2) en la atmsfera gaseosa in vitro vara segn la respiracin y la actividad fotosinttica de las plantas. En condiciones de oscuridad, el CO2 se incrementa mientras que, en condiciones de luz disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables que van del 0,5 al 8,5 %, segn el tipo de sello o tapa empleados. Estas concentraciones superiores a 1 %, generalmente txicas para las condiciones in vivo , probablemente no son limitantes para la actividad fotosinttica. La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Para el cultivo de clulas, callos y anteras, su acumulacin tiene efectos inhibitorios. La cantidad de etileno producida in vitro vara con la especie, el tipo de explante, la concentracin de citocininas en el medio de cultivo, el tipo de agar seleccionado y con la luz. Una forma de incorporar etileno al envase de cultivo es a travs de la esterilizacin del material de diseccin realizada con el material embebido en alcohol y flameado con mechero Bunsen. En muchos casos, el etileno acta como promotor de la morfognesis, pero luego es inhibitorio del crecimiento de los rganos diferenciados.

Entre las condiciones fsicas podemos mencionar los efectos de la temperatura, la humedad relativa y la luz. 32

1. La temperatura de incubacin de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en las condiciones naturales de cultivo las plantas tienen diferencias trmicas durante el da y la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante sealar que cuanto ms se asemejen las condiciones in vitro a las ptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor ser la respuesta esperada. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas, se observ que la regeneracin mayor de brotes se obtuvo a 12 C, mientras que por encima de los 30 C casi no hubo diferenciacin. 2. La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmsfera gaseosa, es otro de los parmetros fsicos a tener en cuenta. La HR depender del sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermtico, la humedad interior ser del 100 %. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso, la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso del contenido de HR puede promover una prdida veloz de agua del medio de cultivo, variando la concentracin de sus compuestos hasta llegar a niveles txicos (Debergh, comunicacin personal). 3. La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad y perodo de suministro. La respuesta morfognica de un explante puede variar segn se le proporcione luz o no. Para estimular la formacin de callo es comn que se prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciacin de rganos. Tal como ya se seal anteriormente, los procesos morfognicos dependen del genotipo seleccionado, pero, adems, debe sumarse el efecto del explante seleccionado. El tratamiento de la planta madre, las condiciones fsicas y fisiolgicas en las que sta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarn a su vez la respuesta morfognica en condiciones in vitro . Un ejemplo muy interesante es la diferente respuesta morfognica observada sobre hojas de Camellia japonica cultivadas en un mismo medio de cultivo, segn la porcin de la lmina que se cultive. Estos resultados fueron obtenidos por Pedroso y Pais (1993) des-

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pus de seis semanas de cultivo in vitro previa inmersin del explante en una solucin de IBA (1 mg l1) durante 20 minutos (Fig. 5).

5 Lecturas recomendadas
BUDDENDORF-JOOSTEN, J.M.C. and WOLTERING, E.J. 1994. Components of the gaseous environment and their effects on plant growth and development in vitro. Plant Growth Regulation 15: 1-16. DE KLERK, G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. and Neumann K.H. 1997. Regeneration of roots, shoots and embryos: physiological, biochemical and molecular aspects. Biologia Plantarum 39 (1): 53-66. GEORGE, E. 1993. Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd (ed). Gran Bretaa. 1361pp.

Figura 5: Esquema de las diferentes respuestas morfognicas obtenidas despus de seis semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. segn la porcin de la lmina cultivada. 1. organognesis indirecta, 2. embriognesis somtica directa, 3. regeneracin directa de races, 4. callo organognico.

HICKS, G.S. 1980. Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination. Bot. Rev. 46: 1-23. WILLIAMS, E.G. and MAHESWARAN, G. 1986. Somatic embryogenic factors influencing coordinated behavior of cells as an embryogenic group. Ann. Bot. 57: 443-597.

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II.-Captulo 2
Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales
Mroginski, Luis; Sansberro, Pedro; Flaschland, Eduardo 1 Introduccin El cultivo de tejidos en su acepcin amplia puede ser definido como un conjunto muy heterogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos clulas desprovistas de pared celular clulas, tejidos u rganos) se cultiva aspticamente en un medio artificial de composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La imprecisin de esta definicin puede generar muchas polmicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es comn dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semislidos y b) cultivos en medios lquidos, los que a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios. Tambin es frecuente dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de rganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubacin. La discusin de estos aspectos constituye el objetivo de este captulo. Adicionalmente se incluye el tema de la aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro, que es de gran importancia en la mayora de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura. 2 Explante Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos:

1. Objetivo del cultivo: si bien es difcil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podra esquematizarlas en aplicaciones para:

Estudios bsicos . En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo nico que se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algn proceso fisiolgico, se puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico que se busca es la induccin de callos lo ideal es cultivar explantes jvenes, derivados de semillas en germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay menores problemas de contaminacin con microorganismos. A veces se hace uso del cultivo de tejidos porque representa un sistema experimental que simplifica la complejidad generada por los fenmenos de correlacin entre las distintas partes que normalmente estn presentes en una planta entera. El explante que se usar estar condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento de los frutos. Asimismo, el cultivo de vulos ha sido muy til para estudiar aspectos relacionados con la formacin de las fibras en algodn. El cultivo de discos de tallos brind una valiosa ayuda para estudiar la rizognesis in vitro. Obtencin de plantas con sanidad controlada. Es muy comn la utilizacin del cultivo de tejidos para la obtencin de plantas libres de virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. Micropropagacin . En este caso depender del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotacin de meristemas, los pices terminales y los segmentos uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la biologa de la reproduccin de la planta para aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propgulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de semillas sintticas (ver 35

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V.-2) el explante original deber posibilitar la induccin de la embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones zigticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes. Obtencin de hbridos interespecficos. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy su empleo como ayuda para la obtencin de hbridos derivados de cruzamientos interespecficos, donde se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrin cigtico en estadios tempranos de su desarrollo. Con la misma finalidad tambin se utilizan ovarios u vulos fecundados. Obtencin de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los explantes pueden ser semillas (por ej. orqudeas) o bien, se aslan los embriones en un estado temprano de desarrollo (corazn) como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero. Obtencin de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito que contiene el complemento gamtico de cromosomas). En este caso, los explantes ms utilizados son las anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas, vulos y ovarios no fertilizados. Induccin de variacin somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la finalidad de su utilizacin es la aplicacin en planes de mejoramiento gentico de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneracin de plantas enteras. Produccin y/o conversin de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad de explantes. Explantes de races suelen ser muy utilizados. Obtencin de hbridos somticos . Para esta finalidad se recurre a la fusin de protoplastos. En la mayora de los casos se aslan los protoplastos de mesfilos de hojas y de suspensiones celulares. Conservacin e intercambio de germoplasma . Los meristemas son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservacin a mediano y largo plazo (cro- conservacin con nitrgeno lquido) y para el intercambio de material gentico.

Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a partir de explantes extrados de semillas en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledones, races).
2. Posibilidad de contaminacin con microorganismos. De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas dadoras que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es recomendable evitar el uso de explantes sucios (races, rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo, dado que en la mayora de los casos no es posible conseguir una buena desinfeccin de los mismos. 3. Edad fisiolgica. Este es un aspecto de gran influencia en la morfognesis. Como regla general se puede decir que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su respuesta in vitro . Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del explante es un factor crtico. Si los tejidos son jvenes, la micropropagacin tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas dadoras de explantes. 4. Tamao. En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un tamao mnimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del empleo de medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados. 5. Epoca del ao. Es un factor que suele tener mucha importancia en la micropropa-

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gacin y que generalmente est asociado al grado de dormicin que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos. 3 Asepsia Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente generado por explantemedio de cultivo-condiciones fsicas de incubacin es altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destruccin de los cultivos. Es difcil cuantificar el impacto de estas prdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican. Es muy difcil conseguir cultivos estrictamente aspticos dado que en la mayora de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y fitoplasmas, por lo que en la prctica, cuando se refiere a cultivos aspticos, en general se quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferacin de hongos y bacterias. Dos son las fuentes de contaminaciones: a) microorganismos presentes en el interior o en la superficie de los explantes y b) fallas en los procedimientos de cultivo en el laboratorio. La correcta deteccin de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el xito de los cultivos, pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminacin y por otro lado, ayuda a la planificacin de los procedimientos para controlarlos. Varios gneros de bacterias (Pseudomonas , Xanthomonas, Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Mycobacterium, Corynebacterium) y de hongos filamentosos ( Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Neurospora) estn frecuentemente en los cultivos . Es conveniente ins-

peccionar visualmente con la ayuda de un microscopio estereoscpico los cultivos en forma peridica (por lo menos semanalmente). Tambin se pueden realizar pruebas con medios de cultivo diferenciales y test bioqumicos especficos. Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario: 1) Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles contaminantes especficos. 2) Realizar una adecuada preparacin de la planta dadora de explantes, cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con productos qumicos que eliminen patgenos y eventuales microorganismos endfitos. 3) Proceder a la desinfeccin superficial de los explantes mediante el uso de compuestos qumicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el menor dao posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede sealar que el procedimiento ms popularizado consiste en una doble desinfeccin mediante la inmersin de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. Algunos procedimientos se basan en el empleo de nicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estril. En este ltimo punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estril de reciente preparacin, dado que est demostrado que el almacenaje prolongado del agua estril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias. Es aconsejable realizar estas operaciones de desinfeccin superficial en una cmara de transferencia con aire estril. En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio (0,1-1,5%). Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo de este ltimo compuesto, dado que es altamente txico y adems no es removido con facilidad del explante.

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En los casos en que no se utilice etanol, la adicin de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una prctica recomendada. Entre los ms usados figuran Tween-20 (0,01 0,1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los explantes con agua corriente y detergentes, ayuda a una mejor desinfeccin. La inmersin de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibiticas y /o antimicticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, ampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifampicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados en casos excepcionales. Estos productos tienen el inconveniente de que alteran la composicin de los medios de cultivo y adems pueden ser metabolizados por los explantes. Ultimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos, previenen la germinacin de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones de microorganismos endfitos. Uno de estos compuestos es el PPM (Plant Preservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la caa de azcar. Este compuesto, qumicamente: 1-(5-bromofur-2-il)-2bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plntulas crecidas in vitro como plantas dadoras de explantes, es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinacin y luego es aconsejable desinfectar tambin las plntulas resultantes. En algunos materiales vegetales se utiliza la preincubacin de los explantes mediante lo cual stos son desinfectados suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa, y finalmente son desinfectados nuevamente y cultivados. 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o esporas. Para la esterilizacin, en la mayora de los casos se hace uso del calor en sus diversas formas: llama directa, calor hmedo (en forma de vapor abierto o bajo presin), calor seco (aire caliente). Se pueden usar hor-

nos a microondas. El agua caliente tambin puede ser usada. En el caso de sustancias termolbiles, la esterilizacin se puede hacer mediante filtracin a travs de filtros bacteriolgicos. No es posible recomendar ningn sistema de esterilizacin dado que la exitosa destruccin de los microorganismos depende de mltiples factores entre los que interesan el tamao del recipiente, el tiempo de esterilizacin y la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas sugerencias: La esterilizacin en estufas mediante calor seco (aire caliente) es recomendable para esterilizar recipientes de vidrios secos (pipetas, cpsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4 horas en estufas a 180-200 C brindan excelentes resultados. La esterilizacin con calor hmedo con vapor bajo presin (en autoclave o en una olla a presin), es el procedimiento ms empleado para la esterilizacin de los medios de cultivo (salvo, como se indic ms arriba, para aquellos que posean componentes termolbiles). En este caso, lo ms comn es usar una presin de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, con lo que prcticamente se destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura, para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimtricas. 5) Cultivar los explantes en una cmara de transferencia con aire estril (gabinete de flujo laminar), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminacin, por lo que es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabn y se desinfecten con etanol al 70 %. La

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utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras de la boca y de la nariz, as como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero. Tambin es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y despus de cultivar el explante. 6) Incubar los cultivos en cmaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulacin de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rpidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados. 4 Medios de cultivo Un medio de cultivo puede ser definido como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col., luego de revisar ms de 3.000 trabajos cientficos describen en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60 medios cada una, listos para su utilizacin especialmente en la micropropagacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. Bsicamente, los medios de cultivo se componen de: Una fuente de carbono Nutrientes minerales Sustancias vitamnicas Sustancias reguladoras del crecimiento Agente gelificante (en el caso de medios semislidos) Otros compuestos

Fuente de carbono: Prcticamente todos los cultivos son hetertrofos (comparativamente unos pocos son auttrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azcar ms utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. Tambin myo-inositol (100 Mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los macro y micronutrientes esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente altas de nitrgeno y potasio. El nitrgeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y casena hidrolizada. Es fundamental que el hierro sea incorporado conjuntamente con un agente quelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible en un amplio rango de pH. Sustancias vitamnicas: De todas las que comnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la nica realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos. Sustancias reguladoras del crecimiento: En la mayora de los casos los medios utilizados para el establecimiento de los cultivos contienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, IBA, NOA, Dicamba, Picloram) y/o citocininas ( BA, CIN, ZEA, 2iP, Thidiazurn). Las giberelinas (especialmente GA3) son requeridas en algunas ocasiones para el cultivo de meristemas o para la elongacin de brotes. El ABA, es usado en algunos casos. Agente gelificante (en el caso de medios semislidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto ms utilizado. Tambin pueden emplearse Agargel (0,40-0,60%), Transfergel (2-2,60%), Phytagel (0,250,40%), agarosa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,10-0,20%). Otros compuestos : Muchas sustancias, de variada composicin qumica, suelen ser adicionadas a los medios bsicos. Adems de la glicina, otros aminocidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparagina y cistena, aunque hay que tener presente que en dosis altas pueden inhibir el

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Durante el perodo de incubacin, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales dismiles al ambiente externo. Tabla 1: Composicin de tres medios bsicos usados en el cultivo La atmsfera interna se caracteriza in vitro de tejidos. por presentar una considerable variacin diurna en la concentracin de CO2, humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad lumnica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azcares (en aquellos sistemas heter-trofos y semiauttrofos de micropropagacin), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfolgicas, anatmicas y fisiolgicas que las plantas debern corregir cuando son transferidas al ambiente externo. Este perodo de adaptacin al nuevo hbitat es llamado fase o etapa de aclimatacin. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deber contemplar el control minucioso de los parmetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratacin y, al mismo tiempo, estimular la fotosntesis con 5 Condiciones ambientales para la el objeto de generar un rpido crecimiento incubacin. de los plantines. La incubacin de los cultivos se debe lleEl retraso en el desarrollo de la cutcula y var a cabo en condiciones controladas. Por la escasa funcionalidad del aparato estomlo menos en lo que se refiere a temperatura, tico que presentan las hojas de la mayora

crecimiento de los cultivos. El carbn activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba metabolitos txicos para los cultivos. En algunos medios se incorporan cidos orgnicos como el mlico, el ctrico, el pirvico y el succnico y es frecuente el empleo de Lglutamina y de casena hidrolizada. An hoy se siguen utilizando ciertas sustancias de composicin qumica indefinida como el agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y pur de banana. Tambin en ocasiones es necesaria la incorporacin de agentes antioxidantes (Lcistena, cido ascrbico, polivinilpirrolidona) para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidacin de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. La preparacin de los medios de cultivo puede llevarse a cabo de diferentes maneras, en lecturas recomendadas se citan manuales de laboratorio donde se describe detalladamente este punto.

calidad e intensidad de luz, fotoperodo, humedad atmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (fro-calor), una buena y uniforme circulacin de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lmparas fluorescentes del tipo luz da con una irradiancia de entre 50 y 200mol.m-2.s-1.La humedad atmosfrica debe ser elevada (8090%). 6 Aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro.

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de las especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiracin que puede ocasionar la muerte por deshidratacin. El control de este proceso fisiolgico es de vital importancia durante la aclimatacin, teniendo en cuenta que la disminucin de la transpiracin ser gradual y depender de la rehabilitacin de los estomas, as como tambin del desarrollo de la cutcula. El equipamiento necesario estar sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde tneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiracin (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a travs del empleo de cmaras climatizadas (Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicacin exgena de ABA (hormona involucrada en el control del cierre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la superficie de la hoja. En este ltimo caso debern tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reacciones de fitotoxicidad. Resulta imprescindible evitar la exposicin a temperaturas extremas tanto en la fase area como en el substrato. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 C durante la estacin estival, mientras que en la poca invernal es necesario, a veces, el empleo de mantas trmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel del substrato, para mantener la temperatura por encima de los 18-20 C. Sin lugar a dudas, la opcin ms econmica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado (saram). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de luz natural es bajo y los das son cortos durante una parte considerable del ao, la luz artificial puede ser aplicada como complemento de la luz natural. Las lmparas tubulares fluorescentes del tipo luz da son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperodo. Asimismo, las lmparas tubulares de sodio alta presin presen-

tan una distribucin espectral de la energa adecuada para estimular fotosntesis y se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos. Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la eleccin del sustrato; siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las races. Se puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaucin de realizar una esterilizacin previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, ya sea a travs del sustrato (fertilizantes de liberacin controlada) o bien, mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); emplendose proporciones ricas en fsforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecern el desarrollo radicular y la rustificacin de las plantas. En todo momento deber realizarse un riguroso control fitosanitario emplendose antibiticos, fungicidas e insecticidas de uso universal. En la Figura 1, se detalla un modelo de cmara de aclimatacin diseada por los autores y empleada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del Nordeste. Bsicamente, est compuesta por una fase area construida en aluminio y policarbonato alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que contiene grnulos de arcilla expandida a fin de facilitar el drenaje. Mediante el agregado de arena u otro substrato adecuado, esta cmara puede ser utilizada tanto para el enraizamiento ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de multiplicacin, como as tambin, para el enraizamiento convencional (a raz desnuda) de estacas de tallos u hojas. La humedad relativa de la fase area es controlada por un sensor (6) ubicado por encima de la tubera de riego (4). El sistema humidificador est compuesto por picos tipo fog y es alimentado por una bomba de bajo caudal y alta presin (13). Con el propsito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua remanente en las caeras, el sistema consta de una vlvula solenoide de descarga y desage (7). La fase gaseosa es renovada en forma intermitente mediante el empleo de extractores ubicados en ambos extremos de la cmara (3) los que, conjunta-

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7 Agradecimientos Los autores agradecen al Ing. Pablo F. Luna por la planificacin digital de la cmara de aclimatacin. A la Secretara General de Ciencia y Tcnica (UNNE) y al Establecimiento La Cachuera por el aporte financiero recibido para construir la misma. 8 Lecturas Recomendadas
GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formulations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pg. GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE. 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pg. HURTADO, D.V. y MERINO, M.E. 1991. Cultivo de Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. Mxico. 232 pg. PREZ PONCE, J.N. 1998. Propagacin y Mejora Gentica de Plantas por Biotecnologa. Instituto de Biologa de Plantas.Santa Clara. Cuba. 390 pg. POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D. HAISEL, S. PLZAKOVA. 1999. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481497. ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edicin). Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali, Colombia, 970 pg. TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998. Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pg. TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO. 1999 Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pg.

Figura 1: Diseo de una CMARA DE ACLIMATACIN

mente, introducen o extraen aire, generando un movimiento masal. Debido a la latitud geogrfica en que se encuentra, la cmara est equipada con un acondicionador de aire (3000 frigoras) para evitar situaciones de estrs trmico en poca estival. A su vez, y dado que la mayora de las especies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales, el sistema cuenta con mantas trmicas que son colocadas por debajo de los tubetes, manteniendo la temperatura del substrato durante el invierno. En este ltimo caso se agrega un material aislante entre la leca (10) y la malla de hierro (16) de tal manera de dirigir el calor hacia la fase area.

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II.-Captulo 3
Herramientas bsicas de ingeniera gentica
Gmez, Marisa; Echenique, Viviana 1 Introduccin Hasta aproximadamente 1970 el ADN era la molcula de la clula que planteaba ms dificultades para su anlisis bioqumico. Excesivamente larga y qumicamente montona, la secuencia de nucletidos del ADN slo poda ser estudiada por caminos indirectos, tales como la determinacin de la secuencia de protenas, del ARN o por el anlisis gentico. Actualmente es posible separar regiones determinadas del ADN, obtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos y determinar incluso la secuencia de esos nucletidos. Estos adelantos tcnicos forman parte de la tecnologa del ADN recombinante, constituida por una mezcla de tcnicas, algunas de las cuales son nuevas, pero otras son adaptaciones de procesos naturales de la gentica microbiana que han sido estudiados y se conocen en profundidad. 2 Gentica microbiana En los procariotas existen mecanismos de intercambio gentico que permiten tanto la transferencia de genes como la recombinacin. La recombinacin gentica en procariotas ocurre porque se transfieren fragmentos de ADN homlogos desde un cromosoma donador a una clula receptora por uno de estos tres procesos: Transformacin: es un proceso por cual el ADN libre del medio ambiente se incorpora en una clula receptora, trayendo aparejado un cambio gentico. Esto ocurre slo en algunas especies bacterianas. El movimiento de las molculas de ADN a travs de la membrana y dentro del citoplasma de la clula receptora es un proceso activo, que requiere energa. Una clula que es capaz de tomar una molcula de ADN y ser transformada se dice que es competente. Estas clulas secretan el factor de competencia, que es

una pequea protena que induce la sntesis de 8 a 10 nuevas protenas requeridas para la transformacin. Transduccin: es un proceso por el cual el ADN se transfiere de una clula a otra por medio de un virus (que en el caso de hospedadores bacterianos se denomina fago). Puede ocurrir de dos maneras. En la llamada transduccin generalizada, una fraccin del ADN celular, que puede proceder de cualquier porcin del genoma del hospedador, pasa a formar parte del ADN de la partcula vrica madura, reemplazando al genoma del fago. En la transduccin especializada, que ocurre slo en algunos fagos atemperados (aquellos que se integran en el genoma como parte de su ciclo biolgico), el ADN de una regin especfica del cromosoma del hospedador se integra directamente en el genoma del fago, reemplazando algunos de sus genes. En ambos casos, la partcula vrica transductora es normalmente defectiva como virus, ya que los genes vricos han sido reemplazados. No todos los fagos pueden transducir, ni todas las bacterias son transducibles. Pero el fenmeno est lo suficientemente extendido para suponer que desempea un importante papel en las transferencias genticas que se producen en la naturaleza. Conjugacin: es un proceso de transferencia gentica que requiere contacto de clula a clula y que est mediado por un plsmido. Consiste en la transferencia de una copia de este plsmido al nuevo hospedador. Sin embargo, otros elementos genticos resultan a veces movilizados durante la conjugacin, como pueden ser otros plsmidos o grandes bloques del cromosoma del hospedador. La conjugacin requiere una clula donadora, que contiene un tipo particular de plsmido conjugativo, y una clula receptora que carece de l. El contacto se realiza a travs del filamento o pelo sexual, que permite el apareamiento especfico y que poseen slo las clulas donadoras. Constituye un puente de conjugacin a travs del cual pasa el ADN. 3 La clonacin molecular El desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante y la clonacin molecular han

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aportado sofisticados procedimientos que permiten el aislamiento, purificacin y replicacin de fragmentos especficos de ADN. La finalidad de la clonacin molecular es aislar gran cantidad de genes especficos, en forma pura. El procedimiento implica esencialmente dos etapas (Fig 1): Creacin del ADN recombinante, que consta de dos pasos: 1) Aislamiento del ADN de partida. Este puede ser ADN genmico, ADN sintetizado a partir del ARNm por transcripcin reversa (ADNc por copia), ADN amplificado por la reaccin en cadena de la polimerasa o sintetizado in vitro . Si se parte de ADN genmico, generalmente se corta con enzimas de restriccin para obtener los fragmentos a clonar. 2) Unin de los fragmentos de ADN a un vector de clonacin utilizando una ligasa de ADN. Un vector es una molcula de ADN que vehiculizar al fragmento de inters. Los vectores de clonacin estn diseados de forma tal que permiten la recombinacin de ADN forneo en un sitio de restriccin del vector, sin afectar su replicacin. A fin de seleccionar las clulas que incorporaron el vector, el mismo lleva genes marcadores (por ejemplo un gen de resistencia a antibiticos). Introduccin del ADN en una clula hospedadora donde se replicar (amplificacin): ste es realmente el verdadero evento de clonacin, en el cual el ADN recombinante es multiplicado para producir varias copias idnticas. Involucra tres pasos: 1) Introduccin y mantenimiento del ADN recombinante en un organismo hospedador. La molcula de ADN recombinante se introduce en el organismo hospedador, que puede ser procariota (bacterias) o eucariota (levaduras, clulas de mamferos cultivadas). En el caso de la utilizacin de sistemas bacterianos, la introduccin se realiza por los procesos naturales de la gentica microbiana (transformacin, transduccin, conjugacin) o modificaciones especficas de los mismos. Tambin se utiliza ampliamente la introduccin del ADN mediante electroporacin (descargas elctricas que crean poros en la membrana celular permitiendo la introduccin del ADN). 2) Deteccin y purificacin del clon deseado. La transferencia del ADN al hospedador

a menudo genera un grupo de clones que portan el vector. A fin de separar las clulas que incorporaron el plsmido de las que no lo hicieron se inoculan las clulas en un medio slido (agarificado) que contiene el antibitico al cual son resistentes las clulas que poseen el vector. Slo stas sobrevivirn. Luego deber buscarse especficamente aquellas clulas que poseen el fragmento de inters. Para ello puede utilizarse la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridacin molecular con una sonda especfica. 3) Crecimiento y amplificacin de las clulas hospedadoras que incorporaron el ADN recombinante deseado para su aislamiento, estudio, etctera

ADN forneo a insertar Ligacin Vector plasmdico

Gen de resistencia a antibitico

Molcula de ADN recombinante

Introduccin en la clula hospedadora

Seleccin de las clulas que contienen molculas de ADN recombinante por crecimiento en presencia de antibitico

Figura 1: Pasos bsicos en la clonacin de un fragmento de ADN. En primer lugar el ADN a clonar y el vector (plsmido) se cortan con la misma enzima de restriccin. Luego se ponen en contacto en presencia de una ligasa para obtener una molcula de ADN recombinante que se introduce en bacterias que multiplicarn el plsmido junto con el fragmento de inters (Modificado de Watson y col., 1992).

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4 Herramientas y procedimientos implicados.

Endonucleasas de restriccin La habilidad para clonar cualquier gen o secuencia de ADN de inters, depende, en gran medida, de un tipo especial de enzimas denominadas endonucleasas de restriccin, que son enzimas que cortan la molcula de ADN en sitios especficos denominados sitios de restriccin. Estas enzimas reconocen secuencias especficas de 4 a 8 bases. Las diferentes endonucleasas de restriccin son producidas por distintos microorganismos, para los cuales constituyen un mecanismo de defensa contra el ataque de fagos. Cuando el ADN de un fago ingresa en la clula bacteriana, sta lo degrada gracias a su batera de enzimas de restriccin. Para proteger su propio ADN, las bacterias contienen enzimas ( metilasas ) que se encargan de modificar (metilar) ciertas bases en los sitios que reconocen sus propias enzimas de restriccin, de manera que ya no pueden reconocer dichos sitios de clivaje. La metilacin ocurre rpidamente despus de la replicacin, catalizada por metilasas producidas por el microorganismo. Las enzimas de restriccin se denominan utilizando la primera letra del gnero y las dos primeras letras de la especie que la produce, seguidas por un nmero que indica el orden en que han sido identificadas las enzimas correspondientes a la misma especie (Tabla 1). Una interesante caracterstica de las enzimas de restriccin es que comnOrganismo Bacillus subtilis Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Haemophilus influenzae Designacin BsuRI EcoRI EcoRII EcoRV HindII

mente reconocen secuencias de ADN que son palndromes (conjunto de caracteres que se lee de igual manera de derecha a izquierda que de izquierda a derecha). Adems producen cortes en las dos cadenas . Muchas enzimas de restriccin estn compuestas de dos unidades idnticas, cada una de las cuales reconoce y corta una de las cadenas. Como las secuencias reconocidas son relativamente cortas y frecuentemente palindrmicas, tales enzimas siempre hacen cortes en ADN bicatenarios y tales cortes no estn sujetos a correccin por enzimas de reparacin. Gracias a este mecanismo pueden destruir el ADN extrao. Ciertas enzimas como Eco RI producen cortes escalonados que crean colas cortas de cuatro bases de cadena simple en cada extremo del fragmento. Estas colas tienden a asociarse a una cadena complementaria por apareamiento de bases, por eso se denominan extremos cohesivos o pegajosos (sticky ends) (Fig. 2 A). Los extremos cohesivos pueden unirse permanentemente a secuencias complementarias de otro fragmento con colas producidas de la misma manera (corte con la misma enzima), adicionando la enzima ADN ligasa, que cataliza la formacin de nuevos puentes fosfodisteres y las apropiadas condiciones de renaturalizacin. Esta cohesividad permite unir fragmentos de ADN no homlogos, una caracterstica de relevancia para la creacin del ADN recombinante. Existe otro tipo de enzimas de restriccin, como HindII, que cortan el ADN en el centro

Secuencia 5..GGCC..3 3..CCGG..5 5..GAATTC..3 3..CTTAAG..5 5..CCAGG..3 3..GGTCC..5 5..GATATC..3 3..CTATAG..5 5..GTPyPuAC..3 3..CAPuPyTG..5

Nota Genera extremos romos Genera extremos cohesivos No palindrmica Genera extremos romos Pu: cualquier purina Py: cualquier pirimidina

Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restriccin de diferentes endonucleasas de restriccin

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Figura 2: Mecanismo de corte del ADN por las enzimas de restriccin. a. Corte en secuencias palindrmicas originando extremos cohesivos (ej. enzima EcoRI). b. Corte en el centro de la secuencia de reconocimiento de la enzima, originando extremos romos (ej enzima Hind II). c. Incorporacin de extremos cohesivos a un fragmento de extremos romos por la transferasa terminal. (Modificado de Watson y col., 1992).

de la secuencia de reconocimiento (en el mismo punto, en ambas cadenas) produciendo extremos romos (blunt-ends), es decir que las bases estn apareadas en sus extremos, y por lo tanto no presentan tendencia para unirse con las bases complementarias (Fig. 2 B). Esto puede solucionarse adicionando extremos cohesivos por medio de la transferasa terminal, enzima que permite adicionar colas de poliA o poliT, que se comportarn como extremos cohesivos (Fig. 2 C).

Vectores de clonacin Como se mencionara ms arriba, un vector es una molcula de ADN que vehiculizar al fragmento de inters y permitir su amplificacin. Los vectores de clonacin ms utilizados derivan del genoma viral o de plsmidos bacterianos. Un vector de clonacin tiene tres componentes esenciales: 1. Un origen de replicacin 2. Un gen marcador fcilmente seleccionable 3. Al menos un sitio nico de restriccin 46

Los vectores de clonacin de ltima generacin son muy prcticos y sencillos de manejar. Incluyen un sitio mltiple de clonacin o sitio de restriccin mltiple (polylinker), que es un segmento corto de ADN con muchos sitios de restriccin diferentes, cada uno de ellos nico para el vector (Fig. 3 A). Este sitio suele formar parte del marco abierto de lectura (ORF) de un gen responsable de alguna caracterstica fenotpica, por lo que resulta sencillo confirmar si tras la restriccin y ligado se ha insertado efectivamente un fragmento de ADN, ya que la inclusin de este interrumpe la secuencia del vector, lo cual redunda en la prdida de funcionalidad del gen mediante inactivacin por insercin. Los vectores pueden clasificarse de la siguiente manera: A) Plsmidos: son molculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosmicas, presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy tiles como vectores de clonacin:

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Figura 3: Vectores de clonacin. a. Sitio de restriccin mltiple: corto segmento de ADN con varios sitios de restriccin, cada uno de ellos nico para el vector. b. Plsmido pBR322 con los sitios de restriccin de BamHI y Pst I dentro de los genes marcadores (genes de resistencia a la tetraciclina y ampicilina, respectivamente). (Modificado de Watson y col., 1992).

1. Pequeo tamao que permite mayor facilidad de aislamiento y manipulacin. 2. Son circulares, lo que hace que el ADN sea ms estable durante su aislamiento qumico. 3. Su replicacin transcurre independientemente del ADN nuclear en la clula bacteriana. 4. Existen mltiples copias en la clula, dependiendo del plsmido y de la especie hospedadora, puede haber de varias a numerosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copias de pBR322 por clula). 5. La presencia de genes de resistencia a los antibiticos que actan como marcadores seleccionables facilita la deteccin y seleccin de los clones que los contienen. 6. El tamao de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin embargo, si son mayores de 10 kb, el plsmido se hace generalmente inestable.

Aunque en el ambiente natural los plsmidos conjugativos generalmente se transfieren por contacto clula a clula, los plsmidos vectores de clonacin generalmente han sido modificados a fin de evitar su transferencia por conjugacin y as lograr su contencin biolgica. Sin embargo, en el laboratorio es posible realizar la transferencia a la clula hospedadora por transformacin , utilizando choque de calor, o por electroporacin. Los primeros plsmidos utilizados como vectores de clonacin existan en forma natural. El plsmido pBR322 constituye una generacin posterior de vectores construidos in vitro (Fig 3 B). En este plsmido, el sitio de restriccin de BamHI est dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstI est dentro del gen de resistencia a la ampicilina. Si se inserta un trozo de un ADN en uno de estos sitios, la resistencia al antibitico conferida por el gen que contiene este sitio se pierde (inactivacin por insercin). Por tanto, cuando pBR322 es digerido con BamHI y se liga a un ADN, y luego se aslan los clones transformados, aquellos transformantes que posean resistencia a la tetraciclina y ampicilina no portan ningn ADN clonado. Aquellas clulas que continan siendo resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen el plsmido con el fragmento del ADN clonado. Como la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina pueden determinarse independientemente en placas con agar, resulta fcil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las clulas que no los contengan. B) Bacterifagos o fagos: Fago : tiene un mapa gentico complejo. Se conoce la secuencia completa de sus 48.502 pares de nucletidos y la funcin de sus genes. El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para la lisogenia (estado integrado) pero no para el ciclo ltico (ciclo productivo de nuevas partculas virales). Esa parte central (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede ser cortada con enzimas de restriccin y substituida por un fragmento de ADN forneo (Fig. 4 A). La molcula resultante de ADN recombinante puede ser empaquetada en las cabezas del fago in vitro. Las partculas

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del fago pueden inyectar el ADN recombinante en E. coli, que se replica produciendo colonias bacterianas que contienen los fragmentos a clonar. El fago l silvestre no es indicado como vector de clonacin porque tiene demasiados sitios para enzimas de restriccin. Para obviar esta dificultad se han construdo fagos l modificados (Charon), en los cuales los sitios de restriccin no deseados han sido alterados de manera tal que la correspondiente enzima no los reconozca. Es un vector de clonacin particularmente til porque: 1. Se conoce bien su estructura, secuencia y funcionamiento 2. Puede insertar mayor cantidad de ADN que la mayora de los plsmidos (entre 10 y 20 kb) 3. El ADN puede ser eficientemente empaquetado in vitro dentro de las partculas del fago 4. Las partculas del fago son mucho ms eficientes en la infeccin de las clulas hospedadoras (transfeccin) que la transformacin. Fago M13: es un fago filamentoso que contiene ADN monocatenario y se replica sin matar a su hospedador. Para poder utilizarlo como vector de clonacin es necesario disponer de una forma bicatenaria, ya que las enzimas de restriccin slo trabajan sobre ADN de doble cadena. El ADN bicatenario de M13 puede obtenerse de clulas infectadas, donde se encuentra en forma replicativa bicatenaria. La mayor parte del genoma del tipo silvestre contiene informacin gentica esencial para la replicacin. Existe, sin embargo, una pequea regin llamada secuencia intergnica que puede ser utilizada como sitio de clonacin. Es posible clonar ADN de longitudes variables (hasta 5kb), sin afectar la viabilidad del fago. El ADN monocatenario de M13 y de sus vectores derivados ha sido extremadamente til para secuenciar ADN. Tanto en el fago l como en M13 se ha insertado un fragmento funcional de lacZ, el gen de E. coli que codifica para la enzima galactosidasa (-gal), que es utilizado como gen marcador. En el inicio de este gen se ha insertado un sitio mltiple de clonacin. Por lo tanto, los fragmentos de ADN clonados en el polylinker interrumpen el gen lacZ y

anulan la actividad de la -galactosidasa. Cuando esta enzima hidroliza un compuesto qumico denominado X-gal, se libera un colorante azul relativamente insoluble. El Xgal se incorpora al medio de cultivo en placa de Petri, donde crecern las clulas hospedadoras del ADN recombinante. Si el ADN clonado se insert en el polylinker y desactiv la -galactosidasa, no se producir pigmento azul y las clulas formarn colonias que se vern blancas en la placa de Petri. En caso contrario, las colonias de las clulas hospedadoras se vern de color azul.

C
Figura 4: Vectores de clonacin. a. Utilizacin del fago. 1. Dos sitios de restriccin EcoRI en el ADN del fago. 2. Regin central no esencial del fago 3. El ADN forneo puede reemplazar al segmento no esencial del ADN del fago 4. Unin con ADN ligasa, se eligen las condiciones para que el ADN hbrido tenga la longitud adecuada para ser empaquetada dentro de la partcula del fago y 5. Empaquetamiento del ADN hbrido aadiendo extractos celulares que contengan las partculas de la cabeza y cola para permitir la formacin de partculas viables del fago. b. Cromosoma artificial de levadura (YAC). ARS: origen de replicacin, CEN: centrmero, TEL: telmeros, URA. gen marcador seleccionable par el desarrollo en medio con uracilo. Modificado de Watson et al., 1992). c. Cromosomas artificiales de bacterias (BAC) (Modificado de Griffith et al., 2000).

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C) Csmidos: Son vectores hbridos, que combinan las caractersticas ventajosas de los plsmidos bacterianos y del fago . Cos proviene de sitio cohesivo (cohesive site), en referencia a las secuencias terminales de simple cadena de 12 bases complementarias en el cromosoma de maduro. El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de ADN de , que hace cortes escalonados que originan los extremos cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago. Poseen la habilidad del plsmido para replicarse autnomamente en las clulas de E. coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro del cromosoma de . Contienen el origen de replicacin y los genes de resistencia a los antibiticos de su plsmido parental. La principal ventaja de los csmidos como vectores es su habilidad para insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb. D) Fsmidos (fagmidos): Son vectores que combinan las caractersticas de un fago filamentoso (M13) y un plsmido (pBR323) y contienen tanto el origen de replicacin del fago como del plsmido. Normalmente la replicacin depende del plsmido, pero cuando una clula que contiene un fsmido se infecta con un fago de tipo silvestre, el origen del fago es responsable de la replicacin y se generan copias

monocatenarias. Este ADN monocatenario es empaquetado en viriones y puede aislarse fcilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente, los fsmidos pueden transportar de forma estable un fragmento de ADN clonado mayor que un vector tpico derivado de M13. E) Cromosomas artificiales: Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucariticos. En la preparacin de mapas fsicos de genomas se utilizan vectores como los csmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levaduras), los BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales basados en el fago P1). Los YAC son minicromosomas de levadura creados por ingeniera gentica que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen de replicacin y un centrmero de levadura, dos telmeros en los extremos del cromosoma, un marcador seleccionable y un sitio mltiple de clonacin. Los BAC se basan en el plsmido F de 7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300 kb, aunque el promedio es de 100 kb (Fig. 4 C). Los PAC son equivalentes. Aunque los BAC y los PAC aceptan fragmentos menores que los YAC tienen algunas ventajas:

Figura 5: Mtodo de hibridacin de Southern. a. Inclusin del ADN en el gel de agarosa. b. las molculas de ADN migran a travs del gel dependiendo de su tamao y forma, c. transferencia de las molculas de ADN del gel a una membrana por capilaridad (S. Solucin tampn, M: mecha, A gel de agarosa, N: membrana de nitrocelulosa, P: papel de filtro y peso), d. incorporacin de la sonda e hibridacin con las molculas de ADN, f: deteccin por autorradiografa, contacto de la membrana con el filme autorradiogrfico, g: revelado de la autorradiografa, observacin de las bandas hibridadas. (Modificado de Micklos et al., 1990).

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1. Son menos complejos y por lo tanto ms fciles de construir. Pueden amplificarse en bacterias y manipularse con la tecnologa bsica de los plsmidos bacterianos. 2. Contienen menor cantidad de insertos hbridos (insertos compuestos por dos o ms fragmentos no contiguos en el genoma) que los YAC. Estos insertos hbridos pueden entorpecer los intentos de ordenar los clones Por estos motivos los BAC han reemplazado a los YAC como vectores en la construccin de mapas fsicos de cromosomas enteros. Estos vectores simplifican mucho el proceso de secuenciacin, ya que an organismos simples como el nemtodo Caenorhabditis elegans poseen enormes cantidades de ADN (100 Mb). En este caso se necesitaran 2.500 csmidos para contener el genoma completo (el inserto promedio de un csmido es de 40 kb). Los YAC pueden aceptar 1Mb, por lo cual el proceso se simplifica. 5 Anlisis molecular de ADN, ARN y protenas: hibridacin. La hibridacin es la construccin artificial de un cido nucleico bicatenario por apareamiento (emparejamiento) de bases complementarias de dos cidos nucleicos monocatenarios. Para que exista la formacin de hbridos estables debe haber un alto grado de complementaridad. Se define formalmente como sonda (probe) a un fragmento determinado de ARN o ADN marcado qumica o radiactivamente, utilizado para localizar determinadas secuencias de cidos nucleicos mediante hibridacin. Anlisis de ADN por hibridaciones Southern Blot La electroforesis en gel es una poderosa herramienta para separar macromolculas de diferentes tamaos y cargas. Las molculas de ADN tienen esencialmente una carga constante por unidad de masa, por lo tanto se pueden separar en geles de agarosa o acrilamida, casi completamente, sobre la base de su tamao o conformacin. Los geles de agarosa o acrilamida actan como tamices moleculares, retardando el pasaje de las molculas ms grandes en relacin con las ms pequeas. Los geles de agarosa actan

como mejores tamices para las molculas ms grandes, mientras que los de acrilamida separan mejor las molculas pequeas. Los procedimientos utilizados, para separar cidos nucleicos y protenas tienen el mismo principio, pero involucran algunas diferencias de tcnicas debidas a las caractersticas particulares de cada clase de molculas. En 1975 E. M. Southern, public un nuevo procedimiento que permiti a los investigadores ubicar los genes y otras secuencias de ADN sobre fragmentos de restriccin separados por electroforesis en gel. La principal caracterstica de esta tcnica es la transferencia de las molculas de ADN que han sido separadas por electroforesis en gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se denomina Southern Blot, en honor al cientfico que desarroll la tcnica (Fig. 5). Para realizarla, el ADN es desnaturalizado (abierto en sus dos cadenas), sea antes o durante la transferencia, ubicando el gel en una solucin alcalina. Una vez completada la transferencia, el ADN es inmovilizado sobre la membrana por exposicin a elevada temperatura o a radiacin UV. Una sonda de ADN conteniendo la secuencia de inters es entonces incubada con el ADN inmovilizado. La sonda slo va a hibridar con molculas de ADN que contienen la secuencia de nucletidos complementaria a su secuencia. El excedente de sonda no hibridada se elimina mediante repetidos lavados de la membrana. Las sondas pueden marcarse por diferentes mtodos: con elementos radioactivos, por mtodos qumicos que producen color o luminiscencia, etc. Luego de la hibridacin, la membrana se somete a diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda, de acuerdo al mtodo con el que haya sido marcada. Anlisis de ARN por transferencia e hibridacin: Northern Blot De manera similar al tratamiento realizado con las molculas de ADN, las molculas de ARN tambin pueden ser separadas por electroforesis en geles de agarosa, transferidas a membranas y analizadas. La transferencia de ARN se denomina Northern blot, en reconocimiento al hecho de que el procedimiento es la imagen de espejo de la tcnica Southern blot. Ambos procedimientos son esencialmen-

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Figura 6: Reaccin en cadena de la polimerasa. a) Los tres pasos de un ciclo de PCR. En primer lugar se eleva la temperatura de la reaccin para separar las hebras de ADN (1) y a continuacin la temperatura baja nuevamente, lo que permite que los cebadores o primers se peguen a las regiones adecuadas de la hebra de ADN (2), y entonces se ensamblan, actuando como lmites de la regin de la molcula que va a ser duplicada. Para terminar, se eleva la temperatura nuevamente y la Taq polimerasa comienza a copiar (3), y sobre la plantilla crece una hebra nueva complementaria (4). Despus de varios ciclos se obtienen mltiples copias del fragmento en cuestin. b) La PCR es una reaccin donde el nmero de copias del gen de inters crece exponencialmente. c) Verificacin de un producto de PCR sobre un gel de agarosa. En primer calle se observa un producto de aproximadamente 1850 pares de bases (bp) de longitud, en la calles 2 y 4 fragmentos de 800 bp, en la calle 3 fall la amplificacin y en la calle 5 se han formado tres bandas debido a que el primer ha encontrado complementariedad en ms de un sitio en el genoma.

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te idnticos. Sin embargo, las molculas de ARN son muy sensibles a la degradacin por ARNasas. Por lo tanto, se debe tener mucha precaucin para evitar la contaminacin de los materiales con estas enzimas. Adems, la mayora de las molculas de ARN contienen estructuras secundarias (producidas por apareamiento complementario intracadenas), por lo tanto deben mantenerse desnaturalizadas durante la electroforesis para poder separarlas sobre la base de su tamao. La desnaturalizacin se provoca incorporando formaldehdo u otro qumico desnaturalizante a la solucin tampn (buffer) utilizada en la electroforesis. Despus de la transferencia a la membrana apropiada, las molculas de ARN pueden hibridar con sondas de ADN o ARN. Anlisis de protenas por transferencia e inmunodeteccin o Western Blot La electroforesis en gel de poliacrilamida es una herramienta muy importante para la separacin y caracterizacin de protenas. Debido a que muchas de las protenas estn compuestas por dos o ms subunidades, los polipptidos individuales son separados por electroforesis en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), que desnaturaliza las protenas. Los polipptidos separados por electroforesis tambin pueden ser transferidos del gel a una membrana de nitrocelulosa y pueden ser detectados utilizando anticuerpos especficos. Esta transferencia de protenas se denomina Western blotting y se realiza utilizando una corriente elctrica para trasladar las protenas del gel a la superficie de la membrana. Despus de la transferencia, la protena de inters es identificada colocando la membrana con las protenas inmovilizadas en una solucin que contiene un anticuerpo contra esa protena. El anticuerpo est conjugado (marcado) ya sea con istopos radioactivos, que permiten la deteccin por autorradiografa , o con enzimas que producen un producto visible cuando se adiciona el sustrato correspondiente. 6 La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR es una tecnologa poderosa que involucra la sntesis enzimtica in vitro de

millones de copias de un segmento especfico de ADN. La reaccin se basa en la hibridacin y extensin de un par de oligonucletidos, sintetizados artificialmente, utilizados como iniciadores o cebadores (primers) que delimitan una secuencia de ADN de doble cadena que se desea amplificar. Un ciclo de PCR comprende tres etapas (Fig. 6): desnaturalizacin de la doble cadena, unin de una secuencia de ADN (primer) a la hebra simple y replicacin del ADN a partir del primer. La doble cadena de ADN se desnaturaliza por elevacin de la temperatura a 92-95C. Luego la temperatura se baja rpidamente a 35-60C, dependiendo del tamao y secuencia del oligonuclotido utilizado, permitiendo la hibridacin ADN-ADN de cada primer con las secuencias complementarias que flanquean la regin objetivo. Luego, se eleva la temperatura a 72 C para que la Taq polimerasa (una ADN polimerasa termoresistente aislada de Thermus aquaticus , bacteria que vive en fuentes termales) realice la replicacin a partir de cada extremo 3 de los primers. Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada polimerizacin sirve como molde para el siguiente, cada ciclo duplica la cantidad de producto del anterior. El resultado de la reaccin es un fragmento de ADN de doble cadena, cuyos extremos corresponden a los extremos 5 de los primers y su tamao a la distancia entre los mismos. A pesar de que se forman molculas ms largas a partir del molde original en cada ciclo, se acumulan solo a una tasa lineal y no contribuyen significativamente a la masa final de secuencia blanco. Despus de apenas 20 ciclos se logra ms de un milln de veces la cantidad inicial de la secuencia de inters. Esta escala de amplificacin permite, por lo tanto, iniciar el proceso con cantidades mnimas de ADN (del orden de pico o nanogramos) y terminar la reaccin con grandes cantidades de una secuencia de inters. La versatilidad de esta reaccin es enorme y la combinacin de la PCR y la secuenciacin constituye una poderosa herramienta para el anlisis de genes. La tecnologa de PCR es de suma utilidad para amplificar ADN a partir de fragmentos clonados en distintos vectores. Solo se nece-

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sita un par de iniciadores complementarios a los sitios del vector que flanquean el fragmento para amplificar cualquier fragmento independientemente de su secuencia. Puede amplificarse ADN de material embebido en parafina por varios aos, de material momificado, de restos fsiles, etc. Se utiliza para detectar enfermedades genticas, determinar el sexo en embriones humanos, para clonar genes, para mutagnesis in vitro y para mapeo y secuenciacin de genomas, entre otras aplicaciones.

RT-PCR La reaccin de PCR en unin con la transcripcin reversa (RT-PCR) puede ser utilizada para el estudio de ARNm casi a nivel de una clula individual. Esta tcnica puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un transcripto, para estimar el nivel de su expresin y para el clonado de ADNc sin la necesidad de construir una genoteca. Consiste en la sntesis de una cadena de ADN a partir de ARNm por medio de la transcriptasa reversa (enzima extrada de virus tumorales cuyo material gentico es ARN), que utiliza ARN como molde para sintetizar una hebra de ADN. La cadena complementaria se sintetiza por PCR . Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten tener cantidades apropiadas del ADNc para diversas manipulaciones genticas. PCR cuantitativa La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar el nivel de amplificacin de una secuencia de inters, con el objeto de estimar la cantidad de esa secuencia en la muestra original. Para llevar a cabo esta deteccin existen varios mtodos pero casi todos basados en la utilizacin de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que se quiere amplificar. Esta sonda lleva adherida una molcula fluorescente y otra molcula que inhibe esta fluorescencia (quencher), de tal forma que slo cuando la sonda es desplazada de su sitio por accin de la ADN polimerasa la molcula fluorescente se libera de la accin del quencher y emite fluorescencia al ser iluminada con un lser. La fluorescencia detectada durante cada ciclo de la PCR ser proporcional a la cantidad de ADN que se est amplificando. En gene-

ral para que sea vlida esta tcnica requiere realizar en paralelo una curva patrn en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se est amplificando. Existen varios tipos de PCR cuantitativa. La ms moderna y sofisticada es la llamada PCR en tiempo real. PCR en tiempo real La PCR en tiempo real es una tcnica que ha ganado mucha importancia en los ltimos aos debido a que ofrece la posibilidad de cuantificar el nmero de copias de un transgen incorporadas en un genoma. Como se explicara ms arriba, se basa en la deteccin de un informador fluorescente cuya seal aumenta en proporcin directa con la cantidad de producto de PCR en la reaccin. Se emplea un ciclador trmico que tiene acoplado un sistema de deteccin capaz de captar y cuantificar la seal emitida por el informador al final de cada ciclo. Se pueden utilizar diferentes reactivos fluorescentes como agentes intercalantes (SYBR green) que se unen a la doble cadena de ADN dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad del producto de PCR. Tambin se pueden emplear sondas que tienen unidas un fotocromo informador y un fotocromo quencher (TaqMan ). Cuando ambos fotocromos estn unidos a la sonda, el informador no emite seal, pero cuando sta hibrida con la secuencia de inters, durante la reaccin de PCR, la enzima Taq polimerasa, mediante su actividad de exonucleasa, cliva al fotocromo informador, liberndolo del resto de la sonda y permitiendo la emisin de una seal fluorescente. Se monitorea esta seal que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR. De este modo, es posible estimar la cantidad de la secuencia original expresada en nmero de copias por genoma o en unidad de masa. En la Parte IX, Captulo 4, se detalla ms este punto y se aplica esta tcnica para la deteccin de organismos genticamente modificados (OGM). 7 Genotecas Una genoteca (gene library) es una coleccin de fragmentos de ADN clonados que representan en su conjunto el ADN to-

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tal de un organismo de inters o bien el ADNc, que representa el conjunto de genes que se estn expresando en un rgano o tejido determinado o bajo una situacin particular o momento de crecimiento o desarrollo. En el primer caso hablamos de una genoteca genmica, donde se encuentran todas las secuencias que se expresan y no se expresan en el organismo y en el segundo de una genoteca de ADNc, donde se encuentran slo las secuencias expresadas. Estas genotecas carecen de un catlogo a travs del cual se pueda saber cul es el clon que contiene una secuencia de inters. Por ello es necesario realizar un relevamiento de todas las colonias utilizando una sonda con la secuencia de cido nucleico que tenga que sea complementaria a la secuencia o gen buscados. Parte de esta secuencia puede ser conocida o puede deducirse de la secuencia de aminocidos de la protena purificada. Alternativamente, puede buscarse la protena producida por un gen clonado usando anticuerpos contra la protena o a travs de un anlisis funcional. Una de las principales dificultades en el clonado de ADN genmico es que algunas secuencias estn representadas una sola vez en el genoma y es difcil hallarlas. Para obviar esta dificultad puede clonarse directamente el ADNc, ya que el nmero de copias del ARNm en el tejido es ms elevado. El problema se plantea cuando no se sabe en qu circunstancias o en qu tejido se expresa un gen en particular. Pero existen varias formas de determinarlo. Actualmente es posible clonar un ADNc a partir de mensajeros poco abundantes en la clula, con concentraciones de 1 a 2 molculas por clula. Genotecas de ADNc El primer paso en la construccin de una genoteca de ADNc consiste en el aislamiento del ARN del cual es posible separar el ARNm tomando ventaja de la caracterstica cola de poliadeninas que posee en su extremo 3. Para ello se empaqueta en una columna de celulosa a la cual se unen oligonucletidos compuestos slo por desoxitimina oligo(dT), a travs de la cual pasa el ARN quedando el mensajero unido a la timina a travs de la cola de poliA. Este es luego eluido de la columna utilizando una solucin tampn adecuada.

Estas colas de poliA tambin son utilizadas en el prximo paso de clonado. La reaccin consiste en poner en contacto el ARNm aislado con oligo(dT) de 12 a 20 desoxitiminas que actan como cebadores o primers para la transcriptasa reversa. El producto de la reaccin es un hbrido ARN-ADN. El problema que tiene esta tcnica es que si el ADNc es muy largo, al comenzar en el extremo 3, muchas veces no se llega al extremo 5. Para salvar esta dificultad existe otra tcnica donde se utilizan primers al azar. Estos constan de 6 a 10 nucletidos de longitud y estn confeccionados de manera de representar muchas secuencias diferentes, por lo que la reaccin comienza a partir de muchos sitios diferentes, no slo del extremo 3. Por cualquiera de los dos mtodos se obtiene un hbrido ARN-ADN, a partir del cual se obtienen molculas de ADN de doble cadena que puede clonarse en el vector apropiado. El primer mtodo desarrollado para obtener la segunda cadena tomaba ventaja de una vuelta o giro que da la hebra recin sintetizada, como un efecto de cambio de rumbo de la transcriptasa reversa al llegar al final de la cadena de ARN. Este artefacto provee un cebador adecuado para la sntesis de la segunda cadena de ADN y puede eliminarse una vez obtenida la segunda cadena, con una nucleasa S1, perdindose parte de la secuencia correspondiente al extremo 5 del mensajero. Existe una segunda tcnica, que presenta dos ventajas sobre la anterior. Una es que genera molculas de ADNc ms largas y la segunda es que contiene prcticamente toda la secuencia correspondiente al extremo 5. Se basa en la utilizacin de la enzima RNasaH, que reconoce molculas hbridas ARN-ADN y digiere la cadena de ARN dejando trozos pequeos que permanecen unidos a la primera cadena del ADNc y sirven como primers para la ADN polimerasa I, que usa el ADNc original como molde para sintetizar la hebra complementaria de ADN. Slo queda un pequeo segmento de ARN en el extremo 5. La segunda cadena de ADN tiene algunos sectores no unidos que son sellados por una ligasa de ADN. Estas molculas de ADNc de doble cadena estn listas ahora para ser insertadas en

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un vector, que puede ser un plsmido o un derivado del fago l. Para ello se utiliza la transferasa terminal, que adiciona colas de poliA o poliT, o se agregan adaptadores, que son sitios artificiales de reconocimiento de alguna enzima de restriccin que se unen a los extremos de la secuencia. Se trata de oligonucletidos artificiales (8-12 bp) que se unen al fragmento utilizando una ligasa de ADN y son cortados con la enzima de restriccin apropiada (Fig. 7 a). Ambos procedimientos sirven para generar extremos cohesivos a fin de unir el fragmento al vector, que posee extremos cohesivos cortados por la misma enzima. Los plsmidos son introducidos en bacterias por transformacin (choque trmico o electrofusin), y se seleccionan por la caracterstica del gen marcador del plsmido. Si se trata de fagos, los vectores son empaquetados in vitro para formar partculas vricas, que introducirn su ADN en el hospedador apropiado por infeccin de un csped de bacterias crecido sobre la superficie de una placa de agar (Fig. 7 a). Si bien los vectores plasmdicos son ms fciles de manipular, las genotecas construidas en los fagos poFigura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadena simple complementarias a los sitios de restriccin del ADN del fago. El ADN del fago se prepara cortando con una enzima de restriccin, en este caso EcoRI, y se purifican los dos brazos del fago. Mientras tanto se adicionan al ADNc los adaptadores que llevan sitios EcoRI. Para ello se utiliza una ligasa. Previamente, el ADN se trata con una metilasa, que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restriccin, a fin de protegerlo de la accin de la enzima. Los adaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADN del fago, cortado con la misma enzima. Se genera as una serie de molculas recombinantes dispuestas en tandem, flanquedas por los sitios cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partculas infecciosas del fago, que se utilizarn para infectar un csped de bacterias. Esto se visualizar como placas o calvas. Cada placa surge de una molcula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. b) Una vez construda la genoteca puede localizarse un gen en la misma por hibridacin con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson et al., 1992).

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seen fragmentos de mayor tamao. Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) de la genoteca, se obtienen cientos de miles a un milln de placas de fagos (zonas claras o de lisis resultado de la produccin de particulas vricas) o, en el caso de vectores plasmdicos, colonias bacterianas, cada una conteniendo un fragmento clonado, distribuidas sobre la placa de agar. A fin de realizar la bsqueda de un gen particular (screening), la genoteca es replicada en membranas de nylon o nitrocelulosa, de manera tal que el patrn de placas en la caja original se vea exactamente reproducido en la membrana de nylon o filtro (Fig. 7 B). Bsqueda del gen clonado: Eleccin de la sonda La bsqueda se lleva a cabo por hibridacin con una sonda de cido nucleico, lo cual requiere un conocimiento previo de la secuencia de inters. En algunos casos, donde parte del gen ha sido clonado, este se utiliza para buscar las partes faltantes. Si se usa una sonda donde la homologa es completa, el screening puede realizarse en condiciones de alta rigurosidad (es decir, con lavados ms fuertes, temperatura elevada y concentracin salina baja, que tienden a despegar lo que se ha unido inespecficamente). Si la sonda no es completamente homloga el screening deber realizarse a menores temperaturas y utilizando concentraciones salinas ms elevadas en los lavados. Si no se tiene conocimiento previo de la secuencia puede construirse una sonda a partir de la secuencia de aminocidos de la protena. Cuando se utiliza esta estrategia, el tamao mnimo de la sonda debe ser de 15 a 16 nucletidos (que permite encontrar secuencias nicas en genotecas de ADNc eucariticos. Generalmente se utilizan sondas de 17 a 20 nucletidos (correspondientes a 6 aminocidos contiguos). Otra consideracin a tener en cuenta cuando se construye la sonda es que existe ms de un codn o triplete para definir la mayora de los aminocidos (es lo que se conoce como la degeneracin del cdigo gentico), por lo que un aminocido puede estar especificado por hasta 6 codones diferentes. Por ello, estas sondas oligonucleotdicas estn constituidas por una mezcla de todas las combinaciones posibles. Una de ellas corresponde-

r a la secuencia correcta del gen buscado. El problema de esta estrategia es el elevado nmero de falsos positivos que pueden dar las secuencias adicionales. Una variante consiste en usar un menor nmero de oligonucletidos o uno solo pero de mayor longitud (35-75 nucletidos), eligiendo una regin de la protena que contenga el menor nmero posible de codones degenerados, utilizando el conocimiento de los codones ms probables para la especie en estudio. Existen otras tcnicas para localizar genes en las genotecas de ADNc, como hibridacin diferencial, si se trata de genes expresados en diferentes tejidos o la utilizacin de sondas de regiones conservadas en familias de protenas para encontrar genes relacionados o bien la utilizacin de vectores de expresin. Genotecas Genmicas Un genoteca genmica puede obtenerse de cualquier tejido, ya que todas las clulas de un organismo tienen la misma constitucin gentica. Como se mencionara previamente, se encuentran en ella no slo secuencias expresadas y no expresadas sino tambin las correspondientes secuencias regulatorias. Pueden utilizarse fagos como vectores, pero sucede que muchos de los genomas eucariotas son muy grandes, por ejemplo el de mamferos contiene 3x109 pb de ADN. Si el promedio tpico de inserto es de 15.000 pb, se necesitarn unos 200.000 fagos para contener el genoma completo. Para asegurar que todas las secuencias estn representadas al menos una vez, los clculos estadsticos dicen que debern analizarse aproximadamente de 1 a 2 millones de fagos. Muchos genes eucariticos tienen ms de 1000 kb, por lo que deben ser clonados como un conjunto de fragmentos parcialmente superpuestos. Para esto pueden utilizarse csmidos, que pueden contener unas 45 kb. Para hacer una genoteca con estos vectores el ADN se corta con enzimas de restriccin de manera de dejar fragmentos de tamao apropiado. El csmido se empaqueta in vitro en fagos que se usan para infectar E. coli . Una vez dentro de la clula el csmido se replica y puede recuperarse de la clula como un plsmido.

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Cuando se trata de genomas muy grandes, como es el caso del humano o de varias especies vegetales y animales la utilizacin de csmidos resulta ineficiente. Por ello en estos casos se utilizan los YAC y BAC. A) Genotecas genmicas en cromosomas artificiales La capacidad de clonar fragmentos de ms de 100 kb es crucial para la genmica estructural, funcional y comparativa de organismos complejos. El primer sistema de clonado de grandes fragmentos de ADN fue

informado en 1987 por Burke y colaboradores. Este sistema estaba basado en YAC, que permitan clonar y mantener fragmentos de ms de 1000 kb en levaduras. Debido a esta ventaja el sistema fue rpidamente adoptado para los proyectos de genmica. Sin embargo, tienen algunos problemas que limitan su utilizacin, como el alto nivel de quimerismo o insertos hbridos (artefacto que resulta de la unin de fragmentos no contiguos en el genoma original en un mismo clon), la inestabilidad de los insertos y la dificultad de purificar los insertos clonados. Para minimizar estos problemas se desarrollaron sistemas alternativos que utilizan bacterias en lugar de levaduras: los BAC y los PAC, que son vectores de clonacin de copia simple. Cuando se los utiliza para transformar plantas se los llama BIBAC . BAC y PAC pueden contener establemente fragmentos mayores de 300 kb en E. coli. Para preparar una genoteca genmica, el ADN se corta con enzimas de restriccin o, para evitar la presencia de fragmentos demasiado largos o cortos, se fragmenta al azar. Un paso crtico en el proceso es el aislamiento de molculas intactas de ADN de elevado peso molecular, esencialmente ADN cromosmico. Para ello las clulas se embeben en bloques de agarosa de baja temperatura de gelificacin y se tratan con en-zimas y otros

Figura 8: Bsqueda de imgenes en una genoteca genmica. Utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasa para buscar un gen especfico en una genoteca de BACs. Las 180 placas de cultivo, de 96 pocillos, contienen un genoma vegetal completo. Estas placas se replican, de a 4, en filtros o membranas. Todos los clones de un mismo filtro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos. El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers especficos para el gen de inters. Como control positivo se utiliza un ADN vegetal, tambin amplificado por PCR. La reaccin se analiza sobre un gel de agarosa. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genmico del vegetal y tambin en uno de los clones. En este caso en el conjunto que contena los filtros 1-3. Cuando se chequean los conjuntos individuales se encuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos dar la posicin exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de inters (Modificado de Watson et al., 1992).

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reactivos para separar el ADN de las protenas celulares y del RNA. La funcin del bloque de agarosa es proteger a las grandes molculas, que, embebidas en esta matriz, se someten a la digestin con enzimas de restriccin que realicen cortes poco frecuentes (rare cutters). La preparacin de ADN de alta calidad en plantas es ms complicada que la correspondiente para el caso de animales debido a la presencia de la pared celular, que dificulta el embebido en agarosa de bajo punto de gelificacin. Para obviar esta dificultad se aslan los ncleos y se trabaja con ellos directamente. Si se desea separar estos fragmentos por electroforesis, los bloques de agarosa conteniendo el DNA digerido pueden ser directamente embebidos en la matriz del gel que se correr. B) Separacin de grandes trozos de ADN: electroforesis de campo pulstil Las tcnicas estndares de separacin de ADN en geles de agarosa no son adecuadas para molculas mayores de 10 kb. Esta limitacin ha sido subsanada con una tcnica llamada electroforesis de campo pulstil, por la cual el campo elctrico que conduce a las grandes molculas de ADN a travs del gel cambia peridicamente de orientacin. De esta manera pueden separarse molculas tan grandes como los cromosomas de levaduras (200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separacin de las molculas de este tamao depende de su relativa facilidad o dificultad para reorientarse en respuesta a direcciones cambiantes de un campo elctrico. Esta tcnica puede utilizarse para hacer mapas fsicos a gran escala. C) Preparacin de una genoteca de BAC El procedimiento consiste en 4 pasos, preparacin del vector, aislamiento y digestin del ADN y seleccin de los fragmentos por tamao, transformacin de las bacterias y ensamblado de la genoteca El vector debe estar bien purificado, digerido y defosforilado (cuando se corta con una sola enzima, se eliminan los fosfatos terminales, para evitar la recircularizacin). La digestin del ADN es crtica para obtener fragmentos adecuados para clonar. Los fragmentos son seleccionados por electroforesis de campo pulstil y se separan de la matriz de agarosa por digestin de la misma con

agarasa o gelasa, o por elucin del ADN desde el gel . Esto permite construir genotecas con fragmentos de tamaos similares, de aproximadamente 150 kb. Estas genotecas de grandes insertos son consideradas recursos de largo plazo para investigacin genmica y deben ser mantenidas continuamente, especialmente cuando son utilizadas para proyectos de secuenciado y mapeo a gran escala. En general, cuando se va a construir una genoteca debe elegirse cuidadosamente el genotipo de la especie utilizada como fuente de ADN, el tipo de inserto, etc. ya que la misma puede utilizarse para variados propsitos. Si en lugar de una genoteca de BAC se hace una de BIBAC, se tiene la ventaja adicional de poder usar directamente los fragmentos para transformar plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens En la Fig. 8 se esquematiza la bsqueda de un gen en una genoteca de BAC. Ms detalles acerca del ensamblado de los distintos fragmentos clonados pueden encontrarse en el captulo correspondiente a genmica. Genotecas de cromosomas especficos o de segmentos de cromosomas Cuando se busca un gen que se sabe est ubicado en un cromosoma especfico simplifica mucho el trabajo hacer una genoteca de ese cromosoma solamente. Se trata de una tcnica que permite separar cromosomas metafsicos teidos con un colorante fluorescente (Hoechst 33258) (para regiones ricas en AT) y cromomicina A (para regiones ricas en GC) y tratados de manera que el ADN no se desnaturalice. Los cromosomas teidos fluorescern cuando se expongan a luz UV (de longitudes de onda de 361 y 363 nm) (Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A). Las cantidades y proporciones de colorantes varan para cada cromosoma y una computadora reconoce el patrn fluorescente tpico de cada cromosoma. Algunos cromosomas son muy similares, por lo que no pueden ser separados. Se necesita un milln de cromosomas para hacer una genoteca. Equipos automticos pueden hacer este trabajo en unas pocas horas. Tambin puede microdisectarse un cromosoma, tomando un segmento del mismo que tenga la regin de inters. En principio se utiliz esta tcnica para cromosomas

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grandes, fcilmente distinguibles por microscopa de contraste de fase. Actualmente, la combinacin con PCR posibilita la aplicacin de la tcnica a cualquier cromosoma. Estos son teidos con Giemsatripsina y las bandas deseadas son cortadas con agujas de vidrio ultrafinas y clonadas. Primers posicionados en el vector permiten amplificar secuencias desconocidas. El ADN amplificado se clona en un vector apropiado y la localizacin cromos-mica de cada clon se determina utilizando hibridacin in situ (ver III.5) 8 Secuenciacin Una vez que se ha obtenido el clon con el fragmento de inters, el paso siguiente es secuenciarlo. La determinacin de la secuencia puede realizarse por el mtodo qumico de Maxam y Gilbert o por el mtodo enzimtico de Sanger. El primero consiste en la utilizacin de un compuesto que destruye selectivamente una o dos de las 4 bases que constituyen el ADN. Se realizan 4 reacciones de sntesis de ADN, marcando un extremo de las molculas, dependiendo de la base a destruir (G, A+G, T+C, C). De esta forma, se generan fragmentos de distinto tamao en funcin de la distancia de la base destruida al extremo marcado radiactivamente del fragmento a secuenciar. Los productos de las 4 reacciones se corren lado a lado en un gel de poliacrilamida y la secuencia del fragmento se determina a travs del patrn de bandas, despus de efectuada una autorradiografa para revelarlas. El mtodo de Sanger, se basa en el mismo principio y consiste en preparar 2,3didesoxinucletidos (ddNTP) de cada una de las 4 bases. Estas molculas pueden ser incorporadas al ADN por el ADN polimerasa de E.coli porque tienen un 5trifosfato normal, pero no pueden formar un enlace fosfodister con el nucletido siguiente, por lo que el crecimiento de la cadena se detiene. En la mezcla de la reaccin se incluye la cadena a secuenciar, una proporcin controlada de uno de los 4 ddNTP con su desoxinucletido normal y los otros 3 dNTP. Cuando se agrega polimerasa la reaccin comienza a partir del primero hasta que se introduce en la cadena un ddNTP, con lo

cual su crecimiento cesa. Con una proporcin correcta ddNTP:dNTP, se generan una serie de fragmentos de distinta longitud, dependiendo de la distancia de la ltima base incorporada al extremo marcado del ADN. Estos fragmentos son separados en un gel de poliacrilamida, donde, previa autorradiografa, se determina el patrn de bandas, que refleja la secuencia del ADN. Al principio, la posicin de cada banda revelada en la pelcula radiogrfica se anotaba manualmente, luego, los digitalizadores de imgenes posibilitaron la lectura directa de la pelcula. Existen actualmente secuenciadores automticos que realizan la electroforesis en gel y determinan autom-ticamente la secuencia utilizando un sistema de deteccin con lser. Messing desarroll una serie de vectores de clonado basados en el fago filamentoso M13, muy tiles para el secuenciado enzimtico. La ventaja es que slo una de las cadenas del vector es empaquetada en las cabezas del fago (ver Vectores de clonacin). Este ADN de simple cadena es ideal para utilizar con el mtodo de Sanger. Clonando el inserto en M13, en las dos orientaciones posibles, se obtiene una o la otra hebra del ADN a secuenciar. Para ello se utiliza un primer que se posiciona en un lugar adyacente a la regin de policlonado de M13, que se llama primer universal, ya que se puede utilizar para secuenciar cualquier clon recombinante. Actualmente se utilizan fsmidos (ver Vectores de clonacin). La adicin de un fago ayudante (helper phage) a las clulas que lo contienen, hace que el ADN del mismo, de simple cadena, sea replicado, empaquetado y extrado de la clula. Al ser de menor tamao (aprox. 3000 bp) que M13 permite la insercin de fragmentos de ADN ms largos. Los proyectos de secuenciacin genmica han requerido mtodos de secuenciado ms veloces y econmicos. Para ello se ha desarrollado una tcnica llamada Multiplex, que permite manejar mayor cantidad de muestras en menor tiempo. Se utilizan 20 vectores plasmdicos que permiten construir 20 genotecas diferentes a partir del mismo ADN. Cada vector lleva dos secuencias nicas que flanquean al sitio de clonado, que pueden ser usadas como eti-

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quetas (tags) para el ADN clonado y estarn presentes sobre cada fragmento a ser secuenciado. Se toma un clon de cada una de las genotecas plaqueadas (20 colonias) y se mezclan. Se hace crecer el cultivo, se asla el ADN y se secuencian los plsmidos utilizando el mtodo Maxam y Gilbert. Los productos de 12 conjuntos de reacciones de secuenciacin se corren en un gel y se transfieren a una membrana de nylon. El filtro se hibrida secuencialmente (es decir, se despega una sonda para luego hibridar con las siguiente y as sucesivamente), utilizando como sonda la etiqueta de cada uno de los 20 vectores. En cada caso se van leyendo las secuencias correspondientes a cada uno de los distintos vectores. De esta manera, una sola reaccin produce datos de 20 clones a la vez. Actualmente existen equipos robotizados que pueden llevar a cabo dos de las reacciones ms limitantes en el proceso de secuenciado: la deteccin de las bandas de ADN y la traduccin de un patrn de bandas en uno de secuencia. Estos equipos utilizan nucletidos marcados con fluorocromos. Se utilizan 4 colorantes diferentes, que al ser exitados por lser emiten luz de diferente longitud de onda. Los colorantes pueden utilizarse para marcar el primer universal de secuenciacin de M13 o cada uno de los 4 terminadores de cadena didesoxi. En este caso, cada mezcla de reaccin con un terminador diferente se marca con un colorante diferente. Cuando la reaccin es completada, los productos de las 4 reacciones se mezclan y se corren en una sola calle de un gel, en un secuenciador automtico. A medida que los fragmentos pasan a travs del l-

ser, sus marcas fluorescentes se excitan y emiten luz que se detecta mediante un fotomultiplicador. Despus de ser procesada por una computadora, la secuencia es mostrada como una serie de picos o cromatograma, donde cada uno de los 4 colores representa a un nucletido diferente (rojo: timina, verde: adenina, negro: guanina y azul: citosina). 9 Lecturas Recomendadas
FTTERER, J.; GISEL, A; IGLESIAS, V.; KLOTI, A.; KOST, B.; MITTELSTEN SCHEID, O.; NEUHAUS, G.; NEUHAUS-URL, G.; SCHROTT, M.; SHILLITO, R.; SPANGENBERG, G.; WANG, Z.Y. 1995. Standard Molecular Techniques for the Analysis of Transgenic Plants. En Gene Transfer to Plants. Potrykus, Y.; Spangenberg, G. (eds.). Springer Lab Manual. GRIFFITHS, A.; MILLER, J.; SUZUKI, D.; LEWONTIN, R.; GELBART, W. 2000. An introduction to the genetic analysis. Sptima Edicin. W:H:Freeman, N:York. 860 pp. MICKLOS, D. ; FREYER, G. 1990. DNA Science. Cold Sprong Harbor Lab. Press. Carolina Biol. Supply Comp. 477. pp. MADIGAN, M.; MARTINKO, J.; PARKER, J. BROCK. 1998 (Octava Edicin). Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall. NEWTON, C.; GRAHAM, A. 1997 (Second Edition). PCR. Springer. N. York. SAMBROOK, J.; SMITCH, E.F.; MANIATIS, T. 1989 (Second Edition). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratomy Press. Cold spring Harbor. SOUTHERN, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol. Biol. 98:503-517 WATSON, J. D.; GILMAN, M.; WITKOWSKI, J.; ZOLLER, M. 1992 (Second Edition). Recombinant DNA. Scientific American Books. N. York.

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II.- Captulo 4
Marcadores Moleculares
Picca, Aurora; Helguera, Marcelo; Salomn, Nelly; Carrera, Alicia 1 Introduccin Desde sus comienzos, el objetivo del mejoramiento vegetal ha sido seleccionar genotipos superiores a partir del reconocimiento de fenotipos superiores. El grado de xito en este proceso depende de i) el control gentico de la caracterstica, es decir el nmero de genes que la codifican y controlan (herencia monognica o polignica) y las relaciones interallicas (dominancia o aditividad), ii) el grado de influencia ambiental que se mide normalmente a travs del parmetro de heredabilidad. Una serie de tcnicas moleculares de gran desarrollo en los ltimos veinte aos permiten conocer la informacin gentica que los organismos portan. Funcionan como sealadores de diferentes regiones del genoma y se los conoce en forma genrica como marcadores moleculares . Son ampliamente utilizados en gentica humana, vegetal, animal y microbiana. Permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen stas o no su fenotipo. En relacin a los vegetales son de utilidad en estudios evolutivos y de gentica poblacional, manejo de bancos de germoplasma, identificacin, proteccin legal de germoplasma, mapeo, seleccin asistida por marcadores y clonado de genes. Para que un carcter sea considerado un marcador gentico debe mostrar una variacin experimentalmente detectable entre los individuos de la poblacin y un modo de herencia predecible segn las leyes de Mendel. Esta variacin puede ser considerada a diferentes niveles biolgicos, desde cambios fenotpicos heredables significativos hasta la variacin de un solo nucletido. Un marcador ideal debe ser: altamente polimrfico o variable dentro y entre especies, de herencia mendeliana no episttica (sin interaccin

entre genes), insensible a los efectos ambientales, codominante, de rpida identificacin y simple anlisis y de posible deteccin en los estadios tempranos del desarrollo de la planta. En los anlisis genmicos, se han utilizado varios tipos de marcadores genticos: morfolgicos, isoenzimas, protenas y marcadores basados en ADN. 2 Marcadores morfolgicos Son caractersticas fenotpicas de fcil identificacin visual tales como forma, color, tamao o altura. Muchos de ellos se convierten en importantes descriptores, a la hora de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor de 50 caracteres de plntula, tallo, hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para inscribir e identificar variedades de trigo en la Secretara de Agricultura Ganadera Pesca y Alimentacin. Este tipo de marcadores contribuy significativamente al desarrollo terico del ligamiento gentico y a la construccin de las primeras versiones de mapas genticos. Un gran nmero de marcadores morfolgicos ha sido mapeado en tomate y maz. En girasol, los primeros hbridos se obtuvieron utilizando el color de hipoctile como marcador ligado al gen ms de androesterilidad; de este modo las plantas verdes que eran androestriles se utilizaban como lneas maternas y las plantas con antocianas que eran frtiles se eliminaban del lote de produccin al comienzo de su desarrollo. Las principales limitaciones de los marcadores morfolgicos se encuentran en: i) nmero reducido de marcadores disponibles en cada poblacin, ii) bajo nivel de polimorfismo, iii) pueden producir alteraciones fenotpicas que dificultan el desarrollo de la planta, iv) varios se hallan bajo control polignico, v) dominancia, vi) muchos de ellos se expresan en estado de planta adulta, lo cual prolonga los tiempos de evaluacin en los programas de mejoramiento. No obstante, los marcadores morfolgicos permanecen como caracteres tiles en la identificacin de materiales dado que representan un conjunto de genes que pueden ser evaluados con mtodos sencillos y a bajo costo.

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3 Isoenzimas Se definen como diferentes formas moleculares de una enzima, que poseen una actividad cataltica comn, es decir actan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en el ADN que codifica estas enzimas (mutaciones) pueden resultar en cambios en la composicin de aminocidos, originando protenas con la misma actividad biolgica pero con diferente carga neta y por tanto con diferentes velocidades de migracin en un campo elctrico. Estas diferencias determinan patrones caractersticos de migracin electrofortica de las formas iso-enzimticas. Varios factores determinan el patrn de bandas o zimograma: 1) Nmero de genes que las codifican. La presencia de varios genes codificando para una misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicacin gnica y subsecuente divergencia a travs de mutaciones diferentes en cada caso. 2) Estados allicos. El proceso ms simple de generacin de nuevas formas enzimticas es la mutacin de un gen estructural; las variantes allicas se denominan aloenzimas. Estos marcadores muestran codominancia 3) Estructura cuaternaria de los productos proteicos . La enzima funcional puede estar compuesta por un nmero variable de sub-unidades. En las formas ms simples o monomricas los individuos homocigotas presentan una banda y los heterocigotas simplemente la suma de ambas. Cuando la estructura cuaternaria se vuelve ms compleja, encontramos enzimas activas compuestas por dmeros, tetrmeros, etc.. En este caso el individuo heterocigota presenta bandas adicionales no presentes en los homocigotas, que se generan por la combinacin de subunidades codificadas por los distintos alelos o loci. (Fig. 1). 4) Compartimentalizacin subcelular. Se encuentran formas enzimticas localizadas en citoplasma, cloroplasto o mitocondria, codificadas todas por genes nucleares pero con diferentes velocidades de migracin. Las isoenzimas se obtienen por homogenizacin del tejido (semilla, raz, hoja)

Figura 1: Locus isoenzimtico Pgd-3 en girasol. Variantes allicas a y b. Genotipos parentales P1, P2 homocigotas y F1 heterocigota

en soluciones buffer y se analizan mediante electroforesis en un soporte slido, generalmente almidn. El gel puede ser cortado en capas horizontales y cada una se destina a una solucin de revelado especfica que consta de un sustrato, un colorante y cofactores, disueltos en un buffer apropiado. La preparacin del gel es relativamente simple y el equipamiento es de bajo costo. Las enzimas se clasifican de acuerdo a su funcin y se representan con una sigla de tres letras. Por ejemplo: dehidrogenasas (alcohol dehidrogenasa ADH, glutamato dehidrogenasa GDH), oxidasas (peroxidasas PRX), hidrolasas (fosfatasas cidas ACP, esterasas EST), isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI) y transferasas (fosfoglucomutasas PGM). Los loci en general se representan con las tres letras sealadas en tipo cursiva y se agrega un nmero para designar al locus y una letra para el alelo, de acuerdo a distancias decrecientes de migracin. Por ejemplo: Adh-1a, Adh-1b, Adh-2a, Adh-2b, Adh-2c. Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura gentica, sistemtica y biologa evolutiva as como en descripcin de germoplasma e identificacin de variedades. Su aplicacin en la construccin de mapas se ha visto limitada por el nmero de marcadores isoenzimticos disponibles, en general menor a 50 y por su reducido polimorfismo, 2-4 alelos. Por otro lado, las formas enzimticas extradas de hoja o raz (no as las de semilla) presentan variaciones en relacin a las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo cual afecta la reproducibilidad de los zimogramas. No obstante, estos loci representan importantes marcas de referencia para relacionar mapas obtenidos a partir de

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distintos marcadores de ADN. 4 Protenas de reserva El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. Almidn y protenas son las dos macromolculas ms importantes. El contenido de protena vara segn la especie y el manejo de cultivo a campo. Los valores ms altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los ms bajos en maz y arroz (6%). La concentracin de protenas en los cereales es apreciablemente menor que en las leguminosas ya que en stas los rganos de reserva o cotiledones son capaces de almacenar hasta un 40% de su peso seco en protenas. Las protenas del endosperma fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por Osborne, quin dio las bases para las clasificaciones actuales. La misma se basa en la solubilidad relativa en diferentes solventes: albminas solubles en agua, globulinas en solucin salina, prolaminas en alcohol y glutelinas en cidos o lcalis. Para el grupo de las prolaminas se ha asignado un nombre especfico para cada uno de los cereales. De esta manera en maz se la denomina zena, en cebada hordena, en avena avenina y en trigo gliadina. En el caso especfico de trigo a las glutelinas se las conoce con el nombre de gluteninas. En la mayora de los cereales las prolaminas y glutelinas estn codificadas por varios genes relacionados conformando familias. Durante la evolucin de estos genes se han detectado duplicaciones, translocaciones, inserciones de elementos mviles entre otros re-arreglos cromosmicos. Estos cambios genticos han generado un alto nivel de polimorfismo proteico entre especies, as como entre variedades de la misma especie. Adems, el anlisis gentico de cruzamientos ha demostrado que la variacin en el patrn de protenas es debida a la existencia de variantes allicas en cada locus. Las glutelinas se analizan en geles discontinuos de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio, en medio bsico (SDS-PAGE) utilizando diferentes tamaos de poros (tamiz molecular) (Fig. 2). El fraccionamiento de las prolaminas se realiza en electroforesis ci-

Figura 2: Fraccionamiento de Gluteninas en variedades de trigo por SDS-PAGE para su correlacin con variables de calidad industrial.

da (A-PAGE), en geles continuos, utilizando el principio de diferencias en la carga elctrica. La visualizacin se realiza en ambos casos mediante tincin con Coomassie Brilliant Blue R250. En trigo pan, Triticum aestivum, los genes estructurales para las dos principales protenas, gluteninas y gliadinas, estn confinados al conjunto de los cromosomas homelogos (cromosomas parcialmente homlogos pertenecientes a los tres genomas) 1 y 6. Los genes para las subunidades de gluteninas de alto peso molecular (GAPM) estn ubicados en el brazo largo de los cromosomas 1A,1B y 1D, cercanos al centrmero. Las gluteninas de bajo peso molecular (GBPM) son codificadas por genes ubicados en los brazos cortos de ese mismo grupo de cromosomas, distantes del centrmero. El patrn electrofortico de las gliadinas muestra cuatro grupos proteicos denominadas a, b, g y w gliadinas. Las fracciones g y w se encuentran codificadas por genes del cromosoma 1 de los tres genomas, prximos al grupo de genes correspondientes a GAPM. Los genes de las fracciones a y b se ubican en el brazo corto de los cromosomas 6A, 6B y 6D. La localizacin cromosmica de los genes de protenas en trigo se ha establecido principalmente utilizando materiales aneuploides tales como nulismicos o tetrasmicos de la variedad Chinese Spring. La posicin relativa del locus sobre el cromosoma fue determinada por cruzamientos entre lneas con contenidos contrastantes de protena y determinando la frecuencia de recombinacin en la progenie. La posicin cromosmica de estas protenas ha sido estable a lo largo de la

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evolucin y han sido usadas como marcadores para el estudio de la homeologa cromosmica de la Tribu Triticeae. 5 ADN y marcadores moleculares Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen. Diversas tcnicas de biologa molecular se encuentran disponibles para detectar variabilidad en la secuencia de ADN. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), las enzimas de restriccin, la separacin electrofortica de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las tcnicas que permiten obtener un nmero virtualmente ilimitado de marcadores moleculares y cubrir la totalidad del genoma de un organismo (para ms detalles ver II.- 3) Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos: A) Marcadores basados en la hibridacin del ADN: los ms utilizados en plantas son los RFLP restriction fragment length polymorphisms o polimorfismos en la longitud de fragmentos de restriccin de ADN. Este tipo de estudio involucra la deteccin de un segmento especfico (marcador molecular) en el ADN de estudio por hibridacin con un fragmento marcado radiactivamente de secuencia complementaria al marcador (sonda). En el proceso, el ADN en estudio es digerido por medio de una enzima de restriccin. Este tipo de enzimas corta el ADN en una secuencia determinada o sitio de restriccin. La variabilidad gentica presente en el marcador molecular se observa como diferencias en la secuencia del ADN genmico debidas a duplicaciones, deleciones, inserciones, etc. que modifican la distancia entre pares de sitios de restriccin y generan fragmentos polimrficos (de diferentes tamaos). Los fragmentos clivados por la enzima de restriccin se separan por su tamao mediante electroforesis y se transfieren a una membrana donde son hibridados con la sonda. En el proceso, la sonda hibrida solamente con fragmentos de ADN inmovilizados en la membrana que presenten la secuencia complementaria a la misma. Para visualizar los polimorfismos se expone la membrana a una

placa radiogrfica La ventaja de los RFLPs radica en que son altamente reproducibles, codominantes y multiallicos. A su vez cuentan con la desventaja de ser muy laboriosos, difciles de automatizar, requieren de infraestructura adecuada para mantener las sondas, trabajar con radiactivos, lo que los hace relativamente caros. Los minisatlites o VNTR variable number of tandem repeats son repeticiones en tandem de secuencias del genoma que contienen de 9 a 100 pares de bases. El nmero de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridacin o por tcnicas de PCR. El ADN genmico es digerido con enzimas de restriccin que reconocen los sitios de restriccin que flanquean las repeticiones en tandem, separado electroforticamente e inmovilizado en una membrana. Cuando la enzima de restriccin corta las secuencias adyacentes a un locus hipervariable, la longitud de los fragmentos de restriccin producidos en diferentes individuos vara con el nmero de repeticiones de minisatlites. Estos fragmentos con diferentes longitudes son detectados utilizando sondas diseadas a partir de las secuencias de ADN que flanquean las repeticiones o a partir de las repeticiones mismas. Estos fragmentos pueden ser considerados como un tipo especfico de RFLP. La diferencia bsica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la tcnica de VNRT las sondas estn constituidas por secuencias homlogas a las secuencias repetidas de los minisatlites, por lo tanto todos los locus hipervariables son detectados simultneamente, mientras que en RFLP, las sondas son homlogas a secuencias nicas del genoma, detectando as uno o pocos loci cada vez. De esta manera, en el autoradiograma al contrario del patrn simple de bandas obtenido por RFLP (una banda para genotipos homocigotas o dos bandas para genotipos heterocigotas), para minisatlites se obtiene un perfil complejo de bandas mltiples. Una ventaja de los VNRT, es que adems de explorar el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin en cada locus hipervariable, utilizan tambin el polimorfismo en el nmero y distribucin de estos loci a lo largo del genoma, posibilitando as

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la visualizacin simultnea de diversas regiones del mismo. Las limitaciones para esta tcnica, son las mismas descriptas oportunamente para RFLP. Los minisatlites tambin pueden ser detectados mediante la amplificacin por PCR de los segmentos conteniendo diferente nmero de repeticiones, utilizando primers o cebadores, que flanqueen dichos segmentos.

B) Marcadores basados en la amplificacin del ADN: mediante la reaccin de PCR polymerase chain reaction o reaccin en cadena de la polimerasa de ADN. Esta tcnica se basa en la sntesis enzimtica de millones de copias de un segmento especfico de ADN en presencia de una polimerasa de ADN termoestable. Para ello se utilizan dos oligonucletidos llamados cebadores o primers. El segmento de ADN a amplificar esta compuesto por dos hebras (a y b), la secuencia de uno de los oligonucletidos hibrida en uno de los extremos del segmento y es complementaria a la hebra a, el segundo oligonucletido hibrida en el otro extremo del segmento y es complementario a la hebra b. Para que exista amplificacin del fragmento es imprescindible que ambos oligonucletidos hibriden en secuencias complementarias presentes en las hebras del ADN en estudio. La presencia de mutaciones en el sitio de hibridacin de cualquiera de los oligonucletidos impide la amplificacin del fragmento. La necesidad de disponer de informacin previa acerca de la secuencia del ADN a amplificar para disear oligonucletidos, limit inicialmente el desarrollo de marcadores Figura 3: RAPDs en DNA genmico de trigo candeal. basados en la reaccin de Genotipos parentales K y D y progenie F7. PCR en plantas. La primera solucin a este problema vino de la mano de que son rpidas y sencillas, de bajo costo de los RAPDs random amplified polymorphic implementacin, automatizables y no radioDNAs o fragmentos polimrficos de ADN activas. La desventaja, adems de su baja amplificados aleatoriamente. Esta tcnica reproducibilidad, es que es un marcador dose basa en la utilizacin de un nico minante (al observar un fragmento es impooligonucletido de 10bp que hibrida al azar sible determinar si el mismo se origin de una con el ADN en estudio. Para que se genere o dos copias de la secuencia amplificada). un fragmento RAPD es necesario que las dos La disminucin en los costos de secuen-

hebras del ADN en estudio presenten sitios de hibridacin con el oligonucletido en orientaciones opuestas suficientemente cercanas (menos de 3000bp) como para permitir la amplificacin. La secuencia del oligonucletido es aleatoria al igual que los sitios de hibridacin, por lo que la secuencia amplificada es desconocida. El polimorfismo que se observa entre distintos individuos consiste en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado (Fig. 3). DAF DNA amplification fingerprinting y AP-PCR arbitrary primer PCR son tcnicas similares a RAPDs. DAF involucra el uso de primers arbitrarios de longitud tan corta como 5 pares de bases. Esto reduce la especificidad del apareamiento con el ADN molde y resulta en un perfil ms complejo de bandas. La visualizacin se lleva a cabo por medio de geles de poliacrilamida teidos con plata. AP-PCR utiliza primers ligeramente ms largos que la tcnica anterior (aprox. 20 pares de bases). Los productos de amplificacin son marcados radiactivamente y tambin pueden ser resueltos por electroforsis en geles de poliacrilamida La ventaja de estas tcnicas consiste en

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ciacin y PCR, junto a la creciente informacin sobre genomas animales y vegetales han permitido el desarrollo de marcadores basados en PCR con diferentes caractersticas, entre ellos los ms frecuentemente utilizados en plantas son: SSR simple sequence repeats o microsatlites y AFLPs amplified fragment length polymorphisms. Los microsatlites (SSR), son regiones genmicas hipervariables constituidas por repeticiones en tandem de unos pocos pares de bases (1 a 4) flanqueadas por secuencias de copia nica. La base gentica del polimorfismo detectado en microsatlites se basa en la variabilidad del nmero de repeticiones en tandem y consecuentemente del tamao del microsatlite amplificado en individuos de una especie. El microsatlite amplificado por PCR es sometido a electroforesis en geles de alta resolucin que permiten detectar diferencias de 2, 3 o 4 nucletidos que corresponden al mnimo polimorfismo de longitud en un microsatlite. Por el alto polimorfismo que presentan por locus (multialelismo) se los considera los marcadores ideales para el mejoramiento en especies autgamas como el trigo. Estos marcadores son codominantes, genoma-especficos y altamente polimrficos en comparacin con los RFLPs y RAPDs. Su implementacin en un laboratorio requiere de mayor infraestructura y presupuesto que los RAPDs. C) Marcadores mixtos: AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados de ADN) puede considerarse como una combinacin de RFLP y RAPDs. Esta tcnica consiste en esencia de cuatro etapas: 1) el ADN genmico es cortado con enzimas de restriccin (generalmente una de corte raro y otra de corte frecuente). 2) adaptadores de ADN de doble cadena se adhieren en forma especfica a los extremos de los fragmentos obtenidos en el paso anterior, generando as el molde para la amplificacin del ADN. 3) una fraccin de los fragmentos obtenidos es amplificada selectivamente por la accin de primers especficos que fueron diseados para reconocer la secuencia de los adaptadores ligados en el segundo paso, el sitio de la enzima de restriccin, ms una a tres bases selectivas al azar agregadas en el

extremo 3. El uso de bases selectivas al azar permite la amplificacin de slo un grupo de fragmentos de restriccin (aquellos en que coincide la secuencia del adaptador + sitio de restriccin + bases selectivas). 4) anlisis de la subpoblacin de fragmentos amplificados mediante su desnaturalizacin por electroforesis en geles de alta resolucin (poliacrilamida) y visualizacin por autoradiografa o por tincin con nitrato de plata (Fig. 4). Su implementacin en laboratorio requiere de una infraestructura y presupuesto similar a los microsatlites. Estos marcadores presentan un alto poder de deteccin de la variabilidad gentica, ya que se explora simultneamente el polimorfismo de ausencia/presencia de sitios de restriccin (como los RFLP) y la ocurrencia o no de amplificacin a partir de secuencias arbitrarias (como los RAPDs). La base del polimorfismo es la ausencia o presencia de fragmentos amplificados de un tamao determinado y al igual que en los RAPDs, no es posible distinguir individuos heterocigotas por lo que se trata de un marcador dominante. Es un marcador mucho ms robusto

Figura 4: AFLPs en trigo candeal. Cinco combinaciones de primers para las enzimas de restriccin Pst I y Mse I en las variedades K y D.

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que los RAPDs, ya que en la amplificacin se (ARNm transcripto a ADN utilizando la enziutilizan oligonucletidos ms largos, que au- ma transcriptasa reversa). La ventaja de los mentan significativamente la especificidad de ESTs, al ser derivados de ARNm maduro es la reaccin sin perder las ventajas de la am- que generalmente se ven libres de intrones plificacin de secuencias al azar (no requiere y de ADN repetitivo. Esto implica que los ESTs informacin previa de secuencia de ADN). representan genes funcionales y son por lo Otra ventaja de los AFLPs es el nmero de tanto ms tiles como marcadores fragmentos (marcadores) resueltos por moleculares que las secuencias annimas. electroforesis que oscila entre 30 - 50 contra En una variante conocida como CAPs los 4 10 de RAPDs. cleavage amplified polymorphic Para una utilizacin ms eficiente en pro- sequence, los productos de amplificacin de gramas de mejoramiento de marcadores secuencias especficas se digieren con una RFLPs, RAPDs y AFLPs existe la posibilidad de enzima de restriccin. Este mtodo permite transformarlos en marcadores PCR alelo-es- identificar individuos heterocigotas, por lo pecficos, que son econmicos, robustos y de que se comporta como marcador codomisencilla implementacin en cualquier labora- nante. La informacin para la secuencia de torio. los primers utilizados en CAPs puede proveExisten distintas estrategias para la con- nir de un banco de genes o de clones versin de marcadores RFLP, RAPDs y AFLPs genmicos o de cDNA. Recientemente meen marcadores PCR alelo-especficos, en ge- diante CAPS ha sido posible seleccionar planneral ligados a un caracter de inters agro- tas de trigo hexaploide portadoras del alelo nmico. Se conocen como STS sequence- 2NS, proviente de una translocacin de tagged sites. En estos casos se aisla el frag- Triticum ventricosum que contiene genes de mento de ADN polimrfico del gel, se clona, resistencia a roya Lr37, Sr38, Yr 17 (Fig. 5). se secuencia y se disean oligonucletidos especficos de alrededor de 20 pb, para ser utilizados como cebadores. Cuando se parte de un fragmento RAPD, el marcador derivado mediante este proceso es conocido como SCAR regin amplificada de secuencia caracterizada. El paso siguiente es detectar el alelo de valor agronmico Figura 5: CAPS en trigo. Calle 1 planta control (sin amplificacin). Calles superior, por ejemplo un alelo 2, 3, 6 y 7 plantas homocigotas para el alelo 2AS (275 pb = 166 + 109). 4 y 5 homocigotas 2NS (285 pb). Calles 8 y 9 plantas heterocigotas asociado a la resistencia a un pa- Calles 2AS/2NS. tgeno y el marcador entonces se hace evidente con una simple reaccin de PCR. El problema que enfrentan Existen tcnicas de alta resolucin que estas estrategias suele ser el bajo nivel de permiten detectar mutaciones a nivel de un polimorfismo entre variedades de una espe- solo nucletido conocidas como SNPs sincie (trigo, soja, etc), lo que disminuye las po- gle nucleotide polymorphisms. Entre ellas, sibilidades de encontrar mutaciones tiles los SSCPs single-strand conformational para desarrollar estos marcadores. De todos polymorphism tienen la capacidad de demodos, existen antecedentes exitosos de tectar cambios de un solo nucletido en fragdesarrollo de marcadores de PCR alelo-espe- mentos de ms de 1000 pares de bases. La cficos en trigo para locus altamente tcnica de SSCPs se basa en la movilidad de polimrficos como pueden ser alelos de las cadenas simples del ADN en geles de gluteninas. poliacrilamida no desnaturalizantes, moviliLos ESTs expressed sequence tags son dad que depende tanto de su tamao como similares a los STSs y sirven para los mismos de su secuencia. Las cadenas simples de ADN propsitos pero derivan de clones de cDNA tienen tendencia a formar apareamientos

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intramoleculares de bases que resultan en una conformacin dependiente de la secuencia y con una movilidad especfica en geles de acrilamida. Por lo tanto cambios en la secuencia del ADN, aunque sea de un solo par de bases, causan modificaciones en la conformacin y consecuentemente en la movilidad electrofortica. Los SSCPs pueden detectarse clivando el ADN con enzimas de restriccin, separando los distintos fragmentos segn su conformacin por corrida en un gel. Posteriormente se realiza una hibridacin de Southern a partir del gel con fragmentos especficos como sondas para la hibridacin. Otra metodologa para obtener SSCPs consiste en la amplificacin de un fragmento especfico por PCR y posterior corrida electrofortica en geles de alta resolucin. De la descripcin realizada, se desprende que los marcadores varan ampliamente en el grado de complejidad del mtodo, el modo de herencia, el nivel de polimorfismo y en los factores costo y tiempo, de gran importancia cuando los objetivos del estudio incluyen el anlisis de un nmero elevado de individuos. La tabla 1 resume algunos aspectos importantes a considerar a la hora de elegir el tipo de marcador a utilizar.

CARRERA, A.; POVERENE, M.; RODRGUEZ, R. 1996. Isozyme variability in Helianthus argophyllus. Its application in crosses with cultivated sunflower. Helia 19 (25): pp. 19-28. DIEFFENBACH, CW.; DVEKSLER, GS. 1995. PCR primer: A laboratory manual. CSHL press. 714 pp. DUBCOVSKY 2003. PCR assays for the Lr37-Yr17-Sr38 cluster of rust resistance genes and their use to develop isogenic hard red spring wheat lines. Crop Science, en prensa. FERREIRA, M.; GRATTAPAGLIA, D. 1996. Introduao ao uso de marcadores moleculares em anlise gentica. 2 ed. EMBRAPA-CENARGEN. 220 pp. GUPTA, PK.; VARSHNEY, RK.; SHARMA, PC.; RAMESH, B. 1999. Molecular markers and their applications in wheat breeding. Pl. Breed. 118: pp. 369-390. HELGUERA, M.; ECHENIQUE, V. 2003. Biotechnology in wheat breeding. Aceptado para publicar en Advances In Plant Physiology, vol 7. NG., P.K.; BUSHUK, W. 1987. Glutenin of Marquis Wheat as a Reference for Estimating Molecular Weights of Glutenin Subunits by Sodium Dodecyl SulfatePolyacryilamide Gel Electrophoresis. Cereal Chemistry. 64(4): pp. 324-327. SALOMN, N., MIRANDA, R.; POVERENE, M. 1998 Variacin de la calidad panadera en trigos de diferentes orgenes a travs de la escala Glu-1. IV Congreso Nacional de Trigo y II Simposio Nacional de Cereales de Siembra OtooInvernal. Mar del Plata. pp. I-21. SALOMN, N., CARRERA, A.; MIRANDA, R.; POVERENE, M. 2001. Estudio de los descriptores de trigo en Argentina. Publicado en Estrategias metodolgicas utilizadas en el mejoramiento de trigo: Un enfoque multidisciplinario. Colonia, Uruguay. pp. 294. SOLTIS, D.; SOLTIS, P. (Eds.). 1989. Isozymes in Plant Biology . Advances in Plant Sciences Series. Vol. 4. Portland, Oregon. 268 p.

Tabla 1: Comparacin entre algunos sistemas de marcadores moleculares.

6 Lecturas recomendadas
BUSHUK W.; ZILLMAN, R.R. 1978. Wheat Cultivar Identification by Gliadins Electrophoregram I: Apparatus, methods and nomenclature. Canadian Journal of Plant Science, 58: pp. 505-515.

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PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMN, Nelly; CARRERA, Alicia

II.-Captulo 5
Citogentica
Poggio, Lidia; Naranjo, Carlos A. 1 Introduccin Los estudios citogenticos han permitido realizar valiosos aportes al conocimiento de los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiacin en plantas. La especiacin hbrida es muy comn en el reino vegetal, en especial la especiacin por poliploida. En estos casos la citogentica, a travs del anlisis genmico, ha contribuido a la resolucin del origen y evolucin de distintos grupos taxonmicos. Mutaciones cromosmicas que alteran la morfologa de los cromosomas jugaran un papel importante en la determinacin de los mecanismos de aislamiento reproductivo y distintos modos de especiacin. Aun sin alterar la morfologa de los cromosomas, existen ejemplos en los que mutaciones gnicas que afectan el apareamiento han sido determinantes en la evolucin de distintos grupos. La citogentica brinda valiosos aportes para la resolucin de problemas taxonmicos, evolutivos y aplicados. Esta disciplina tiene grandes ventajas pero tambin limitaciones y sus aportes deben ser complementados con estudios provenientes de otros campos. Sin embargo es importante sealar que trabajar en biologa o gentica de eucariontes, usando tcnicas clsicas o moleculares, pero desconociendo las caractersticas y el comportamiento de sus cromosomas puede llevar a errores en la interpretacin de causa y efecto de muchos fenmenos. En esta contribucin se explicar brevemente la informacin que la citogentica puede brindar, con el anlisis del cariotipo, anlisis meitico en hbridos y poliploides, estudio de la variacin intra e interespecifica en el tamao del genoma y con la citogentica molecular (hibridacin in situ , FISH, GISH), exponiendo como ejemplos, algunos aportes realizados por nuestro grupo de trabajo.

2 Anlisis del cariotipo Las caractersticas estructurales y cuantitativas de los cromosomas (cariotipo) son importantes en investigaciones bsicas (taxonmicas y evolutivas) y aplicadas. Los taxnomos y evolucionistas estn familiarizados con el hecho de que los cromosomas son parte de un sistema dinmico que est moldeando el proceso de evolucin. Esta variacin se expresa en caractersticas fcilmente analizables como el nmero, forma y tamao de los cromosomas y no est relacionada con complejidad gentica u organsmica. Es importante analizar tambin, la cantidad y localizacin de heterocromatina (ADN repetitivo no codificante) mediante distintas tcnicas de bandeo, y caracterizar citoqumicamente distintos tipos de heterocromatina utilizando fluorocromos, y en algunos casos, identificar ADN satlite y relacionarlo con bandas heterocromticas. Adems, deben localizarse las regiones organizadoras del nucleolo (NOR). Es frecuente y normal la existencia de variacin cariotpica interespecfica. Por otro lado, aunque menos frecuente, tambin puede existir variabilidad cariotpica intraespecfica manifestada como polimorfismos o politipismos cromosmicos. Varios parmetros del cariotipo pueden ser alterados por rearreglos estructurales. En algunos casos puede variar el nmero cromosmico y la simetra del cariotipo. Un ejemplo de este caso lo constituyen las fusiones cntricas entre cromosomas con centrmero subterminal produciendo cromosomas metacntricos de mayor tamao, con o sin eliminacin de regiones centromricas. El fragmento con centrmero puede persistir como un cromosoma supernumerario o cromosoma B. En otros casos no se encuentra variacin en el nmero cromosmico ya que en muchos gneros el nmero y, a veces, la morfologa cromosmica es constante entre las distintas especies que lo componen. En Bulnesia (Zygophylaceae) siete de las nueve especies que lo componen son diploides (2n=26). Sin embargo existen diferencias importantes interespecficas en cuanto a la morfologa cromosmica, simetra del cariotipo y tamao del genoma. El cariotipo de B. retama es el ms asimtrico ya que

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posee un cariotipo bimodal por adicin de heterocromatina en 24 de los 26 cromosomas del complemento. El nmero cromosmico tambin puede variar por poliploida. Nuevos nmeros bsicos que no tengan relacin directa con los ancestrales pueden surgir si ocurren nuevas reestructuraciones o hibridacin entre poliploides con distintos nmeros bsicos. Variaciones en el cariotipo pueden ocurrir sin cambios notorios en el exofenotipo. Sin embargo rearreglos en condicin heterocigota pueden ocasionar disturbios en el apareamiento meitico e iniciar aislamiento reproductivo. Si se dan las condiciones adecuadas para la fijacin de estos rearreglos pueden iniciarse eventos especiognicos que involucren rearreglos cromosmi- FIGURA 1. A-E = Bandeo C. A, C, E = metafases mitticas. B, D = interfases. A, B = cos. Estos procesos Zea luxurians. C, D = Zea mays ssp. mays. E = Bulnesia retama, las flechas sealan el nico par de cromosomas metacntricos eucromticos.- F = Metafase I. Eulophia pueden conducir, en paiveana ssp. borealis, n = 42; las flechas muestran ejemplos de asociacin algunos casos, a la exis- secundaria de bivalentes.- G, H = Zea luxurians x Z. diploperennis , n = 10; G = tencia de especies Metafase I, 8 bivalentes y 4 univalentes, la flecha seala un bivalente heteromorfo; crpticas o hermanas, H = Anafase I, 2 puentes (flechas) y 2 fragmentos (cabeza de flecha).- I, J = Zea mays ssp mays, diacinesis. n = 10; I = dos grupos de 5 bivalentes y un cromosoma B; J = con pocas diferencias a Asincrona meitica, 5 bivalentes en Metafase I y 10 cromosomas en Anafase I.- K = nivel bioqumico o Zea luxurians x Z. perennis, 2n=30; metafase I, 5 trivalentes, 5 bivalentes y 5 morfolgico pero con univalentes. A-D y F-K poseen el mismo aumento. Las barras representan 10 micrones. diferencias cromos- Ver explicacin extensa de las figuras en: Poggio et al., 1986a y b, 1999; Tito et al., 1991. micas que las mantendran aisladas reproductivamente. matina constitutiva compuesta por secuenUn anlisis ms preciso de la variacin cias cortas repetidas en tandem. La cariotpica puede obtenerse empleando tc- heterocromatina constitutiva es un componicas de bandeo que revelan marcadores nente aditivo del genoma y presenta, en cromosmicos (secuencias de ADN altamen- muchos grupos, variacin intra e te repetidas ricas en AT o GC, regiones orga- interespecfica. Aunque no contiene genes nizadoras del nucleolo, etc.). El bandeo C es activos podra tener importancia en eventos el que se utiliza de rutina y revela heterocro- regulatorios, en el desarrollo y en la organi-

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zacin tridimensional de los cromosomas en el ncleo. Bennett (1983, 1988) crea el trmino cariotipo natural para referirse al ordenamiento de los cromosomas de acuerdo a la posicin real que los mismos ocupan en el ncleo interfsico. Se han postulado varios modelos que explican la organizacin supracromosmica en los ncleos eucariontes estableciendo que si bien sta no es universal, es indudable que la informacin gentica no est contenida caoticamen-te en el ncleo sino que est ordenada de acuerdo a patrones que actualmente no conocemos. 3 Anlisis meitico en hbridos y poliploides Una especie diploide con reproduccin sexual para ser frtil debe poseer un comportamiento meitico normal, o sea que debe poseer buen apareamiento entre cromosomas homlogos y consecuentemente formacin de bivalentes. Ello determina que exista buena segregacin y formacin de gametos balanceados y frtiles. En general el grado de apareamiento meitico es una medida de la homologa que existe entre los cromosomas. Esto es cierto cuando son normales los genes que regulan fisiolgicamente todas las etapas y procesos de la divisin meitica. Estos principios han permitido realizar rpidas evaluaciones de la homologa genmica entre dos entidades por medio del estudio meitico de su hbrido F1, cuando stos han sido posibles de obtener artificialmente o se los ha encontrado en poblaciones naturales. Si el hbrido analizado es frtil y posee formacin de bivalentes se puede concluir que hay afinidad (homologa) entre los genomas parentales. El grado de irregularidades meiticas es una estimacin de diferencias gnicas y estructurales de las entidades en estudio. Configuraciones meiticas anormales como univalentes, bivalentes heteromrficos o multivalentes en Profase-Metafase I y, en estados posteriores (puentes, fragmentos, cromosomas con cromtidas desiguales, husos multipolares, etc.,), pueden deberse a heterocigosis para distintos tipo de rearreglos estructurales.

Si el hbrido es estril habr que analizar si el aislamiento reproductivo postcigtico obedece a causas gnicas o cromosmicas. La formacin de univalentes podra significar falta de homologa entre los cromosomas de los progenitores y, en estos casos, el poliploide artificial debera poseer meiosis regular y fertilidad elevada. Sin embargo podra ocurrir que aunque las especies parentales tuvieran una elevada homologa en cuanto a las secuencias de ADN, los hbridos fueran estriles, con formacin de univalentes en su meiosis. Esto ltimo podra deberse a la accin de genes que interfieren con el proceso normal de apareamiento (formacin del complejo sinaptonmico, ocurrencia y/o posicin de sobrecruzamientos) o alteran la disposicin espacial de los genomas en el ncleo provocando asinapsis. En algunos casos la formacin de univalentes en los hbridos se debera a divergencia cuantitativa en el nmero de copias de secuencias de ADN altamente repetidas. Este mecanismo disminuye el valor adaptativo del heterocigota por provocar disturbios en la alineacin estructural de los cromosomas. Otro caso frecuente en la naturaleza es la existencia de hbridos diploides con formacin regular de bivalentes y desarrollo normal de los estados II de la meiosis, pero elevada esterilidad. Este fenmeno es muy comn en hbridos entre distintas especies de Amaranthus, Prosopis y Bromus entre otros. Stebbins (1971) ha denominado a este fenmeno hibridez estructural crptica y ocurrira cuando las especies progenitoras se diferencian en pequeos rearreglos estructurales. En estos casos se pueden formar bivalentes pero se segregan combinaciones gnicas inviables a las gametas. El comportamiento meitico puede tambin verse alterado por interacciones particulares ncleo - citoplasmticas. En los hbridos el citoplasma puede ejercer una accin diferencial sobre la condensacin cromosmica de los genomas parentales o en el ritmo de contraccin cromosmica durante la meiosis (alociclia genmica). Cuatro lneas aloplsmicas fueron obtenidas por el Ing. Agr. L. Mazoti utilizando maz ( Zea mays ssp mays) como progenitor masculino recurrente durante al menos 10 retrocruzas so-

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bre teosinte como progenitor femenino. Estas lneas presentaron comportamiento meitico regular con formacin de bivalentes. Todas las lneas aloplsmicas presentaron caractersticas citolgicas en comn. Una de estas caractersticas es que, en mas del 50 % de las clulas analizadas en Diplotene Metafase I, los 10 bivalentes se distribuyeron en dos grupos de cinco bivalentes cada uno. Si bien este comportamiento meitico fue descripto en hbridos y en razas nativas de maz, en las lneas aloplsmicas se observa con mayor claridad y frecuencia. Otra caracterstica observada en las lneas aloplsmicas es que, en aproximadamente 20-40% de los meiocitos en Profase I, Metafase I y Anafase I, los dos grupos de 5 II presentan una leve asincrona en su comportamiento meitico (es decir que, por ejemplo, un grupo de 5 II inicia la Anafase I mientras que el resto de los bivalentes permanecen en Metafase I). La drstica separacin en dos grupos de 5 II en la mayora de las clulas sugiere que la interaccin citoplasma de teosinte-nucleo de maz influencia la distribucin espacial de los cromosomas en el ncleo. La presencia de dos grupos de 5 II y la asincrona de los mismos en lneas aloplsmicas de maz sugiere que el citoplasma de teosinte promueve la separacin y asincrona de dos genomas diferentes con 10 cromosomas cada uno (x=5). Evidencias citogenticas de la naturaleza poliploide del maz y especies afines se discutirn con mayor detalle en la prxima seccin. Citogentica de poliploides. El estudio meitico de poliploides e hbridos entre taxones con distinto nivel de ploida aporta mayor informacin que el realizado en hbridos diploides puesto que se puede analizar la afinidad relativa de distintos genomas en el mismo fondo gentico. En estos casos la formacin de multivalentes es decisiva para establecer las relaciones entre genomas. En el gnero Larrea el hbrido estril entre la especie diploide L. divaricata (2n=26) y L. cuneifolia (2n=52) hemos encontrado, en MI, 13 II y 13 I en un gran porcentaje de las clulas analizadas, indicando que L. divaricata o una especie muy afn sera un progenitor de L. cuneifolia. El anlisis de las asociaciones meiticas en especies e hbridos del gnero Zea nos revel la naturaleza

alotetraploide del maz y especies relacionadas con 2n=20 cromosomas. En hbridos con 2n=30 cromosomas (Z. diploperennis x Z. perennis y Z. mays ssp mays x Z. perennis) la configuracin meitica ms frecuente fue 5 III + 5 II + 5I. Zea perennis , con 2n=40 cromosomas present, con frecuencia elevada, 5 IV + 10 II. Estas configuraciones slo pueden ser claramente explicadas proponiendo dos genomas (A y B) de 5 cromosomas cada uno, siendo AmAm BmBm y ApAp ApAp Bp1Bp1 Bp2Bp2 las frmulas genmicas postuladas para maz y Zea perennis , respectivamente. Nuestro grupo de trabajo ha encontrado, en especies e hbridos con 2n=20 cromosomas, formacin frecuente de dos grupos de 5 II cada uno en MI. Este doble huso observado sera una evidencia de la existencia de genomas ancestrales con 10 cromosomas cada uno. Adems, en alrededor del 50 % de las clulas observadas en algunas lneas de maz e hbridos interespecficos se observ asociacin secundaria de bivalentes, sugiriendo la existencia de homeologa entre los genomas ancestrales A y B postulados. Tratamientos premeiticos con soluciones diluidas de colchicina (0,5 x 10 -4) en el gnero Helianthus indujeron apareamiento homelogo y formacin de multivalentes en especies que, aunque tienen origen poliploide, posean meiosis regular con formacin de bivalentes. Los resultados obtenidos sugirieron que estos tratamientos pueden inducir apareamiento intergenmico. Este tratamiento produce el mismo efecto que alelos mutantes de genes que controlan el apareamiento, permitiendo recombinacin entre genomas que normalmente no recombinaran. Hemos realizado tratamientos con soluciones diluidas de colchicina en maz y Z. perennis con la finalidad de detectar recombinacin entre los genomas A y B postulados anteriormente. El maz tratado mostr en Diplotene-MI de 1 a 5 IV mientras que el maz testigo slo form bivalentes. Estos resultados sugirieron que en maz existen genomas homelogos (Am y Bm) con 5 cromosomas cada uno. El tratamiento en Zea perennis di como resultado un incremento en la frecuencia de IV sealando tambin manifestacin de homeologa dentro de los genomas A y B. El tratamiento con colchicina

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de los hbridos con 2n=30 cromosomas, Z. diploperennis x Z. perennis y Z. perennis x Z. mays ssp mays dieron resultados diferentes. En Z. diploperennis x Z. perennis el tratamiento con colchicina provoc un aumento en la frecuencia de trivalentes, no observndose nunca IV VI. En cambio el hbrido Z. perennis x Z. mays ssp. mays tratado con colchicina, no slo mostr un aumento en el porcentaje de III sino que el 43% de las clulas analizadas en Diacinesis -MI mostraron IV y VI. Estos resultados permitieron concluir que si se comparan los genomas Am-Bm Ad-Bd y Ap-Bp, slo son homelogos los genomas Am y Bm. El anlisis conjunto de los datos obtenidos en nuestro laboratorio no slo confirma la naturaleza alopoliploide del maz y especies afines con 2n=20 cromosomas, sino que sugiere que en estas especies existen genes (semejantes al Ph descripto en trigo) que impiden el apareamiento entre genomas homelogos. En Amaranthus la configuracin cromosmica de 8 II + 17 I observada en el hbrido A. hybridus (2n=32) x A. spinosus (2n=34), conjuntamente con la asociacin secundaria de bivalentes observada en especies e hbridos con meiosis regular apoyaron la hiptesis de que las especies actuales de Amaranthus con 2n=32 cromosomas son poliploides con x=8. EL nmero n=16 sera un nmero bsico derivado y n=17 habra surgido por trisoma primaria. Se han dado varios ejemplos en los cuales el anlisis meitico ha permitido dilucidar el origen y postular modos de especiacin en varios grupos. Como ya se ha discutido, el apareamiento puede estar bajo control gentico (por ejemplo genes tipo Ph) y a menudo estos genes pueden constituir un sistema mucho mas simple que los que controlan caracteres diagnsticos de especies y gneros. El establecimiento de sistemas taxonmicos basados en relaciones genmicas deben en lo posible estar apoyados por estudios citogenticos completos (cariotipo, bandeo C y fluorescente, contenido de ADN, etc.), morfolgicos, bioqumicos y moleculares. Adems de la utilidad en estudios taxonmicos y evolutivos el conocimiento de

la meiosis es de importancia fundamental en estudios aplicados. En la produccin de hbridos o poliploides de importancia agronmica se debe lograr un mximo de fertilidad y esto est relacionado con el comportamiento cromosmico. Aunque no siempre la esterilidad es de origen cromosmico, ste es un parmetro que debe ser controlado. 4 Variacin intra e interespecifica en el tamao del genoma: evolucin y significado adaptativo Durante el proceso evolutivo ocurren cambios cuantitativos y cualitativos en el contenido de ADN total. En Angiospermas el tamao del genoma es muy variable entre grupos, oscilando entre 0,2 pg en Arabidopsis thaliana a 127,4 pg en Fritillaria assyriaca no estando esta variacin relacionada necesariamente con nivel de ploidia. El contenido de ADN (valor C) se evala mediante microdensitometra o citometra de flujo. Si se descarta la variacin en el nivel de ploida, las principales causas de variacin (intra o interespecfica) del contenido de ADN serian: aneuploida, polimorfismo numrico para cromosomas accesorios o supernumerarios, reordenamientos cromosmicos con perdida o duplicacin de material gentico y variacin en el nmero de copias de secuencias no codificantes. La variacin del tamao del genoma se encuentra, a grandes rasgos, relacionada con diferencias en la complejidad organsmica pues los virus tienen genomas mas pequeos que las bacterias y stas a su vez menores que el de eucariotas. Sin embargo en organismos superiores se encontr que el aumento en el valor C no estaba relacionado con complejidad organsmica, ni era explicable por la existencia de mayor nmero de genes funcionales (el contenido de ADN de un alga unicelular, por ejemplo, puede ser igual al de una angiosperma leosa). Esta paradoja o enigma del valor C (C: contenido de ADN del genoma haploide no replicado) fue explicada, en parte, cuando se demostr que en Angiospermas la variacin del tamao del genoma involucra cambios en la cantidad y proporcin de secuencias de ADN repetidas. Los estudios moleculares han reve-

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lando gran complejidad dentro de los genomas existiendo, adems del ADN codificante, secuencias repetidas que no codifican tales como ADN satlite, minisatlites, microsatlites, y elementos transponibles. En general, la relacin ADN gnico, no gnico disminuye con el aumento del tamao del genoma y en angiospermas con elevado contenido de ADN las secuencias repetidas pueden representar hasta el 90% del ADN total. Estos resultados explican la naturaleza de la variacin pero plantean interrogantes acerca del significado evolutivo de esta arquitectura repetida del genoma: cul es el origen, funcin y/o significado de esta variacin? cul es el papel del ADN repetido, tpicamente no codificante?, qu relacin poseen estos cambios con la fluidez y plasticidad del genoma en plantas? y cual es la direccin, distribucin y extensin de estos cambios en distintos grupos vegetales?. Un enfoque para comprender el significado del tamao del genoma fue analizar las relaciones que existan entre el contenido de ADN y caractersticas celulares, organsmicas y geogrficas. En varios grupos de plantas se vio que las variaciones en el contenido de ADN total estn correlacionadas positivamente con: volumen o longitud cromosmicas, rea y volumen celular, porcentaje de heterocromatina, longitud del complejo sinaptonmico, duracin del ciclo mittico, duracin de la meiosis, tiempo mnimo de generacin, factores fenolgicos, latitud y altitud. Bennett (1987) crea el trmino nucleotipo para referirse a los aspectos del ADN nuclear que afectan al fenotipo independientemente del ADN codificante. En la literatura existen muchos datos que sugieren que el tamao del genoma posee significado adaptativo y que los parmetros nucleotpicos juegan un papel importante en la evolucin, diversificacin y adaptacin a distintos ambientes, limitando el rango de expresin fenotpica que puede ser alcanzado por accin gnica. Por otro lado, varios autores opinan que las secuencias de ADN no gnico que pueden variar en el genoma no poseen significado adaptativo constituyendo ADN egosta, parsito o ignorante. Otros investigadores sealan que no puede descartarse la existencia de mecanismos moleculares que generen

ADN repetido no codificante que, en forma oportunista, acte como mutgeno y /o agente regulador. En algunos organismos se ha demostrado que la transposicin de elementos mviles retrovirales pueden alterar la dinmica del genoma provocando una inestabilidad que se puede traducir en una sbita explosin de variabilidad. Se conocen procesos de escisininsercin de elementos mviles produciendo por ejemplo, plantas variegadas. Estos procesos pueden, adems, producir reestructuraciones cromosmicas alterando el orden y posicin de los genes. Estos cambios rpidos pueden ser potentes mecanismos evolutivos ya que concomitantemente con el aislamiento reproductivo que implica la diferencia en rearreglos estructurales, los mismos pueden involucrar efectos de posicin que, en algunos casos, poseen valor adaptativo. Todos estos procesos tienen, adems relevancia en aspectos aplicados ms inmediatos ya que un cambio en la posicin de un gen puede cambiar la expresin o la funcin bioqumica del mismo. Se ha demostrado que el genoma de las plantas es inestable y responde al estrs provocado por alteraciones genmicas, ambientales, cromosmicas o citoplasmticas. Estos factores fsicos, bioqumicos o genticos inducen mecanismos de inestabilidad insercional o modifican el numero de copias de secuencias de ADN no codificante. La hibridacin, en la naturaleza o en prcticas de mejoramiento, ha sido, en algunos casos, un factor que desencadena mecanismos de aumento de ADN repetido. Otros experimentos han mostrado que la interaccin entre el genoma y el medio resulta en una rpida generacin de variacin. En lino, por ejemplo, se encontraron diferencias en el nmero de copias de ADN repetido entre lneas que crecan en medios con diferentes nutrientes. En lneas aloplasmicas de maz hemos encontrado que el citoplasma de teosinte provocaba activacin de elementos transponibles concomitantemente con aumento de secuencias de ADN repetido correspondientes a las zonas heterocromticas. El anlisis del contenido de ADN ha permitido evaluar rpidamente fenmenos de aneuploida y poliploida generados por estrs durante prcticas de cultivo de tejidos.

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La variabilidad intraespecfica en el contenido de ADN fue informada y probada en varios grupos taxonmicos. El maz y especies silvestres relacionadas constituyen un ejemplo de variacin intraespecfica donde est bien demostrada la variacin en el contenido de ADN debida a variacin en porcentaje de heterocromatina (ADN repetido) y en el nmero de cromosomas supernumerarios. En veintiuna razas nativas de maz del noroeste argentino ubicadas a lo largo de un gradiente altitudinal encontramos una correlacin lineal negativa significativa entre el contenido de ADN de los cromosomas normales (A) y la altitud de cultivo, esto significa que el contenido de ADN de los cromosomas del maz es menor en lugares de cultivo elevado, sugiriendo que las diferencias no pueden ser al azar y obedecen a procesos selectivos. Es interesante sealar que esta disminucin del contenido de ADN de los cromosomas A se correlaciona con un aumento en la frecuencia de cromosomas accesorios no codificantes (B). Aunque se desconocen las causas de este cline discordante entre dos tipos de ADN supernumerario no codificante (ADN repetido- cromosomas B), su repetibilidad en distintos ambientes sugiere que existen fuerzas selectivas involucradas en su mantenimiento. La presencia de cromosomas accesorios (heterocromticos, no codificantes sin funciones vitales para el organismo), en razas nativas de plantas cultivadas tales como maz y centeno, es una de las incgnitas actuales de la biologa evolutiva y aun no se comprende el papel que pueden jugar los mismos en futuros planes de mejoramiento. El particular modo de herencia de estos cromosomas accesorios (con mecanismos de impulso que hacen que se hereden con mayor frecuencia que la esperada por herencia mendeliana) abre un nuevo campo de investigacin en lo que se refiere a su utilidad como portadores de genes tiles en programas de mejora. En resumen, la evolucin del genoma eucariota ha involucrado casos de amplificacin, divergencia, reamplificacin y delecin de secuencias de ADN repetido. Estos procesos han llevado a grandes diferencias en el tamao del genoma, quedando aun muchas cuestiones por resolver en lo que se refiere a los mecanismos moleculares involucrados, la

frecuencia con que ocurren estos eventos y la relacin de los mismos con factores ambientales, genticos fisiolgicos. Resolver estas cuestiones permitir comprender el papel de la variacin del tamao del genoma en la evolucin y analizar la relevancia de la variacin del contenido de ADN con relacin a caractersticas de importancia agronmica. 5 Citogentica molecular: resolucin de problemas bsicos y aplicados El hallazgo de tcnicas para identificar genomas y cromosomas en preparaciones de rutina ha representado un gran progreso en la citogentica vegetal, ya que disponer de marcadores cromosmicos permite estudiar la organizacin del genoma y la arquitectura nuclear. Las tcnicas de bandeo (C, fluorescente) permiten revelar zonas de ADN altamente repetido (heterocromatina constitutiva), pero no diferencian la composicin molecular del ADN. En ausencia de bandas marcadoras no es posible identificar cromosomas con morfologa similar. Adems en especies algamas suele existir polimorfismo para nmero y posicin de zonas heterocromticas, lo que dificulta la caracterizacin cromosmica y la deteccin de regiones introgresadas. Un notable ejemplo de polimorfismo y politipismo para bandas heterocromticas lo constituye el estudio de lneas y razas nativas de maz. Los marcadores moleculares combinados con la citogentica resultaron ser de gran utilidad para entender la organizacin cromosmica y la distribucin fsica de las secuencias repetidas. El gran potencial de las tcnicas de hibridacin in situ resulta de combinar informacin acerca de la morfologa nuclear o cromosmica con la informacin molecular de la estructura de las secuencias. Aunque estas tcnicas se conocen desde 1969 utilizando marcacin radioactiva, en plantas se comenz a aplicar a fines de la dcada del 80 debido a la gran disponibilidad de secuencias clonadas para utilizar como sonda. Adems, la posibilidad de utilizar ADN genmico total como sonda ( GISH) y modernos sistemas de marcacin y deteccin no radioactivos han impulsado el uso de esta tcnica en forma rutinaria, complementando los resultados obtenidos por metodologas ms clsicas.

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Mediante la aplicacin de estas tcnicas se obtienen datos que podrn ser utilizados en estudios de sistemtica, filogenia, biodiversidad, evolucin, mejoramiento y biotecnologa. La hibridacin in situ (ISH) de sondas de cidos nucleicos en preparaciones cromosmicas involucra cuatro pasos fundamentales que son: 1) Obtener una sonda marcando secuencias de ADN; 2) reaccin de hibridacin entre la sonda y el ADN blanco (cromosomas), ambos desnaturalizados previamente. Las secuencias complementarias de la sonda y del ADN de los cromosomas hibridarn, en relacin a su homologa, en un sitio citolgico; 3) remocin de la sonda que no se uni o que se hibrid en forma inespecfica; 4) Deteccin de la hibridacin y visualizacin de la hibridacin a travs de fluorocromos. Una de las aplicaciones de esta tcnica (FISH o fluorescent in situ hybridization) es la obtencin de un mapa fsico, funcional y estructural del genoma utilizando secuencias de distinto origen como sondas. El anlisis de la organizacin fsica de secuencias repetidas, genes, secuencias clonadas (BACs, ESTs, ver II_3), rDNA, transgenes, retrovirus, etc., permite identificar cromosomas, analizar la arquitectura nuclear del genoma y verificar hiptesis acerca de la relacin entre posicin y funcin de determinadas secuencias. Otras aplicaciones de esta tcnica consisten en determinar la distribucin y posicin de material cromosmico extraespecfico, la existencia de apareamiento y recombinacin intergen-mica, la existencia de segregacin preferencial (responsables de herencia no mendeliana de algunos tipos cromosmicos), la presencia y tipo de rearreglos cromosmicos y analizar la segregacin de determinados cromo-somas en estudios evolutivos y planes de mejora. Estos son relevantes para comprender la relacin entre estos fenmenos y variaciones en la expresin gnica. La hibridacin in situ utilizando ADN genmico total como sonda (GISH o Genomic ISH) revela homologas especficas del ADN, principalmente en lo que respecta a secuencias repetidas y ha permitido realizar aportes relevantes en estudios evolutivos, biosistemticos y en mejoramiento vegetal.

Esta tcnica ha facilitado, por ejemplo, el reconocimiento de especies parentales en hbridos y poliploides, analizar afinidades genmicas interespecficas, detectar reestructuraciones cromosmicas, corroborar que en el ncleo existen dominios espaciales de genomas o secuencias particulares, detectar la existencia de apareamiento intergenmico y recombinacin. Adems, permite analizar la organizacin nuclear y desarrollo cromosmico en especies e hbridos; detectar la presencia de cromosomas o segmentos cromosmicos introgresantes en planes de mejoramiento; analizar afinidades genmicas interespecficas en cuanto a variacin en secuencias de ADN repetitivo disperso y determinar la naturaleza del apareamiento meitico en generaciones segregantes de hbridos y poliploides. Es importante sealar que las relaciones obtenidas mediante GISH no son afectadas por genes que producen disturbios en el apareamiento meitico (asinapsis, desinapsis, apareamiento homelogo o heterlogo). Como ya fue mencionado, el ADN repetido es el mayor componente del genoma en la mayora de los eucariontes. En maz, por ejemplo, el genoma est dominado por elementos repetidos, siendo la mayora de stos del tipo disperso (como, por ejemplo, retroelementos), los que ocuparan el 33- 62% del genoma. En el gnero Zea, por ejemplo, existen variaciones intra e interespecficas en el tamao del genoma. Su valor (2C) en especies con 2n = 20 oscila, en lneas y razas argentinas de maz, entre 4,9 y 6,9 pg (5700 Mpb) y es de 9,2 pg (8878 Mpb) en Z. luxurians . Estas variaciones, tanto intercomo intraespecficas se deberan principalmente a diferencias en la heterocromatina, reveladas por bandeo C y DAPI, que corresponderan a secuencias repetidas en tandem. Sin embargo, tanto este tipo de ADN repetido en tandem, como as tambin el disperso correspondiente a los retrotransposones, pudieron haber experimentado amplificaciones y diversificaciones durante la evolucin de las especies del gnero Zea. La tcnica GISH es, en la actualidad, la herramienta adecuada para revelar tales amplificaciones y divergencias. Esta tcnica puede discriminar en forma directa aquellos genomas que presentan secuencias tan divergentes que no existe hibridacin cruza-

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POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

FIGURA 2. A-B, FISH: Zea luxurians (2n=20, A = las zonas amarillas brillantes muestran hibridacin con la sonda Knobs de maz marcada don digoxigenina y revelada con FITC; B = contratincin con DAPI, las zonas intensamente hibridadas en A coinciden con las zonas DAPI (+) de B.- C y D = Zea mays ssp. parviglumis , ncleo interfsico; la mayora de las zonas DAPI (+) observadas en D muestran fuerte seal de hibridacin en C; se utiliz sonda Knob de maz marcada con dioxigenina y revelada con FITC. E = Zea mays ssp. mays (2n=20 + 5 cromosomas B), hibridacin con sonda rDNA pta71 de trigo, marcada con biotina y revelada con Cy3, se sealan (puntas de flechas) los organizadores nucleolares en cromosomas y ncleo interfsico. F = Prometafase I meitica de la F1 Zea mays ssp. mays x Zea perennis (2n=30); se observan III, II y I; la seal de hibridacin se encuentra en un trivalente (sealado con flecha), se utiliz como sonda rDNA (pta71) como fue indicado en E. G-I = clula de Tricepiro; G = hibridada con sonda de ADN genmico total de centeno marcado con dioxigenina y revelada con FITC (GISH), se observan 14 cromosomas con fuerte seal de hibridacin indicando que Tricepiro posee 14 cromosomas de centeno. H = igual clula rehibridada con la sonda pSc119.2 marcada con biotina y que da fuerte seal con Cy3 (en rojo), permiti reconocer los genomas de trigo presentes en Tricepiro. I = contratincin con DAPI. La barra representa 10 micrones, todas con igual aumento. Ver explicacin extensa de las figuras en: Ferrari et al., 2001, 2004; Poggio, et al.,1999a,b y 2000.

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da entre ellas. El uso de ADN genmico total como sonda especie-especfica tiene algunas ventajas sobre sondas clonadas pues el ADN genmico total incluye un rango muy amplio de secuencias mltiple copia y es por lo tanto improbable que exista slo un lugar afn a la sonda. Esto es una ventaja cuando se necesita una amplia especificidad, ya que una sonda clonada sera homloga de algunos pocos cromosomas o segmentos de cromosomas. En los casos en que la divergencia sea leve, puede modificarse el nivel de exigencia en la hibridacin y utilizar DNA no marcado como bloqueante. Esta modificacin consiste en agregar a la mezcla de hibridacin ADN no marcado en alta concentracin. Este bloqueo no slo aumenta la diferenciacin entre la especie que se usa como sonda y la que se usa como bloqueante, sino que reduce la hibridacin cruzada con otras especies, ya que muchas plantas de la misma familia comparten muchas secuencias. Para diferenciar especies y cuando la resolucin es importante se requiere bloqueo y estricto control de exigencia. Estudios de hibridacin in situ (FISH, GISH) mostraron que el cereal sinttico Tricepiro (2n=6x=42) est compuesto por 28 cromosomas de trigo, 14 de centeno y pequeas zonas de introgresin de Thynopyrum. Mediante el uso de sondas repetidas particulares se logr identificar la totalidad de los cromosomas de Tricepiro. Experimentos con GISH han demostrado que Bromus setifolius (2n=28), es uno de los progenitores de B. pictus (2n=70), gramnea patagnica de potencial importancia forrajera. En el genero Zea la tcnica GISH nos ha permitido: analizar la afinidad genmica entre subespecies de la seccin Zea, y entre maz, teosinte y gneros relacionados. Mediante GISH hemos demostrado que existen zonas de alta homologa entre Tripsacum dactyloides (una de las especies que pudieron haber estado involucradas en el origen del maz) y Zea mays spp. mays. Estas zonas coinciden con regiones controladoras de la apomixis y secuencias neocentromricas. Estos resultados apoyan hiptesis planteadas previamente sobre la existencia de zonas de homologa entre ambas especies que favoreceran el intercambio

gentico y la transferencia de genes de importancia para el mejoramiento del maz. Estudios realizados en especies de la seccin Luxuriantes permiti determinar, mediante tcnicas de FISH, que Zea luxurians presentara secuencias telomricas de ADN altamente repetitivo. El anlisis de estas secuencias marcadoras en meiosis nos permiti resolver la constitucin cromosmica de las complejas configuraciones meiticas que se observan en hbridos intra e interseccionales. Estos resultados permitieron corroborar las frmulas genmicas planteadas para las distintas especies, avalando la hiptesis propuesta sobre el origen poliploide del maz y especies afines. Las mismas tcnicas, aplicadas en razas de maz que presentan polimorfismo numrico para cromosomas B, permitieron postular hiptesis acerca del origen de los mismos. 6 Lecturas recomendada
APPELS R., MORRIS R., BIKRAM S. & CEDRIC M. 1998. Chromosome Biology. Kluger Academic Publish. London BENNETT M. D. 1982. Nucleotype basic of spatial ordening of chromosomes in eukaryotes and the implications of the order for genome evolution and phenotypic variation. In Genome Evolution, Academic Press, London, pp. 230-261. BENNETT M. D. 1983. The spatial distribution of chromosomes, Kew Chrom. Conf. II. George Allen & Unwin. P. Brandham & M. D. Bennett (eds.). pp. 71-79. BENNETT M. D. 1984. The genome, the natural karyotype and biosystematics. In: Plant biosistematics (Grant, W.F., ed.). Academic Press, New York, pp 41-66. BENNETT, M. D. 1995. The development and use of genomic in situ hibridization (GISH) as a new tool in plant biosystematics. In: Kew Chromosome Conference IV (Brandham, P.E. and Bennett, M.D. eds.). Royal Botanic Gardens, Kew, pp 167-183. CUADRADO, A. & JOUVE, N. 1995. Fluorescent in situ hybridization and C-banding analysis of highly repetitive DNA sequence in the heterochromatin of rye (Secale montanum Guss.) and wheat incorporating S.montanum chromosome segments. Genome 38: 795-802. FELDMAN, M. & AVIVI, L. 1988. Genetic control of bivalent pairing in common wheat. The mode of Ph 1 action. In: Kew Chromosome Conference III (Brandham, P.E. ed.). Royal Botanic Gardens, Kew, pp 269-279. FERRARI, M.R., GREIZERSTEIN, H.E., PACAPELO, A., NARANJO, C.A. & L. POGGIO. 2001. Identificacin cromosmica de Tricepiro, mediante tcnicas de bandeo e hibridacin in situ (GISH). XXX Congreso Argentino

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POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

de Gentica y IV Jornadas Argentino-Uruguayas de Gentica, Mar del Plata, 16-19 de Septiembre de 2001, pg. 80. FERRARI, M.R., GREIZERSTEIN, H.E., PACAPELO, A., NARANJO, C.A., CUADRADO, A., JOUVE, N. & L. POGGIO. 2004. The genomic composition of Tricepiro, a synthetic forage crop. Genome (Canad), en prensa. FUTUYMA, D.J. 1998. Evolutionary biology. (Third Edition). Sinauer Associates Inc. GRANT, V. 1981. Plant Speciation. Columbia Univ. Press. New York. 435 pp. GRANT, V. 1985. The Evolutionary Process. W.H. Freeeman and Co. San Francisco, 499 pag. GREIZERSTEIN, E. & POGGIO L. 1995. Meiotic studies of sponta-neus hybrids of Amaranthus: genome analysis. Plant Breeding (Alemania) 114: 448-450. GRIPYA & T. TSUCHIYA (eds) 1991. Chromosome engineering in plants: genetics, breeding, evolution. Part A. Elsvier. HARRISON, G. R. 1993. Hybrid zones and the Evolutionary Process. Oxford University Press. New York. JACKSON, R.C. & MURRAY, B.G. 1983. Colchicine-induced quadrivalent formation in Helianthus : evidence of ancient polyploidy. Theor. Appl. Genet. 64: 219-222. KING, MAX. 1993. Species Evolution. The role of chromosome change .Cambridge Univ. Press LACADENA J. R. 1996. Citogenetica. Editorial Complutense. 991 pags. LEWIN B. 2000. GENES VII. Oxford University Press, NY. NARANJO, C. A., MOLINA, M. C. & POGGIO, L. 1990. Evidencias de un nmero bsico X=5 en el gnero Zea y su importancia en estudios del origen del maz. Acad Nac Cs Ex Fis Nat, Buenos Aires, Monografa 5: 43-53. NARANJO, C. A., POGGIO, L., MOLINA, M. & BERNATEN, E. 1994. Increase in multivalent frequency in F1 hybrids of Zea diploperennis x Z. perennis by colchicine treatment. Hereditas 120: 241-244. PAGE & HOLMES. 1998. Molecular Evolution. Blackwell Science. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., CUADRADO, A., JOUVE, N. & NARANJO, C. A. 1999a. Genomic in situ hybridization (GISH) of Tripsacum dactyloides and Zea mays ssp. mays with B-chromosomes. Genome 42: 687691. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., GONZALEZ, G. & NARANJO, C. A. 1999b. Genomic affinities of Zea luxurians, Z. diploperennis and Z. perennis: meiotic behaviour of their F1 hybrids and genomic in situ hybridization (GISH). Genome 42: 993-1000. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., GONZALEZ, G. & NARANJO, C. A. 2000. Evolutionary relationships in

the genus Zea: analysis of repetitive sequences used as cytological FISH and GISH markers. Genetics and Molecular Biology (Brasil) 23,4,1021-1027. POGGIO, L., NARANJO, C. A. & JONES, K. 1986. The chromosomes of Orchids IX. Eulophia. Kew Bulletin 41:45-49. POGGIO, L., ROSATO, M. & NARANJO, C. A. 1997. Meiotic behavior in alloplasmic lines of Zea mays ssp. mays. Genome 40: 723-729. POGGIO, L., ROSATO, M., CHIAVARINO, A. M. & NARANJO, C. A. 1998. Genome size and environmental correlations in maize (Zea mays ssp. mays). Annals of Botany (UK) 82 Suppl.A:107-115. POGGIO L., ROSATO. M., MAZOTI L. B. & NARANJO, C. A. 1997. Variable meiotic behaviour among plants of an alloplasmic line of maize. Cytologia (Japn) 62:271-274, POGGIO, L.., WULFF, A.F. & HUNZIKER, J.H. 1986b. Chromosome size, nuclear volume and DNA content in Bulnesia (Zygophyllaceae). Darwiniana 27:25-38. SHARMA, A.K. & SHARMA, A. (eds.) 2001. Chomosome Painting. Principles, Strategies and Scope. Kluwer Academic Publishers, 179 pp. (Reprinted from Methods in Cell Science 23: (1-3), 2001). SOLTIS D. E., SOLTIS P. S. & DOYLE J. 1998. Molecular Systematics of Plants II. DNA Sequencing. Kluwer Academic Publishers. 574pp. STEBBINS, G.L. 1971. Chromosomal Evolution in Higher Plants. Addison Wesley Publ. Reading. Massachusetts. 216 pags. SUMNER, A.T. 1990. Chromosome banding. London Unwin Hyman.434 pp. SWANSON, C.P., T. MERZ & W.J. YOUNG. 1981. Cytogenetics. Englewood Cliffs., New Jersey. Prentice Hall, Inc. SYBENGA, J. 1975. Meiotic Configurations. Springer Verlag. 251 pp TITO, C.M., POGGIO, L. & NARANJO, C.A. 1991. Cytogenetic studies in the genus Zea. 3. DNA content and heterochromatin in species and hybrids. Theor. Appl. Genet. 83:58-64.

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PARTE III Mtodos para generar variabilidad

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CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE, Viviana

III.-Captulo 1
Variacin somaclonal
Cardone, Susana; Olmos, Sofa; Echenique, Viviana 1 Introduccin El comportamiento celular normal es el resultado de una compleja cascada de programas genticos que son sensibles a la disrupcin por estreses biticos y abiticos. El cultivo in vitro per se puede ser muy estresante para las clulas vegetales e involucra procesos mutagnicos durante el establecimiento del explanto, la induccin de callo, la formacin de embriones y la regeneracin de plantas. Por esta va es posible obtener variacin, de origen nuclear y/o citoplasmtica, que podra ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este proceso, denominado variacin somaclonal por Larkin y Scowcroft (1981), involucra cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de interacciones no especficas que no generan variacin estable y transmisible, pero que conducen a cambios en la expresin gnica. Dichos cambios, denominados epigenticos, son tambin considerados por algunos autores como variacin somaclonal mientras que otros slo incluyen en la misma los cambios estables. Los mecanismos por los cuales ocurre la variacin somaclonal no han sido completamente dilucidados, pero entre sus causas se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinacin somtica e intercambio de cromtidas hermanas, rearreglos gnicos somticos, elementos genticos transponibles, amplificacin y/o metilacin del ADN y cambios en el ADN de las organelas. Por ello, aunque los caracteres morfolgicos (como por ejemplo el hbito de crecimiento, la morfologa floral, etc.) son fciles de evaluar, muchos aspectos de la variacin suceden sin manifestarse en cambios morfolgicos evidentes. Una diferencia estructural en un producto gnico puede no alterar su actividad biolgica lo suficiente como para producir un fenotipo modificado.

Por ello, la variacin debe analizarse a varios niveles. Esta variacin depende del genotipo, de la fuente de explanto, del tiempo en que el material ha estado sometido al cultivo in vitro, de las condiciones y composicin del medio de cultivo y de la va de regeneracin, donde la embriognesis somtica generara menores alteraciones que la organognesis. Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparicin ocasional de caracteres no encontrados en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronmico permite utilizar este fenmeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado en algunos casos para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia econmica, entre los que se incluyen resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos cidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta tcnica involucra un balance entre la cantidad de variacin inducida y el mantenimiento de los caracteres agronmicos del cultivar. Como ejemplo puede citarse el caso de somaclones de pasto bermuda, Cynodon dactylon, donde se encontr resistencia a la oruga militar en un cultivar que reuna otras buenas caractersticas, dando origen al cultivar Brazos-R3. Si bien desde el punto de vista prctico no resulta una tcnica muy eficiente en todos los casos, debido a que no es posible predecir ni dirigir el tipo de variacin y se hace menester trabajar con grandes poblaciones de plantas, es necesaria la compresin del mecanismo para evitarlo en casos donde se quiere fidelidad gentica, como en la micropropagacin, la conservacin de germoplasma y la transformacin de plantas. Tambin, en algunos casos, puede representar una fuente rpida y fcilmente accesible de variacin para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genticos limitados y/o de base gentica estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones naturales o cultivadas es limitada. Los primeros casos de variacin somaclonal fueron registrados en plantas de reproduccin agmica como la caa de azcar y la papa, pero el fenmeno ha sido ob-

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servado en monocotiledneas como trigo, maz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorn (Eragrostis curvula) y en dicotiledneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies. 2 Factores relacionados con la aparicin de variacin somaclonal La aparicin de la variacin somaclonal depende de varios factores, entre los que se han citado: el genotipo, el tipo de explanto, la va de regeneracin, la composicin del medio de cultivo utilizado, los reguladores de crecimiento y la duracin del perodo de cultivo. Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios depender de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el genotipo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variacin que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variacin somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtencin de variedades. El nivel de ploida es otro factor a tener en cuenta. Por ejemplo en raigrs (Lolium multiflorum) y en papa se observ que las variedades diploides muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidas durante el cultivo de tejidos. La explicacin ms razonable es que los poliploides, con ms de dos juegos completos de cromosomas, estn tamponados, y por lo tanto toleran la ganancia o prdida de cromosomas, pudiendo as cumplir con los requisitos impuestos por la regeneracin. En los diploides, la prdida o la alteracin de cromosomas que llevan genes vitales impedir la regeneracin de las plantas, llegando con xito a esta etapa slo aquellos explantos que tengan su complemento cromosmico completo. Existen evidencias de una mayor inestabilidad en hbridos interespecficos cultivados in vitro, si se los compara con las especies parentales. Como ejemplo puede citarse el caso de los hbridos obtenidos de la cruza de Hordeum vulgare x Hordeum jubatum ,

donde el cultivo in vitro gener entre un 5% y un 10% de regenerantes haploides que contenan slo el genoma de Hordeum vulgare. Por esta causa ciertos cruzamientos interespecficos suelen utilizarse como metodologa para la obtencin de haploides. Explanto. La variacin tambin puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto original. Las quimeras son mosaicos genticos. Esto significa que dentro de una misma planta existen clulas con diferente constitucin gentica, lo cual se debe a una serie de cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus clulas son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes lneas celulares podran entonces dar origen a plantas genticamente diferentes. Por lo tanto, la utilizacin de explantos con tejidos quimricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de variacin. Sin embargo, la recuperacin de quimeras a partir de explantos no quimricos es un fenmeno frecuente que puede ocurrir a partir de procesos organognicos. La utilizacin de explantos con tejidos organizados como esquejes radicales o caulinares sera una buena opcin si es necesario mantener estabilidad gentica durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, an con explantos seguros. Parecera que el cultivo de meristemas aislados sera la mejor opcin para minimizar el riesgo de variacin somaclonal. Sin embargo, esto no debera tomarse como regla. Utilizando tcnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variacin en plantas de frutilla y paraso obtenidas a partir de meristemas. El cultivo de protoplastos parecera inducir, en ocasiones, inestabilidad gentica, como fue observado en papa y Nicotiana. Esto, en ocasiones, ha sido asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneracin de plantas a partir de explantos tan pequeos. La va de regeneracin tambin tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los gneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variacin observada en cultivos embriognicos es relativamente menor que

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la que aparece en cultivos organognicos. Esto probablemente se debe a la gran presin de seleccin impuesta en la formacin de los embriones, mayor que la requerida en la formacin de vstagos. Se postula que el gran nmero de genes requeridos para la iniciacin y maduracin de embriones cigticos y somticos impedira la acumulacin de mutaciones deletreas. Sin embargo, se observaron variantes en plantas de caf, apio y caa de azcar regeneradas a travs de embriognesis somtica. En estos casos se observ que algunos fenotipos anormales de embriones somticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maz. La mayor parte de la variacin obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo. La iniciacin de un callo puede ser anloga a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la induccin de enzimas y productos especficos que se inducen tambin en situaciones de estrs. Cuando comienza la divisin celular a partir de tejidos diferenciados, que dar origen a un callo, se incrementa el riesgo de inestabilidad cromosmica. La variacin que ocurre en los nmeros cromosmicos en la primera fase de la induccin del callo sera el resultado de fragmentacin nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares, combinada con la mitosis normal de los ncleos intactos (ncleos euploides). La naturaleza del callo tambin puede afectar el nivel de variacin obtenida. Un callo verdadero es una masa de clulas desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variacin. En varias monocotiledneas, el callo representa, a menudo, una masa de rganos suprimidos o proembriones ms que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo mantiene un alto grado de estabilidad gentica, como se ha observado en esprrago. En un estudio realizado en Cymbopogon se observ que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos de semilla fueron anormales, mientras que las obtenidas por callos de inflorescencias fueron muy semejantes a las plantas de las cuales provenan los explantos. En ocasiones tambin fue posible

observar variacin en plantas obtenidas por regeneracin directa, es decir, sin que medie un proceso previo de desdiferenciacin celular y formacin de callo. Medio de cultivo. El estado fsico del medio de cultivo tambin influye en el nivel de variacin obtenida. Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio slido o en medio lquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotpica o puede incrementar el nmero de plantas albinas. Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) han sido sealados como inductores de inestabilidad. Ejercen profundos efectos sobre la respiracin celular, el consumo de azcares y en el control de la divisin celular. Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la induccin de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. Si bien el modo de accin herbicida del 2,4-D no es totalmente comprendido, aparentemente involucra un incremento sustancial en la transcripcin que puede alterar la estructura de la cromatina, siendo utilizado en gramneas como inductor de aneuploidas. Lo que algunos autores sugieren es que el 2,4-D induce desdiferenciacin y este proceso sera el generador de los cambios. La fragmentacin nuclear amittica citada anteriormente observada en algunas plantas regeneradas tambin se reconoce como causa de aneuploida. Este fenmeno es causado por una relacin especial auxina:citocinina. El 2,4-D, el AIA (cido indolactico) y el ANA (cido naftalenactico) han sido sealados como los responsables de los incrementos en la metilacin de la citosina que tiene lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores en el ADN, donde la citosina se encuentra metilada en posicin 5 son considerados puntos calientes de mutacin, ya que la desaminacin de una 5-metil citocina resulta en un cambio de la base de citocina a timina. Las auxinas naturales y sintticas tienen una elevada correlacin con el porcentaje de 5metil citocina, las citocininas no tienen efecto en este sentido.

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Estudios tendientes a analizar los efectos de los reguladores de crecimiento sobre la regeneracin de plantas a partir de protoplastos, realizados en papa, indicaron que la variacin en el tipo y concentracin de reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo no generara variacin gentica. Sin embargo, si el cambio en la composicin de los reguladores ocurre en el estadio que va desde el crecimiento del callo a la iniciacin de los vstagos, se generan elevados niveles de variacin gentica. Estos datos sugieren que la fase de callo sera un perodo sensible en el cual la manipulacin hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas, de manera que las hormonas induciran la inestabilidad gentica sin ser, necesariamente, el origen de la misma. Otro factor a considerar es la deficiencia de oxgeno que se genera durante el curso del cultivo. La tensin de oxgeno de las clulas en la superficie del callo es diferente a la de aquellas clulas que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo. La anaerobiosis resultara en la produccin de etanol, el cual podra comportarse como un mutgeno. Tambin existen especies de plantas que producen compuestos mutagnicos durante el cultivo. Un efecto similar podra tener la acumulacin de metabolitos producidos por las propias clulas durante el proceso. Se ha mencionado que las condiciones de cultivo in vitro podran afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que normalmente se encuentran presentes en los tejidos en bajas concentraciones. La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variacin, aumentando la proporcin de variantes en cultivos envejecidos y tambin en plantas obtenidas a travs de varios subcultivos. Esto se ha observado en ajo, maz, avena, tabaco, triticale y raigrs triploide. La variacin puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos no envejecidos. El nmero ptimo de subcultivos podra estimarse empricamente luego de realizar pruebas de fidelidad gentica en las plantas regeneradas a travs de subcultivos subsecuentes. Una observacin comn es que en los perodos prolongados de cultivo hay una prdida de totipotencia y que esto sucedera debido a la acumulacin

de mutaciones y a la alteracin de los genes que son responsables de la regeneracin. Sin embargo, un estudio realizado por nuestro grupo de trabajo en la UNS, en colaboracin con el IBONE, demostr que las variaciones se producen al azar en los diferentes subcultivos, no habiendo una relacin lineal entre el nmero de subcultivos y la cantidad de variacin obtenida en plantas micropropagadas de paraso gigante. La variacin en este caso se detect mediante la tnica de RAPD a lo largo de de 10 subcultivos (Olmos y col., 2002). La deficiencia o exceso de minerales tambin podra afectar la estabilidad gentica in vitro. Se ha observado que las deficiencias o excesos de azufre, fsforo, nitrgeno, calcio y magnesio pueden resultar en cambios genmicos. En la variedad de lino Stortmont Cyrrus se detectaron cambios genticos estables y heredables inducidos por una alta fertilizacin del suelo con fsforo o con nitrgeno. Varias lneas estables obtenidas, fundamentalmente una llamada L y otra llamada S, denominadas genotrofos, se caracterizaron por poseer diferentes contenidos de ADN nuclear, de ADN repetitivo y diferencias a nivel del ADN ribosomal. 3 Cambios genmicos producidos durante el cultivo de tejidos Las plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las situaciones cambiantes de su entorno, pero en algn momento esa capacidad de amortiguacin se vuelve deficiente y los organismos caen en un estado de crecimiento subptimo que podra inducir a mecanismos generadores de cambios genmicos. Las bases metablicas de la interaccin entre el estrs y estos cambios son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses ambientales, dependiendo de la intensidad del estrs y del estado de diferenciacin de las clulas en el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurren probablemente debido a un mecanismo de respuesta al estrs que comprende la prdida del control del ciclo celular. En el caso de un callo, la desdiferenciacin que se produce durante la induccin del mis-

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mo provoca en las clulas una serie de procesos metablicos que resultan en reordenamientos genmicos que podran dar lugar a fenotipos alterados. Entre las alteraciones genticas registradas durante el cultivo in vitro pueden citarse mutaciones gnicas, cambios cromosmicos que involucren la estructura o el nmero de los cromosomas y activacin de elementos genticos transponibles. Tambin existen anomalas, como el intercambio entre cromtidas hermanas o el crossing over somtico, que pueden alterar su frecuencia de aparicin en plantas regeneradas respecto de plantas que no pasaron por cultivo in vitro. Varias hiptesis han intentado explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como por ejemplo las perturbaciones del ciclo celular, las aberraciones estructurales y numricas, los cambios en la metilacin y las mutaciones gnicas. Kaeppler y Phillips (1993) han propuesto una base molecular comn para todos estos eventos mutagnicos. Tal mecanismo podra afectar la expresin gnica y la estructura de la cromatina. Un posible mecanismo involucra alteracin en los patrones de metilacin. Esta hiptesis establece que el estrs inducido por el proceso de cultivo in vitro, al involucrar efectos hormonales y desbalance en el conjunto de nucletidos, provoca alteraciones en los patrones de metilacin del ADN. Estas alteraciones podran afectar la expresin de genes especficos, incluyendo elementos transponibles y/ o podran afectar la estructura de la cromatina de una manera ms global, involucrando, por lo tanto, a un gran nmero de genes. Los cambios en la metilacin del ADN podran estar relacionados con la replicacin tarda de la heterocromatina, que, en definitiva resulta en eventos de ruptura cromosmica. El mecanismo por el cual se producen los cambios en metilacin no ha sido totalmente dilucidado. Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrs severo de nutrientes o de agua no presentan estos cambios de metilacin encontrados en los regenerantes de cultivo in vitro. Esto podra indicar que la variacin en metilacin no es una respuesta general a todos los estreses.

El cultivo de tejidos podra representar, por lo tanto, un tipo muy particular de estrs que podra inducir una respuesta nica y un perfil particular de mutacin. Un posible efector de esta variacin en la metilacin sera la alta concentracin de reguladores de crecimiento utilizada para inducir a las clulas a crecer en cultivo. El 2,4-D provoca cambios en la estructura de la cromatina en pices de raz de echalote y tambin en cultivos de clulas humanas. Las auxinas podran ejercer el mismo efecto durante el cultivo de tejidos vegetales. Se cree, adems, que los cambios en los modelos de metilacin causados por el cultivo de tejidos no seran aleatorios. En este sentido, en raigrs se ha propuesto la existencia de puntos calientes de inestabilidad en el ADN genmico. Los puntos de ruptura de muchas de las alteraciones estructurales presentes en las plantas regeneradas se hallan en zonas heterocromticas, de manera que parecera que la variacin somaclonal no es al azar y que habra loci especficos que tendran mayor tendencia a la mutacin. Los cambios estructurales que no estn asociados a cambios en el dosaje gnico o a cambios en la regulacin suelen pasar desapercibidos fenotpicamente, pero pueden causar infertilidad. Por otra parte ocurren tambin cambios genmicos que involucran alteraciones en el nmero de cromosomas, como aneuploidas y poliploidas. La poliploida es el ms comn de estos fenmenos y estara relacionada con fallas en la mitosis, mientras que la aneuploida puede surgir por segregacin desigual en la mitosis o por fragmentacin nuclear, seguida de mitosis. A veces estos cambios en el nmero cromosmico pueden afectar el fenotipo a travs de dosajes gnicos alterados. En papa, por ejemplo, se observaron fenotipos aberrantes por aneuploida o por duplicacin cromosmica; sin embargo, no todos los regenerantes aneuploides o poliploides pudieron detectarse a nivel fenotpico. Los cambios pueden ocurrir tambin en el genoma de los plstidos y las mitocondrias. Como ejemplo puede mencionarse la restauracin parcial de la fertilidad en plantas de sorgo androestriles obteni-

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das in vitro. Tambin puede citarse el caso del cultivo in vitro de plantas androestriles de maz con citoplasma T (susceptibles a Helminthosporium maydis), que condujo a la reversin de la androesterilidad y de la susceptibilidad. Estos cambios se corresponderan con mutaciones en el ADN mitocondrial. Otro caso de variacin debida al cultivo in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de anteras en las Gramneas. El anlisis de los genomas de cloroplastos de plantas albinas de trigo obtenidas a partir del cultivo de anteras revel la presencia de deleciones y rearreglos. Si bien parecera que los tejidos somticos son menos sensibles a la variacin, tambin se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos. Como puede apreciarse a travs de los casos mencionados, son varios los mecanismos que conducen a la variacin somaclonal. Como se mencionara anteriormente existen, adems, variaciones epigenticas, que no son estables y que son el resultado de cambios en los patrones de metilacin del ADN y de amplificaciones gnicas, provocados por las condiciones microambientales del cultivo de tejidos. Caractersticas tales como el acostumbramiento a la citocinina y la resistencia a heladas pueden citarse como ejemplos de este tipo de variacin. La comprensin de los mecanismos por los cuales ocurre la variacin somaclonal ayudara a comprender y definir los procesos celulares de respuesta al estrs y permitira definir cmo los mismos actan en los procesos de evolucin (Kaeppler et al., 2000). 4 Niveles de deteccin de la variacin somaclonal Es evidente que los mecanismos que operan para inducir variacin son numerosos y diversos, y probablemente actan simultneamente, conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones genmicas generadas por cultivo in vitro reviste inters desde un punto de vista prctico, ya que las mismas podran ser potentes fuentes de material para seleccionar caracteres de inters y, desde un punto de vista terico, ya que posibilitaran realizar estudios

bsicos acerca de la variacin y el posible control de la misma. La ocurrencia de variacin somaclonal puede detectarse con marcadores fenotpicos, bioqumicos y moleculares. La correlacin de dichos marcadores con caracteres agronmicos es un requisito relevante para su implementacin en los programas de mejoramiento. Se citan a continuacin algunos ejemplos de la utilizacin de marcadores de varios tipos en la evaluacin de la variacin somaclonal.. La utilizacin de marcadores morfolgicos para detectar variantes somaclonales ha sido exitosa y citada en varios trabajos de investigacin. El examen visual y la utilizacin de un analizador de imgenes posibilitaron la diferenciacin entre fenotipos normales y aberrantes de plantas regeneradas de Pelargonium x hortorum Ro. Plantas de (man) presentaron variaciones epigenticas en altura, tamao de hojas, nmero y peso de semillas. El cultivo in vitro de yemas de anan dio como resultado plantas que exhiban cambios estables en el tamao de frutos, tasa de proliferacin de vstagos y color y textura de las hojas; el cultivo de tejidos de violeta africana, variedad Crimson Frost, result en un 67% de variacin en el color de las flores de las plantas regeneradas. A nivel fisiolgico, se detectaron y seleccionaron variaciones en cultivo de clulas y tejidos por presentar resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales, diferencias de crecimiento en condiciones de pHs variables, entre otros, tanto para cereales como para plantas frutales. La mayora de estos estudios se basaron en la implementacin de una alta presin de seleccin durante la etapa de regeneracin celular mediante la adicin de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneracin, tales como inculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas. El estudio del cariotipo permite detectar cambios en el nmero y estructura de los cromosomas. De esta manera podran detectarse translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones. Los cambios cariotpicos constituyen una fuente importante de variacin que muchas veces es subestimada cuando se realizan recuentos cromosmicos. Por esto

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mismo existen otras tcnicas que estiman cambios cariotpicos con mayor eficiencia, como por ejemplo el bandeo cromosmico. Esta tcnica fue aplicada a suspensiones celulares de Brachycome dichromosomatica (2n = 4), donde permiti detectar rearreglos importantes en individuos donde el nmero cromosmico permaneci estable. La hibridacin in situ es otra de las tcnicas que podra aportar informacin til para detectar cambios genticos estructurales. Entre los marcadores bioqumicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las isoenzimas, que permitieron detectar entre un 24 a 35% de variacin en plantas de Populus tremuloides regeneradas a travs de callos. Esta variacin fue detectada mediante electroforesis en geles de almidn utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenasa (IDH) shiquimato deshidrogenasa (SKDH), malato deshidrogenasa (MDH), fosfogluco- isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6-PGD). Los patrones electroforticos permitieron caracterizar a las plantas fenotpicamente normales y anormales. Sin embargo, las plantas albinas obtenidas en este estudio no presentaron polimorfismos en los loci estudiados. En otros casos el anlisis isoenzimtico no permiti detectar variacin. El estudio de lneas de callos derivadas de embriones cigticos y de embriones somticos de abeto (Picea glauca x engelmannii) utilizando 15 sistemas isoenzimticos no evidenci la presencia de variacin somaclonal en 25 loci analizados. Los patrones isoenzimticos de lneas isognicas de Trifolium pratense L. que diferan en su capacidad de regeneracin, resultaron idnticos para los sistemas de peroxidasas, glutamato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas y esterasas. Las isoenzimas, por lo tanto, pueden proveer informacin til acerca de la variacin generada in vitro. Sin embargo, se estn analizando los productos de genes expresados, cuya regulacin puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o fisiolgicos. Por otro lado, slo se transcribe y traduce una pequea proporcin del genoma. Por ello, los mtodos de anlisis a nivel molecular pueden proporcionar mucha informacin, ya que las secuencias de ADN son

esencialmente las mismas en todas las clulas vivas de la planta, independientemente del estado fisiolgico o de desarrollo de las mismas. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar inestabilidad gentica debido a su amplia cobertura del genoma y a que no son influenciados por el ambiente ni por los estados fenolgicos de las plantas. Utilizando RAPD pudo detectarse la existencia de polimorfismos en plantas de Triticum tauschii obtenidas mediante callognesis. Los RAPD para diagnosticar fidelidad gentica en plantas regeneradas por cultivo in vitro han sido utilizados en Pinus mariana (Mill), Festuca pratensis Huds., Picea abies , Quercus suber L.y Panax notoginseng. En Phalaenopsis se ha encontrado correspondencia entre variaciones morfolgicas y moleculares, pudindose discriminar plantas normales de variantes morfolgicas mediante la combinacin de perfiles RAPD generados por 38 cebadores. En otros casos no ha sido posible realizar esta asociacin, probablemente debido a la necesidad del empleo de un mayor nmero de cebadores. En Pelargonium x hortorum Ro el empleo de un conjunto de 13 cebadores permitieron la deteccin de polimorfismos en solamente el 50% de las plantas con fenotipos aberrantes. En Mentha arvensis se obtuvieron perfiles RAPD polimrficos con 12 cebadores en las 6 plantas fenotpicamente diferentes obtenidas por micropropagacin. En otro estudio se observ que no todas las plantas de Musa de fenotipo anormal (enanas) obtenidas presentaban el mismo patrn de bandas. En este mismo gnero, la tcnica permiti detectar polimorfismos en plantas micropropagadas de fenotipo normal. Esto indicara que la variacin molecular no siempre se expresa a nivel fenotpico y viceversa. Existen otros ejemplos que corroboraran esta afirmacin, tal es el caso de la palmera datilera (Elaeis guineensis Jacq.), donde no se detectaron polimorfismos en plantas regeneradas que haban presentado fenotipos florales anormales o el de plntulas micropropagadas de Populus deltoides, donde a travs de la utilizacin de microsatlites se detectaron polimorfismos en plantas

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fenotpicamente normales. Otros marcadores moleculares utilizados con xito para la evaluacin de variacin somaclonal, como los AFLP, permitieron detectar en banana la existencia de diferencias a nivel molecular entre plantas regeneradas de fenotipo normal y aberrantes. A veces, para detectar un cambio es necesario realizar pruebas especficas. Por ejemplo, se evaluaron somaclones de Cynodon dactylon en laboratorio, invernculo y a campo para resistencia a la oruga militar. Un somaclon, el Brazos-R3 (Croughan y col., 1994), tena un rendimiento a campo equivalente al del cultivar madre, pero adems era resistente a dicho insecto. Esto fue debido a que produca menores niveles de un estimulante para la alimentacin del insecto. Es decir que mantena los caracteres agronmicos positivos del cultivar parental, pero tena un cambio en la produccin de un metabolito secundario que confera resistencia a la oruga. 5 La variacin somaclonal y su aplicacin en el mejoramiento gentico de las plantas La base del mejoramiento gentico es la optimizacin de interacciones gnicas. Para lograr combinaciones gnicas ptimas o superiores se requiere de diversidad gentica. Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas (fsicas o qumicas o producidas por ADN-T o por elementos transponibles o retrotrasposones), hibridacin somtica y transformacin gentica. La variacin somaclonal proveera una fuente adicional de variabilidad gentica, utilizable en programas convencionales de mejoramiento. Algunas de las ventajas que presenta la variacin somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera:

que son difciles de mejorar a travs de tcnicas tradicionales. Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. Puede utilizarse para mejorar especies de propagacin sexual y vegetativa. Las tasas de mutacin son relativamente altas si se comparan con las tasas de mutaciones espontneas. La variacin somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutacin cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutacin espontnea de 10-7 10-9 mutaciones por par de nucletidos por generacin. El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad gentica durante el cultivo in vitro permitira utilizar el fenmeno como estrategia de mejoramiento y permitira eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad gentica, como en la micropropagacin, la conservacin de germoplasma y la transformacin gentica. El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutgenos qumicos o fsicos, ya que, en el caso de la variacin somaclonal, la mayora de los cambios deletreos producidos son eliminados por el filtro que representa la regeneracin de plantas. Entre las desventajas cabe mencionar:

Es relativamente poco costoso generarla: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. Constituye una forma rpida de generar variabilidad gentica, particularmente para cultivos con base gentica estrecha y

En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia prctica. La escasa regeneracin de plantas en cultivos de largo trmino. Generalmente en estos casos existe prdida de la capacidad morfognica. La regeneracin est limitada a genotipos especficos que pueden no ser de mucho inters para los mejoradores. Algunos somaclones son inestables (originados por variacin epigentica). Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploida, esterilidad, etc.
Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debera cumplir los siguientes requerimientos:

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Involucrar caracteres agronmicamente


tiles. El nivel de expresin del carcter debe superar al de sus progenitores. El carcter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronmicos de la variedad que son importantes para el cultivo. La variacin debe ser heredable (o bien estable) en las generaciones subsiguientes. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia prctica. La estrategia es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar unos pocos caracteres, ya que resulta ms sencillo mejorar selectivamente una variedad corriente que crear una nueva. 5.1 Estrategias para la seleccin de variantes tiles Las estrategias que se han utilizado para obtener variacin somaclonal comprenden:

etapa de multiplicacin de semillas, que permitir realizar pruebas agronmicas en diferentes ambientes, al menos en dos aos distintos, para evaluar los efectos del componente ambiental en la expresin del carcter. El programa finaliza con la etapa de multiplicacin de semillas para el lanzamiento de la variedad nueva al mercado. Una modificacin para la produccin de nuevas variedades est basada en el empleo de variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se utilizan clulas haploides como fuente de tejido, las variantes obtenidas se denominan variantes gametoclonales. Los gametoclones

a) La obtencin de plantas por cultivo de clulas o tejidos, que luego son analizadas para el carcter deseado. La Figura 1 resume los pasos a seguir para la obtencin de un cultivar por variacin somaclonal. Para este fin se cultiva la mejor variedad Figura 1: Estrategia para la produccin comercial de variantes disponible y se seleccionan, entre las somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz. plantas regeneradas, aquellas que expresen el carcter de inters. Estas plan- se refieren a regenerantes haploides duplitas (generacin R0) se emplean para generar cados, derivados del cultivo de anteras. Esta progenies sexuales (en el caso de plantas con metodologa tendra la ventaja de permitir este tipo de reproduccin), sobre las cuales recuperar caracteres recombinantes adems se vuelve a realizar la seleccin para el carc- de los que pudieran surgir in vitro. Las planter agronmico buscado, tratando de man- tas haploides obtenidas son duplicadas metener a la vez todas las caractersticas favora- diante la exposicin al alcaloide colchicina. Las bles de la variedad. En plantas autgamas, evaluaciones a campo se realizan en forma como trigo, arroz y cebada, se considera conjunta a medida que los nuevos materiaaceptable la evaluacin de la estabilidad del les van siendo multiplicados, de manera de carcter hasta la generacin R4. A partir de aumentar las replicas bajo diferentes condieste momento pueden realizarse cruzamien- ciones ambientales. tos de las plantas R4 selectas con las lneas b) La seleccin a nivel celular, seleccin parentales a fin de determinar, mediante el anlisis de segregacin, la base gentica del in vitro, que se hace con el objetivo de obcarcter mejorado. Posteriormente viene la tener resistencia a estreses biticos o

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abiticos y se utiliza generalmente para caracteres tales como resistencia a toxinas fngicas, herbicidas, concentraciones salinas elevadas y temperaturas extremas. Mediante esta estrategia pueden cultivarse explantos de distintos genotipos y observarse el comportamiento de los callos frente al agente selectivo, en condiciones de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes se procede a la regeneracin de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de mejoramiento. La seleccin efectuada sobre cultivos celulares in vitro puede llevarse a cabo mediante dos modalidades: - Seleccin directa en un solo paso, donde el agente de seleccin es utilizado en concentraciones dobles o triples Figura 2: Seleccin in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas de la MIC (concentracin m- concentraciones de aluminio nima que produce un 100 % racin de callo en el medio de cultivo al que de inhibicin). - Seleccin en varios pasos, donde la con- se ha adicionado aluminio es indicadora de centracin del agente selectivo es gradual- la tolerancia del genotipo al metal en cuesmente incrementada en cultivos sucesivos y tin. Una vez que se han regenerado las plantas se requieren posteriores evaluaciones a frecuentes. El primero es un mtodo simple y efecti- campo, en suelos con concentraciones elevo, ya que las clulas sensibles al agente mo- vadas de aluminio, a fin de corroborar la toriran, permitindo el crecimiento de las tole- lerancia evidenciada in vitro por los materiarantes. Sin embargo, elevados niveles de les. A continuacin se citan ejemplos donde estrs seran deletreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor se combin la seleccin in vitro con la subsinivel de diferenciacin tisular hubiesen sido guiente regeneracin de plantas: capaces de regenerar plantas tolerantes. La - Produccin in vitro de plantas de arroz eleccin de un mtodo u otro depender de un monitoreo preliminar que proporciona resistentes a concentraciones txicas de aluuna indicacin acerca de la reaccin del teji- minio. Se obtuvieron plantas resistentes utido vegetal a las concentraciones letales y lizando distintas concentraciones de aluminio en el medio de cultivo. Por otro lado, se subletales del agente selectivo. En la Figura 2 se representan las etapas observ la aparicin de plantas resistentes a de la seleccin in vitro. En el ejemplo dife- partir de callos de variedades susceptibles rentes lneas de arroz son evaluadas para to- mantenidos en medio de cultivo desprovislerancia al aluminio. La induccin y la prolife- to de aluminio. Estos estudios indicaran que CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE, Viviana

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el cultivo in vitro per se puede originar modificaciones tiles en el genoma de arroz. - Obtencin de resistencia a Fusarium oxysporum en clavel. El cultivo de segmentos internodales de dos cultivares de clavel susceptibles a Fusarium oxysporum f.sp. dianthi permiti, luego de dos ciclos de seleccin, la obtencin de callos resistentes que se utilizaron para regenerar plantas. El 32% de las plantas regeneradas a partir estos callos evidenci considerable resistencia al patgeno en experimentos de campo. La bsqueda de variantes a nivel celular permitira verificar y seleccionar fenotipos adecuados entre millones de clulas, con una inversin menor en tiempo, espacio y dinero y ha sido extensamente utilizada en diferentes cultivos. Sin embargo, no existe total garanta de que la resistencia manifestada in vitro se expresar a nivel de la planta entera. Hay diferentes explicaciones para este fenmeno, como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios epigenticos, a la naturaleza quimrica del material, al uso de toxinas no especficas (en el caso de resistencia a enfermedades), a la complejidad del carcter a ser seleccionado (como por ejemplo la resistencia a salinidad o sequa) o a la falla de las clulas para expresar el carcter cuando se diferencian. En ambos casos (a y b) la obtencin de resistencia slo ser posible si sta existe en la poblacin original (entonces el cultivo servira slo para recuperar los genotipos tiles) o bien si surge por variacin somaclonal durante el proceso de cultivo. 6 Variantes somaclonales liberadas comercialmente La variacin somaclonal fue utilizada para la produccin de variedades comerciales con caracteres agronmicos superiores en diferentes especies. A continuacin se enumera, para cada especie, el carcter agronmico seleccionado y el centro de investigacin responsable de dicho logro: en geranio, aquitectura florar (Purdue Univ., USA); en batata: calidad de races y arquitectura de la canopia (North Carolina Research Service, USA); en caa de azcar: resistencia a estrs y a enfermedades (Sugarcane Research Cen-

tre, Fiji); en maz: contenido de triptfano (Molecular Genetic, USA); en tomate y apio: contenido de materia seca y rendimiento, respectivamente (DNA Plant technology of New Jersey, USA); en arroz: resistencia a enfermedades (Plantech Research Institute, Japan y Univ. Agricultural Sciences, Hungary); en mostaza: rendimiento (ICAR, India). Las primeras observaciones de variacin en caracteres morfolgicos fueron realizadas en arroz y otras especies a partir de 1968. Diez aos ms tarde se inform en detalle la variacin obtenida en la progenie de plantas de arroz cultivadas in vitro y autopolinizadas. Tambin se encontraron alteraciones en la altura de la planta, la longitud del tallo y otras caractersticas en alfalfa. En arroz, la variacin somaclonal result en el mejoramiento de varios caracteres cuantitativos, incluyendo parmetros morfolgicos, caracteres agronmicos y tolerancia a estreses biticos y abiticos. Pueden mencionarse adems otros ejemplos de variacin somaclonal en cultivos agrcolas de inters, como por ejemplo caa de azcar , donde se obtuvieron somaclones provenientes del cultivar Pindar resistentes a una virosis transmitida por fidos. Paralelamente, tambin por variacin somaclonal, se seleccion el cultivar Ono, que presenta resistencia al downy mildew, causado por Sclerospora sacchari. En papa, el cultivo de protoplastos obtenidos de suspensiones celulares cromosmicamente variables produjo gran cantidad de variantes somaclonales del cultivar Russet Burbano, que presentaron resistencia a Phytophthora infestans, a Alternaria solana y a la colonizacin por fidos que transmitan el virus Y de la papa (PVY) y el virus del enrrollamiento de la hoja (PLRV). Se encontr tambin tolerancia a glifosato en somaclones de cebada regenerados en medios conteniendo el herbicida. En sorgo se encontr variacin somaclonal estable para altura, nmero de macollos, mayor produccin de granos y mayor nmero de semillas y tolerancia a suelos cidos y a sequa. La incidencia de variacin somaclonal en banana se encuentra extensamente documentada. En el caso de cultivares comerciales de banana Cavendish en Taiwn se obtu-

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vo resistencia a la Raza 4 de Fusarium oxysporum f. sp. Cubense. Estos cultivares no haban podido ser mejorados por mtodos tradicionales. No obstante, para lograr una variedad con rendimiento equiparable a las variedades no resistentes se necesitaron varios ciclos de micropropagacin adicionales, que permitieron combinar ambas caractersticas en un somaclon. Otros ejemplos donde se han obtenido cultivares por variacin somaclonal son tabaco (tolerante a aluminio y resistente a herbicida), trigo (resistente a Helminthosporium sativum) y alfalfa (resistente a Fusarium oxysporum). Se han detectado tambin caracteres interesantes modificados por esta tcnica para

su explotacin comercial en ornamentales, como por ejemplo variacin en el color de las flores en gerbera, clavel y crisantemo. En gramneas forrajeras puede citarse variacin cromosmica en Festuca arundinacea y pasto llorn ( Eragrostis curvula), albinismo en Lolium perenne y Festuca pratense, cambios en la morfologa de planta, forma y tamao de hoja y espiga, desarrollo floral, vigor, y supervivencia en somaclones de Lolium y Festuca arundinacea , variacin isoenzimtica en Festuca arundinacea; disturbios reproductivos y resistencia al moteado de hoja en pasto bermuda (Cynodon dactylon). En el laboratorio de Gentica del Dpto.

Figura 3: Obtencin de variantes somaclonales de pasto llorn, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo de inflorescencias A) Formacin de callos, B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfognesis. C) Estudio histolgico de los mismos callos mostrando clulas embriognicas y D) embriones somticos. E) En el mismo callo se observaron embriones bipolares y tambin F) organognesis. G) Plntula completa en el momento de salir del tubo de ensayo. H) Las plantas llevadas al campo fueron frtiles (I). J) Cromosomas en el pice radical de la planta donadora de explanto, 2n=4x=40 apomctica. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a partir de la anterior 2n=2x=20, sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando variacin, lo cual indica la presencia de sexualidad. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas.

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de Agronoma de la UNS se llev a cabo un proyecto para obtener somaclones de pasto llorn (Fig.3). Se trabaj con varios cultivares de esta gramnea apomctica y luego de la evaluacin de gran nmero de plantas se seleccionaron los siguientes materiales: - Una planta diploide sexual, obtenida a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Dicho material est en proceso de registracin, y est siendo utilizado en estudios de apomixis. - Dos plantas hexaploides apomcticas a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Dichas plantas dieron origen a dos nuevos cultivares de Eragrostis curvula , muy promisorios por sus caractersticas forrajeras, que estn en proceso de registro. La variacin in vitro en trigo y en otros cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo. En plantas regeneradas de triticale y trigo se informaron variaciones a nivel del ADN mitocondrial y de protenas de la semilla, como las gliadinas. A nivel fenotpico, se han informado cambios estables en longitud de la espiga, nmero de granos por espiga, peso de 100 granos, densidad y biomasa de la espiga, mayor contenido de protena en grano sin reduccin del rendimiento, aristas, altura de la planta, fertilidad, nmero de macollos, color del grano, tiempo de espigazn, dureza, sensibilidad al cido abcsico, color de las glumas, entre otros caracteres morfolgicos. Las mutaciones observadas han sido de dominantes a recesivas y viceversa. El nico antecedente en nuestro pas de bsqueda de variacin somaclonal en trigo es un estudio acerca de la estabilidad in vitro de tres cultivares de trigo con elevados niveles de inestabilidad cariotpica espontnea. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosmica, patrn de gliadinas, color del grano y de las glumas, tipo de aristas, niveles de clorofila y morfologa de la planta, detectndose slo una translocacin no descripta previamente y un patrn diferente de gliadinas como consecuencia del cultivo in vitro, sugiriendo que esta tcnica no es efectiva para inducir variacin que pueda ser utilizada en programas de mejoramiento (Franzone y col., 1996).

7 Lecturas recomendadas
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CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE, Viviana

III.-Captulo 2
Hibridacin somtica
Polci, Pablo; Friedrich, Pablo 1 Introduccin La mejora gentica de las plantas cultivadas en procura de incrementar la produccin viene siendo practicada por el ser humano desde hace miles de aos, seguramente desde el inicio mismo de la agricultura. Para ello, el hombre ha empleado los cruzamientos con el fin de incrementar la variabilidad gentica, paso inicial en el proceso de mejoramiento. De esta manera la hibridacin entre especies diferentes permiti aumentar de modo significativo la productividad de diversos cultivos, como por ejemplo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos esta estrategia no result exitosa a causa de esterilidad sexual o incompatibilidad gentica. La hibridacin somtica, es decir, la obtencin de plantas hbridas a partir de la fusin de clulas o de protoplastos derivados de clulas somticas, surgi hace unos 30 aos como una herramienta muy promisoria para sortear problemas de incompatibilidad precigtica. Esta tcnica, si bien presenta algunas limitaciones, como una elevada esterilidad o imposibilidad de regenerar plantas en algunos casos, demostr ser til en la mejora gentica de plantas, principalmente por permitir la introgresin limitada de genes de especies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o tolerancia a estreses. Tambin permite la obtencin de citoplasmas hbridos (cbridos). La hibridacin asimtrica y cibridizacin sirve como puente para la transferencia de genes individuales La tcnica de fusin de protoplastos se desarroll en la dcada de 1950-60, a partir de la observacin de que ciertos virus pueden inducir la fusin de clulas animales. Sin embargo, recin en la dcada de 1980-90 tuvo un mayor auge debido a la aparicin de mtodos qumicos y elctricos ms apropiados para la fusin de clulas vegetales. La pared presente en estas clulas representa una

barrera que normalmente impide la fusin entre ellas. Por ello, la obtencin de plantas hbridas somticas requiere del previo aislamiento de protoplastos mediante la digestin enzimtica de las paredes celulares, para luego proceder a la fusin de protoplastos de distintos tipos parentales (distintos genotipos) y posterior regeneracin de plantas a partir de los productos de fusin. La hibridacin somtica en plantas comenz a desarrollarse a principios de 1970 con la aplicacin de mtodos qumicos de fusin, y se extendi en los 80 con el empleo de mtodos de electrofusin. Es relevante destacar que, a los fines del mejoramiento gentico, el sistema de protoplastos no slo se emplea para la obtencin de hbridos somticos, sino que tambin constituye un material apropiado para la incorporacin de ADN exgeno. Asimismo, la fusin de protoplastos tiene un uso mucho ms amplio que el estrictamente de inters agronmico; en tal sentido, es de gran utilidad en estudios de biologa celular as como para otras aplicaciones biotecnolgicas, por ejemplo, la produccin de anticuerpos monoclonales. 2 Hibridacin somtica vs. hibridacin sexual Con relacin a su potencialidad para producir hbridos, existen diferencias importantes entre la fusin de protoplastos somticos y el cruzamiento sexual: La hibridacin sexual entre organismos de diferentes especies est limitada por barreras de incompatibilidad. En algunos casos estas barreras son precigticas, es decir, no permiten que se produzca la fecundacin. Tal limitacin no existe en la fusin de protoplastos, dado que este proceso es noespecfico, permitiendo la fusin de clulas de orgenes muy diversos, incluso de organismos muy distanciados filogenticamente (por ejemplo, clulas animales y vegetales). Ello no significa que pueda regenerarse un organismo viable y frtil a partir de cualquier tipo de combinacin entre clulas. De hecho, la bsqueda de hbridos de inters agronmico ha demostrado que el principal aporte de esta metodologa es la introgresin, en los cultivos, de genes provenientes de plantas silvestres emparentadas.

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La hibridacin sexual ocurre normalmente por fusin de clulas haploides (n + n), mientras que en la hibridacin somtica se fusionan dos protoplastos con sus genomas completos (2n + 2n) o con uno de ellos conteniendo slo parte de su genoma. Otra diferencia est dada por la herencia de los genes extranucleares, esto es, plastdicos y mitocondriales. Mientras que en la reproduccin sexual el genoma citoplasmtico es aportado casi exclusivamente por la gameta femenina, en la hibridacin somtica se combinan organelas de ambos progenitores, produciendo nuevas combinaciones de genes citoplasmticos.
3 Hibridacin somtica vs. transformacin gentica

bridacin somtica pero no por transformacin gentica. Sin embargo, en la actualidad, con las nuevas herramientas aportadas por la genmica se est avanzando en el conocimiento de todos los genes involucrados en diversas vas metablicas. Estos podran ser transferidos en conjunto va transgnesis. 4 Tipos de hbridos somticos Cuando se realiza la fusin de protoplastos se obtienen clulas con el aporte de cromosomas de dos o ms ncleos (Fig.1.) Si los protoplastos involucrados en la fusin proceden de distintos tipos parentales se originan heterocariones, y si proceden del mismo tipo parental se originan homocariones. Cuando en el heterocarin ocurre la fusin de los ncleos (cariogamia), se forma una clula hbrida. A partir de una clula hbrida, que contiene dos genomas completos, se puede regenerar una planta que, segn cual haya sido el destino del material gentico nuclear durante las divisiones celulares que siguen a la fusin, puede ser de tres tipos: 1. Hbrido simtrico , que tiene el genoma nuclear completo de cada tipo parental. 2. Hbrido asimtrico , que tiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales y slo una parte del genoma nuclear del otro parental.

La preponderancia que han tomado las tcnicas de transformacin gentica ha relegado a la hibridacin somtica a un papel de menor significacin como herramienta biotecnolgica aplicada al mejoramiento de los cultivos. Comparando ambas metodologas, podemos destacar las siguientes diferencias: En la transformacin gentica se incorporan uno o pocos genes exgenos en una planta, mientras que en la hibridacin somtica el nmero de genes introducidos es mayor dado que se transfieren cromosomas de una especie a otra o se combinan dos genomas completos. La hibridacin somtica permite transferir caracteres sin necesidad de contar con un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares que determinan la expresin de dichos caracteres. Por el contrario, la transformacin gentica requiere la previa identificacin y aislamiento de los genes que determinan la expresin del carcter de inters. Caracteres tales como productividad, tolerancia a ciertos tipos de estrs, resistencia horizontal a enfermedades y otros son polignicos, por lo que su Fig. 1. Destino del material gentico nuclear y extranuclear en la fusin transferencia es factible por hi- de protoplastos.

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3. Cbrido, que contiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales, reteniendo slo material gentico extranuclear del otro parental. Es usual que en el proceso de regeneracin de plantas hbridas ocurra una eliminacin gradual de cromosomas de uno de los tipos parentales, producindose de este modo hbridos asimtricos o cbridos. La prctica de la hibridacin somtica en plantas demostr que, en general, los hbridos asimtricos y cbridos son ms valiosos que los simtricos producidos entre plantas alejadas filogenticamente. Por esta razn se han desarrollado mtodos para inducir la hibridacin asimtrica o cibridacin, alterando el genoma de uno de los protoplastos parentales. En este caso se dice que se transfiere parte del genoma de un protoplasto donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo en cuenta el material de partida empleado para la fusin, pueden producirse tres tipos de clulas hbridas: 1. Clulas hbridas simtricas, por fusin de dos protoplastos con sus genomas completos. 2. Clula hbrida asimtrica, por fusin de un protoplasto conteniendo su genoma completo con otro conteniendo su ncleo inviable o slo una parte de su genoma nuclear. Los protoplastos donantes son irradiados con rayos X o Gamma, lo que provoca la fragmentacin de los cromosomas. Una vez producida la fusin, dichos fragmentos tienden a eliminarse en las sucesivas mitosis, pero algunos de ellos pueden integrarse con el genoma del receptor produciendo un hbrido asimtrico. El tratamiento de irradiacin parece no tener efectos deletreos o mutagnicos sobre los genomas de organelas, probablemente debido a que cada clula posee varias copias de ellas. Tambin puede producirse una clula hbrida asimtrica fusionando protoplastos receptores con microprotoplastos, conteniendo uno o pocos cromosomas. Los microprotoplastos se obtienen induciendo la formacin de microncleos por tratamientos con agentes antimicrotbulos. 3. Cbridos, por fusin de un protoplasto conteniendo su genoma nuclear completo

con un protoplasto enucleado o con su ncleo inviable. Los protoplastos enucleados o citoplastos pueden obtenerse centrifugando los mismos a alta velocidad en un gradiente de densidad isosmtico. Asimismo, el mtodo de irradiacin con rayos X o Gamma puede generar cbridos en casos en que se produzca la eliminacin total de los fragmentos cromosmicos. Los protoplastos que poseen su genoma nuclear completo (receptores), pueden ser tratados previamente con inhibidores metablicos. En este caso slo pueden sobrevivir, por complementacin metablica, los heterocariones conteniendo el ncleo del receptor y el citoplasma del donante enucleado. La segregacin de los plstidos y mitocondrias de los dos tipos parentales tambin constituye una fuente importante de variabilidad en la regeneracin de plantas hbridas. Es frecuente que ocurran recombinaciones de los genomas mitocondriales de ambos tipos parentales, pero ello es poco comn entre plstidos. Dado que las organelas segregan independientemente unas de otras, la regla es que al cabo de pocas divisiones mitticas las clulas formadas contengan plstidos provenientes de uno u otro tipo parental. As, una clula hbrida origina una colonia de clulas que exhiben diferentes combinaciones de genes citoplasmticos, pero con una mayor frecuencia de clulas que poseen mitocondrias recombinantes y plstidos de uno u otro tipo parental. El destino que sufre el material gentico nuclear y extranuclear durante las divisiones celulares determina que, a partir de una poblacin de clulas hbridas similares, se puedan regenerar plantas con diferentes combinaciones de genes nucleares, plastdicos y mitocondriales. La Figura 2 muestra un esquema de las etapas involucradas en la hibridacin somtica, las cuales son tratadas a continuacin. 5 Aislamiento de protoplastos El desarrollo de mtodos enzimticos de aislamiento a partir de 1960 brind la posibilidad de obtener grandes cantidades de protoplastos vegetales. Ello tuvo gran influen-

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establecerse en forma emprica las condiciones ptimas para un sistema determinado. Las etapas del aislamiento y los factores a considerar en cada una de ellas se describen a continuacin: 1. Seleccin del material de partida. Influye en el resultado del aislamiento as como en el proceso de regeneracin posterior. Generalmente se emplean hojas y clulas en cultivo lquido o slido. Cuando se emplean hojas, la edad y las condiciones de cultivo de la planta afectan el rendimiento. Se obtienen mejores resultados con hojas jvenes totalmente expandidas que con hojas viejas. (Fig. 3A.). Para facilitar el contacto de las enzimas con las clulas, las hojas suelen cortarse en trozos pequeos, muy finos en el caso de las monocotiledneas. Algunas veces se extrae la epidermis inferior antes de colocar la hoja en la solucin Figura 2: Materiales y procesos involucrados en la hibridacin enzimtica, como sucede con las somtica. dicotiledoneas. Cuando se emplean cia en diferentes reas de la biologa y la clulas en suspensin, se obtienen mejores biotecnologa de plantas, dada la utilidad de resultados si se encuentran en la fase los protoplastos como sistema experimental exponencial de crecimiento. para estudios fisiolgicos, bioqumicos y 2. Tratamiento enzimtico. La concentramoleculares, as como para su aplicacin al cin de la enzima y el tiempo de incubacin mejoramiento gentico. requeridos para lograr la liberacin de los Los protocolos de aislamiento emplean protoplastos dependen del producto comerenzimas fngicas con actividad celulasa y cial utilizado. El pH generalmente se ajusta pectinasa, siendo necesario en algunos casos en un rango de 4,7 a 6, y la temperatura enel agregado de hemicelulasas. Las celulasas y tre 25 y 30 C. La duracin del tratamiento hemicelulasas degradan la pared celular, en enzimtico y la relacin volumen de solucin/ tanto que las pectinasas digieren la matriz cantidad de tejido influyen en el rendimiende pectina que mantiene adheridas a las c- to. Durante el aislamiento se produce la lisis lulas. El uso de enzimas disponibles comer- de algunas clulas, que liberan enzimas cialmente posibilit el aislamiento de hidrolticas y compuestos oxidantes que pueprotoplastos de prcticamente cualquier te- den daar los protoplastos, por lo que se jido vegetal, siempre que el mismo no est suelen agregar inhibidores de proteasas y lignificado. Se ha podido aislar protoplastos antioxidantes tales como el Polivinilpirrolide una gran cantidad de especies vegetales dona-10. El agregado de un estabilizador y regenerar plantas a partir de los mismos, osmtico a la solucin enzimtica es esencial permitiendo el uso de este sistema para la para evitar la ruptura de los protoplastos a propagacin clonal y la modificacin gentica medida que son liberados, siendo ms estade plantas. bles si la solucin es ligeramente hipertnica. El nmero de protoplastos aislados, su Para ello se utilizan solutos osmticamente viabilidad y la pureza de la suspensin obte- activos, comnmente manitol o sorbitol, en nida dependen de varios factores, debiendo concentraciones que varan entre 0,3 a 0,8

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6 Mtodos de fusin 6.1 Mtodos qumicos Los primeros casos informados de fusin controlada y reproducible de protoplastos vegetales y de regeneracin de hbridos somticos se produjeron a principios de la dcada de 1970, empleando nitrato de sodio como agente fusgeno. La frecuencia de formacin de heterocariones en tales casos era muy baja. Posteriormente, se lograron mejores resultados fusionando protoplastos de clulas del mesfilo de Nicotiana en un medio conteniendo alta concentracin de Ca++ (50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo, el fusgeno que alcanz mayor aceptacin es el polietilenglicol (PEG) debido a que, en comparacin con los otros agentes qumicos, produce mayor proporcin de heterocariones y, para muchos tipos celulares, resulta menos txico. Adems, el tratamiento con PEG genera una mayor proporcin de heterocariones binucleados, con menor ocurrencia de fusiones entre ms de dos protoplastos. El procedimiento de fusin con PEG ms ampliamente utilizada es, en lo esencial, una combinacin del mtodo original del PEG y el de CA++ y pH elevados. Los protoplastos de dos tipos parentales se mezclan en una solucin conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30 minutos. La temperatura de incubacin ptima para inducir la fusin es de 35 a 37 C pero, en la prctica, suele ajustarse a 24 C. La densidad de protoplastos adecuada para la formacin de heterocariones es de 4 a 5 % (volumen de protoplastos/volumen de suspensin). La remocin del PEG se lleva a cabo en forma gradual, siendo esto fundamental para asegurar una elevada frecuencia de heterocariones. Para ello, la suspensin se somete a sucesivos lavados con una solucin alcalina (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, disminuyendo progresivamente la concentracin de PEG con cada lavado. En la fusin de los protoplastos ocurren, en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1) las membranas plasmticas de protoplastos adyacentes entran en ntimo contacto, (2) se producen alteraciones en sitios localizados

Figura 3: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A. Eliminacin de las nervaduras centrales y seccionado de la hoja en trozos pequeos. B. Digestin enzimtica de las paredes celulares. C. Centrifugacin y obtencin de protoplastos libres de restos de tejidos vegetales.

M segn el tipo de protoplasto. La solucin enzimtica es por lo general suplementada con sales, comnmente CaCl2, que incrementan la estabilidad de la membrana (Fig. 3B). 3. Limpieza y purificacin de los protoplastos. Una vez lograda la liberacin de los protoplastos, se procede a la remocin de las enzimas y de los restos de tejido y de clulas rotas. La suspensin se pasa por un filtro de nylon o metlico con un dimetro de poro (30-100 mm) que permita el paso de los protoplastos y retenga los restos de tejido y grupos de clulas no digeridas. Posteriormente, se efectan 3 4 lavados centrifugando la suspensin por 5 minutos a baja velocidad (50-100 g). Finalmente, los protoplastos sedimentados se resuspenden en una solucin salina que contenga un estabilizador osmtico. De este modo se eliminan las enzimas y restos celulares. Para lograr una mayor pureza de la suspensin es conveniente centrifugarla en un gradiente de densidad (Fig. 3C). Para el recuento de protoplastos se emplea un hemocitmetro. La viabilidad se determina generalmente empleando colorantes que son incorporados (rojo neutro, diacetato de fluorescena) o excluidos (azul de Vean) por las clulas viables; tambin pueden evaluarse la actividad fotosinttica (emisin de fluorescencia) y la respiratoria (consumo de O2).

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de las mismas, formndose puentes citoplasmticos entre protoplastos vecinos, y (3) las interconexiones citoplasmticas se expanden, provocando la fusin. La carga negativa neta de la superficie de las membranas produce la repulsin entre ellas; el tratamiento con Ca++ y pH elevados neutraliza las cargas superficiales, favoreciendo el contacto entre protoplastos. El PEG actuara como un puente molecular causando alteraciones en las membranas plasmticas que promueven la adhesin y formacin de puentes citoplasmticos entre protoplastos vecinos, producindose finalmente la fusin. 6.2 Electrofusin En 1973 se descubri que pulsos de elevado potencial elctrico en un rango muy estrecho de intensidad y duracin conducen a un incremento reversible, experimentalmente controlable, de la permeabilidad de la membrana celular. Este efecto se denomin ruptura elctrica reversible para enfatizar la habilidad de la membrana para reparar tales perturbaciones. El voltaje mnimo para un protoplasto (umbral) con el cual se produce la formacin de poros disminuye a mayor duracin del pulso elctrico. Este fenmeno de ruptura reversible tambin es aplicado en la tcnica de electroporacin, con la que se pueden introducir en las clulas construcciones de ADN y otras molculas de alto peso molecular. El mtodo de electrofusin en esencia involucra dos pasos: 1. Los protoplastos, colocados en un medio de baja conductividad entre dos electrodos, se ponen en contacto al aplicar corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz) en un campo elctrico no uniforme. Las cargas se separan dentro de las clulas formando un dipolo y generando, por lo tanto, un potencial de membrana. La fuerza del campo a ambos lados de una clula es diferente (campo no uniforme), dando origen a una fuerza neta que la empuja a una regin de mayor intensidad de campo (hacia uno de los electrodos). Este proceso se denomina dielectroforesis. La polaridad de la clula incrementa el campo local no uniforme, atra-

yendo a las clulas vecinas. Luego, los protoplastos se aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a las lneas de campo aplicadas (Fig. 4A). La fuerza ejercida sobre la clula bajo condiciones dielectroforticas depende (1) de la intensidad de campo elctrico, (2) del gradiente del campo, (3) del volumen del protoplasto y (4) de la diferencia entre las constantes dielctricas de la clula y su ambiente (as como la correspondiente diferencia entre sus conductividades). 2. El segundo paso consiste en la aplicacin de uno o ms pulsos cortos de corriente directa de 15 a 100 seg., con una intensidad de campo elevada (1 a 3 Kv/cm), suficiente para causar la ruptura reversible de la membrana. Para que esto ocurra es necesario que el voltaje crtico de membrana sea alcanzado en cuestin de nanosegundos a microsegundos. Ocurre entonces la fusin de las dos clulas cuyas membranas estn en estrecho contacto (1 a 2 nanmetros de distancia). El proceso de resellado es principalmente atribuido a las molculas lipdicas debido a que su coeficiente de difusin es dos rdenes de magnitud mayor que el de las protenas. Durante este proceso pueden formarse puentes lipdicos entre las membranas de las dos clulas. En otras palabras, las membranas no se vuelven a sellar separadamente en la zona de contacto. Los puentes formados de esta manera, con continuidad citoplasmtica entre las dos clulas, conducen a un radio de curvatura muy pequeo y a altas tensiones superficiales. Como consecuencia se forma una nueva clula esfrica, ya que el proceso es favorecido energticamente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversible si el nmero y el tamao de los poros son pequeos en relacin con el total de la superficie de la membrana. Fuerzas de campo supra crticas, as como tambin largos perodos de exposicin, rompen reas mayores de membrana y pueden producir la destruccin total de la clula La frecuencia de fusin depende de varios factores: El genotipo. La procedencia de los protoplastos dentro del mismo genotipo. Diferentes poblaciones de protoplastos exhiben frecuen-

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Figura 4: Electrofusin de protoplastos de mesfilo de pasto llorn. A. Dielectroforesis de clulas. Las diferencias en intensidad de campo elctrico hacen que las clulas se muevan hacia la zona cercana al electrodo. B. Aplicacin de pulsos cortos de corriente directa, que inducen la formacin de poros en la membrana, generando puentes entre las membranas de las clulas adyacentes. C. Los puentes con continuidad citoplasmtica poseen un radio de curvatura muy pequeo. Las altas tensiones superficiales generadas en ese sector conducen a la formacin de una nueva clula esfrica.

cias de fusin diferentes, aun cuando provengan del mismo genotipo. En general, los protoplastos obtenidos a partir de hojas se fusionan ms fcilmente que los provenientes de raz o de cultivos celulares. El tamao de los protoplastos. Los ms grandes se fusionan ms fcilmente. La densidad de los protoplastos. El nmero, la duracin y la fuerza de los pulsos de corriente directa. La duracin del pulso elctrico es de 15 a 50 seg. El tiempo requerido para la fusin que sigue a la aplicacin de un pulso vara desde pocos segundos a varios minutos. Esto probablemente est relacionado a la diferencia de fluidez de la membrana en los distintos tipos celulares y a las propiedades del citoesqueleto dentro de la clula. El medio de fusin. Un factor de limitacin en la agregacin dielectrofortica de las clulas es la conductividad elctrica del medio; si sta es muy alta, hay mucho flujo de corriente en la solucin y se producen calentamientos y turbulencias que impiden la formacin de cadenas. El potencial osmtico del medio de fu-

sin. La inclusin de iones en el medio puede incrementar el porcentaje de fusin. Sin embargo, existe la limitacin de que la dielectroforesis debe realizarse en un medio de baja conductividad; el medio de fusin usualmente consiste en manitol (cuya concentracin se ajusta segn los protoplastos empleados) y CaCl2 1 mM. Valores bajos de presin osmtica en el medio de suspensin de los protoplastos pueden favorecer el proceso de fusin. La longitud de las cadenas de protoplastos formadas durante la dielectroforesis, que adems depende de factores como la densidad de protoplastos, fuerza del campo elctrico y tiempo durante el cual es aplicado. Cadenas ms largas darn mayor frecuencia de fusin que las cadenas cortas. Pulsos de corriente ms largos y de mayor voltaje producen un aumento de los eventos de fusin mltiple; obviamente, pulsos muy largos y voltajes muy elevados pueden matar a los protoplastos. La composicin y propiedades de la membrana plasmtica pueden ser afectadas por la actividad metablica de los protoplastos y por el tipo de enzimas empleadas en el proceso de aislamiento, influyendo en consecuencia en el proceso de fusin. Las condiciones experimentales deben ajustarse de modo de obtener la mayor frecuencia de fusin posible (nmero de protoplastos fusionados sobre el total de protoplastos), intentando maximizar la proporcin de heterocariones (productos de la fusin de protoplastos diferentes) formados por sobre la de homocariones (productos de la fusin de protoplastos del mismo tipo parental), y minimizando la ocurrencia de eventos de fusin mltiple (fusin de ms de dos protoplastos). La proporcin de cada uno de los dos tipos de protoplastos en la suspensin puede fijarse a fin de incrementar la formacin de heterocariones por sobre la de homocariones. El tipo de protoplasto con mayor tendencia a fusionar se mezcla con el de menor tendencia a fusionar en una relacin de 1:5 a 1:10. As, durante la formacin de cadenas, los protoplastos ms fusionables estarn mayoritariamente en contacto con los menos fusionables, y stos a su vez esta-

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rn ligados entre ellos mismos. Seleccionando las condiciones duracin y voltaje de los pulsos que promuevan slo la fusin de los protoplastos ms fusionables, los productos sern mayormente heterocariones. Sin embargo, aun cuando las condiciones de fusin puedan fijarse de modo de incrementar la frecuencia de fusin y la proporcin de heterocariones formados, la fusin de protoplastos a gran escala (macrofusin), tanto por mtodos qumicos como elctricos, resultar en una mezcla de protoplastos parentales, homocariones y heterocariones. Esto conlleva la necesidad de emplear mtodos de seleccin de los hbridos somticos obtenidos. Una tcnica alternativa que ofrece la ventaja de no requerir una posterior seleccin de heterocariones, aunque demanda mayor manipulacin, es la microfusin o electrofusin de pares de protoplastos. Esta tcnica se basa en los mismos principios que la electrofusin a gran escala pero est diseada para inducir la fusin en pares seleccionados de protoplastos. Este sistema emplea microelectrodos de platino fijados a un soporte montado debajo del condensador de un microscopio invertido. Los pares de protoplastos seleccionados se colocan en microgotas de medio de fusin sobre un soporte, recubiertas por aceite mineral. En cada evento de fusin, los microelectrodos se posicionan a cada lado de una microgota conteniendo un par de protoplastos, y se aplican los pulsos elctricos. Despus de la fusin, los heterocariones resultantes son transferidos a gotas con medio de cultivo para la posterior regeneracin de plantas hbridas. La tasa de fusin es de aproximadamente 30 pares de protoplastos fusionados y transferidos a medio de cultivo por hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fusin cercanas al 50 %. Ventajas de la electrofusin: 1. El proceso entero puede ser seguido bajo microscopio por lo que los hbridos pueden ser fcilmente identificados y transferidos a un medio nutritivo o selectivo. 2. Puede preseleccionarse el nmero de clulas a ser fusionadas. Las formaciones de dos clulas son favorecidas por bajas densidades en la acanaladura entre los electrodos.

Para obtener productos de multifusin deben emplearse elevadas densidades. 3. El proceso de fusin es sincrnico, ya que el pulso provoca la fusin de todas las clulas expuestas al campo. 4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80 - 100 %) y cariogamia. 5. La viabilidad de las clulas fusionadas es muy buena. 6. Este mtodo ofrece ventajas sobre otros como el del PEG, que: -requiere condiciones no fisiolgicas -las frecuencias de formacin de heterocariones binucleados son bajas y variables -resultan txicos para diversos tipos celulares- el fusgeno debe ser removido antes del cultivo de los protoplastos y tiene bajo rendimiento de clulas fusionadas. 7 Seleccin de heterocariones La fusin de protoplastos a gran escala produce una mezcla de tipos parentales y productos de fusin. Si no se efecta una previa seleccin de las clulas hbridas, la regeneracin de plantas y la posterior identificacin de los hbridos demandar mucho trabajo y recursos. Dicha seleccin es particularmente necesaria cuando se emplean mtodos qumicos, que producen una baja proporcin (<10%) de clulas hbridas. Por el contrario, los mtodos elctricos no requieren necesariamente del posterior proceso de seleccin dado que normalmente producen frecuencias de fusin muy elevadas o porque, en el caso de la microfusin, no se generan mezclas heterogneas de protoplastos debido a que se fusionan dos clulas por vez. Cualquiera que sea el caso, la condicin de hbrido debe verificarse en la planta regenerada mediante diferentes anlisis que se explican ms adelante. La seleccin de clulas hbridas puede llevarse a cabo empleando los siguientes mtodos: Seleccin sobre la base de caracteres morfofisiolgicos. En ciertos casos es posible diferenciar los callos hbridos de los parentales. Por ejemplo, en algunos cruzamientos, los callos hbridos poseen un color intermedio al de los parentales. Cuando se produce un cruzamiento entre un parental con capacidad para regene-

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rar planta con uno recalcitrante, los hbridos somticos normalmente regeneran plantas, ya que este carcter se comporta como dominante. Si los protoplastos del genotipo respondedor son tratados con inhibidores metablicos irreversibles (iodoacetamida, dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirn, y solamente podrn regenerarse los hbridos. Seleccin por complementacin. La seleccin se produce porque el medio de cultivo resulta restrictivo para el crecimiento de los parentales, pero no para el de los hbridos. La complementacin puede lograrse por las siguientes vas: a) Empleando dos parentales con defectos metablicos o genticos no allicos. Si dichos caracteres son recesivos, la fusin produce una clula hbrida en la que los defectos se anulan por complementacin. Por ejemplo, la fusin de dos variedades albinas no allicas (nucleares) de tabaco, permiti obtener plantas verdes. AAbb (albina) x aaBB (albina) AAaaBBbb (verde) Asimismo, a partir de dos lneas mutantes no allicas de tabaco deficientes en nitrato reductasa, se obtuvieron colonias capaces de crecer en un medio conteniendo nitrato como nica fuente de nitrgeno. b) Fusionando parentales que expresan caracteres dominantes tales como resistencia a antibiticos o herbicidas. Para ello se emplea una lnea resistente a cierta droga, y otra resistente a una segunda droga, efectundose la seleccin de las clulas hbridas en un medio conteniendo ambas drogas a concentraciones que resultan letales para las lneas parentales. c) Una lnea que presente una mutacin autotrfica (por ejemplo: albinismo, deficiencia a nitrato reductasa) y un carcter dominante (por ejemplo, resistencia a antibiticos o herbicidas) es de gran utilidad para la seleccin. Los hbridos producidos por el cruzamiento de estos parentales con cualquier genotipo silvestre pueden ser seleccionados en medio mnimo suplementado con el antibitico o herbicida, que no permite el crecimiento de los parentales. Seleccin por aislamiento de los

heterocariones o clulas hbridas. Es el sistema ms confiable y de ms amplio espectro de aplicacin. El aislamiento puede realizarse de dos maneras: a) Seleccin mecnica directa utilizando tcnicas de micromanipulacin con micropipeta. Puede realizarse cuando los protoplastos parentales presentan rasgos que los distinguen al microscopio, permitiendo reconocer las clulas hbridas. Por ejemplo, al fusionar protoplastos del mesfilo (verdes) con protoplastos de suspensiones celulares (incoloros). Tambin pueden colorearse las clulas de ambos progenitores con diferentes colorantes vitales, como el rojo neutro y azul brillante de cresilo. b) Citometra de flujo. Los protoplastos parentales se marcan con diferentes colorantes fluorescentes; por ejemplo, rodamina (rojo) y fluorescena (verde amarillento). El aislamiento de los heterocariones marcados con ambos colorantes se realiza utilizando un citmetro de flujo (FACS, fluorescenceactivated cell sorter), que es preciso y muy rpido. El equipo posee fotoclulas que detectan fluorescencia, pudiendo separar los protoplastos marcados con un solo fluorocromo (parentales) de aqullos doblemente marcados (hbridos). 8 Cultivo de protoplastos La habilidad para regenerar plantas a partir de clulas y tejidos en cultivo es un componente esencial en la biotecnologa para la manipulacin gentica y el mejoramiento vegetal. Esto resulta relativamente fcil para las dicotiledneas herbceas, pero ha sido bastante difcil para las monocotiledneas, particularmente las gramneas. Los protoplastos se cultivan en cajas de Petri en medio lquido o semislido, rico en compuestos orgnicos e inorgnicos, suplementado con reguladores del crecimiento, y en presencia de un estabilizador osmtico. Suelen ser cultivados en cajas de Petri con medio agarificado, donde se mezcla la solucin de protoplastos con un medio de cultivo lquido a 40C conteniendo 1,2% de agar, perferen-temente agarosa (Fig. 5AyB). Los protoplastos quedan, as, atrapados en el medio semislido y, luego de varios das, se ven las colonias formadas (Fig. 5C). Sin em-

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dos con vitaminas, azcares, aminocidos, reguladores de crecimiento y tambin con aditivos inespecficos como leche de coco, hidrolizado de casena, extracto de levadura, etctera. El potencial osmtico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de proteccin osmtica antes de regenerar la pared celular. Normalmente se ajusta con el agregado al medio de cultivo de manitol o sorbitol. La densidad celular: la densidad inicial de protoplastos vara de 104 105 protoplastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos con altas densidades producirn, a partir de cada protoplasto, colonias que debern separarse tempranamente para evitar quimeras. Si deseamos colonias bien separadas para asegurar que provengan de un solo protoplasto, la densidad inicial debe ser baja, de 100 500 protoplastos/ml. Hay protoplastos de varias especies y tipos que no logran dividirse a bajas densidades de cultivo. Para estos casos se desarroll la tcnica de cultivo con clulas nodrizas o alimentadoras. Esta tcnica consiste en exponer una suspensin de 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la divisin celular, pero que quedan metablicamente activas. Estas clulas se plaquean en un medio agarificado, y luego se colocan por sobre stas los protoplastos sin irradiar, de los cuales se formarn las colonias. Tambin suele utilizarse papel de filtro para separarlas de las clulas nodrizas. Otra tcnica utilizada es el cultivo en microgota, donde se puede cultivar hasta un solo protoplasto. Cada microgota contiene entre 0,25 - 25 l de medio de cultivo, logrando densidades de 2 4 x 103 proto-plastos/ml. Con ayuda de un micromani-pulador se coloca la clula y se la cubre con aceite mineral para evitar la deshidratacin del medio. Los tratamientos fsicos: tratamientos de choque elctrico y trmico estimulan la divisin de los protoplastos. Las condiciones de cultivo: en geFigura 5: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos de neral los protoplastos son sensibles a mesfilo. B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa suspendidas en medio lquido. C. Detalle de la formacin de la luz, por lo cual durante el cultivo se callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneracin. los mantiene en oscuridad o bajo luz F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G. muy tenue. Planta regenerada. El origen de los protoplastos: el

bargo, el medio lquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos de varias especies slo pueden dividirse en medio lquido, (b) la presin osmtica del medio puede ser fcilmente reducida a los pocos das en cultivo, (c) la densidad celular puede ser modificada agregando medio de cultivo o las clulas con especial inters pueden ser aisladas y cultivadas a alta densidad, (d) la degradacin de algunos componentes del medio por la poblacin de protoplastos puede producir algunas sustancias citotxicas, cuya concentracin alrededor de las clulas ser menor en el medio lquido. Una tcnica muy eficiente que combina medio slido y lquido es la de cultivo en perlas de agarosa, donde los bloquecitos con los protoplastos inmovi-lizados en agarosa son cortados en cuatro mitades y colocados en medio lquido, donde se cultivan en continua agitacin. Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro das en cultivo. La presencia de pared es esencial para lograr una divisin regular. Luego de dos a tres semanas, producto de mitosis sucesivas, se forman microcolonias derivadas cada una de una clula, que dos semanas despus se pueden ver a simple vista. Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para regenerar plantas (Fig. 5). Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son: Los requerimientos nutricionales: se han utilizado en muchos casos los mismos medios de cultivo que se utilizan en el cultivo de clulas y tejidos, pero en general son enriqueci-

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estado fisiolgico del tejido del cual provienen y la calidad de los protoplastos son muy importantes para obtener una elevada eficiencia en la respuesta al cultivo. 9 Identificacin de las plantas hbridas La condicin de hbrido debe verificarse en la planta regenerada aun cuando se haya efectuado algn tipo de seleccin para el cultivo de las clulas hbridas. A tal fin es conveniente efectuar diferentes evaluaciones, lo que permite una mejor caracterizacin del hbrido. Comnmente se llevan a cabo los siguientes estudios: 1. Morfolgicos. Los hbridos somticos pueden presentar rasgos morfolgicos caractersticos. Los mismos pueden ser intermedios a los de los parentales, la suma de ellos, u otros completamente nuevos. 2. Citolgicos. El anlisis del complemento cromosmico permite revelar si el hbrido posee el total de cromosomas de cada parental, si se han fusionado ms de dos protoplastos, el grado de aneuploida y posibles translocaciones intergenmicas. Mediante hibridacin in situ empleando sondas de ADN repetitivo especfico de especie puede evaluarse con ms profundidad la contribucin de los genomas parentales y reestructuraciones cromosmicas en el hbrido. 3. Isoenzimticos. El patrn de bandas isoenzimticas del hbrido debe mostrar bandas de ambos parentales, pudiendo haber otras bandas que resultan de nuevas combinaciones de las subunidades enzimticas. Habitualmente se analizan los patrones de glucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglucoisomerasas, glutamato oxalacetato transaminasas, esterasas, peroxidasas y fosfatasas cidas. Las isoenzimas son extremadamente variables entre tejidos vegetales, por lo que para el anlisis se deben emplear los mismos tejidos u rganos, y en el mismo estado fenolgico. 4. En el mbito del ADN. La demostracin de la presencia de ADN de ambos parentales es la prueba ms directa de la hibridacin. El anlisis de ADN es independiente del tejido empleado y de la edad de la planta. Puede llevarse a cabo por RFLP (polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin), RAPD (polimorfismos en

el ADN amplificado al azar) o Southern blot, empleando sondas de ADN repetitivo especfico de especie o de genes de ARN ribosomal. 10 Logros y tendencias de la hibridacin somtica La hibridacin somtica ha permitido producir hbridos que no se haban podido obtener por cruzamientos sexuales, incrementando as el flujo de genes en los cultivos. La tabla 1 muestra algunos ejemplos de hbridos somticos que presentan algunas ventajas agronmicas. En sus inicios, algunos esperaban que la hibridacin somtica permitiera producir nuevas especies que expresaran las caractersticas deseadas de ambos progenitores. Por ejemplo, por hibridacin entre tomate y papa, se busc producir plantas que desarrollaran tomates en la parte area y tubrculos en la raz (pomato). La experiencia mostr que difcilmente puedan lograrse estos hbridos espectaculares, debindose ms bien dirigir la tcnica hacia la introgresin de pocos genes silvestres en las especies cultivadas mediante hibridacin asimtrica o cibridacin, manteniendo las caractersticas generales del cultivo. Uno de los factores que dificulta la obtencin de hbridos simtricos es la progresiva prdida de cromosomas de uno de los parentales, que normalmente ocurre durante la regeneracin. Si bien la fusin de protoplastos permite sortear las barreras precigticas, siguen existiendo barreras genmicas que resultan en la eliminacin espontnea de cromosomas durante las divisiones celulares. El mecanismo que determina la eliminacin de cromosomas no est bien comprendido, pero generalmente se retienen los cromosomas del parental que tiene el ciclo celular ms corto. Uno de los factores que puede producir incompatibilidad genmica es el estado de diferenciacin de los tipos celulares involucrados en la fusin. Por ejemplo, cuando se fusionan clulas en fase de crecimiento activo con clulas del mesfilo, que no se dividen, generalmente se pierden los cromosomas de estas ltimas. Los hbridos somticos o sexuales entre especies silvestres y cultivadas contienen

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Tabla 1: Ejemplos de hbridos somticos que exhiben algn carcter de inters agronmico

muchas caractersticas no deseadas de la primera, adems de aqullas deseadas. El retrocruzamiento con la especie cultivada es requerido para remover los genes no deseados del parental silvestre, pero ello no siempre es posible debido a que los hbridos suelen ser estriles. La hibridacin asimtrica y la cibridacin tienen la ventaja de incorporar slo uno o pocos caracteres provenientes del parental silvestre en la especie cultivada, y producir plantas con mayor fertilidad. Algunos caracteres deseables estn codificados por el genoma extranuclear, tales como la androesterilidad citoplasmtica y ciertos tipos de resistencia a enfermedades y a herbicidas. Para estos casos es de particular utilidad la cibridacin, dado que es un mtodo simple para transferir estos genes. 11 Algunos ejemplos Se han obtenido hbridos intergenricos de Panicum maximum (+) Pennisetum americanum (Ozias-Atkins et al ., 1986), Saccharum officinalis (+) Pennisteum americanum, Oriza sativa (+) Echinochloa

oryzicola, Triticum monococcum (+) Pennisetum americanum , Festuca arundinacea (+) Lolium multiflorum. El primer caso de regeneracin de plantas maduras de hbridos intergenricos (simtricos y asimtricos) en gramneas fue el Festulolium. A pesar de los esfuerzos realizados, la aplicacin de esta estrategia no ha conducido a la obtencin de nuevos hbridos de especies importantes, fundamentalmente debido a problemas de baja o nula fertilidad. Los mtodos actuales de transferencia de genes aislados han desplazado el inters en la hibridacin somtica. Sin embargo son una excelente herramienta para estudiar las interacciones ncleo-citoplasmticas entre genomas. 12 Lecturas recomendadas
BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K. 1996. Protoplast isolation and culture. Somatic hybridization and cybridization. En: Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulos 12 y 13. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier, Amsterdam. pp. 337-406. LINDSEY Y JONES, 1992. Biologa celular de la ingeniera gentica. En: Biotecnologa vegetal agrcola, Captulo 6. Editorial ACRIBIA, S.A., Zaragoza. pp.105-142. MATSUMOTO, K. 2001. Hbridos somticos. Biotecnologa Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo / junio: pp. 26-28. ZIMMERMANN, U. 1983. Electrofusion of cells: principles and industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5: pp. 149-156.

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III.-Captulo 3
Transformacin gentica
Daz, Marina L.; Zappacosta, Diego C.; Franzone, Pascual M.; Ros, Ral D. 1 Introduccin El mejoramiento gentico vegetal se origin hace aproximadamente 10.000 aos, cuando el hombre se hizo agricultor y comenz la domesticacin de las plantas. En el siglo XX, con la incorporacin de los cruzamientos sexuales, el conocimiento de la biologa floral de las especies, los avances de la gentica y de la estadstica experimental, entre otros, se desarrollaron los mtodos de mejoramiento actualmente utilizados. El mejoramiento gentico se basa en la existencia de variabilidad gentica para los caracteres que se desea mejorar y la reproduccin sexual para la incorporacin de los mismos. Este hecho hace que el aprovechamiento de la variabilidad est restringido por barreras de cruzabilidad. El reciente desarrollo de mtodos no sexuales para transferir genes, como la transformacin gentica, permite superar esta limitacin, abriendo nuevas perspectivas en el mejoramiento de las plantas. La ingeniera gentica o transformacin gentica, tcnica conocida como del ADN recombinante, permite introducir en plantas genes provenientes no slo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino incluso de hongos, virus, bacterias y animales. Conviene destacar que la transformacin de plantas es una tecnologa que aporta variabilidad gentica conocida sin alterar el fondo gentico. Este ltimo aspecto es de gran importancia ya que la creacin de cultivares es un proceso acumulativo; es decir que se desea incorporar caractersticas favorables sin perder las mejoras logradas anteriormente. El germoplasma transgnico es posteriormente incorporado al proceso de mejoramiento, el cual depender de la especie y del tipo de cultivar a obtener. En 1983 se informaron los primeros experimentos de expresin de un transgen (gen

introducido) en clulas vegetales y al ao siguiente se obtuvieron las primeras plantas transgnicas (tabaco y petunia). Desde entonces se ha extendido la aplicacin de esta tecnologa a unas 120 especies. Las plantas transgnicas obtenidas hasta la fecha se desarrollaron por diversos mtodos, los que han sido modificados para cada especie en particular, aumentndose de esta forma la eficacia de los mismos. Entre sus aplicaciones se encuentran la obtencin de plantas con resistencia a virus, insectos, hongos y bacterias, tolerancia a herbicidas y a estreses abiticos y modificacin de la calidad nutritiva de los cultivos entre otras. Asimismo, a travs del uso de transgenes es posible modificar la expresin de genes presentes en el genoma de la planta. La transformacin gentica tambin constituye una herramienta til para estudios bsicos que permiten conocer y/o profundizar acerca de la estructura y funcin de genes especficos, aspecto particularmente relevante en la era genmica (ver VII.-1). 2 Requerimientos para la obtencin de plantas transgnicas Para todas las tcnicas de transformacin desarrolladas hasta el momento es necesario disponer del transgen (secuencias regulatorias y codificante clonadas en un vector de transformacin) y de una metodologa eficiente para la transferencia al genoma vegetal. Una vez introducido el gen de inters en la clula, se induce el desarrollo de plantas mediante distintas tcnicas de cultivo de tejidos. Se procede luego al anlisis molecular de las plantas regeneradas in vitro para identificar aquellas que porten y expresen el o los transgenes en los niveles deseados. Finalmente, a travs de experimentos de campo y laboratorio se estudia el comportamiento de los individuos transgnicos y su descendencia. Por lo tanto, los elementos bsicos que se requieren en trabajos de transformacin gentica en plantas son: 1. Un sistema de cultivo de tejidos que permita regenerar plantas completas y frtiles. 2. Vectores apropiados, que permitan el

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clonado del gen de inters y/o su transferencia al tejido blanco de transformacin. 3. Un protocolo de transformacin (sistema de transferencia de genes y de seleccin del material transformado). 4. Herramientas de anlisis para detectar la presencia del transgen y los productos del mismo en la planta. Antes de iniciar la descripcin de los tem anteriores, resulta importante destacar que para lograr una planta transgnica deben ocurrir tres procesos en la misma clula: a) El transgen debe ser transferido al interior de la clula, b) El transgen debe integrarse al ADN celular y c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la clula transgnica en la que se verificaron los procesos a y b. Dado que las clulas tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada uno de estos procesos, la puesta a punto de un protocolo de transformacin eficiente requiere maximizar la cantidad de clulas competentes para todos ellos de manera simultnea. 2.1 Cultivo de tejidos vegetales Los mtodos de transformacin ms utilizados actualmente se basan en la obtencin de clulas transgnicas y posterior recuperacin de plantas completas y frtiles a partir de las mismas a travs del cultivo y seleccin in vitro. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia expresada por las clulas vegetales (ver II.-1). En la mayora de las especies se observa una importante influencia del genotipo en la respuesta al cultivo in vitro. Por ello, cuando se usa esta tecnologa con fines de mejoramiento gentico es muy importante conocer la respuesta morfogentica de distintos genotipos con adaptacin local. En el cultivo in vitro, un prolongado perodo de subcultivos puede inducir la aparicin de variacin somaclonal no deseable, ya que es conveniente introducir slo las modificaciones que se desean y en forma controlada (ver III.-1).

2.2 Construccin del vector Para introducir un transgen es necesario que el mismo sea incorporado previamente en un vector (por ejemplo un plsmido). Para ello se digiere el ADN extrado de un organismo, cualquiera que sea su origen, con enzimas de restriccin. Estas endonucleasas tienen la capacidad de reconocer en el ADN secuencias especficas compuestas por pocos nucletidos y posteriormente producir cortes en las mismas. Los fragmentos de restriccin as obtenidos pueden ser ligados enzimticamente a vectores de clonado, obtenindose, de este modo, clones de ADN recombinante (ver II.-3)

Figura 1: Estructura molecular del transgen

Un transgen est compuesto por una secuencia codificante (regin comprendida entre los codones de iniciacin y terminacin de la traduccin) y por secuencias regulatorias que determinan el tejido, el momento del desarrollo y el nivel de expresin del transgen en la planta. La adecuada expresin de los transgenes es un aspecto importante en la obtencin del fenotipo deseado en la planta transgnica. Muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias y usualmente no pueden expresarse eficientemente en clulas eucariotas. Por ello, para optimizar la expresin del transgen es necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por otras aptas para su expresin en clulas vegetales. En este contexto, la secuencia ms importante es el promotor, sitio del ADN al cual se une la enzima ARN-polimerasa para iniciar el proceso de transcripcin (Fig. 1). Cabe destacar que la expresin gnica es controlada por las secuencias regulatorias y no depende de la secuencia codificante. Por lo tanto, una secuencia codificante aislada de un gen A, puesta bajo el control de un promotor aislado de un gen B, se expresar de acuerdo con el patrn de expresin de dicho promotor. Asimismo, en la eleccin del pro-

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motor a utilizar en la construccin del transgen, hay que considerar la especie vegetal a transformar, ya que su nivel y patrn de expresin pueden variar al ser utilizados en especies distintas a la de origen del mismo. Dentro de los promotores se distinguen aquellos constitutivos, que permiten la expresin del gen en toda la planta en forma continua, los inducibles que responden a factores ambientales y finalmente los especficos de tejido que permitirn la transcripcin en determinados rganos y tejidos (Tabla 1). Los promotores pueden ser modificados con el fin de aumentar la expresin de los genes que regulan, pueden truncarse, adicionrseles un intrn o unrseles secuen-

nidos en el mismo experimento. La solucin para evitar los efectos de posicin es dirigir la secuencia de inters a sitios especficos del genoma vegetal, elegidos por su patrn de expresin adecuado y estable. Esto se puede lograr usando sistemas de recombinacin heterloga sitio-especficos o mediante reemplazo gnico por recombinacin homloga. 2.3 Mtodos de transformacin

La pared celular impide la entrada del ADN en la clula, constituyendo un obstculo que todos los mtodos de transformacin gentica tienen que superar de algn modo. Estos mtodos pueden dividirTabla 1: Promotores usados en transformacin gentica de plantas se en:
nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium) 35 S (virus del mosaico del coliflor) Ubi (ubiquitina de maz) Act 1 (actina de arroz)

Constitutivos

Promotores

TA 29 (tapete de la antera de tabaco) faseolina (cotiledones de poroto) Especficos de tejido TobRB 7 (raz de tabaco) patatina (tubrculo de papa) glutenina (endosperma de trigo) subunidad pequea de Rubisco inducible por luz alcohol deshidrogenasa-1 inducible por Inducibles anaerobiosis protena de shock trmico inducible por calor

a) Transformacin mediada por Agrobacterium, vector biolgico que participa del proceso de transferencia. b) Mtodos de transformacin gentica directa, tambin llamados fsicos, mediante los cuales, por distintos mecanismos, se introduce el ADN en la clula.

cias de otros promotores. Al momento de elegir el promotor debe tenerse en cuenta tambin la planta a transformar ya que algunos de ellos son menos activos en monocotiledneas, como el 35S; por otra parte el de ubiquitina 1 (ubi1) de maz es uno de los ms efectivos en gramneas. Adems, es necesario que el transgen disponga de una regin no traducida en el extremo 3 del mismo, que incluya la seal de corte y poliadenilacin (terminador), necesaria para el correcto procesamiento del transcripto correspondiente. Por otra parte el nivel y patrn de expresin del gen tambin puede estar afectado por la posicin del mismo en el genoma de la planta transformada (efecto de posicin). Esto puede deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias cercanas, a la estructura de la cromatina, al patrn de metilacin, etc. La cantidad de protena producida por el transgen comnmente vara ms de 100 veces entre individuos transformantes obte-

2.3.1 Transformacin mediada por Agrobacterium Las especies del gnero Agrobacterium son bacterias Gram-negativas aerbicas obligadas que viven en el suelo. Ellas son capaces de desarrollar un crecimiento saproftico o parastico. El gnero comprende cuatro especies fitopatognicas, dos de ellas ampliamente estudiadas ( A. tumefaciens y A. rhizogenes). Ambas especies son capaces de infectar una amplia variedad de especies de dicotiledneas y tienen como blanco de infeccin a las heridas, atacando clulas individuales y provocando su proliferacin. A. tumefaciens causa tumores, enfermedad que se conoce como agalla de la corona y A. rhizogenes induce la proliferacin de races dando lugar a la enfermedad denominada raz en cabellera . La capacidad patognica de estas bacterias esta asociada a la presencia de megaplsmidos (150-200 kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por

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tumor-inducing o inductor de tumores) o Ri (por root-inducing o inductor de races), presentes en algunas de las agrobacterias. Se demostr que durante la patognesis un fragmento de estos plsmidos llamado Figura 2: Estructura del T-DNA T-DNA (por transfer-DNA), es transferido a la clula estn involucrados genes cromosmicos (chv vegetal, donde se integra al ADN A, chv B, chv E, cel, psc A y att), se produce cromosmico de la planta y cuya expresin el procesado y la transferencia del T-DNA, causa proliferacin de clulas de la planta a mediados por los genes vir (por virulencia) travs de la sntesis y alteracin de la respues- que son inducidos por azcares y compuesta a hormonas vegetales. El T-DNA contiene tos fenlicos, como la acetosiringona, produgenes que se expresan eficientemente en la cidos por clulas vegetales heridas. Se conoclula vegetal infectada y producen sntesis ce con mucho detalle la etapa de la de hormonas vegetales (llamados oncogenes patognesis que ocurre en la bacteria (ver porque son los responsables de la prolifera- revisin de Gelvin, 2000). La regin de virucin anormal del tejido) y genes que provo- lencia (de alrededor de 30 Kb) est organizacan la sntesis de opinas (fuente de carbono da en operones esenciales para la transferencia del T-DNA (vir A, vir B, vir D, vir G) o y nitrgeno para la bacteria). A. tumefaciens es el caso ms estudiado que permiten incrementar la eficiencia de la y utilizado en la transformacin de plantas. transformacin (vir C, vir E). El ingreso de El T-DNA est delimitado por dos repeticio- Agrobacterium en la era genmica permitines directas imperfectas de 25 pares de ba- r avanzar en el conocimiento de la ses (bp) que lo flanquean, llamadas bordes interaccin de esta bacteria con las plantas. El desarrollo de la patognesis de planderecho e izquierdo (Fig. 2). Estos bordes son los nicos elementos en cis necesarios para tas por Agrobacterium representa una situadirigir el procesamiento del T-DNA. Cualquier cin nica en la naturaleza: la transferencia fragmento de ADN ubicado entre estos bor- de un elemento gentico (T-DNA) de un ordes puede ser transferido a la clula vegetal. ganismo procariota a un organismo eucariota Contrariamente a lo que sucede con otros superior, con su subsiguiente integracin y tipos de secuencias mviles de ADN, el T-DNA expresin en el genoma hospedador. Este no codifica los productos que median su mecanismo de ingeniera gentica natural es transferencia. El T-DNA es una regin relati- aprovechado para la transferencia de genes vamente grande (ca. 20 Kb) que contiene de inters a las plantas, para lo cual, los genes con secuencias regulatorias (promoto- oncogenes y genes de sntesis de opinas, son res y seales de poliadenilacin) tpicamente reemplazados por un marcador seleccionable y el gen a transferir (Fig. 2). El mtodo llamaeucariticas. Desde la dcada de 1950-60 se sabe que do del explante (Horsch y col., 1984) conlos tumores de la agalla de la corona se desa- siste en inocular un explante con A. rrollan si hay A. tumefaciens patognicas en tumefaciens, dejar la bacteria en contacto presencia de heridas. Un aspecto destacable con el explante durante un cierto tiempo, en de esta bacteria es que usa la respuesta de la l se produce la transferencia del T-DNA que planta a las heridas (cicatrizacin y defensa) contiene un gen marcador seleccionable y el como quimioatractivo y activador del proce- o los transgenes de inters. Posteriormente so de patognesis. Luego de la adhesin de se transfieren los explantes a un medio de la bacteria a la clula vegetal, etapa en la que cultivo que contiene un antibitico que ac-

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ta como bacteriosttico y el agente selectivo correspondiente al gen marcador seleccionable utilizado. Una vez completado el protocolo de cultivo y seleccin in vitro se recuperan las plantas transgnicas (Fig. 3). Anlisis por hibridacin del T-DNA en plantas transgnicas y su progenie han demostrado que el T-DNA se incorpora al ADN cromosmico y se hereda en forma estable. Los plsmidos Ti sin oncogenes se denominan desarmados, son de gran tamao y resulta difcil introducir genes en su T-DNA usando tcnicas habituales de ADN recombinante. Por esta razn se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores cointegrados, que deben formar estructuras cointegradas para replicarse en A. tumefaciens y los vectores binarios, que son capaces de replicarse en forma autnoma en esta bacteria. En los vectores cointegrados, la insercin del ADN que contiene los transgenes dentro del T-DNA de un plsmido Ti desarmado se logra por recombinacin homloga. Sobre la base de la capacidad de los genes de virulencia de actuar en trans, movilizando el T-DNA presente en otro plsmido, se construyen vectores denominados binarios que contienen un T-DNA no oncognico en un plsmido pequeo, con un origen de replicacin de amplio espectro de hospedantes, caractersticas que permiten su fcil manipulacin gentica usando E. coli como husped. La introduccin de este plsmido a una cepa de Agrobacterium que contenga un plsmido llamado helper de virulencia (con la regin vir intacta y sin TDNA) la hace apta para la transferencia del T-DNA a las clulas vegetales. Si bien ambos tipos de vectores son herramientas eficientes para la transformacin, se aprecia una notable preferencia por el uso de vectores binarios. La integracin del T-DNA en el ADN cromosmico de la planta se produce al azar, por recombinacin ilegtima, preferencialmente en regiones con actividad transcripcional y con la participacin de protenas de la bacteria y de la planta. Este sistema de transformacin permite transferir fragmentos de ADN de hasta 150 Kb. Para ello se utilizan vectores especiales que tienen caractersticas tanto de cromosomas artificiales de

bacterias (BACs) como de vectores binarios. El uso de estos vectores permite clonar fragmentos de ADN de gran tamao y posteriormente transferirlos al genoma vegetal va A. tumefaciens. Esta tecnologa es de gran utilidad para el clonado posicional de genes. Ms de 600 especies vegetales son hospedantes naturales de A. tumefaciens. Estas pertenecen en su mayora a dicotiledneas y gimnospermas y ms raramente a monocotiledneas. Para muchas de ellas se han puesto a punto protocolos de transformacin gentica basados en este vector. El inters en el desarrollo de este tipo de tecnologa hizo que se expandiera el rango de hospedantes de A. tumefaciens a especies que no son susceptibles en condiciones naturales a este patgeno. Esto fue posible debido al amplio conocimiento que se tiene de esta patognesis. As, se ha puesto nfasis en la utilizacin de A. tumefaciens como vector de transformacin en gramneas y se han desarrollado protocolos en varias especies de este grupo (arroz, maz, cebada, trigo y gramneas forrajeras). Cabe notar que su aplicacin es actualmente una rutina en arroz y maz. La transformacin con A. rhizogenes tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la produccin de races con alta tasa de crecimiento capaces de sintetizar metabolitos secundarios como productos farmacuticos, aditivos alimentarios y cosmticos, y por otra parte representa una valiosa herramienta para la estimulacin de la rizognesis en especies recalcitrantes, por ejemplo, leosas. La puesta a punto de un protocolo eficiente y reproducible de transformacin mediada por Agrobacterium es un proceso complejo en el que adems de tener muy buen conocimiento de la respuesta al cultivo in vitro de la especie a transformar, hay que considerar aspectos tales como el genotipo vegetal, la cepa bacteriana, el tejido blanco de transformacin, la induccin de los genes de virulencia y el control del estrs durante todo el proceso. 2.3.2 Transformacin directa o por mtodos fsicos La primer metodologa de transformacin gentica de plantas desarrollada fue la de A.

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Figura 3: Comparacin de tcnicas de transformacin directa e indirecta

tumefaciens. Inicialmente esta tecnologa no result de utilidad para abordar la transformacin de especies de gran importancia econmica como los cereales, debido a que no son hospedantes naturales de esta bacteria. Este hecho condujo al desarrollo de los mtodos fsicos de transformacin. En ellos el transgen es introducido en la clula vegetal mediante distintas tcnicas que se detallan a continuacin. - Transformacin de protoplastos La introduccin y expresin de ADN for-

neo en protoplastos fue el primer mtodo de transferencia directa claramente demostrado en plantas y esto se debi a que se dispona, para algunas especies, de procedimientos eficientes para la regeneracin a partir de protoplastos. Se basa en el hecho de que la pared celular es la principal barrera para la introduccin de ADN en las clulas vegetales por lo que sta es temporariamente removida. Los protoplastos pueden ser aislados en forma mecnica o por un proceso enzimtico que digiere la pared. As se obtiene una suspensin conteniendo millones de clulas individuales lo que favorece la transformacin de clulas aisladas. Los protoplastos pueden ser transformados utilizando polietilenglicol (PEG), electroporacin, microinyeccin o liposomas. La transformacin de protoplastos mediada por PEG es el mtodo ms comnmente usado. Tanto el PEG como la electroporacin producen poros en la membrana plasmtica por alteracin de la polaridad de la misma y por ellos penetra el ADN forneo. En el ltimo caso se someten los protoplastos a un campo elctrico. Ambas tcnicas permiten el tratamiento de un gran nmero de protoplastos al mismo tiempo. La microinyeccin es un mtodo difcil y laborioso que consiste en la introduccin de ADN dentro de protoplastos individuales mediante el uso de capilares de inyeccin y micro-manipulador y aunque con esta metodologa es necesario manipular las clulas individualmente, es posible lograr un alto grado de integracin del ADN forneo. Cabe notar que el cultivo de protoplastos es la metodologa ms sofisticada de cultivo in vitro de plantas por lo cual representa gran complejidad experimental y no est disponible ms que para algunas especies y dentro de ellas particularmente en genotipos modelo. Por ello se desarrollaron metodologas alternativas de transformacin directa como la electroporacin de tejidos, el uso de fibras

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de carburo de silicio para facilitar la entrada corporar de manera permanente la informadel ADN en las clulas en cultivo y el bombar- cin gentica transferida. A pesar de la desdeo con microproyectiles o micropartculas. ventaja que representa el bajo nmero de - Bombardeo de micropartculas transformantes producido por un solo epiEs un proceso por el cual micropartculas sodio de bombardeo, la versatilidad de la cubiertas con ADN son aceleradas por un gas aceleracin de partculas para introducir comprimido e introducidas en clulas vege- transgenes ha superado muchas de las batales. Esta tcnica se ha ido perfeccionando rreras asociadas a otros mtodos de transy actualmente es la ms difundida entre los formacin, como son el rango de huspedes mtodos de transformacin directa. Inicial- de Agrobacterium y las dificultades inherenmente, la fuerza impulsora de las partculas tes al cultivo y regeneracin de protoplastos. estaba dada por plvora, pero luego fue reemplazada por el Tabla 2: Comparacin entre mtodos de transformacin del genoma sistema de helio comprimido nuclear Mtodo biolstico Agrobacterium que brinda una mejor regulacin de la fuerza, distribucin Especies a transformar - dicotiledneas y algunas - sin limitaciones monocotiledneas de microproyectiles y mayor Eficiencia de transformacin - alta - baja reproducibilidad entre bombar- Tipo de integracin en el - aleatoria en regiones con - aleatoria transcripcin genoma vegetal deos. Se utilizan micropro- bajo nmero de copias - multicopia en tandem yectiles de oro o tungsteno independientes - precisa - imprecisa (qumicamente inertes) cuyos Construccin de vectores - compleja - simple tamaos van desde 0,5 a 3 Dependencia del genotipo - mayor - menor vegetal mm, que al ser disparados a grandes velocidades pueden La biolstica ha demostrado ser la mejor opatravesar pared y membranas de la clula cin para la produccin de plantas vegetal bombardeada sin causarle daos le- transgnicas de soja, sorgo, papaya, esprratales (Klein y col., 1987). Para el bombardeo go, caa de azcar y trigo. se puede emplear cualquier tipo de explante vegetal, desde clulas o protoplastos hasta 2.3.3 Transformacin directa vs. indirecta plntulas completas, pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas. El Con el transcurso de las investigaciones explante es generalmente sometido a un tra- se ha logrado optimizar los protocolos de tamiento osmtico pre y posbom-bardeo, transformacin para muchas especies vegeque produce plasm-lisis celular, evitando tales; igualmente, en la actualidad, ambas que el impacto y la penetracin de las part- vas de transformacin presentan ventajas y culas daen las clulas (Fig. 3). Los vectores desventajas que las hacen ms o menos conplasmdicos que se usan en este tipo de pro- venientes para los distintos fines. En la Tacedimiento slo requieren un origen de bla 2 se presenta una comparacin entre la replicacin que permita un alto nmero de transformacin del genoma nuclear mediacopias de los mismos en E. coli, aspecto que da por A. tumefaciens y el mtodo biolstico facilita en la prctica la preparacin del ADN como representante de los mtodos de necesario en grandes cantidades para la transformacin directa. transformacin gentica por este mtodo. Uno de los procesos necesarios para obEsta tcnica, sin embargo, tiene manifies- tener plantas transgnicas es la integracin tas limitaciones. Algunas especies oponen del transgen al ADN cromosmico. Con reuna resistencia natural a la penetracin de lacin a este proceso existen diferencias enlas partculas, dada por cutculas endurecidas, tre ambos mtodos. A. tumefaciens posee paredes celulares lignificadas o superficies un mecanismo natural muy eficiente para vellosas. Sin embargo, la principal limitacin transferir, al ncleo celular, el T-DNA que condel mtodo contina siendo la baja relacin tiene el transgen y producir una integracin entre el total de clulas sometidas al bom- aleatoria en regiones cromosmicas con acbardeo y el nmero de clulas que logran in- tividad transcripcional. Generalmente, los

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patrones de insercin de transgenes son ms sencillos en comparacin a los producidos por el mtodo biolstico. As, el nmero de copias que se incorpora es bajo y cuando hay ms de una copia, suelen distribuirse en loci independientes, lo que facilita la posterior eliminacin de las copias no deseadas por segregacin. Por otra parte, el mecanismo involucrado hace que se transfiera un segmento de ADN definido: el T-DNA, acompaado de protenas que lo protejen de la accin de nucleasas. Por el contrario, en el mtodo biolstico el ADN transferido no est asociado a protenas, por lo que al ser parcialmente degradado, slo parte del mismo llega al ncleo donde se produce, con baja eficiencia, la integracin al azar en el ADN cromosmico. En este mtodo es comn que se produzcan inserciones de varias copias del transgen en un mismo sitio del genoma con distinto grado de reordenamiento de la secuencia del transgen. Este ltimo aspecto es considerado como una desventaja ya que tanto desde el punto de vista de la percepcin pblica como el de la optimizacin de la expresin de los transgenes, es deseable disponer de inserciones simples y bien definidas molecularmente. Esto es particularmente relevante cuando se tiene por objetivo el desarrollo de productos comerciales. As, el fenmeno de silenciamiento de transgenes (prdida de su expresin), observado en algunos casos, puede resultar de la presencia de varias copias del transgen. Por otra parte, cuando se utiliza el mtodo biolstico, el segmento de ADN plasmdico que se integra al ADN cromosmico no est definido, como en el caso de T-DNA, sino que es de longitud variable. La construccin de vectores es mucho ms sencilla en el caso del mtodo biolstico. Este aspecto puede resultar importante en el contexto del desarrollo de proyectos de investigacin, en los cuales muchas veces se requiere utilizar un nmero considerable de vectores diferentes. Es conveniente destacar que en ambos mtodos la integracin del transgen en el genoma se produce al azar. Como consecuencia de ello, diferentes plantas transgnicas provenientes de un mismo experimento, presentan inserciones en distintos sitios del genoma receptor. As, la expre-

sin fenotpica de un transgen ser diferente en distintas plantas que contienen el mismo transgen, por lo cual, para clarificar la situacin se considera a cada una de ellas como eventos de transformacin distintos. La aplicacin de cualquiera de estos mtodos de transformacin al mejoramiento vegetal depende, en gran medida, de la disponibilidad de genotipos con muy buena respuesta al cultivo in vitro. Finalmente, cabe mencionar que en el caso de A. tumefaciens, debido a que se trata de una interaccin biolgica entre una planta y una bacteria, la dependencia del genotipo es mucho ms acentuada, ya que influyen tambin en la eficiencia de transformacin, tanto el genotipo de la planta como el de la bacteria. 2.3.4 Genes de seleccin e informadores En el proceso de obtencin de plantas transgnicas, los genes marcadores seleccionables (Tabla 3), generalmente de origen bacteriano, cumplen un rol de relevancia, sea para poner a punto un protocolo de transformacin o como acompaantes de genes de inters que se desean introducir. El gen marcador seleccionable otorga a las clulas transgnicas que lo expresan una importante ventaja, con respecto a las clulas no transgnicas, al permitirles crecer en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo correspondiente. Entonces, si el gen marcador codifica para una protena que confiere resistencia a agentes fitotxicos como antibiticos o herbicidas, las clulas que lo expresen podrn crecer y desarrollarse en medio de cultivo que contenga dichos agentes selectivos mientras que las clulas no transgnicas no lo harn (seleccin negativa). En otros casos, la ventaja estar dada por la posibilidad de utilizar diferencialmente un sustrato. As, el gen man A de E. coli permite a las clulas vegetales que lo expresan utilizar la manosa como fuente de carbono, lo cual no es posible para las clulas no transgnicas (seleccin positiva). Es necesario tener en cuenta que algunas especies pueden poseer una resistencia natural a los agentes selectivos antes mencionados, por lo que es importante evaluar este aspecto cuando se elige el gen de seleccin a utilizar, as como

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Tabla 3: Genes marcadores utilizados comnmente en transformacin de plantas


Marcadores

2.4 Tcnicas de deteccin del transgen y sus productos

Seleccionables (Agente selectivo) npt II (kanamicina, paromomicina, G418) hph (higromicina) pat o bar p ( hosphinotricina, bialaphos) CP 4 (glifosato) man A (manosa 6 fosfato)

Visualizables (Fenotipos asociados) gus A (color azul ndigo) luciferasa (luminiscencia) gfp (fluorescencia verde)

el agente selectivo y las concentraciones del mismo. En la puesta a punto de las metodologas de transferencia de genes son asimismo de gran utilidad los genes marcadores visualizables o informadores que posibilitan la observacin directa de las clulas que los expresan (Tabla 3). Estos genes codifican para protenas que no estn presentes en las clulas vegetales y producen un fenotipo caracterstico de fcil y rpida observacin. As, el gen gus A proveniente de E. coli codifica para la enzima - glucuronidasa. Esta protena puede ser detectada cualitativamente por tincin histoqumica, en presencia de un sustrato especfico, por la produccin de un precipitado azul-ndigo de fcil visualizacin. Este marcador tambin puede ser detectado cuantitativamente usando tcnicas fluoromtricas. Como ejemplo de la aplicacin de estos mtodos de deteccin podemos mencionar el estudio de la expresin de un promotor en una especie vegetal. Para ello se puede construir un vector con la secuencia codificante de gus A y con una secuencia de terminacin de transcripcin, y estudiar en plantas transgnicas el patrn de expresin espacio-temporal del promotor (en qu tipo de clulas y cundo se expresa) por tincin histoqumica y su nivel de expresin por fluorometra. Recientemente, el gen de la protena fluorescente verde, gfp (green fluorescent protein), aislado de una medusa, se ha convertido en un gen marcador visualizable in vivo muy utilizado. Cuando se ilumina con luz ultravioleta o luz azul, tejidos que contienen clulas que expresan este gen, se observa un brillo verde fluorescente. Al ser ste un ensayo no destructivo, es decir que permite conservar vivo el material en estudio, representa una herramienta de utilidad para visualizar diferentes etapas del proceso de transformacin.

Luego de la seleccin in vitro, las plantas regeneradas deben ser analizadas por mtodos moleculares para identificar aquellas que porten y expresen los transgenes en los niveles deseados. Para ello se emplean tcnicas como: - Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR): con el uso de primers homlogos a la secuencia del transgen se puede determinar la presencia del mismo. Esta tcnica permite hacer un screening rpido de las plantas regeneradas, aunque tiene algunas limitaciones, un resultado positivo indica solamente que en la muestra existe una secuencia que amplifica con los primers utilizados pero no indica si el transgen se encuentra incorporado al genoma de la planta. Para maximizar la robustez de esta prueba es necesario utilizar temperaturas de annealing o apareamiento de primers altas (ms de 60 C) y primers relativamente largos (ms de 20 nucletidos). Una variacin de esta tcnica, PCR en tiempo real, resulta de utilidad para evaluar el nmero de copias del transgen incorporadas al genoma de la clula vegetal.

- Hibridacin southern o Southern blotting: es una de las herramientas moleculares ms poderosas para caracterizar las plantas transgnicas. Adems de indicar la presencia o no de la secuencia de inters, da informacin acerca de la integracin de la misma en el genoma de la clula husped (nmero de copias integradas y nmero de loci en los cuales se produjo la integracin). En la Fig. 4 se representa el anlisis de un caso hipottico de transformacin mediante Agrobacterium, aunque ste es aplicable tambin a plantas obtenidas por mtodos directos. El esquema 4-a representa parte del vector que contiene el gen de inters y el gen marcador. Si se utiliza como sonda el T-DNA completo y la digestin del ADN genmico se realiza con enzimas de restriccin que no cortan dentro del T-DNA, el nmero de bandas del patrn representa el nmero de si-

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Hind III

Eco RI

Sal I

Sal I

Hind III

BI

Gen Marcador 2 kb b)

Gen de Inters 3 kb c) 1 2 3 4 5 d) 1 2 3

BD

1 2 3

4 5

4 5

Sitio de corte: Sonda: Frag: tamao

Ausente dentro del T -DNA T-DNA (frag.Hind III) > 5 kb

Uno interno (Eco RI) Un sitio (EcoRI) entre el marcador y el transgen T-DNA (frag.Hind III) > 2 kb Gen marcador > 2 kb

e) 1

2 3

f)

2 3

Sitio de corte: Un sitio (Eco RI) entre el marcador y el transgen Sonda: Frag: ta mao cantidad Transgen > 3 kb Igual que en d)

Dos sitios (Sal I) dentro del transgen Fragmento (Sal I) del transgen 1 kb Uno

Figura 4: Patrones de Hidridacin de Southern (Modificado de Bhat y Srinivasan, 2002)

tios de insercin. El tamao de las bandas ser mayor que el T-DNA ya que se estn utilizando enzimas que cortan por fuera de ste. Plantas transgnicas obtenidas en forma independiente tendrn patrones de hibridacin diferentes (4-b). Por otra parte, si la enzima tiene un sitio de corte nico dentro del T-DNA, utilizando la sonda antes mencionada, sta dar dos seales de hibridacin para

cada sitio de insercin independiente del TDNA (4-c). La aparicin de un nmero impar de bandas indica que en un mismo sitio se insertaron mltiples copias, ocurrieron rearreglos o se produjo el truncado del TDNA. Si se digiere la muestra con una enzima de restriccin que posee un sitio nico de corte entre el gen marcador y el gen de inters y utilizando como sonda el gen marca-

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dor, se obtendr una sola banda por cada insercin independiente (4-d). Si la membrana se hibrida con el gen de inters (4-e) aparecer un patrn que tendr el mismo nmero de bandas que el anterior. La ausencia de una banda es indicativo de la insercin de una copia truncada de uno de los genes por lo que se pierde el sitio de corte. La aparicin de una banda del tamao del T-DNA puede indicar la presencia de repeticiones en tandem. Para estimar el nmero de copias del transgen en un locus transgnico, se deben utilizar enzimas de restriccin con sitios flanqueantes del transgen y como sonda, el transgen. Se observar una sola banda del tamao del transgen; sin embargo, la intensidad de la seal variar entre las distintas plantas analizadas de acuerdo con el nmero de copias del mismo (4-f). Para realizar la comparacin es necesario utilizar simultneamente estndares conteniendo un nmero conocido de copias del transgen. Esta determinacin no es del todo precisa ya que existe mucha variabilidad en los resultados debido a diferencias en la digestin de las muestras y a la degradacin que sufre el ADN. En lo que respecta a la cuantificacin, esta tcnica ha sido reemplazada en gran medida, en los ltimos aos, por la PCR en tiempo real o real time PCR, antes mencionada, dado que esta ltima resulta menos costosa en reactivos y tiempo y requiere menos cantidad de material vegetal para realizar el anlisis. - Anlisis de ARN: Las tcnicas de RTPCR (transcripcin reversa seguida de PCR) con la hidridacin de ARN o Northern blotting pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de inters presentes en la muestra. La RT-PCR presenta algunas ventajas frente al Northern blotting: se requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y la muestra es de fcil preparacin. Por otra parte, la hibridacin del ARN utiliza como sonda el transgen, ofrece informacin sobre el tamao del transcripto y permite su cuantificacin. - ELISA y Western blotting: aquellas plantas que poseen la secuencia de inters y la expresan como transcripto, pueden ser analizadas con estas tcnicas inmunolgicas a fin de determinar la presencia de la protena codificada por el transgen.

La actividad de la protena debe ser medida, sea por ensayos bioqumicos o por bioensayos, a fin de interpretar correctamente el fenotipo de la planta obtenida. Adems, es conveniente confirmar la estabilidad meitica de los transgenes estudiando su transmisin sexual a la generacin siguiente. Estas tcnicas se encuentran descriptas detalladamente en la seccin II.3 y su aplicacin para el anlisis de plantas transgnicas en Register (1997) y en Bhat y Srinivasan (2002). Finalmente, el comportamiento de los individuos transgnicos se estudia en laboratorio, invernculo y campo. Cabe aclarar que para realizar experimentos de invernculo y de campo es necesario contar con autorizacin de la Comisin Nacional Asesora de Biotecnologa Agropecuaria (CONABIA) (ver IX.-3). 3 Aporte de la transformacin gentica a la variabilidad gentica Como ya se mencion, la transformacin gentica permite introducir variabilidad gentica novedosa en las diferentes especies vegetales. Analizando con ms detalle este concepto podemos considerar que este aporte puede ser realizado de diferentes maneras. As, este puede consistir en: a) La expresin de secuencias codificantes no existentes en la especie (ejemplo: protenas insecticidas de origen bacteriano). b)La expresin de nuevas formas allicas de genes que ya estn presentes en el genoma (ejemplo: tolerancia al glifosato en soja). c) La expresin de secuencias codificantes presentes en el genoma pero bajo el control de nuevas secuencias regulatorias que modifican su nivel o patrn de expresin (ejemplo: protenas relacionadas a la patognesis). d)La inhibicin de la expresin de genes residentes en el genoma . Para lograr la inhibicin de la expresin gnica se pueden usar diferentes tcnicas: cosupresin, antisentido y la denominada interferencia del ARN. Todas ellas se basan en un proceso denominado silenciamiento gnico post-transcripcional. Este involucra la degradacin del ARN mensajero producido

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por un gen determinado. La cosupresin consiste en la obtencin de plantas transgnicas que expresan un transgen homlogo del gen residente que se desea silenciar. La tcnica del ARN antisentido involucra la sntesis de molculas de ARN que son complementarias al ARNm producido por la transcripcin del gen que se quiere silenciar. El transgen consta de la secuencia codificante del gen cuya expresin se desea alterar pero con la orientacin invertida, cuando esta secuencia se transcribe genera ARN que hibrida con el ARNm formando una hebra doble que bloquea la traduccin. Como resultado de este mecanismo las clulas transformadas producirn poco o ningn producto proteico. Esta tcnica ha sido utilizada para obtener variedad de tomates (FlavrSavr) la que mantiene su firmeza durante mas tiempo luego de la cosecha debido a que la enzima responsable de la rotura de la pared celular, la polygalacturonidasa, se expresa en un 10% del nivel normal. La interferencia del ARN es parte de un mecanismo regulatorio natural de la expresin gnica que es actualmente muy estudiado y es la metodologa ms eficiente, y por ello la ms utilizada, para silenciar genes en plantas. La tcnica se basa en la construccin de transgenes cuyo producto final es un ARN. Este contiene parte de la secuencia transcripta del gen a silenciar en forma de repeticin invertida. Como consecuencia de esta estructura , cuando este tipo de transgen se transcribe en la planta se genera un ARN de doble cadena que dispara el mecanismo de degradacin dependiente de la secuencia antes mencionado (Agrawal et al., 2003). El uso de una secuencia espaciadora entre las repeticiones confiere a las construcciones mayor estabilidad durante las manipulaciones en bacterias. Este tipo de construcciones se denominan ARN hairpin. Adems, se observ que el uso de un intrn como secuencia espaciadora, produce un silenciamiento ms eficiente en la planta. Esta metodologa es una herramienta muy valiosa para los proyectos de genmica funcional para poner en evidencia la funcin de genes clonados mediante su inactivacin. Otra posibilidad es utilizarla para la obtencin de plantas transgnicas mejoradas mediante la inactivacin de genes endgenos cuya expre-

sin es indeseada (Kusaba, 2004). Una interesante aplicacin de inters agronmico de esta tecnologa fue la obtencin de plantas transgnicas de caf que no contienen cafena. 4 Obtencin de plantas transplastmicas Las clulas vegetales contienen tres genomas: el nuclear, el plastdico y el mitocondrial. Los mtodos presentados en las secciones precedentes tienen como blanco de transformacin al genoma nuclear. Sin embargo, en los ltimos aos la obtencin de plantas transplastmicas ha recibido notable atencin (Maliga, 2002). As, el genoma de los plstidos (plastoma) se ha convertido en un blanco atractivo para la ingeniera gentica ya que esta tecnologa ofrece una serie de ventajas sobre la transformacin del genoma nuclear: 1. Se pueden obtener altos niveles de expresin de los transgenes y elevados niveles de acumulacin de las protenas codificadas por ellos (hasta el 47% de las protenas solubles totales). Cabe notar que el nivel de acumulacin observado a partir de transgenes nucleares es generalmente inferior al 1%. 2. Es posible expresar un transgen opern con varias secuencias codificantes bajo el control de un mismo promotor. 3. No se observa efecto de posicin debido a que la integracin del transgen est dirigida a un sitio particular del plastoma. Esto hace que no sea necesario obtener una gran poblacin de transformantes, a diferencia de lo que actualmente ocurre con las plantas transgnicas nucleares. 4. No se observa silenciamiento de transgenes. 5. Para las especies que tienen transmisin materna de los plstidos (la mayora). Se minimiza la dispersin de los transgenes por el polen debido a la ausencia de transmisin de los plstidos por el mismo. 6. A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del sistema gentico de los plstidos, se ha demostrado que estas organelas pueden procesar protenas eucariotas permitiendo su correcto plegamiento y la formacin de puentes disulfuro gracias a la presencia de protenas

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chaperonas endgenos.

sistemas

enzimticos

Los protocolos existentes para la obtencin de plantas transplastmicas se basan en la transferencia de genes por el mtodo biolstico, un eficiente proceso de cultivo y seleccin in vitro, y la utilizacin de vectores con secuencias homlogas al genoma del cloroplasto. A diferencia de lo que ocurre en la transformacin del genoma nuclear, la integracin dirigida de los transgenes en el plastoma se realiza mediante recombinacin homloga. Para lograr esto, los vectores contienen los transgenes de inters flanqueados por secuencias con alta homologa al ADN plastdico. La homologa entre el ADN del vector y del ADN del cloroplasto determina la potencialidad del plsmido para ser utilizado en la transformacin gentica del plastoma. En este contexto, la existencia de secuencias altamente conservadas en el plastoma de varias especies es explotada para el diseo de vectores universales, potencialmente tiles en la transformacin de los cloroplastos de numerosas especies. La expresin exclusivamente plastdica de los transgenes queda asegurada a travs de la utilizacin de promotores especficos del cloroplasto, cuya transcripcin tiene caractersticas tpicamente procariticas. 5 Importancia y aplicaciones de las plantas transgnicas Las primeras plantas transgnicas experimentales fueron obtenidas a mediados de los aos 80. La disponibilidad de esta tecnologa permiti importantes avances en el rea del conocimiento de la biologa vegetal. Por otra parte, se constituy en una herramienta disponible para el mejoramiento gentico vegetal (ver aspectos para esta aplicacin en Birch, 1997) y el gran esfuerzo realizado en este sentido tuvo como consecuencia la llegada al mercado, a partir de 1995, de los primeros cultivares transgnicos. Es destacable la rpida adopcin que tuvieron estos productos. As en el 2002 se cultivaron en el mundo 58,7 millones de hectreas con plantas transgnicas. El 99% de este rea global se cultiv en 4 pases (USA, Argentina, Canad y China) mientras que el 1% restante se

distribuy en 12 pases. Esta superficie estuvo ocupada prcticamente por 4 cultivos: soja (62%), maz (21%), algodn (12%) y canola (5%). Los caracteres modificados que presentaron estos cultivos fueron resistencia a herbicidas (75%), resistencia a insectos (17%) o una combinacin de ambos (8%). En la Argentina los eventos con autorizacin de comercializacin son los siguientes: soja (tolerancia a glifosato), maz (resistencia a lepidpteros, tolerancia a glufosinato de amonio) y algodn (resistencia a lepidpteros, tolerancia a glifosato). La CONABIA (ver en la pgina de la Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos, Repblica Argentina; http:// www.sagpya.mecon.gov.ar/), ha autorizado desde el ao 1991, 520 solicitudes para liberaciones a campo, en distintas especies y con diferentes eventos de transformacin. Los cultivos transgnicos actuales corresponden a lo que se denomina la primera generacin que tiene por objetivo el aumento de la productividad de los cultivos, la reduccin en el uso de agroqumicos, la conservacin de la tierra arable, el agua y la energa, la reduccin de la contaminacin del ambiente y los beneficios para la salud humana derivados de estos aspectos. Se considera que la segunda generacin de cultivos transgnicos tendr ms beneficios directos para los consumidores. Estos comprenden el mejoramiento de la calidad nutricional (protenas, aceite, vitaminas y minerales), la eliminacin de alergenos, la fitoremediacin (es decir la recuperacin de ambientes contaminados mediante el uso de plantas) y la utilizacin de plantas como bioreactores para la expresin de protenas recombinantes con fines tales como la produccin de vacunas comestibles, anticuerpos y otras protenas de uso teraputico o industrial. Esta aplicacin se conoce como molecular farming (produccin de molculas en la granja) y presenta numerosas ventajas para la produccin en gran escala de estas protenas en particular en lo que respecta a costos, practicidad y seguridad. Sin embargo an quedan algunos aspectos que limitan su potencial como biorreactores como son la calidad y homogeneidad del producto final. En los ltimos 10 aos, se han desarrollado varios sistemas de expresin basados en plantas y en la ac-

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tualidad se producen ms de 100 protenas recombinantes en diferentes especies vegetales, generndose un estrecho vnculo entre la agricultura y muchas ramas de la industria. Un ejemplo destacable es el arroz dorado, llamado as por la pigmentacin amarilla que tienen sus granos debido a que acumula altos niveles de provitamina A en el endosperma. La tercera generacin de cultivos transgnicos se basar en la informacin producida por los proyectos genmicos y tendr por objeto aspectos tales como la modificacin de la arquitectura de la planta, la manipulacin de la floracin, el mejoramiento de la eficiencia fotosinttica, la manipulacin de la heterosis y la apomixis, etc. 6 Perspectivas La continuidad en el desarrollo de tecnologa de transferencia de genes en plantas es importante tanto para ampliar el rango de especies a transformar como el de genotipos dentro de cada especie. En los ltimos aos se nota un creciente inters en el control del nivel de expresin de transgenes as como de su regulacin espacial y temporal. La expresin de los genes nucleares eucariticos est controlada en varios niveles que involucran la transcripcin propiamente dicha, el procesamiento, transporte y estabilidad de los transcriptos y su traducibilidad, as como la estabilidad, modificacin y compartimentalizacin del producto proteico final. Por otra parte, es necesario aprovechar la experiencia acumulada en cuanto a la expresin de transgenes, de modo de disear protocolos de transferencia que minimicen las posibilidades de silenciamiento gnico. En este contexto, est recibiendo notable atencin el estudio de la recombinacin homloga como mecanismo para la transformacin del genoma nuclear (ver revisin de Hanin y Paszkowski, 2003). Del anlisis comparativo de mtodos presentado cabe destacar dos aspectos actualmente en desarrollo. Por un lado, contina el inters en extender el uso de la transformacin mediada por A. tumefaciens a especies que no son hospedantes naturales de la bacteria. Por otro lado, como fuera anteriormente mencionado, los mtodos de transformacin gentica actualmente en uso re-

quieren de genotipos con una excelente respuesta al cultivo in vitro, lo cual resulta en una clara limitacin cuando se desea aplicar esta tecnologa a los materiales usados por los mejoradores, los que generalmente no poseen esta caracterstica. Por ello, se est tratando de reducir y si es posible evitar la fase de cultivo in vitro durante el proceso de transformacin, lo que permitir ampliar el rango de genotipos a los cuales se podr aplicar esta moderna tecnologa. As, se desarroll un mtodo eficiente y reproducible de transformacin in planta para Arabidopsis thaliana. Este consiste en infiltrar con vaco plantas adultas de esta especie, con una suspensin de A. tumefaciens de modo que los tejidos y rganos reproductivos sean invadidos por la bacteria. Posteriormente se propuso una simplificacin de este mtodo que consiste en reemplazar el tratamiento de vaco y sumergir la inflorescencia en una suspensin bacteriana que incluye un surfactante. Las plantas transgnicas que se obtienen por autofecundacin de las plantas as transformadas, son hemicigotas y se demostr que esta metodologa produce la transformacin de la gameta femenina. El logro de determinados objetivos como puede ser el redireccionamiento de una ruta metablica o la modificacin de un carcter complejo de inters agronmico como por ejemplo la resistencia durable a enfermedades fngicas, requiere de la integracin de mltiples transgenes y de la expresin coordinada de los mismos en la planta transgnica. Este tema est recibiendo notable atencin (ver revisin de Franois y col., 2002). Los mtodos de transformacin que hemos descripto se basan en la utilizacin de genes marcadores seleccionables. Sin embargo, hay razones por las cuales la presencia del marcador no es deseable en plantas transgnicas que se liberan al ambiente. Hay un manifiesto rechazo por parte del pblico con respecto a la utilizacin de genes de resistencia antibiticos y en determinadas situaciones, el uso de genes de resistencia a herbicidas puede ser inconveniente. Por otra parte, desde un punto de vista experimental puede ser necesario transformar una misma planta varias veces con distintos trans-

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genes y con la metodologa convencional no hay ms que un nmero limitado de genes marcadores disponibles. Por ello se consideran estrategias alternativas para la obtencin de plantas transgnicas libres de marcadores (Puchta, 2003). La estrategia que ha recibido ms esfuerzo hasta ahora, plantea la remocin va cruzamiento sexual del marcador seleccionable luego de haber obtenido la planta transgnica. Una posibilidad para ello es cotransformar, esto implica que el transgen de inters y el marcador seleccionable estn presentes en vectores distintos y que posteriormente se separen los genes por segregacin luego de la reproduccin sexual. Sin embargo, esta puede ser una alternativa poco atractiva en circunstancias particulares como cuando no se dispone de un protocolo eficiente de cotransfor-macin o cuando no se desea reproducir sexualmente la planta transgnica. Otra opcin dentro de esta lnea es la utilizacin del sistema de recombinacin sitio-especfica de origen viral Cre/lox. Ms recientemente se ha propuesto como estrategia alternativa el desarrollo de mtodos de transformacin que no usen marcadores seleccionables. La idea subyacente es incrementar la frecuencia de transformacin a travs del uso de genes que promuevan la regeneracin. Finalmente, las plantas transgnicas actualmente cultivadas comercialmente, en su mayora resistentes a herbicidas nos permiten ganar experiencia y acumular el conocimiento necesario para desarrollar nuevas y mejores generaciones de productos.

7 Lecturas recomendadas
AGRAWAL, N.; DASARADHI, V.; MOHAMMED, A.; MALHOTRA, P.; BHATNAGAR, R. y MUKHERJEE, S. 2003 RNA Interference: Biology, Mechanism , and Applications. Microbiology and Molecular Biology Reviews Dec. 2003, p. 657-685. BIRCH R. 1997. Plant transformation: Problems and strategies for practical applications. Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 48: 297-326. FRANOIS, I.; BROEKAERT, W.; CAMMUE, B. 2002. Different approaches for multi-transgene-stacking in plants. Plant Science 63: 281-295. GELVIN S. 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 223-256. HANIN, M.; PASZKOWSKI, J. 2003. Plant genome modification by homologous recombination. Current Opinion in Plant Biology 6: 157-162. HORSCH, R.; FRALEY, R.; ROGERS, S.; SANDERS, P.; LLOYD, A.; HOFFMAN, N. 1984. Inheritance of functional foreign genes in plants. Science 223: 496-498. KLEIN, T.; WOLF, E.; WU, R.; SANFORD, J. 1987.High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327: 70-73. KUSABA, M. 2004. RNA interference in crop plants Current Opinion in Biotechnology 15: 1-5. MALIGA, P. 2002. Engineering the plastid genome of higher plants. Current Opinion in Plant Biology 5: 164172. PUCHTA, H. 2003. Marker-free transgenic plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 123-134. REGISTER J. 1997. Approaches to evaluating the transgenic status of transformed plants. TiBTech, 15:141-6.

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III.-Captulo 4
Polinizacin y fertilizacin in vitro.
Picca, Aurora; Cardone, Susana 1 Introduccin Muchas plantas con flores producen menos frutos maduros que flores, y los frutos, a su vez, generan menos semillas que el nmero de vulos disponibles para la fecundacin. Considerando que la produccin de polen no es el factor limitante, existen diferentes razones que explican esta situacin. En ocasiones, a pesar de la ocurrencia de la polinizacin, la fecundacin no puede llevarse a cabo. Otras veces, la fecundacin ocurre normalmente pero el embrin aborta en forma precoz. En cualquiera de estas circunstancias, las tcnicas de cultivo in vitro y manipulacin de clulas aisladas son apropiadas para lograr el proceso completo de desarrollo del embrin y del endosperma y la obtencin de semillas normales. En este captulo se utilizarn indistintamente los trminos fecundacin y fertilizacin como sinnimos, refirindose a la unin de las gametas masculina y femenina para originar un nuevo individuo. La tcnica de fertilizacin o polinizacin ovular in vitro fue desarrollada por Kanta et al. en 1962, quienes demostraron que en algunas especies de papaverceas los granos de polen tenan la capacidad de germinar in vitro directamente sobre los vulos en cultivo. En estas condiciones el tubo polnico alcanzaba el saco embrionario para concretar la fertilizacin, con la consiguiente formacin de semilla normal en el mismo medio de cultivo. Esta tcnica desarrollada en Papaver somniferum, ha sido luego empleada en varias especies de plantas como Dianthus caryophyllus, Nicotiana tabacum, N. rustica, Argemone mexicana, Eschechlozia californica, Petunia violacea, Antirrhinum majus y Dicranostigma franchetianum. Bajo el nombre de polinizacin in vitro se suele englobar a varias tcnicas que si bien poseen puntos en comn, difieren en otros. Entre ellas se pueden citar la polinizacin in vitro de vulos, la polinizacin placental

in vitro y la polinizacin estigmtica in vitro. En todos los casos la gameta femenina es fecundada por clulas espermticas liberadas por el tubo polnico, en forma casi idntica a la va natural. El trmino fertilizacin in vitro se utiliza para aquellos casos donde la fusin de las gametas aisladas se logra por distintos mtodos como electrofusin, alta concentracin de calcio o elevado pH. A veces la fertilizacin ocurre normalmente, pero el embrin no puede alcanzar la madurez debido a una ruptura del equilibrio entre el mismo y el endosperma o por anomalas en el desarrollo embrionario que impiden una nutricin normal. Esto es lo que se conoce como barreras posfertilizacin o poscigticas , que pueden contrarrestarse con el rescate de los embriones y su posterior crecimiento en un medio nutritivo adecuado. 2 Fertilizacin in vitro Durante aos, los cientficos utilizaron tcnicas de fertilizacin in vitro de gametas aisladas tanto en animales como en plantas inferiores. Sin embargo, estos mtodos no pudieron ser aplicados a las plantas superiores hasta comienzos de la dcada de los noventa. Esto se debi a que la fertilizacin in vitro de las gametas aisladas de plantas superiores es un proceso muy diferente al que ocurre in vivo, y tambin lo es de los sistemas animales y de las plantas inferiores, donde las gametas son de vida libre. El hecho ms notable de la fertilizacin in vivo de las angiospermas es el de la doble fecundacin, que es un proceso muy complejo en comparacin con lo que acontece en todos los dems seres vivos. Esto ocurre en el saco embrionario, que se halla profusamente cubierto por el tejido materno. Los ncleos espermticos se encuentran dentro de los granos de polen o tubos polnicos. Durante la fertilizacin, el tubo polnico llega hasta el aparato ovular, desorganizndose entonces el ncleo vegetativo. Las dos clulas espermticas contenidas en el tubo, se vuelcan en una de las sinrgidas, la misma se desorganiza y uno de los ncleos espermticos se fusiona con la osfera para dar el cigoto, que luego producir el embrin.

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El otro ncleo masculino se reunir con dos ncleos femeninos secundarios para dar la clula madre del endosperma triploide (Fig. 1). Para que la fertilizacin tenga lugar in vitro no slo deben aislarse las gametas fe-

la clula espermtica con la ovoclula, dando como resultado un cigoto, un embrin y finalmente una planta madura. Estudios posteriores (1998,1999) posibilitaron el desarrollo de endosperma in vitro de maz a partir de la fusin por pares de clulas espermticas y nOsfera en fusin con uno de cleos secundarios aislados. los gametos La fusin del ncleo de la clula espermtica puede ocurrir con uno de los dos nNcleos polares cleos polares o con los nSaco embrionario recibiendo al segundo cleos secundarios y se comSaco embrionario gameto pleta aproximadamente dos horas despus de la fusin in Sinrgida que vitro de las clulas. Los esturecibi el extremo dios in vitro sobre los primedel tubo polnico ros eventos despus de la fusin de las clulas y ncleos indicaron que las primeras clulas del endosperma resultante desarrollan un tejiTubo polnico polnico Tubo do caracterstico capaz de autoorganizarse en forma Figura 1: Corte longitudinal de un vulo mostrando la doble fecundacin en angiospermas. separada del tejido materno. meninas y masculinas sino que deben ser inducidas a fusionarse en ausencia de las clu- 2.1 Aislamiento y seleccin de las las asociadas. Las tcnicas de micromani- gametas pulacin desarrolladas durante los aos 80 Se han desarrollado mtodos de aislapermitieron el aislamiento y la fusin in vitro de gametas femeninas y masculinas de miento y seleccin de gametas para una angiospermas. La combinacin de estas tc- amplia variedad de especies vegetales entre nicas con mtodos de cultivo de clulas ni- ellas maz ( Zea mays ), trigo ( Triticum cas posibilitaron la fertilizacin in vitro. Se aestivum ), cebada ( Hordeum vulgare ), pudo concretar de esta manera el desarrollo raygrass ( Lolium perenne ) y algunas de cigotos y de endospermas en forma indi- brasicceas. Los pasos a seguir son los siguientes: vidual in vitro, lo cual demuestra que cigotos a) Conocer exhaustivamente la morfoloy endosperma son capaces de autoorganizarse en cultivo, independientemente del ga floral de la especie a utilizar con el objetitejido materno. Tanto los cigotos obtenidos vo de ubicar el saco embrionario y sus clulas in vitro como los que son aislados despus constituyentes. b)Aislar las gametas masculinas a partir de la polinizacin in vivo desarrollan embriones normales y posteriormente plantas fr- de los granos de polen mediante choque osmtico y/o de pH. tiles en cultivo. c) Aislar el saco embrionario y las gametas En 1989 se fusionaron por primera vez gametas aisladas de maz in vitro (Zea mays). femeninas mediante microdiseccin individual Llev tres aos ms regenerar plantas en asociacin con maceracin enzimtica. hbridas frtiles, va embriognesis cigtica, a Este paso es crtico y limitante ya que puepartir de esos cigotos cultivados individual- den obtenerse pocas gametas femeninas y mente. Actualmente puede reproducirse in el proceso de manipulacin es muy delicado. vitro el ciclo completo de vida de una planta El tratamiento de las espigas no polinizadas superior, comenzando con la electrofusin de con 2,4-D, que induce a la expansin del ova-

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Figura 2: Fertilizacin in vitro mediante electrofusin. rio, facilita el proceso, resultando en ovarios ms grandes y vulos ms blandos, incrementando la eficiencia en el aislamiento de las ovoclulas. Fertilizacin in vitro propiamente dicha. Esta puede ser realizada mediante la microinyeccin de clulas espermticas o ncleos espermticos aislados en clulas individuales obtenidas de los sacos embrionarios o por electrofusin (Fig. 2). En este ltimo caso las gametas se ponen en contacto en una cmara de electrofusin por alineacin dielectrofortica y se fusionan mediante pulsos elctricos. Los productos de fusin pueden ser entonces cultivados en una solucin con clulas nodrizas y algunos de ellos desarrollarn en proembriones. 2.2 Fusin de las gametas Muchos de estos estudios, algunos de los cuales datan de 1994, fueron realizados en maz, donde las gametas masculinas se obtienen a partir de granos de polen fresco sometidos a un shock de pH en una solucin 0,5 M de manitol. Las ovoclulas y los protoplastos de las clulas centrales se aislan

de vulos por tratamiento con enzimas celulolticas y microdiseccin manual. Las gametas femeninas y masculinas aisladas se colocan de a pares, bajo condiciones de esterilidad, en un medio de fusin simple compuesto por manitol y cloruro de calcio (CaCl2). El uso de microagujas de vidrio permite poner en contacto las gametas femeninas y masculinas a fin de facilitar y dirigir la fusin. La adhesin y posterior fusin de las gametas es rpida (aproximadamente 10 segundos). A los 20 minutos de realizada la fusin, deja de visualizarse el ncleo masculino y 20 horas despus es posible visualizar mediante contraste de fases la presencia de dos ncleos, de manera similar a lo que se observa in vivo. En 1995 se logr la fertilizacin exitosa de trigo a travs de la electrofusin de ovoclulas con clulas espermticas. En promedio, la frecuencia de fusin suele ser del 30%, pero bajo condiciones ptimas es posible alcanzar frecuencias superiores al 55%. Dos das despus de la fusin elctrica aproximadamente el 60% de los productos de fusin comenz a dividirse y cerca del 90% de ellos form estructuras multicelulares y en unos pocos casos microcallos. Pese a que se ha tomado al maz (Zea mays L) como sistema vegetal modelo en el cual estudiar los procesos de fusin de gametas y posterior embriognesis, tambin se han realizado trabajos exitosos de fusin de gametas en trigo (Triticum aestivum L.) obteniendo como resultado estructuras multicelulares y en algunos casos del tipo de microcallos. Los recientes progresos relacionados a los sistemas de fertilizacin in vitro as como los proyectos de genmica posibilitarn una mejor comprensin de los procesos de reconocimiento gamtico, fusin, seales intracelulares, eventos tempranos de activacin del huevo y formacin del cigoto. 3 Polinizacin in vitro En muchos casos el polen no puede germinar sobre el estigma de la propia flor aunque ste se halle receptivo. Este hecho puede deberse a barreras genticas o fisiolgicas. Algunas de estas barreras de prefertilizacin o precigticas se deben a:

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a) la incapacidad del polen de germinar en estigmas extraos b)la incapacidad del tubo polnico para alcanzar el vulo debido a una lenta velocidad de crecimiento o a una excesiva longitud del estilo. En estos casos, el ovario aborta antes de que el tubo polnico alcance la base del estilo o sin que la alcance en absoluto c) el hecho que el tubo polnico se deshaga en el estilo. La polinizacin in vitro de vulos con el desarrollo posterior de embriones ha sido exitosa en 14 familias de Angiospermas, resultando ms adecuada su aplicacin en aquellas especies que poseen ovarios grandes y que contienen muchos vulos. No obstante, con el tiempo se desarrollaron varias tcnicas de polinizacin in vitro ms sofisticadas ampliando con esto las posibilidades de aplicacin. Entre estas tcnicas se encuentran: - La polinizacin estigmtica, que consiste en cultivar el pistilo in vitro y colocar el polen sobre el estigma. - La polinizacin placental, donde los vulos se ponen en contacto con el polen a travs de un corte en la parte superior del ovario o quedan directamente expuestos por remocin de la pared del ovario. - La polinizacin de vulos aislados que se cultivan directamente sobre el medio de cultivo. - El injerto del estilo, en el cual los granos de polen germinan en un estilo compatible y luego se los une al ovario de la planta madre que se desea fertilizar. Es de esperar que en todos estos casos el polen germine en pocas horas, y que despus de la polinizacin, tenga lugar la fertilizacin. En la polinizacin placental in vitro los porcentajes de supervivencia son muy buenos, ya que los vulos no resultan daados durante las manipulaciones involucradas en su aislamiento. El cultivo junto con la placenta incrementa, en general, las posibilidades de un rpido desarrollo embrionario. El cultivo de vulos aislados (separados de su placenta) es un procedimiento mucho ms complicado y que ha sido empleado con xito slo en pocas especies de plantas. Para que las tcnicas sean exitosas es

crucial realizar el aislamiento de los vulos y del polen en el estado fisiolgico adecuado, por lo que es indispensable realizar un estudio de la duracin de los distintos estadios del desarrollo de ambos. Este estudio consiste en: a) Determinar los tiempos de antesis, dehiscencia de las anteras y polinizacin. b)Precisar el momento en que el estigma est receptivo c) Especificar el momento adecuado para la polinizacin. d)Establecer el tiempo adecuado para recoger el polen. Experimentalmente se intent la polinizacin in vitro de vulos de varias especies de angiospermas con polen proveniente de varias especies de gimnospermas. El anlisis embriolgico de los vulos de Melandrium album, fijados tres das despus de la polinizacin con polen de Pinus wallihiana, revel la presencia de remanentes de tubos polnicos y embriones de 2-clulas en los sacos embrionarios. 4 Cultivo de vulos y embriones in vitro El cultivo de vulos es un procedimiento muy complejo debido a que la manipulacin del material es difcil. El vulo es una estructura delicada, muy pequea, altamente hidratada, que puede ser daada con suma facilidad. Es imprescindible realizar la microciruga con rapidez para evitar que los tejidos sufran desecacin durante el proceso. Pese a las dificultades de la tcnica, en algunos cruzamientos interespecficos como los realizados en papa, algodn y Hevea brasiliensis, se comprob que el cultivo de vulos completos es ms exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados. El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los vulos de una planta y cultivarlos en un medio estril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal y germinar. Esta tcnica es relativamente fcil de llevar a cabo en embriones maduros y sus posibilidades de xito son muy buenas. Las dificultades incrementan cuanto ms inmaduro sea el

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embrin a rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son ms especficos en las etapas tempranas de desarrollo del embrin. El cultivo de vulos y de embriones vegetales se emplea en mejoramiento vegetal cuando se desea: - sortear algunas de las barreras de autoincompatibilidad - rescatar embriones abortivos derivados de la hibridacin interespecfica o intergenrica - superar problemas de abscisin precoz del fruto - recuperar embriones de cruzas interespecficas que conducen a la obtencin de haploides - acortar el perodo de latencia que ocurre en algunas semillas por presentarse inhibidores del desarrollo del embrin, en el endosperma o en la cubierta de la misma. El cultivo de embriones ha ayudado tambin al mejoramiento gentico de especies leosas que tienen dificultad en la germinacin de sus semillas como en Taxus mairei o con escasa produccin de semillas como es el caso de Pseudotsuga macrolepis y constituye una herramienta interesante en estudios bsicos de biologa reproductiva ya que permite analizar la embriognesis in vitro. 4.1 Factores externos que condicionan el cultivo de vulos y de embriones Entre los factores externos ms importantes que afectan el cultivo de vulos y de embriones se citan el medio de cultivo, la osmolaridad y los reguladores de crecimiento. El vulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, que varan con el estadio de desarrollo del mismo y que es necesario identificar para cada especie en particular. Es importante adems obtener un medio de cultivo adecuado para favorecer la germinacin de los granos de polen y permitir el desarrollo de los vulos fertilizados hasta semillas maduras. En general, todos los medios de cultivo para germinacin de los granos de polen poseen altas concentraciones de sacarosa y de cido brico. Un aspecto fundamental a tener en cuen-

ta en el rescate de embriones es la seleccin correcta de un medio de cultivo que pueda soportar los cambios progresivos de requerimientos durante las distintas etapas del desarrollo embrionario. Se pueden reconocer dos fases en el desarrollo embrionario con respecto a la nutricin: la fase heterotrfica en la que el embrin es dependiente del endosperma y dems tejidos maternos que lo rodean, y la fase autotrfica, en la cual el embrin es capaz de sintetizar las sustancias requeridas para su crecimiento a partir de sales minerales y azcares. La etapa crtica de pasaje de una fase a otra vara con las especies. Este cambio de requerimientos nutricionales hace que, cuando crecen in vitro, sea imprescindible la transferencia de los embriones de un medio de cultivo a otro para garantizar un ptimo crecimiento. Entre los medios de cultivo ms difundidos podemos citar el de Murashige & Skoog, Monnier, Randolph & Cox, Gamborg, Liu y col., etctera. El agua de coco y los extractos de endospermas han sido muy tiles, activando el crecimiento y desarrollo de los embriones en el cultivo de vulos de algunas especies vegetales. No existe demasiada evidencia acerca de la absoluta necesidad de los reguladores de crecimiento para el desarrollo de los embriones extrados, sean inmaduros o maduros, fuera de su rol en la ruptura de la dormicin. La concentracin osmtica es un factor importante en el desarrollo de vulos y embriones, dependiendo del estado de madurez de los mismos. La sacarosa presente en los medios de cultivo no slo provee la fuente de carbono necesaria para el crecimiento sino que adems mantiene la osmolaridad requerida para cada etapa del desarrollo. Est demostrado que una presin osmtica elevada previene la germinacin precoz de los embriones inmaduros, evitando as la ocurrencia de malformaciones estructurales. A medida que van creciendo, los embriones necesitan ser transferidos a medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa. Los embriones de la mayora de las especies presentan un buen crecimiento en un rango de temperaturas que va de los 25C a los 30C. Aunque algunos estudios indican

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que la luz no es crtica para el crecimiento de los embriones, se demostr que en el caso de la cebada la luz disminuye las probabilidades de germinacin precoz en los embriones inmaduros. 5 Aplicaciones La polinizacin placental in vitro puede ser empleada para superar las barreras de autoincompatibilidad e incompatibilidad cruzada. Los granos de polen de plantas autoincompatibles son capaces de germinar directamente sobre los vulos y llevar a cabo el proceso completo de la reproduccin sexual. En algunas combinaciones de cruzamientos, la polinizacin directa de los vulos permite que se superen las barreras de incompatibilidad precigtica, obtenindose embriones hbridos y aun plantas hbridas imposibles de obtener mediante tcnicas convencionales, como es el caso de Zea mays x Z. mexicana , Nicotiana tabacum x N. amplexicaulis, Melandrium album x Viscaria vulgaris, M. Album x Silene schafta, etc. En aquellos cruzamientos en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario como en Trifolium repens x T. hybridum, es necesario rescatar los vulos recin fecundados. La polinizacin placental in vitro tambin se emplea como va para la obtencin de plantas resistentes a estreses ambientales, ya que permite seleccionar para la fecundacin aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo diferentes condiciones de estrs. La polinizacin in vitro con polen obtenido de plantas de maz creciendo a temperaturas elevadas condujo a la obtencin de plantas tolerantes a estrs por calor. En Brassica rapa, la seleccin de polen a baja temperatura tuvo un efecto positivo en el crecimiento de la progenie en condiciones de fro, logrando acumular ms peso seco que en progenies normales. Se podra entonces seleccionar para la fecundacin aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estreses ambientales, en este caso trmico, acelerando as la obtencin de plantas resistentes. Dentro de las aplicaciones del cultivo de embriones est la del rescate de embriones

para la produccin de plantas haploides, donde se cultivan embriones que se forman por partenognesis o por eliminacin de cromosomas luego de la hibridacin interespecfica o intergenrica. Los embriones haploides en algunos casos se distinguen morfolgicamente de los normales, de manera que se extraen y se los cultiva in vitro en medios y condiciones de cultivo adecuados (ver IV.-1). Otras veces es necesario esperar a obtener las plantas para determinar el nivel de ploida. Esta tcnica se ha utilizado con xito en cebada, trigo y tabaco. El cultivo de embriones se utiliza tambin en el caso de plantas que sufren el aborto de los mismos en estadios tempranos del desarrollo debido a la incompatibilidad con el endosperma, como en la produccin artificial del triticale. Precisamente fue en este caso donde la tcnica de cultivo de embriones junto con la aplicacin de colchicina fueron de fundamental importancia en la transformacin del triticale en cultivo comercial, para superar el alto grado de incompatibilidad del cruzamiento inicial y la marcada esterilidad que posea la F1. El perfeccionamiento de estas dos metodologas fue decisiva para la produccin de un gran nmero de triticales hexaploides y octoploides, cruzando el centeno con trigos duros y harineros, respectivamente, con un alto grado de fertilidad. Tambin se emplea el cultivo de embriones en casos en que el endosperma no se desarrolla normalmente, como sucede en los cruzamientos de cultivares diploides y tetraploides de Citrus, o cuando el mismo se desintegra despus de la fecundacin, como en Oenothera biennis x O. muricata o O. biennis x O. lamarckiana. Esta tcnica tambin es de utilidad para sortear barreras de dormicin o en casos donde la viabilidad de la semilla es baja, como en yuca y otras especies del gnero Manihot. El cultivo in vitro de embriones es una alternativa para el intercambio de semilla a travs de fronteras internacionales. En un proyecto de mapeo de genes con resistencia al virus del mosaico en yuca, desarrollado entre CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Colombia) y IITA (Instituto Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Nigeria) donde fue necesario trasladar stocks de semillas desde

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Sudamrica al continente africano, el cultivo de embriones result ser un excelente mtodo para transferir germoplasma con mnimos riesgos fitosanitarios. El cultivo de embriones inmaduros tambin puede ser aplicado como complemento del mejoramiento convencional, entre las estrategias utilizadas para disminuir el tiempo necesario en la obtencin de un nuevo cultivar. Por ejemplo en soja se requieren unos diez aos para este fin. Si se consiguen realizar varias generaciones por ao, en contraestacin, se acelera el proceso. El cultivo de embriones inmaduros ahorrara adems el tiempo de maduracin de la semilla. Cultivo de nucelas. Existen pocos explantos que poseen la capacidad de producir callos embriognicos. Las inflorescencias y los embriones inmaduros se utilizan para este fin en los pastos y en los cereales, constituyendo excelentes herramientas para la transformacin de plantas. En las plantas leosas los explantos de tejidos maduros pierden la capacidad de regeneracin, se ha inducido entonces con xito la embriognesis somtica a partir de nucelas de vulos jvenes. Este es el caso de Citrus sp , Vitis vinifera , Malus domesticus , Psidium guajava y Pyrus serotina. En estas especies tambin permiten acortar el perodo de siembra a floracin. Otro sistema que puede utilizarse en algunos experimentos bsicos es la obtencin de un embrin a partir de cigotos transgnicos o micromanipulados. Para ello son importantes la fertilizacin in vitro de gametas aisladas y el cultivo de los productos de fusin hasta la obtencin de una planta. Bajo esas condiciones el embrin no se diferencia de los embriones obtenidos in vivo. En maz tambin es posible cultivar los cigotos fertilizados in vivo dentro de sacos embrionarios parcialmente aislados. 5.1 El cultivo de vulos y embriones y la embriognesis somtica para dilucidar aspectos bsicos del desarrollo en plantas Las plantas parecen poseer un programa embriognico especfico preestablecido que puede dispararse en respuesta a condiciones especficas. La embriognesis cigtica se dispara por la fertilizacin mientras que la

somtica lo hace a travs del cultivo de tejidos. El estudio de los eventos moleculares que tienen lugar durante la embriognesis temprana es actualmente uno de los campos principales de la biologa vegetal. Los embriones somticos constituyen una excelente herramienta para estudiar los procesos de desarrollo en plantas, ya que facilitan el acceso a gran cantidad de embriones libres. En su medio natural los embriones cigticos ofrecen dificultades debido a su pequeo tamao y al hecho de estar inmersos en el tejido materno. Los embriones vegetales son morfolgicamente simples pero molecularmente complejos. A diferencia de lo que ocurre en los embriones animales, donde los patrones de expresin gnica se hacen ms complejos a medida que progresa el desarrollo, en los embriones vegetales se encontraron unos 20.000 ARN, nmero similar al encontrado en rganos ms complejos como hojas, races, flores, anteras, etc., donde los ARN que son especficos de un estadio determinado constituyen una modesta fraccin del total, representando, sin embargo, a un gran nmero de genes. En algodn, por ejemplo, el 10% de los ARN presentes en embriones en la fase media de maduracin son nicos de aquel estadio. Muchos de estos genes especficos de estadio han sido clonados como ADNc, pero en general se trata de genes expresados mayoritariamente, como aquellos de las protenas de reserva de la semilla. Estos ADNc resultaron ser marcadores tiles de la diferenciacin celular, como el gen inhibidor de la tripsina de Kunitz, cuyo ARN se acumula en el polo micropilar del embrin globular (por donde penetra el ncleo espermtico al saco embrionario) antes de que sea evidente la diferenciacin celular. La expresin de este gen es uno de los primeros indicadores moleculares de polaridad en la transicin del embrin globular a uno de simetra bilateral con forma de corazn. Para estudiar el desarrollo en plantas, al igual que en el caso de animales, se ha recurrido al uso de mutantes. El organismo modelo en este caso es Arabidopsis thaliana, que es una planta de genoma pequeo y ci-

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clo de vida muy corto, lo cual la hace apta para estudios genticos. Se han detectado dos tipos de mutantes, letales embrionarios y con alteraciones en el patrn de desarrollo. Calculando el nmero de mutantes letales embrionarios que se encontraron, algunos investigadores han concluido que existen unos 4.000 genes expresndose durante la embriognesis. En el punto superior de esta compleja va se encuentran genes reguladores principales (master regulators) y slo de 40 a 50 genes que afectan el patrn embriognico. Entre las mutaciones estudiadas se encuentran bio1 , que es letal y detiene la embriognesis en el estadio de corazn temprano. No es un gen regulador principal y sus efectos se ven revertidos en presencia de biotina. Otra mutacin es raspberry. Estos mutantes quedan bloqueados en el estado globular y poseen protuberancias en las clulas externas lo que le da el aspecto de una frutilla. El bloqueo se presenta en un estadio anterior a la formacin de rganos, momento en el que ya existe diferenciacin celular. En maz tambin se han encontrado mutantes letales embrionarios. En algunos se encuentran inhibidos el desarrollo del embrin y el endosperma. En otros, slo el embrin. Una importante conclusin a la que permitieron arribar estos mutantes es que el embrin de Arabidopsis est constituido por el ensamblaje de dos patrones superpuestos, uno a lo largo del eje apical-basal y el otro a lo largo del eje radial. Ninguno de los mutantes encontrados fueron mutantes tempranos, lo cual sugerira un control de los primeros estadios del desarrollo embrionario por parte de genes maternos, como sucede en animales. Sin embargo, se han identificado pocos genes maternos que afecten el desarrollo en plantas y el hecho de que se puedan formar los embriones somticos o que se puedan desarrollar embriones producto de la fertilizacin in vitro inducira a sospechar que los genes maternos no juegan un rol primordial. Un gen materno encontrado en Arabidopsis es sin1 (short integument 1). Este gen afecta la formacin de vulos, el tiempo de floracin y el desarrollo embrionario. No se sabe si real-

Preglobular

Globular

Embrin maduro Corazn Torpedo

Figura 3: Estados de la embriognesis de Arabidopsis thaliana.

mente se requiere para la embriognesis o si los defectos observados se deben a las limitaciones impuestas por los defectos en el tejido materno. Los embriones provenientes de madres sin1/sin 1 tienen grandes defectos morfogenticos. Embriones con ese genotipo en madres normales tienen un desarrollo normal (Fig. 3). Un gen embrionario muy importante es GN/EMB30. No se sabe si es un regulador principal y acta muy temprano en el desarrollo, durante la primera divisin celular del cigoto. En los mutantes las dos clulas resultantes no son diferentes, como ocurre en embriones normales, donde la primera divisin celular es asimtrica. El sistema mejor estudiado en relacin con la embriognesis somtica es el de suspensiones celulares de zanahoria (Daucus carota). En este sistema, la remocin del cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) genera un respuesta embriognica por la cual los agregados celulares forman embriones que crecen de a millares en un medio lquido. La disponibilidad de gran cantidad de embriones creciendo sincrnicamente en un medio lquido representa un buen sistema para estudiar los eventos genticos involucrados en el desarrollo embrionario. Los primeros estudios tendientes a identificar patrones de expresin gnica relacionados con la embriognesis somtica fueron realizados en 1981. Utilizando electroforesis bidimensional se encontra-

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ron pocas diferencias entre patrones proteicos de embriones somticos y clulas en proliferacin, aunque, en virtud de lo expresado anteriormente, se esperara un patrn ms complejo. Habra varias explicaciones para esta inconsistencia. Una es que los productos de genes individuales involucrados en el desarrollo embrionario no fueran muy abundantes como para ser detectados en las genotecas de ADNc. Otra es que la sincronizacin fuera slo aparente, particularmente en estadios tardos y que estas diferencias enmascararan las diferencias entre estadios. Otra es que las constelaciones gnicas involucradas en la embriognesis somtica podran estar ya activadas en las clulas proliferando en cultivo. Algunos estudios indicaran que muchos de los genes expresados en los embriones somticos ya estaran hacindolo en las masas proembriognicas. Uno de estos genes es el SERK que se expresa en clulas competentes. Se conoce la secuencia de su ADNc y codificara para una protena receptora con repeticiones ricas en leucina del tipo protena quinasa. La expresin de este gen est correlacionada con la aparicin de clulas competentes en cultivos primarios derivados de explantos de hipoctilos. La expresin contina en las masas proembriognicas y persiste hasta el estadio de embrin globular. Se encontr una lnea celular (ts11) sensible a la temperatura (letal condicional) que en la temperatura restrictiva detiene su desarrollo en el estadio de corazn. Este efecto es revertido al colocar las clulas en un medio condicionado proveniente de suspensiones celulares normales. El compuesto responsable de la reversin result ser una endoquitinasa acdica. Aparentemente, esta enzima puede hidrolizar un sustrato que se encuentra en las paredes celulares vegetales y liberar un compuesto indispensable para disparar la embriognesis somtica. Tal sustrato no pudo ser identificado pero se encontr un lipoligosacrido de Rhizobium, NodRlv-R (Ac, C18:4), que puede rescatar a estas lneas celulares mutantes a fin de que prosigan los procesos de embriognesis somtica. Hasta el momento no se ha encontrado cul es la sustancia en clulas vegetales que produce este efecto. El programa de eventos que tiene lugar

durante la embriognesis somtica es muy elaborado como para estar regulado solamente por el 2,4-D. La perturbacin causada por la deprivacin de este regulador del crecimiento debe disparar una serie de eventos clave que involucran la accin de factores de crecimiento ms especficos y fuerzas biofsicas que confieren informacin posicional y de desarrollo. 6 Lecturas recomendadas
BARNABAS, B.; PONYA, Z. 1999. Test-tube Plants as Tools for Crop Improvement. Hungarian Agriculture Research. 2: 5 9. BHOJWANI, S. S.; RAZDAN, M. K. 1996. Plant Tissue Culture: Theory and Practice, a Revised Edition. Elsevier. DUMAS, C; MORGENSEN, H. L. 1993. Gametes and fertilization: Maize as a model system for experimental embryogenesis in flowering plants. Plant Cell. 5: 13371348. FAURE, J. E.; DIGONNET, C.; DUMAS, C. 1994. An in Vitro System for Adhesion and Fusion of Maize Gametes. Science. Vol 263, pp 1598-1600. FAURE, J. E.; ALDON, D.; ROUGIER, M.; DUMAS, C. 1996. Emerging data on pollen tube growth and fertilization in flowering plants, 1990-1995. Protoplasma, Vol 193, Iss 1-4, pp 132-143. GUEVARA, C.; OSPINA, J.; MAFLA, G.; V. VERDIER. 1998. Zygotic embryo culture of Manihot esculenta Crantz : a practical approach for the safe internacional movement of cassava seed stocks. Plnat Genetic Resources Newsletter 115:33-38. HOWELL, S. 1998. Molecular Genetics of Plant Development. Cambridge University Press. KANTA, K.; RANGASWAMY, W. S.; MAHESHWARI, P. 1962. Test tube fertilization in a flowering plant. Nature 194:1214-1217. KOVACS, M.; BARNABAS, B.; E. KRANZ. 1995. Electrofused isolated wheat (Triticum aestivum L.) gametes develop into multicellular structures. Plant Cell Rep. 15: 178-180. KRANZ, E.; DRESSELHAUS, T. 1996. In vitro fertilization with isolated higher plant gametes. Trends in plant science reviews. Vol. 1, Nro. 3, pp 82-89. KRANZ, E.; KUMLEHN, J. 1999. Angiosperm fertilization, embryo and endosperm development in vitro. Plant Science. Vol. 142, Iss 2, pp 183-197. LITZ, R. E. 1991. Cultivo de embriones y vulos. En Cultivo de tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Roca y Mroginsky editores. pp 295-312.

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PICCA, Aurora; CARDONE, Susana

PARTE IV Mtodos para acelerar programas de mejoramiento e identificacin varietal

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POLCI, Pablo; CONTI, Vernica; MIRANDA, Rubn

IV.-Captulo 1
Obtencin de plantas doblehaploides
Polci, Pablo; Conti, Vernica; Miranda, Rubn 1 Introduccin

Identificacin de Haploides
Varios procedimientos facilitan la bsqueda de haploides en muestras grandes en nmero de individuos. Algunos de ellos son: - Morfologa: Las plantas haploides son, en general, ms pequeas que las diploides, tanto en sus partes vegetativas como florales. Esto se debe principalmente a la disminucin en el tamao de sus clulas. Es lgico pensar que el fenotipo ms pequeo de las plantas puede ser una primera aproximacin en la bsqueda de haploides. Si esta disminucin de tamao fuera notable en las semillas, sera muy fcil realizar una seleccin mecnica, aunque sucede en pocas especies. - Poliembriona : La presencia de poliembriona facilita la deteccin de embriones haploides; no obstante ello, debe realizarse el control citolgico correspondiente. El porcentaje de embriones gemelos observados vara con la especie y el genotipo. - Genes marcadores: Con este fin puede utilizarse cualquier par de alelos cuyos fenotipos dominante y recesivo sean fcilmente distinguibles. En la prctica, conviene utilizar marcadores que posean manifestaciones fenotpicas claras en semilla o en plntula y de esta manera hacer una seleccin ms econmica en tiempo y esfuerzo. Para identificar haploides en una variedad que se supone homocigota, se realizan cruzamientos con otra variedad que sea homocigota para el alelo alternativo. La mayor parte de la descendencia ser heterocigota (diploide), con fenotipo dominante. Los individuos que aparezcan con el fenotipo recesivo seran haploides, obtenidos por partenognesis o andrognesis, segn sea el fenotipo recesivo materno o paterno, respectivamente.

Comentarios generales sobre los haploides Para referirnos al trmino haploide es necesario conocer previamente el origen de dicha denominacin, y definir algunos conceptos bsicos sobre el tema. Si consideramos haploide al individuo que posee un solo juego de cromosomas de la especie, no estaramos incluyendo en esta clasificacin a aquellos individuos derivados de especies poliploides, cuya constitucin gentica es igual a la de los gametos normales de dicha especie. Por ejemplo, un autopoliploide AAAA (2n = 4x) dara lugar a individuos haploides AA (n = 2x), que por tener dos juegos cromosmicos (AA) no podran ser incluidos en la definicin. Por lo tanto, una solucin sera denominar como haploides a los individuos originados a partir de especies diploides, que posean un solo juego de cromosomas (n = x), llamando polihaploides a aquellos individuos con una composicin cromosmica igual que la gamtica normal de la especie, que tengan dos o ms juegos cromosmicos (n > x). Otra posibilidad sera considerar el trmino haploide en un sentido ms amplio, comprendiendo en ste a todos los individuos que posean una constitucin cromosmica igual a la de los gametos normales de la especie (n = 2n/2). Llamaramos de esta manera monoploides y polihaploides a los individuos provenientes de plantas diploides (2n= 2x) y poliploides (2n> 2x) respectivamente. De aqu en adelante, a los fines prcticos y en concordancia con la segunda definicin, nos referiremos al trmino haploide indistintamente del nivel de ploida de la especie en cuestin, como a aquellos individuos que poseen la mitad del nmero cromosmico normal contenido en las clulas somticas de la especie.

Antecedentes El valor de los haploides es conocido desde 1922, cuando se descubri la produccin espontnea de los mismos. Actualmente son ms de cien las especies vegetales capaces de producirlos in vivo. Sin embargo, la frecuencia con la cual se producen es muy baja, con valores que van de 0,001 a 0,01 %. Entre los casos de haploida espontnea es comn la poliembriona, que, con una gran variacin entre los distintos genotipos, ocurre en una amplia gama de especies, gneros y familias. En estos casos es frecuente 137

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la aparicin de haploides procedentes de una sinrgida del saco embrionario, puesto que se ha comprobado en muchas especies que las clulas antpodas degeneran antes de la fecundacin. En 1966, Guha y Maheshwari descubrieron que las anteras de Datura innoxia Mill. generaban plantas haploides al ser cultivadas in vitro. Este proceso, confirmado posteriormente por Nitsch y Nitsch (1969) en tabaco, se ha utilizado para producir haploides en numerosas especies. En el caso de Datura innoxia, las frecuencias de induccin son casi del 100% y el rendimiento es de ms de mil plntulas o callos por antera en condiciones ptimas (Fig. 1).

das mundiales de produccin. A pesar de que cada ao se liberan al mercado numerosas variedades, no persisten demasiado. Los objetivos de mejoramiento a largo plazo no podrn ser alcanzados a menos que se genere mucha variabilidad gentica que pueda ser utilizada con estos fines y que existan mtodos que acorten el tiempo necesario para la obtencin de variedades. El advenimiento de las tcnicas biotecnolgicas y los avances en biologa molecular han permitido el desarrollo de nuevas herramientas de gran utilidad en el mejoramiento vegetal. Entre stas, la produccin de haploides y doblehaploides es una herramienta interesante ya que permite acortar el tiempo requerido para la obtencin de nuevas variedades, siendo un buen complemento para los programas de mejoramiento tradicionales. En algunos casos, las poblaciones haploides o doblehaploides (DH) carecen de genotipos heterocigotas y sirven para encontrar genotipos raros, especialmente en el caso de caracteres recesivos, ya que stos no quedan enmascarados por los alelos dominantes. Estas poblaciones presentan mayor variacin gentica aditiva y ausencia de varianza gentica debida a Figura 1: Obtencin de plantas haploides por cultivo de anteras. la dominancia, si se las compara En estudios de andrognesis in vitro se con poblaciones segregantes. Es decir que se ha detectado especial facilidad para regene- eliminan las complejidades del estado rar haploides a partir de anteras aisladas o heterocigota y se facilita enormemente el de granos de polen en miembros de la fami- anlisis gentico. De esta manera pueden lia de las solanceas Tambin se han encon- distinguirse las mutaciones recesivas de fortrado resultados sorprendentes en numero- ma inmediata, haciendo que el proceso de sos gneros de las crucferas, gramneas y de seleccin sobre una poblacin de haploides las ranunculceas, aunque resulta comn resulte ms eficiente (Fig. 2). La produccin de haploides es una alterobservar diferencias significativas, incluso dentro de un mismo gnero. No se ha logrado, nativa biotecnolgica de gran importancia y sin embargo, el mismo xito en especies ha resultado exitosa en varios cultivos, entre ellos cebada, arroz y trigo. arbreas y arbustivas. Un sistema de produccin de DH debe cumplir con tres requisitos bsicos para su 2 Importancia de los haploides y utilizacin en programas de mejoramiento: aplicaciones en el mejoramiento vegetal - Debe producir lneas DH eficientemente Los mtodos tradicionales para el mejo- a partir de todos los genotipos. - Los DH obtenidos deben ser normales ramiento vegetal han sido practicados por cientos de aos. Actualmente se ha llegado y estables. Estos deberan representar una muestra a una etapa en donde estos mtodos son insuficientes para hacer frente a las deman- al azar del conjunto de gametos parentales.

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trigo de ciclo invernal es de aproximadamente diez aos, a travs Gametos Ab aB del mejoramiento tradicional (Fig. 3). AaBb Generacin F La biotecnologa se presenta hbrido intervarietal como una alternativa atractiva no AB Ab aB ab Gametos F slo para reducir el tiempo de obtencin de los genotipos deseados, sino tambin para lograr una economa de mano de obra y espacio en el campo experiCultivo de anteras Autofecundacin mental. Genotipos posibles despus del Genotipos posibles despus de un Ciclo En las plantas autgamas , cultivo de anteras: de autofecundacin de la F1: Plantas haploides AB Ab aB ab con los mtodos convencionales Ab aB ab AB de mejoramiento, la homocigosis AB AABB AABb AaBB AaBb prctica se logra recin luego de Ab AABb AAbb AabB Aabb seis a ocho generaciones de aB AaBb AaBb aaBB aaBb Duplicacin con colchicina ab AaBb Aabb aaBb aabb autofecun-dacin, mientras que Plantas doblehaploides * La probabilidad de ocurrencia de los recuadros AABB AAbb aaBB aabb con una tcnica de produccin de internos es de 1/16 (1/4 x 1/4) 1/4 1/4 1/4 1/4 haploides, seguida de duplicacin cromosmica, es posible llegar a Figura 2: Ventaja del uso de haploides en el mejoramiento cuando los homocigosis completa en una gecultivares parentales difieren, tericamente, en dos pares de genes. Si el genotipo buscado es, por ejemplo, el doble recesivo aabb, se tiene, por neracin. En las plantas algamas, la autofecundacin convencional, una probabilidad de 1/16 de encontrarlo. Si se induce haploida, el mismo genotipo tendr una probabilidad de produccin de homocigotas resulocurrencia de porque no se producirn los genotipos heterocigotas. ta de gran importancia. Al trabajar con especies de polinizacin Entre las aplicaciones ms importantes de cruzada se favorece naturalmente la heterolos doblehaploides en el mejoramiento ve- cigosidad, y, de ser posible la autofecungetal podemos citar: dacin, la obtencin de homocigotas se ve dificultada por la endogamia. Acortamiento de los programas de En plantas bulbosas, rboles frutales y mejoramiento forestales la homocigosis juega un rol muy El desarrollo de nuevos cultivares por los importante en el aceleramiento de los promtodos tradicionales actuales comprende gramas de mejoramiento. Debido al prolontres etapas fundamentales: gado tiempo requerido para alcanzar la fase (a) Generacin de variabilidad gentica, sea por medio de hibridaciones sexuales intra Progenitor A x Progenitor B e interespecfica, por induccin de mutaciones, o por transformacin gentica. (b) Recuperacin de progenies homocigotas a travs de generaciones repetidas de F 1 autofecundacin o retrocruzamiento, selec6-7 ciclos cionando a favor de los caracteres de inteSeleccin De @ rs. Autofecundacin (c) Evaluacin del comportamiento de los @ nuevos materiales en ensayos comparativos a campo. Lneas puras Estos pasos son bsicos en un programa (homocigosis prctica: F7-8) de mejoramiento, pudiendo existir otras etapas en funcin del modo reproductivo de la Figura 3: Representacin esquemtica de los pasos especie. As, por ejemplo, el tiempo requeri- requeridos para la obtencin de lneas puras en un do para la obtencin de un nuevo cultivar de programa de mejoramiento tradicional.
AAbb X aaBB
Generacin parental
1 1

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4 1/4

1/4 1/4

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adulta, el proceso de mejoramiento resulta extremadamente largo, aun siendo posible la autopolinizacin.

Generacin de poblaciones de mapeo Diversos tipos de poblaciones pueden ser utilizadas para el mapeo gentico de plantas. La eleccin del tipo de poblacin se realiza en funcin de los objetivos de la investigacin y del tiempo y recursos disponibles. Las poblaciones de mapeo con el mayor contenido de informacin son aquellas obtenidas a partir del cruzamiento entre dos indivduos homocigotos contrastantes. En las plantas F 1 obtenidas, el desequilibrio de ligamiento es mximo, y las poblaciones derivadas a partir de estas plantas F1 procuran explorar este desequilibrio. Para especies de autofecundacin o que toleran la autofecundacin pueden utilizarse poblaciones F2, Fn, RILs (Recombinant Imbreed Lines), derivadas de retrocruzas y doblehaploides. Las poblaciones de doblehaploides representan la variabilidad gentica entre los progenitores luego de ocurrida una meiosis (F1), y son especialmente indicadas cuando se realizan estudios con QTL (quantitative trait loci), ya que al obtenerse genotipos 100 % homocigotas se dispone de poblaciones estables o inmortales de mapeo. Esto permite analizar la misma poblacin en diferentes aos y localidades, debido a la constante disponibilidad de semilla, obtenindose estimaciones mas precisas de los parmetros de los caracteres cuantitativos a ser mapeados. Estudio de especies poliploides La induccin de haploides en plantas poliploides facilita el trabajo de investigacin y mejoramiento, ya que permite manejar niveles de ploida menores para los estudios de herencia y la combinacin de caracteres de inters. Fusin de protoplastos Al fusionar dos protoplastos haploides se origina uno diploide que puede duplicarse y llevar a la obtencin de un hbrido interespecfico o intergenrico, siendo esto una ventaja importante cuando se trabaja en hibridacin somtica. Variacin gametoclonal 140

La andrognesis in vitro provee un excelente sistema para analizar, a nivel esporoftico, la variacin debida a recombinacin y segregacin meitica. Las variantes gametoclonales expresan el carcter recesivo en la R 0, a diferencia de las somaclonales, que requieren de autofecundacin y anlisis de progenie. Algunos logros de esta tcnica: - Frutos de tomate con mayor contenido de slidos - Plantas enanas de arroz con granos ms largos y con elevados niveles de protenas de reserva y ms macolladoras. - Plantas de Datura innoxia con contenidos ms elevados de alcaloides en las hojas. - Plantas de tabaco con mayor resistencia a bajas temperaturas. - Plantas de Brassica napus con mayor contenido de aceite del cido ercico en las hojas. Este aceite se usa como lubricante en la industria.

Mutagenesis Si se aplica mutagnesis a un sistema de haploides, se obtienen mutantes slidos, logrndose la homocigosis del mutado rpidamente luego de la duplicacin con colchicina. Entre los agentes mutagnicos ms frecuentemente utilizados se encuentra la N-metil-N-nitrosurea (20 mM), los rayos (0,5 krad) y el etil metil sulfonato. Transformacin gentica Rige el mismo principio que para mutagnesis. La transformacin de haploides permite la obtencin del transgen en homocigosis luego de la duplicacin con colchicina. Puede realizarse con PEG, microinyeccin o utilizando Agrobacterium tumefaciens. Produccin de plantas homogamticas Asparagus officinalis es una especie cultivada, dioca, en la cual las plantas femeninas son XX y las masculinas son XY. De esta manera, para obtener una poblacin de plantas deben cruzarse ambos tipos, lo que dar una progenie constituida por 50 % de plantas XX y 50 % de plantas XY. Sin embargo, desde el punto de vista del productor, es deseable la obtencin de una poblacin cons-

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Por este tratamiento se han obtenido haploides de Triticum monococcum. 2) Polinizacin retrasada: la castracin de las flores y la posterior polinizacin Progenitor masculino en el lmite de la madurez receptiva XY del estigma permiten obtener hasta Formacin de gametos un 30 % de haploides en trigo. 3) Polinizacin con polen inviable: X Y a) Utilizando polen extrao (tpiPlantas haploides co de cruzamientos interespecficos), Cultivo de anteras incapaz de fecundar a la especie en X Y cuestin, puede servir de estmulo Duplicacin para inducir haploida, como sucede cromosmica Homocigotos, XX YY en el cruzamiento entre Solanum hembra y supermacho tuberosum x S. phureja (papa silvestre). El polen de la papa silvestre contiene slo un ncleo generativo, proFormacin de ducto de una gametognesis anorGametos X Y gametos mal, por lo cual la fertilizacin doble no logra producirse, pero se forman XY embriones haploides por partenogHbrido nesis. b) Utilizando polen previamente irradiado. Para solucionar este problema y obtener 100 4) Cultivo de ovarios: puede ser eficaz % de plantas masculinas se ide un sistema para obtener haploides a partir de cruzaque consiste en el cultivo de anteras y mientos interespecficos. diploidizacin de plantas YY, llamadas supermachos. La ventaja de estas plantas es II. Andrognesis: desarrollo de un gameque, al ser cruzadas con plantas XX darn to masculino. 100 % de plantas XY, como se muestra en el esquema: 1) Cultivo de anteras: se ha inducido Con este sistema, en 1990 fue liberada haploida en mono y dicotiledneas, siendo una variedad llamada Andrea (es un hbrido ms fcil en las ltimas. Es una tcnica simple obtenido como se mencionara anteriormen- que, dependiendo del genotipo y de las conte). Andrea es una variedad muy homog- diciones de cultivo permite obtener elevados nea, de alto rendimiento y de excelente cali- nmeros de plantas en tiempos relativamendad. te cortos. Ha sido ms difcil en los cereales; no obstante ello, se obtuvieron haploides de 3 Obtencin de Haploides arroz, trigo, cebada con diferentes grados de dificultad. Como se mencionara anteriormente, las 2) Cultivo de micrsporas: en 1974 Nitsch plantas haploides aparecen en muy baja fre- indujo la regeneracin de plantas haploides cuencia en la naturaleza, siendo necesaria la de Nicotiana terbium y Datura inoxia a parposterior ocurrencia de duplicacin tir de cultivos en suspensin de micrsporas, cromosmica para la obtencin de semillas. previo choque trmico a baja temperatura Por ello, la produccin artificial de haploides de las flores. Este mtodo tiene la ventaja de producir haploides masivamente (ms de resulta siempre ms efectiva. 7000 plantas por botn floral en tabaco), y de permitir la aplicacin de diferentes trata Origen de los haploides mientos a las micrsporas como transformaI. Ginognesis: desarrollo de un gameto cin o mutagnesis para luego obtener plantas por embriognesis partiendo de una nifemenino no fecundado. Se logra por: 1) Castracin y aislamiento de las flores. ca clula inicial. Para conseguir diferenciar

tituida solamente por plantas XY, que tienen un menor contenido de fibra y son, por lo tanto, preferidas por los consumidores.

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plantas a partir de micrsporas es necesario quebrar el mecanismo responsable de la asimetra en la primera mitosis del polen. III. A partir de alguna clula haploide del saco embrionario distinta del gameto femenino (sinrgidas o antpodas). IV. Cruzamientos interespecficos o intergenricos con eliminacin cromosmica: se produce la fertilizacin de manera de que se forme un cigoto diploide, que, a lo largo de las sucesivas divisiones mitticas, va perdiendo el genoma del individuo que aport el gameto masculino, como sucede en los cruzamientos entre Hordeum vulgare y H. bulbosum. V. Interaccin ncleo-citoplasma: utilizando lneas de sustitucin y restauracin nuclear se encontr que los individuos con citoplasma de Aegilops caudata y ncleo de Triticum aestivum o Triticale mostraban una frecuencia de haploida del 3,1% y del 52,9% respectivamente. Esto se debe a que ciertas interacciones entre un citoplasma y un ncleo extrao inducen haploida. VI. Semigamia: el ncleo del gameto masculino penetra en la ovoclula pero sin fusionarse con el ncleo femenino. Ambos ncleos comienzan a dividirse independientemente, produciendo un individuo haploide con tejidos de origen materno y paterno.

Figura 4. Produccin de callos y plantas a partir del cultivo de anteras de Triticum aestivum. A. Callo blanco y compacto sobre una antera(flecha). B. Detalle del callo sealado en (A). C. Callo transferido a medio de cultivo para regenerar planta. D. Plntula de trigo regenerada a partir de callo, con sistema radicular en formacin. E. Planta haploide completa finalizando la etapa de rusticacin, creciendo sobre sustrato inerte (Perlita).

Mtodos ms utilizados para la obtencin de plantas haploides: Entre los mtodos disponibles actualmente para la obtencin de doblehaploides, los ms utilizados son la hibridacin interespecfica e intergenrica y la andrognesis.
- Cultivo de Anteras: Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en un medio de induccin, donde las micrsporas competentes originarn callos, que sern luego transferidos a un medio apropiado para la regeneracin de plantas (Fig. 1). En algunas especies de dicotiledneas el nmero de plantas obtenidas por cada cien anteras cultivadas es muy elevado. En cambio en las gramneas la tcnica no ha sido tan exitosa. Sin embargo, los progresos en

los mtodos de cultivo in vitro durante las ltimas dcadas han permitido obtener buenos resultados con gramneas (Fig. 4), aun en aquellas consideradas recalcitrantes. La capacidad de respuesta al cultivo de anteras, denominada capacidad andrognica, puede ser evaluada a travs de la produccin de callos y de plantas verdes, y su eficiencia es altamente dependiente de: a) El genotipo: es quizs el factor ms importante que afecta al cultivo de anteras. En la naturaleza, la haploida es controlada por el gen hap, llamado gen inhibidor de la haploida. Existe suficiente evidencia que sugiere que la andrognesis in vitro tambin est bajo control gnico y que este carcter puede ser transferido desde clones con alta respuesta a otros no respondedores. Se ha hallado variabilidad en la respuesta entre especies y aun dentro de ellas. En cebada y trigo los caracteres de induccin de callos y regeneracin de plantas son altamente heredables, y ha sido sugerido que ambos caracteres estaran controlados por muchos genes. Por lo tanto, el mejoramiento de la capacidad andrognica no parece difcil, sien-

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do la identificacin de genotipos con gran capacidad de respuesta un paso indispensable para su incorporacin en los bloques de cruzamiento. b) El % de albinismo: La ocurrencia de plantas albinas representa un serio problema para la aplicacin del cultivo de anteras en programas de mejoramiento de cereales. La incidencia depende no solo de la especie sino tambin de la variedad, citndose valores de 50, 70 y 100 % para tres variedades diferentes de arroz (Wang y col., 1978). Bernard (1980) ha sugerido que las altas temperaturas incrementan la diferencia entre la velocidad de replicacin del material nuclear y el de las organelas, resultando en un desarrollo retardado o incompleto de los plstidos, lo cual conducira a la produccin de fenotipos albinos. De acuerdo con este autor, el desarrollo de un sistema fotosinttico funcional es promovido por el tratamiento con bajas temperaturas, aunque no siempre un pretratamiento con fro reduce incidencia de albinismo. c) Las condiciones de crecimiento de las plantas donantes: la edad y las condiciones ambientales en que crecen las plantas afectan considerablemente la capacidad andrognica de las mismas. Los factores ambientales ms crticos son el fotoperodo, la intensidad de luz, la temperatura, la nutricin y la concentracin de CO2. Estos factores incidiran en la capacidad de producir las divisiones celulares morfognicas que conducen al desarrollo de embrioides y la regeneracin de plantas. Este ltimo paso es crtico dentro de todo el proceso, es altamente dependiente de la calidad del callo y est asociado fuertemente a toda la historia previa del cultivo. En general, se ha informado que la utilizacin de anteras de las primeras floraciones favorece la respuesta andrognica, mientras que las colectadas al final de la estacin muestran una menor respuesta al cultivo, generando una menor cantidad de embrioides. En Brassica napus, el crecimiento de las plantas a bajas temperaturas mejora la produccin de embrioides obtenidos a partir de anteras. d) El estado de desarrollo de las microsporas: en la fase gametoftica de las plantas, que comienza luego de la meiosis, las micrsporas sufren inicialmente una divisin mittica asimtrica que da origen a dos

clulas de distintos tamaos: la generativa, ms pequea y con un ncleo altamente condensado; y la vegetativa, ms grande y con un ncleo difuso. En las gramneas, el ncleo generativo se divide nuevamente originando dos ncleos espermticos. Uno generar el endosperma triploide al fusionarse con los dos ncleos polares del saco embrionario, mientras que el segundo fertilizar a la oosfera produciendo el cigoto diploide, que constituir el primer paso de la nueva fase esporoftica. Los embrioides haploides se originan in vitro a partir de una de las vas que se enuncian a continuacin. Cuando la primer divisin mittica de la micrspora es asimtrica, los haploides se originan por repetidas divisiones de la clula vegetativa, de la generativa o de ambas. Cuando la primer divisin mittica es simtrica, ambas clulas resultantes contribuyen al desarrollo del haploide. Por lo tanto, una clula gamtica masculina puede revertir su desarrollo gametoftico hacia el grano de polen y dar origen directamente a un nuevo individuo. En general, las micrsporas que se encuentran en la primera divisin mittica son las que mejor responden. Esto vara levemente con la especie vegetal, pero esta reversin no es posible luego de iniciada la deposicin de almidn. El estado ms apropiado para los cereales es el de micrspora uninucleada media y tarda. e) Los pretratamientos: distintos tipos de estrs aplicados durante el estado adecuado pueden enmascarar el programa gametoftico e inducir la expresin de genes especficos del desarrollo esporoftico. Si bien las bajas temperaturas son consideradas como el mejor pretratamiento, tambin otros pueden estimular la andrognesis, como el calor, el choque osmtico, la centrifugacin de las anteras o hasta una incisin en la parte superior de la inflorescencia donante. Tambin se citan la poda, la pulverizacin con etrel, la irradiacin, la reduccin en la presin atmosfrica, la anaerobiosis, el tratamiento en una atmsfera saturada de agua y la aplicacin de gametocidas. Las bajas temperaturas aplicadas sobre la planta madre, sobre las yemas florales jvenes o sobre las anteras, generalmente estimulan la embriognesis. El fro estimula la divisin mittica simtrica de las micrsporas. Esto se

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debera a una alteracin en la orientacin del huso que conducira a una primera mitosis anormal del grano de polen. Por otra parte, se ha mencionado que las bajas temperaturas retardan el envejecimiento de la pared de la antera, lo cual aumentara la supervivencia y la viabilidad del polen. En general, las temperaturas citadas varan entre 2 y 10 C y la duracin del tratamiento de 2 a 30 das. Es importante determinar la temperatura adecuada para cada especie vegetal, aun para variedades dentro de la misma especie. En algunas especies, tales como Capsicum annun, avena y algunos genotipos de trigo se ha logrado xito con un choque con alta temperatura. Temperaturas de 30 - 35C durante los primeros 1 a 4 das del cultivo ayudaron a inducir la andrognesis en varias especies de gnero Brassica. f) La composicin del medio de cultivo: es otro de los factores importantes para el xito en el cultivo de anteras. No existe una recomendacin general y las variaciones dependen de la especie a cultivar.

aerbicas, permitiendo elevadas tasas de embriognesis y de produccin de plantas verdes. En cuanto a los reguladores de crecimiento, la mayora de los cereales requiere de la presencia de auxinas y de citocininas en el medio de cultivo y las respuestas parecen depender de los niveles endgenos de tales reguladores. Por ejemplo, para lograr la induccin en trigo es indispensable el uso de 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) en concentraciones de 1,5 a 2 mg/l. Existen otras sustancias que, adicionadas al medio de cultivo, ayudan en la estimulacin de la andrognesis, como la glutamina y el inositol. Tambin se citan otros compuestos inespecficos como extracto de papa, de batata, de mandioca, de trigo germinado y de endospermas de arroz y de maz. En ocasiones, si el medio se suple con leche de coco, los granos de polen desarrollan directamente en embrioides.

Medios de induccin : dos tipos de estrs, osmtico y nutricional, han sido identificados como causas disparadoras de la induccin de embriognesis en las micrsporas de mono y dicotiledneas. En tabaco, el cultivo de las anteras en un medio carente de sacarosa durante los primeros 6 das de la etapa de induccin permiti una mxima respuesta andrognica. Los carbohidratos cumplen dos roles fundamentales en los medios de induccin ya que actan como osmolito y como nutriente. Los agentes gelificantes representan otro aspecto importante en la evolucin de los medios de induccin. Tradicionalmente se utiliz agar como gelificante de los medios de cultivo, debido a su disponibilidad y bajo costo. Pero en 1973 se detect una mejor respuesta andrognica en tabaco cuando las anteras fueron cultivadas en un medio solidificado con agar y suplementado con carbn activado. En medios lquidos la adicin de Ficoll (polmero sinttico de sacarosa, inerte, no inico y de alto peso molecular) incrementa la tensin superficial y la viscosidad del medio. De esta manera, las anteras y callos flotan sobre el medio lquido y se desarrollan en condiciones 144

Medios de regeneracin: la variedad de medios de regeneracin citada es menor cuando se la compara con la de los medios de induccin. Los ms utilizados son modificaciones derivadas del medio MS, con concentraciones de carbohidratos similares a las utilizadas en los medios de cultivo de tejidos tradicionales (30gr/l de sacarosa), utilizando agar (0,6 %) como gelificante, auxinas menos poderosas, y un balance hormonal a favor de las citocininas.
g)Las condiciones de incubacin: las caractersticas ideales de cultivo son especficas para cada especie, y aun para cada genotipo dentro de una misma especie. Estas afectan particularmente la tasa de absorcin final de nutrientes y la regeneracin de plantas verdes. La duracin e intensidad lumnica, la temperatura y la orientacin de las anteras sobre el medio de cultivo pueden tener un efecto considerable en algunas especies.

y Cultivo de Micrsporas: comprende la obtencin de individuos haploides a partir de micrsporas aisladas. Las espigas son pretratadas y las micrsporas liberadas son colocadas en un medio de cultivo donde desarrollarn embriones haploides, que sern luego transferidos a un medio de regeneracin para originar plntulas (Fig. 5).

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Figura 5. El diagrama muestra las diferentes etapas del cultivo de anteras y de micrsporas aisladas. Para el cultivo de anteras, las etapas requeridas a partir de anteras hasta la obtencin de las plantas haploides pueden describirse como sigue: a) yema floral previo a la antesis, 1b) anteras, 1c) anteras en cultivo, 1d) y 1e) proliferacin de las anteras, 1f) callo haploide, 1g) diferenciacin de callo, h) planta haploide. Para el cultivo de micrsporas aisladas: a) yema floral previo a la antesis, 3b) micrsporas aisladas de una antera, 3c) cultivo de micrsporas, 3d) estado multinucleado, 3e) y 3f) embrin en desarrollo.

plantas en condiciones controladas de fotoperodo y temperatura es esencial y debe ser ajustado en funcin de la especie. Se han citado resultados en cebada cuando las plantas son cultivadas en ambientes libres de patgenos, con alta humedad relativa (60-80%), fotoperodo de 16 hs. de luz, y adecuado rgimen de fertilizacin y riego. Cuando las plantas crecen estresadas, sea por riego excesivo, sequa, enfermedades, o la aplicacin de algn plaguicida, la respuesta al cultivo de micrsporas es menor.

Este sistema es considerado el de mayor potencial para la produccin de doblehaploides, debido a que induce a los miles de micrsporas que contiene una flor a dividirse y producir embriones. La ausencia de la pared de la antera podra mejorar la nutricin y eliminar las restricciones fsicas para la andrognesis. El cultivo de micrsporas tiene la ventaja de originar embriones de similar tamao y etapa fisiolgica debido a que pueden separarse las micrsporas de tamaos semejantes por centrifugacin diferencial. La optimizacin de los diferentes pasos crticos para el xito de esta tcnica puede llevar a la obtencin de una alta cantidad de plantas verdes con menores costos y esfuerzos. Entre los factores determinantes de la eficiencia del mtodo podemos citar: (a) Genotipo: se han citado cultivares de cebada con una alta respuesta al cultivo de micrsporas, en contraste con otros menos respondedores. (b) Albinismo: al igual que en el cultivo de anteras el nmero de plantas albinas depende del genotipo, y tambin se ve influido por la densidad de cultivo de las micrsporas. (c) Condiciones de crecimiento de la planta donadora: el mantenimiento de las

(d) Estado: Como se citara anteriormente para el cultivo de anteras, es imprescindible el chequeo del estadio correcto para que conserven su capacidad androg-nica. (e) Pretratamientos: los pretratamientos ms utilizados consisten en el uso de fro, estrs osmtico, presencia o ausencia de determinados nutrientes, etc. Se ha demostrado que los nutrientes disponibles durante el pretratamiento constituyen un factor decisivo que determina la calidad de los embriones originados. (f) Densidad de cultivo: La densidad de las micrsporas en cultivo afecta el desarrollo de las mismas y el nmero que entrarn en divisin. Existe una concentracin mnima para el desarrollo de las micrsporas, y una densidad ptima para una mayor regeneracin. Las condiciones ms favorables deben ser ajustadas en cada caso y para cada genotipo en particular. (g) Medio de induccin: Se han estudiado diferentes concentraciones de azcares, distintas fuentes de nitrgeno orgnico, y la adicin de diferentes auxinas al medio. En general se sugiere la sustitucin de sacarosa por maltosa como fuente de carbohidratos, la disminucin de la concentracin de nitra-

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to de amonio, el agregado de glutamina, y el empleo de APA (cido fenil actico) como auxina para favorecer la induccin (Kasha y col. , 2001). (h) Medio de regeneracin: la composicin del medio de regeneracin puede afectar el vigor y supervivencia de las plntulas. Kasha et al. (2001), trabajando con cebada, encontraron en este mtodo una manera eficiente de produccin de DH, con una mejor respuesta y una menor dependencia del genotipo que en el caso del cultivo de anteras. A esto se le suma la ventaja de contar con una elevada cantidad de micrsporas haploides en un estado fisiolgico uniforme, que constituyen excelentes blancos para la mutagnesis, la seleccin y la transformacin. - Hibridacin interespecfica e intergenrica : en este caso los haploides se originan a travs de la eliminacin del genoma del polinizador. El sistema de hibridacin de trigo x Hordeum bulbosum, inicialmente descubierto y empleado con xito en cebada, ha sido considerado superior al cultivo de anteras por tres razones: (a) La produccin de haploides es ms fcil. (b) El tiempo requerido para la regeneracin de plantas es menor. (c) La eficiencia en la regeneracin de plantas parece ser mayor.

Figura 6. Produccin de haploides de Triticum aestivum por cruzamientos de trigo x maz (Zea mayz). A. Espigas de trigo cortadas en el campo y castradas en el laboratorio. B. Plantas de maz (donantes de polen) crecidas en invernculo. C. Desgrane de espigas para realizar la desinfeccin de los granos y posterior rescate de embriones. D. Grano con dos embriones haploides (poliembriona). E. Embriones inmaduros rescatados y creciendo in vitro. F. Planta rusticada. G y H. Plantas con 3-5 macollos con sus races sumergidas en solucin de colchicina para la duplicacin cromosmica. I. Plantas tratadas con colchicina y llevadas a macetas con tierra en cmara de crecimiento.

La gran limitante de este sistema lo constituye el hecho de que la mayora de los cultivares de trigo no pueden cruzarse con H. bulbosum debido a la presencia de los genes de incompatibilidad, Kr1 y Kr2, y al desconocimiento del estado de estos genes en los genotipos de trigo y de H. bulbosum involucrados en los cruzamientos, debido a que los genotipos se seleccionan sobre la base de criterios agronmicos y no a un sistema de compatibilidad de cruzamientos con H. bulbosum. Para sortear estos inconvenientes se ha sugerido como alternativa realizar

los cruzamientos, en el caso de trigo, utilizando maz como polinizador (Fig. 6). Luego de la fertilizacin del vulo de trigo por el polen de maz, durante las primeras mitosis del cigoto, los cromosomas del maz son eliminados. Esto se debe a una incompatibilidad entre los cinetocoros de estos cromosomas y las fibras de los husos acromticos que hace que en las primeras anafases los cromosomas de maz vayan quedando rezagados en el citoplasma, donde finalmente son degradados. El resultado de este proceso es un em-

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brin haploide de trigo. Seguidamente, los embriones inmaduros deben ser rescatados en un medio de cultivo apropiado. A travs de las cruzas con maz se han obtenido haploides de trigo de cultivares tanto compatibles como incompatibles con H. bulbosum, lo cual sugiere que el sistema de incompatibilidad no afecta al mtodo de trigo x maz, por lo que sera menos dependiente del genotipo. 4 Duplicacin cromosmica Despus de la duplicacin cromosmica, ya sea espontnea o inducida, se logra la homocigosis y se restaura la fertilidad. La planta haploide, sin duplicar, es estril por lo que no podra producir semillas. Entre las tcnicas que han sido utilizadas para la duplicacin de haploides cabe mencionar: (a) Duplicacin espontnea durante la etapa de callo o de rescate de embriones. (b) Regeneracin de plantas doblehaploides a partir de callos de mdula de plantas haploides de tabaco (Kasperbauer y Collins, 1972). (c) Sustancias qumicas: aunque se conocen casos mediante agentes qumicos tales como acenafteno, hidrato de cloral, sulfanilamida, etc., la mayor eficacia se ha logrado con la colchicina y el xido nitroso. La aplicacin del xido nitroso bajo presin (2-6 atmsferas) resulta de especial inters por su fcil penetracin en los tejidos y la rpida desaparicin de los mismos cuando cesa la presin. Puede utilizarse en flores recin polinizadas. La ventaja que presenta este tratamiento es que, al poder ser aplicado durante la primera divisin mittica del vulo fecundado, se ve reducida la aparicin de quimeras. Por otro lado, los residuos de este agente resultan menos txicos para la planta que otros que se aplican en forma lquida, aunque la frecuencia de aneuploides puede ser muy elevada. La accin de la colchicina fue descubierta en 1937 y desde entonces ha pasado a ser prcticamente el agente diploidizante ms importante Esta droga acta impidiendo el autoensamblaje de la tubulina, inhibiendo as la formacin de los microtbulos del huso y, en consecuencia, la

segregacin anafsica de las cromtides. Afecta por lo tanto slo a las clulas que se encuentran en divisin. Puede aplicarse a plntulas, plantas adultas, semillas, micrsporas y anteras. El tratamiento puede realizarse utilizando una solucin acuosa donde se sumergen las races, dejando fuera la parte area. Tambin se puede hacer llegar la solucin al interior de la planta utilizando una jeringa con la dosis deseada (microinyeccin), o por absorcin de la solucin a travs de los tallitos decapitados, sobre los que se vierte. Otra forma de hacerlo es tratar los callos con colchicina antes de trasladarlos al medio de regeneracin. Este ltimo mtodo permite la obtencin de gran nmero de doblehaploides, pero presenta la desventaja de que la mayora de las plantas as obtenidas son mosaicos cromosmicos. Otra alternativa, para micrsporas y anteras, es la adicin del agente duplicador directamente en el medio de induccin, antes de la primer mitosis. La diploidizacin en este momento requiere menos tiempo y esfuerzo y ha sido utilizada en programas de mejoramiento de trigo, maz, Tritordeum y arroz. El problema de la suplementacin del medio de induccin con colchicina es que reduce la embriognesis en trigo, si bien en Oryza sativa y Brassica la puede incrementar. La duracin del tratamiento y la concentracin de la solucin varan para cada especie. Cualquiera que sea el mtodo con que se duplique la planta, un macollo o slo una yema floral, lo importante es lograr que las semillas que stas produzcan sean viables. 5 Consideraciones finales La eleccin de los progenitores y la seleccin son etapas decisivas en un programa de mejoramiento que avanzar luego generacin tras generacin, hacia una homocigosis que permita entrar en las etapas de evaluacin. Ganar tiempo en estos casos puede significar una reduccin de costos muy importante y una ms temprana entrada en el mercado de la nueva variedad. En el caso de una especie autgama como el trigo es posible ganar generaciones haciendo dos cosechas en un ao, especialmente en aquellos cultivares de corto ciclo vegetativo. Esto, sin

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embargo, dificulta la observacin de algunas caractersticas agronmicas importantes, que no pueden ser observadas en los genotipos en esas condiciones, atentando contra una seleccin eficiente. Para los trigos de tipo invernal y facultativos, con ligeros requerimientos de vernalizacin, esta ganancia de generaciones no es posible o es difcil. La produccin de individuos doblehaploides que puedan participar anticipadamente en la etapa de evaluacin agronmica se plantea como una solucin promisoria a este problema, reduciendo los tiempos y presupuestos. Muchos interrogantes, sin embargo, quedan an sin resolver, limitando la aplicacin extensiva de esta tecnologa a algunos modernos programas de mejoramiento vegetal. Algunas preguntas a las que debemos encontrar respuestas son: En que generacin segregante se aplica el mtodo de doblehaploides? Cul es el nmero de individuos doblehaploides derivados de un cruzamiento, representativo de la variabilidad gamtica creada en la cruza, que permita un aprovechamiento integral, comparable al logrado con el mtodo convencional de seleccin a campo? Cmo superar la escasa cantidad de semilla producida? Es una tcnica alternativa, o complementaria del mejoramiento tradicional? La eficiencia en la produccin de doblehaploides justifica su alto costo dentro de un plan de mejoramiento? De acuerdo con Mujeb-Kazi (1998), las generaciones segregantes adecuadas para producir doblehaploides son la F2 y F3. Si eligiramos individuos F3, que ya cuentan con un ao de seleccin a campo durante la F2 generacin que ha mostrado la mayor varianza gentica entre los dos padres- estaramos evitando producir un gran nmero de plantas doblehaploides que no sern agronmicamente promisorias. No obstante, debemos considerar que seran necesarios varios cientos de individuos DH para que el proceso tenga posibilidades de xito agronmico. En general, la produccin de doblehaploides resulta en un gasto excesivo en com-

paracin a los mtodos tradicionales de mejoramiento, por lo cual en la mayora de los programas slo genotipos lite son sometidos a este sistema. Si bien el costo de produccin de los DH depende directamente del mtodo elegido y la eficiencia lograda, la aplicacin de esta metodologa al mejoramiento vegetal se vislumbra ms bien como una herramienta complementaria al mejoramiento tradicional, y que en ningn modo intentara reemplazarlo. 6 Lecturas Recomendadas
ATANASSOV, A.; ZAGORSKA, P.; BOYADJIEV, P.; DJILIANOV, D. 1995. In vitro production of haploid plants. World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 400408. BERNARD, S. 1980. In vitro androgenesis in hexaploid triticale: determination of physical conditions increasing embryoid and green plant production. Z. Pflazenzucht 85: 308-321. BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K. 1996. Haploid Production. En: Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulo 7. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier, Amsterdam. pp.167-213. KASHA, K.J.; SIMION, E.; ORO, R.; YAO, W.A.; HU, T.C.; CARLSON, A.R. 2001. An improved in vitro technique for isolated microspore culture of barley. Euphytica 120:379385. KASPERBAUER, M.; COLLINS, G. 1972. Reconstitution of diploids from leaf tissue of anther derived haploid in tobacco. Crop Sci. 12: 98-101. LACADENA, J.R. 1988. Variaciones cromosmicas numericas. En: Gentica, Captulo 15. Lacadena, J.R.(ed.) A.G.E.S.A., Madrid. pp. 683-719. SNAPE, J.; SIMPSON, E.; PARKER, B.; FRIEDT, W.; FOROUGHI-WHER, B. 1986. Criteria for the selection and use of doubled haploid systems in cereal breeding programmes. En: Genetic manipulation in plant breeding. Proc. Int. Symp. Eucarpia W. Horn, C. Jensen, W. Odenbach, O. Schieder (eds). W. De Gruyter, Berlin. pp. 217-229. WANG, C.; CHU, Z.; SUN, C.; CHI, C.; WU, W. 1978. Studies on the albino pollen plantlets of rice. En: Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Pekin Press, pp149-160.

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IV.-Captulo 2
Aplicaciones de los marcadores moleculares
Carrera, Alicia; Tranquilli, Gabriela; Helguera, Marcelo Las herramientas descriptas en II.-4 se utilizan en numerosas reas relacionadas con el mejoramiento vegetal y el anlisis de la biodiversidad. A continuacin se describen algunas de esas aplicaciones. Cada uno de estos campos posee una base terica en ocasiones compleja y muchos de ellos requieren del uso de programas de estadstica avanzada. De este modo, el presente captulo debe ser considerado como una introduccin a los temas considerados. 1 Identificacin de genotipos Pureza varietal El control de la pureza varietal y la discriminacin de variedades protegidas (es decir, registradas) requieren de una adecuada identificacin de los materiales. Esta identificacin se basa tradicionalmente en el uso de descriptores morfolgicos y fisiolgicos. En la mayora de los cultivos, la utilizacin de recursos genticos similares en diferentes programas de mejoramiento ha reducido la eficiencia de discriminacin por marcadores fenotpicos. Por otro lado, varios de los caracteres usados como descriptores presentan limitaciones en cuanto al nmero restringido de variantes, influencia ambiental y dependencia del estadio de desarrollo de planta. Como alternativa para resolver estos problemas, los polimorfismos moleculares de protenas y ADN resultan de utilidad en la determinacin de los criterios DUS (distincin, uniformidad y estabilidad). Se utilizan localmente como datos complementarios de los descriptores morfolgicos y fisiolgicos para el registro de los cultivares, en aquellos casos en que las diferencias entre materiales no son conspicuas. ISTA (International Seed Testing Association) y UPOV (Union Pour La Protection Des Obtenions Vegtales) son

entidades internacionales que han desarrollado protocolos para estandarizar los anlisis de laboratorio para identificacin de cultivares y reglamentar la utilizacin de diferencias moleculares en el control de la pureza varietal, la discriminacin de variedades protegidas y en el otorgamiento de nuevas patentes. Con el objeto de evitar el registro de variedades esencialmente equivalentes, UPOV ha establecido umbrales mnimos de diferencias moleculares sobre la base de distancias genticas obtenidas a partir de caracteres tradicionales. En la actualidad se dispone de patrones moleculares varietales para una extensa lista de especies. Como ejemplo podemos mencionar al trigo pan (Triticum aestivum L.), para el que se desarroll una matriz de identificacin varietal sobre la base de marcadores microsatlites de ADN, que permite la individualizacin de variedades argentinas. (Manifesto y col., 1998). A partir de datos moleculares es posible obtener distintos ndices de distancia gentica y generar esquemas ramificados o dendrogramas, que ponen en evidencia la similitud gentica de los materiales (Ver VI.1). La pureza varietal es uno de los principales requisitos de la semilla comercial. En la produccin de semilla hbrida la heterogeneidad intralote puede originarse por falta de uniformidad en las lneas parentales, polinizacin cruzada espontnea o mezcla de semillas durante la cosecha o embolsado. Los individuos fuera de tipo pueden identificarse mediante el patrn molecular. Del mismo modo pueden establecerse las relaciones de descendencia entre una serie de lneas parentales y sus hbridos. Se ha observado que an despus de 5-6 generaciones de autofecundacin, una lnea puede no haber alcanzado completa uniformidad para ciertos marcadores moleculares. Esto puede interpretarse como una porcin residual del genoma que permanece segregando. Cuando la evaluacin de estos lotes muestra uniformidad morfolgica, fisiolgica y de caracteres agronmicos, pueden aceptarse ciertos niveles de variacin molecular sin expresin fenotpica evidente. El mejorador considerar en cada caso los niveles mximos de variacin admisibles. Sin embargo, la ocurrencia de polimorfismos moleculares

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intravarietales puede representar una limitante para el uso de marcadores como descriptores complementarios en la inscripcin de nuevos cultivares. 2 Uso en bancos de germoplasma Las prcticas de la agricultura moderna han generado una prdida de diversidad en la mayora de las especies cultivadas. El reemplazo paulatino de las variedades primitivas por los cultivares hbridos de indudables ventajas econmicas ha producido una reduccin en el nmero de genotipos que se cultivan. La erosin gentica puede tener graves consecuencias para el cultivo, principalmente en relacin a su vulnerabilidad sanitaria. Este proceso puede ser atenuado mediante la creacin de bancos de germoplasma, que constituyen un componente vital de los programas de mejora. Las colecciones pueden mantenerse como bancos de semilla, a campo o in vitro. Los recursos genticos de una especie cultivada comprenden i) cultivares antiguos y de reciente obtencin ii) poblaciones locales mantenidas por los productores, landraces iii) poblaciones silvestres de la misma especie o formas maleza y iv) especies relacionadas. Los marcadores moleculares permiten caracterizar las accesiones o muestras a ser incluidas en las colecciones, estudiar el proceso de domesticacin, establecer relaciones filogenticas y colaborar en la eleccin de las estrategias de conservacin. El procedimiento consiste bsicamente en analizar los materiales mediante marcadores proteicos o de ADN y calcular medidas de diversidad (nivel de polimorfismo, riqueza allica, presencia de alelos nicos) y de similitud gentica. Esta informacin luego se complementa con datos geogrficos (procedencia de las accesiones, distribucin), pedigr y datos histricos de obtencin. La informacin generada por los marcadores resulta de inmediata aplicacin en los procesos de acopio (dnde colectar, qu intercambios realizar), conservacin (identificacin de duplicados en las colecciones, monitoreo de los cambios en la composicin gentica que puedan ocurrir durante la multiplicacin o conservacin de los materiales), caracterizacin (diversidad gentica de la co-

leccin) y distribucin eficiente de los recursos genticos hacia los usuarios. Veamos algunos ejemplos. En casos como el girasol (Helianthus annuus), el anlisis de diversidad molecular ha demostrado que el proceso de domesticacin ha reducido considerablemente la base gentica de los materiales cultivados con relacin a las poblaciones silvestres. Por el contrario, en poroto (Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea europea), las formas cultivadas conservan gran parte de la variabilidad presente en las poblaciones de los centros de origen en Amrica y Europa, respectivamente. La comparacin entre los materiales silvestres y cultivados de una especie permite adems identificar los lugares de origen del cultivo, conocidos como centros de domesticacin. Una vez que los recursos genticos disponibles han sido caracterizados, es posible decidir cules seran los cruzamientos que ms contribuiran a la expansin de la base gentica. Frecuentemente, limitaciones en cuanto a espacio fsico y presupuesto, hacen que los centros nacionales e internacionales de recursos genticos deban restringir el nmero de entradas a conservar en el banco de germoplasma. La informacin reunida a partir de datos moleculares y morfolgicos puede contribuir a establecer una coleccin ncleo o representativa de la variabilidad total. Esta coleccin central debera incluir los caracteres que estn presentes en numerosas accesiones o comunes, pero tambin los denominados componentes raros y aquellos presentes en pocas accesiones de manera bastante frecuente. La mayor parte de los polimorfismos moleculares carecen de expresin fenotpica y son selectivamente neutros, siendo la deriva gnica el proceso ms importante para el cambio de frecuencia en las poblaciones. Una gran parte de ellos se encuentran en regiones no codificantes del genoma. En contraste, los genes que codifican los rasgos morfolgicos poseen un fuerte efecto fenotpico y han estado sometidos a intensas presiones de seleccin en las distintas etapas del mejoramiento; podran, por lo tanto, constituir una muestra de genes atpica con respecto a la mayora de genes de una especie. Estos caracteres representan grupos de genes sometidos a diferentes fuer-

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zas de seleccin a lo largo del proceso de domesticacin. Los marcadores moleculares combinados con datos morfolgicos, agronmicos y de origen, conforman una base de datos integral que permite describir la variacin gentica en colecciones de germoplasma. 3 Mapeo gentico Un mapa gentico de una especie animal o vegetal muestra la distribucin linear de un grupo de genes y marcadores en cada uno de los cromosomas que constituyen el genoma de un organismo. Este mapa esta basado en el concepto clsico de ligamiento: si dos o ms genes o marcadores estn fsicamente cercanos sobre el mismo cromosoma, sus alelos se heredan usualmente juntos a travs de la meiosis. Las proporciones en que estos genes segregan en una poblacin se apartan de las esperadas bajo la ley de Mendel de segregacin independiente. La mayor parte de los gametos contendrn las mismas combinaciones allicas que los padres; slo aquellos meiocitos que experimenten un intercambio entre cromtides no hermanas o crossover generarn gametos con combinaciones allicas diferentes de las parentales (recombinantes). El fundamento del mapeo gentico reside en la relacin directa entre la frecuencia de recombinacin y la distancia fsica entre los loci. Es as como determinando la frecuencia de recombinacin entre dos genes, uno puede estimar la distancia de mapa entre los mismos, siendo la unidad de mapeo equivalente a una frecuencia de recombinacin del 1%. Usualmente esta distancia se expresa en centimorgan (cM). La relacin entre frecuencia de recombinacin y distancia fsica es distorsionada por factores tales como la distribucin no al azar de los entrecruzamientos, las diferencias entre organismos, la presencia de hot spots o sitios de alta frecuencia de recombinacin y la evidencia de control gentico de la recombinacin. No obstante, el uso de la intensidad de ligamiento como estimador de la distancia gentica genera un modelo de la disposicin linear de genes y marcadores de gran utilidad en mltiples reas del estudio genmico.

Recordemos que el grado de recombinacin gentica (r), tambin conocido como fraccin de recombinacin, es la proporcin de gametos recombinantes, nr sobre el total de gametos. r = nr / n Para tres loci, ABC, ligados en ese orden, las fracciones de recombinacin entre los tres se relacionan a travs de la siguiente expresin: rAC = rAB + rBC 2C rAB rBC donde 2rAB rBC representa la frecuencia esperada de entrecruzamientos dobles y C, el coeficiente de coincidencia, una medida de la independencia con la que ocurren quiasmas (entrecruzamientos) en regiones cercanas. La fraccin de recombinacin no es aditiva a lo largo del cromosoma y la desviacin respecto de la aditividad aumenta con la distancia entre los loci. De este modo se han desarrollado funciones de mapa tales como Haldane o Kosambi que tornan aditiva la fraccin de recombinacin. Funcin de Haldane : m = - 0.5ln (1-2r), donde m representa unidades de mapa gentico. Si un marcador resulta estar genticamente ligado a un gen que controla un carcter de inters agronmico, la seleccin de este marcador resulta en la seleccin indirecta del gen de inters. Este hecho constituye el fundamento del proceso denominado seleccin asistida por marcadores moleculares, aplicado en el mejoramiento gentico vegetal y animal (ver seccin correspondiente en este captulo). La eficiencia del proceso de seleccin indirecta basado en la cosegregacin del marcador y del gen, es una funcin de distancia, expresada como la probabilidad de recombinacin gentica entre el marcador y el gen; por lo tanto, cuanto ms prximos estn el marcador y el gen en cuestin, ms eficiente ser la seleccin. Este anlisis puede aplicarse tanto en caracteres cualitativos como cuantitativos. La diferencia entre un carcter cuantitativo y uno cualitativo se basa en la magnificacin del

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efecto de sustitucin de un alelo por otro en un determinado locus (Falconer, 1988). Si el efecto de la sustitucin allica sobre la variacin fenotpica total del carcter es pequeo, se considera el carcter como cuantitativo o QTL (quantitative trait loci). Si el efecto de la sustitucin de un alelo por otro es grande en relacin con la variacin fenotpica total, el carcter es cualitativo (genes de herencia simple). En general, la mayora de los caracteres de importancia econmica y/o agronmica, principalmente aquellos relacionados con la productividad, poseen herencia cuantitativa o fenotipos complejos. Para incorporar un carcter de inters agronmico en un mapa gentico es necesario cumplir con una serie de premisas: 1- Desarrollar una poblacin segregante para el carcter agronmico en cuestin. 2- Caracterizar la poblacin segregante utilizando marcadores moleculares polimrficos (con diferencias en la secuencia de ADN entre los parentales). Para construir un mapa mnimo es deseable disponer de al menos cuatro marcadores moleculares por cada cromosoma del genoma en estudio. Cuanto mayor sea el nmero de marcadores incorporados al mapa, mayor ser su resolucin y la probabilidad de identificar algn marcador ligado al carcter agronmico de inters. 3- Evaluar fenotpicamente el carcter agronmico, sobre los individuos de la poblacin segregante. Este punto es crucial, ya que si la evaluacin del carcter en la poblacin de mapeo no es clara, es imposible incorporarlo al mapa gentico. 4- Identificar marcadores ligados al carcter agronmico (cosegregacin entre fenotipo del carcter y fenotipo del marcador). Para esta instancia, al igual que para la construccin del mapa gentico, se pueden utilizar herramientas informticas especficas tales como los programas Mapmaker, MapmakerQTL, Genemap, etctera. Cuanto mayor sea la distancia gentica entre los parentales que darn origen a la poblacin de mapeo, mayor ser la probabilidad de detectar marcadores polimrficos, que es un punto crtico para identificar marcadores ligados al carcter en estudio.

En el contexto del mejoramiento vegetal los mapas genticos posibilitan: ~ La cobertura y anlisis de genomas completos ~ La descomposicin de caracteres genticos complejos (QTL) en componentes mendelianos ~ La localizacin de regiones genmicas que controlan caracteres de importancia agronmica ~ La cuantificacin del efecto de estas regiones en la caracterstica estudiada ~ La canalizacin de esta informacin en programas de mejoramiento La construccin de un mapa gentico genera informacin bsica sobre la estructura y organizacin de un genoma tal como reordenamientos cromosmicos (inversiones, translocaciones, duplicaciones) e identificacin de regiones con alta densidad de genes. Por otro lado un mapa gentico constituye el punto de partida para proyectos de clonado posicional de genes (ver seccin 6 de este captulo). 4 Seleccin asistida por marcadores El advenimiento de nuevas tcnicas moleculares ha facilitado el anlisis gentico de caracteres de inters agronmico y la seleccin asistida por marcadores moleculares. Un argumento frecuentemente utilizado en contra de la seleccin asistida por marcadores es que el mejoramiento de caracteres de herencia simple no necesita de marcadores para seleccin si los fenotipos son fcilmente identificables. Si bien esto es correcto, en estos casos, la utilizacin de marcadores en un programa de mejoramiento puede aportar una ventaja muy importante basada en su naturaleza molecular y es que la seleccin se independiza del fenotipo y el ambiente. Estas caractersticas permiten identificar rpidamente genotipos nicos en poblaciones segregantes e incorporar varios genes de inters en un fondo gentico, proceso tambin denominado piramidizacin o apilamiento de genes. Los ejemplos ms claros para ilustrar la utilidad de la seleccin asistida por marcadores moleculares en la piramidizacin de genes se observan en los casos en que interacciones

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gnicas como la epistasis (efectos de ciertos genes sobre la funcin de otros) enmascaran la presencia de un gen, dificultando su seguimiento mediante el fenotipo. Esta situacin se presenta con los genes de resistencia a enfermedades, cuando se desea sumar en un genotipo resistente a una determinada enfermedad otros genes de resistencia al mismo patgeno, como estrategia de resistencia durable. Otro impacto de la seleccin asistida por marcadores moleculares es el menor tamao de las progenies mantenidas en un programa. Con la seleccin asistida, el nmero de generaciones necesarias para la estabilizacin de los genotipos es menor, ya que la heredabilidad de los caracteres es prxima a 100%, aumentando la ganancia gentica. Tambin es posible incrementar la velocidad de un programa de mejoramiento, ya que al independizarse la seleccin del ambiente y de la expresin del fenotipo, se logra adelantar el nmero de generaciones por ao.

En la Figura 1 se representa un programa de retrocruzas asistida por marcadores moleculares como ejemplo de la utilizacin de esta herramienta en el mejoramiento vegetal. La utilidad potencial que los marcadores moleculares presentan en el proceso de mejoramiento gentico resulta clara. Sin embargo, a pesar de ello, el uso actual de estas herramientas en algunos casos es limitado. Diversos son los factores que determinan esta situacin. Por un lado podramos considerar los de orden tcnico y por otro los de ndole econmico. Dentro de los primeros, adems de lo mencionado en prrafos anteriores respecto de la necesidad de contar con el mapa gentico, con alta resolucin y de una poblacin segregante, debemos tener en cuenta el paso siguiente que es la validacin de los marcadores que se identifiquen como promisorios para el seguimiento de caracteres de inters, es decir, la confirmacin de determinados marcadores como herramien-

Figura 1. Esquema de un programa de retrocruzas, asistido por un marcador especfico para el gen de resistencia a roya de la hoja del trigo Lr47. Pavon: variedad donora de la fuente de resistencia. PI Gaucho: variedad susceptible recurrente. BC: generacin de retrocruza.

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ta efectiva de seguimiento o seleccin de un gen particular. La validacin es un aspecto fundamental previo a la implementacin de estas herramientas en programas de mejoramiento, y su importancia reside en que la mayora de los marcadores disponibles hasta el momento derivan de regiones del genoma que, como ya fuera indicado, son neutras y en que la asociacin con caracteres de inters est determinada por ligamiento gentico en la poblacin evaluada. Dado que ese ligamiento puede no mantenerse en otro germoplasma, es necesario confirmar en los materiales de mejoramiento que el carcter deseado est determinado por gen/es presentes en el locus marcado. Desde este punto de vista, el mejor marcador es aquel que reconoce sitios polimrficos que estando dentro del gen son los determinantes de la variacin fenotpica observada. Estos marcadores, tambin llamados diagnstico o funcionales, pueden ser usados en forma confiable en poblaciones en los que no se hayan mapeado previamente, sin correr el riesgo de que la informacin de inters se pierda por recombinacin. (Andersen y Lbberstedt, 2003). Como ejemplo podemos mencionar al marcador desarrollado para el gen denominado Pinb-D1. Este gen codifica para una de las protenas relacionada con textura de grano en trigo y se ha observado que la mutacin de una base especfica dentro de su secuencia implica el cambio de un aminocido (de glicina a serina) en la protena codificada y que esto es suficiente para determinar un mayor grado de dureza de grano. Para este gen, se ha desarrollado un marcador cuyo polimorfismo esta dado por dicha mutacin, y esto asegura que su uso sea vlido para identificar la presencia de esta caracterstica, sea en poblaciones de mejoramiento como en la caracterizacin de germoplasma. Sin dudas, la disponibilidad de marcadores diagnstico aumentar progresivamente a partir de nuevos conocimientos que surjan de los proyectos genmicos emprendidos en diversos cultivos de inters econmico. Dentro de los factores de ndole econmico, la limitante en la adopcin de esta tecnologa ha sido la relacin entre el costo de la misma y el valor comercial de la semilla mejorada. En los programas de mejoramien-

to de aquellas especies donde el material de cultivo es hbrido, en general se observa mayor uso de seleccin asistida por marcadores moleculares. Es esperable que esta tendencia se modifique con el tiempo, ya que el permanente avance tecnolgico ha permitido simplificar las metodologas a aplicar, por ejemplo, sustituyendo marcadores basados en hibridacin (RFLP, por ejemplo) por marcadores basados en amplificacin (RAPD, AFLP), reduciendo costos y tambin aumentando la eficiencia en el proceso de seleccin. 5 Mapeo comparativo La comparacin de mapas de ligamiento entre diferentes especies se denomina mapeo comparativo. Si un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y sus relaciones de ligamiento entre dos especies se dice que son colineares o que muestran sintenia. Los mapas comparativos en vegetales comenzaron a realizarse a partir del desarrollo de los marcadores RFLP y de la posibilidad de obtener hibridacin entre las secuencias de ADN utilizadas como sondas con genomas distintos a los utilizados para la obtencin de las mismas. Es decir, a partir de los RFLP fue posible identificar sitios comunes en distintas especies que servan como puntos de referencia para la comparacin de sus genomas. Es as que los mapas comparativos dieron las primeras evidencias de que el ligamiento de grupos de genes podra haberse conservado a travs de largos perodos evolutivos. Estudios en diversos grupos taxonmicos han revelado una estrecha relacin entre los genomas de las especies comprendidas dentro de cada grupo. Esto se ha observado, por ejemplo, entre especies pertenecientes a las Solanceas (tomate, papa, pimiento), entre Arabidopsis y cultivos del gnero Brassica, y dentro de las gramneas entre especies pertenecientes a la tribu Triticeas (trigo, cebada, centeno) as como entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonmicas, tal el caso de arroz, maz y sorgo. Es importante sealar que los tamaos de los genomas de las especies comparadas, en general, son significativamente diferentes. Sin embargo, a pesar de esa gran variacin en el tamao del genoma, el orden

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linear de los genes se encuentra altamente conservado. La utilidad de los mapas comparativos puede apreciarse desde distintos puntos de vista. Por un lado, aportan informacin muy valiosa para conocer los cambios producidos en la estructura cromosmica (inversiones, translocaciones, duplicaciones, deleciones) durante el proceso evolutivo que lleva a la diferenciacin de especies a partir de un antecesor comn, as como tambin permiten evaluar niveles de ploida. Por ejemplo, a partir de la comparacin de mapas moleculares, ciertas especies consideradas inicialmente diploides han modificado su estatus. Sobre la base de estudios citogenticos, el maz posee un comportamiento meitico que corresponde al de una especie diploide tpica. Sin embargo, numerosos loci RFLP de arroz estn representados dos veces en el genoma de maz por lo que actualmente se considera que el maz desciende de un poliploide ancestral. Por otro lado, los mapas comparativos posibilitan la transferencia de informacin entre especies con genomas simples y bien caracterizados, tales como Arabidopsis y arroz, a especies con genomas ms complejos tales como trigo, cebada y avena. Este ha sido tal vez el objetivo principal para impulsar el desarrollo de estos mapas. Las notables similitudes observadas entre genomas fue la base sobre la que se postul el uso de especies modelos, como arroz o Arabidopsis, a partir de las cuales estudiar y avanzar en el conocimiento de genomas ms complejos. Asimismo, partiendo del supuesto de que los genes que gobiernan aspectos fundamentales de la biologa vegetal muy probablemente estn conservados entre distintas especies, y el hecho de que la variacin en el tamao de los genomas de especies relacionadas se debe fundamentalmente a variacin en la cantidad de ADN no codificante y no a una variacin en el nmero de genes, la idea de llegar a la identificacin, clonado y estudio de genes en las especies modelo se vio fortalecida. De este modo la informacin generada podra hacerse extensiva a una amplia gama de especies, incluyendo las cultivadas, facilitando as el estudio en estos organismos.

6 Clonado posicional El clonado posicional de un gen es un claro ejemplo de la utilizacin de informacin gentica (disposicin espacial de genes), molecular (secuencia nucleotdica de genes) y del funcionamiento ( expresin de los genes) de un genoma (conjunto de genes) para identificar al gen responsable de un carcter particular. El primer paso para lograr esto es seleccionar parentales que sean contrastantes para el gen en cuestin; por ejemplo, una variedad de trigo susceptible y otra resistente a la roya de la hoja, para desarrollar una poblacin de mapeo segregante para el gen de resistencia (Stein y col., 2000). Una vez seleccionados los parentales se desarrolla una poblacin segregante para el carcter, la ms sencilla es una F2. Posteriormente, se caracteriza esta poblacin utilizando marcadores moleculares (microsatlites, RFLP, AFLP, RAPD) que cubran todo el genoma del organismo en estudio (en este caso trigo). El siguiente paso es determinar el fenotipo de los individuos que constituyen la poblacin de mapeo (en este caso plantas resistentes o susceptibles a roya de la hoja). Una vez obtenida la informacin fenotpica y molecular de la poblacin de mapeo, con la ayuda de programas especficos de computacin (por ejemplo, Mapmaker QTL), se identificarn marcadores ligados genticamente al carcter en una regin especfica del genoma. Una vez identificada la regin cromosmica portadora del gen responsable del carcter, se satura dicha regin con nuevos marcadores moleculares. El objetivo es delimitar el intervalo del genoma al fragmento mnimo posible que contenga al gen de inters. Muchos de estos marcadores pueden obtenerse del mapeo comparativo, identificando las regiones cromosmicas colineares de las especies ms estudiadas, por ejemplo en plantas, arroz, Arabidopsis, maz, sorgo, tabaco, etctera. Una vez reducido al mnimo el intervalo de genoma portador del gen de inters, el paso siguiente es obtener la secuencia nucleotdica del mismo. Una forma de hacerlo es mediante una caminata cromosmica.

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La caminata se inicia seleccionando clones de una genoteca de trigo (BAC library, Ver Captulo II.-3) con los marcadores que flanquean al intervalo portador del gen. Los dos grupos de BAC (uno para cada marcador) son digeridos con enzimas de restriccin para identificar en cada grupo fragmentos compartidos y no compartidos. Se estima que, en cada grupo los BAC seleccionados deben tener en comn al menos un fragmento de digestin (el fragmento que posee la secuencia del marcador). Los fragmentos no compartidos corresponden a los extremos de estos BAC parcialmente solapados entre s. Estos extremos se utilizan como nuevos marcadores para extender la caminata cromosmica en ambos sentidos. Este proceso se hace simultneamente con ambos grupos de BAC hasta que se superpongan y se forme un continuo o contig de BAC. Este contig contiene la secuencia del gen en estudio. El paso siguiente consiste en la secuenciacin del contig. A partir de esta informacin, y por anlisis de secuencia, se determinan los genes presentes, posibles candidatos del carcter en estudio. La prueba definitiva para establecer el hallazgo del gen en cuestin es la prueba de complementacin. Esto consiste en transformar una planta que carece del carcter en estudio (por ejemplo es susceptible a un patgeno) con cada uno de los genes candidatos y determinar cul de ellos le confiere el carcter (en este caso resistencia al patgeno). En algunos genomas (por ejemplo, arroz), la regin cromosmica colinear a trigo puede estar secuenciada, y a partir de esta informacin se puede tener una primera estimacin del nmero de genes candidatos para la resistencia al patgeno en la regin cromosmica homloga a trigo en arroz. En el caso del trigo pan, que posee un genoma extremadamente grande (16000Mb/ genoma haploide) es crtico obtener un intervalo genmico lo ms pequeo posible, ya que si bien posee aproximadamente el mismo nmero de genes que arroz, su genoma haploide es diez veces mayor, y la diferencia est constituida principalmente por ADN repetitivo no codificante que dificulta el clonado posicional. Como ejemplo, para el clonado posicional del gen Vrn-1 que controla el momento de floracin del trigo

se utiliz una poblacin de trigo diploide (Triticum monococcum) de 3095 individuos F2, para llegar a delimitar un intervalo de 0.03 cM que contena dos genes candidatos para Vrn-1 (Yan et al. 2003). Esta regin present una densidad de genes de uno cada 70000 pares de bases, la mitad del valor promedio de fragmentos contenidos en un BAC. 7 Distribucin de la variabilidad gentica en poblaciones naturales Las especies estn constituidas por unidades o demos ms o menos aislados denominados poblaciones. Una especie vegetal raramente se extiende en forma continua e ininterrumpida. En general adopta una distribucin en parches. El nmero de individuos en cada poblacin, el modo reproductivo (autogamia-alogamia), las distancias inter-demos, el tipo de polinizacin (gravedad-anemfila-entomfila), la accin del hombre en la fragmentacin del hbitat y el origen histrico (especies nativas-especies introducidas) determinan en conjunto una distribucin de la variacin gentica propia de cada especie. Los programas de conservacin utilizan a menudo informacin acerca de la distribucin de la variacin gentica para establecer prioridades y estrategias de manejo. El estudio de los componentes de la variacin dentro y entre poblaciones colaboran en la definicin de las unidades a conservar y se convierten en elementos importantes para la toma de decisiones relacionadas con la proteccin de la biodiversidad. Es deseable que las poblaciones seleccionadas para formar parte de las reas protegidas, contengan la mayor diversidad gentica posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo. A partir de marcadores codominantes como las isoenzimas pueden ser obtenidos parmetros de diversidad: P: nmero de loci polimrficos/nmero total de loci analizados. A: nmero promedio de alelos por locus He: heterocigocidad esperada promedio (1- fi2, fi : frecuencia allica) Ho: heterocigocidad observada Tambin se calculan coeficientes de endogamia (F) a partir de la heterocigocidad observada y esperada, e ndices de simili-

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tud (I) o distancia gentica (D) que cuantifican la semejanza o diferencia gentica entre poblaciones a partir de las frecuencias allicas (Ver VI.-1 ). La diversidad gentica cuantificada por marcadores moleculares puede mostrar por ejemplo, que en una especie nativa de inters forestal todas las poblaciones presentan altos niveles de variabilidad gentica y son bastante similares entre s. En este caso la decisin de cules poblaciones formarn parte del programa de conservacin podra basarse en consideraciones exclusivamente prcticas ya que las poblaciones son genticamente equivalentes. Por el contrario, una especie compuesta de poblaciones con niveles bajos de variabilidad en cada unidad pero con alto grado de diferenciacin entre poblaciones, requerir que los esfuerzos de proteccin sean dirigidos hacia tantas poblaciones como sea posible, ya que cada una de ellas posee una identidad gentica diferente. Poblaciones de especies endmicas, con niveles de diversidad gentica extremadamente bajos y un reducido nmero de individuos, son normalmente ingresadas a la categora de especies en peligro de extincin. En este punto, es importante recordar que los marcadores moleculares representan variacin gentica esencialmente neutra, es decir se encuentran sometidos a la accin de fuerzas evolutivas no selectivas tales como deriva o flujo gnico. Las decisiones finales de un programa de conservacin deberan por lo tanto combinar los datos obtenidos a partir de marcadores moleculares junto con la evaluacin de ciertos rasgos morfolgicos, fisiolgicos o reproductivos, que son crticos en el proceso de adaptacin y supervivencia de las poblaciones en su hbitat. El conocimiento de los componentes de variacin entre y dentro de las poblaciones naturales puede utilizarse adems en situaciones de repoblamiento, es decir, la introduccin de individuos en reas en proceso de declinacin. De acuerdo a la informacin obtenida por la caracterizacin molecular, es posible seleccionar la las poblaciones donadoras sobre la base de la similitud gentica con la receptora, de modo de evitar los efectos indeseables de la depresin por exogamia. Las malezas de mayor impacto en la agri-

cultura mundial son en general especies introducidas. En el nuevo territorio, libre de presiones selectivas tales como especies competidoras o patgenos caractersticas del ecosistema de origen, la especie introducida es capaces de establecerse y colonizar todos los territorios que renan determinadas condiciones ambientales. La caracterizacin gentica de las poblaciones de malezas puede aportar informacin de utilidad en los programas de control. Mediante diferentes marcadores moleculares puede establecerse si las poblaciones actuales provienen de un solo evento de introduccin, con unos pocos individuos iniciales o por el contrario, ocurrieron mltiples eventos de introduccin. Adems, determinados marcadores informativos pueden establecer con bastante precisin cul es el lugar de origen de las poblaciones introducidas, y en este caso rastrear enemigos naturales que pudieran ser tiles como control biolgico de la especie invasora. Del mismo modo puede ser analizada la variabilidad gentica de patgenos o parsitos vegetales tales como razas de royas, virus, nematodos, etc. y a partir de esta informacin disear programas de control ms eficaces. El tipo de reproduccin de una especie vegetal determina en gran parte la distribucin de variabilidad gentica entre poblaciones. Los mecanismos reproductivos pueden clasificarse en los tres tipos bsicos: alogamia, autofecundacin y apomixis (ver Captulo VIII.-3). En realidad existen combinaciones de estos tipos bsicos, con porcentajes variables de cada uno de ellos, segn las especies, y aun dentro de las poblaciones, con formas obligadas o facultativas. El estudio de marcadores moleculares en diferentes plantas de una poblacin y su progenie ha contribuido a determinar el tipo de reproduccin de numerosas especies vegetales. 8 Estimacin del flujo gnico El flujo gnico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. La morfologa de semilla y polen, los mecanismos de dispersin, el tipo de polinizacin, etc., hacen que la contribucin de estas dos vas al flujo total vare de acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares

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permiten cuantificar cada uno de estos procesos. Si el flujo gnico se produce bsicamente a travs de polen, los marcadores de ADN de organelas, como por ejemplo cloroplastos, no sern transferidos de una poblacin a otra porque este tipo de informacin es slo heredada por va materna. En contraste, si el flujo gnico se realiza principalmente a travs de semillas, tanto los marcadores de herencia materna como los de herencia biparental o nuclear, sern transmitidos entre poblaciones. Mediante el uso de marcadores altamente polimrficos como los microsatlites es posible determinar cul ha sido la planta donadora del polen de cada semilla por ejemplo, en especies arbreas. En este caso, por un lado se obtiene informacin acerca de la distancia de transporte de polen y adems constituye un test de paternidad. La estimacin del flujo gnico ha cobrado especial relevancia en los estudios tendientes a evaluar el efecto sobre el ambiente de los materiales genticamente modificados. Dicho efecto comprende diferentes facetas. Por un lado la posibilidad de que poblaciones silvestres cercanas a las formas cultivadas, adquieran el transgen mediante fecundacin cruzada, generando cambios en la dinmica poblacional, competitividad o relacin con otro miembros de la comunidad bitica tales como polinizadores, patgenos, etc.. Esta potencial transferencia de genes se torna preocupante cuando se trata de flujo gnico hacia poblaciones silvestres catalogadas como malezas. En este escenario los marcadores moleculares de ADN o isoenzimas constituyen herramientas muy tiles. Los individuos de una determinada poblacin pueden ser analizados y comparados con su progenie, producto de una polinizacin libre. Los alelos que no estaban presentes en la poblacin materna son atribuidos al ingreso externo de polen del cultivo. Evaluando poblaciones a distancias crecientes desde una determinada fuente de polen, el flujo gnico puede ser cuantificado, y cuando esta informacin se complementa con datos de compatibilidad sexual, polinizadores y clima se arriba a una serie de conclusiones que pueden aplicarse al cultivo en gran escala de variedades transgnicas. A modo de ejemplo, con el objeto de estable-

cer el riesgo ambiental de la liberacin de girasol genticamente modificado en la Argentina, se est realizando un estudio que comprende el relevamiento de las especies silvestres del gnero Helianthus, su distribucin y el grado de intercambio gentico en las zonas de contacto cultivo-silvestre (Ver IX.2). Se trate de variedades transgnicas o no, los procesos de hibridacin de formas cultivadas de base gentica estrecha con silvestres alteran los niveles de diversidad gentica de las poblaciones naturales, produciendo una erosin de los recursos genticos vegetales, con potencial aplicacin en mejora. Nuevamente la estimacin del flujo gnico y la determinacin de la variabilidad gentica mediante marcadores pueden contribuir a atenuar los procesos de homogenizacin gentica y dar tiempo a la evaluacin de las poblaciones naturales en cuanto a rasgos como resistencia a enfermedades o parmetros de calidad. 9 Filogenia La filogenia intenta reconstruir las relaciones jerrquicas de descendencia entre especies o grupos de especies y utiliza esta informacin como criterio de clasificacin biolgica. El conocimiento de la filogenia y diversidad gentica de los recursos silvestres permite optimizar los procesos de hibridacin con los materiales cultivados. Cultivos importantes como trigo, girasol, tomate, poroto, arroz cuentan con numerosas especies y gneros silvestres relacionados, con potencial uso en el mejoramiento gentico mediante cruzamientos. Los marcadores RFLP son particularmente tiles dado que estn basados en reacciones de hibridizacin, lo que garantiza la homologa de los segmentos que se comparan entre los diferentes taxa. RAPD no requiere un conocimiento previo del genoma en estudio y puede ser aplicado a diferentes especies pero la interpretacin de los datos parte de asumir que los productos de amplificacin de iguales tamaos son homlogos. El procedimiento consiste bsicamente en calcular un ndice de distancia gentica sobre la base del nmero de bandas en comn y luego realizar un anlisis de agrupa-

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miento (UPGMA) o rbol filogentico (Neighbour Joining), que refleje las relaciones entre los taxa. Establecer cul es el rbol correcto entre todos los posibles es una tarea difcil que en parte es resuelta mediante el uso de mtodos estadsticos, como tcnicas de re-muestreo, que generan ndices de consistencia o confiabilidad para cada rbol. Las relaciones establecidas de este modo se comparan luego con vas filogenticas propuestas a partir de datos citogenticos, morfolgicos, ecolgicos, cruzamientos, etctera. Los polimorfismos en los fragmentos de restriccin de ADN de cloroplasto resultan tiles para establecer relaciones filogenticas en el mbito de familias y gneros debido a su tasa de evolucin ms lenta y a su modo de herencia uniparental. Para los niveles de especie e infraespecficos es conveniente complementar con marcadores de origen nuclear, entre los cuales las sondas para ARN ribosmico 45S y ADNc son frecuentemente usadas. El mapeo comparativo ha permitido conocer el tipo de reorganizacin genmica que ha operado durante el proceso de especiacin. Cuando se compara el orden de los marcadores moleculares del girasol, Helianthus annuus, y especies relacionadas como H. petiolaris y H. anomalus se observa que las especies poseen zonas colineares y zonas no colineares, originadas estas ltimas en cambios estructurales como inversiones y translocaciones. Adems se ha comprobado que H. anomalus es una especie resultante de la hibridacin entre las dos especies mencionadas, que conserva el mismo nmero cromosmico de las especies parentales. Mediante marcadores isoenzimticos es posible dilucidar las especies parentales ancestrales de una especie alopoliploide, como ocurri con el tabaco y el algodn. Basta con examinar las variantes moleculares de las especies candidatas diploides y compararlas con las de la especie poliploide derivada. El modo de herencia de un locus isoenzimtico, es decir, dismico vs. polismico, permite adems caracterizar una especie en cuanto a su origen alo- o autopoliploide, respectivamente.

En la evolucin del gnero Citrus ha operado la hibridacin natural a travs de reproduccin sexual pero tambin estn presentes mecanismos apomcticos que constituyen barreras al intercambio de genes. La taxonoma de este grupo resulta particularmente compleja ya que no puede ser aplicado el concepto biolgico de especie. Marcadores de ADN han permitido esclarecer las relaciones de este polimrfico grupo que incluye naranjas, limones, limas y mandarinas. Los estudios moleculares ms recientes han colocado al tomate, previamente denominado Lycopersicon esculentum, dentro del gnero Solanum, pasndose a denominar Solanum lycopersicon. Los estudios sobre ADN de cloroplasto y la similitud de los mapas de ligamiento constituyen evidencias de que el tomate y la papa comparten un antecesor comn muy reciente. Esta informacin resulta de gran aplicacin en el mejoramiento de estos cultivos as como en la comprensin de la evolucin de los genomas. 10 Lecturas recomendadas
ANDERSEN, J. R.; LBBERSTEDT, T. 2003 Functional markers in plants. Trends in Plant Science 8: 554-560. ANGIOLILLO, A.; MENCUCCINI, M.; BALDONI, L. 1999. Olive genetic diversity assessed using amplified fragment polymorphisms. Theor. Appl. Genet. 98: 411-421. CARRERA, A.; PIZARRO, G.; POVERENE, M.; FEINGOLD, S.; BERRY, S.; LEN, A. 2002. Variability among inbred lines and RFLP mapping of sunflower isozymes. Genetics and Molecular Biology 25: 65-72. FALCONER, DS. 1988. Introduction to quantitative genetics. New York, Longman. GRIFFITH, S.; ANTHONY, J.F.; GELBART, WILLIAM, M.; MILLER, JEFFREY H.; LEWONTIN, RICHARD C.1999. Modern Genetic Analysis. New York: W.H: Freeman & Co. (eds.) ISBN 0-7167-3118-5 http:// w w w . n c b i . n l m . n i h . g o v / b o o k s / bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=mga GODT M, HAMRICK J. 1998. Allozyme diversity in the grasses. En: Population biology of grasses. G. P. Cheplick (ed). Cambridge University Press. 399 pp. MANIFESTO M.M., SCHLATTER A.R., HOPP H.E., SUREZ E.Y., AND DUBCOVSKY J. Quantitative evaluation of genetic diversity in wheat germplasm using molecular markers. 2001, Crop Science 41: 682- 690. MOORE G. 2001. Oranges and lemons: clues to the taxonomy of Citrus from molecular markers. Trends in Genetics 17: 536-540.

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PARTE V Mtodos de propagacin y conservacin de germoplasma

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OLMOS, Sofa; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

V.-Captulo 1
Micropropagacin
Olmos, Sofa; Luciani, Gabriela; Galdeano, Ernestina 1 Introduccin La micropropagacin consiste en la propagacin de un genotipo a gran escala a travs del empleo de tcnicas de cultivo de tejidos. El cultivo es as una herramienta muy til en los programas de mejoramiento, ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicacin ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las clulas vegetales; esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando estn sujetas a los estmulos adecuados. As, las clulas somticas de cualquier tejido podran formar tallos, races o embriones somticos de acuerdo con la competencia que posean y al estmulo que reciban. Esta regeneracin ocurre en fases consecutivas: la fase de desdiferenciacin, donde las clulas se vuelven competentes para responder ante cualquier estmulo organognico o embriognico; la fase de induccin, donde las clulas se determinan para formar un rgano o embrin, y la fase de realizacin, donde se forma el rgano o embrin propiamente dicho. Estas fases estn directamente afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo, por lo cual la optimizacin de los protocolos de regeneracin debe realizarse teniendo en cuenta los requerimientos intrnsecos de cada genotipo en cada fase del cultivo. As, en general, puede decirse que el proceso de desdiferenciacin generalmente es promovido por una auxina, la fase de induccin por un balance hormonal especfico del rgano o embrin a formarse y la fase de realizacin, por una disminucin de la concentracin hormonal en el medio de cultivo. 2 Etapas de la micropropagacin La regeneracin de plantas in vitro presenta cuatro etapas principales: 1) estableci-

miento del cultivo, 2) desarrollo y multiplicacin de vstagos, 3) enraizamiento y 4) aclimatacin de las plntulas. Generalmente, las etapas de enraizamiento y aclimatacin pueden combinarse en condiciones ex vitro. En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0), que es la etapa de preparacin de los explantos para el establecimiento.

Etapa 0: Preparacin del material vegetal El empleo de explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patgenos puede resolver el problema de la contaminacin por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son: 1) El tipo de rgano que sirve como explanto, 2) la edad ontognica y fisiolgica del mismo, 3) la estacin en la cual se colecta el material vegetal, 4) el tamao y 5) el estado sanitario general de la planta donante. La planta donante debe elegirse sobre la base de una seleccin masal positiva para las caractersticas agronmicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso definir el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. En general, los rganos jvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. Se recomienda colectar explantos primarios a campo durante la estacin primaveral y estival, cuando existe una brotacin activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormicin ocasiona serios problemas de contaminacin. A fin de lograr explantos de ptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mnimo en condiciones de invernculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad lumnica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25C) y baja humedad relativa (75%), a fin de reducir la proliferacin de patgenos. 163

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Los procesos morfognicos de floracin, dormicin y bulbificacin son controlados por el fotoperodo y la temperatura. Controlando estos factores tambin es posible obtener plantas donantes y explantos ms homogneos durante todo el ao. Pueden aplicarse adems pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes, as como tambin a los explantos mismos. En especies leosas suele utilizarse como pretratamiento la inmersin de los explantos primarios en soluciones con citocininas a fin de inducir la brotacin de yemas.

Etapa 1: Establecimiento del cultivo El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y axnicos. El xito est determinado por la edad de la planta donante, la edad fisiolgica, el estado de desarrollo y el tamao del explanto. En esta etapa los principales procesos a controlar son la seleccin, el aislamiento y la esterilizacin de los explantos. Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son los obtenidos de tejidos meristemticos jvenes, sean yemas axilares o adventicias, embriones o semillas en plantas herbceas y aquellos tejidos meristemticos que determinan el crecimiento en grosor, como el cambium en las plantas leosas. En este sentido, es importante sealar que el empleo de yemas adventicias (tambin llamadas yemas formadas de novo) est asociado con una mayor probabilidad de ocurrencia de variantes somaclonales respecto de los sistemas de propagacin, basados en la regeneracin a partir de yemas axilares o embriones somticos. La obtencin de cultivos axnicos puede lograrse trabajando tanto sobre aspectos preventivos como curativos. Una accin preventiva la constituye el empleo de mtodos de verificacin de patgenos en los explantos. Esto puede realizarse mediante anlisis especficos para las enfermedades del cultivo, tales como DAS-ELISA o PCR, anlisis generales para patgenos cultivables como el empleo de medios de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos y mtodos especficos para la deteccin e identificacin de patgenos intracelulares como virus, viroides y bacterias. La realizacin de estos 164

anlisis directamente sobre las plantas donantes, previo establecimiento, presenta dos ventajas. En primer lugar, el empleo de tejidos maduros permite visualizar los sntomas ms marcados de la enfermedad; en segundo lugar, la carga de patgenos es mayor y por lo tanto la precisin del sistema de deteccin aumenta. Por otro lado, las plantas enfermas pueden tratarse con tcnicas adecuadas para la eliminacin de patgenos como la termoterapia, la quimioterapia a travs de la aplicacin de antibiticos, desinfectantes, antivirales y el cultivo de meristemas. La desinfeccin superficial incluye varios pasos: el lavado de los explantos con agua corriente, el empleo de etanol al 70% por 1 minuto, seguido de concentraciones variables de hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo) con unas gotas de tensoactivos para favorecer su penetracin y actividad. Posteriormente, los explantos deben ser enjuagados al menos tres veces con agua destilada estril. Algunos patgenos permanecen latentes y se expresan cuando son transferidos a un medio de cultivo nuevo. En general, estos patgenos incluyen los patgenos superficiales del material vegetal, los patgenos endgenos y los patgenos propios del manejo en laboratorio. En la Etapa 1 tambin pueden observarse infecciones por bacterias y hongos asociados a trips que sobreviven a los tratamientos de esterilizacin y por patgenos endgenos latentes dentro del sistema vascular, resultado de una esterilizacin inefectiva de los explantos. Estos patgenos latentes podran manejarse mediante el empleo de bacteriostticos o antibiticos en el medio de cultivo. El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicacin sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de produccin (enraizamiento, bulbificacin, etc.). Es importante sealar que en esta etapa, cualquiera que sea la va de regeneracin empleada, es conveniente evitar la formacin de callo para disminuir el riesgo de variacin somaclonal. En esta etapa, los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y cido giberlico y las

Etapa 2: Multiplicacin

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condiciones de crecimiento juegan un papel implementacin a escala comercial. Los crtico sobre la multiplicacin clonal de los biorreactores son equipos que contienen explantos. aproximadamente 2 litros de medio de cultiAmbas vas de regeneracin, organog- vo lquido estril y donde los embriones nesis y embriognesis, pueden darse en for- somticos pueden regenerar y madurar a ma directa o indirecta. Esta ltima implica la partir de suspensiones celulares, sustentados formacin de callo. En general, la organo- por la circulacin permanente de nutrientes gnesis conduce a la produccin de vstagos y de aire (Fig.1). Hoy en da, el empleo de unipolares que enrazan en etapas sucesivas, biorreactores para la micropropagacin a gran mientras que por embriognesis somtica se escala est limitado por dos motivos crticos. forman embriones bipolares a travs de etapas ontognicas similares a la embriognesis cigtica. La organognesis puede darse por induccin de yemas axilares o adventicias. La induccin de yemas axilares comprende la multiplicacin de yemas preformadas, usualmente sin formacin de callo. La induccin de yemas adventicias comprende la induccin de tejido meristemtico localizado mediante un tratamiento con reguladores de crecimiento, conduciendo a la diferenciacin del primordio y desarrollo del vstago, esto ltimo generalmente en au- Figura 1: Embriognesis somtica en zanahoria. A partir de clulas del floema sencia del regulador de creci- se obtienen los embriones somticos que son un excelente sistema de miento que indujo la propagacin clonal. Los biorreactores permiten el cultivo a gran escala de los mismos.(Gentileza Dr. Miguel Pedro Guerra) organognesis. La principal desventaja del primer mtodo es que el nmero de yemas En primer lugar, el declinamiento de las lneas axilares por explanto limita la cantidad de celulares (clones) por efecto de la variacin vstagos. Esto se ve compensado, sin embar- somaclonal y segundo, por los altos costos go, por un aumento en la tasa de multiplica- asociados con la conversin de estos embriocin con los sucesivos subcultivos. La forma- nes somticos en plntulas. cin de yemas adventicias ofrece mayor poLas condiciones culturales en las cuales tencial para la produccin de vstagos, ya crece el explanto son el resultado de la que la induccin de vstagos ocurre en sitios interaccin de tres factores: el estado del distintos al de los meristemas. explanto o material vegetal, determinado en La embriognesis somtica es una va ms parte por el medio de cultivo, el recipiente conveniente porque permite saltar las eta- de cultivo y el ambiente externo o condiciopas de formacin de yemas y enraizamiento nes de crecimiento del cuarto de cultivo. La regenerando plantas en una forma mucho capacidad de respuesta de los explantos a ms rpida y eficiente, disminuyendo adems un mismo medio de cultivo cambia con el el riesgo de variacin somaclonal. A su vez, la nmero de subcultivos, el tipo de explanto disponibilidad de protocolos para la obten- subcultivado y el mtodo del repique. Por cin de embriones somticos es clave para la esto mismo, el medio de cultivo debe automatizacin de la micropropagacin y la optimizarse a fin de lograr la mayor tasa de consecuente reduccin de costos para su multiplicacin vegetativa. Comnmente se

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emplea como medio basal el medio MS completo sugerido por Murashige & Skoog (1962) suplementado con 3% de sacarosa como fuente de carbono. A este medio se le adicionan adems reguladores de crecimiento, tanto del tipo de auxinas como de citocininas. La etapa de multiplicacin generalmente comprende dos perodos, la fase de induccin y la fase de multiplicacin propiamente dicha. La primera implica, generalmente, el empleo de concentraciones elevadas de reguladores de crecimiento (generalmente de auxinas ms que citocininas) para favorecer la desdiferenciacin. La segunda etapa requiere del empleo de un balance hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciacin y multiplicacin celular. En este caso, el sistema es ms dependiente de reguladores del tipo de las citocininas. En algunos casos, como ocurre en la formacin de embriones somticos, se requiere de una tercera y cuarta etapa, denominadas de maduracin y de germinacin respectivamente, cuya duracin vara entre 1 a 2 semanas. Para la etapa de maduracin se adiciona ABA (cido absccico) al medio basal en rangos de 5 a 20 micromolar, seguido del subcultivo a un medio basal conteniendo AG (cido giberlico) en concentraciones de 0,1-1 micromolar, cuyo fin es lograr la germinacin de los embriones obtenidos. Los tipos de auxinas (a) y citocininas (b) y los rangos de concentracin ms empleados se mencionan a continuacin: a) IBA (cido 3-indolbutrico): 0,1-2 M; 2,4-D (cido 2,4diclorofenoxiactico): 4-35 M; AIA (cido 3indolactico): 0,1-2 M ; ANA (cido naftalenactico): 1-5 M; y, picloram: 1-10 M; b) BA (N6-benciladenina): 1-20 M; CIN (cinetina): 0,1-1 M; ZEA (zeatina): 1-10 M; 2ip (isopentiladenina): 1-5 M ; y, TDZ (tidizuron): 0,01-1 M. Los tipos de reguladores, sus combinaciones y rangos de concentraciones deben ser optimizados para cada especie, genotipo y etapa de multiplicacin determinada. Los cultivos se incuban en luz a 272 C con 14 horas de fotoperodo e intensidad lumnica moderada (100 mol m-2 s-1). La presencia de compuestos fenlicos oxidados se encuentra asociada con tejidos vegetales sometidos a situaciones de estrs, tales como aquel provocado por el dao mecnico producido durante el aislamiento del explanto de la planta madre. Estos compuestos se encuentran en ge-

neral en las plantas en estado reducido y el ataque de patgenos producira su oxidacin y liberacin. Esto inhibira el crecimiento de los mismos, daando, indirectamente, a los explantos. Estas sustancias (quinonas, fitoalexinas y protectores de auxinas) son muy lbiles y fcilmente oxidables. Por esto mismo, durante el establecimiento y multiplicacin in vitro es necesario emplear estrategias tendientes a disminuir el estrs de las plantas y limitar al mnimo la produccin y oxidacin de los compuestos fenlicos. Para ello se emplean agentes absorbentes de fenoles en el medio de cultivo, tales como el carbn activado y la polivinilpirrolidona o antioxidantes como el cido ascrbico, la modificacin del potencial redox con agentes reductores, la inactivacin de las fenoloxidasas con agentes quelantes o la reduccin de su actividad o afinidad por el sustrato utilizando un bajo pH, o bien cultivando in vitro en condiciones de oscuridad. Es recomendable adems lograr que la tasa de intercambio gaseoso entre los ambientes del recipiente y externo sea ptima, evitndose la acumulacin de CO 2 y de etileno. En este sentido, el sellado del recipiente es importante, el intercambio gaseoso es ms limitado con el empleo de una tapa de plstico que con un film de polietileno extensible. La utilizacin de una tapa perforada con tapn de gomaespuma es altamente recomendable (Fig. 2). Los principales problemas que pueden presentarse durante los sucesivos subcultivos in vitro son la vitrificacin y la produccin de compuestos fenlicos por los explantos. La vitrificacin consiste en un proceso de morfognesis anormal con cambios anatmicos, morfolgicos y fisiolgicos que producen hojas de una apariencia vidriosa. Este fenmeno est regulado por dos factores clave que son la humedad relativa y el potencial agua, y afecta a dos procesos fisiolgicos fundamentales: la fotosntesis y la transpiracin. Debido a la disfuncin metablica asociada, las plantas se vuelven hetertrofas y transpiran excesivamente debido a un mal funcionamiento estomtico y a cambios estructurales en las paredes celulares. La principal consecuencia de la vitrificacin es la baja supervivencia de las plntulas obtenida du-

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Figura 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro en un recipiente de vidrio con tapa metlica perforada y tapn de gomaespuma, que evita la acumulacin de CO2, etileno y excesiva humedad en el ambiente de cultivo.

rante la aclimatacin ex vitro. Por ello, es fundamental conocer el rol de los distintos factores que inciden negativamente sobre el desarrollo morfognico normal (auttrofo) in vitro. Estos factores son el ambiente de cultivo, los componentes orgnicos e inorgnicos del medio, los reguladores de crecimiento, la luz y la temperatura. Una baja humedad relativa, elevada irradiacin, la remocin de la fuente de carbohidratos del medio de cultivo y la defoliacin de las plantas para estimular la formacin de hojas nuevas estimulan la fotosntesis y otras actividades metablicas de las hojas en forma normal. Otras estrategias para lograr un ptimo crecimiento implican el empleo de retardantes del crecimiento para estimular la formacin de hojas nuevas despus del transplante. O bien, el empleo de altos niveles de CO2 (antagonista del etileno) para estabilizar la va de lignificacin y prevenir la vitrificacin a travs de la inhibicin de la hiperhidratacin, la hipolignificacin y la formacin de aernquima. En esta etapa se produce la formacin de races adventicias. En las especies herbceas es relativamente fcil mientras que en las

Etapa 3: Enraizamiento y aclimatacin

especies leosas es complicado por su limitada capacidad rizognica. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso pueden emplearse varios tipos de sustratos y reguladores de crecimiento (auxinas) para promover la rizognesis. Los sustratos incluyen: medio solidificado con agar, perlita y/o vermiculita humedecidas con medio nutritivo o agua. En un medio solidificado con agar, los nutrientes se reducen de 1/2 a 1/4 de la composicin original, y la sacarosa se reduce a una concentracin final de 1-2%. Medios con baja concentracin salina, como el WPM (Lloyd & Mccown, 1980) y GD (Gresshoff & Doy, 1972), incrementan el porcentaje de enraizamiento de vstagos axilares en plantas latifoliadas. El empleo de agar presenta ventajas y desventajas sobre la rizognesis. Por un lado, el enraizamiento de especies forestales en agar se favorecera al producirse una rizognesis ms sincrnica como resultado del contacto ntimo de las estacas con el medio de cultivo. Sin embargo, las races producidas por este mtodo son usualmente delgadas y no se forman races cabellera. Adicionalmente, el empleo de agar est asociado con la formacin de callo en la base de las estacas, que conduce al establecimiento de conexiones vasculares interrumpidas entre races y vstagos. Comnmente, a fin de proceder a su enraizamiento, los vstagos de buen tamao provenientes de la etapa de multiplicacin y provistos de al menos 4-5 yemas, se colocan durante perodos cortos en soluciones con concentraciones elevadas de auxinas. La auxina ms utilizada es el IBA (cido 3indolbutrico), que puede utilizarse a concentraciones de 1-10 M durante pocas horas. Alternativamente se pueden emplear niveles ms bajos de auxinas (0.1 a 1M ), pero manteniendo la induccin por un perodo ms prolongado (3 a 7 das). Luego los vstagos se transfieren a un medio de cultivo basal desprovisto de reguladores de crecimiento para permitir el desarrollo de las races. Aproximadamente 20 das despus del tratamiento de induccin es posible la obtencin de una adecuada cantidad de races funcionales que permitan continuar hacia la etapa de aclimatacin. Es importante acentuar que el uso de

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auxinas a elevadas concentraciones es contraproducente porque induce la formacin de callo en la base de las estacas. Por ello, para cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizognesis que minimice la formacin de callo y maximice la tasa de rizognesis y supervivencia de las plantas. El enraizamiento ex vitro permite que el enraizamiento y aclimatacin se logren simultneamente y que raramente se forme callo en la base de las estacas, asegurando as una conexin vascular continua entre el vstago y la raz. Sin embargo, el estrs asociado a la evapotranspiracin acelerada de las plantas durante las etapas iniciales del trasplante puede reducir considerablemente la tasa de supervivencia. Por ello, es conveniente contar con instalaciones de invernadero o cmaras de crecimiento adecuadas para brindar temperatura y humedad relativa moderadas, que permitan lograr la rusticacin de las plantas en forma progresiva. Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes sustratos, mezclas de tierra y arena y/o abonos, los cuales conviene que estn debidamente esterilizados. 3 Propagacin de especies leosas El empleo de clones en programas de reforestacin genera al menos un 10 % de incremento en ganancia gentica en relacin con el empleo de plantas regeneradas por semillas de rboles selectos. Sin embargo, la mxima ganancia gentica puede ser obtenida mediante el empleo conjunto de propagacin sexual y agmica. La reproduccin sexual es importante para la introduccin de genes nuevos, prevenir los efectos de la endogamia y el mejoramiento de caractersticas controladas por efectos aditivos de genes. La reproduccin asexual, por otro lado, permite la multiplicacin de individuos o grupos de individuos seleccionados de una poblacin lite, que exhiben una significativa ganancia gentica debida a efectos no aditivos de genes. Tradicionalmente, las especies forestales fueron propagadas vegetativamente mediante el enraizamiento de estacas, de braquiblastos en conferas, as como tambin por injertos. La propagacin por estacas de Cryptomeria japonica (kiri), Populus (lamo) y Salix (sauce) ha sido llevada a cabo duran-

te siglos en Asia y Europa. Sin embargo, para la mayora de los rboles propagados por estacas se observa una rpida prdida de capacidad de rizognesis al aumentar la edad de la planta donante de las estacas. En este sentido, una de las principales ventajas de la micropropagacin es la capacidad potencial de desarrollar protocolos de multiplicacin optimizados para multiplicar rboles adultos que han demostrado ser fenotpicamente superiores. 3.1 Mtodos de Micropropagacin Los trabajos pioneros en el cultivo de tejidos cambiales de especies forestales condujeron, en el ao 1940, a la formacin de yemas adventicias en Ulmus campestris. Durante la dcada del 40 se publicaron logros adicionales en al produccin separada de vstagos y races en especies latifoliadas. En 1950 se public por primera vez la obtencin de organognesis en conferas, con la formacin de vstagos a partir de callos de Sequoia sempervirens. En la dcada 1970-80 se obtuvieron las primeras plantas de lamo (Populus tremuloides) y Pinus palustris. En ambos casos la formacin de plntulas se logr va organognesis. Luego del ao 1975 la micropropagacin de especies latifoliadas se realiz a travs de la regeneracin indirecta, pasando por una etapa de callo. Actualmente, la multiplicacin in vitro de conferas y latifoliadas se logra a travs de tres vas, 1) brotacin de yemas adventicias, 2) produccin de yemas adventicias y 3) embriognesis somtica. La brotacin de yemas adventicias emplea pices de vstagos, yemas laterales y microestacas. Es el principal mtodo utilizado para especies latifoliadas. En las conferas, la elongacin de las yemas axilares a partir de braquiblastos de plantas adultas no ha sido muy exitosa. En latifoliadas de clima templado los mejores explantos los constituyen las yemas y vstagos en activo crecimiento ms que las yemas en estado de dormicin. Los vstagos se colectan en primavera y a principios del verano a fin de obtener material con reducido nivel de contaminacin. Alternativamente, las yemas en dormicin pueden ser colectadas y brotadas en condiciones ambientales controladas.

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Para la induccin de vstagos, tanto en gimnospermas como en angiospermas, se requiere el empleo de citocininas. Las ms usadas son la N6-benciladenina (BA) y el tidiazurn (TDZ). Los medios basales ms usados para angiospermas son el MS (Murashige & Skoog, 1962) o el WPM (Lloyd & Mccown, 1980). Para el caso de gimnospermas, el empleo de medios reducidos en sales minerales y baja cantidad de nitrgeno resulta mucho mejor que el empleo de un medio altamente salino y nitrogenado como el MS. La induccin de yemas adventicias es el mtodo ms empleado para gimnospermas y angiospermas. En este caso, las yemas se inducen directamente sobre el explanto en general sin previo pasaje por una etapa de callo. En general, cuanto ms joven es el tejido, tanto mayor es la respuesta a los tratamientos que conducen a la organognesis de novo. Los explantos ms frecuentes son embriones cigticos maduros, seguidos de cotiledones y epictilos de plntulas. Generalmente se utiliza BA a concentraciones mayores o iguales a 5 ppm como nica fuente de induccin o en combinacin con otras citocininas. La adicin de auxinas puede ser beneficiosa, aunque en conferas se ha encontrado que promueve la formacin de callo y reduce el proceso de organognesis. En algunos casos, como en Populus spp., la formacin de yemas adventicias se logra a partir de un callo originado a partir de tejido cambial. El mtodo llamado multiplicacin mediante ndulos meristemticos es un mtodo tambin utilizado para pino radiata y lamo. En este caso se obtiene bsicamente un tejido meristemtico (no un verdadero callo) usando relaciones altas de auxina/citocinina para luego inducir la produccin de vstagos. La disponibilidad de protocolos va embriognesis somtica para especies forestales es an limitada. En las angiospermas los primeros embriones somticos se obtuvieron de Santalum album, donde sin embargo no fue posible la obtencin de plantas completas. Veinte aos despus pudieron lograrse plantas completas de abeto (Picea abies ), una gimnosperma. En las gimnospermas los mayores xitos se lograron empleando como explantos embriones cigticos maduros e

inmaduros. En la mayora de los casos los embriones se originan en forma indirecta a partir de callos embriognicos o bien, directamente, desde el explanto. En las conferas puede ocurrir un proceso de poliembriona, previa formacin de callo que conduce a una alta tasa de multiplicacin inicial. En general, los medios de cultivo ms efectivos para estos fines contienen elevados niveles de sales y suministran nitrgeno tanto como NH4+ y NO3-. Las auxinas ms comnmente empleadas en el medio de induccin son el 2,4-D (cido 2,4-diclorofenoxiactico) y el ANA (cido naftalenactico), en concentraciones mayores de 2 M. En algunos casos es necesario adems el empleo de alguna citocinina, generalmente en concentraciones mayores a 1 M si se trata de BA y entre 0,1-1 M en el caso del TDZ. 3.2 Condiciones de cultivo Los explantos jvenes de especies leosas, particularmente angiospermas, a menudo secretan al medio de cultivo polifenoles oxidados, visibles como pigmentos marrones y/o negros. Se observa tambin que en los explantos de rboles adultos el problema se acenta. Por ello se recomienda el empleo de explantos primarios juveniles. Los tipos de explantos ms utilizados para el establecimiento in vitro son los segmentos nodales de explantos juveniles, las yemas axilares obtenidas por rejuvenecimiento de plantas adultas, y los embriones cigticos y plntulas obtenidas de semillas de origen sexual. La desinfeccin de los mismos se logra mediante inmersin en etanol al 70 % (1 a 2 minutos) seguido de una solucin de lavandina comercial conteniendo de 0,8 a 2,4 % de hipoclorito de sodio durante 5-30 minutos. En la mayora de los casos se emplean agentes tensoactivos, tales como Tritn y Tween20 , adicionados en la solucin de lavandina. En todos los casos los explantos son lavados finalmente varias veces con agua destilada estril. Los medios basales ms empleados son el MS, formulado por Murashige & Skoog (1962), diludo a la mitad o a un cuarto de su formulacin original o el WPM, formulado por Lloyd & McCown (1981). Como medios de

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blanco y negro

Figura 3: Etapas de la micropropagacin en plantas de paraso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002): A) Huerto semillero de paraso gigante con ejemplares de seis aos de edad, provincia de Misiones, Danzer Forestacin S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas para generar una poblacin de plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparacin del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 meses de edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: vstagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 das sobre medio de establecimiento (Medio basal de Murashige y Skoog, 1962 (MS) suplementado con 2,22 M 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 M cido giberlico (GA3) + 0,25 M cido 3-indolbutrico (IBA). D) Etapa de Multiplicacin: vstagos luego de 30 das sobre medio de multiplicacin (medio MS suplementado con 2,22 M BAP, estos vstagos fueron empleados como explantos para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de la etapa de multiplicacin con problemas de vitrificacin y presencia de callo. En estos casos, el medio de multiplicacin para los cultivos subsiguientes fue modificado reduciendo la concentracin de BAP a 0,44 M. F) Vstago enraizado en medio de MS con la concentracin salina reducida a la mitad, suplementado con 9,89 M IBA durante 2 das, seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 das hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatacin.

multiplicacin se emplean adems el BTM (broadleaved tree medium, Chalupa, 1983) y el medio de Prinet y Lalonde (1983). Los reguladores de crecimiento ms utilizados son el cido naftale-nactico (ANA) y la benciladenina (BA). Tambin han sido efectivas auxinas como el cido indol-butrico (IBA) y el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y citocininas como la 2- isopentil amino purina (2iP), cinetina (CIN), zeatina (Z) y tidiazurn (TDZ). En general, los cultivos se incuban a 272 C con 14 horas de fotoperodo e intensida-

des lum-nicas moderadas. En la Fig. 3 se muestran las etapas de la micropropagacin de plantas de paraso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002). 3.3 Problemas asociados a la micropropagacin de especie leosas Es mucho ms difcil propagar material adulto que juvenil ya que los primeros son recalcitrantes, es decir, difciles de regenerar. Sin embargo, an en estos casos es posible

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extraer ex-plantos de mayor capacidad regenerativa mediante dos formas: 1) seleccionando los tejidos ms juveniles dentro de un rbol o 2) induciendo el rejuvenecimiento del rbol donante antes de aislar los explantos. Para seleccionar el material ms juvenil en una planta adulta hay que considerar el fenmeno de topfisis. Este es un proceso por el cual el tipo de crecimiento de un nuevo individuo est determinado por la posicin que ocupaba en la planta adulta. Esto es ocasionado por efecto del envejecimiento fisiolgico e implica que los explantos ms reactivos in vitro se encuentran en las yemas de las reas basales del tronco y races. A su vez, el rejuvenecimiento es un proceso de reversin temporaria de las caractersticas adultas que permite lograr material vegetal en estado de juvenilidad. En general, a fin de contrarrestar los efectos debidos a la topfisis, se recomienda emplear tejidos juveniles y un tamao de explanto muy pequeo. La juvenilidad puede lograrse por dos mtodos. En primer lugar, mediante el empleo de rganos juveniles separados de plantas adultas, la utilizacin de estacas enraizadas o bien de brotes epicrmicos. En segundo lugar, mediante el rejuvenecimiento de partes adultas, la iniciacin de yemas adventicias y embriones (en este caso se logra un rejuvenecimiento total por el inicio de un nuevo ciclo ontognico), del injerto de yemas adultas sobre pies juveniles, de tratamientos con reguladores de crecimiento (como citocininas como el BA), por la poda severa (recepado de rboles adultos) y a travs del cultivo in vitro de meristemas. Tanto los atributos de supervivencia a campo, como la tasa de crecimiento, el plagiotropismo y la susceptibilidad a enfermedades de las plantas, tienen una correlacin directa con la calidad de los vstagos durante el cultivo in vitro. Un problema crucial a resolver en cada sistema de propagacin es la calidad diferencial de las races de las plantas regeneradas en relacin con aquellas obtenidas por semillas. Por ejemplo, las plantas regeneradas de Pinus elliotti suelen tener una raz principal no ramificada y gruesa. En cambio, las plantas obtenidas a travs de semillas tienen races ms delgadas y de

mayor crecimiento lateral que permiten comparativamente un mejor anclaje y una mayor resistencia a los vientos. 4 Propagacin de especies herbceas La micropropagacin de especies herbceas est orientada a proveer material libre de patgenos, propagar material seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor resistencia a enfermedades y estreses ambientales, conservar la diversidad especfica en bancos de germoplasma, obtener material para estudios fisiolgicos y genticos y sentar las bases para la aplicacin de tcnicas de ingeniera gentica. Existe una gran variedad de protocolos, desarrollados en funcin de la especie y de los objetivos de la propagacin. Existen protocolos generales para monocotiledneas como en el caso ciertos cereales (trigo, maz, cebada, avena, arroz), pasturas (pasto bermuda, festuca alta, raigrs, pasto llorn) y hortcolas (cebolla, ajo, puerro); protocolos generales para dicotiledneas que incluyen especies hortcolas (tomate, papa, pimiento y zanahoria) y leguminosas forrajeras (alfalfa, man, trbol blanco) y protocolos para especies modelo como Arabidopsis y tabaco. En todos los casos, las formas de propagacin son las mismas. Se emplean vas de regeneracin por formacin de yemas axilares, yemas adventicias y embriognesis somtica. En los dos primeros casos, el sistema de propagacin a travs de la organognesis directa asegura la estabilidad gentica de las plantas regeneradas y se emplean cuando el objetivo es la propagacin clonal a gran escala. La embriognesis u organognesis indirecta, con formacin de callo, se emplea en cambio para generar variabilidad en programas de mejoramiento. En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo, las etapas de la micropropagacin incluyen tanto la multiplicacin de yemas axilares por el cultivo de meristemas, la formacin directa de yemas adventicias en explantos obtenidos a partir de placas basales o umbelas inmaduras y la formacin indirecta de yemas adventicias y/o embriones somticos obtenidos a partir de callos que provienen de distintos tipos de explantos (meristemas, bro-

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tes, placa basal races). En el caso de alfalfa y otras leguminosas como soja y man, la micropropagacin es llevada a cabo por la va de la embriognesis somtica, donde los embriones se obtienen utilizando tejidos juveniles (embriones, cotiledones y pecolos) como explantos. En algunos casos como pasto llorn (Eragrostis curvula) es posible la regeneracin de plantas mediante embriognesis, organognesis y regeneracin directa a partir de los explantos. 5 Lecturas Recomendadas
CASO, O. H. 1992. Juvenilidad, rejuvenecimiento y propagacin vegetativa de las especies leosas. Agriscientia 9 (1): 5-16. CHALUPA, V. 1983. Micropropagation of conifer and brodleaved forest trees. Communicationes Instituti Forestalis Cechosloveniae 13: 7-39. DEBERGH PC; PE READ, 1993. Micropropagation. En Micropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: 1-13. EVANS, D.A.; SHARP, W.R.; BRAVO, J.E. 1984. Cell culture methods for crop improvement. Handbook of Plant Cell Culture 2: 47-68. KLOPFENSTEIN, N.B.; KERL, J.G. 1995. The potential of biotechnology in temperate agroforestry practices. In:

Agroforestry systems 32. Kluwer Academic Publishers. Netherlands: 29-44. LLOYD, G.; B. MCCOWN. 1981. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kolmia latifolia, by use of shoot tip culture. Combined Proceedings International Plant Propagator Society 30: 421-427. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497. PRINET, P.; M. LALONDE. 1983. In vitro propagation and nodulation of the actinorhizal host plant Alnus glutinosa (L.) Gaertn. Plant Science Letters 29: 9-17. SCHENK, R.U.; HILDEBRANDT, A.C. 1972. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot 50:199-204. THORPE, T.A.; HARRY, I.S.; KUMAR, P.P. 1991. Application of micropropagation to forestry. En Micropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: 311-336. ZIV M, 1993. Vitrification: morphological and physiological disorders of in vitro plants. En Micropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: 45-92.

172

OLMOS, Sofa; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

V.-Captulo 2
Semilla sinttica
Rey, Hebe Y.; Mroginski, Luis A. 1 Concepto Resulta difcil determinar como se origin la idea de producir semillas sintticas o artificiales. Estas son el resultado de la aplicacin en agricultura del fenmeno de embriognesis somtica, descripto por primera vez en 1958 por Jakob Reinert y F.C.Steward y colaboradores. Sin embargo, un gran propulsor de su utilizacin para la propagacin a gran escala de plantas fue Toshio Murashige, quien en un simposio realizado en 1977 en Ghent (Blgica) present formalmente la idea de la produccin de las semillas sintticas, entendiendo como tal a un simple embrin somtico encapsulado. Esta semilla se diferencia de la semilla verdadera en que el embrin es somtico (producido por el fenmeno conocido como embriognesis somtica) y no cigtico, y que si tiene endosperma y cubierta, stos son artificiales (Fig.1 a y b). Esta semilla, puesta en condiciones adecuadas, germina (Fig.1 c) y se convierte en una planta (Fig.1 d). Muchos grupos de investigacin han contribuido al desarrollo de tales semillas. Entre ellos se deben destacar el grupo liderado por Keith Walker de la Compaa Monsanto, quien a partir de mediados de la dcada que va de 1970 a 1980 trabaj especialmente con alfalfa. Tambin hay que mencionar la labor de Robert Lawrence de la Union Carbide, quienes comenzaron los trabajos con especies forestales, lechuga y apio. Otros investigadores como Drew, Kitto y Janick realizaron sus trabajos con zanahoria. El aporte del grupo liderado por Keith Redenbaugh de la Plant Genetic Inc. fue muy importante, especialmente por su descubrimiento de que hidrogeles como el alginato de sodio podan utilizarse para producir semillas artificiales que podan germinar en condiciones de invernadero. Existe otro tipo de semilla sinttica, diferente del definido ms arriba, donde, en lu-

Figura 1: a) Partes de una semilla sinttica. b, c y d) Obtencin de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30) mediante semillas sintticas (las barras verticales indican 3 mm).

gar de encapsular embriones somticos se encapsulan yemas. Este tipo de semillas sintticas de una utilizacin muy restringida no ser tratado en este captulo. 2 Tipos de semillas sintticas Las semillas sintticas pueden fabricarse de diferentes maneras (Fig. 2). Bsicamente pueden utilizarse embriones hidratados, tal como resultan del proceso de embriognesis somtica, o bien pueden ser desecados. En algunos casos estos embriones estn protegidos por cubiertas protectoras. De esta manera se pueden distinguir 5 tipos bsicos de semillas sintticas: 1) Semillas sintticas con embriones desecados sin cubierta (Tipo 1, Fig. 2). Se

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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de los embriones somticos tal como resultan del proceso de embriognesis somtica, sin ningn tipo de cubierta protectora. Este sistema ha sido desechado en la prctica por la escasa conversin de embriones en plantas. 4) Semillas sintticas con embriones somticos hidratados suspendidos en un gel viscoso (fluid drilling)(Tipo 4, Tabla 1: Ejemplos de semillas sintticas basadas en la desecacin de Fig. 2). Inicialmente fue desarrollaembriones sin cubierta protectora. do en zanahoria y ms recientemente en batata; consiste en la Especie % humedad en la semilla % conversin en plantas inclusin de varios embriones en Apium graveolens 10-13 35-85 una especie de tubo que contieDactylis glomerata 13 5-30 Medicago sativa 8-20 33-95 ne un gel viscoso. 5) Semillas sintticas con dad de este tipo de embriones por un ao, embriones somticos hidratados y provisaproximadamente, en condiciones de labo- tos de una cubierta protectora (Tipo 5, Fig. 2). Es el sistema ms usado. Por esta razn, ratorio. 2) Semillas sintticas con embriones de aqu en adelante, cuando se mencione somticos desecados y provistos de cubier- semilla sinttica se referir a este tipo. Tieta protectora (Tipo 2, Fig. 2). Esta tcnica ha ne la ventaja de que los embriones no estn sido utilizada en zanahoria y apio, donde los sujetos a la desecacin, que constituye la prinembriones fueron recubiertos con cipal causa de los bajos valores de conversin polyoxietileno y luego desecados. Los resul- en plantas. Si bien se han ensayado numetados han mostrado que es factible lograr rosas sustancias para encapsular a los embriouna buena supervivencia de stos; sin embar- nes somticos (agar, gelrite, gomas), una de go, la conversin en plantas es realmente la tcnicas ms utilizadas consiste en lograr la formacin de una cubierta protectora de baja. 3) Semillas sintticas con embriones alginato de calcio, compuesto que no es txihidratados sin cubierta (Tipo 3, Fig. 2). Es el co para el embrin y permite una rpida sistema ms simple; consiste en la utilizacin encapsulacin. El proceso es muy simple y consiste bsicamente en sumergir a los embriones somticos en una solucin de Explante alginato de sodio al 2%, pasndolos luego a una solucin acomplejante de, por Cultivo e induccin de la ejemplo, 100 mM de Ca (NO3)2 (Fig. 3). embriognesis somtica Con esta tcnica se genera una semilla sinttica consistente en un embrin somtico recubierto con una cubierta Embriones somticos seminal y provisto de un endosperma artificial (Fig.1 a y b). Eventualmente esDesecados tas cpsulas pueden ser recubiertas por Hidratados sustancias tales como polioxieti-lenglicol, que sirve para mantener una adecuada Gel Viscoso Encapsula do hidratacin de las cpsulas y embriones. Encapsulado Este procedimiento ha posibilitado la obtencin de semillas sintticas de nu1 2 3 4 5 merosas especies de inters econmico, entre las que pueden mencionarse alfalSiembra en el suelo fa, zanahoria, apio y especies forestales como Picea abies, Pinus radiata , Figura 2: Tipos de semillas sintticas. Santalum album y Pseudotsuga trata de un sistema muy simple donde los embriones son desecados hasta alcanzar porcentajes de humedad del 8 al 20% y no estn provistos de ningn tipo de cubierta protectora. En el caso de alfalfa, embriones sometidos a la desecacin mostraron porcentajes de conversin en plantas de hasta el 95% (Tabla 1). Es posible mantener la viabili-

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REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.

tores que regulan la embriognesis somtica. Sin embargo, en muchos casos, la base A B C D gentica de este fenmeno no est completamente dilucidado. En alI E falfa es un carcter hereF H G dable, codificado por dos genes dominantes de segregacin independiente. Una vez inducida la ) seleccin de embriones somticos, F) embriognesis Figura 3: A-D) Induccin de la embriognesis somtica,E) inmersin de los embriones en alginato de sodio,G) acomplejamiento con nitrato de calcio, H) somtica, el lavado, I) semilla sinttica (i) segundo menziesii. 3 Produccin de semillas sintticas En la Fig.4 se esquematizan 6 aspectos que deben tenerse en cuenta para la produccin y manipulacin de las semillas sintticas. En primera instancia es necesario contar con un sistema eficiente de induccin de embriognesis somtica in vitro, es decir, la produccin de embriones sin la necesidad de la fusin de gametas. Estos embriones deben ser estructuras bipolares perfectas (con un polo que genere el vstago y el otro la raz) capaces de convertirse (germinar) en plantas enteras (ver II.-2). Si bien la existencia de embriognesis somtica ha sido informada en centenares de especies de angiospermas y gimnospermas, en muchos casos no es de utilidad para iniciar la produccin de semillas sintticas debido a la baja tasa de produccin de embriones aptos para la encapsulacin. En los ltimos aos se han hecho notables avances en el conocimiento de los facInduccin de la embriognesis somtica

Produccin sincronizada y en gran escala de los embriones somticos

Maduracin de los embriones somticos

Encapsulamiento mecanizado

Almacenamiento de las semillas sintticas

Siembra en invernadero o a campo


Figura 4: Etapas en la produccin de las semillas sintticas.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

175

paso consiste en lograr una produccin sincronizada, a gran escala, de los embriones. Es fundamental contar con embriones simples, en estado cotiledonar, que no se fusionen entre s y que no generen embriones secundarios. A fin de seccionarlos se han desarrollado diferentes procedimientos basados en filtros y equipos clasificadores automticos. Para la produccin a gran escala se han diseado biorreactores y sistemas mecanizados de encapsulamiento adaptados a las particularidades de cada especie. Gran parte de la investigacin se halla centrada en lograr una adecuada maduracin de los embriones, que es un factor esencial para la obtencin de altos valores de conversin en el suelo. En alfalfa se ha demostrado la necesidad del empleo de tratamientos con cido abscsico, maltosa y de pretratamientos con temperaturas bajas (4C). El almacenamiento de las semillas sintticas es otro aspecto importante a tener en cuenta. Lo ideal sera que las semillas sintticas tuvieran un comportamiento similar al de la mayora de las semillas verdaderas y permanecieran viables por mucho tiempo. Los resultados obtenidos con semillas sintticas de muchas especies muestran que an hay que trabajar arduamente para que ello ocurra. La criopreservacin con nitrgeno lquido (ver V.3) podra resolver este punto. Por ltimo, si bien muchos factores inciden negativamente para que ello ocurra, lo ideal sera que la semilla sinttica fuera sembrada directamente en el suelo, rindiendo elevados porcentajes de conversin en plantas. Actualmente, en la mayora de los casos, las semillas sintticas son sembradas primeramente en cmaras climatizadas o en invernaderos para luego ser llevadas al campo. 4 Calidad de la semilla sinttica Otro aspecto de gran importancia tecnolgica es el contar con semillas sintticas que, adems de no generar variantes somaclonales, tengan un alto porcentaje de conversin en plantas cuando stas son sembradas en el suelo. Este aspecto se ve afectado por varios factores, entre los que figuran el tipo de embrin, la calidad del endosperma sinttico, la dureza de la cpsula y la proteccin

contra agentes patgenos. Generalmente, la carencia de embriones de calidad es el factor limitante para la produccin de semillas sintticas. Los mismos deben poder generarse rpidamente, en grandes cantidades, sin fusionarse entre s ni formar callos. Deben desarrollarse de manera sincronizada y convertirse rpidamente en plantas. Es adems altamente deseable que conserven su viabilidad por largo tiempo en condiciones de laboratorio o preservados en refrigeradores comerciales. El endosperma sinttico tiene que proteger y nutrir al embrin hasta que germine y pueda crecer autotrficamente. En este punto es preciso recordar que si bien los embriones somticos son muy similares a los embriones cigticos, carecen de las sustancias de reserva necesarias para su conversin en plntulas. El endosperma sinttico generalmente est compuesto de los mismos medios de cultivo que se usan para inducir la germinacin in vitro de los embriones. Estos medios contienen macro y micronutrientes, vitaminas, sacarosa y sustancias reguladoras de crecimiento. La composicin de este endosperma lo hace susceptible al ataque de patgenos, por lo que tambin se incorporan compuestos de accin fungicida y bactericida. Es comn el agregado de 1-5 mg/ L de benomyl y de algunos antibiticos como cefotaxina o ampicilina. La dureza de la cpsula puede afectar, por accin mecnica o por dificultar la respiracin, la conversin de los embriones en plantas. En general, la dureza debe ser del orden de 0,2 y 2 Kg/cm2 de presin, y puede obtenerse mediante una adecuada manipulacin de la concentracin de alginato y de los tiempos de la reaccin de acomplejamiento. 5 Ventajas del empleo de semillas sintticas La mayora de las plantas de inters econmico son propagadas mediante semillas verdaderas. Estas constituyen excelentes propgulos que pueden ser producidos a bajo costo, en forma rpida, y pueden ser sembrados mecnicamente. Adems, la mayora de ellas pueden ser conservadas fcilmente por mucho tiempo. Sin embargo, existen muchas plantas que no se propagan median-

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te semillas verdaderas y lo hacen a travs de sus partes vegetativas, como es el caso, entre otras, de la caa de azcar, mandioca, ajo, frutilla, papa, batata, varios rboles y plantas ornamentales. Otras especies tienen semillas de baja calidad (muchas conferas) o presentan dificultades para la germinacin (como, por ejemplo, la yerba mate). En otras un alto grado de heterocigosis hace que las poblaciones derivadas de semillas sean muy heterogneas (t, yerba mate, paraso), lo que hace muy recomendable su propagacin asexual. Tambin es el caso de muchos hbridos y de plantas que no producen semillas verdaderas o bien el caso de ciertas plantas transgnicas. En todas estas situaciones el uso de semillas sintticas resultara ventajoso. Las plantas podrn ser clonadas y sembradas en el campo utilizando sembradoras similares a las que hoy se emplean con las

semillas verdaderas. Adicionalmente las semillas sintticas podrn actuar como transportadoras de reguladores de crecimiento, microorganismos y pesticidas que se quieran incorporar durante la siembra. De esta manera, los costos de los transplantes se vern reducidos, las poblaciones sern genticamente uniformes y podrn ser comercializados ciertos hbridos resultantes de costosas manipulaciones manuales. En la Tabla 2 se sealan algunas especies para las cuales sera necesario contar con un sistema de semilla sinttica. La falta de una difusin masiva de esta tecnologa en la actualidad obedece a razones tcnicas, ya que en muchas especies an no se ha logrado inducir eficientes sistemas que permitan la generacin de grandes cantidades de embriones somticos de calidad, y econmicas. Los clculos realizados en rela-

Tabla 2. Necesidad de contar con semillas sintticas en algunas plantas leosas subtropicales de inters para la Argentina y estado actual de su desarrollo.

Especie

Estado de desarrollo Estado de Inters en contar con de la induccin de la desarrollo de la semillas sintticas Embriognesis produccin de la Somtica semilla sinttic a XXX X ---

Agua (Chrysophyllum gonocarpum ) Araucarias (Araucaria spp.) Algarrobo (Prosopis spp) Ctricos * (Citrus spp.) Eucaliptos* (Eucalyptus spp.) Mango (Mangifera indica) Paraso (Melia azedarach) Pinos* (Pinus spp.) Quebracho (Schinopsis balansae) T (Camellia sinensis) Toona (Toona ciliata) Yerba mate (Ilex paraguariensis)

XXX XXX XX XXX XX XXX XXX XX

XX --XXX X X XX XX ---

----X ----X X ---

XXX XXX XXX

XXX --X

-------

Ref.: * depende de la especie --- Nulo, X

escaso,

XX

regular, XXX elevado

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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cin a alfalfa indican que su costo de produccin supera en casi cien veces el costo de produccin de la semilla verdadera. Sin embargo, este costo es casi similar o incluso inferior al de la produccin de semillas verdaderas para algunos hbridos de alcaucil, geranio y gerbera. 6 Conclusiones Si bien el uso de semilla sinttica en la agricultura es an incipiente y slo es utilizada en ciertos grupos de rboles forestales, las perspectivas para esta tecnologa son altamente promisorias, pudiendo llegar a convertirse, en un futuro cercano, en el principal mtodo de propagacin de plantas. Si bien los progresos logrados en los ltimos 20 aos han sido notables, existe an la necesidad de realizar estudios bsicos sobre embriognesis somtica para luego abordar los aspectos industriales de la produccin a gran escala de semillas sintticas, tanto de angiospermas como de gimnospermas. En la Argentina, la mayor demanda proviene del sector de productores de plantas leosas, donde el desarrollo de esta tecnologa es an incipiente (Tabla 2). Existe, sin embargo, la capacidad tcnica y humana para encarar este desafo.

7 Lecturas recomendadas
CANTLIFFE, D. J. 2001. Bioreactor technology in plant cloning, Proceedings of the Fourth International Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding. Acta Horticulturae. 560: 345-351. CARLSON, W. C.; HARTLE J. E. 1995. Manufactured seeds of woody plants. In S.M. Jain , P K.Gupta,R.J. Newton (eds.) Somatic embryogenesis in woody plants. London, Kluwer Acad. Press. 1 : 253-263. GRAY, D. J. P., A. 1991. Somatic embryogenesis and development of synthetic seed technology. Critical Reviews in Plant Sciences 10: 33-61. GUERRA, M. P. T., A.C.; TEIXEIRA, J.B. 1999. Embriogenese somtica e sementes sintticas. In: A.C.Torres, L.S.Caldas, J.A.Buso (eds.) Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. CBAB. Embrapa. Brasilia . 2: 533-568. IBARAKI, Y. K., K. 2001. Automation of somatic embryo production. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 65: 179199. JIMNEZ GONZLEZ,E.A.; MENDOZA ,E.Q. 1998. In :Prez Ponce,J.N. (ed.) Propagacin y Mejora Gentica de Plantas por Biotecnologa. Instituto de Biologa de Plantas.Santa Clara. Cuba. pp.225-240. McKERSIE,B.D.; BROWN D.C.W. 1996. Somatic embryogenesis and artificial seeds in forage legumes. Seed Science Research 6: 109-126. MROGINSKI, L. A.; REY, H.; OLMOS, S.; GONZALEZ, V. 1995. Semillas artificiales para la propagacion de plantas. Paradigmas 1: 5-9. TIMMIS,R. 1998. Bioprocessing for tree production in the forest industry: Conifer somatic embryogenesis. Biotechnol. Progress 14: 156-166.

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REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.

V.-Captulo 3
Conservacin de germoplasma in vitro
Scocchi, Adriana; Rey, Hebe 1 Introduccin Desde sus inicios, el hombre ha dependido bsicamente de los vegetales como fuente de energa. Al aumentar rpidamente el tamao de la poblacin, se han ido implementando tcnicas de explotacin, en particular agropecuarias, que han contribuido a la destruccin de las poblaciones vegetales pioneras, que fueron el producto de siglos de evolucin. Por otro lado, las tcnicas modernas de produccin de variedades mejoradas, altamente homogneas, han provocado la reduccin de la variabilidad gentica de las especies cultivadas, ocasionando una verdadera erosin gentica. Es en este contexto en que se recurre a las fuentes genticas originales de variabilidad, las que se deben preservar adecuadamente. Cuando se habla de preservacin de germoplasma hay que subrayar que el objetivo es conservar, con la mayor integridad posible, la variabilidad gentica de las poblaciones seleccionadas. 2 Mtodos empleados para la conservacin de germoplasma La estrategia a seguir para la conservacin de germoplasma depende de la naturaleza del material vegetal, y est definida por la duracin de su ciclo de vida, el modo de reproduccin y el tamao de sus individuos. De acuerdo con estas caractersticas se han intentado diversas alternativas de conservacin, que van desde el tradicional banco de semillas hasta el mantenimiento de reas de reserva. Sin embargo, en muchos casos el mantenimiento no es posible y en otros resulta sumamente costoso, siendo muy elevados los riesgos de prdidas por manipulacin o desastres naturales. Por ello se ha buscado implantar nuevas estrategias para conservar los recursos genticos en una forma ms eficiente.

Los mtodos de conservacin de germoplasma pueden dividirse en mtodos in situ y mtodos ex situ. Los primeros se basan en la conservacin de las plantas en sus hbitat naturales e incluyen la conservacin en parques nacionales y en reservas ecolgicas, lo cual requiere de un considerable espacio fsico e implica altos costos, asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas estn expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios. Por otra parte, los mtodos de conservacin ex situ se basan en el mantenimiento del material biolgico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botnicos). En general, los bancos de semillas constituyen uno de los mtodos ms convenientes para la conservacin de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad gentica en forma econmica y prctica. Para la conservacin de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecacin hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18C). Este protocolo de conservacin es, en general, el ms recomendado para la mayora de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecacin sin que ello implique prdida de viabilidad. A las semillas que presentan estas caractersticas se las denominan semillas ortodoxas, como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en ciertos casos este mtodo de conservacin no es aplicable porque la especie se propaga, en la prctica, vegetativamente, (como la mandioca, papa, caa de azcar, pltanos y bananos), o bien porque sus semillas pierden rpidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecacin. A estas semillas se las denominan semillas recalcitrantes. Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categora, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras. Otro mtodo de conservacin de germoplasma ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos. El descubrimiento de la

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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totipotencialidad de las clulas vegetales y la posibilidad de desarrollar plantas normales y completas a partir de diferentes explantes ha permitido pensar en el establecimiento de bancos de germoplasma utilizando el cultivo de tejidos vegetales. Algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma fueron realizados en mandioca en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y en papa en el Centro Internacional de la Papa (CIP). En 1980 se reconoci el potencial de los mtodos del cultivo in vitro para la conservacin de especies de plantas consideradas difciles (este trmino se refiere a las especies propagadas vegetativamente en forma obligada o que tienen semillas recalcitrantes). En estos casos, la conservacin de los genotipos se realiza mediante el mantenimiento de plantas vivas o mediante el cultivo in vitro de pices caulinares o de nudos. El mantenimiento de los recursos fitogenticos mediante los mtodos de cultivo in vitro se logra generando cambios en el ambiente de cultivo que permiten desacelerar el crecimiento de las clulas y de los tejidos. El objetivo es aumentar al mximo el perodo de transferencia del cultivo. Es esta necesidad la que estimul algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma de diversas especies. Este mtodo cubre un amplio espectro de tcnicas que implican el cultivo, bajo condiciones de asepsia, de rganos o fragmentos de rganos (meristemas, semillas, embriones somticos, embriones cigticos, hojas, tallos, races, yemas, polen, anteras, callos o protoplastos), en un medio de cultivo artificial definido, bajo condiciones ambientales controladas. Esta tcnica ha sido utilizada para mantener colecciones en crecimiento mnimo, para lo cual se requiere: reducir la temperatura, reducir las condiciones de luminosidad, modificar el medio de cultivo, adicionar al mismo inhibidores osmticos o retardantes del crecimiento, deshidratadores de tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente de cultivo. La modificacin de uno o ms de estos factores es usada para la conservacin de numerosas especies, como por ejemplo para la conservacin de microestacas de Manihot esculenta ; de vstagos de especies de

Fragaria , Ipomoea, Rubus , Musa , Saccharum , Zingiber , Ananas , Coffea, Dioscorea y de microtubrculos de Solanum. Estas tcnicas de almacenamiento se realizan a mediano plazo, es decir, se basan en reducir el metabolismo celular y con ello reducir el crecimiento y el nmero de subcultivos durante meses hasta un ao, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos. Desde hace varios aos en el Laboratorio de Cultivo in vitro del Instituto de Botnica del Nordeste (IBONE), en la Facultad de Ciencias Agrarias de la UNNE, se llevan a cabo experimentos referidos a la conservacin de germoplasma de paraso (Melia azedarach). Utilizando como explantes meristemas de clones selectos de paraso mantenidos durante 12 meses a tasas de crecimiento reducidas (medios de cultivo subptimos o empobrecidos y en condiciones de oscuridad) se logr mantener con xito y regenerar plantas de paraso que actualmente se encuentran en la etapa de evaluacin a campo (Fig. 1). En el IBONE tambin se realizan experimentos tendientes a optimizar las tcnicas de conservacin in vitro a largo plazo, que consisten en el almacenamiento a la temperatura del nitrgeno lquido (-196C) crioconservacin, con lo cual se consigue la supresin del crecimiento hasta llegar a un estado de suspensin animada. En el mencionado Instituto se ha logrado la crioconservacin de meristemas de paraso mediante la tcnica de encapsulacin-deshidratacin (Fig. 1). El uso de la crioconservacin para el almacenamiento de germoplasma ofrecen varias ventajas en relacin con las tcnicas tradicionales, pues permiten la conservacin a largo plazo (aos), con bajos costos de mantenimiento, fcil manipulacin de las muestras y no dependen del suministro elctrico. Luego del informe, en 1968, acerca de la crioconservacin de clulas de lino y de los resultados satisfactorios que se obtuvieron con la crioconservacin de meristemas de frutilla en el Instituto de Biotecnologa de Plantas en Saskatoon, Canad, en 1985 se iniciaron algunas investigaciones colaborativas entre el CIAT y el IPGRI para desarrollar esta tcnica para meristemas de mandioca. A partir de estos estudios numerosos trabajos han dado muestras de la importancia de esta tcnica, de sus usos y aplicaciones.

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SCOCCHI, Adriana; REY, Hebe

con el tipo de propagacin de la especie. Por ejemplo, en el caso de la mandioca, especie que se propaga principalmente por va asexual (mediante estacas), en el CIAT se conserva su germoplasma in vitro mediante el cultivo de microestacas y tambin de meristemas, con lo cual paralelamente a la conservacin se consigue el saneamiento de los cultivares. Actualmente se estn realizando estudios tendientes a desarrollar protocolos para la crio-conservacin de meristemas.

Deshidratacin La deshidratacin del explante es un paso crucial para el xito de la crio-conservacin, ya que es necesario eliminar toda el agua libre presenFigura 1: Estrategias para la conservacin de germoplasma de paraso (Melia azedarach te en el tejido veL.), desarrolladas en el Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. IBONE. getal, minimizanFacultad de Ciencias Agrarias. UNNE. do as posibles daos debidos a conLa crioconservacin consta de seis pasos: gelacin. La deshidratacin del tejido puede realizarse en una cmara a 0C o en cmaras Seleccin del material a crioconservar hermticamente cerradas utilizando sustanCuando se realiza la seleccin del mate- cias higroscpicas como silica gel o glicerol (5 rial a crioconservar se debe tener la absoluta - 20%), o sometiendo al explante a una coseguridad de que a partir del mismo se ob- rriente de aire en un flujo laminar de aire estendrn plantas completas. El explante se- tril. leccionado depender del objetivo de conservacin y est estrechamente relacionado Aclimatacin
Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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La aclimatacin puede realizarse en forma rpida o lenta. La aclimatacin rpida consiste en colocar el explante directamente en nitrgeno lquido, con o sin la adicin exgena de crioprotectores. La aclimatacin lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-3C/min.). Este punto debe ser manejado cuidadosamente, pues una deshidratacin excesiva de las clulas puede exponerlas a una alta concentracin interna de solutos. Por esta razn, el material generalmente se congela lentamente, a una velocidad adecuada, hasta alcanzar una temperatura prxima a los -40 C. Luego se lleva directamente a la temperatura del nitrgeno lquido (-196 C). A fin de preparar (aclimatar) el explante para enfrentar las bajas temperaturas a las que ser sometido, se utilizan sustancias crioprotectoras como azcares (sacarosa, glucosa), alcoholes (glicerol, etileglicol, manitol y sorbitol), dimetilsulfxido (DMSO) y polivinilpirrolidona (PVP). Tambin pueden utilizarse soluciones de vitrificacin, que son una combinacin de varios crioprotectores tales como el PVS2, que est compuesto por 30% de glicerol, 15% de etilenglicol, 15% de DMSO y 0.04M de sacarosa. Tanto los crioprotectores como las soluciones de vitrificacin actan fundamentalmente como agentes anticongelantes, aumentando la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo la permeabilidad de las clulas.

nor preparacin para el almacenamiento y comprenden aquellas especies que habitan zonas fras y/o templadas. En cambio, los sistemas hidratados son ms susceptibles a las bajas temperaturas y estn representados por todas aquellas especies que habitan zonas tropicales y subtropicales, las cuales no estn adaptadas para soportar temperaturas inferiores a 0C. Por este motivo estos tejidos deben ser protegidos exgenamente mediante el uso de crioprotectores.

Descongelamiento y rehidratacin Cuando se desea recuperar el explante mantenido en nitrgeno lquido se puede realizar un descongelamiento rpido en bao de agua (generalmente 1-2 min. a 30-40 C) o en forma lenta, sometiendo al explante a la temperatura del laboratorio o a una corriente de aire en el flujo laminar de aire estril. Tests de viabilidad Los tests de viabilidad nos permiten comprobar la/s zona/s del tejido que ha/n muerto y cul/es ha/n sobrevivido al fro. La evaluacin de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma visual, realizando el re-cultivo y determinando la capacidad de regeneracin, utilizando TTC (cloruro de 2,3,5TrifenilTetrazolio) que colorea el tejido que ha sobrevivido a la crioconservacin o midiendo la conductividad elctrica, que permite estimar el dao producido en las membranas celulares. Tcnicas de almacenamiento del material a preservar En la ltima dcada han surgido numerosas tcnicas que combinan el uso de crioprotectores y de soluciones de vitrificacin con tcnicas de deshidratacin y encapsulacin, las cuales bsicamente pueden resumirse en tcnicas de: - Encapsulacin-deshidratacin - Vitrificacin - Encapsulacin-vitrificacin - Desecacin - Precultivo - Precultivo-desecacin - Gotita congelada.
En la Tabla 1 se detallan las especies y

Almacenamiento De acuerdo al material vegetal que se utilice, se presentan dos grandes sistemas:
- Sistemas secos: comprenden todos aquellos tejidos vegetales endgenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin. - Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin, por lo cual se requiere de una proteccin exgena. Esta proteccin puede lograrse a travs del uso de crioprotectores o bien por la utilizacin de soluciones de vitrificacin. Los sistemas secos, por tratarse de tejidos ms resistentes, necesitan de una me-

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Tabla 1: Utilizacin de tcnicas de crioconservacin en diferentes explantes de algunas especies de inters agronmico.
Tcnica Empleada Explante y Especie

Suspensiones celulares de Catharanthus roseus . Meristemas de 125 variedades de Solanum spp. Meristemas de Dioscorea alata, Malus domestica, Pyrus spp. y Morus spp. EncapsulacinApices de Pyrus spp., Malus spp., Saccharum spp. y Solanum Deshidratacin tuberosum Apices caulinares de Camellia japonica, Coffea racemosa x Coffea sessiliflora, Citrus spp, y de Saccharum spp. Embriones somticos de Elaeis guineensis . Clulas nucelares de Citrus sinensis . Lneas celulares embriognicas de Pinus silvestris . Suspensiones celulares y callos embriognicos de Gossypium hirsutum. Meristemas de Pyrus communis, Malus spp y de Pyrus spp., Ipomoea batata, Manihot esculenta (15 genotipos), Prunus spp., y de Solanum spp. Meristemas, polen y anteras de Arachis hypogaea. Vitrificacin pices de Ananas comosus, Colocasia esculenta . Yemas adventicias de Guazuma crinita Mart., Populus alba. Semillas de Bletilla striata Semillas y protocormos de Dendrobium candidum. Suspensiones celulares embriognicas de Oryza sativa . Embriones somticos de Abies cephalonica Semillas, embriones cigticos, polen, anteras y suspensiones celulares de Triticum spp. Meristemas, segmentos nodales, segmentos de raz y yemas Encapsulacin- adventicias de Guazuma crinita, y de Fragaria x ananassa . Vitrificacin Apices de Dyanthus cariophyllus, Armoracia rusticana, Lilium spp. y de Wasabia japonica Meristemas de Morus spp. Embriones somticos de Cucumis melo, y de Elaeis guineensis Embriones somticos y ejes embriognicos de Camellia japonica . Desecacin Ejes embriognicos de Junglans cinerea . Ejes embriognicos y semillas de Gossypium hirsutum. Semillas de Pinus silvestris , y de Apium graveolens . Meristemas de Musa spp. Embriones cigticos de Triticum aestivum, Phaseolus vulgaris y Oryza spp. Precultivo Polen y anteras de Oryza spp Lneas celulares y callos de Oryza sativa . Embriones somticos de Phoenix dactylifera, Coffea spp., PrecultivoPyrus spp., Cucurbita spp., Cocos nucifera, y de Elaeis Desecacin guineensis (aplicada como rutina a 80 clones).
Gotita Congelada Apices de 150 variedades de Solanum tuberosum.

explantes en los cuales cada una de estas tcnicas ha sido empleada con resultados satisfactorios. -Encapsulacin-Deshidratacin La tcnica de encapsulacin-deshidratacin se basa en la metodologa aplicada a las

semillas sintticas, en la cual un explante es recubierto por una matriz de alginato de sodio y polimerizado en una solucin de cloruro de calcio, formando un gel de alginato de calcio alrededor del explante. Una vez encapsulados, los explantes son pretratados, generalmente con sacarosa (desde 0.3 has-

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ta 1.5M), que acta como crioprotector. En especies tolerantes al fro la exposicin de las plantas madres a bajas temperaturas durante varias semanas, previo a la criopreservacin, incrementa la supervivencia. La deshidratacin puede llevarse a cabo sometiendo las cpsulas de alginato (conteniendo a los explantes) a una corriente de aire en el flujo laminar o exponindolas en cmaras hermticamente cerradas con silica gel. Las cpsulas, as deshidratadas, pueden sumergirse directamente en nitrgeno lquido o bien pueden ser llevadas a un descenso lento de temperatura. - Vitrificacin Esta tcnica involucra el pretratamiento de las muestras con soluciones de vitrificacin, como el PVS2, ya mencionado, o bien otra, compuesta por 40% de etilenglicol, 15% de sorbitol y 6% de albmina srica bovina. Luego de la exposicin a las soluciones de vitrificacin (generalmente a una temperatura de 0C, a fin de disminuir los riesgos de fitotoxicidad), las muestras pueden ser sumergidas directamente en nitrgeno lquido o a travs de un descenso lento de la temperatura. Las soluciones crioprotectoras recomendadas en los protocolos de vitrificacin son generalmente txicas para las clulas. El tiempo de exposicin a la solucin debe estar relacionado con el tamao del explante y la misma debe ser removida rpidamente luego del descongelado. - Encapsulacin-Vitrificacin La tcnica de encapsulacin-vitrificacin es una combinacin de las tcnicas de encapsulacin-deshidratacin y vitrificacin. Las muestras son encapsuladas en alginato de calcio y sometidas a vitrificacin durante el enfriamiento. La supervivencia del material vegetal cuando se utiliza esta tcnica es un 30% mejor que cuando se usa la de encapsulacin-deshidratacin. Esto puede explicarse debido a que las cpsulas de alginato de calcio reducen la toxicidad de las soluciones de vitrificacin. - Desecacin La tcnica de desecacin es un proceso muy simple que slo requiere la deshidratacin del material vegetal, la cual es crucial para

el xito de la crioconservacin. Esta tcnica consiste en someter al explante a una corriente de aire en un flujo laminar o en cmaras hermticamente cerradas, que contienen silica gel, luego de lo cual se realiza un enfriado rpido sumergiendo el material directamente en nitrgeno lquido. - Precultivo La tcnica del precultivo involucra la incorporacin de crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del explante) antes del congelamiento. Como ejemplos pueden citarse la adicin de altas dosis de sacarosa para la crioconservacin de meristemas de Musa spp.; la utilizacin de polietilenglicol (PEG) y DMSO en el caso de embriones cigticos de Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris; la utilizacin de sacarosa y DMSO o glicerol en semillas, embriones cigticos, polen y anteras de Oryza spp., y la utilizacin de cido abscsico para la conservacin de lneas celulares y de callos de Oryza sativa. - Precultivo-Desecacin Esta tcnica es una combinacin de dos de las tcnicas descriptas anteriormente. Las muestras son tratadas con crioprotectores, parcialmente desecadas y luego sometidas a enfriamiento rpido o lento. Generalmente en el precultivo se emplean azcares como sacarosa o glucosa. La duracin del tratamiento es variable, desde horas, como en el caso de la conservacin de embriones maduros de Cocos nucifera, donde el cultivo dura 11-20 hs., hasta das, como en el caso de embriones somticos de Elaeis guineensis, que dura 7 das. - Gotita congelada Esta tcnica ha sido aplicada con xito en pices de Solanum tuberosum. Consiste en pretratar el material con DMSO por 2-3 hs. en medio lquido y formar una microgota (2.5 ml), la cual se suspende sobre papel de aluminio y luego se sumerge directamente en nitrgeno lquido. Este procedimiento es una adaptacin de la tcnica clsica desarrollada para meristemas de mandioca. Esta tcnica ha sido satisfactoriamente aplicada en 150 variedades de Solanum tuberosum, con un porcentaje de supervivencia del 40%.

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3 Conclusiones Los recursos fitogenticos constituyen un reservorio de informacin gentica imprescindible para la solucin de muchos de los problemas a los que se enfrenta la agricultura. Los mtodos para asegurar su conservacin son diversos y cada uno de ellos posee sus ventajas e inconvenientes. Por ello, se considera que el conjunto de tcnicas de conservacin in situ y ex situ son mtodos complementarios, no excluyentes, para lograr el objetivo comn de preservar los recursos fitogenticos, como parte esencial de una estrategia global para la conservacin de la biodiversidad. En la ltima dcada se han producido avances significativos en el desarrollo de tcnicas in vitro de conservacin. La disponibilidad de bancos de germoplasma in vitro, tanto en condiciones de crecimiento lento como la conservacin a temperaturas ultrabajas (crioconservacin), han contribuido a dicho avance. Las tnicas de crecimiento lento son utilizadas como rutina en centros internacionales tales como el CIAT (Cali, Colombia), donde se aplican a la conservacin de germoplasma de mandioca y para la conservacin de germoplasma de papa en el CIP (Centro Internacional de la Papa, Per). Las

tcnicas de crioconservacin ofrecen una alternativa muy valiosa cuando se piensa en conservar los recursos fitogenticos por tiempo ilimitado (aos), si bien hasta el momento slo se aplica como rutina para la conservacin de lneas celulares en laboratorios de investigacin y para la conservacin de algunos genotipos pertenecientes a los gneros Rubus spp. , Pyrus spp. , Solamun spp. y Elaeis guineensis. 4 Lecturas recomendadas
ENGELMANN, F. 1997. Status report on the development and application of in vitro techniques for the conservation and use of plant genetic resources. Engelmann, F. (ed.) IPGRI :1-63. ENGELMANN, F. and H. TAKAGI. 2000. Cryopreservation of tropical plant germoplasm. Current research progress and application. Engelmann, F. and H. Takagi (eds.) JIRCAS-IPGRI pp 496. MROGINSKI, L.A., W.M. ROCA, K.K. KARTHA. 1991. Criopreservacin del Germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca W. M. y L. A. Mroginski (eds.) CIAT (32) :715-730. ROCA, W.M., D.I. ARIAS y R. CHVEZ. 1991. Mtodos de conservacin in vitro de germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca, W.M. y L.A. Mroginski (eds.) CIAT (31) :697-714.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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PARTE VI Mtodos de anlisis de la variabilidad

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OLMOS, Sofa y DI RENZO, Miguel

VI.-Captulo 1
Consideraciones estadsticas y biolgicas para estimar variabilidad gentica
Olmos, Sofa; Di Renzo, Miguel 1 La variacin biolgica La variabilidad gentica es un hecho universal en las poblaciones reproductivas y una condicin preliminar necesaria para el cambio evolutivo y para la respuesta al mejoramiento gentico mediante seleccin o hibridacin. Por otra parte son conocidos los peligros que implica la uniformidad y la falta de diversidad en las especies cultivadas y en los animales domsticos, como consecuencia de la erosin gentica. La variacin que presentan los individuos de una poblacin puede ser discontinua o continua. Los caracteres cualitativos de variacin discontinua, como los marcadores moleculares, permiten clasificar a los individuos sin ambigedades, ya que estos caracteres estn regidos por uno o por pocos genes y el ambiente no tiene efecto en su manifestacin fenotpica. En cambio, los caracteres cuantitativos, representados por la mayora de los caracteres de inters agronmico, presentan variacin continua y los fenotipos, que estn determinados por poligenes y por efectos ambientales, son difciles de clasificar en categoras discretas. Para su anlisis deben emplearse mtodos biomtricos, que no miden el efecto de genes individuales o de segmentos cromosmicos especficos, sino de todo el genoma. Durante los ltimos aos ha surgido un consenso entre los mejoradores y genetistas moleculares sobre la conveniencia del uso de marcadores moleculares para asistir a la seleccin de caracteres cuantitativos (MAS, Marker Assisted Selection). La biotecnologa ha colaborado mediante la construccin de mapas genticos saturados, esto es, con innumerables marcadores moleculares a lo largo de los cromosomas, que permiten ubicar regiones de actividad cuantitativa (QTL, Quantitative Trait Loci). De esta manera, un

carcter de variacin contnua puede ser manejado como si se tratara de un carcter de herencia mendeliana mediante la introgresin de un fragmento de cromosoma conteniendo un QTL por retrocruzamientos sucesivos en las variedades comerciales. Los QTL representan un nuevo sistema de enfocar el estudio bsico y el manejo prctico de los sistemas polignicos y de la gentica cuantitativa. 2 Experimento cientfico La ciencia, que tiene como objetivo la explicacin y la prediccin de los hechos, cuenta con el mtodo cientfico como un procedimiento que contempla un proceso en flujo desde los hechos observados hasta la proposicin de hiptesis explicatorias. Un requisito fundamental en toda ciencia fctica es la contrastacin de las hiptesis planteadas, poniendo a prueba las mismas mediante una confrontacin con la experiencia. El diseo experimental crea artificialmente las condiciones para la contrastacin de la hiptesis y brinda la metodologa estadstica correspondiente para el anlisis de los datos. El experimento cientfico, que como queda dicho es un ensayo destinado a probar la validez de una hiptesis, se basa en la reproduccin de ciertos fenmenos bajo condiciones controladas con el objeto de medir el efecto que produce la modificacin de uno o varios factores en estudio (tratamientos) sobre la variable dependiente. El ensayo , cuidadosamente diseado, deber ser lo ms simple posible, evitando los errores tendenciosos y sistemticos (biass=sesgo) de manera tal que los datos recavados provean conclusiones con un amplio rango de validez. Por otra parte, para magnificar el efecto de los tratamientos y disminuir el error experimental, se procura minimizar el efecto de otros factores no controlados que ejercen influencia en las observaciones. Esto se logra utilizando materiales y condiciones experimentales lo ms homogneas posibles. De esta manera, las variaciones observadas se debern casi exclusivamente a los tratamientos. Para conocer el efecto de los factores controlados y el de los factores no controlados (error experimental) sobre el material

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experimental es necesario formular claramente una hiptesis, utilizar un diseo experimental apropiado y analizar e interpretar los resultados obtenidos. Por ejemplo, la aplicacin de distintos tratamientos (ej.: distintas dosis de fertilizante = causa), producen variaciones sobre una caracterstica de inters (ej. rendimiento = efecto):

- Variable independiente: es la causa que afecta los resultados del experimento y est representada por los distintos niveles del factor cuyo efecto se quiere medir (tratamientos) o que se quiere controlar (bloques). - Variable dependiente: variable respuesta o simplemente variable es el rasgo o carcter de inters cuyas mediciones constituyen los datos u observaciones del experimento. Ej. rendimiento (kg./ha), dimetro de colonia (mm); ( variables continuas), tiempo a panojamiento (das), tamao de camada, nmero de colonias (nmero), grado de respuesta a un patgeno (tolerante, intermedio, susceptible), (variables discretas). La variacin de estos datos permite cuantificar el efecto del factor al que est sometido el material. 3 Hiptesis estadstica Como se indicara previamente, el experimento cientfico es un ensayo destinado a probar la validez de una hiptesis. Las hiptesis estadsticas plantean supuestos referentes a algn parmetro poblacional. Por lo general se utiliza la hiptesis nula (Ho), que se refiere a la igualdad entre los parmetros probados. Frente a la Ho se plantea una hiptesis alternativa (Ha). Para determinar si un tratamiento tuvo algn efecto, se considera a la Ho como la ausencia de efectos, lo que equivale probar la igualdad entre las medias de los tratamientos. La Ha plantea que al menos una de las medias difiere significativamente del resto, o sea que al menos uno de los niveles del factor probado tiene efecto sobre la variable de inters. Las hiptesis estadsticas tambin prueban otras caractersticas poblacionales, como por ejemplo la igualdad entre varianzas o entre coeficientes de regresin. El ensayo y las pruebas de significancia permiten calcular la probabilidad a favor de la hiptesis nula. Es decir que P es la probabilidad que la Ho sea verdadera. Si la probabilidad calculada es igual o mayor que un nivel de significancia preestablecido (de 0,05 por ejemplo), la Ho no se rechaza y se infiere que no hay diferencias significativas entre las medias de los tratamientos. Se concluye que los tratamientos no tienen efecto significati-

Terminologa - Factor: es la causa cuyo efecto se quiere medir (ej. fertilizante, competencia, medio de cultivo) - Nivel: es cada una de las categoras o alternativas del factor en estudio (ej. dosis de un fertilizante, densidades de siembra, pH de los medios de cultivo). - Tratamiento: Es cada nivel del factor en estudio. Si se estudia el factor fertilizante, cada dosis (o nivel) es un tratamiento distinto. Si se prueba el efecto de concentraciones crecientes de un fertilizante los tratamientos tendran un orden natural ( discreto ordinal); pero si se prueban distintas combinaciones de fertilizantes (NPK), no habra un orden entre los tratamientos ( discreto categrica). Cuando se estudian dos (o ms) factores simultneamente, los distintos tratamientos resultan de la combinacin de cada nivel de un factor con cada nivel del otro factor. Por ejemplo, si se estudia el efecto de fertilizante y competencia, cada tratamiento resulta de la combinacin de una dosis de fertilizante y una densidad de siembra determinada.

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vo en la variabilidad del carcter estudiado y las diferencias observadas no son mayores que las que se produciran por azar. En cambio si la probabilidad calculada es pequea (P0,05) se rechaza la Ho y se infiere, de acuerdo con la Ha, que hay diferencias significativas entre los tratamientos. Si P0,01 se dice que las diferencias son altamente significativas.

El anlisis de la varianza es un procedimiento aritmtico que permite la descomposicin de la varianza total en varianzas parciales. El cociente entre las varianzas permite obtener un valor de F calculado (Fc), el cual se compara con un F de tabla (Ft) para un determinado nivel de significacin (por ejemplo = 0,05) y los grados de libertad de los tratamientos y del error. Los programas de computacin calculan directamente el P (la probabilidad) del test. Varianza total Se puede considerar a la variacin total como la resultante de dos fuentes de variacin: una fuente de variacin debida a las diferencias entre grupos o tratamientos, sealadas por los promedios de stos y otra debida a la diferencia dentro de los tratamientos, que se calcula sobre la base de las diferencias entre las observaciones de cada tratamiento. Varianza entre tratamientos Para aislar la variacin entre los grupos necesitamos suprimir la variacin dentro de los tratamientos. Podemos obtener este resultado haciendo a todos los individuos de un mismo grupo iguales entre s e iguales a la media del grupo. Mediante esta operacin, la variacin entre los grupos no se modifica mientras que toda la variacin dentro del grupo queda anulada. Varianza dentro de tratamientos Para obtener la varianza dentro de los grupos debemos tener en cuenta solamente la variacin entre las observaciones de un mismo tratamiento. La variacin dentro de un tratamiento se debe a las desviaciones que presentan los valores individuales en ese grupo en relacin con la media de ese grupo. 5 Anlisis multivariado El anlisis multivariado brinda los mtodos estadsticos para el anlisis conjunto de dos o ms variables que pueden estar interrelacionadas. Esta rama de la estadstica comprende procedimientos y tcnicas para la sntesis, la presentacin y el anlisis multidimensional de caracteres, tanto cualitativos como cuantitativos, obtenidos a par-

El nivel de significancia, generalmente designado por , representa hasta qu punto, en trminos de probabilidad, estamos dispuestos a aceptar un error de tipo I, es decir, rechazar una Ho que sea verdadera. Esto conlleva a que aceptemos una Ho como verdadera con una probabilidad 1-. Si se fija = 0,05 estamos dispuestos a aceptar el error tipo I aproximadamente una de cada 20 veces. 4 Anlisis univariado Los anlisis univariados emplean una variable dependiente, mientras que los anlisis multivariados comparan muestras sobre la base de dos o ms variables que estn relacionadas. La significancia estadstica de una diferencia entre dos medias puede verificarse mediante una prueba t o mediante una prueba F. Ambas son equivalentes, t2 = F. La prueba F, que es un cociente de varianzas, es una generalizacin de la prueba t, especialmente til cuando se comparan ms de dos tratamientos. En el anlisis de la varianza (ANOVA), por ejemplo, se utiliza la prueba F para verificar la igualdad de medias. Prueba F Una prueba F consiste en un cociente entre dos varianzas: F = s2entre / s2dentro Para realizar la prueba F resulta necesario descomponer la varianza total (s2total) en dos componentes: s2entre y s2dentro

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tir de un nmero de individuos, una OTU Operational Taxonomic Unit, objetos o tratamientos. Debido a que las variables se consideran en forma simultnea, estas tcnicas permiten realizar interpretaciones ms complejas a las que surgen mediante la utilizacin de mtodos univariados. El anlisis multivariado colabora en la comprensin ms adecuada y completa de las ciencias biolgicas; por tal motivo, en este captulo se brindar un panorama simplificado y algunos comentarios sobre las tcnicas ms usuales con la finalidad de poder discernir y elegir la metodologa ms apropiada para analizar la informacin que se disponga. Hay algunas razones que justifican el anlisis conjunto de diferentes variables en lugar de analizar cada variable separadamente por mtodos univariados. Por ejemplo, cuando se trata de probar hiptesis mediante procedimientos de inferencia estadstica. En este caso, la aplicacin del anlisis univariado a cada una de las variables aumenta el error Tipo I mientras que la aplicacin del anlisis multivariado preserva el valor de y aumenta en muchos casos el poder del test (1-). El anlisis multivariado utiliza las relaciones (correlaciones) entre las variables o entre los objetos que el mtodo univariado directamente no considera. El anlisis multivariado aprovecha estas relaciones para buscar en los datos patrones o estructuras enriqueciendo as la descripcin de los mismos. En el captulo siguiente (VI.2) se desarrollarn en ms detalle algunas metodologas multivariadas, seleccionandose aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. Anlisis exploratorio y confirmatorio Con los datos provenientes de observaciones realizadas sobre un hecho en particular es necesario, en primer lugar, realizar un anlisis exploratorio. Posteriormente, mediante las inferencias realizadas a partir de este anlisis y con la informacin que se pueda disponer acerca de los mecanismos que originan el proceso biolgico, es posible desarrollar un anlisis confirmatorio y as plantear un modelo descriptivo de causalidad, el que, a su vez, es confirmado mediante una prueba de bondad de ajuste.

En otras palabras, toda investigacin llevada a cabo especialmente en reas nuevas, donde existen pocos antecedentes, comienza con una exploracin de los datos con el objeto de reconocer cualquier estructura o patrn no aleatorio que requiera una explicacin. En una segunda etapa, es posible que surja la necesidad de formular la pregunta, lo cual es a menudo ms interesante que buscar la respuesta subsiguiente, ya que el objetivo primordial es, en primer lugar, generar hiptesis interesantes que promuevan estudios ms avanzados. En este caso, los mtodos que estn diseados para responder a preguntas especficas no seran necesarios. En cambio resultaran apropiados aquellos mtodos que puedan detectar un patrn de comportamiento no previsto en los datos y que, adems, abran un amplio campo de posibles explicaciones del proceso. Estas tcnicas generalmente se caracterizan por el nfasis puesto en la utilizacin de representaciones visuales y grficas y por la carencia de modelos estocsticos, donde la significacin estadstica de los resultados pierde importancia. La aplicacin de los anlisis confirmatorios se vuelve ms apropiada cuando el investigador tiene en mente hiptesis bien definidas. Es aqu donde son necesarias las pruebas de significacin estadstica. Sin embargo, no existe una divisin muy estricta entre tcnicas exploratorias y confirmatorias. Por ello sera importante que el investigador tenga una perspectiva flexible y pragmtica para analizar sus datos y una experiencia suficiente que le permita elegir la herramienta analtica adecuada. El error ms grave que se podra realizar en este sentido sera arribar a conclusiones que expliquen causas a partir de datos exploratorios y descriptivos sin haber realizado ningn tipo de diseo experimental para probarlos. Se plantea como causa probable de esta tendencia generalizada el mal uso semntico entre las terminologas estadsticas y las biolgicas. El uso estadstico de trminos como efectos o variable independiente no implica causalidad. Sntesis de mtodos: objetivos y limitaciones Los anlisis multivariados ms comnmente adoptados, en orden decreciente, son:

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anlisis de componentes principales, anlisis lineales. Cuando se utilizan combinaciones de de funciones discriminantes, anlisis de variables hay que considerar que el coeficienagrupamientos o clusters, regresin mltiple, te que afecta a una variable representa la anlisis multivariado de la varianza, anlisis contribucin de esta variable a la combinade correspondencia, coordenadas principa- cin lineal y que este valor depende de las les, anlisis factorial, correlacin cannica, otras variables incluidas en el anlisis. No se modelos logartmicos lineales, escalamiento considera correcto el empleo de estos coefimultidimensional, y la regresin logstica ml- cientes individuales para la interpretacin de tiple. dichas correlaciones. En la Tabla 1 se mencionan los objetivos Antes de aplicar cualquier tcnica de angenerales de los mtodos de anlisis lisis resulta imprescindible realizar un examen multivariado ms utilizados. Los procedimien- inicial de los datos. El examen inicial, bsicatos enumerados del 1 al 7 utilizan combina- mente, consiste en la evaluacin de datos ciones lineales de las variables, estos mto- faltantes, identificacin de outliers (fuera dos son ms eficientes con datos continuos, del rango o fuera de tipo) y cuando el anlimientras que aquellos mtodos enumerados del 8 al Tabla 1. Objetivos y limitaciones de los 12 tipos de anlisis multivariados ms comnmente utilizados. 12, comprenden mtodos no lineales y son ms apropiados cuando se cuenta con datos binarios. Los mtodos lineales son apropiados cuando se quiere interpretar combinaciones ptimas de variables (por ejemplo, componentes principales en ACP (anlisis de componentes principales), factores en AF (anlisis factorial, funciones discriminantes en AD (anlisis discriminante). Quienes aplican mtodos lineales, usualmente asumen que los valores de las variables incrementan o decrecen regularmente y que entre ellas no hay interacciones. Estas relaciones no lineales en el MANOVA aparecen en los trminos de las interacciones y pueden revelar efectos no lineales importantes en el anlisis de datos experimentales. Para examinar con mayor eficiencia datos binarios (presencia/ausencia) y datos en rangos, se pueden usar otros modelos donde las variables se combinan acordes con funciones no

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sis multivariado a emplear as lo requiera, verificar si se cumplen los supuestos bsicos de normalidad, homogeneidad de varianzas, independencia de error y linealidad. Por otro lado, y al igual que en el anlisis univariado, hay que tener precauciones con el uso del nivel de significancia () que se adopte, de las subsiguientes inferencias es-

tadsticas y de las conclusiones a que se arriba luego del anlisis. Las conclusiones confirmatorias solamente se justifican si los estudios estuvieron basados en un muestro apropiado. Esto significa que la inferencia est justificada en relacin a la forma en que los datos fueron tomados y en que el experimento fue realizado, ms que en la tcnica de anlisis en s misma. Las inferencias slo estn justificadas cuando los datos son tomados de una muestra grande y bien definida. Cuando esto no ocurre, los valores de probabilidad directamente no se deberan informar y las conclusiones a las que se arriba slo deberan limitarse a los datos utilizados y a las condiciones en las que se desarroll el experimento. De la misma manera resulta poco aconsejable elaborar generalizaciones demasiado amplias cuando los estudios se realizan sobre casos particulares o especficos que no son representativos. A menudo sucede que el investigador prefiere o necesita interpretar las variables en forma separada cuando maneja un grupo de variables correlacionadas. En estos casos sera ms apropiado utilizar mtodos univariados, con el complemento de pruebas de Bonferroni ajustadas. Sin embargo, cuando sea posible, la consideracin conjunta de las variables, mediante la aplicacin del anlisis multivariado, puede brindar conclusiones ms fuertes que las logradas a travs de un grupo de comparaciones simples. Si se tiene cuidado durante el proceso de in-

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terpretacin de resultados, las combinaciones de variables (componentes, factores, etc.) podran ser de significativa importancia para estudiar un proceso. El uso racional de la estadstica multivariada, el modelamiento y el conocimiento biolgico pueden ayudar al investigador a disear con criterio un experimento crucial y a llegar a conclusiones consistentes. Como dijimos anteriormente, el anlisis multivariado aprovecha las relaciones entre las variables para buscar patrones o estructuras en los datos. En este sentido, podra encontrarse un origen de patrones cuando se realizan mediciones sobre grupos de objetos similares. Pueden existir casos donde no se conoce a priori si los grupos estn ya formados, cuntos son, o cules objetos pertenecen a cada grupo; es all donde habra que ver qu tipo de anlisis es ms apropiado. En general, en esta etapa se podran usar mtodos como los de ordenamiento de objetos (donde se logra la reduccin de dimensiones entre las variables o entre objetos a una o pocas dimensiones). Otra posibilidad es hacer anlisis de agrupamientos donde los objetos se clasifican en categoras jerrquicas sobre la base de matrices de similitud entre los mismos. En el primer caso, los objetos son representados en un espacio grfico en los cuales los ejes constituyen gradientes de combinaciones de variables. El mtodo de anlisis de componentes principales (ACP), que es un ejemplo de anlisis por ordenamiento, utiliza para tal fin las estructuras de los autovectores (tambin llamados eigens races latentes) de la matriz de correlacin o bien de una matriz de varianza-covarianza entre las variables originales. El ACP y el anlisis factorial (AF) tienen como objetivo encontrar una estructura ms simple reduciendo la dimensionalidad de las variables sin perder informacin. Para simplificar el anlisis de los datos se reduce el nmero de variables a un pequeo nmero de ndices o factores. Algunas diferencias entre estas dos tcnicas son que las componentes principales estn definidas como una combinacin lineal de la variables originales y no estn basadas en un modelo estadstico particular y por lo tanto no se requiere el cumplimiento de supuestos previos. En el AF las variables estn expresadas como una combi-

nacin de factores, est basado en un modelo especial y requiere el cumplimiento de distintos supuestos. Por otra parte mediante el ACP se busca explicar una gran parte de la varianza total, mientras que con el AF se enfatiza el estudio en las relaciones entre las variables explicadas con las covarianzas o correlaciones. El AF resulta apropiado cuando el objetivo consiste en encontrar un grupo de variables similares, altamente correlacionadas, y postular que esas similitudes provienen del hecho de que stas son variables latentes o factores que actan en forma particular sobre el proceso estudiado. Cuando el investigador est interesado en definir grupos homogneos de objetos y estudiar la estructura natural de las observaciones puede aplicar el anlisis de clusters. El objetivo consiste en descomponer un conjunto de objetos en dos o ms grupos basados en la similitud de los objetos debido a una serie de caractersticas especificadas. El uso tradicional de clusters ha sido para propsitos exploratorios. Dado que no es una tcnica de inferencia estadstica, para que los clusters de objetos exhiban la mayor homogeneidad interna y la mayor diferenciacin entre clusters slo se requiere que la muestra sea representativa y que las variables no sean multicolineales. En este anlisis, adems, slo se deben incluir aquellas variables que contribuyan a caracterizar los objetos y que se encuentren relacionadas con los objetivos del anlisis. Este anlisis es similar al AF, la diferencia es que ste agrupa a variables, mientras que el anlisis de clusters agrupa a objetos. Se recomienda que un anlisis de clusters sea posteriormente complementado con un anlisis de funciones discriminantes (AD) sobre los grupos previamente identificados. El escalamiento multidimensional (EMD), involucra una serie de tcnicas que ayudan al analista a identificar dimensiones subyacentes en la evaluacin de objetos. Es especialmente utilizado en ciencias del comportamiento, ya que permite identificar dimensiones no conocidas que afectan el comportamiento. Se basa en evaluaciones comparativas de objetos cuando las bases de comparacin son desconocidas o indefinibles. Se transforma el comportamiento de quienes perciben los objetos en distancias, las que fi-

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nalmente se representan en un espacio multidimensional. Si bien mediante el anlisis de clusters los objetos se agrupan de acuerdo con sus caractersticas, con el EMD no se enfoca el inters en los objetos en s sino ms bien, en cmo stos son percibidos. Esta tcnica mide la correlacin o covarianza de los estmulos derivados de las caractersticas de los objetos a ser evaluados. As, las representaciones grficas enfatizan las relaciones entre los estmulos que se estudian. El anlisis de correspondencia (AC) es un procedimiento de ordenacin apropiado para datos de frecuencias (tablas de contingencia). En este caso, la distincin entre objeto y variable es menos relevante porque stos son ordenados en forma simultnea. Cuando los objetos o individuos se renen en dos o ms grupos, definidos a priori, frecuentemente se plantea el problema de cmo describir las diferencias entre grupos sobre la base de un conjunto de variables. El propsito bsico del AD es estimar la relacin que existe entre una variable dependiente cualitativa (machos vs. hembras o genotipos resistentes vs. genotipos susceptibles) y entre un grupo de variables independientes cuantitativas con distribucin normal. Lo mismo que en el caso de ACP y AF, el AD se basa en la posibilidad de encontrar una combinacin lineal de las variables originales. Como caracterstica, el AD permite identificar aquellos grupos ya formados a los cuales pueden ser asignados nuevos objetos en estudio (individuos, genotipos). Posibilita adems la identificacin de cul o cules de las variables independientes contribuye ms a la diferenciacin entre grupos. El anlisis multivariado de la varianza (MANOVA) es un procedimiento de inferencia estadstica usado para evaluar la significancia de la diferencia entre los grupos, que se hallan delimitados sobre la base de las distintas variables independientes discretas o tratamientos. Es una extensin del ANOVA, slo que las diferencias se establecen teniendo en cuenta simultneamente dos o ms variables dependientes cuantitativas de distribucin normal. Por ello este anlisis es particularmente til cuando los datos provienen de diseos experimentales. Tambin pude ser considerado como una extensin del AD, aunque en ste la nica

variable dependiente es categrica y las variables independientes son cuantitativas, mientras que el MANOVA involucra un grupo de variables dependientes cuantitativas y las variables independientes son cualitativas. Las correlaciones cannicas (CC) reducen las dimensiones de dos grupos de variables provenientes de un mismo conjunto de objetos o individuos de manera que se puedan estudiar las relaciones conjuntas entre los grupos. Es similar al AD slo que en las CC las variables (no los objetos o individuos) son divididas en grupos, por lo que el inters se centra sobre las relaciones entre los grupos de variables. Por ejemplo, las CC se pueden utilizar cuando interesa conocer la relacin existente entre los patrones de marcadores moleculares, que representan diferentes genotipos, y algunas caractersticas ambientales donde viven los individuos muestreados. La regresin mltiple (RM) se considera el mtodo apropiado cuando se presume que los valores de una variable continua dependen de los valores que tomen las otras variables. Esta tcnica, que explora todo tipo de relaciones dependientes, tiene como objetivo predecir los cambios en una variable dependiente cuantitativa en respuesta a los cambios en las distintas variables independientes o predictoras. Los modelos de RM constituyen la base para la estimacin de parmetros en gentica cuantitativa. Son ejemplos de su aplicacin la descomposicin del valor genotpico en el efecto medio de cada alelo y las interacciones debidas a dominancia y epistasis, el clculo de la estabilidad de los genotipos mediante la descomposicin de la interaccin genotipo ambiente, el parecido entre parientes, la ubicacin y la utilizacin de QTL mediante marcadores moleculares. La ecuacin de regresin es una combinacin lineal de las variables independientes que mejor predicen la variable dependiente. La seleccin de las variables con mayor poder de prediccin se realiza mediante aproximaciones secuenciales, llamadas estimaciones stepwise (pasos inteligentes). Mediante los coeficientes de regresin estandarizados es posible determinar la importancia relativa de cada variable predictora. Las variables in-

196

OLMOS, Sofa y DI RENZO, Miguel

dependiente y dependiente deben ser cuantitativas si bien, mediante transformaciones previas, es posible incluir variables independientes no mtricas. La aplicacin del anlisis de RL permite predecir una variable dependiente binaria (0,1). Es importante tener en cuenta que para asignar causalidad en forma justificada es necesario disponer de una cantidad adecuada de datos biolgicos experimentales. Si se cumplen los supuestos bsicos, en especial la normalidad de las variables, no hay mayores diferencias entre la RL y el AD, slo que en el caso que sea posible formar ms de dos grupos, este ltimo resulta el ms apropiado. Los modelos logartmicos lineales (LOGL) comprenden a otros anlisis que permiten mostrar las relaciones que existen entre variables categricas.

Lecturas recomendadas EVERITT, B.S.; DUNN, G. 1991. Applied Multivariate Data Analysis. E. Arnold, London. HAIR, J.F.; ANDERSON, R.E.; TATHAM, R.L.; BLACK, W.C. 1995. Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. Prentice Hall - Upper Saddle River, New Jersery. MANLY, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. RENCHER, A.C. 1995. Methods Of Multivariate Analysis. J. Wiley & Sons, Inc. New York.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

197

VI.-Captulo 2
Mtodos para estimar variabilidad gentica
Winzer, Nlida; Di Renzo, Miguel; Olmos, Sofa 1 Introduccin La informacin procesada a partir de las tcnicas que se desarrollan en este libro pueden ser de diversos tipos y puede tratarse, por otro lado, del anlisis de una sola variable o de varias variables evaluadas en cada individuo o muestra. Los anlisis estadsticos a utilizar dependen de estos dos aspectos, tipo de datos y nmero de variables, y, adems, de qu objetivo se haya planteado el investigador. Si se trata de una sola variable se podrn aplicar las tcnicas aprendidas en un curso bsico de estadstica (comparacin de dos medias, anlisis de la varianza, anlisis de regresin, pruebas chi-cuadrado, etc.), o bien alguna de sus generalizaciones. En este captulo se desarrollarn en ms detalle algunas metodologas multivariadas. Se han seleccionado aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. Los datos multivariados se ordenan en una matriz. A efectos de unificar el lenguaje se considerar que cada fila de la matriz representar un individuo, una muestra, una especie; en definitiva, una OTU (Operational Taxonomic Unit). Las columnas representarn los caracteres o variables que se observan en cada OTU. 2 Tipo de datos DATOS DOBLE ESTAD: Son los tambin llamados datos binarios o dicotmicos. Estos datos se presentan cuando el carcter puede tomar slo dos estados posibles. Habitualmente se codifican como 0 1. Hay que reconocer dos tipos de situaciones donde pueden aparecer datos binarios. a) Datos de presencia o ausencia. Slo se registra la presencia ausencia del carcter.

Ejemplo: Presencia o no de una banda en una corrida electrofortica de isoenzimas o marcadores moleculares. b) Datos doble estado excluyentes. El carcter tiene slo dos estados posibles y la asignacin del 0 el 1 es indistinta. Ejemplos: Carcter: Sexo. Codificacin: Hembra = 0, Macho = 1, Hembra = 1, Macho = 0. Tipo de Fruto: dehiscente indehiscente. Clasificacin de hojas: paripinadas imparipinadas. La distincin entre uno u otro tipo de dato binario es importante al momento de seleccionar la medida de asociacin. DATOS MULTIESTADO CUALITATIVOS: El carcter puede tomar un conjunto finito de estados. Ejemplos: Margen de la hoja: aserrado, lobulado, entero. Color de la flor: blanca, roja o rosada. Disposicin de fololos en el raquis: alternos, subopuestos, opuestos. Identificacin de los nucletidos presentes en una determinada secuencia de ADN: A,C, T, G. Identificacin de los aminocidos esenciales presentes en una protena: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Tyr, Met, Trp, Asn, Gln, His, Asp, Glu, Lys, Arg. Clases de embriones somticos: globular, acorazonado, torpedo, cotiledonar. DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS DISCRETOS: estn asociados a valores de conteo. Ejemplos: Nmero de hileras por espiga, nmero de macollos por planta, nmero de inflorescencias. DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS CONTNUOS: Representan propiedades que se pueden expresar en una escala contnua. Ejemplos: Biomasa de plantas, peso de semillas, longitud de partes verdes, concentracin de protena del grano, frecuencia relativa de un alelo. 3 Medidas de asociacin y distancia Un objetivo frecuente suele ser la descripcin del grado de parecido que hay entre las

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OTUs,. Para ello ser necesario medir ese grado de similitud. Se describirn a continuacin algunas de las medidas que aparecen con mayor frecuencia en la literatura. Hay dos tipos de medidas: los ndices de asociacin y las distancias. Los primeros miden el grado de similitud: Cuanto ms parecidas sean 2 muestras, mayor ser su asociacin. Las segundas miden el grado de disimilitud: cuanto ms parecidas son 2 muestras menor ser su distancia. Para datos binarios es usual trabajar con medidas de asociacin. Entonces, para caracterizar a dos OTUS existen 4 valores a considerar: a = N de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 1; b = N de caracteres donde la primera muestra tiene un 1 y la otra un 0; c = N de caracteres donde la primera muestra tiene un 0 y la otra un 1; d = N de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 0. La suma de estos 4 valores dar el total de caracteres medidos.

J12 =

a a+b+c

Es la proporcin de caracteres presentes que comparten, respecto al total de caracteres presentes en las 2 OTUs. DICE

D12 =

Es la proporcin de caracteres copresentes respecto al promedio de los caracteres presentes en cada OTU. Se puede probar que Jaccard siempre dar un valor de asociacin menor que Dice, salvo cuando toman el valor 0 1, caso en que siempre coinciden. Ms an, ambos estn relacionados mediante la ecuacin J = D/ (2-D) D = 2J/(1+J). Esta relacin tiene como consecuencia, entre otras, que en un Anlisis de Cluster, cuando se usa ligamiento simple o completo, den los mismos grupos, slo que con distintos valores de asociacin. Ejemplo: Como resultado de la aplicacin de la tcnica RAPD sobre 6 muestras se registr la siguiente informacin sobre la presencia o ausencia de 8 bandas generadas por un cebador: Este es un proceso tpico en el anlisis de la informacin a partir de bandas. Primero se codifica la informacin, se construye la matriz de datos y, en este caso, se calcularon

2a a = + + (a + c) (a b) 2a + b + c 2

OTU 2

1 0

OTU 1 1 0 a b c d
A B 1 2 3 4 5 6 7 8

F
1 2 3 4 5 6 7 8

Si los datos son de presencia/ausencia, un criterio vlido es considerar que dos muestras son ms parecidas cuantos ms unos compartan. La coincidencia de ceros no aporta a la similitud porque puede estar generado por falta de informacin (la no amplificacin de un fragmento RAPD no informa si esto es producido por la carencia del sitio de hibridacin del cebador o bien como consecuencia de una mutacin de punto en dicho sitio, por ejemplo). Dos de los ndices que comparten este criterio son Jaccard y Dice. JACCARD

Codificacin

A 1 1 0 1 1 0 1 0

B 0 1 1 1 1 0 0 0

C 0 0 1 0 0 1 0 1

D 1 1 1 0 0 0 0 0

E 1 1 0 1 1 0 1 0

F 0 1 1 1 1 1 1 1

Matriz de Datos
1 1 0 0 1 1 0 2 1 1 0 1 1 1 3 0 1 1 1 0 1 Bandas 4 1 1 0 0 1 1 5 1 1 0 0 1 1 6 0 0 1 0 0 1 7 1 0 0 0 1 1 8 0 0 1 0 0 1

A B C D E F

Asociacin de Jaccard
A A B C D E F B C D E F A A B C D E F

Asociacin de Dice
B C D E F

1 0.5 0 0.333 1 0.5

0.5 1 0.167 0.4 0.5 0.571

0 0.167 1 0.2 0 0.429

0.333 0.4 0.2 1 0.333 0.25

1 0.5 0 0.333 1 0.5

0.5 0.571 0.429 0.25 0.5 1

1 0.667 0 0.5 1 0.667

0.667 1 0.286 0.571 0.667 0.727

0 0.286 1 0.333 0 0.6

0.5 0.571 0.333 1 0.5 0.4

1 0.667 0 0.5 1 0.667

0.667 0.727 0.6 0.4 0.667 1

200

WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

las matrices de asociacin de Jaccard y Dice a efectos de observar las caractersticas mencionadas ms arriba. Entre las muestras A y C no se observaron bandas en comn, por lo tanto a = 0 y tanto Jaccard como Dice dan 0. Por otro lado, A y E comparten la presencia de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0. Tanto Jaccard como Dice dan 1. Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tanto, de las 6 bandas presentes en una u otra muestra comparten 3. As Jaccard vale 0.5. El total de bandas de B es 4 y el total de bandas detectadas en E es 5. El promedio de estos totales da 4,.5 por lo que la asociacin de Dice da (3/4,5) = 2/3 = 0,667. Se observa tambin que, salvo los 0 y los 1, todos los valores de Jaccard son menores que los de Dice. Adems, ambas matrices son simtricas: la asociacin entre A y E es la misma que la que se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la mitad de la matriz de asociacin. Esta observacin ser vlida para todas las medidas que se presenten en este captulo. Si los datos son binarios pero de estados equivalentes, 2 muestran debern considerarse ms asociadas tanto cuando comparten unos como ceros, ya que la codificacin que se les asigna es indistinta. Un ndice recomendable por su simplicidad es el de Simple Matching o de Concordancia Simple: SIMPLE MATCHING

Se observa que A y E comparten todos los caracteres, por lo tanto tienen la mxima asociacin. En cambio C y E no coinciden en ninguno, su asociacin es 0. La asociacin entre C y D y entre D y E es 0,5, lo que significa que coinciden en la mitad de los caracteres evaluados. Adems de las que se han definido hasta ahora, existen muchas otras medidas para datos binarios. Tambin se pueden definir medidas de distancia o asociacin para distintos tipos de datos multiestado. Para no extender en demasa esta seccin se presentarn algunas distancias definidas especficamente para frecuencias allicas. 4 Distancias genticas Se pueden clasificar en 2 grupos: las basadas en un modelo geomtrico (Cavalli-Sforza y Rogers) y las basadas en modelos consideraciones biolgicas (Nei). Para n poblaciones, hay n(n-1)/2 pares, y si en cada una de ellas se tiene la informacin sobre los loci para m alelos, y tambin sus frecuencias correspondientes, stas pueden expresarse de la siguiente manera: Pob. 1: p1, p2, ... , pm Pob. 2: q1, q2, ... , qm Distancia Cuerda de CAVALLI-SFORZA y EDWARDS (1967)

SM12 =

a+d a+b+c+d

m d12 = 2 1 - pi q i ) i =1

Simplemente es la proporcin de caracteres que comparten las dos muestras. Si se piensa que la matriz de datos anterior corresponde a 8 caracteres binarios de estados equivalentes la matriz de asociacin con el ndice de Simple Matching dar:
A A B C D E F B C D E F

0.625 1

0 0.375 1

0.5 0.625 0.5 1

1 0.625 0 0.5 1

0.5 0.625 0.5 0.250 0.5 1

Los puntos P* = ( p1 , p 2 ,..., p m ) y Q*= ( q1 , q 2 ,..., q m ) estn sobre una esfera de radio 1. La distancia Cuerda es, precisamente, la longitud de la cuerda que une esos 2 puntos. Para el caso m = 2, se ve en el grfico la distancia cuerda entre los puntos P = (0.3, 0.7) y Q = (0.8, 0.2). Los puntos originales son llevados a la esfera (crculo) de radio 1 y luego se calcula la distancia entre esos 2 puntos: d = 0.5324

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

201

P*
0.8

P
0.6

Los dos ltimos trminos equivalen a un estado de homocigosis en la poblacin 1 y 2, respectivamente. Nei define primero la Identidad normalizada (vara entre 0 y 1) :
Q*

0.4

I=
Q

p q
i =1 m i =1

i i m

0.2

pi2 qi2
i =1

0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

y luego la Distancia Estndar: D12 = - ln I. Si se consideran simultneamente varios loci la distancia Cuerda se calcula as:
r d12 = 2 1 - i =1

j=1

mi

pijq ij )

Si se usan varios loci se trabaja con el promedio aritmtico de las probabilidades definidas anteriormente resultando:

Distancia de ROGERS (1972)

D12 = - ln

p q
i =1 j=1 2 ij r mi r i =1 j=1

mi

ij ij mi

p q
i =1 j=1

2 ij

1 r R 12 = r i =1

(p
j=1

mi

ij

- q ij ) 2

En el grfico, sta es la distancia habitual entre los puntos P y Q. Distancia Estndar de NEI (1972): Esta distancia tiene una base biolgica. Expresa la probabilidad de que dos alelos tomados al azar de dos poblaciones diferentes sean idnticos (con respecto a la probabilidad de que lo sean dos alelos tomados al azar de la misma poblacin). Sean, como antes, las poblaciones 1 y 2 y las frecuencias allicas de un solo locus:

Ejemplo: Para la informacin de la tabla, en el caso de las frecuencias de cinco alelos provenientes de dos loci, se tiene: I = 0.857986 y, por lo tanto, D = 0.15317.

pi q i se puede interpretar como la probabilidad que 2 alelos sean iguales si uno ha sido elegido al azar de la poblacin 1 y el otro de la poblacin 2.
sera la probabilidad que 2 alelos elegidos al azar de la poblacin 1 sean iguales; sera la probabilidad que 2 alelos elegidos al azar de la poblacin 2 sean iguales.

En las poblaciones naturales una de las formas de realizar el agrupamiento jerrquico de las mismas en razas, es mediante el empleo de medidas de divergencia gentica. Aqu, las llamadas distancias genticas tienen su mayor aplicacin. Las medidas de distancias genticas basadas en modelos biolgicos son las ms empleadas en estudio de gentica poblacional, debido a que resumen los conocimientos obtenidos de las fuerzas evolutivas que conllevan a los cambios genticos es decir, mediante mutaciones y deriva gentica. La medida de distancia gentica estndar de Nei es ms confiable cuando se utilizan

202

WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

datos provenientes de muchos alelos. La distancia de Nei est formulada para un modelo donde se asume que las mutaciones ocurren en forma infinita, con la misma probabilidad para todos los alelos a una tasa de mutacin neutral, y que la variabilidad gentica inicial en la poblacin est en equilibrio entre la variabilidad producida por mutaciones y por deriva gentica, siendo el tamao efectivo de la poblacin, en cada una, constante. Basndose en estos supuestos, y de que todos los loci sean equivalentes entre s, se espera que la Distancia de Nei incremente linealmente con el tiempo. Si las frecuencias allicas en cada poblacin han sido estimadas con pocas muestras se pueden utilizar en cambio algunas modificaciones a la Distancia Estndar de Nei como las propuestas por Nei, (1978) y Hillis, (1984). La distancia de Cavalli-Sforza y Edwards, por el contrario, asume que las diferencias entre las poblaciones no provienen de mutaciones sino solamente como consecuencia de la deriva gentica. Adems, no asume que el tamao poblacional ha permanecido constante en todas las poblaciones. Considera que el tamao de la poblacin cambia en forma lineal pero no con el tiempo sino con 1/N, donde N es el tamao efectivo de la poblacin. As en estos casos, los conocimientos bsicos de gentica poblacional brindarn las herramientas necesarias en el momento de la eleccin del mtodo ms apropiado para el anlisis de nuestros datos. 5 Anlisis de coordenadas principales Si se tiene una matriz de distancias entre N muestras ser posible representar cada muestra mediante un punto de manera tal que las distancias resultantes reproduzcan las de la matriz? Veamos dos ejemplos: (i) Si se tiene la siguiente matriz D de distancias entre las muestras A, B y C:
1 .447 0 D= 1 0 .707 .447 .707 0

1.4 1.2 1.0 B 0.8 0.6 0.4 0.0


0.5 0.3 C 0.1 -0.1 -0.3 -0.5 -1.0
0.5 0.3 0.1 -0.1 C -0.3 -0.5 -1.0 A B

I
C

0.5

1.0

1.5

2.0

II

-0.5

0.0

0.5

1.0

III

-0.5

0.0

0.5

1.0

Coordenadas de A, B y C: I:(1.444, 0.881); (0.445, 0.94); (1.111, 1.179) II:(0.444, -0.119); (-0.555, -0.06); (0.111,0.179) III: (0.444, 0.119); (-0.555, 0.06); (0.111,-0.179) Si se calcula la distancia eucldea entre los puntos en uno cualquiera de estos grficos se ve que se han reproducido exactamente los valores de la matriz D. Por ejemplo:
d E (A, B) = (1.444 - 0.445) 2 + (0.881 - 0.94) 2 = 1

en el grfico I. (ii) Si se tuviera la matriz de distancias entre las muestras P1, P2 y P3: Es fcil ver que es imposible representar en un plano puntos separados por estas distancias porque si P1 y P2 se ubican como extremos de un segmento de longitud 0.9, no hay manera de ubicar un punto P3 que est a 0.5 de P1 y a 0.3 de P2.
0 0.9 0.5 # D = 0.9 0 0.3 0.5 0.3 0

se podran hacer algunos de los siguientes grficos:

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203

P1 P1 P 3? P 3?

P2 P2

donde Sij es la asociacin entre la muestra i y la j. Si la asociacin de una muestra consigo misma es 1, es decir Sii = 1, como ocurre con la mayora de los ndices, la ecuacin se reduce a: d2(i, j) = 2(1- Sij ). (2)

Se van a considerar, por ahora, distancias como las del ejemplo i). Esto es, distancias para las que se puedan encontrar puntos que reproduzcan esas distancias. Otro aspecto a considerar es el nmero de coordenadas necesarias para esos puntos. Es intuitivo que si slo hay 2 muestras a una distancia dada se pueden graficar en una recta (dimensin =1); si hay 3 muestras ya se vi que se pueden graficar en un plano (dimensin = 2); si se tuvieran 4 muestras ya son necesarias 3 coordenadas (dimensin = 3); ... y si se tienen N muestras se necesitarn, en general, N-1 coordenadas. Con lo cual si se quieren graficar 40 muestras sern necesarias 39 coordenadas!!! Es evidente que esto no es cmodo si el objetivo es obtener una representacin grfica de los puntos o muestras. Lo ideal sera obtener dos coordenadas pues se podran graficar en un plano, o bien tres para graficar en 3 dimensiones. El problema, entonces, es encontrar las 2 mejores coordenadas ( las 3 mejores) para obtener esta representacin. Ese es el objetivo del Anlisis de Coordenadas Principales (ACOOP): encontrar las k mejores coordenadas para las muestras de manera tal que si se calculan las distancias eucldeas entre ellas reproduzcan lo mejor posible una matriz de distancias dada. Habitualmente k = 2 3, a stas, se las llama Coordenadas Principales. Naturalmente se perder la informacin de las restantes coordenadas. Como se vi en el ejemplo (i) hay muchas representaciones posibles. Ah se han dado 3 pero se podran haber dado muchas ms. Una manera de reducir las opciones es obtener coordenadas de manera tal que los puntos estn centrados en el origen, como en II III. Se explicar el mtodo de obtencin de las Coordenadas Principales partiendo de una matriz de Asociacin S. En este caso las distancias que se van a reproducir son las definidas por: d2(i, j) = Sii+ Sjj- 2 Sij (1)

Se detallarn los pasos que se deberan realizar para hacer este anlisis al simple efecto de poder manejar con idoneidad los programas estadsticos de que se dispongan. Los pasos 1) a 3) son responsabilidad de esos programas. El usuario deber, fundamentalmente, indicarle qu asociacin o distancia desea calcular y cuntas coordenadas quiere. PASO 1) Centrar doblemente la matriz S S0 . P A S O 2) Calcular los autovalores y autovectores de S0. PASO 3) Calcular las coordenadas de los puntos representativos de las muestras. PASO 4) Graficarlos. El PASO 1 tiene como fin hacer que los puntos resultantes estn centrados. Cada elemento de la matriz de asociacin S se centra por filas y por columnas: (3) donde Si es el promedio de la fila i de S, S j es el promedio de la columna j y S es el promedio de todos los elementos de S. En el PASO 2 se encuentran: a) una matriz NxN donde cada columna es un vector de longitud uno. Son los autovectores. b) N nmeros ordenados en forma decreciente: los autovalores. Estos elementos son caractersticos de cada matriz S0. Por eso tambin se los conoce como vectores y valores caractersticos. Cada autovector est asociado a un autovalor. Si la matriz de distancias es representable (como la del ejemplo (i)) los autovalores sern positivos o ceros (el ms chico es siempre cero para estas matrices representables).

0 Sij

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WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

En el PASO 3 , si se desean k coordenadas, se toman los k primeros autovectores y se multiplican por la raiz del autovalor respectivo. El primer autovector da la primera coordenada de todas las muestras, el segundo la segunda coordenada y as siguiendo hasta la k-sima. Si slo se desean 2 coordenadas para graficar los puntos en un plano se toman los 2 primeros autovectores (k=2). Veamos un ejemplo sencillo:
0.5 0.9 1 S = 0.5 1 0.75 0.9 0.75 1
Autovalores de S0 :

de las distancias. Hay 2 tipos de porcentajes que se pueden calcular: Porcentaje de Dispersin:

a1=

l1 + l2 x 100% l1 +l2 +...+ln

si slo se usan 2 coordenadas. Este porcentaje se interpreta teniendo en 2 d ij cuenta que: 2N (1 + ...+ N) = , sumando sobre todos los pares de muestras. En cambio, la suma del cuadrado 0.21110.2390.028 de las distancias reconstruidas Doble centrado S0 = -0.239 0.3111 -0.072 con las dos coordenadas es igual 0.0280.0720.0444 a 2N (1 + 2). Por lo tanto, este l1 = 0.5167 l2 = 0.05 l3 = 0 porcentaje mide cunto se rev1 v2 v3 construye del cuadrado de todas 0.6173 - 0.5344 0.57735 las distancias.

Autovectores de S0 : Columnas de V = -0.7716

0.1543

- 0.2674 0.8019
l 22 v

0.57735 0.57735

Primeras 2 Coordenadas: Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

l11 v
0.4437 -0.5546 0.1109

-0.1195 -0.0598 0.1793

Si se usan ms de 2 coordenadas se van sumando los autovalores correspondientes en el numerador. En nuestro ejemplo: 1 = 100% .

0 sij

Grfico: Es el Grfico II que se vi ms arriba donde A es la muestra 1, B la 2 y C la muestra 3. Las distancias ( 2 ) calculadas a partir de la matriz de asociacin S dan la matriz de Distancias D. Por esa razn ambas matrices tienen la misma representacin.
2 d12 = 2(1 - S12 ) = 2(1 - 0.5) = 1
2 d13 = 2(1 - S13 ) = 2(1 - 0.9) = 0.2

Porcentaje de Distorsin:

l1+l2 a1= 2 x 100% l 1 +l22 +...+l2n


Este valor mide cunto se acercan los valores de la matriz de asociacin reconstruda respecto de la matriz de asociacin original S0. Ms exactamente:
a2= 1- S - 0S2 S
0 0* 2

d12 = 1
d13 = 0.447

d2 d 23 = 0.707 23 = 2(1 - S23 ) = 2(1 - 0.75) = 0.5

x 100%= 1-

(S - S (S )
0 ij

0* 2 ij

0 2 ij

x 100%

OBSERVACIN 1: Como en el ejemplo slo hay 3 muestras los autovectores tienen 3 componentes. Si se trabajara con una matriz de asociacin entre 40 muestras, los autovectores tendran 40 componentes, una por cada muestra. OBSERVACIN 2: Para la matriz S se han reconstrudo totalmente las distancias porque slo son 3 muestras. Si hubiera ms (N=40, por ejemplo) slo se reconstruiran totalmente las distancias si se usan 39 coordenadas. Si se usan slo las dos primeras se reconstruye, en general, slo un porcentaje

En este algoritmo se ve que lo que se est comparando son las asociaciones originales, 0* ,con las reconstruidas, sij , una a una. Para el clculo de 2 se usa la primera frmula por lo que el lector no debe traumatizarse con la segunda. OBSERVACIN 3: Si se hubieran obtenido autovalores negativos la primera medida no es recomendable. Hasta podra darse el caso que 1 fuera mayor al 100%. La segunda, en cambio, sigue teniendo sentido. Por

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otro lado, no se podran calcular coordenadas asociadas a ese autovalor porque no se puede calcular i . La aparicin de autovalores negativos no es necesariamente un problema grave para la representacin siempre que los autovalores negativos sean pocos y pequeos. Por ejemplo, si se trabaja con 50 muestras, en el PASO 2 se obtendrn 50 autovalores, de los cuales uno, seguramente, es cero. Para la representacin en el plano se usan slo los 2 primeros. Si los ltimos 10 son negativos no se vern afectados los clculos de las coordenadas. Hay asociaciones y distancias que nunca dan autovalores negativos, entre ellos se encuentran Jaccard, Ochiai, Russell y Rao, Simple Matching, y distancia eucldea. Si en lugar de tener una matriz de asociaciones se tiene una matriz de distancias el procedimiento consiste en calcular una matriz S cuyos elementos son: (4) 2

No debe causar sorpresa, entonces, que con un programa se obtenga un grfico y con otro el mismo grfico pero con una reflexin sobre uno u otro eje, o sobre los dos. Por otro lado, tambin es lcito cambiar, por alguna razn, el signo de una coordenada. Por ejemplo, esto puede ser til cuando se quieren comparar Anlisis de Coordenadas Principales realizados con distintas asociaciones o distancias sobre el mismo conjunto de muestras. Ejemplo: Presentamos la caracterizacin de 8 cultivares comerciales y 35 cultivares en experimentacin mediante anlisis isoenzimtico de semillas de Amaranthus. Estas accesiones pertenecen a siete especies: A. caudatus, A. cruentus , A. hypochondriacus , A. mantegazzianus, A. dubius, A. tricolor, y A. hybridus. Del total de 43 cultivares, 31 fueron polimrficas con 7 sistemas isoenzimticos. Se aplic anlisis de coordenadas principales el cual, estuvo basado en la presencia o ausencia de las 23 bandas polimrficas. En la figura puede observarse el nivel de diversidad gentica dentro de este germoplasma representado por las coordenadas 1 y 2. Este anlisis agrup la mayora de los cultivares de acuerdo a su clasificacin taxonmica as como mostr que existen relaciones entre diferentes accesiones. Se concluye que el anlisis isoenzimtico de semillas fue efectivo para caracterizar los cultivares destinados a los programas de mejoramiento de Amaranthus.
A.hypoch A.caudat. A.manteg. A.dubius A.tricolor A.hybrid.

sij = -

d ij 2

y luego seguir los PASOS 1, 2, 3 y 4 anteriores. OBSERVACIN 4: Cada autovector de S0 es un vector de longitud 1 en una cierta direccin. Pero por cada direccin podemos tener 2 vectores: v y -v. Por ejemplo:
-0.5344 v 2 = -0.2674 0.8019 0.5344 - v 2 = 0.2674 -0.8019
0.6

A.cruen.

Cualquiera de estos dos vectores pueden usarse como segundo autovector y, ms an, algunos programas pueden dar como resultado el primero y otros el segundo. Como consecuencia de esta seleccin se obtendr el grfico II el III. Se ve que el nico efecto de usar uno u otro vector es una reflexin del grfico respecto del primer eje. Si se cambia el signo de v1 se obtendr una reflexin respecto del segundo eje. Ninguno de estos cambios modifica la distancia entre los puntos.

38-39 40-43 0.4 6-9-10-11 2 0.2 14 5 0.0 12 15 7 8 29-30 -0.4 31 3 28 1 35 20 16 25 26 21 23 24 -0.6 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 13 36 34 27 4 17 41 42 37

-0.2

19

18-22 32-33

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WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

Matriz de datos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1

3 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0

4 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1

6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

7 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1

8 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

9 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

10 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1

11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

16 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0

17 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

19 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

20 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

21 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

22 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0

23 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

207

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

V1 -0.12709 -0.10710 -0.12311 -0.00462 -0.22005 -0.23182 -0.12459 -0.12472 -0.23182 -0.23182 ...

V2 0.03060 0.13683 0.09085 0.07441 0.07043 0.16179 -0.11226 -0.09717 0.16179 0.16179 ...

CP1 -0.27881 -0.23496 -0.27007 -0.01014 -0.48274 -0.50856 -0.27331 -0.27360 -0.50856 -0.50856 ...

CP2 0.05495 0.24570 0.16313 0.13362 0.12647 0.29052 -0.20157 -0.17448 0.29052 0.29052 ...

Autovalores: 4.81258 3.22431 1 = 46.85 2 = 78.2

Al slo efecto de que el lector pueda repasar algunos clculos se dan los primeros 10 elementos de los 2 primeros autovectores y las 2 primeras coordenadas Principales. 6 Anlisis de agrupamientos (cluster) Esta tcnica tiene como objetivo formar grupos de muestras, poblaciones, individuos u OTUs que sean similares entre s y diferentes a los elementos de los otros grupos. El primer problema es fijar el criterio para decidir cundo dos elementos son similares. Si se tuviera un mazo de cartas, cmo formar grupos? por el valor de la carta?, porque comparten el palo?. Segn el criterio que se aplique los grupos que se formen sern distintos. En la seccin anterior hemos visto distintas maneras de definir la similitud o disimilitud entre OTUs. Cada una de ellas, u otras que no se han presentado aqu, plantean distintas formas de medir la similitud entre los elementos a agrupar. Existen, adems, muchos mtodos para formar los grupos. Uno de los ms usados son los agrupamientos jerrquicos que pueden, a su vez, ser divisivos o aglomerativos. Los primeros comienzan con todos los elementos en un solo grupo y en sucesivas divisiones se van formando grupos cada vez ms pequeos. Los aglomerativos, por el contrario, empiezan considerando tantos grupos como elementos se tienen y se van agrupando segn su grado de parecido. Los sucesivos pasos de uno y otro mtodo se pueden representar en un grfico denominado dendrograma.

En esta seccin se tratarn solamente los mtodos jerrquicos divisivos. Aqu se plantea un segundo problema: Qu tipo de ligamiento se va a utilizar? Esto es, una vez realizado el primer agrupamiento, cmo se define la distancia entre ese grupo y los restantes elementos? Supongamos que en un primer paso se han agrupado los elementos A y B porque son los que presentan la menor distancia entre s. La distancia entre el nuevo grupo AB y otro elemento C se puede definir segn el criterio empleado para incorporar al nuevo elemento: LIGAMIENTO SIMPLE: d(AB,C) = mn {d(A, C), d(B, C)}, LIGAMIENTO d(B, C)},
COMPLETO:

d(AB,C) = mx {d(A, C),

LIGAMIENTO PROMEDIO: d({A,B},C) =

En el caso del ligamiento simple, la incorporacin del nuevo elemento est basada en la extraccin de los menores valores de distancias entre el nuevo elemento y el grupo preformado, y entre el nuevo elemento y las restantes OTUs que se consideren. En cambio, el ligamiento completo lo que hace es extraer los mayores valores de distancia, respectivamente. Si A, B y C son grupos formados en pasos anteriores, se usan los mismos algoritmos en el caso del ligamiento simple o completo. Para el ligamiento promedio hay que promediar todas las distancias entre ele-

d(A, C) + d(B, C) 2

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WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

mentos de AB y de C:

d(AB, C) =

d
i, j

ij

A B C D E F

A 0 1 1.41 1.15 0 1.1

B 1 0 1.29 1.10 1 0.93

C 1.41 1.29 0 1.26 1.41 1.07

D 1.15 1.10 1.26 0 1.15 1.22

E 0 1 1.41 1.15 0 1

F 1.1 0.93 1.07 1.22 1 0

n AB n C

AE B C D F

AE 0 1 1.41 1.15 1.1

B 1 0 1.29 1.10 0.93

C 1.41 1.29 0 1.26 1.07

D 1.15 1.10 1.26 0 1.22

F 1.1 0.93 1.07 1.22 0

donde dij es la distancia entre el elemento i del grupo AB y el j de C; nAB y nC son los nmeros de elementos en el grupo AB y C, respectivamente. Este ligamiento promedio se conoce tambin por las siglas UPGMA (Unweighted Pair Groups Method with Arithmetic AE BF C D Averages). AE 0 1.1 1.41 1.15 0 1.29 1.22 Consideremos la matriz de dis- BF 1.1 1.41 1.29 0 1.26 tancias de la tabla. Se realizar un C D 1.15 1.22 1.26 0 agrupamiento aplicando ligamiento simple. AEBF C D En primer lugar se agrupan los AEBF 0 1.41 1.22 C 1.41 0 1.26 elementos A y E porque estn a D 1.22 1.26 0 menor distancia (son iguales). ForAEBFD C mado ese primer grupo habra que AEBFD 0 1.41 calcular las nuevas distancias del C 1.41 0 grupo AE a los restantes elementos pero como d(A, U) = d(E, U) para todos los restantes elementos U se AE BF C D mantienen esas distancias. AE 0 1.05 1.41 1.15 En el segundo paso se observa BF 1.05 0 1.18 1.16 1.41 1.18 0 1.26 que la menor distancia es la de B a C D 1.15 1.16 1.26 0 F; se forma ese grupo y se recalculan las distancias del nuevo AEBF C D grupo a los restantes. Y as hasta AEBF 0 1.295 1.155 C 1.295 0 1.26 que se han agrupado todos. TamD 1.155 1.26 0 bin se puede detener el proceso AEBFD C fijando algn otro criterio para ello. AEBFD 0 1.277 Por ejemplo, cuando se ha alcanC 1.277 0 zado una distancia mxima fijada previamente. A continuacin se aplica el ligamiento mados inicialmente se van acoplando los rescompleto. Los 2 primeros agrupamientos co- tantes elementos. En cambio, el ligamiento inciden en este ejemplo, por lo que slo se completo tiende a generar muchos grupos muestran los tres ltimos pasos. chicos que se reunirn en los ltimos pasos. El ligamiento promedio conduce a las siEl anlisis de Agrupamientos slo debe guientes agrupaciones: tomarse como un mtodo exploratorio. Si Los mismos mtodos se pueden aplicar originalmente los datos forman grupos bien sobre matrices de asociacin cambiando los separados cualquier mtodo de agrupamienconceptos de menor distancia por el de to dar, aproximadamente, los mismos remenor asociacin. sultados. Pero si las muestras forman un En general, el ligamiento simple produce contnuo, cada mtodo y cada medida de agrupamientos en cadena: a los grupos for- distancia pueden conducir a resultados muy
AE BF C D AE 0 1 1.41 1.15 BF 1 0 1.07 1.10 C 1.41 1.07 0 1.26 D 1.15 1.10 1.26 0
AEBFC D AEBFC 0 1.10 D 1.10 0

AEBF C D

AEBF 0 1.07 1.10

C 1.07 0 1.26

D 1.10 1.26 0

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dispares. En este caso las conclusiones deben realizarse con cautela. A veces es conveniente realizar un Anlisis de Coordenadas Principales para determinar si existen grupos claramente definidos o no. 7 Lecturas recomendadas
CAVALLI-SFORZA, L.L. y A.W.F. EDWARDS. 1967. Phylogenetic analysis: models and estimation procedures. Am. J. Hum. Gen. 19: 233-257. DI RENZO, M.; BONAMICO, N.; GESUMARIA, J. 2001. Characterisation of amaranth accessions by isozymic patterns. Seed Science And Technology, v.29 (1): 227238. EVERITT, B.S.; DUNN, G. 1991. Applied Multivariate Data Analysis. E. Arnold, London. HAIR, J.F.; ANDERSON, R.E.; TATHAM, R.L.; BLACK,

W.C. 1995. Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. Prentice Hall - Upper Saddle River, New Jersery. HILLIS D, 1984. Misuse and modification of Neis genetic distance. Syst Zool 33:238-240. MANLY, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. NEI, M. 1972. Genetic distances between populatios. Am. Nat. 106: 283-292. NEI, M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from small number of individuals. Genetics 76: 379-390. RENCHER, A.C. 1995. Methods Of Multivariate Analysis. J. Wiley & Sons, Inc. New York

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WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

PARTE VII Genmica

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

VII.-Captulo 1
Genmica
Echenique,Viviana; Schrauf, Gustavo; Selva, Juan P. 1 Introduccin La genmica se desarroll en los ltimos 10 aos como consecuencia de los avances realizados en biologa molecular e Informtica, dos reas de la ciencia que han tenido un desarrollo tecnlogico enorme, generando una revolucin en el conocimiento y en la comprensin de los procesos biolgicos. El trmino fue acuado en 1986 por Thomas Roderick para referirse a la subdisciplina de la gentica que se ocupa del mapeo, secuenciacin y anlisis de las funciones de genomas completos y sirvi de nombre para una revista especializada en la publicacin de los mencionados temas, Genomics . Consiste en la caracterizacin molecular de genomas enteros y aporta informacin acerca de la secuencia y de la funcin de cada sector del genoma en diferentes situaciones de desarrollo y bajo diferentes condiciones ambientales, as como de los mecanismos implicados en la regulacin de la expresin e interaccin gnica. Para ello, las herramientas que se utilizan para el anlisis individual de genes o pequeas regiones cromosmicas, se aplican al anlisis global de genomas completos, estudiando en conjunto los miles de genes, protenas y metabolitos que constituyen un organismo, as como las complicadas redes de interacciones que operan entre ellos. La informacin generada es enorme y es clave para la identificacin y el aislamiento de genes de inters y permitir interpretar, en trminos moleculares, los procesos biolgicos. Para ayudar en este proceso han surgido poderosas herramientas bioinformticas que permiten almacenar e interpretar esta informacin. Las aplicaciones de la genmica alcanzan a todos los mbitos de la actividad humana relacionados con la biologa, como la salud, la alimentacin y el medio ambiente. En pocos aos estarn disponibles las secuencias

de nucletidos y aminocidos de todos los genes y productos gnicos codificados por los genomas de varios organismos complejos. Estas servirn para el estudio de enfermedades humanas complejas y para comprender fenmenos tales como la fisiologa celular, el desarrollo, la conducta, la evolucin, etc. Tambin aportarn informacin acerca de todos los aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal, diferenciacin y respuesta a estreses biticos y abiticos. Gracias al potencial de relacionar fenotipos biolgica y econmicamente importantes con los genes responsables de los mismos ser posible identificar genes de inters que puedan ser transferidos a otros organismos por medio de tecnologa gnica. Por otro lado, el conocimiento de la secuencia de los genes posibilitar el desarrollo de marcadores perfectos, basados en la secuencia del mismo gen, lo cual facilitar la seleccin y la transferencia de los mismos a variedades de inters. La conjuncin entre tecnologa gnica, marcadores moleculares, genmica y bioinformtica revolucionar el mejoramiento gentico vegetal, dando origen a lo que se denomina mejoramiento molecular y conducir al desarrollo de nuevos y promisorios cultivares (Fig. 1). La genmica se divide en dos grandes reas: - Genmica estructural, que se ocupa de la caracterizacin fsica de genomas enteros. - Genmica funcional, que caracteriza el transcriptoma, que est constitudo por el conjunto completo de transcriptos, producidos por un organismo, el proteoma o conjunto de protenas codificadas por un genoma, y el metaboloma o conjunto total de metabolitos de una clula, consecuencia de la funcin de los RNA y protenas. El objetivo de la genmica es la dilucidacin completa y exacta de la secuencia de ADN de un genoma haploide representativo de una especie. Cuando esta secuencia se conoce, abre la puerta a numerosas posibilidades. Por anlisis computacional de la misma y utilizando principios conocidos de gentica y el anlisis molecular de los transcriptos y protenas es posible: - Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades biolgicas y comprender el papel de dichas secuencias.

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Esto ha dado origen a la genmica comparativa y ha demostrado que existe considerable sintenia es decir una localizacin conservada de genes en posiciones equivalentes en especies relacionadas (Fig. 2). Tambin ha sido una excelente herramienta para identificar motivos de secuencia altamente conservados y, por lo tanto, funcionalmente importantes en regiones codificantes y no codificantes del genoma. Catalogar las variaciones genticas entre individuos ayudar a identificar aquellos cambios que conducen a enfermedades genticas, investigar nuevas terapias y establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores. En Febrero de 2001, coincidiendo con el cincuenta aniversario de la puFigura 1: La conjuncin entre tecnologa gnica, marcadores moleculares, genmica y bioinformtica revolucionarn el blicacin del modelo estructural del mejoramiento vegetal, conduciendo al desarrollo de nuevos DNA por Watson y Crick, la revista cultivares. Los nuevos genes hallados sern introducidos en Nature public el primer borrador del plantas por tecnologa gnica. Esto a su vez permitir establecer genoma humano, que ha sido la funcionalidad de los mismos. El conocimiento de la secuencia permitir la obtencin de mapas, marcadores perfectos y realizar secuenciado completamente. Tamseleccin asistida por marcadores moleculares (MAS), as como bin se han secuenciado el fenotipeado molecular. Gentileza de G. Spangenberg. exitosamente en los ltimos aos los genomas completos de ms de 30 bacterias - Realizar predicciones acerca de todas y de varios eucariotas, entre los que se enlas protenas codificadas por una especie. cuentran la levadura, Saccharomyces - Establecer las variaciones genticas cerevisiae , el nematodo Caenorhabitis entre distintas poblaciones de una misma especie. - Comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos evolutivos.
Figura 2: Sintenia entre los genomas de varias gramneas. El genoma de arroz contiene grupos de marcadores que se hallan altamente conservados en muchos cereales, por lo cual dichos genomas pueden sintetizarse bsicamente como compuestos por bloques de ligamiento de arroz. En la figura se muestra el alineamiento de los cromosomas y segmentos de cromosomas (identificados con letras maysculas) de varias gramneas con los del arroz (centro). El genoma del maz tiene dos copias semejantes de cada bloque de genes por lo que est representado por dos anillos del crculo. Las lneas externas punteadas conectan sectores adyacentes de los cromosomas de trigo. Modificado de Gale y Devos (1998) y de Snustad et al. (2003)

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ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

elegans, la mosca del vinagre Drosophila melanogaster y una planta, Arabidopsis thaliana. Actualmente se encuentran en marcha proyectos de secuenciacin de los genomas de diferentes modelos animales como rata, ratn, perro, gato, cerdo, etc. y vegetales como arroz, maz, colza, soja, trbol, raigrs, etc. A continuacin se brinda un panorama global acerca de la forma en que se articulan los proyectos de genmica, algunos resultados relevantes, las aplicaciones en agricultura y el estado de la investigacin en Sudamrica. 2 Genmica estructural

Como su nombre lo indica, el objetivo de la misma es caracterizar la estructura del genoma. Conocer la estructura de un genoma individual puede ser de utilidad para manipular genes y segmentos de ADN en una especie particular. El anlisis comparativo de diferentes genomas posibilitar deducir reglas generales que gobiernan la estructura de todos los genomas. La genmica estructural procede a travs de niveles incrementales de resolucin analtica, comenzando con la asignacin de genes y marcadores a cromosomas individuales, mapeando estos genes y marcadores dentro de los cromosomas, finalizando con la preparacin de un mapa fsico a travs de la secuenciacin. Es decir, que se procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, hacia uno de alta resolucin, basado en marcadores moleculares, llegando a la realizacin de un mapa fsico, basado en la secuencia de fragmentos clonados parcialmente solapantes (Fig. 3). Los pasos seran: Mapeo cromosmico de baja resolucin (ubicacin de genes que producen fenotipos mutantes conocidos y algunos marcadores). Las distancias genticas se basan en frecuencias de entrecruzamientos (crossing overs) y son medidas como porcentaje de recombinacin en centiMorgans (cM). - Mapeo gentico de alta resolucin de cada cromosoma (con marcadores moleculares ubicados muy prximos entre s).

Figura 3: Niveles de complejidad de la genmica estructural. La genmica estructural procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, a uno de alta resolucin, basado en marcadores moleculares hasta la realizacin de un mapa fsico, basado en la secuencia de fragmentos clonados solapantes. Modificada de Griffths et al. (2000).

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- Mapeo fsico , basado en distancias moleculares, resultantes de mapas de fragmentos de restriccin parcialmente superpuestos. La distancia entre dos marcadores puede ser medida determinando el tamao de los fragmentos de restriccin que los contienen, siendo el fragmento ms pequeo que lleva ambos marcadores una estimacin de la distancia entre ellos. Utilizando combinaciones de sondas y enzimas de restriccin puede construirse un mapa fsico determinando qu fragmentos poseen marcadores en comn. Las distancias fsicas se miden en kilobases (Kb) o megabases (Mb). - Anclado del mapa gentico en el mapa fsico. - Secuenciacin de ADN a gran escala, que brinda un mapa completo de cada cromosoma. - Anclado del mapa gentico y del mapa fsico en el de secuencia. Las distancias fsicas generalmente no se correlacionan directamente con las distancias genticas porque las frecuencias de recombinacin no son siempre proporcionales a las distancias moleculares. Sin embargo, a menudo las dos correlacionan razonablemente bien en las regiones eucromticas de los cromosomas (aquellas menos condensadas, que se colorean de manera ms difusa ). En humanos, un cM es equivalente, en promedio, a aproximadamente 1 Mb de ADN. 2.1 Asignacin de loci a cromosomas especficos Se utilizan los siguientes mtodos: - Ligamiento a loci conocidos: anlisis tradicional basado en cruzamientos, en especies en las que es factible hacerlo. - Electroforesis de campo pulstil: se usa en el caso de especies que poseen cromosomas pequeos, separables por esta tcnica, como sucede con los de levaduras. Las bandas en el gel corresponderan a cromosomas individuales y pueden utilizarse para localizar nuevos genes por hibridacin. Primero, utilizando sondas de localizacin conocida se establece que banda corresponde a cada cromosoma. Luego, un nuevo gen clonado de ubicacin desconocida se utiliza como sonda para asignarle una posi-

cin en un cromosoma determinado. - Hbridos celulares interespecficos, por ejemplo humano-ratn. Se utiliza exclusivamente en mapeo del genoma humano o de especies animales. Se establecen bancos de lneas celulares que contengan todos los cromosomas del roedor y un cromosoma humano particular. Siempre incluye un cromosoma humano que lleva un alelo salvaje defectivo para una funcin bioqumica determinada en el genoma del ratn. Si sobreviven en un cultivo deficiente para el factor que no sintetizan es porque llevan el alelo humano equivalente, que complementa la funcin faltante . 2.2 Ubicacin de los genes a lo largo del cromosoma El prximo nivel de resolucin consiste en determinar la posicin de un gen o marcador molecular sobre el cromosoma. Este paso es importante porque los mapas genticos pueden alinearse con los mapas fsicos y utilizarse para validar los mismos. - Mapeo por recombinacin: en los casos en que ha sido factible hacerlo -organismos experimentales como levaduras, la mosca de la fruta, ratn, Arabidopsis, etc- ha posibilitado la construccin de mapas que a lo largo de los aos aparecen repletos de genes con efectos fenotpicos determinados. Sin embargo, los intervalos recombinacionales entre genes conocidos contienen cantidades muy grandes de ADN. Estos intervalos o gaps no pueden ser completados utilizando anlisis de ligamiento debido a la ausencia de marcadores en esas regiones. Para llenarlos y construir mapas de alta resolucin surgieron los marcadores moleculares, entre los que se encuentran los RFLP y los SSLP (mini y microsatlites) (ver II.-4 y IV.-2). Estos marcadores permiten la construccin de mapas genticos con una densidad de un marcador /centimorgan (cM). Aunque tal resolucin es un logro muy importante, un centimorgan representa, en humanos, una megabase, lo que equivale a un milln de pares de bases o 1000 kb. Para lograr mayor resolucin actualmente existen los SNP, que son marcadores basados en el polimorfismo de un solo nucletido. - Hibridacin in situ: cuando se dispone

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de un gen clonado ste puede ser utilizado como sonda para hibridar con los cromosomas in situ , para lo cual se lo marca radiactivamente o por fluorescencia. Puede, de ese modo, identificarse a los cromosomas portadores de la secuencia, determinar si son secuencias especficas de un cromosoma y determinar la posicin del gen en el mismo. En el caso de fluorescencia, la tcnica se denomina FISH (fluorescence in situ hybridization). La localizacin del fragmento en el cromosoma se visualiza como un punto brillante (ver II.-5). - Mapeo fsico de los cromosomas: aporta un nivel de resolucin mayor. Se trata de identificar un conjunto de fragmentos de ADN clonados superpuestos que juntos representen un cromosoma o un genoma completo. Los mapas as obtenidos se llaman mapas fsicos, porque el ADN es el material fsico del genoma. El mapa fsico es til en tres aspectos: 1- Los marcadores genticos ubicados en los clones pueden ordenarse y contribuir al proceso general de mapeo. 2- Cuando se han obtenido los clones contiguos, ellos representan una genoteca ordenada de secuencias de DNA que puede utilizarse para futuros anlisis genticos, como, por ejemplo, correlacionar fenotipos mutantes con disrupciones en regiones moleculares especficas. 3- Estos clones constituyen la materia prima para secuenciar en proyectos genmicos a gran escala. 2.3 Secuenciacin a gran escala del genoma - Generacin de bancos de EST (etiquetas de secuencias expresadas) La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable, como primera aproximacin, no abordar el estudio del genoma completo. Es preferible estudiar slo una fraccin del mismo, es decir, aquellos genes que se estn expresando en un momento determinado de la vida del organismo. Para ello se obtienen poblaciones de ADNc (que reflejan slo secuencias expresadas) que se secuencian de forma masiva para

generar miles de secuencias parciales conocidas como ESTs (ver VII.- 2). Estas secuencias de entre 300-500 pb suelen ser suficientes para la identificacin de los genes mediante comparacin con las secuencias existentes en las bases de datos pblicas (ej. Genbank, EMBL), utilizando para ello programas de anlisis informtico. Si la informacin contenida en la secuencia parcial no es suficiente, habra que determinar la estructura del ADNc completo para estudiar su funcin por otros mtodos. - Secuenciacin genmica La aproximacin anterior no permite identificar genes que se expresan a bajo nivel o en situaciones fisiolgicas no consideradas o regiones no representadas en el ARNm. Para obtener esta informacin debe secuenciarse el genoma completo. Para ello, el ADN genmico total se digiere con enzimas de restriccin apropiadas o se fragmenta mecnicamente para generar fragmentos de gran tamao (100-300 kb), que se clonan en vectores apropiados, para construir genotecas que contienen, al menos, una representacin completa del genoma, que puede estudiarse en detalle y secuenciarse (ver II.-3). A fin de distinguir las regiones codificantes para genes, que en muchos organismos representan un porcentaje bastante pequeo del genoma, de las no codificantes, las secuencias se comparan con las secuencias de ESTs y ADNc previamente estudiadas. a) Secuenciacin de los clones y ensamblado de los fragmentos El clonado comienza obteniendo un nmero elevado de fragmentos al azar que se clonan en un vector apropiado. En la preparacin de mapas fsicos de genomas se utilizan vectores como los csmidos, los YAC, los BAC y los PAC, que aceptan insertos de gran tamao (ver II.-3). El contenido de estos clones se caracteriza y se ordenan, buscando los puntos de solapamiento o superposicin. Un conjunto de clones solapantes se llama contiguo (contig). Para establecer el solapamiento de clones al azar se secuencian regiones cortas del inserto proximales al sitio de clonado utilizando primers posicionados en el vector. Los vacos (gaps) se completan utilizando el final de un

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Se utilizan varias tcnicas para ordenar los clones en contiguos. Entre ellas: - FISH: para localizar las posiciones aproximadas de insertos grandes. - Fenotipificacin (fingerprinting): se corta el clon con enzimas de restriccin que generan un grupo de bandas que representan un fingerprint o huella digital del clon. Las bandas generadas por vaFigura 4: Estrategia de secuenciado jerrquico (hierarchical shotgun rios clones pueden sequencing strategy). El primer paso consiste en construir una alinearse visualgenoteca por fragmentacin del ADN e introduccin del mismo en mente o por un vectores que aceptan grandes insertos, en este caso de BACs. Los programa de comfragmentos de ADN representados en la misma son organizados en putacin para deun mapa fsico y los clones individuales son seleccionados y secuenciados terminar si se superpara lo cual se hace una nueva genoteca de trozos ms pequeos ponen o solapan. (shotgun library). La secuencia de los clones se ensambla finalmente - STS (sequenpara reconstruir la secuencia del genoma. Modificada de la publicacin ce tag sites o sidel International Human Genome Sequencing Consortium, 2001. tios de secuencia marcada) : son sefragmento clonado para llegar al siguien- cuencias cortas de insertos grandes clonados. te (primer walking). A medida que se van Se rene un conjunto de clones al azar y se caracterizando los clones, los contiguos se cortan en fragmentos ms pequeos que se alargan y van convergiendo unos con otros. clonan en y se secuencian pequeas regioEl proyecto termina cuando se tiene un con- nes de cada uno. Para ello se disean primers junto de contiguos que equivale al nme- que amplifican una secuencia corta de ADN ro de cromosomas de la especie en estu- (STS). dio. En la Fig. 4 se resume una estrategia de secuenciacin jerrquica ( hierarchical 3 Utilizacin de mapas genmicos para el shotgun sequencing ). Esta se usa para anlisis gentico genomas grandes. Para genomas ms pequeLos mapas genticos y los mapas fsicos os se utiliza otra, llamada secuenciacin de son un importante punto de partida para vagenomas completos ( whole genome rios tipos de anlisis gentico, incluyendo el shotgun sequencing). aislamiento de genes y genmica funcional. Todos los estados del anlisis genmico Por ejemplo: como la preparacin de clones, el aislamien- Aislamiento de genes por clonado to de ADN, la electroforesis y la secuenciacin posicional: para ubicar un gen cuya secuenhan sido bien adaptados a diferentes m- cia se desconoce se puede partir de un marquinas o robots, automatizando el trabajo. cador conocido que est estrechamente lib) Ordenamiento de los clones gado al mismo. Este marcador acta como

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punto de partida para el procedimiento de caminado cromosmico ( chromosome walking), por el cual los fragmentos finales del marcador ligado son utilizados como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Del segundo grupo de clones (los que solapan con el inicial) se hacen mapas de restriccin y los fragmentos obtenidos son utilizados para hacer una nueva ronda de seleccin de clones superpuestos. As el proceso de caminado se mueve hacia ambos lados a partir del sitio inicial, que culmina cuando se llega al gen de inters. Existe otra tcnica relacionada llamada salto cromosmico, que permite saltar a travs de reas distantes y potencialmente no clonables del ADN y genera marcas, ampliamente espaciadas a lo largo de la secuencia, que pueden utilizarse como puntos de inicio para mltiples caminatas cromosmicas bidireccionales. Esta tcnica consiste en crear fragmentos grandes (entre 80-150 kb) por restriccin del ADN en la regin que se cree contiene al gen de inters. Cada fragmento de ADN es luego circularizado, poniendo en contacto los extremos libres. Este procedimiento acerca puntos relativamente distantes de la regin de genoma en estudio. Se trata de generar en esa unin un sitio que no sea cortado en una posterior restriccin, de manera que esas dos regiones que estaban distantes en el genoma ahora esten unidas en un fragmento. El crculo se corta con una nueva enzima de restriccin y los fragmentos obtenidos, entre los que se encuentran los sitios de unin, se clonan en fagos. Esto es lo que se llama una genoteca de saltos. Una sonda del sector de comienzo de la regin que contiene al gen de inters puede utilizarse como punta de partida para comenzar a saltar por el genoma. Un salto puede, por ejemplo, avanzar unos 50 kb hacia el locus de inters. Una vez all, el otro extremo de la unin del fragmento inicial se corta y se usa para buscar el siguiente punto de salto en la genoteca. O sea que a travs de las uniones se va avanzando hacia el punto donde se encuentra el locus. Cada posicin de salto es un punto de partida para una caminata cromosmica. Estas regiones se van secuenciando. All comienza la bsqueda de genes utilizando programas de prediccin y se seleccionan las secuencias

candidatas. Esta estrategia de saltos se utiliz para clonar el gen de la fibrosis qustica, que es una enfermedad humana que resulta fatal y es causada por mutaciones en gen de gran tamao localizado en el cromosoma 7. - Estrategia del gen candidato: la caracterizacin de una regin cromosmica hace que aparezcan varios genes de funcin desconocida. Si un gen de inters es mapeado en esa regin, estas secuencias pasan a ser candidatas. Para cada una de ellas, o para la ms probable de acuerdo al anlisis de secuencia, se disean experimentos tendientes a determinar en cuales tejidos se expresa, en qu condiciones, etc., utilizando Northern blot o RT-PCR. Si el patrn de expresin encontrado coincide con el patrn esperado es altamente probable que hayamos encontrado el gen de inters. El experimento ideal para confirmar esto, sera la transformacin de un individuo mutante para esta funcin con el gen normal. Si se produce la reversin del fenotipo mutante (complementacin), tendremos la prueba irrefutable de que estamos frente al gen buscado. - Genes con patrones complejos de herencia: no todos los genes muestran patrones simples de herencia. Puede suceder que: - La variacin fenotpica sea cuantitativa, como peso o altura. Este tipo de variacin se debe a la interaccin acumulativa entre alelos + y de varios genes y el ambiente. La disponibilidad de miles de marcadores moleculares como los SSLP, dispuestos a lo largo del cromosoma, ha posibilitado el mapeo de algunos de estos genes que contribuyen a la variacin cuantitativa cuyos loci son llamados QTL (quantitative trait loci). Para abordar este problema, se buscan dos tipos de lneas que muestren fenotipos contrastantes para un carcter cuantitativo y se cruzan para generar descendencia homocigota que contenga solo un segmento o un pequeo nmero de segmentos de una de las lneas. Se realizan cruzas y retrocuzas y se obtienen lneas endocriadas recombinantes (RIL). Estos individuos pueden caracterizarse por su fenotipo y puede estimarse la contribucin de los segmentos especficos a la variacin observada. (ver IV.2) En el futuro, el anlisis de SNP (polimorfismos de un nucletido simple) promete ace-

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lerar el mapeo de caracteres complejos. Nuevos enfoques de mapeo de QTL y QTN (quantitative trait nucleotide) estn disponibles. El concepto emergente es la posibilidad de explorar directamente la variacin dentro de genes y no a travs de marcadores annimos. 4 Anlisis funcional de los genes Una vez secuenciado el genoma completo pueden identificarse la mayora de los genes de una especie. Restara entonces determinar cul es la funcin de cada uno de ellos y cmo interaccionan para definir un fenotipo determinado. La genmica funcional intenta resolver esta cuestin a travs del estudio de: - El transcriptoma: se refiere al estudio de los perfiles de expresin de todos los genes presentes en el genoma. El mtodo ms utilizado es el de micromatrices de ADN, que permite analizar simultneamente la expresin de miles de genes, pudindose disponer 5000-6000 genes (ESTs, ADNc, oligonucletidos) sobre un portaobjetos utilizando un sistema robotizado. Sobre este chip de ADN se realizan experimentos de hibridacin con muestras marcadas radioactivamente o con fluorforos apropiados, y los resultados se cuantifican mediante anlisis con phosphorimager o microscopa confocal (ver VII.-2). De esta manera se pueden identificar, de forma simultnea, los patrones de expresin de miles de genes en un momento del desarrollo o en respuesta a diferentes estmulos ambientales. El anlisis bioinformtico de estos datos permite asociar grupos de genes que se expresan de forma coordinada y proporciona informacin importante sobre la funcin de los mismos, ver (VII.3). - El proteoma: comprende el conjunto total de protenas expresadas por un genoma completo, incluyendo las modificadas despus de la traduccin. El estudio del transcriptoma debe ser complementado con el anlisis de expresin de las protenas codificadas por los transcriptos, puesto que estas macromolculas estn al final de la ruta de expresin gnica. El mtodo ms utilizado para estudiar la abundancia relativa de cientos de protenas es la electroforesis

bidimensional en geles de poliacrilamida (2DPAGE), que permite separar con gran resolucin, la mayora de los polipptidos celulares combinando de forma secuencial diferencias en carga y en masa molecular. Utilizando sistemas computarizados de anlisis de imagen se seleccionan las protenas cuya abundancia relativa cambia durante el desarrollo o en respuesta a diferentes estmulos ambientales. Los polipptidos se purifican y digieren con proteasas para generar una coleccin de pptidos que se analizan por espectrometra de masas o se secuencian a partir del extremo amino. Para identificar la protena, los perfiles de masa molecular o secuencias de aminocidos obtenidos se comparan con las bases de datos de protenas existentes. - El metaboloma: comprende el conjunto total de metabolitos de una clula. En plantas, el metabolismo secundario (conjunto de reacciones que no son vitales para el individuo y que conducen a la producin de compuestos que no tienen una funcin reconocida en el manteniento de los procesos fisiolgicos fundamentales de los organismos que los sintetizan pero que a veces ayudan a la supervivencia, como por ejemplo antraquinonas, alcaloides, digoxina, taumatina, vainillina, menta, etc.) produce una enorme variedad de compuestos diferentes de los que se han identificado 40.000 y se estima que an quedan por descubrir alrededor de 100.000. Los investigadores que trabajan en este nuevo campo de la qumica aplicada a la biologa (metabolmica) consideran que slo de esta forma se podra definir, en trminos moleculares, un fenotipo concreto. En metabolmica se emplean herramientas analticas muy sensibles (tales como espectrometra de masa, cromatrografa lquida o gaseosa y resonancia magntica nuclear) para analizar los cambios metablicos provocados por mutaciones gnicas o por la expresin de transgenes. La metabolmica puede ser aplicada al monitoreo de estreses inducidos, para identificar pasos metablicos limitantes, para el anlisis de mutantes y hasta para realizar la evaluacin de manejos agronmicos, tales como el efecto de fertilizantes sobre el metabolismo, etc. - La bioinformtica intenta dar sentido

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a la informacin derivada de las tcnicas anteriormente descritas. La importancia de esta ciencia resulta obvia cuando se considera que los genomas poseen miles de millones de pares de bases (ver VII.-3). 5 Modelos El mapeo comparativo ha demostrado que la organizacin de los genes dentro de los genomas ha permanecido muy conservada a travs de la evolucin, existiendo estrechas relaciones de colinearidad entre los genomas de casi todas las gramneas cultivadas, entre las solanceas, entre las brasicaceas cultivadas y Arabidopsis, entre los pinos, rosceas y varias leguminosas. Por ello, teniendo en cuenta la envergadura de un proyecto de secuenciado de un organismo, los emprendimientos genmicos tomaron especies modelo, representativas de un genoma vegetal. El primer modelo vegetal fue una dicotilednea, Arabidopsis thaliana. Le sigui una monocotilednea, el arroz, cuyo genoma es seis veces menor que el del maz y 37 veces menor que el del trigo. El estudio de estas dos especies permitir arribar a conocimientos clave para el mejoramiento vegetal. Arabidopsis thaliana es una dicotilednea que posee uno de los genomas vegetales ms pequeos. Carece de importancia econmica pero resulta ser un excelente organismo para la investigacin puesto que es fcil de transformar y su ciclo de vida tarda slo 7 semanas, de semilla a semilla. Alrededor de 12.000 cientficos trabajan coordinadamente en Arabidopsis, conformando el ms avanzado sistema de experimentos en biologa de plantas del mundo. Su secuencia gentica es de libre acceso en el sitio Web www.arabidopsis.org, as como tambin las experiencias biotecnolgicas que se estn o se han realizado con esta planta. En un artculo publicado en Nature (2000) se analiza el genoma de esta planta a partir de las 115.4 megabases secuenciadas (de un total de 125). Pudo establecerse que la evolucin de Arabidopsis involucr una duplicacin completa del genoma, seguida por una subsecuente prdida y duplicacin de genes,

lo cual dio origen a un genoma dinmico, enriquecido por una transferencia lateral de genes de cianobacterias. El genoma contiene 25.498 genes que codifican para 11.000 familias de protenas, con una diversidad funcional similar a la encontrada en Drosophila y Caenorhabditis elegans. Arabidopsis posee varias familias de protenas nuevas pero carece de otras comunes, indicando que los conjuntos de protenas en comn han experimentado una expansin y contraccin en estos tres grupos eucariotas. 6 Algunas generalizaciones acerca de los genomas Los estudios en especies modelo han permitido arribar a varias generalizaciones. Una de ellas es que el nmero de genes no es la base de la complejidad. La mosca de la fruta tiene unos 13000 genes, Caenorhabitis elegans 18000, Arabidopsis 26000 y los humanos 31000. Si el nmero de genes nos es muy diferente entre estas especies, cul es la base de la mayor complejidad en los humanos? La explicacin estara en el proteoma, ms que en el genoma. Las protenas codificadas por los genes pueden agruparse en familias en base a su similitud y muchas de estas familias proteicas son compartidas por todos los grupos mencionados, aunque el nmero de miembros por familia es mayor en humanos. Esto es particularmente evidente en aquellos genes involucrados en el desarrollo . Los humanos tenemos 30 genes para factores de crecimiento del fribroblasto, mientras que Drosophila y Caenorhabitis elegans tienen 2. Las nuevas protenas surgen a travs de cortes y empalmes alternativos de un mismo ARN (alternative splicing), lo que permite aumentar considerablemente la diversidad proteica a partir de los mismos mensajes. Las predicciones indican que el 60 % de los genes humanos tiene dos o ms alternativas de splicing. En Caenorhabitis el 22%. Un elevado nmero de factores de transcripcin y modificaciones postraduccionales tambin conducen a una mayor complejidad. En el caso de Arabidopsis, cerca del 9 % de los genes son factores de transcripcin

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(FT). Si se compara la proporcin con los genomas de otras especies, se observa que Arabidopsis no slo tiene ms genes que algunos animales pequeos, sino que la proporcin de FT es ms alta que en cualquier clase de organismo estudiado. Esto parece reflejar el hecho de que las plantas deben adaptarse a una amplia variedad de condiciones medioambientales, a diferencia de los animales, que pueden movilizarse y cambiar de lugar si este no les resulta propicio. En humanos, los genes ocupan una cuarta parte del genoma, y slo el 1,5% codifica para protenas. Las secuencias correspondientes a los exones (secuencias del mensajero que se encuentran representadas en la protena, las secuencias correspondientes a los intrones no lo estn) comprenden un porcentaje bajo del genoma, mientras que los intrones comprenden el 24%. Los genes no estn distribudos en forma pareja. Algunos se encuentran agrupados en ciertas regiones del genoma mientras que otros se encuentran aislados. En la mosca, el nematodo y Arabidopsis la disposicin de los genes es mucho ms regular. Aproximadamente la mitad del genoma humano consiste de secuencias repetitivas, siendo la mayora de ellas secuencias parsitas de elementos transponibles que se propagan replicndose e insertando una copia de s mismos en otras regiones del genoma. En la actualidad solo dos tipos de elementos son activos, Alu y LINE1. La mayora de los mismos se encuentran en regiones ricas en A y T, mientras que los genes se encuentran en reas con elevado contenido de G y C. Fragmentos de estos elementos tambin se encontraron en las secuencias regulatorias que controlan la expresin de varios genes, por lo que se ha sugerido que, de alguna manera, podran afectar positivamente su expresin y evolucin. Los genomas vegetales tambin estn plagados de estas secuencias repetitivas. Haciendo uso de la posibilidad que nos brindan las bases de datos de llevar a cabo Northerns electrnicos fue posible encontrar elementos repetitivos en las bases de EST de trigo, cebada y centeno, siendo 0.15 % de las EST similares a retrotransposones (elementos genticos transponibles, es decir que pueden movilizarse de un sector del genoma

a otro y cuyo movimiento depende de la transcripcin reversa . Son secuencias sin funcin aparente que han contribudo a lo largo de la evolucin a la expansin de los genomas de plantas y animales superiores). Ejemplo aplicado al mapeo y caracterizacin de los genes de vernalizacin de los cereales Un ejemplo interesante para aplicar varios de estos conceptos ha sido la investigacin que llev al mapeo y caracterizacin de los genes de vernalizacin de trigo (Yang y col., 2004). El descubrimiento de estos genes es un buen ejemplo de cmo se encaran algunos proyectos de genmica. Se utiliz trigo diploide (2n=2x=14 AA) debido a la menor complejidad de su genoma que los del trigo pan y candeal y se confeccionaron detallados mapas genticos y fsicos para la regin cromosmica que los contena en trigo, arroz y sorgo. Haciendo uso de las herramientas de la genmica comparativa se determin que uno de estos genes, VRN1, est involucrado en la transicin de los pices desde un estado de crecimiento vegetativo a uno reproductivo. Este gen es similar a uno hallado en Arabidopsis llamado APETALA1, que no est involucrado en la respuesta a la vernalizacin. El otro gen involucrado en el proceso, VRN2 es un represor dominante de la floracin en cereales de invierno. Por mapeo gentico de alta densidad, utilizando una poblacin de trigo diploide obtenida de cruzar progenitores con hbitos contrastantes de crecimiento, uno primaveral y el otro invernal, se determin que este gen se encuentra ubicado en el brazo largo del cromosoma 5A. A partir de aqu se realiz el clonado posicional del mismo. Esto significa que a partir de marcadores conocidos ubicados en el genoma se comenz una caminata cromosmica. De esta manera se construy un mapa fsico o de secuencia de la regin que contena el gen. Para ello se utilizaron marcadores moleculares distruibudos en la regin, genotecas de BAC y genotecas de ADNc. La comparacin de la secuencia de esta regin con regiones equivalentes de cebada y de arroz permiti establecer que esta regin contena ocho genes,

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Figura 5: La inhibicin de la expresindel gen VRN2 por transgnesis acelera la floracin en aproximadamente un mes en comparacin con la misma variedad de trigo no modificada. De Yan et al. (2004), gentileza Dr. Jorge Dubcovsky.

cinco de los cuales se encontraron en el mismo orden y orientacin que en la cebada y tres como en el arroz. La funcin de algunos de estos genes es an desconocida. La regin tambin contena elementos repetitivos o retrotransposones. Dos de los genes all ubicados, denominados ZCCT1 y ZCCT2, codificaban para protenas muy similares, lo cual permiti inferir que los mismos provienen de un evento de duplicacin que ocurri millones de aos atrs. Estas protenas resultaron ser similares a una protena de Arabidopsis y de arroz que est involucrada en la regulacin del tiempo de floracin. Por ello, este gen era un candidato atractivo para ser el represor de floracin, es decir VRN2. Los transcriptos de este gen son muy poco abundantes en las hojas y desapare-

cen durante el proceso de vernalizacin, no obstante ello, el anlisis de su expresin permiti determinar que junto con la desaparicin de los transcriptos de VRN2 se produce un incremento de los transcriptos de VRN1 , lo cual resultaba coherente con la interaccin episttica entre los dos genes y con el hecho de que VRN2 acte como un represor de la floracin, que directa o indirectamente reprime la transcripcin de VRN1. Todas las pruebas de localizacin de los transcriptos y niveles de expresin condujeron a concluir que ZCCT1 era VRN2. Tambin se estableci que las diferencias entre variedades invernales y primaverales de trigo estaran dadas por diferencias en la regin codificante de este gen (es decir en aquella regin que est representada en el ARN mensajero). En una accesin de hbito primaveral se encontr una mutacin de punto que redundaba en un cambio de un aminocido arginina por un triptofano en una regin crtica del gen, lo cual afectara su funcin. La arginina se encuentra en todas las protenas del tipo ZCCT de Arabidopsis, arroz y cebada. Esta mutacin de punto sera la causante del hbito primaveral. El anlisis de este sitio en variedades cultivadas de trigo diploide permiti verificar que la mutacin est ausente en todas las variedades de trigo invernal. Lo mismo ocurri en cebada. Todo esto llev a sugerir que la gran adaptabilidad de los cereales de clima templado fue favorecida por un sistema muy flexible de regulacin de la iniciacin de la floracin. El hbito ancestral de crecimiento invernal, esencial para la adaptacin a clima fro, poseera el potencial para generar formas primaverales por mutaciones de prdida de funcin en los dos principales loci de vernalizacin. Para validar la hiptesis de que ZCCT1 era VRN2 se transform trigo pan invernal con una construccin que inactivaba los mensajeros del mismo, tcnica denominada de ARN de interferencia (ver III.3). Estas plantas transformadas, donde estaba inhibida la expresin del gen (efecto que semejaba la inhibicin del mismo por fro) mostraron una aceleracin en el tiempo de floracin (23 das) en relacin a los controles no transformados (Fig.5). Esto confirm que la disminucin en los niveles de los transcriptos de VRN2

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economa y la calidad de vida que en el mbito de la salud humana. Gracias al aporte de grupos de investigacin de todo el mundo se dispone de bases de datos pblicas con informacin genmica de utilidad para los mejoradores. El conocimiento de cmo actan los genes en una especie puede ayudar a los mejoradores a perfeccionar su funcin en otra especie. La secuencia de los genomas de Arabidopsis y de arroz proporcionarn informacin relevante acerca de otros cultivos, como el maz y el trigo. Dado que estos tres cereales representan ms de la mitad de la produccin alimentaria mundial y que el arroz es el alimento bsico de ms de la mitad de la poblacin del planeta, la trascendencia de la genmica en la agricultura es indiscutible. La similitud entre las especies de cereales tambin implica que cuando se trasladan genes de una especie de cereales a otra, tendern a funcionar Figura 6: Categorizacin funcional de ESTs de Deschampsia bien y en la misma forma con una antarctica . El objetivo de este proyecto es encontrar genes mnima manipulacin gentica. involucrados en la resistencia a bajas temperaturas para ser transferidos, A travs de esfuerzos pblipor tecnologa gnica, a especies de cultivo. Gentileza de G. cos y privados podrn identificarSpangenberg. se conjuntos de genes asociados genes de floracin. En variedades invernales con caracteres como rendimiento, resistende trigo, VRN2 evita la floracin. Cuando la cia a la sequa, calidad de los alimentos, resisplanta se expone a un perodo de fro dutencia a insectos y tolerancia a herbicidas. De rante la vernalizacin, la actividad del mismo esta manera se acelerar significativamente disminuye y permite que la planta florezca. A diferencia del gen VRN1, VRN2 es dife- el aporte de nuevas variedades al mercado, rente de un gen de Arabidopsis que tiene ya sea por modificacin gentica o por seuna funcin similar. Esto permiti sugerir que leccin con marcadores moleculares o utien su evolucin, Arabidopsis y los cereales y lizando criterios de seleccin a partir de la pastos de clima templado desarrollaron di- informacin molecular. La genmica comparativa, basada en el ferentes mecanismos de vernalizacin, que anlisis de ESTs de diferentes plantas toleincluyen genes similares y genes muy diferenrantes a estreses abiticos, permitir la identes. tificacin de redes de genes comunes asoDe ello tambin se concluye que si bien ciados con estreses ambientales, tales como los modelos son importantes, no siempre se adaptan a todos los casos y hay que analizar salinidad, sequa, bajas y altas temperaturas. todos los detalles antes de extrapolar infor- El anlisis de especies tolerantes a situamacin para aplicarla a la comprensin de los ciones extremas permitir localizar genes involucrados en los mecanismos que las hafenmenos biolgicos. cen tolerantes. Dichos genes podrn entonces ser transferidos a especies de cultivo. 7 Genmica y Agricultura Como ejemplos pueden citarse Agrostis Especialistas en varias disciplinas han lle- adamsonii y Agrostis robusta, tolerantes a gado a la conclusin de que el alcance de la salinidad, Microlaena stipoides, tolerante a genmica ser mayor en lo que se refiere a la aluminio y Deschampsia antarctica, toleran-

(ZCCT1) est directamente relacionada con la aceleracin del tiempo de floracin. Este experimento demostr, adems, que esta tecnologa puede ser utilizada para manipular el tiempo de floracin del trigo y confirm que VRN2, un factor de transcripcin, juega un rol central en la regulacin de la floracin. Este sera entonces un nuevo tipo de gen involucrado en la regulacin de otros

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te a bajas temperaturas (la nica gramnea que crece en la Antrtida) (Fig. 6). Tambin se ha mencionado que los factores de transcripcin seran las llaves para desbloquear funciones gnicas que aprovechen la diversidad de la naturaleza para producir mejores cultivos. Estos son genes que virtualmente controlan todo carcter importante, desde el punto de vista agrcola, en las plantas, incluyendo rendimiento, resistencia a las enfermedades, proteccin contra las heladas y sequa, produccin de qumicos, protenas usadas en farmacutica, etc. La mayora de los caracteres vegetales a los que interesa aplicar la ingeniera gentica son multignicos (ej. tolerancia al estrs hdrico) y los genes involucrados se expresan en cascadas de forma tal que genes primarios activan a genes secundarios que a su vez activan a genes terciarios. Los factores de transcripcin seran los responsables de hacer funcionar a los genes primarios , obtenindose largas cascadas de expresin de genes por la manipulacin de un solo gen. Durante los ltimos aos se ha obtenido una gran coleccin de FT de plantas, funcionalmente caracterizados, no slo en Arabidopsis, sino tambin en especies como tomate, maz y soja. En total hay cerca de 1900 FT en Arabidopsis pero en el contexto de la genmica funcional el inters recae en unas 60 familias que tienen funciones reconocidas. La herramienta primaria que se utiliza para conocer la funcin de los FT consiste en sobre-expresarlos y/o detener la expresin de algunos de ellos por disrupcin gnica o knock out. Se puede, por ejemplo, medir el efecto de cada FT en la composicin de los lpidos en las semillas aceiteras y la composicin de lpidos en las hojas, la composicin de azcares, de esteroides, etc., estudiar procesos bsicos, a travs de la dilucidacin de sus efectos en el desarrollo vegetal y la resistencia a las enfermedades, o tratar de identificar el FT que regula el consumo de nitrgeno (N). El N es uno de los insumos ms costosos para la agricultura, por lo que identificar los genes que controlan y modifican la respuesta al N sera de gran valor. En este sentido tambin existen proyectos genmicos sobre leguminosas y sus simbiontes fijadores de nitrgeno. Recientemente se han secuenciado los genomas de

las especies de Mesorhizobium y Sinorhizobium y se han producido cientos de miles de EST de Medicago truncatula, Lotus corniculatus y soja. En el caso de M. truncatula no slo se han disectado los pasos que controlan las seales entre la bacteria fijadora y la planta sino tambin entre la planta y otro simbionte, las micorrizas (asociacin de un hongo con la raz de una planta superior. Esta asociacin no es especfica de especie como el caso de Rhizobium y las leguminosas. El hongo puede ser de varios gneros y aportan fsforo a la planta,). Recientemente se logr la identificacin, en alfalfa, de un receptor requerido para el reconocimiento de seales bacterianas de nodulacin, los llamados factores NOD. Las plantas medicinales aportan el 25% de los compuestos activos utilizados actualmente por la industria farmacutica. Entre estos compuestos se encuentran los citocromos P450 , que participan en la biosntesis de muchos compuestos anticancergenos, alcaloides, fitoesteroides, antioxidantes y antimicrobianos. Tambin tienen un rol muy importante en la detoxificacin de xenobiticos (herbicidas y pesticidas). Se han identificado 1052 citocromos P450 y el objetivo actual es, utilizando herramientas de metabolmica, determinar su funcin bioqumica precisa. Otro de los objetivos de la metabolmica es el estudio de la sntesis de las esencias que confieren perfume a las flores y el mejoramiento del sabor de algunas plantas utilizadas en alimentacin humana, como por ejemplo Cassava, donde el objetivo sera la eliminacin de los glicsidos cianognicos que le confieren sabor amargo. La devastacin de los bosques es motivo suficiente para invertir en proyectos de genmica tendientes a la identificacin de genes involucrados en perennidad, desarrollo, interaccin con herbvoros, respuesta a estrs y sntesis de metabolitos secundarios como lignina y celulosa. Se han comenzado a colectar EST de lamo, abedul, abeto, pino y eucaliptus. El lamo se utiliza como sistema modelo para el anlisis de los genes involucrados en la formacin de madera. Otro objetivo en este campo es la bsqueda de estrategias para inducir floracin temprana,

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que es un factor crtico en el mejoramiento de forestales. La secuenciacin de los genes y la dilucidacin de las vas que controlan la floracin en los cereales, que difiere en varios aspectos con los corresponientes en Arabidospsis, ha sido otro de los logros de la genmica. Como se mencionara anteriormente en este captulo, recientemente se localizaron y caracterizaron, en trigo y cebada, los genes VRN1 y VRN2, que son los genes centrales en la va de vernalizacin en trigo, cebada y otros cereales invernales. Este conocimiento es clave en agricultura, ya que permitira, potencialmente, controlar la floracin en cultivos de gran importancia econmica, como los cereales y los forrajes. 8 Aportes de la genmica al mejoramiento de trigo El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x= 42; AABBDD) es uno de los principales cultivos alimenticios ya que provee cerca del 55% de los carbohidratos consumidos por el hombre. La gentica de este cultivo resulta compleja, es de naturaleza hexaploide, con tres genomas homelogos denominados A, B y D, que aportan 7 pares de cromosomas cada uno. Los genes redundantes son una norma, con sets homoallicos triplicados en la mayora de ellos. Dentro de los cereales, el genoma de trigo pan es el de mayor tamao (17000 Mb trigo, 2800 Mb maz, 800 Mb sorgo, 450 Mb arroz). Ms del 80% del genoma de trigo lo constituyen secuencias de ADN altamente repetitivo. El restante 20% est compuesto por ADN de bajo nmero de copias o copia nica, donde se encuentran la mayora de los genes. Si bien las secuencias del ADN altamente repetitivo varan de especie en especie, las secuencias de los genes en general son conservadas. Esta caracterstica permite el uso de sondas heterlogas (de otros genomas) en experimentos de hibridacin de tipo RFLP (ver II.4) para identificar secuencias conservadas en especies diferentes dentro de una misma familia taxonmica (Devos y Gale, 2000). En 1989 se public el primer mapa gentico molecular de trigo correspondiente a los cromosomas homelogos del grupo

7, observndose que en gran parte de los tres genomas de trigo hexaploide se conservaba el orden de los genes y marcadores. Esta fue la primera prueba de colinearidad en gramneas y posibilita el desarrollo de la gentica comparativa en cereales. En trabajos posteriores pudo comprobarse que largos segmentos de los cromosomas de maz, sorgo, arroz, trigo y cebada conservan la presencia y el orden de marcadores y genes, aunque en algunos casos la correspondencia cromosmica ha sido modificada por duplicaciones, inversiones o translocaciones . En la actualidad se ha logrado consensuar un mapa unificado de gramneas en el que se detallan secuencias y genes conservados en diferentes genomas (Fig. 2). A partir de esta herramienta es posible transferir informacin proveniente de plantas de genomas pequeos (arroz, sorgo) a plantas de genomas ms complejos como el trigo. Esto facilita la ubicacin ms precisa de genes para tolerancia a estrs bitico y abitico, prebrotado, dormicin, vernalizacin, etc. y el desarrollo de marcadores tiles para el mejoramiento. La informacin generada a partir de los proyectos genmicos de Arabidopsis, arroz y maz con el descubrimiento de nuevos genes y QTLs permitir el desarrollo de marcadores perfectos, generados a partir de la informacin de la secuencia del gen a seleccionar, en lugar de marcadores genticamente ligados. Actualmente el acceso a los principales genes que afectan la calidad ha abierto nuevas vas para el desarrollo comercial de diferentes productos derivados del trigo. Es posible obtener variedades con diferente calidad de almidn, diferente textura de grano, diferente composicin de gluteninas y gliadinas en funcin del uso industrial. Por otro lado, el descubrimiento de nuevos genes valiosos de otros genomas y la posibilidad de incorporarlos al trigo a travs de la transformacin permitir resolver problemas del cultivo, como pueden ser limitantes debido a estreses biticos y abitico o desarrollar nuevas generaciones de transgnicos en funcin de las necesidades del consumidor con mayor contenido de aminocidos esenciales como la lisina, vitaminas, etc. La complejidad del genoma del trigo ha hecho aconsejable abordar los estudios genmicos a travs del transcriptoma. Para ello, se han establecido consorcios interna-

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cionales. Las bases de datos de EST han crecido exponencialmente en la ltima dcada, de manera que en el National Center for Biotechnology Information dbEST database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST) en Marzo de 2004 haba 20 millones de ESTs. Esto incluye cerca de 1 millon de ESTs de trigo hexaploide y sus parientes ms cercanos de la tribu Triticeae, que son Hordeum vulgare L., especies diploides y tetraploides de Triticum, Secale cereale L. y Aegilops speltoides Tausch. Toda esta informacin permite inferir que la biotecnologa puede cambiar el escenario del trigo en dos reas principales: (1) protegiendo al cultivo de estreses biticos y abiticos y (2) modificando el concepto de produccin de commodities por el de produccin de specialities derivadas de trigo, de mayor valor agregado, como noodles (tipo de fideo muy utilizado por los asiticos), galletitas dulces, crackers (un tipo de galletita que se rompe fcilmente), masa congelada, pan de molde, pasta, almidones, plsticos biodegradables, etc. 9 Genomas trabajadores La genmica aplicada a dilucidar los mecanismos por los cuales funcionan los microorganismos puede conducir al aislamiento de sus componentes para desarrollar nanoestructuras que lleven a cabo complejas funciones. Como ejemplos pueden citarse: Methanococcus jannaschii: es una bacteria que produce metano, una importante fuente de energa. Contiene enzimas que soportan temperaturas y presiones elevadas por lo que son potencialmente tiles para fines industriales .Deinococcus radiodurans: soporta niveles de radiacin extremadamente elevados por lo cual tiene un alto potencial para limpiar desechos radiactivos. Thalassiosira pseudonana: se trata de una diatomea marina que es la principal participante en el bombeado biolgico de carbono hacia las profundidades de los ocanos, por lo que posee un elevado potencial para mitigar los cambios climticos del planeta

10 Proyectos de Genmica en Sudamrica En Sudamrica se han desarrollado y se encuentran en ejecucin algunos proyectos genmicos. Frente al estado del desarrollo de estas reas en el mundo, existen en la regin serias carencias, tanto de recursos humanos entrenados como de infraestructura y equipamiento. En Brasil se estableci una red de cooperacin que secuenci completamente el genoma de Xylella fastidiosa, bacteria que ataca a los ctricos causando importantes prdidas econmicas. Tambin incursion en el estudio de genmica funcional de clulas cancerosas y de secuenciacin del genoma de caa de azcar, Saccharum oficinalis. En Argentina se ha trabajado en la secuenciacin de Brucella abortus, agente causal de la brucelosis bovina . Investigadores argentinos participan tambin en proyectos de genmica en cooperaciones internacionales, como el consorcio involucrado en la secuenciacin del genoma de Trypanosoma cruzzi, el proyecto que llev a la clonacin y caracterizacin de los genes de vernalizacin en trigo o el proyecto de bsqueda de genes de tolerancia a fro en Deschampsia antarctica. En Chile se ha completado recientemente la secuenciacin de Piscirickettsia salmonis, patgeno intracelular de salmones que causa importantes prdidas en esta industria. Otros ejemplos son el desarrollo de marcadores de microsatlites (ver II.4) de diversas especies, como girasol (colaboracin de INTA-Argentina con empresas semilleras locales), vides (INIA-Chile como parte de un consorcio internacional), alpacas y otros camlidos sudamericanos (INIA-Chile), entre otros. Actualmente se est desarrollando en Chile un programa de genmica funcional coordinado por diversos ministerios, destinado a enfrentar problemas de postcosecha y enfermedades en plantas de inters agrcola. En varios pases se han secuenciado fragmentos de genomas de virus, y viroides (Argentina, Chile, Uruguay). Los objetivos para programas de genmica sudamericanos deberan enfocarse hacia el aumento de la productividad y la mejora de la calidad de los productos, desarrollando capacidades para identificar genes

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propios del germoplasma regional, de manera de disminuir la dependencia de variedades y genes desarrollados y aislados por pases del primer mundo y buscar soluciones para problemas propios de la regin, que difcilmente pueden ser enfrentados por programas de mejoramiento gentico ajenos a la misma. 11 Lecturas recomendadas
CENCI A., CHANTRET N., XY K., GU Y., ANDERSON O.D., FAHIMA T., DISTELFELD A., y DUBCOVSKY J.. 2003. Construction and characterization of a half million clones Bacterial Artificial Chromosome (BAC) library of durum wheat. Theor Appl Genet 107:931-939. ECHENIQUE V., STAMOVA B., WOLTERS P., LAZO G., CAROLLO V y DUBCOVSKY J. 2002. Frequencies of Ty1copia and Ty3-gypsy retroelements within the Triticeae EST databases. Theor. Appl. Genet. 104: 840-844. GALE M. y DEVOS K. 1998. Plant comparative genetics after 10 years. Science, 282: 656-658. DEVOS, K.M,; GALE, M.D. 2000. Genome relationship: the grass model in current research. Plant Cell 12:637-646 GOFF, S.A.; RICKE, D.; LAN, T.H.; PRESTING, G.; WANG, R.; DUNN, M.; GLAZEBROOK, J.; SESSIONS, A.; OELLER, P.; VARMA, H. et al. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science, 296:92-100. GRIFFITHS, A.; MILLER, J.; SUZUKI, D.; LEWONTIN, R.; GELBART, W. 2000. An introduction to the genetic analysis. Sptima Edicin. W:H:Freeman, N:York. 860 pp. KNIGHT, JONATHAN. 2003. News Feature. A Dying Breed Nature 579, vol. 421 KONCZ, C. 2003. Plant Biotechnology. From genome projects to molecular breeding. Current Opinion in Biotechnology 14:133-135. KUMAR, A. y BENNETZEN, J.L. 1999. Annu Rev Genet 33:479532 LAGUDAH, E.; DUBCOVSKY, J. y POWELL, W. 2001. Wheat Genomics. Plant Physiology and Biochemistry. 39:335-344. MORGANTE, M. y SALAMINI, F. 2003. From plant genomics to breeding parctice.Current Opinion in Biotechnology14:214-219. RAFALSKI, A. 2002. Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics. Curr Opin Plant Biol,

5:94-100. SANMIGUEL, P.; RAMAKRISHNA, W.; BENNETZEN, J. L.; BUSSO, C. y DUBCOVSKY, J. 2002. Transposable elements, genes and recombination in a 215-kb contig from wheat chromosome 5A. Functional and Integrative Genomics. 2: 70-80. SCHNEIDER, K.; WEISSHAAR, B.; BORCHARDT, D.C.; SALAMINI, F. 2001.SNP frequency and allelic haplotype structure of Beta vulgaris expressed genes. Mol Breed, 8:63-74 SNUSTAD, D.; SIMMONS, M. 2003. Principles of Genetics. 3th. edition. John Wiley and Sonds, Inc. 840 pp. WADE, C.M.; KULBOKAS, E.J. III; KIRBY, A.W.; ZODY, M.C.; MULLIKIN, J.C.; LANDER, E.S.; LINDBLAD-TOH, K. y DALY, M.J. 2002. The mosaic structure of variation in the laboratory mouse genome. Nature, 420:574-578. YAN, L.; ECHENIQUE, V.; BUSSO, C. S.; SANMIGUEL, P.; RAMAKRISHNA, W.; BENNETZEN, J.L.; HARRINGTON, S. y DUBCOVSKY, J. 2002. Cereal genes similar to Snf2 define a new subfamily that includes human and mouse genes. Molecular and General Genomics 268:488-499. YAN, L.; LOUKOIANOV, A.; BLECHL, A.; TRANQUILLI, G.; RAMAKRISHNA, W.; SANMIGUEL, P.; BENNETZEN, J.; ECHENIQUE, V. y J. DUBCOVSKY. 2004. Positional cloning of wheat VRN2 gene reveals a new vernalization pathway. Science. En prensa. YANO, M.; KATAYOSE, Y.; ASHIKARI, M.; YAMANOUCHI, U.; MONNA, L.; FUSE, T.; BABA, T.; YAMAMOTO, K.; UMEHARA, Y.; NAGAMURA, Y. Y SASAKI, T. 2000. Hd1, a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS. Plant Cell, 12:2473-2484. YU, J.; HU, S.; WANG, J.; WONG, G.K.; LI, S.; LIU, B.; DENG, Y.; DAI, L.; ZHOU, Y.; ZHANG, X. et al. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Science, 296:79-92. The Arabidopsis Genome Initiative: Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 2000, 408:796-815. The Caenorhabitis elegans Sequencing Consortium. Science, 282, 2012-2018. The Genome International Sequencing Consortium. Nature, 409, 860-921 2001. The Yeast Genome Directory, Nature, 387, supplement 1-105 1997.

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VII.-Captulo 2
Mtodos para el estudio de la expresin de genes
Pessino, Silvina C.; Martelotto, Luciano G. 1 Introduccin La capacidad de secuenciar genomas completos desarrollada en la ltima dcada ha impulsado a la investigacin cientfica en la direccin de definir la funcin de cada uno de los genes identificados. Para contribuir con ese objetivo se han diseado tcnicas que permiten estudiar la expresin gnica global en un determinado tejido y en un momento particular del desarrollo, posibilitando la identificacin inicial y el agrupamiento en clases funcionales de secuencias nuevas con una actividad asociada. Los procedimientos para esta evaluacin han progresado desde los mtodos desarrollados para el anlisis de genes nicos especficos (como el Northern slot y dot blotting, la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa y los ensayos de proteccin de nucleasas) hacia otros enfocados en la identificacin de mltiples transcriptos que difieren en su representacin entre las diversas muestras experimentales (como la hibridacin substractiva, el display diferencial, el ADNc-AFLP , la secuenciacin de etiquetas expresadas o EST, el anlisis serial de la expresin de genes o SAGE y la hibridacin de microarreglos). La organizacin de las secuencias dentro de grupos funcionales basada en los datos de expresin y de homologa proporciona un marco bsico para conducir nuevos estudios dirigidos a definir la actividad precisa de cada producto gnico. 2 Hibridacin substractiva Los mtodos de hibridacin substractiva fueron creados a principios de la dcada que comenz en 1980 con el propsito de construir bibliotecas de ADNc para obtener sondas de genes expresados diferencialmente. Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propsito de identificar genes regulados positiva o negativamente en

una escala global. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de funcin relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de tcnicas comunes de biologa molecular que no requieren equipos especializados de deteccin y anlisis. El procedimiento general consiste en la hibridacin de ADNc provenientes de una muestra prueba (tester) con un exceso de ARNm proveniente de una muestra control (driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman molculas de ARNm/ADNc hbridas, mientras que las secuencias de ADNc que estn presentes nicamente en la muestra tester permanecen como hebras simples. Las molculas de hebras simples y dobles se separan usando cromatografa en hidroxilapatita. Los ADNc expresados diferencialmente pueden entonces ser recuperados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una biblioteca. Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) el requerimiento de grandes cantidades de ARNm y ii) la tendencia a una menor eficiencia en la identificacin de transcriptos poco abundantes. La hibridacin substractiva es aplicable slo a comparaciones de pares de muestras y debe ser realizada por duplicado con el tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como disminuciones en los niveles de expresin. Adems no genera una medida cuantitativa y aunque es eficiente en la identificacin de genes que estn completamente ausentes en el driver no revela fcilmente a aquellos que estn presentes en ambas muestras en distinta proporcin. A fin de mejorar el protocolo original se realizaron modificaciones que incluyen la produccin de ADNc con marcas de biotina u oligo(dT)30-ltex de manera de refinar la separacin de las molculas de cadena simple y doble. Tambin se incorpor la amplificacin de ADNc selectos por PCR para disminuir la cantidad inicial de mARN requerido y aumentar la eficiencia de clonado de los transcriptos seleccionados. En la actualidad se utiliza ms comnmente un protocolo ingenioso conocido como hibridacin substractiva de supresin (SSH) que fue diseado para favorecer la deteccin de

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transcriptos raros expresados diferencialmente. Este incluye una normalizacin en la representacin de los transcriptos diferenciales basada en la inhibicin de la amplificacin de aquellos que son ms abundantes, eliminando tambin la necesidad de separar molculas de cadena doble y simple (Fig.1).

3 Display diferencial y RAP-PCR Las tcnicas conocidas en general como huellas digitales genticas de ARN (ARN fingerprinting) incluyen al display diferencial (DD) y al fingerprinting de ARN con una PCR cebada arbitrariamente (RAP-PCR). Ambos mtodos estn basados en una amplificacin por PCR de subgrupos al azar de transcriptos a partir de dos o ms muestras. La primera etapa de ambos procedimientos es comn y consiste en generar ADNc haciendo una transcripcin reversa de una fraccin de las molculas de ARNm de una muestra. En el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la transcripcin reversa a un poliT anclado con una o ms bases adicionales al extremo 3 del ARN mensajero (por ejemplo (T)12AC). Estos oligonucletidos se fijan al ARN mensajero a travs de la unin de las bases adicionales, impidiendo que el poliT resbale sobre distintas zonas del poli A. El nico grupo de ARNm que es transcripto en forma reversa es el integrado por las molculas que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del poliT en el extremo del mensajero adyacente al poliA. En contraste, la RAP-PCR utiliza oligonucletidos de secuencia arbitraria para la transcripcin reversa. Estos cebadores tienen normalmente 10 bases de largo y se unen a sus secuencias com-

Figura 1: Esquema general que describe el procedimiento de hibridizacin substractiva de supresin (SSH). El ADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadas por separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver), lo que conduce a la formacin de los productos de tipo a, b, c y d que se indican en la figura. Luego ambas muestras se mezclan y se rehibridizan en presencia de un exceso adicional del driver desnaturalizado, lo que origina los productos a, b, c, d y e. Los extremos de las hebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a los adaptadores. El enriquecimiento en las molculas e se logra durante la amplificacin por PCR ya que: i) a y c pueden unir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente; ii) la amplificacin de b est suprimida debido a la complementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptador que promueven la formacin de estructuras secundarias internas en las hebras simples; iii) d no contiene sitios de unin a los adaptadores. Los productos de PCR resultantes provendrn de transcriptos presentes esencialmente en el tester y ausentes en el driver y adems su representacin estar normalizada ya que los fragmentos diferenciales abundantes tendrn mayores posibilidades de formar molculas de tipo b. Este esquema fue adaptado de Diatchenko et al. 1996.

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plementarias permitiendo formar una hebra en los distintos tratamientos experimentade ADNc desde este sitio. En este caso el les representan potenciales transcriptos de subgrupo de ARNms que sufre transcripcin ARNm de expresin diferencial. Tpicamenreversa estar integrado por aquellas mol- te, las bandas son evaluadas slo si amplificulas que presenten la secuencia complemen- can en forma consistente en reacciones de taria a la del cebador orientada en el senti- PCR duplicadas para cada muestra (Fig. 2). do adecuado. La fase final del display diferencial consisLuego de haberse realizado la sntesis de te en la identificacin de la secuencia del la primer hebra del ADNc, se amplifican seg- transcripto representado por el producto de mentos de los transcriptos usando pares ml- PCR y la confirmacin de que este realmente tiples de cebadores de PCR. Tanto para el se expresa en forma contrastante. Estas etadisplay diferencial como para la RAP-PCR, el pas se logran localizando fsicamente y cebador superior es un oligonucletido arbi- escindiendo la seccin del gel de trario de 10 pares de bases. El cebador infe- poliacrilamida que contiene al producto de rior es el mismo oligonucletido poliT anclado (para el caso del display diferencial) o el decmero arbitrario (para el caso de RAP-PCR) que se usaron alternativamente para hacer la transcripcin reversa. Se ha estimado que los productos de PCR de 240 combinaciones particulares de pares de cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las combinaciones de 20 oligonucletidos arbitrarios y 12 oligonucletidos anclados) representan estadsticamente a todos los ARNm originalmente presentes en la muestra. Los productos de PCR pueden ser marcados por incorporacin de un nucletido radiactivo o de una molcula que pueda ser detectada a travs de su interaccin con un anticuerpo conjugado a un sistema de deteccin (por ejemplo digoxigenina). Tambin puede usarse un cebador unido a un fluorforo u optarse por no marcar los fragmentos amplificados y usar luego una tincin con nitrato de plata para revelar los geles. La visualizacin de los productos de PCR se logra Figura 2: Representacin grfica del mtodo de display diferencial. luego de la electroforesis en geles de Las muestras de ARN son transcriptas en forma reversa usando poliacrilamida seguida de la apropia- como cebador un oligonucletido poliT de secuencia 5T(T)nTXY da generacin y deteccin de imge- 3 (donde 10 n 12) que se fija en forma estable al extremo 3de transcriptos a travs de la unin de las bases adicionales de nes, que son evaluadas comparando los secuencia arbitraria X e Y. Una vez sintetizada la primer hebra del la intensidad relativa de las bandas ADNc, sta se usa como molde para una reaccin de PCR que producidas a partir de diferentes utiliza como cebadores el mismo poliT anclado y un decmero de secuencia arbitraria. Distintas combinaciones de poliTs y decmeros muestras experimentales. Los fragmentos que estn presen- generan numerosos perfiles de amplificacin a partir de diversas subpoblaciones de ARN mensajeros. El patrn de bandas de las tes en una muestra y ausentes en la muestras experimentales se compara en busca de diferencias de otra o aquellos que estn presentes tipo presencia-ausencia o alteraciones en la intensidad de las con diferentes intensidades relativas bandas.

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inters. En la mayora de los casos debe realizarse un alineamiento de las imgenes de los fragmentos de amplificacin con el gel de poliacrilamida seco. En los casos en que se utiliza tincin con nitrato de plata no es necesario realizar este paso, por lo cual la recuperacin de la banda es mucho ms eficiente. Los productos de PCR son purificados del gel y reamplificados. Se han utilizado varias estrategias para confirmar la expresin diferencial de los transcriptos, que incluyen el uso de los fragmentos como sondas de Northern, la siembra de los fragmentos en membranas para someterlos a anlisis de Northern inverso y el clonado y secuenciacin de los productos para disear cebadores especficos que permitan realizar PCR semicuantitativas. Independientemente de cul sea la tctica usada para confirmar la expresin diferencial, las secuencias de los fragmentos de los genes expresados diferencialmente se requieren siempre para comenzar a entender la funcin del gen. El aislamiento de la secuencia completa de los genes involucrados puede lograrse usando los clones diferenciales en estudios de bibliotecas de ADNc o realizando experimentos de 5RACE. Dos ventajas importantes de los mtodos de fingerprinting de ARN con respecto a los de hibridizacin substractiva son la capacidad de comparar muestras experimentales mltiples en forma simultnea y la de identificar genes que estn regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las otras. Sin embargo, los mtodos de fingerprinting de ARN comparten con el SSH la limitacin de que no son cuantitativos. Adems suelen aparecer numerosos falsos positivos, es decir, fragmentos de genes que parecen estar diferencialmente expresados pero son artefactos de PCR. Otro problema es que estas tcnicas deben aplicarse en general a muestras provenientes del mismo individuo sometido a distintas condiciones o sobre individuos genticamente idnticos (por ejemplo, isolneas). Cuando se comparan los perfiles de ARNm de individuos diferentes genticamente, pueden aparecer falsos positivos que son resultado de una amplificacin diferencial debida a una variacin en la secuencia de los transcriptos ms que a

diferencias en su representacin. Ese problema puede ser evitado utilizando estrategias de anlisis de segregantes en grupo (BSA) aplicadas al estudio de perfiles de ARN. Finalmente, la investigacin de todos los genes que potencialmente se expresan en forma diferencial requiere el uso de equipamiento de ltima generacin y una inversin extensiva de tiempo y trabajo para detectar y confirmar la expresin diferencial de cada uno de los genes individuales. 4 Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de ADNc amplificados (ADNc-AFLP) La tecnologa de AFLP , generalmente utilizada para producir huellas genticas de ADN genmico, puede ser aplicada tambin a preparaciones de ADNc de doble hebra para obtener un perfil del transcriptoma. Los patrones obtenidos por esta tcnica son una herramienta confiable y eficiente para la identificacin de los ARNm expresados diferencialmente. La tcnica de ADNc-AFLP detecta fragmentos de restriccin de ADN por medio de amplificacin por PCR. Comprende las siguientes etapas: i) generacin de ADNc, ii) restriccin del ADNc con dos endonucleasas especficas, preferiblemente una que reconoce sitios de 6 bases y otra que reconoce sitios de 4 bases, iii) ligacin de adaptadores de cadena doble a los extremos de los fragmentos de restriccin, iv) amplificacin de un subgrupo de los fragmentos de restriccin usando dos cebadores complementarios al adaptador que llevan bases selectivas adicionales en el extremo 3 v) electroforesis de los fragmentos de restriccin amplificados en geles de poliacrilamida, vi) visualizacin de las huellas digitales genticas mediante el uso de autorradiografas, fosfoimgenes y otros mtodos (Fig. 3, ver pg.7). Las mayores ventaja del uso de la tecnologa de ADNc-AFLP son: i) no se requiere informacin previa de secuencia; ii) se puede estudiar una fraccin muy grande de todos los genes expresados, iii) es una tcnica muy sensible que permite la deteccin de transcriptos de baja abundancia, iv) los fragmentos son extrados fcilmente de los geles

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y las secuencias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos. 5 Etiquetas de secuencia expresadas (Expressed sequence tags, EST) Los avances tecnolgicos que facilitan la secuenciacin masiva condujeron a principios de los aos 90 a idear el concepto de las bibliotecas de etiquetas de secuencia expresadas (bibliotecas de ESTs). Las secuencias EST son generadas tomando clones al azar de una biblioteca de ADNc y realizando una sola reaccin de secuenciacin que abarca 300-500 pb del clon. Las diferencias en la expresin de genes pueden ser identificadas considerando el nmero de veces en que aparece representada una secuencia en particular. Sin embargo, las secuencias EST a menudo se generan a partir de bibliotecas de ADNc que han sido normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Los EST secuenciados a partir de estas ltimas pueden ser comparados para identificar transcriptos que se expresan en una biblioteca y estn completamente ausentes en otra, pero si se pretende obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a bibliotecas de ADNc no normalizadas. La posibilidad de detectar diferencias en la expresin de genes a travs de la comparacin de la abundancia de secuencias en las bases de datos de EST se incrementa con el crecimiento de estas bases. La combinacin de la informacin generada por los EST (nivel y localizacin espacio/ temporal de la expresin gnica) y la de los proyectos de secuenciacin de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de expresin y homologa estructural que en muchos casos facilitan la inferencia de la posible funcin de los genes identificados. Por supuesto, esto constituye una instancia inicial en la identificacin de la funcin de cada gen. Para determinar su actividad precisa deben hacerse estudios particulares en general dirigidos a bloquear o aumentar su expresin por ingeniera gentica y a modificar estructuralmente la molcula de manera de

alterar la actividad de los diferentes dominios de la protena que codifica. 6 Anlisis serial de la expresin de genes El anlisis serial de la expresin de genes (SAGE) consiste esencialmente en una versin acelerada de la secuenciacin de EST. Est basada en el concepto de que una etiqueta corta de unas pocas bases es suficiente para identificar inequvocamente a un transcripto, siempre y cuando est ubicada en una posicin definida dentro de la secuencia del mensajero. Una etiqueta SAGE consiste tpicamente en 9 bases de secuencia ubicadas por debajo del ltimo sitio de reconocimiento de una endonucleasa especfica en el transcripto blanco. Mltiples etiquetas SAGE se ligan juntas en un vector de clonado de manera que una reaccin de secuencia de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiempo (Fig. 4, ver pg.7). Como cada etiqueta SAGE representa un nico transcripto de ARNm, es posible obtener una visin general de todos los genes expresados en la muestra original. Las diferencias en la expresin de genes entre muestras experimentales pueden entonces ser identificadas comparando la abundancia relativa de etiquetas SAGE especficas en diferentes bibliotecas. Los genes o las secuencias EST representados por las etiquetas SAGE son localizados en las bases de datos detectando aquellos transcriptos que tengan la etiqueta SAGE en la posicin adecuada. Una limitacin del SAGE es la identificacin de los genes representados por las secuencias de etiquetas. Este proceso est en primer lugar restringido a secuencias que estn accesibles en las bases de datos. Sin embargo, esta limitacin se tornar menos problemtica a medida que se generen ms secuencias EST y que a las secuencias existentes se les asignen asociaciones y funcin. Otra limitacin potencial es la identificacin errnea de las etiquetas. Esto puede resultar de errores de secuenciacin y de la identificacin fallida de la regin que corresponde al SAGE en la base de datos de secuencia. Adems, ciertos transcriptos pueden estar ausentes en la muestra, dependiendo de cul sea la enzima especfica usada para generar la biblioteca de SAGE. Otros ARNm por el contrario

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pueden estar representados por mltiples etiquetas SAGE a causa de la existencia de polimorfismos en un slo nucletido o el procesamiento alternativo de los transcriptos. Se espera que muchos de esos problemas afecten a una porcin relativamente pequea de los genes representados, pero no deberan ser dejados de lado en la interpretacin de los resultados. Por otra parte, dos ventajas importantes del SAGE sobre la hibridacin substractiva y el display diferencial es que los datos obtenidos son cuantitativos y acumulativos. Si se genera la suficiente cantidad de informacin de secuencia se obtienen perfiles exactos de la expresin de los transcriptos, que describen la abundancia de todos los genes expresados en una clula o tejido. Existe una base de datos pblica de expresin gnica que ha sido creada para el almacenamiento y anlisis de secuencias de SAGE cuyo poder continuar creciendo a medida que se contribuya con ms informacin. Otra caracterstica de los datos de SAGE es que pueden complementar datos de ESTs generados a partir de bibliotecas de ADNc normalizadas o substradas. Los EST brindan informacin de secuencia mientras que el SAGE provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de los transcriptos. Finalmente, a pesar de que el SAGE requiere capacidad de secuenciacin de ltima generacin, la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciacin EST. 7 Hibridacin de microarreglos o micromatrices La evaluacin de la expresin de genes usando la tecnologa de micromatrices ha demostrado ser un procedimiento muy efectivo para una variedad de aplicaciones. Los tres tipos generales de micromatrices incluyen: i) chips de oligonucletidos, construdos realizando la reaccin de sntesis de cebadores cortos directamente sobre una matriz de vidrio, ii) arreglos de oligonucletidos, construdos depositando oligonucletidos sobre placas de vidrio o membranas de nylon, iii) arreglos de ADNc, obtenidos depositando insertos amplificados por PCR a partir de una biblioteca sobre placas

de vidrio o membranas de nylon. Uno de los aspectos ms importantes de la experimentacin con micromatrices es la seleccin de los fragmentos de ADN que contendr. An cuando el nmero de genes representado suele ser grande (3000 a 10000), pueden faltar algunos que sean importantes para una cuestin experimental particular. La seleccin de la biblioteca ms adecuada para una aplicacin en particular y la eleccin de los clones son factores crticos que determinan el xito de estos experimentos. En algunas situaciones, puede ser ms efectivo enfocar los experimentos en un grupo pequeo de genes seleccionados por criterios ms especficos como, por ejemplo, perfiles de distribucin de tejidos, clasificacin funcional o cambio de expresin conocidos. Se pueden adquirir clones de fuentes comerciales u otras fuentes y/o clonar secuencias especficas usando tcnicas estndar de biologa molecular. Despus de que los clones han sido seleccionados deben ser ensamblados y organizados para generar el arreglo de ADNc junto con los controles apropiados. Tpicamente, el largo de los insertos ser mayor a 500 bases, pero esto depende de los clones seleccionados. Los productos de PCR son purificados y luego depositados (o impresos) en lugares precisos sobre una placa de vidrio o una membrana de nylon. Los instrumentos usados para la produccin de micromatrices han mejorado en los ltimos aos. Las opciones varan desde la construccin de un arreglo por raspado hasta la compra del sistema completo. Independientemente de cul sea el origen de los clones, es esencial saber con seguridad la secuencia de cada sonda que est siendo ubicada sobre la matriz para asegurar una interpretacin exacta de los datos resultantes. Por la tanto, puede ser necesario secuenciar por duplicado todos o una porcin de los fragmentos organizados (Fig. 5, ver pg.8). El ARNm que representa las muestras experimentales se prepara para la hibridacin con las micromatrices de ADNc por transcripcin reversa y marcado con nucletidos fluorescentes (Cye3 y Cye5 dUTP) o radiactivos ([ 33 P] dCTP). Las molculas

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Figura 3: Generacin de una huella digital de ARN por la tcnica de ADNc-AFLP. El RNA mensajero se transcribe en forma reversa utilizando un poliT como cebador. Las hebras de ADNc se digieren con dos enzimas de restriccin, una de corte raro y otra de corte frecuente. Se ligan adaptadores complementarios a ambos extremos y se preamplifican por PCR los fragmentos utilizando cebadores que reconocen la secuencia de los adaptadores. Los fragmentos que contienen adaptadores diferentes en los extremos son amplificados preferentemente a causa de que en general tienen un tamao intermedio. Luego se realiza una segunda amplificacin utilizando cebadores anclados con una o dos bases adicionales en el extremo 3que amplifican una subpoblacin de fragmentos. El cebador correspondiente al adaptador para la enzima de corte raro est marcado radiactivamente. La combinacin de diferentes cebadores anclados genera perfiles provenientes de distintos subgrupos de ARNms.

Figura 4: Procedimiento general para la obtencin de etiquetas de secuencia SAGE. El ARN mensajero es transcripto en forma reversa utilizando un poliT biotinilado como cebador. Luego es digerido con una enzima de restriccin ancla que reconoce sitios de 4 bases frecuentes en la secuencia de los mensajeros. Es probable que la mayora de los mensajeros sean digeridos por esta enzima en algn sector de su secuencia. Los extremos 3de las molculas son recuperados por unin a esferas de estreptavidina. La muestra se divide en dos partes iguales que se ligan alternativamente a dos adaptadores diferentes (A y B). A continuacin son digeridas con una segunda enzima de restriccin (enzima de etiquetado) que reconoce un sitio dentro de la secuencia del adaptador pero corta al transcripto unos 20 pares de base ms abajo generando un extremo romo. Ambas muestras se mezclan, se ligan y amplifican con dos oligonucletidos A y B complementarios a los respectivos adaptadores. Los amplicones se digieren nuevamente con la enzima ancla y los fragmentos se ligan como concatmeros y se clonan. Este diagrama fue adaptado a partir del presentado por Velculescu et al. 1995.

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Figura 5: Expresin de genes controlada a travs del uso de microarreglos de ADNc. Los clones amplificados por PCR se imprimen sobre un soporte slido. Las muestras a analizar se marcan con diferentes fluorforos y se hibridizan con la matriz. Un detector permite medir por separado la emisin de cada fluorforo. La intensidad de la seal de hibridizacin ser proporcional al contenido de cada molcula particular de ARN en la muestra. Los patrones de emisin de ambas muestras son comparados para detectar expresin diferencial.

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fluorescentes generalmente se usan para marcar sondas con las que se hibridarn placas de vidrio, mientras que las radiactivas se incorporan a sondas que se usarn sobre membranas de nylon. Los fluorforos Cye3 y Cye5 presentan diferentes espectros de emisin, por lo tanto dos muestras experimentales pueden ser marcadas alternativamente con cada uno de ellos, hibridadas juntas en una reaccin nica competitiva y luego evaluadas en forma separada con un detector de fluorescencia. Por el contrario, las muestras radiactivas deben ser hibridadas individualmente en reacciones seriales y pueden ser detectadas usando un sistema de fosfoimgenes. Independientemente del diseo experimental, el anlisis de micromatrices se basa en la premisa de que la intensidad de la seal de hibridacin resultante para una secuencia es proporcional a la cantidad de ARNm que corresponde a esa secuencia en la muestra original. La expresin relativa de cada secuencia representada en el microarreglo es evaluada comparando las seales de intensidad de hibridacin generadas por las diferentes muestras experimentales. Cada experimento de micromatrices genera una gran cantidad de datos y es crtico realizar un procesamiento apropiado de los mismos. El anlisis de la informacin obtenida puede ser dividido en tres componentes: i) identificacin y cuantificacin de las intensidades de hibridacin; ii) visualizacin de los datos; iii) tcnicas de agrupamiento. El primer componente incluye la identificacin exacta de los puntos de la imagen, la normalizacin segn el fondo, la cuantificacin de las intensidades de hibridacin y la salida de los datos en una forma utilizable. La visualizacin de los datos incluye su clasificacin y presentacin en una forma lgica y su organizacin en diferentes formatos para apuntar a la resolucin de cuestiones mltiples. Finalmente, los algoritmos de agrupamiento permiten identificar conjuntos de genes con patrones de expresin similar a travs de distintas muestras experimentales. En base a la presuncin de que la expresin de los genes con funciones relacionadas estn regulada en forma coordinada, el agrupamiento de datos de microarreglos se convierte en un mtodo poderoso para asignar

posibles clasificaciones funcionales a genes nuevos. 8 Conclusin Los mtodos descriptos en este captulo son tecnologas eficaces que expanden los estudios de expresin desde los genes nicos hasta el nivel genmico. Ninguno de estos procedimientos per se es ptimo para todas las aplicaciones y la mejor estrategia para situaciones especficas puede ser crear combinaciones de varios de ellos. El continuo refinamiento de las tcnicas genmicas y de la bioinformtica relacionada proporcionar a los investigadores nuevas herramientas para estudiar la expresin de la informacin hereditaria y lograr un mejor entendimiento sobre el control gentico de los procesos fisiolgicos. 9 Lecuras Recomendadas
ADAMS, M. D.; J. M. KELLEY, J. D. GOCAYNE, M. DUBNICK, M. H. POLY-MEROPOULOS, H. XIAO, C. R. MERRIL, A. WU, B. OLDE, R. F. MORENO. 1991. Complementary DNA sequencing: expressed se-quence tags and human genome project. Science (Wash DC) 252:16511666. DAVIS, M. M.; D. I. COHEN, E. A. NIELSEN, M. STEINMETZ, W. E. PAUL, L. HOOD. 1984. Cell-typespecific ADNc probes and the murine 1 region: the localization and orientation of Ad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:21942198. DIATCHENKO, L.; Y.-F. C. LAU, A. P. CAMPBELL, A. CHENCHIK, F. MOQA-DAM, B. HUANG, S. LUKYANOV, K. PUKYANOV, N. GURSKAYA, E. D. SVERDLOV, P. D. SIEBERT. 1996. Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific ADNc probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:60256030. GURSKAYA, N. G.; L. DIATCHENKO, A. CHENCHIK, P. D. SIEBERT, G. L. KHASPEKOV, K. A. LUKYANOV, L. L. VAGNER, O. D. ERMOLAEVA, S. A. LUKYANOV, E. D. SVERDLOV. 1996. Equalizing ADNc subtraction based on selective suppression of polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell transcripts induced by phytohemaglutinin and phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal. Biochem. 240:9097. LIANG, P.; A. B. PARDEE. 1992. Differential display of eukaryotic messenger ARN by means of the polymerase chain reaction. Science (Wash DC) 257:967971. MOODY D. E. 2001. Genomics techniques: an overview of methods for the study of gene expression. J. Anim. Sci. 79 (E. Suppl.): E128-E135.

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OKUBO, K.; N. HORI, R. MATOBA, T. NIYAMA, A. FUKUSHIMA, Y. KOJIMA, K. MATSUBARA. 1992. Large scale ADNc sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of gene expression. Nat. Genet. 2:173 179. SARGENT, T. D.; I. B. DAWID. 1983. Differential Gene expression in the gastrula of Xenopus laevis. Science (Wash DC) 222: 135-139. SCHENA, M.; D. SHALON, R. W. DAVIS, P. O. BROWN. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (Wash DC) 270:467470. VELCULESCU, V. E.; L. ZHANG, B. VOGELSTEIN, K. W. KINZLER. 1995. Serial analysis of gene expression. Science (Wash DC)270:484487. WELSH, J.; K. CHADA, S. S. DALAL, R. CHENG, D. RALPH, M. McCLELLAND. 1992. Arbitrarily primed PCR fingerprinting of ARN. Nucl. Acids Res. 20:49654970.

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VII.- Captulo 3
Anlisis informtico de secuencias moleculares
Paniego, Norma; Heinz, Ruth; Fernndez, Paula; Lew, Sergio; Hopp, Esteban 1 Introduccin La Bioinformtica es el rea de las ciencias de la computacin que aborda la bsqueda de soluciones a los problemas biolgicos con herramientas computacionales. Tanto el anlisis genmico como sus disciplinas relacionadas pueden ser abordados desde una perspectiva diferente a partir de la enorme disponibilidad de secuencias moleculares acumuladas en las bases de datos internacionales como GenBank [1], EMBL [2], DDBJ [3] y SwissProt [4]. El impacto de los proyectos genmicos durante los ltimos 10 aos, ha sido por un lado la creciente disponibilidad de secuencias, y por el otro la gran diversidad de datos biolgicos acumulados. Esto, junto con el desarrollo de las tecnologas informticas y el arribo de Internet transformando la estructura de almacenamiento y acceso de los datos, ha permitido el desarrollo de aspectos fundamentales para el avance de los conocimientos sobre los sistemas biolgicos, como lo son la bsqueda de similitud en secuencias moleculares, el anlisis comparativo (filogentico, taxonmico y sintnico) de las especies, el anlisis de macromolculas, la ingeniera y diseo de estructuras proteicas, entre otros [5]. El propsito de este captulo es introducir los conceptos y las herramientas bsicas de la Bioinformtica a los estudiantes de un curso de biotecnologa vegetal o de biologa molecular de plantas. De ninguna manera este material pretende cubrir la totalidad de los recursos existentes para la materia, por el contrario el objetivo es guiar el inters de los estudiantes en la exploracin y el uso de mtodos computacionales decisivos para el desarrollo de su actividad cientfica o profesional futura. Por lo cual, en primer lugar describiremos las bases de datos generales para secuencias de ADN y protenas y las bases

de datos especficas de plantas remitiendo en cada caso al estudiante a visitar las paginas principales de los sitios mencionados para ampliar el conocimiento de los mismos. Posteriormente, con la misma orientacin abordaremos aspectos relacionados a la bsqueda, el anlisis y la interpretacin de secuencias biolgicas. 2 Bases de datos moleculares Un proyecto tpico de anlisis genmico genera secuencias nucleotdicas las cuales se hacen pblicas envindolas a las bases de datos internacionales. No slo lo hacen los proyectos dedicados a la secuenciacin a gran escala. Tambin lo hacen los investigadores involucrados en proyectos ms especficos de biologa molecular, dado que el depsito de la secuencia es una condicin frecuentemente exigida por las revistas internacionales que publican estos trabajos. As, las bases de datos moleculares se alimentan constantemente y contienen una enorme y heterognea cantidad de datos que incluyen secuencias de cidos nucleicos, protenas, estructuras macromoleculares, etc., asociados a recursos informticos que asisten el acceso, el envo, la actualizacin, y la extraccin de datos. Existen varios cientos de bases de datos accesibles desde la Web, pero la dinmica enunciada no asegura tener el mximo provecho sustentable de las mismas, empezando por mantener una actualizacin constante. Con este fin, se pueden revisar catlogos como DBCAT [6], o el componente DATABANK de la plataforma SRS (Sequence Retrieval System [7]) de integracin de datos del European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Otra fuente de actualizacin exhaustiva la constituye el primer nmero de cada ao de la revista Nucleic Acid Research [8] de acceso libre a travs de Internet, que presenta una coleccin actualizada de artculos de los sitios ms importantes como son las bases de datos generales National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA), European Bioinformatics Institute (EBI, EU) y DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Japn) y bases de datos ms especficas. Otro punto de inters es que la calidad de las secuencias vara notablemente: desde secuencias obtenidas a partir de un pasa-

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je por amplificacin por PCR por secuenciacin nica (es decir, con posibles artefactos tcnicos y sin rechequeos) hasta secuencias obtenidas de clones independientes y que han sido secuenciadas en ambas hebras. Lo mismo pasa con la funcin hipottica de los genes representados. Tpicamente los proyectos de biologa molecular bsica generan datos muy bien caracterizados en cuando a la funcin de los genes estudiados, mientras que los proyectos genmicos generan secuencias annimas cuya funcionalidad es primero hipottica, es decir, deducida a partir de su similitud con otros genes de funcin conocida (ver prediccin de genes, ms abajo) y debe ser corroborada funcionalmente, por ejemplo, mediante experimentos de complementacin gentica. Incluso los perfiles de usuarios que atienden estas bases de datos pueden ser bastante heterogneos: desde el tpico bilogo molecular que clon y secuenci un gen involucrado en su tema de estudio (por ejemplo, genes que se activan a partir de una aplicacin hormonal) hasta evolucionistas interesados en redefinir la taxonoma tradicionalmente basada en caractersticas fenotpicas. A pesar de esta heterogeneidad de intereses y de recursos disponibles, lo ms comn es que los usuarios frecuenten las tres bases de datos generales de acceso pblico. Estos sitios colaboran desde 1982 manteniendo las bases de datos de nucletidos de Genbank (NCBI), EMBL Nucleotide Sequence Database (EMBL-Bank, EBI), y DDBJ [8]. Estos grupos coleccionan una porcin del total de las secuencias producidas y reportadas en el mundo, e intercambian diariamente todas las secuencias nuevas o actualizadas. Las bases de datos de protenas incluyen aquellas que derivan de las bases de datos de nucletidos como Swissprot, TrEMBL [4] y PIR [9], y las bases de datos estructurales como PDB (Protein Data Bank [10]) que contiene mas de 21.000 estructuras resueltas por cristalografa o resonancia magntica nuclear y Macromolecular Structure Database (MSD) [11] que es una base de datos de EBI derivada en parte de PDB. El NCBI, el EBI y el DDBJ disponen de otros recursos como bases de datos de transcriptos (dbEST), polimorfismos de un

solo nucletido (dbSNP), sitios de secuencia especfica (dbSTS), genomas completos, taxonoma, literatura, vectores, etc. por lo cual recomendamos explorar estos recursos visitando la pgina About NCBI [12] y 2CAN [13] del EBI. En general, las bases de datos archivan la informacin a partir de una organizacin o estructura lgica, cada entrada en la base de datos se identifica con un cdigo nico que es una cadena de nmeros y letras. Este identificador o nmero de acceso de la secuencia nunca cambia y es la forma en que se cita la secuencia en las publicaciones. A este identificador se le suma otro cdigo que da cuenta de la versin de la secuencia depositada (seq.versin, geninfo identifier, GI). A medida que la secuencia se va actualizando, el nmero de acceso incorpora un punto seguido de un valor incremental que corresponde a la versin actualizada, mientras que el GI toma un valor diferente en cada actualizacin. Las protenas tambin poseen identificadores o nmeros de acceso (protein_ids) (Fig. 1). 2.1 Sistemas de bsqueda de las bases de datos: ENTREZ, SRS y DBGET Las bases de datos no solo proveen la informacin molecular, sino tambin los medios adecuados para acceder fcilmente a esa informacin. Las interfases de bsqueda principales son ENTREZ [14], SRS [7] y DBGET [15]. La ms usada probablemente sea el sistema ENTREZ del NCBI, una de las caractersticas nicas del mismo es que fue el primero en incorporar relaciones lgicas o nexos entre las entradas individuales de datos en distintas bases de datos pblicas (Fig. 2). La interfase SRS rene unas 400 bases de datos (Fig. 3), en el ltimo ao se desarroll como un sistema integrado de bsqueda y recuperacin de datos asociados y aplicaciones para anlisis de secuencias [16]. DBGET es un sistema simple de acceso de datos a un grupo diverso de bases de datos moleculares (Fig. 4). 2.1.1 Uso avanzado de ENTREZ y SRS NCBI desarroll Entrez como una herramienta para permitir a los usuarios interac-

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Figura 1: La Figura muestra los cdigos asignados por las bases de datos a cada secuencia ingresada. A) Nmero de acceso y gi de una secuencia nucleotdica. B) Nmero de acceso y gi de la secuencia de aminocidos correspondiente.

una interfase de usuario. Es decir, constituye el nexo entre el usuario y las bases de datos subyacentes. Esto le permite al usuario realizar consultas simples y obtener resultados, an desconociendo la arquitectura de las bases de datos. Sin embargo, para realizar consultas ms poderosas (en selectividad y eficiencia), es necesario conocer dicha arquitectura u ordenamiento de la estructura de la base de datos, al menos en parte, y saber como restringir las bsquedas a ciertas reas de la base de datos. Para profundizar en los alcances y la operabilidad de Entrez se recomienda visitar el documento de ayuda en la pgina del NCBI [17]. Sin embargo, desde el punto de vista de la facilidad de uso, tal vez SRS sea una mejor opcin, dado que los formularios de bsquedas avanzados son un tanto ms exFigura 2: Representacin grfica de las relaciones del sistema Entrez plcitos que en el caso de Entrez. para la bsqueda y la recuperacin de datos depositados en el sitio NCBI. Entrez es una plataforma dinmica, en la cual se agregan SRS es un paquete de manejo de constantemente nuevos componentes o cambian de manera dinmica bases de datos desarrollado por las vnculos establecidas entre los elementos. EBI y accesible desde distintos si-

cionar o consultar estas bases de datos. Desde el punto de vista informtico, Entrez es

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Figura 3: Algunas de las Bases de Datos accesibles desde el servidor SRS.

tios, que a diferencia de Entrez, puede ser operado de manera local. 2.1.2 Uso de PubMed (ENTREZ) Otra forma muy popular de acceso es a travs del PubMed , usualmente utilizado para el relevamiento bibliogrfico por la mayora de los cientficos. Se basa en el mapeo automtico de trminos (automatic term mapping): cuando se ingresa un trmino para realizar una bsqueda en PubMed, el servidor que recibe el requerimiento intenta identificar el tipo de bsqueda que se est intentando hacer: est el usuario intentando buscar un autor, o una revista, o un rea de conocimiento? Entonces el servidor filtra los trminos de bsqueda a travs de listas sucesivas para intentar responder dicha pregunta y usar los trminos en forma eficiente. Este proceso utiliza las siguientes listas

MeSH (Medical Subject Headings): vocabulario controlado utilizado para indexar artculos en PubMed. Journals: nombre completo de la revista, abreviaturas usadas en MedLine y nmeros ISSN. Lista de frases: cientos de miles de frases generadas a partir de MeSH y otros vocabularios controlados similares. ndice de autores: apellido e iniciales. Si el trmino ingresado est presente en alguna de estas listas, la bsqueda se limitar a ese campo de la base de datos. En caso contrario, el trmino ser utilizado para buscar sobre todos los campos de la base de datos. Es evidente que si uno slo est interesado en buscar publicaciones en determinada revista (por ejemplo Cell), es ineficiente utilizar el trmino Cell como palabra clave, ya que muy probablemente exista algn autor llamado as, y la palabra Cell se encuentre presente en varios ttulos o resmenes.

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Figura 4: Representacin grfica de las relaciones del sistema DBGET para la bsqueda y la recuperacin de datos

El mapeo automtico de trminos puede evitarse en primer lugar encerrando el trmino o frase entre comillas. Esto evitar el filtrado a travs de listas, realizando una bsqueda sobre todos los campos de la base de datos en forma directa. Adems, en caso de una bsqueda con una frase (ms de una palabra), esto fuerza la bsqueda usando la frase tal como fue ingresada (con las palabras en ese orden), lo cual puede resultar til en algunos casos. Los trminos de una bsqueda pueden proporcionarse truncados (truncation), utilizando un asterisco (*). Por ejemplo, una bsqueda con el trmino enzym* retornar citas conteniendo la palabra enzyme, pero tambin enzymes, enzymology, enzymatic, etc. La bsqueda con trminos truncados desactiva el mapeo automtico, por lo cual

las bsquedas utilizando este mtodo van a diferir de las que no lo usan. PubMed ignora ciertas palabras en las bsquedas, estas son llamadas stopwords y corresponden a palabras muy comunes, presentes en la gran mayora de las citas de la base de datos: artculos, proposiciones, adverbios, etc. La lista de stopwords se encuentra en la documentacin de PubMed. Entrez permite combinar trminos utilizando operadores lgicos ( AND, OR, NOT). Los operadores lgicos, tambin llamados operadores volanos ( boolean operators), deben ser ingresados en maysculas para ser reconocidos como tales por Entrez (por ejemplo: vitamin C OR zinc, DNA AND Crick AND 1993). Entrez lee los operadores lgicos de izquierda a derecha. Es posible cambiar el orden de evaluacin de los ope-

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radores usando parntesis. Para focalizar las bsquedas es recomendable utilizar cdigos de calificacin de trminos (search field qualification). Esto es, describir qu tipo de trmino se est usando: si se busca por nombre de un autor, de una revista, o por fecha, etc. La calificacin de trminos se realiza agregando una etiqueta entre corchetes al lado del trmino a calificar. Es muy poco intuitivo el criterio de uso de estos calificadores, por lo que se recomienda leer el manual como fue sugerido al inicio del captulo. Entrez realiza las bsquedas sobre cierto tipo de campos de la base de datos. Estos campos se encuentran indexados, y es posible acceder a los ndices para evaluar la eficacia de nuestra estrategia de bsqueda. Cuando se realiza una bsqueda, se selecciona en Preview/Index, esto permite acceder a un formulario para ver los ndices y eventualmente agregar un trmino a la bsqueda. 2.1.3 Uso de SRS El SRS ofrece a los usuarios la posibilidad de buscar datos y analizarlos a travs de distintos paquetes de software en el mismo sitio. La pgina de inicio de este servidor presenta distintas opciones: Comenzar un proyecto temporario o permanente. Correr una aplicacin. Acceder a informacin disponible sobre las bases de datos. Acceder a la documentacin en lnea. Para realizar una bsqueda hay que seleccionar sobre Start a Temporary Project, con lo que se abre una pgina que muestra las bases de datos disponibles en el sitio. Una vez all deber seleccionarse la(s) base(s) de datos sobre la cual(es) buscar. Es posible seleccionar todas las bases de datos seleccionando sobre el botn all. Luego se accede a la solapa de bsqueda estndar (denominada QUERY) donde se definen las opciones de bsqueda y se ingresan las palabras clave. Dentro de las opciones de bsqueda, si seleccionamos Append wildcards to words la bsqueda se realizar sobre las palabras claves ingresadas y tambin sobre todas aquellas posibles termina-

ciones de dichas palabras. Combine searches with permite relacionar los trminos de la bsqueda mediante los conectores & AND, OR y BUTNOT. Number of entries to display per page permite definir el nmero mximo de registros listados en cada pgina. Pueden hacerse bsquedas extendidas para lo cual hay que ingresar al sitio seleccionando sobre el botn Extended, habiendo seleccionado primero una base de datos. En este formulario se pueden definir los mismos parmetros que en el formulario estndar (wildcards, nmero de registros por pgina, etc.), pero a su vez contiene una lista de reas de datos (que varan de acuerdo con el tipo de base de datos utilizada) sobre la cual pueden realizarse bsquedas. Una vez elegido el campo sobre el cual se quiere buscar, simplemente hay que ingresar la(s) palabra(s) clave en el cuadro de texto de la derecha. 3 Otras bases de datos moleculares Aparte de las bases de datos generales existe un gran nmero de bases de datos especializadas de gran importancia para focalizar proyectos y obtener informacin adicional generalmente no accesible desde las bases generales como son fenotipos, datos experimentales, datos de mapeo, etc.; bases de datos derivadas del anlisis de las bases de datos generales (bases de datos de motivos funcionales y estructurales) y bases de datos de interacciones. Un rea de estas bases especializadas por especies la constituye el rea de proyectos genmicos de plantas. Aqu las iniciativas centrales la constituyen la secuenciacin completa de especies modelo como Arabidopsis thaliana [18] y el arroz, Oryza sativa var. indica [19] y Oryza sativa var. japonica [20]. Sin embargo, estn en marcha muchos proyectos de secuenciacin parcial de genomas en gramneas, crucferas, solanceas, compuestas, etc., que aportan informacin para sustentar el anlisis comparativo de regiones de inters entre genomas ampliando los conocimientos sobre la estructuracin de genes y genomas de las plantas. La identificacin de regiones sintnicas (conservacin de las posiciones cromosmi-

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cas relativas de secuencias marcadoras homlogas en especies relacionadas, es decir, conservacin de mapas genticos a escala evolutiva) har posible el aislamiento de genes en especies con genoma complejo, usando la informacin de genes homlogos en especies con genomas ms pequeos y ms profusamente estudiados (los as llamados clonados posicionales en base a mapas) [21]. Desde lo acadmico, el anlisis comparativo de los genomas usando una estrategia bioinformtica persigue entender cuales son los mecanismos esenciales para el funcionamiento mnimo de una planta, su crecimiento normal, su desarrollo y metabolismo, entender las bases de la especiacin y la diversidad, los mecanismos bsicos de la adaptacin y la enorme diversidad qumica [22]. 3.1 Bases de datos de motivos Existe otro conjunto de bases de datos denominadas secundarias porque derivan
Base de Datos Blocks CDD CluSTr DOMO InterPro IproClass MetaFam Pfam PIR PIR-ALN PRINTS-S ProClass ProDom PROSITE ProtoMap SBASE SMART Descripcin

de las bases de datos generales, son las llamadas de motivos estructurales y funcionales. Estas bases de datos introducen el concepto de patrones y perfiles de secuencias. Los patrones definen secuencias cortas de aminocidos conservados que corresponden a sitios activos, sitios de unin, etc. Al ser regiones acotadas, no dan cuenta del resto de la secuencia adyacente y son muy poco sensibles al momento de encontrar secuencias relacionadas que presenten una divergencia mnima en la regin definida por el patrn [23, 24, 25]. Los perfiles compensan esta debilidad dado que cubren reas ms largas de la secuencia a travs de la representacin numrica de las posiciones conservadas en un alineamiento mltiple. En otras palabras, los perfiles representan las posiciones comunes y caractersticas de aminocidos de una coleccin particular de secuencias, frecuentemente de una familia de protenas. Usando perfiles es posible encontrar miembros muy divergentes de familias de protenas que presenten muy baja identidad de secuencia [23, 24, 25].
URL http://blocks.fhcrc.org/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml http://www.ebi.ac.uk/clustr/ http://www.infobiogen.fr/services/domo/ http://www.ebi.ac.uk/interpro/ http://pir.georgetown.edu/iproclass/ http://metafam.ahc.umn.edu/ http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ http://pir.georgetown.edu/ http://pir.georgetown.edu/pirwww/dbinfo/piraln.html http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS/ http://pir.georgetown.edu/gfserver/proclass.html http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/doc/prodom.html http://www.expasy.ch/prosite/ http://www.protomap.cs.huji.ac.il/ http://www3.icgeb.trieste.it/~sbasesrv/ http://smart.embl-heidelberg.de/ http://www.ebi.ac.uk/swissprot/ or http://www.expasy.org/sprot/ http://systers.molgen.mpg.de/ http://www.tigr.org/TIGRFAMs/

Database of protein alignment blocks Conserved domain database Clusters of SWISS-PROT and TrEMBL proteins Protein-domain database based on sequence alignments Integrated documentation resource for protein families, domains and functional sites Integrated protein classification database Database of protein family information Collection of multiple sequence alignments and hidden Markov models Protein Information Resource Curated database of protein sequence alignments Compendium of protein fingerprints Non-redundant protein database organized by family relationships Automatic compilation of homologous domains Database of patterns and profiles describing protein families and domains Automatic hierarchical classification of SWISS -PROT proteins Curated protein domain library based on sequence clustering Simple Modular Architecture Research Tool - a collection of protein families and domains

SWISSPROT Protein sequence databases and TrEMBL Systematic re-searching method for sequence searching and SYSTERS clustering TIGRFAMs Protein families based on hidden Markov models

Tabla 1: Bases de datos y recursos para el anlisis de datos de familias de protenas, dominios y motivos [25].

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Dentro de este grupo de bases de datos que proveen informacin para la bsqueda de secuencias homlogas remotas y para la prediccin de funcin se incluyen Prosite, PRINT-S, Pfam, SMART, TIGRfam y Blocks entre otras listadas en la Tabla 1. 4 Alineamiento de Secuencias: Fundamentos 4.1 Alineamiento de pares de secuencias Una de las maneras mas frecuentes de obtener informacin sobre una o un grupo de secuencias incgnitas, es mediante la bsqueda comparativa utilizando la informacin depositada en distintas bases de datos. Uno de los mtodos comparativos ms comunes es el alineamiento de pares de secuencias, la descripcin del resultado del mismo trae aparejado el uso (o mal uso) de los trminos: identidad, similitud y homologa. La identidad significa que existe exactamente el mismo nucletido o aminocido en la misma posicin de las secuencias alineadas. Similitud expresa una medida observable que considera por un lado las identidades y por otro lado, le da valor a las sustituciones favoreciendo aquellas que sean conservativas respecto de las que no lo son. Finalmente, homologa significa que las secuencias no slo se parecen mucho entre s, sino que tambin comparten una historia evolutiva [26, 27]. Los algoritmos de comparacin de secuencias ms comunes tales como BLAST [28], FASTA [29] y SSEARCH [30, 31] miden similitud o identidad entre secuencias pero no miden homologa. La forma que estos algoritmos emplean para darle significado a cada uno de los alineamientos posibles es asignndole un valor (score) a cada uno de ellos, el score ms alto corresponde al mejor alineamiento. La manera ms comn de asignar este valor es, a travs de una suma simple de scores especificados para cada alineamiento de pares de letras (que representan igualdades o sustituciones), y de letras con caracteres nulos (que representan deleciones o inserciones). El conjunto de estos scores mencionados representa una matriz de scores, las ms populares son las matrices de bloques de sustitucin BLOSUM [32] y las matrices de mutaciones

puntuales aceptables PAM [33, 34]. La construccin de estas matrices se basa en el modelo de Dayhoff [33], que establece que relaciones lejanas entre secuencias pueden modelarse con suficiente precisin usando la informacin de secuencias estrechamente relacionadas. Ambas matrices se basan en grupos de alineamientos altamente confiables de protenas homlogas, a partir del cual miden la frecuencia de todas las sustituciones a travs de mtodos diferentes [26]. Las matrices PAM fueron calculadas sobre la base de un modelo de distancia evolutiva sobre alineamientos de secuencias muy relacionadas, as PAM1 define una unidad de cambio evolutivo y representa la probabilidad de que 1 aminocido en 100 haya experimentado una sustitucin. Multiplicando PAM1 por s mismo se obtiene una familia de matrices de sustitucin arbitrarias que representan distintos grados de parentesco. La matriz PAM120 es considerada una buena matriz de sustitucin para analizar secuencias evolutivamente ms cercanas, mientras que PAM250 es ms apropiada para comparar secuencias ms distantes [26, 27]. Las matrices BLOSUM son calculadas de manera similar pero usando una estrategia diferente para estimar las frecuencias de sustitucin [27, 32]. Los bloques representan alineamientos mltiples de secuencias relacionadas (a diferencia de PAM, que usa secuencias estrechamente relacionadas). Los nmeros asociados a estas matrices indican el valor de corte del porcentaje de identidad que define el grupo. Por lo tanto, las matrices con valores de corte ms bajo (ej. BLOSUM62) admiten una mayor diversidad de secuencias en los grupos y son ptimas para comparar secuencias ms distantes. No obstante, los eventos de mutacin no slo incluyen sustituciones sino tambin inserciones y deleciones, por lo cual tambin se asigna un score a los intervalos vacos o gaps observables en los alineamientos. Una vez definido el score para un alineamiento arbitrario, surge la necesidad de encontrar el alineamiento ptimo entre los muchos alineamientos posibles. Dado que lo ms comn entre secuencias de ADN o protenas es que sean similares en algunos seg-

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mentos y no en toda la extensin de las secuencias involucradas, lo ms frecuente es usar en esta instancia programas basados en el algoritmo de Smith-Waterman que busca ptimos en alineamientos locales de pares de secuencias [35]. No obstante, tratn-

dose de mtodos de programacin dinmica, para los cuales el tiempo de clculo es proporcional al cuadrado del tamao de las secuencias que se comparan [23], son extremadamente lentos para realizar bsquedas exhaustivas en las bases de datos de mayor

Figura 5: Resultado de una bsqueda en BLAST. A) el encabezado muestra el nombre de la secuencia incgnita y el nombre de la base de datos analizada. Como el programa usado fue BLASYx, la secuencia fue traducida en las seis marcos de lectura correspondientes y comparada con la base de datos nr (non redundant}de protenas mantenida por NCBI. B) muestra una representacin grfica de los alineamientos. C) muestra un resumen de los alineamientos mas significativos junto con el score normalizado y el valor E. D) muestra los lineamientos detallando las propiedades

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referencia (GenBank, Swissprot, etc.). En cambio, tanto FASTA como BLAST emplean otro tipo de desarrollo llamado heurstico, que favorecen la velocidad a cambio de la sensibilidad y la selectividad [26]. Ambos programas operan de manera similar pero usando distintas estrategias para localizar las posiciones donde es ms probable que ocurra el mejor alineamiento. FASTA busca cadenas de letras exactamente iguales de un tamao fijo establecido (words). BLAST, en cambio, usa matrices de sustitucin (tomando de base BLOSUM62 para secuencias de aminocidos) para encontrar words que sin ser exactamente iguales muestren el score ms alto, en este nivel de bsqueda ambos algoritmos no admiten gaps. BLAST realiza algunas otras operaciones como filtrar las regiones de baja complejidad (regiones repetitivas), y elimina words con baja probabilidad de producir un score alto. Una vez que se identifican estas regiones de alto score, se aplican algoritmos ms sofisticados de programacin dinmica, ahora s permitiendo la existencia de gaps. En esta segunda etapa BLAST busca segmentos similares a la lista de words establecidos en toda la base de datos y cuando encuentra un alineamiento posible trata de extenderlo hacia ambas direcciones, hasta tanto el score contine incrementndose. Luego BLAST evala si el valor E de los alineamientos obtenidos satisface el umbral seleccionado por el usuario (normalmente entre 0,1-0,001) para finalmente informar la lista de los seleccionados. La Figura 5 muestra un resultado obtenido a partir de BLAST. El encabezado cita la versin del algoritmo empleado y su referencia, el nombre y la longitud de la secuencia analizada y la base de datos que se us como blanco. La segunda parte del informe presenta un resumen de todas las secuencias que produjeron alineamientos significativos junto con un valor de score normalizado y el valor E . La tercera parte muestra los alineamientos detallando los valores de los scores, identidad y valor E obtenidos y la ltima parte del informe muestra los parmetros utilizados en la bsqueda. Para interpretar los resultados obtenidos de la bsqueda de similitud en bases de datos moleculares usando cualquiera de los algoritmos (FASTA, BLAST o SSEARCH), el valor ms representativo es el valor E [26, 35].

Este depende del valor de score, del largo de la secuencia incgnita y del tamao de la base de datos analizada y mide las chances de que el alineamiento obtenido sea solamente causa del azar. As un valor E de 0.001 (que es el valor de corte ms usado par las bsquedas con BLAST) significa que hasta 1 de cada 1000 alineamientos puede haberse dado por azar. Un valor cercano o menor a 1 e-50 es menos frecuente de encontrar, y resulta muy confiable en cuanto a que las secuencias alineadas estn evolutivamente relacionadas, no obstante esta apreciacin exige una confirmacin mediada por un anlisis filogentico. 4.2 Alineamiento mltiple de secuencias Como se mencion ms arriba, el advenimiento de proyectos genmicos a gran escala ha llevado a la acumulacin de un enorme y heterogneo nmero de secuencias depositadas en bases de datos pblicas. El alineamiento mltiple de secuencias juega un papel importante en la biologa molecular actual. Tanto la anotacin (edicin por correccin e interpretacin de hipotticas funciones por homologa) de dichas secuencias como las herramientas de anlisis dependen de alineamientos mltiples adecuados. El objetivo de la aplicacin ha pasado de una simple transferencia de anotacin funcional de una secuencia a otra, a un enfoque genmico ms amplio. El anlisis de familias proteicas, la prediccin de su estructura secundaria, la estimacin de los diferentes tipos de plegamientos as como la deteccin de homlogos entre especies distantes como pasos intermedios en la construccin de rboles filogenticos, se han constituido en los principales objetivos de este tipo de alineamiento [37, 23]. El alineamiento mltiple de secuencias puede ser visto como una generalizacin del alineamiento de pares de secuencias, donde la complejidad de esta aproximacin crece exponencialmente con el nmero de secuencias que intervienen. La posibilidad de resolver el problema por mtodos manuales [38] debe quedar descartada por la enorme complejidad del problema, limitndose su uso a casos con pequeos grupos. Por analoga con la comparacin de pares de secuencias, es

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posible aplicar la misma tcnica de programacin dinmica al caso exhaustivo multidimensional, pero el crecimiento exponencial de la complejidad de mtodo limit su aplicacin prctica [39, 40, 41]. Introdujeron un esquema de acotamiento que utiliza alineamientos de parejas de secuencias para limitar el volumen del espacio N dimensional que se necesita para el alineamiento exhaustivo, resultando en importantes mejoras en la velocidad, que posibilitaron su implementacin en el programa MSA [42] y la aplicacin del mtodo a pequeos grupos de secuencias. Por lo general tampoco es posible alinear ms de 10 secuencias usando el riguroso modelo del programa MSA. De esta forma es fcilmente entendible la proliferacin de mtodos aproximados para conjuntos ms grandes de secuencias. Los programas desarrollados abarcan una amplia gama, desde aquellos que utilizan mtodos progresivos tradicionales [43, 44, 45] a aquellos iterativos y con mayores requerimientos computacionales [40, 46, 47, 48]. Los mtodos iterativos tienden a una optimizacin de la funcin de puntajes. El objetivo buscado es que la funcin de puntaje refleje una funcin biolgica tal que su optimizacin lleve a un alineamiento biolgicamente correcto. El alineamiento mltiple puede dividirse en dos categoras principales: aquellos mtodos de alineamiento de secuencias en toda su extensin (globales) y aquellos mtodos que alinean regiones con alta similitud. Tradicionalmente se ha focalizado en los mtodos globales tales como el mtodo CLUSTAL W, que son aplicables a casos en los que las secuencias comparadas tienen extensiones similares. Sin embargo ms recientemente se ha puesto mayor inters en los mtodos de alineamiento mltiple local para el alineamiento de secuencias derivadas de proyectos genmicos que slo alinean parcialmente [37]. En los mtodos de alineamiento global, la solucin clsica se basa en la formacin de agrupamientos (clusters) de secuencias, los cuales se resuelven progresivamente [48]. Para ello, dada una medida del parecido o semejanza entre dos secuencias, se elige aquel par correspondiente al valor ms alto y se alinean y agrupan entre s para formar

un nico grupo o cluster de secuencias. A partir de este momento este cluster ser tratado como una sola secuencia, y el proceso se repetir hasta tener un solo cluster con todas las secuencias que intervenan en el alineamiento mltiple. Posiblemente, los programas ms difundidos de este tipo sean CLUSTAL V [45] o CLUSTAL W en su ltima versin [49], y PILEUP, el cual utiliza el mtodo heurstico para el clculo de los niveles de semejanza entre las secuencias [50]. La aplicacin de esta estrategia no garantiza resultados ptimos (en una primera etapa evala por coincidencias de residuos, por lo que s utilizar esquemas de puntuacin, aunque podran existir otras soluciones posibles con puntuacin mayor). Sin embargo, la calidad de los alineamientos es bastante aceptable, y permiten alinear algunos pocos cientos de secuencias [51, 52]. Otro algoritmo de comparacin mltiple global progresivo es el POA que no generaliza perfiles sino que emplea grficos parcialmente ordenados partiendo de las secuencias ms similares y va adicionando otras secuencias progresivamente. Este programa permite comparar no slo secuencias relacionadas originadas por mecanismos de delecin, insercin o mutacin sino secuencias ms distantes [53]. Los algoritmos de comparacin mltiple local, como el DIALIGN, alinean segmentos completos en vez de residuos simples. Inicialmente realiza alineamientos de pares, seleccionando luego las regiones sin intervalos no apareados que aparecen como diagonales de una matriz, para progresar en una comparacin iterativa [46]. Otros programas como el T-Coffee combinan alineamientos mltiples globales y locales, realizando primero una comparacin de a pares global utilizando el algoritmo CLUSTAL W y luego una comparacin local utilizando FASTA [47]. Tanto el DIALIGN como el T-Coffee arrojan mejores resultados con grupos de secuencias ms diversas pero tienen altos requerimientos computacionales. Con la idea de mejorar la sensibilidad de estos resultados, tambin se han propuesto numerosas posibilidades hbridas, tales como la representada por el programa MACAW [54] basado tanto en informacin estadstica sobre alineamientos de segmentos de las secuencias como en la posibilidad de interaccin con el usuario. As mismo, se ha

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propuesto la utilizacin de matrices de consenso [55] para describir la preferencia de cada aminocido, o de cada delecin, para situarse en el alineamiento. Tambin se ha recurrido a informacin sobre las estructuras secundarias [56, 57], o a la localizacin de motivos y/o dominios conservados en las secuencias [58], o a la utilizacin de las caractersticas fsico-qumicas de los aminocidos en cada posicin [59]. 5 Bsqueda por perfiles para localizar homlogos remotos Existe una tercera generacin de mtodos ms elaborados para realizar bsquedas de similitud con mayor sensibilidad [60]. Los ms exitosos son PSI-BLAST y los mtodos basados en los modelos ocultos de Markov (HMM, [61]). El primero es un mtodo extremadamente sensible para detectar similitudes dbiles basndose en un proceso iterativo mediante el cual el algoritmo de BLAST puede ser generalizado para utilizar un perfil en vez de una secuencia [5], se recomienda usar este algoritmo cuando no se encuentran resultados significativos a partir de una bsqueda estndar a travs de BLASTP. El proceso de PSI-BLAST comienza con una secuencia provista por el usuario, la cual es alineada mediante el algoritmo BLASTP contra una base de datos seleccionada. A partir de los alineamientos ms significativos, el programa usa de base aquellos alineamientos que presentan un valor E menor que 0.005 , construye una matriz de scores especficos de posicin o perfil (position-specific scoring matrix, PSSM o profile). En la segunda ronda, la versin adaptada del algoritmo BLAST usa la matriz como entrada para realizar una bsqueda ms refinada. De una manera similar, HMMs genera perfiles a partir de alineamientos mltiples de secuencias, tales como los obtenidos usando Clustal W o X [49, 62] y calcula scores especficos de posicin que guarda en un archivo de formato compatible que luego se usa para analizar una base de datos. Tanto PSI-BLAST como HMMs facilitan el desarrollo de bases de datos secundarias como las bases de datos de dominios de protenas [63, 64] que permiten el anlisis de la

arquitectura modular de las protenas y sus unidades funcionales. Hoy en da se prefiere usar estas bases de datos para predecir o confirmar la funcin de genes o protenas, dado que resultan ms confiables que las bases de datos primarias que reciben grandes cantidades de informacin regularmente lo cual hace difcil controlar que las anotaciones de los datos sean correctas. 6 Prediccin de Genes La expansin de los proyectos genmicos en los ltimos aos ha sido tal que al da de hoy existen 717 iniciativas de este tipo en el mundo, 140 de los cuales corresponden a genomas completos, entre ellos el genoma humano, el genoma de Arabidopsis thaliana [18], Oryza sativa variedad indica [19] y Oryza sativa variedad japonica [20], 235 corresponden a organismos eucariotas, 38 de los cuales son genomas vegetales y 342 corresponden a organismos procariotas (GOLD [65]). La gran cantidad de datos generados por estos, y otros proyectos de anlisis genmico parcial fuerzan las necesidades de disponer de las herramientas adecuadas para darle interpretacin biolgica a estos datos. Una de las etapas ms crticas de este proceso es la de identificar todos lo genes y sus protenas asociadas. La manera ms directa de abordar esta tarea es mediante mtodos comparativos como los descriptos anteriormente basados en encontrar una secuencia altamente similar a la secuencia incgnita en otro organismo usando generalmente bases de datos de protenas. Sin embargo, slo un 50-70% de los genes nuevos suelen encontrar homologa con genes o protenas conocidas [66]. La caracterizacin del resto de las secuencias requiere la aplicacin de mtodos predictivos, los mismos tratan de identificar secuencias codificantes a partir de patrones caractersticos, usualmente secuencias cortas sobre el ADN genmico que representan sitios claves para procesos como la transcripcin (sitios de unin a factores de transcripcin, cajas TATA), el procesamiento postranscripcional del ARN (sitios de splicing) y la traduccin (codones de iniciacin y terminacin) [67]. Existen muchos programas para predecir genes, la mayora de los cuales son accesibles desde la Web, el

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sitio Computational Gene Recognition mantenido por W Li [68] ofrece una lista completa y actualizada de publicaciones y software dedicado a este tema. Sin embargo, aunque los recursos son vastos y los algoritmos de prediccin han ido avanzando junto con los desarrollos en informtica y el avance de los conocimientos, cimentados en una mayor disponibilidad de informacin biolgica caracterizada, actualmente no existen mtodos precisos para identificar estas seales en las secuencias moleculares. Este problema se acenta cuando se trata de predecir genes eucariticos que tienen una organizacin y una estructura ms compleja que la de los genes de organismos procariticos. En genomas complejos los genes no estn dispuestos en forma continua, estn separados por distancias intergnicas enormes y a su vez estn estructurados en fragmentos codificantes (exones) separados por regiones no codificantes (intrones), los cuales adems varan en tamao y nmero dentro y, ms an, entre especies. Algunos programas, adems de reconocer y modelar las seales de patrones especficos, tratan de incorporar un modelo estadstico de las propiedades que definen de manera ms global exones, intrones y regiones intergnicas, aprovechando los sesgos de composicin de bases (en regiones codificantes es ms alto el porcentaje de G+C) [69], el uso de codones, la frecuencia de hexmeros o dicodones [70, 71, 72, 73], la periodicidad de aparicin de bases [74], etc. Sin embargo, todas estas consideraciones no son suficientes para reconocer con exactitud exones e intrones cuando stos son cortos. En la mayora de los casos, los programas ms promisorios para reconocer genes en la especie bajo estudio deben ser analizados particularmente, a partir de lo cual muchos son redefinidos o diseados especficamente [67]. Dado que los algoritmos usan distintas medidas y scores para predecir regiones codificantes, lo recomendable es combinar el resultado de algunos o varios de ellos para construir el mejor modelo, en este sentido existen distintas herramientas de acceso libre como RiceGAAS [75, 76], y GenMachine [77, 78], GenMark [79], entre muchos otros.

7 Conclusiones La biologa moderna ha generado una explosin de informacin en el rea de secuenciacin de genomas completos, la protemica, la transcriptmica, la genmica funcional, la interactmica, la metabolmica, etc. Todo esto genera la necesidad constante de actualizar esta informacin y aplicarla en beneficio de los proyectos particulares. Para ello, es necesario entender cmo se genera esa informacin, cun confiable es, cmo se maneja y cmo se analiza. En este proceso juega un papel clave el desarrollo de la bioinformtica, que se define como un rea de fusin entre la biologa, la matemtica avanzada y la computacin cuyo objetivo discurre en observar la biologa en trminos de macromolculas, con el fin de ordenar y entender la informacin contenida en las mismas a partir de recursos de la informtica. En este sentido, la bioinformtica enfoca tres reas bsicas, la primera tiene que ver con el desarrollo de un sistema simple de organizacin de los datos biolgicos de manera de favorecer el acceso y el ingreso de nuevas entradas a las bases de datos compartidas. La segunda rea tiene que ver con el desarrollo de recursos y herramientas para analizar la informacin coleccionada en las bases de datos, lo cual implica conocimientos slidos en las teoras computacionales y biolgicas.El tercer rea, implica el uso de estas herramientas para analizar los datos e interpretar los resultados de manera biolgicamente significativa. En este captulo hemos intentado dar una visin amplia de la bioinformtica focalizando dos elementos fundamentales como son las secuencias y los alineamientos, familiarizando a los lectores con los recursos bsicos disponibles para el acceso a la informacin y su anlisis, e instalando el concepto de que existen diferentes caminos para resolver un problema. Sin dejar de tener en cuenta que la mayora de los mtodos computacionales se basan en conocimientos limitados sobre genes, protenas y caminos biosintticos por lo cual todos los resultados obtenidos a travs de estos medios exigen una verificacin experimental. En su defecto, es recomendable explorar dis-

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tintos programas que aborden el problema desde perspectivas diferentes. En este sentido, tambin es aconsejable no confiar en los parmetros de base (defaults) de los programas sino experimentar valores diferentes (tales como valor E, enmascarado de regiones de baja complejidad, matriz de score, etc.) para lo cual es crucial leer la documentacin asociada a los programas o bases de datos usadas. 8 Lecturas Recomendadas
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PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

PARTE VIII Aplicaciones

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ESCANDN, Alejandro S.

VIII.-Captulo 1
Biotecnologa en el Cultivo de Especies Ornamentales
Escandn, Alejandro S.

2 El cultivo de tejidos en ornamentales Una de las tcnicas biotecnolgicas que se emplean en ornamentales es el cultivo de tejidos. Esta tcnica no slo permite la produccin masal de plantas, sino que tambin posibilita el estudio y caracterizacin de la biologa del desarrollo de las mismas. Dependiendo del objetivo planteado es posible clonar individuos utilizando cultivo de pices o meristemas, o bien buscar aumentar la variabilidad gentica por medio del cultivo de callos, suspensiones celulares o protoplastos. La tcnica de micropropagacin (Fig.1) es una excelente herramienta que ha sido am-

1 Introduccin

La industria florcola es de una importancia ms que relevante a escala mundial, ya que representa un negocio de alrededor de 30.000 millones de dlares. Tradicionalmente se ha empleado el mejoramiento clsico para obtener variedades exitosas que satisfagan las demandas de un mercado vido de novedades, que busca nuevas caractersticas en cuanto a colores, formas, aromas, etc. Sin embargo, las tendencias actuales hacia la mejora ecolgica de los cultivos y la necesidad de incorporar caracteres tales como resistencia a herbicidas, insectos, enfermedades, mayor vida en postcosecha, modificar la arquitectura de las flores, etc., ha conducido a la industria de la floricultura a adoptar las nuevas biotcnicas. El presente captulo tiene como objetivo brindar un panorama sobre la situacin actual de la Biotecnologa en relacin al cultivo de plantas ornamentales. No se profundi- Figura 1. Cultivo de tejidos de Santa Rita. A: Desarrollo de la yema principal y de zar en los detalles de las brotes subsidiarios en la base de la misma que sern cultivados in vitro. B: Brotes subsidiarios aislados. C: La flecha seala la yema principal, los restantes son tcnicas involucradas, que brotes subsidiarios cultivados en forma aislada. D: Estado previo a la transferencia ya han sido tratadas en de los brotes al medio de enraizamiento. E: Plantas ex vitro enraizando en otros captulos de este vo- sustrado artificial. F: Plantas ex vitro floreciendo en condiciones de invernculo. Modificado de Escandn et al. RIA 32 (1):11-122. Abril 2003. lumen.

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pliamente utilizada para la propagacin a gran escala de especies ornamentales, ya que no slo permite la obtencin de miles de individuos a partir de un genotipo elite seleccionado, sino que tambin permite la multiplicacin de plantas raras o en peligro de extincin, resguardando la estabilidad gentica de las mismas. Algunos gneros y especies de plantas que se pueden cultivar in vitro a partir de diferentes explantos son: - Cultivo de meristemas: Ghypsophyla, Chrysantemum, Maranata sp., Gladiolus, Iris sp., Pelargonium, Saintpaulia spp. - Apices: Diphaenbachia , Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp., Rosa L. , Iris sp. - Yemas o segmentos nodales: Dianthus, Bignoniaceae, Nierembergia, Jacaranda mimosifolia, Bougainvillea, Blandfordia sp., Anthurium sp. Bromeliaceas, Maranta sp., Campanula sp., Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp., Mediocactus coccineus, Zinnia elegans, Rosa L., Gardenia, Chrysantemum, Gladiolus, Impatiens, Iris sp. , Saintpaulia spp. - Segmentos de mdula: Chrysantemum, Orchidea, Saintpaulia spp. - Pecolos: Rhododendron sp., Anthurium sp., Gerbera sp., Chrysantemum. - Discos de hojas: Rhododendron sp., Bromeliaceas. Begonia sp., Gardenia. Chrysantemum, Saintpaulia spp. - Lmina: Saintpaulia spp. - Escamas: Lilium - Bulbos o Segmentos de bulbos: Sego lily, Narcissus - Rizomas: Cymbidium - Cotiledones: Zinnia elegans. - Semillas: Cattleya sp., Mammillaria sp., Orchidea, Saintpaulia spp. - Embriones maduros: Alstroemeria sp., Zinnia elegans, Impatiens , Iris sp. - Embriones inmaduros: Alstroemeria sp., Orchidea spp. - Secciones de flores: Iris sp. - Anteras: Saintpaulia spp. - Segmentos de ptalos: Chrysantemum. - Segmentos de inflorescencia: Chrysantemum, Saintpaulia spp.. - Captulos: Gerbera sp. - Ovulos: Impatiens

- Callos: Chrysantemum, Iris sp. - Protoplastos: Chrysantemum. - A partir de plntulas in vitro : Bromeliaceae, Gerbera sp., Cyclamen persicum, Gardenia, Scoparia sp. La lista precedente es apenas una muestra de la gran diversidad de explantos que se utilizan para la multiplicacin in vitro de plantas y, como tal, est muy lejos de abarcar el total de las especies ornamentales que se multiplican por este mtodo. Adems de la micropropagacin, la posibilidad de obtener plantas libres de virus por medio del cultivo de meristemas tambin ha sido explotada en ornamentales. Hace ms de 50 aos Morel y Martn informaron la regeneracin de plantas de dalia libres de virus por escisin y cultivo del domo meristemtico de pices de plantas infectadas. Este descubrimiento dio un gran impulso al cultivo de tipo intensivo en general. El cultivo de meristemas es uno de los mtodos ms eficaces para la eliminacin de virus, ms an si se lo combina con termoterapia y/o mtodos qumicos; es de gran aplicacin en el campo de los cultivos intensivos tanto ornamentales como hortcolas. Como la mayora de los cultivos ornamentales se multiplican asexualmente, estas enfermedades virales suelen ser un problema importante. La eleccin errnea de un material, por error o desconocimiento, provocara la diseminacin de estas enfermedades, con las consecuentes prdidas econmicas Gerbera representa un claro ejemplo de la necesidad de la aplicacin de estas tcnicas en la industria florcola. En Europa la demanda anual del mercado de plantas de este gnero oscila entre 15 y 20 millones de unidades. Con el mtodo convencional (semillas o divisin de la corona sobre sustrato artificial e inerte) se logra una tasa de multiplicacin de 30 plantas por ao. Por otro lado, se hace necesario eliminar de los cultivos de esta especie los virus que los afectan normalmente, entre ellos el del mosaico del coliflor (CMV). Si bien existe una dependencia del genotipo, por medio de la multiplicacin de yemas apicales in vitro es posible obtener una tasa de multiplicacin de hasta 300 yemas por pice cultivado en 90 das, libres de virus. En general, con todos los genotipos,

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estas tcnicas de produccin superaron largamente los rendimientos del mtodo convencional, por lo que fueron adoptadas como mtodo de rutina para la multiplicacin comercial de este gnero. El cultivo in vitro tambin puede ser fuente de variabilidad gentica. La produccin de plntulas por regeneracin a partir de callos, suspensiones celulares o protoplastos, puede dar origen a individuos que presentan algn rasgo diferente respecto de la planta madre. Esto tambin puede lograrse utilizando mutgenos durante el cultivo in vitro asociados con una presin de seleccin conferida por factores tales como pH, salinidad, toxinas y baja temperatura. Las plantas regeneradas luego de estos tratamientos pueden mostrar caractersticas que difcilmente se puedan obtener por otra va. La induccin de variantes somaclonales tiene especial significado en la floricultura debido a la constante bsqueda de nuevas variedades, seleccionndose las variantes prometedoras y estables e incorporndolas a los programas de mejoramiento. En la actualidad se conoce un importante nmero de variantes en ornamentales. Se han obtenido individuos con diferencias en la forma, el color y el tamao de la flor (en Chrysantemum, Zinnia, Geranium y Saintpaulia). En Chrysantemum, se han obtenido individuos con resistencia al estrs salino y con cambios interesantes en la forma de las hojas. Otro ejemplo de variacin somaclonal es el caso de Zinnia. Los somaclones en este gnero se obtuvieron a travs del desarrollo de yemas adventicias a partir de cotiledones cultivados con diferentes concentraciones de tidiazuron (TDZ). Este fue un avance importante para la especie Z. marylindica, que es un hbrido estril. A partir de este tratamiento se recuper una gran cantidad de variantes, plantas con diferentes tamaos, hbitos de floracin, color de ptalos y, lo que es ms interesante, en algunos casos se restaur la fertilidad. Aquellas variantes cuyos nuevos caracteres mostraron ser heredables se seleccionaron para incorporar en el programa de mejoramiento. Asimismo, la variacin somaclonal tambin se ha utilizado a fin de seleccionar genotipos resistentes a enfermedades fngicas en el gnero Rosa, lo mismo que la

fusin de protoplastos. En este caso se obtuvieron yemas a partir de callos originados de protoplastos interespecficos fusionados que haban sido pretratados con antimetabolitos como iodoacetato o rodamina-6G o, alternativamente, con rayos X. La obtencin de plantas completas y frtiles a partir de estos materiales hace a esta estrategia muy promisoria para incorporar nuevos caracteres. Una tcnica tradicional para la obtencin de mutantes in vitro que tambin se utiliza en especies ornamentales es la aplicacin de inductores de poliploida, como la colchicina y los herbicidas orizalina y trifluralina, que ha sido aplicada en Rhododendron y Lilium. Esta tcnica se est utilizando en el Centro Tecnolgico en Flori, Fruti y Horticultura (CETEFFHO) con el objetivo de obtener cruzamientos interespecficos viables en especies de los gneros Calibrachoa y Scoparia. Para ello, una vez efectuado el cruzamiento, se duplican los cromosomas del hbrido a fin de que sea frtil. Las plantas de Calibrachoa que sobrevivieron al tratamiento demostraron ser quimeras diploides/tetraploides. Se multiplicaron las tetraploides y se espera la floracin a fin de establecer la posibilidad de cruzarlos con otras especies del gnero. 3 Marcadores moleculares para el mejoramiento y la seleccin de ornamentales Los marcadores moleculares como herramienta para la caracterizacin y diferenciacin entre genotipos fueron rpidamente utilizados por genetistas y mejoradores de plantas. Su neutralidad en relacin al proceso de seleccin, su poder de resolucin y la celeridad con que se obtiene la informacin, son algunas de las ventajas que ofrece esta herramienta. A pesar de que diferentes clases de marcadores moleculares fueron probados en ornamentales, los AFLPs y los microsatlites son los ms frecuentemente utilizados por su alta reproducibilidad y la gran cantidad de informacin que brindan. Estos marcadores moleculares aplicados a la diferenciacin de genotipos son un arma muy poderosa para la proteccin de los derechos de los mejoradores y productores. Para detectar la

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propagacin fraudulenta de un cultivar el mtodo tradicional se basa en el anlisis y la comparacin de los caracteres fenotpicos de plantas crecidas y en perodo de floracin. Esta estrategia tiene la desventaja de que requiere mucho tiempo y depende de factores ambientales. Esto se soluciona utilizando marcadores moleculares de manera ms rpida y precisa. La genmica tambin est realizando aportes en el rea de las plantas ornamentales. La rosa, que como flor de corte es uno de los cultivos ornamentales ms importantes del mundo, es un ejemplo interesante. A mediados de la dcada de 1990, se inici un proyecto conjunto entre las Universidades de Clemson y Texas a fin de obtener el mapa gentico de esta especie. El mismo tiene como objetivos, a largo plazo, ubicar los genes involucrados en la produccin de la fragancia y los de la resistencia a la enfermedad de la mancha negra, causada por el hongo Diplocarpon rosae. Esta enfermedad es la de mayor incidencia en el produccin de rosas. Se caracteriza por la presencia en las hojas de manchas negras de contorno irregular, defoliacin, prdida del vigor de la planta, y disminucin en la produccin de flores. La enfermedad se controla con aplicaciones de fungicidas. Un hecho de importancia es que se han detectado variedades de rosas que manifiestan resistencia a la enfermedad y se estn buscando los genes que la confieren. Con este fin los investigadores texanos estn analizando la F2 de un cruzamiento seleccionado entre una variedad susceptible y una resistente, donde la progenie segreg adems para varios caracteres de inters para la industria florcola, como color de la flor (rosa vs blanco), nmero de ptalos (5 vs. 10 o ms), presencia o ausencia de espinas en el tallo, floracin una vez al ao o siempre florecida. A partir del anlisis de esta F2 se est construyendo un mapa de alta densidad con distintos marcadores moleculares, entre los que se encuentran los AFLPs. Una vez construdo este mapa, se proceder al anlisis de los perfiles detectados a fin de establecer la asociacin entre los marcadores utilizados y los caracteres de inters. Esto permitira llevar a cabo en el gnero Rosa un programa de mejoramiento asistido por marca-

dores moleculares. Como el resto de las tcnicas biotecnolgicas, la de marcadores moleculares est siendo intensamente aplicada en especies ornamentales, sobre todo por la relevancia
Tabla 1: Aplicacin de marcadores moleculares para determinar la distancia gentica (DG), identificacin varietal (I.V) y anlisis gentico (A.G), en algunos gneros ornamentales.
Gnero Alstroemeria Calladium Cephalotaxus Cymbidium Dahlia Dedrathema Dianthus Euphorbia Geranium Gerbera Heliconia Jacaranda Junipers Lilium Osteospermum Ozothamnus Pelargonium Petunia Rhododendron Rosa Scaevola Syringa Viola X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X I. V. X X X X X X X X X X X X D. G. X A. G. X

que estos estn adquiriendo en la verificacin de los criterios de distinguibilidad, estabilidad y uniformidad de las nuevas variedades que ao a ao ingresan al mercado. En la Tabla 1 se mencionan los cultivos ornamentales en los cuales se han aplicado marcadores moleculares. 4 Mejorando la ecologa de los cultivos y modificando las formas y los colores de las flores La tecnologa gnica es otra de las estra-

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tegias que se ha aplicado exitosamente en el mejoramiento y se ha difundido en forma sostenida entre los principales cultivos ornamentales. Varios factores han contribudo a este importante desarrollo, entre los que se puede considerar un profundo conocimiento de la bioqumica de las plantas (sobre todo en lo que hace a la sntesis de pigmentos), un notable manejo del cultivo de tejidos en las especies de inters, el alto valor agregado que implica la aplicacin de la tcnica, adems de las ventajas adicionales que se pueden lograr en la incorporacin de un caracter determinado (por ejemplo: ahorro de insumos, incremento en el rendimiento, etc.). Asimismo, y desde un punto de vista totalmente ligado el mercado, los organismos genticamente modificados (OGMs) ornamentales, no generan el mismo tenor de controversias que provocan los OGMs ligados al consumo alimentario humano como los cereales y las oleaginosas. Para el mejoramiento de ornamentales por transgnesis existe un considerable inters en la incorporacin de caractersticas tales como: resistencia a insectos, a enfermedades fngicas y virales, tolerancia a herbicidas, androesterilidad, etc., que son los de aplicacin en la mayora de los cultivos. A estas se suman los caracteres especficos para la floricultura, como son la modificacin del color y la forma de las flores, el incremento de la vida post cosecha, la modificacin de la fragancia, el control de la floracin y el mejoramiento de la eficiencia de enraizamiento. En el tema donde ms se ha avanzado es en la modificacin de los pigmentos de los ptalos. El color de las flores se debe a tres tipos de pigmentos. De los colores amarillo y naranja son responsables los carotenoides. Del rojo y del rosa son responsables los flavonoides (cianidina y pelargonidina, flavonoides, se encuentran en las flores rosas y rojas respectivamente). El color azul se debe a un pigmento denominado delfinidina. La modificacin del color de las flores se plante como objetivo por los grupos de mejoradores de ornamentales. El primer informe acerca de la modificacin de los colores de flores por ingeniera gentica lo efectu en 1987 el Instituto Max Planck de Colonia, Alemania. Desde mediados de la dcada que comenz en 1990 se sucedieron una

serie de publicaciones acerca de la alteracin de la pigmentacin de flores de crisantemo por aplicacin de la tecnologa antisentido para el gen de la chalcona sintetasa (chs). En clavel se utiliz la secuencia antisentido de la flavonona 3-hidroxilasa (Fht), para bloquear la va metablica de las antocianinas. De esta manera se logr la modificacin del color original y se obtuvieron nuevos genotipos de la variedad utilizada en el ensayo. Asimismo, se encontr que los genotipos transgnicos que tenan reprimida la expresin de Fht resultaron tener mucho ms fragancia que los controles. Estudios de cromatografa gaseosa mostraron incrementos de 10 a 100 veces en los niveles de los derivados del cido benzoico, por lo que a partir de la alteracin de la expresin de un transgen, se logr la modificacin de dos caracteres. La introduccin de la secuencia en sentido del gen de la chalcona sintetasa en petunia permiti redireccionar la va metablica de los flavonoides hacia la produccin de chalconas, lo que deriv en la obtencin de flores amarillas en el gnero por acumulacin de pigmentos como chalconas, auronas y algunos flavonoles en los ptalos. El color azul no es muy frecuente en las flores. Slo en petunia el azul tiene la intensidad que los mejoradores pretenden. Este color depende de tres factores: la sntesis de un pigmento denominado delfinidina (3,5hidroxiantocianina), la presencia de copigmentos como flavonas y un pH alcalino en las vacuolas de las clulas de los ptalos. La obtencin de flores dentro de la gama del azul se constituy un desafo para las semilleros. Una idea de la relevancia de este tema lo indica el hecho que en el ao 1986 se fund en Melbourne, Australia, la compaa Florigene cuyo principal objetivo era el desarrollo de claveles, crisantemos y rosas de color azul (las tres especies abarcan el 50% del mercado mundial de flores de corte). Esta empresa aisl el gen que codifica para la enzima clave para la biosntesis de delfidina, la flavonoide 3',5'-hidroxilasa, el Blue Gene. A mediados de la dcada que comenz en 1990 se obtuvieron claveles azules. Otro gen involucrado en la produccin de delfinidina fue identificado en 1999. Este gen codifica para un citocromo del tipo b5. La expresin

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del mismo incrementa la produccin de la antocianina 3,5 sustituda. El silenciamiento de este gen en plantas de petunia redunda en un 60% menos de acumulacin de delfinidina en relacin a plantas no tratadas. En la actualidad existen en el mercado siete variedades de claveles cuya pigmentacin fue modificada por ingeniera gentica por incorporacin del Blue Gene. En cuanto a la obtencin de rosas azules, un inconveniente a resolver es que la va metablica de produccin de pigmentos en estas plantas es muy diferentes a la petunia, ya que la rosa es deficiente en la enzima flavonoide 3',5' hidroxilasa. En consecuencia no puede sintetizar los pigmentos adecuados. Otro inconveniente es el pH vacuolar, que en las rosas es cido y bajo estas condiciones la delfidina se torna de color rosa. Los datos indican que el microambiente de las clulas del ptalo de la rosa no sera el ms propicio para la produccin de pigmentos azules va flavonoides, por lo que esta estrategia no sera la ms adecuada para la produccin de una rosa de color azul. En la actualidad Florigene est probando el citocromo P450 (responsable de la detoxificacin heptica en mamferos), como alternativa para la obtencin de rosas de color azul. Experimentos efectuados en la Universidad de Queensland demostraron que bacterias transformadas con el gen que codifica para el P450 son capaces de generar un color azul intenso usando como sustrato compuestos con grupos indlicos, que se encuentran normalmente presentes en los vegetales. Si bien presenta la ventaja de que se trata de una va metablica directa (de un solo paso), habra que determinar si los productos de la conversin de grupos indol no

presentan fitotoxicidad. Todava no se han obtenido resultados concluyentes con la aplicacin de esta estrategia para la obtencin de rosas azules. Otro importante avance tecnolgico, desarrollado y patentado por la misma empresa, es la produccin de claveles larga vida (long vessel life, LVL) por bloqueo de la sntesis de etileno. La va metablica de produccin de esta hormona es bien conocida, la enzima ACC (cido 1 amino ciclo propano-1carboxlico) sintetasa, convierte a la Sadenosilmetionina en ACC que, por accin de la ACC oxidasa se transforma en etileno. Aplicando tecnologa antisentido se logr suprimir la expresin de ambas enzimas, por lo que se bloque la produccin de etileno en los claveles transgnicos. La falta de produccin de etileno impide el deterioro prematuro de las flores una vez cortadas (principalmente, el enrollamiento de los ptalos), retrasando su envejecimiento. La tecnologa ofrece una importante ventaja tanto en lo comercial como en lo ecolgico, ya que los productores podrn abandonar el uso de las sales de plata, muy contaminantes, para prevenir la produccin de etileno en el perodo post-cosecha. En otros laboratorios se ha modificado la forma de las flores de crisantemo por la introduccin del gen rol C de Agrobacterium rhizogenes, obtenindose plantas de menor tamao, flores de menor dimetro y ptalos y hojas modificados. En clavel la incorporacin de este transgn produjo una serie de modificaciones morfolgicas muy ventajosas como ser disminucin de la dominancia apical, mayor capacidad de enraizamiento, mejor incorporacin de metabolitos y mayor produccin de varas (se increment tres veces

Tabla 2: Algunos avances logrados en el mejoramiento de ornamentales por ingeniera gentica

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en relacin al producto no transgnico). En trminos prcticos estas modificaciones implican una sensible mejora en el rendimiento del cultivo. La Tabla 2 resume algunos avances logrados en el mejoramiento de ornamentales por ingeniera gentica. 5 La situacin en la Argentina

La revisin de los libros de resmenes del Primer Congreso Argentino de Floricultura y del V Simposio de Redbio Argentina 2002 muestra que en nuestro pas son muy pocos los laboratorios que trabajan en biotecnologa de ornamentales. La lista alcanza a 5 instituciones trabajando en el rea. En el Dpto. de Agronoma de la Universidad Nacional del Sur y en el Centro de Recursos Naturales Renovables de la Zona A B Semirida (CERZOS) se trabaja en multiplicacin in vitro de Lilium. En el laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del Noreste (IBONE) y Universidad Nacional del Noreste (UNNE) se multiplican orqudeas in vitro. Este Instituto en colaboracin con el Dpto. de Agronoma de la UniversiC D dad Nacional del Sur estudia la variabilidad gentica Figura 2. A) Individuos tetraploides del gnero Scoparia (izq.) obtenidos a en la micropropagacin de partir de un diploide (der.) tratado con colchicina en condiciones in vitro, comparados con el correspondiente control. B). Comparacin entre las flores paraso (Melia azaderach). de ambas plantas, tetraploide (izq.) y control (der.). C) Hojas de la planta Sobre esta misma especie tetraploide (arr.) y de la planta control (ab.). D) Planta tetraploide florecida. en el IBONE se efectan estudios de crioconservacin. En el Laboratorio de Propagacin y Pro- en la Argentina se est trabajando en flora duccin Vegetal del Centro Austral de Inves- nativa de importancia ornamental, entre tigaciones Cientficas de Usuahia se trabaja otros con los gneros: Tabebuia, Jacaranda, Tecoma, Nierembergia, Lilium, Calibrachoa, en Berberis sp. En el Centro de Produccin Vegetal Bougainvillea y Scoparia (Fig.2). Adems de importantes avances en el (CEPRoVe) de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de La Plata se establecimiento in vitro de Tabebuia y est trabajando en la micropropagacin de Tecoma, se han logrado interesantes resultados en la micropropagacin de J. Pelargonium.

En la Ctedra de Produccin Vegetal de la Facultad de Agronoma de la UBA se han realizado experiencias en la micropropagacin de Pelargonium , Lupinus , Jasminum mensyi y Gerbera. En el CETEFFHO, futuro Instituto de Floricultura de INTA-Castelar, se trabaja desde hace algunos aos en micropropagacin de especies ornamentales como, entre otras, alstroemeria, clavel, rosa, orqudeas, Poinsetia, Ghypsophylla, Gerbera, etc. Dentro del mismo Instituto y en el marco del proyecto INTA-JICA: Desarrollo de la Floricultura

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mimosifolia, Bougainvillea sp, Lilium sp, Calibrachoa sp y Scoparia spp. En algunos casos con el objetivo de micropropagacin en s misma, y en otros, para aplicar mutagnesis in vitro. Otra de las reas en las que se trabaja en el CETEFFHO es la puesta a punto de tcnicas de marcadores moleculares para la identificacin, va fingerprinting (fenotipeado), de los individuos que se obtienen por mejoramiento. Se han obtenido resultados promisorios en la aplicacin de microsatlites anclados en la caracterizacin molecular de clones de Jacarand, siendo la primera vez que se informa un resultado de esta ndole para el gnero. De esta revisin se desprende que en nuestro pas la herramienta biotecnolgica de aplicacin en cultivos de inters ornamental es la multiplicacin in vitro. Si bien a partir del desarrollo del proyecto INTA-JICA Desarrollo de la Floricultura en la Argentina se dieron pasos sustanciales en la formacin de recursos humanos, nuestro pas debera potenciar el desarrollo y aplicacin de las nuevas tecnologas en el rea del mejoramiento de cultivos ornamentales. Estos dos aspectos son fundamentales para que el pas pueda intervenir en el mercado mundial de ornamentales, aprovechando los inmensos e interesante recursos naturales de los cuales dispone. Se espera que la incorporacin de nuevas variedades al mercado incidir en forma positiva sobre el desarrollo de la industria local y permitir el ingreso de la Argentina en el mercado florcola mundial como generador de germoplasma mejorado. 6 Perspectivas El advenimiento de la genmica y protemica y el desarrollo de la bioinformtica han aportado herramientas de utilidad que podran aplicarse en el mejoramiento de especies ornamentales. Los estudios sobre el genoma de Arabidopsis facilitarn la comprensin de la estructura y funcin del genoma de los cultivos ornamentales, en especial a travs de la identificacin de genes involucrados en estrs abitico, sntesis de hormonas, resistencia a patgenos, etc. Tambin ser sustancial el aporte que se haga acerca de los mecanis-

mos que intervienen en el establecimiento de la arquitectura de la planta, en el funcionamiento de los meristemas (en especial de las flores), o en los componentes de la resistencia a enfermedades. La identificacin y el aislamiento de estos genes posibilitar su incorporacin, va transgnesis, a los cultivos ornamentales a fin de lograr un mejoramiento sustancial que involucre todos los aspectos del cultivo. Los avances efectuados en fotobiologa y en el conocimiento de los ritmos circadianos vegetales permitirn ajustar finamente el control de procesos tan importantes como la floracin. Tambin se abren nuevas y muy interesantes perspectivas para la creacin, seleccin y uso de la variabilidad gentica. 7 Lecturas Recomendadas
ARNAU, G.; LALLEMAND, J.; BOURGOIN, M. Are AFLP markers the best alternative for cultivar identification? (abstract). International Symposium on Molecular Markers for characterizing genotypes and identifying cultivars in horticulture. Acta Hort. 546. 37-38. ARUS, P. 2000. Molecular Markers for ornamental breeding. Proc. 19th Int. I Symposium Improvement Ornamental Plants. Ed. Cadic, A. Acta Hort. 508: 91-98. ISHS. BAJAJ, Y. P. S.; SIDHU, M. M. S.; GILL, A. P. S. 1992. Micropropagation of Chrysantemum. En: Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol.: 20. Hightech and Micropropagation IV. Captulo V, (Ed. Bajaj, Y. P. S. Springer.). BIJMAN, J. 1994. Flower Colour is Major Target in Genetic Engineering of Cut Flowers. Biotec. & Development Monitor. Nro 20, p10. BRACALENTI, P.; SOTO, S.; KOBAYASHI, N.; ESCANDN, A. 2002. Multiplicacin in vit ro de S. montevidiensis, una herbcea con potencial ornamental como planta en maceta o para borduras. Libro de Resmenes del I Congreso Argentino de Floricultura y Plantas Ornamentales. Buenos Aires. CALLAWAY, M. B.; CALLAWAY, D. J. 2000. Genetic and its applications. En: Breeding Ornamental Plants. Capitulo 1. Ed. por Callaway, D. J.; Callaway, M. B. Timber Press Portland, Oregon, USA. CURTIS, H.; BARNES, S. 2000. DNA recombinante, las herramientas del oficio. En Biologa (Ed. por Schnek, A.; Flores, G.) Editorial Mdica Panamericana, Bs. As. Argentina. DE JONG, J. 2000. Genetic engineering for resistance, quality and plant habit. XIX International Symposium Improvement Ornamental Plants. Ed. Cadic, A. Acta Hort.

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VALVERDE, F.; MOURADOV, A.; SOPPE, W.; RAVENSCROFT, D.; SAMACH, A. y COUPLAND, G. 2004. Photoreceptor regulation of CONSTANS protein in photoperiodic flowering. Science, vo, 303, 13 February pags.: 1.003-1006.

8 Sitios de la web sugeridos


-Making a Gene Map for Roses. Rajapakse, S y Ballard, E.

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http://aggie-horticulturae.tamu.edu/rose/rmaping.htm -My love is like a blue, rose blue. The scientist. Nasto, B. http://www.biomedcentral.com/news/20030213/06 - Ornamental Plant Biotechnology http://sbc.ucdavis.edu/Outreach/lecture/ ornamental_files - Plant Biotechnology Applied To Horticultural Crops. Boxus, P. World Conference on Horticultural Research. Junio, 1998, Roma ,Italia. http://www.agrsci.unibo.it - Proceeding of the XIX International Symposium Improvement Ornamental Plants. Acta Hort.508, 2000. - Proceeding of the XX International Eucarpia

Symposium. Section Ornamentals. Strategies for New Ornamentals II. Acta Hort. 572, 2002. http://www.actahort.org/books/508 -Researchs and technology http://www.florigene.com.au - Towards blue carnation. Practical Hydroponics. Issue: 33 (1997). Fox, R. http://www.hydroponics.com.au - True Blue Rose. Russell. J. http://www.cx.yn.cninfo.net/edu/science/flecture-1.htm

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VIII.-Captulo 10
Estrategias para el control de insectos plaga
Ferrero, Adriana A.; Descamps, Lilian; Reviriego, Mara 1. Introduccin

La categorizacin de un organismo como peste o plaga est determinada por el hombre, es decir, tiene carcter antropocntrico, considerndose ste como el factor principal en el sistema. As, insectos que se alimentan de plantas y granos, que actan como vectores de agentes patgenos en los vegetales o que alteran la salud humana son considerados plagas. La poblacin humana est sumergida en un mar de insectos. Si se considera su nmero solamente, la tasa estimada de insectos en relacin con los humanos en nuestro planeta es de 200 millones a 1, existiendo alrededor de 160 millones de insectos por hectrea. Basados en su biomasa y abundancia, los insectos son los organismos ms exitosos en la tierra, siendo el 1% de ellos los que caen en la categora de plagas. Se supone que las formas ms primitivas de insectos conocidas eran consumidores de detritus. El hbito de alimentarse de plantas parece, en algunos casos, haber evolucionado independientemente. Los insectos han atravesado un largo y variado perodo de coevolucin y coadaptacin con sus plantas huspedes estableciendo modelos de asociacin con distintas estrategias en el ciclo biolgico y en los mecanismos alimentarios necesarios para la explotacin de stas. La produccin primaria neta de las 300.000 especies de plantas vasculares, que Figura 1: Principales destinos de la agricultura mundial. El hombre debe competir por las cosechas con insectos plaga, malezas y enfermedades habitan las zonas secas de la que reducen el rendimiento de los cultivos. Gentileza del Prof. Germn superficie de la tierra, ha sido Spangenberg. 9 estimada en unas 115 x10

toneladas por ao. Esto representa un recurso potencialmente disponible para ser explotado por los insectos fitfagos. El impacto de los insectos sobre las cosechas es conocido desde los tiempos bblicos, cuando las plagas de langostas se extendieron por el territorio egipcio. Sin embargo, el estudio global de la interaccin y del impacto de los insectos sobre la vegetacin natural se ha desarrollado en los ltimos cien aos. En la actualidad, los insectos plaga y los organismos patgenos (hongos, bacterias y virus) son responsables del 14 % de las prdidas en cosechas en el mundo (Fig. 1). Las actividades agrcolas incrementan las oportunidades para el surgimiento de las plagas a travs del desarrollo de monocultivos, del cultivo en reas donde no existen enemigos naturales de la plaga, del uso de fertilizantes y herbicidas, del desarrollo del cultivo en un rea nueva permitiendo as que las especies nativas de insectos se alimenten de ste y se conviertan en plagas, de la eliminacin de los enemigos naturales de la plaga por cambios en el manejo del cultivo y del uso continuo del mismo producto qumico, generando adaptacin a ste y posibilitando la aparicin de resistencia. En los agroecosistemas modernos la evidencia experimental sugiere que la biodiversidad puede ser utilizada para mejo-

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orgnicos. Estos contienen cloro, hidrgeno y carbono en su molcula y, ocasionalmente, oxgeno y azufre. Aunque son muy efectivos, estables y persistentes, se acumulan en grasas y dan origen al conocido fenmeno de biomagnificacin. Sus efectos sobre la vida silvestre, el medio ambiente y la salud humana estn muy bien documentados en el libro La primavera silenciosa, escrito en el ao 1962 por la biloga Raquel Carlson. A partir de 1950/1960 los organoclorados fueron reemplazados por los organofosforados y los carbamatos. Los organofosforados se desarrollaron en Alemania durante la Segunda Guerra Mun2 Insecticidas dial; qumicamente derivan del cido fosfrico, son menos estables en presencia de la El uso de insecticidas en el mundo es muy luz y se descomponen rpidamente en comgeneralizado. Su aplicacin para mantener a puestos no txicos. La ruptura de estos comlos cultivos libres de insectos representa cuan- puestos se produce en horas o das en comtiosas inversiones econmicas (Fig.2). Las paracin con los organoclorados, que demoprdidas en cosechas debidas a los insectos ran meses o aos. Los carbamatos son insecsumado al costo de los herbicidas represen- ticidas de amplio espectro muy utilizados en tan una inversin mundial de unos 3 billones la agricultura, desarrollados por la corporade dlares anuales. cin Geigy. Son derivados del cido carbmico El mtodo ms preciso de clasificacin de y similares en la persistencia en el ambiente los insecticidas es de acuerdo con su compo- a los organofosforados. Entre 1970 y 1980 sicin qumica. Los grupos ms importantes siguieron los insecticidas piretroides, derivason los organoclorados, organofosforados, dos del cido crisantmico. Su carbamatos y piretroides. fotodegradacin es rpida y en la actualidad Los organoclorados constituyen el grupo son los ms utilizados por ser ms seguros ms antiguo y ms utilizado de insecticidas para la vida silvestre y el ambiente. Como grupo, los compuestos sintticos mencionados son los ms potentes para el control de las plagas. Debido a su amplio espectro de accin en la naturaleza, pueden resultar perjudiciales al hombre tanto en los agroecosistemas como en los ecosistemas naturales, no slo destruyendo a la plaga sino tambin a otros insectos que actan como enemigos naturales o favoreciendo el resurgimiento de plagas secundarias. A menudo, algunas de las causas de estos efectos indeseables estn relacionadas con la eleccin del Figura 2: Uso de insecticidas en los principales cultivos agrcolas y el monto producto, la dosis y el modo de las inversiones realizadas. en que stos se aplican.

rar el manejo de las plagas. Varios estudios muestran que es posible estabilizar las comunidades de insectos en un agroecosistema constituyendo arquitecturas vegetales que soporten a las poblaciones de enemigos naturales y/o inhiban el ataque de las plagas. Es difcil imaginar una tecnologa que produzca la cantidad necesaria de alimento para la humanidad y el mantenimiento adecuado de la salud pblica sin recurrir al uso de plaguicidas, adquiriendo particular relevancia dentro de este grupo los insecticidas destinados a combatir y/o reducir una poblacin de insectos plaga.

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Continuamente se buscan compuestos ms selectivos, ms especficos y con blancos para accionar especficos de los insectos. Muchos insecticidas convencionales afectan el sistema nervioso del insecto, que tiene funciones similares a las del hombre o al de otros animales. Esto hace que el inters en ellos se reduzca por los potenciales riesgos para la salud humana y animal. En las ltimas tres dcadas se han logrado avances tecnolgicos significativos que han permitido descubrir, identificar y sintetizar qumicos especficos que regulan o median el crecimiento, comportamiento y desarrollo del insecto. En este grupo se encuentran los llamados reguladores del crecimiento, que se caracterizan por causar muerte prematura y metamorfosis anormales. Dado su modo de accin su uso es seguro. Otro grupo de insecticidas son los naturales, que pueden ser aceites minerales obtenidos del refinamiento del petrleo o botnicos. Los aceites refinados de petrleo presentan ventajas como bajo costo, buena cobertura de las superficies a tratar y facilidad en su formulacin. Se los ha utilizado como coadyuvantes de otros insecticidas y son seguros para el ambiente. Sin embargo, son inestables en almacenaje, inefectivos contra ciertas plagas y algunos insectos presentan resistencia a los mismos. Los insecticidas botnicos son derivados de las plantas o de parte de ellas y han sido utilizados durante mucho tiempo antes que cualquier otro insecticida. Las plantas producen una diversidad de compuestos, sin un rol aparente en los procesos fisiolgicos bsicos de las mismas, y a los que se conoce con el nombre de metabolitos secundarios. Un considerable nmero de ellos son txicos para los insectos ocasionndoles lesiones o la muerte, dependiendo de las circunstancias y de la cantidad ingerida. Los ms conocidos son los alcaloides. Adems de stos, existen anlogos qumicos de las hormonas de los insectos, que pueden actuar interrumpiendo su ciclo biolgico. Tambin existen protenas, dentro de las cuales estn incluidas enzimas tales como quitinasas, lectinas e inhibidores de enzimas digestivas, con la misma funcin. Actualmente es posible introducir en plantas genes que confieren resistencia a insectos para reducir su susceptibilidad a los mis-

mos. Estos genes pueden tener diversos orgenes y constituyen una herramienta importante en el desarrollo de variedades resistentes. Su importancia radica en su efectividad, selectividad contra la plaga, baja estabilidad relativa y compatibilidad con otras tcticas. Adems, las variedades resistentes pueden ser introducidas fcilmente y en forma econmica resultando en ganancias en corto tiempo. Sin embargo, el tiempo requerido para su desarrollo, los problemas de biotipos y que, a veces, las caractersticas agronmicas de un cultivar puedan ser beneficiosas para otra plaga son algunas de sus desventajas. Las barreras qumicas de las plantas pueden ser interpretadas como un mecanismo de defensa contra los insectos que se alimentan de ellas y que la planta ha adquirido por seleccin natural. Sin embargo, es difcil demostrar esta afirmacin. Los metabolitos secundarios tienen funciones alternativas, muchos son considerados como agentes antimicrobianos que protegen las plantas de posibles enfermedades. De todas maneras existen ejemplos que demuestran que durante la alimentacin de los insectos con una planta puede inducirse en la misma un incremento en la concentracin de algunos metabolitos secundarios, que sern efectivos contra sucesivos ataques. La relacin entre el estmulo qumico de la planta y la respuesta del insecto es una forma de comunicacin qumica entre estos organismos. Esta comunicacin se realiza mediante compuestos conocidos como semioqumicos, que suelen llamarse agentes antiinsectos y que pertenecen al grupo de los biorracionales. Los semioqumicos incluyen a las feromonas, sustancias producidas por insectos que permiten la comunicacin entre individuos de la misma especie y a los aleloqumicos, que permiten la comunicacin entre individuos de diferentes especies. Es necesario destacar que en la ltima dcada se han investigado intensamente las posibilidades de aplicar comercialmente las feromonas con fines de control. En la prctica slo el 5% de las mismas se ha logrado sintetizar. Hasta el momento no se encuentran en la bibliografa casos instalados de resistencia a feromonas, pero poco uso se ha hecho de ellas. Los aleloqumicos pueden subdividirse en

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allomonas y kairomonas. Las allomonas cumplen funcin defensiva, produciendo respuestas negativas en los insectos y reduciendo el contacto y la utilizacin de la planta. Entre ellas se encuentran los repelentes y los compuestos que alteran la oviposicin y la alimentacin. Las kairomonas provocan respuestas positivas en el insecto favoreciendo la localizacin del huesped, la oviposicin y la alimentacin. Estas incluyen atractantes, excitantes y estimulantes. El estudio de la interaccin entre la plaga y los compuestos presentes en las plantas ofrecen un potencial importante para mejorar, en el futuro, el control de las plagas en muchos cultivos. Dentro del grupo de los biorracionales tambin resultan de inters los productos de fermentacin bacteriana y las protenas cristalinas. Entre los primeros se encuentran las avermectinas, que son una mezcla de productos naturales producidos por un actinomicete del suelo, Streptomyces avermectilis. Este moderno insecticida y tambin acaricida debe su mecanismo de accin a la actividad como agonista del cido gama amino butrico (GABA), que es una neurohormona del sistema nervioso de los invertebrados. Las avermectinas actuaran en los mismos receptores especficos para GABA provocando la parlisis y muerte del insecto. Entre los segundos se encuentran las endotoxinas de Bacillus thuringiensis, tambin conocidas como Bt. Los productos basados en Bacillus thuringiensis (Bt) son los ms difundidos entre los llamados insecticidas biolgicos porque poseen bajo riesgo ambiental y humano. No obstante, su aplicacin ha sido muy restringida. En la actualidad, debido a los avances logrados en su formulacin y a la biotecnologa se han descubierto cepas de Bt. con mayor potencia y espectro de accin. Las Bt son bacterias Gram positivas que producen, durante la esporulacin, una inclusin cristalina parasporal proteica. Esta inclusin es disuelta por ingestin en el intestino medio de los insectos, donde se libera la llamada delta endotoxina. Los cristales de las diferentes cepas de Bt contienen ms de un tipo de protena con poder insecticida. Son bioactivas frente a lepidpteros, dpteros o colepteros. La estructura de las delta

endotoxinas vara segn el gen que las codifica. Se identificaron y clasificaron numerosos genes que las codifican, que son de dos tipos, denominados cry (por cristal), y cyt (toxinas citolticas). Ya hay ms de 100 genes identificados pertenecientes a estas familias. El modelo actualmente vigente para el mecanismo de accin sugiere que por unin de la toxina a su receptor especfico se induce la formacin de poros en la membrana celular que generan un desbalance inico que conduce finalmente a la muerte del insecto. Una nueva clase de insecticidas que surgieron a partir de las bacterias mencionadas es la que corresponde a la llamada clase VIP (vegetative insecticidal protein). Estas molculas se sintetizan durante el ciclo vegetativo de las bacterias y actan como exotoxina que al ser ingerida por la plaga, cesa la alimentacin y muere rpidamente. Gracias a los avances de la tecnologa del ADN recombinante se pudieron aislar los genes de las deltas endotoxinas de Bacillus thuringiensis y expresarlos en plantas y bacterias del suelo. Esta biotecnologa condujo a nuevas formas de liberacin de las toxinas para controlar insectos plaga. Los genes Bt que ms comnmente se utilizan, en la actualidad en algodn tienen dos orgenes, uno es el CryAc utilizado por Monsanto en sus variedades Bollgard y el otro es un gen hbrido que fue desarrollado por el sector pblico (Academia de Ciencias Agrarias de China, CAAS). Se trata de un gen Cry1Ab/Cry1Ac. Existe otro gen CpTi (cowpea trypsyn gene) que se emplea unido a Bt en alguna variedades chinas. Otro gen dual es el CryAc/ Cry1F. La utilizacin de dos genes simultneamente es una importante herramienta para demorar el comienzo de la resistencia. Las dos toxinas juntas resultan en un control redundante que conferira una resistencia ms duradera e incrementa el espectro de insectos que permite controlar. En la actualidad se han informado 1.326 especies de insectos que atacan al algodn, de los cules 10 producen prdidas importantes desde el punto de vista econmico, la mayora de los cuales son lepidpteros. Cabe mencionar que las toxinas expresadas en la plantas Bt son idnticas o similares a las encontradas en la naturaleza y a las que se encuentran en el microorganismo que se

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utiliza en las aplicaciones convencionales de Bt. Esta toxina es inocua para insectos que naturalmente no son sensibles al Bt, para aves, peces y mamferos, entre los que se incluye el hombre. En cuanto a la evaluacin del impacto ambiental ver IX.2 y 3. El cultivo a gran escala de variedades Bt, comenz en 1996 y se increment rpidamente, alcanzando los 14 millones de has. en el 2002. En el 2001 variedades comerciales de maz, algodn y papa fueron plantadas en 5 millones de hectreas en EE.UU., Argentina, Canad, China, Australia, Sudfrica, Mxico, Espaa, Francia, Portugal, Rumania y Ucrania En el 2003 el maz Bt ocup el segundo lugar en importancia en el mundo, con una superficie de 12,3 millones de has, lo que equivale al 13 % del rea total de cultivos transgnicos (67,7 millones de has). Los pases que lo han adoptado son Estados Unidos, Canad, Argentina, Sudafrica, Espaa, Filipinas, Honduras, Uruguay y Alemania. En un ao la superficie sembrada aument de 9,9 millones de has a 12,3 millones. El maz tolerante a herbicidas e insectos (eventos combinados por cruzamiento convencional) con 3,2 millones de has representa el 5 % de la superficie y el algodon Bt tiene una superficie equivalente. El algodn tolerante a herbicidas e insectos ocupa 2,6 millones de has (4%) Este tipo de biotecnologa tiene mucha importancia en los pases en vas de desarrollo. Los beneficios que otorgan estos productos son la reduccin en el uso de insecticidas convencionales, en algunos casos de ms del 50 %, el incremento del valor del cultivo, mejor control natural de la plaga, proteccin de los enemigos naturales, reduccin en la contaminacin ambiental y posibilidad de combinar esta tecnologa con otras tcticas para el control de la plaga. Tambin se han registrado incrementos en el rendimiento y menores costos de produccin, ya que el gen se expresa en todos los estadios de crecimiento y en todos los rganos de la planta, evitando tener que aplicar insecticida en tiempos determinados; no existe riesgo de lavado por la lluvia ni prdida de actividad debida a la luz del sol, como sucede cuando se aplican las formulaciones derivadas del microorganismo directamente. (Fig.3 y 4).

Figura 3: Caas de maz convencional (arriba) y protegido de insectos (abajo) con el gen cry 1Ab especfico para el barrenador del tallo, Diatraea saccharalis. (Gentileza Monsanto Argentina).

Figura 4: Ensayo experimental de soja tolerante a insectos lepidpteros. En primer plano, variedad convencional (Gentileza Monsanto Argentina).

Como un efecto indirecto de la proteccin contra insectos del maiz Bt, se ha podido determinar una reduccin en la presencia de fumonisinas (micotoxinas producidas por diferentes especies de Fusarium sp ). Estas micotoxinas son toxicas y cancerigenas para un nmero de especies animales y se han relacionado con los altos indices de cancer esofgico observados en agricultores de Africa y China. Los niveles de reduccin de fumonisinas en maices protegidos del dao de los insectos (que constituyen vas de entrada del hongo), varan entre 3 y 8 veces en diferentes pases y aos. Otra ventaja es el ahorro en consumo de agua que implica la menor utilizacin de insecticidas, que, como se sabe es uno de los recursos ms limitantes del planeta (ver VIII.12). El volumen de agua utilizada en una

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simple aplicacin de insecticida es de 40 a 80 litros por ha. El ahorro en consumo de agua debido a la utilizacin de tecnologas como Bt puede estimarse de la siguiente manera: durante 2001, 81 millones de kg de insecticidas fueron aplicados en el cultivo de algodn en el mundo, a un promedio de 0,45 kg/ha/ aplicacin en el 2001. Esto representa 180 millones de has. fumigadas, lo que es consistente con un promedio global de 5,5 aplicaciones sobre 33,5 millones de has. La cantidad de agua utilizada para aplicar 81 millones de kg de insecticida es de 12,6 billones de litros. El ahorro en consumo de agua con esta tecnologa podra ser del 50%, es decir 6.3 billones de litros anuales. Tambin significa una reduccin de 5,6 millones de litros de combustible y de un milln de kg de deshechos industriales generados en la fabricacin de insecticidas convencionales. Dados los recientes avances en biotecnologa, se podra esperar que las plantas transgnicas resistentes jueguen a futuro un importante rol en el control de insectos plaga. Hasta donde se conoce, no ha evolucionado una plaga que exprese a campo resistencia a los cultivos Bt. No obstante, el Bt aplicado como spray ha generado moderados a elevados niveles de resistencia en poblaciones de polilla de las coles y en algunos ensayos se observ resistencia a plantas Bt en experimentacin, como por ejemplo a plantas transgnicas de brccoli. Existen al menos 7 cepas resistentes de 3 insectos plaga que sobreviven sobre cultivos Bt. A fin de contrarrestar la aparicin de resistencia se desarroll la estrategia de refugio, basada en la teora desarrollada en docenas de publicaciones durante los ltimos 25 aos y en la limitada experiencia de trabajos experimentales a pequea escala. Se trata de plantar refugios de plantas no Bt en reas prximas a los cultivos Bt para permitir la supervivencia de los insectos susceptibles. De manera ideal, la resistencia es conferida por alelos raros, recesivos y los adultos ms resistentes de los cultivos Bt se aparearn con los adultos susceptibles de los refugios. Si esto es as, la teora predice que la aparicin de resistencia se ver demorada sustancialmente. Aunque no existen informes detallados acerca de las evaluaciones a gran escala de esta estrategia de refugio, los ex-

perimentos muestran que pueden ocurrir algunas violaciones a algunas de las asunciones clave (baja frecuencia de alelos de resistencia y herencia recesiva de la resistencia a Bt) en algunos sistemas. De esta manera, dado el difundido uso de los cultivos Bt contra varios insectos plaga, la resistencia podra evolucionar rpidamente en algunas situaciones a pesar de la presencia de refugios. Contrariamente a esto, no se han documentado hasta la fecha incrementos en la frecuencia de resistencia a las toxinas Bt en poblaciones de insectos a campo a causa de la exposicin a cultivos comerciales que expresan Bt. Los factores clave para la demora en la aparicin de resistencia son probablemente: los refugios, las bajas frecuencias iniciales de los genes de resistencia, la herencia recesiva de la misma, los costos asociados con el desarrollo de la resistencia, que reducen la aptitud de los individuos resistentes en relacin a los individuos susceptibles sobre los cultivos Bt y las desventajas sufridas por las cepas resistentes sobre los huspedes Bt en relacin a su desempeo sobre cultivos no Bt. La importancia relativa de estos factores vara entre los sistemas de las plagas y los cultivos Bt. Una leccin que nos brindan estos pocos aos de cultivos Bt es que debemos ser cautelosos y reconocer que la habilidad para predecir tasas de evolucin de la resistencia en el campo es limitada. El xito de los cultivos Bt hasta la fecha excede las expectativas de muchos, pero no previene los problemas de resistencia en el futuro. El monitoreo constante y las estrategias biotecnolgicas en continuo desarrollo sern fundamentales para conservar este recurso de control biolgico. 2.1. Insecticidas naturales vs insecticidas sintticos La pregunta que nos deberamos hacer es: son los insecticidas naturales ms seguros que los sintticos? Los cientficos responden que puede ser que sean, dependiendo del insecticida natural o sinttico que se est comparando. Cuando se evala el riesgo o la seguridad de cualquier plaguicida se debe recordar que 1) la toxicidad es una funcin de

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la estructura qumica y no de su origen, 2) la seguridad de un plaguicida depende del tiempo y frecuencia con que el individuo estuvo expuesto y de la dosis de exposicin y que 3) la percepcin del riesgo a veces no es coincidente con el riesgo real o actual de un plaguicida. En algunas plagas, no se puede detener la aparicin de resistencia a insecticidas convencionales, biopesticidas o nuevos cultivos transgnicos. La resistencia en insectos es un caso de toxicidad selectiva intraespecie. Segn una definicin, el fenmeno de resistencia consiste en la habilidad desarrollada en una cepa de insectos para tolerar dosis de txicos que seran letales para la mayora de los individuos de una poblacin normal de la misma especie, siendo esta habilidad de carcter gentico y heredable. Los insecticidas crean una presin de seleccin que elimina progresivamente los individuos sensibles dejando un nicho vaco que pasan a ocupar los individuos resistentes. La resistencia es un caso de evolucin preadaptativa . Los insecticidas naturales y/o sintticos no inducen sino que seleccionan cepas resistentes. El mecanismo ms comn por el cual una cepa resulta resistente a un insecticida es por la modificacin de la toxicocintica o toxicodinmica. La toxicocintica de los insecticidas naturales o sintticos tienen que ver con las etapas de penetracin, distribucin, acumulacin, biotransformacin y excrecin en el insecto. La llegada al sitio de accin se denomina toxicodinmica y tiene que ver con la reaccin fundamental del insecticida o su metabolito activado con una enzima o receptor vital. Estas etapas dependen crticamente de las propiedades fisicoqumicas de los compuestos antiinsectos. 3. Consideraciones finales Sin duda, varias tcticas pueden ser implementadas para evitar la prdida de las cosechas por accin de los insectos plaga. As programas de Manejo Integrado de la Plaga (MIP) deben ser desarrollados para cada cultivo y en cada regin, manteniendo la poblacin de la plaga debajo del nivel de dao econmico. Se debe entender al MIP como una filosofa y una metodologa que enfatizan

la necesidad de utilizar estrategias de manejo de la plaga para minimizar el resurgimiento de la misma. A pesar de todo, los insecticidas han sido y probablemente continuarn siendo los mtodos ms efectivos para controlar el desarrollo de las plagas. Deca el Dr. Edgardo Wood, en una conferencia relacionada con la resistencia a insecticidas: El hombre contemporneo debera comprender que las tcticas qumicas eficaces para controlar las plagas como asimismo los blancos sensibles y viables deben protegerse como patrimonio de la humanidad, porque de la irracionalidad en el uso de la qumica contra la naturaleza podr sobrevenir una crisis debida a resistencia generalizada en la que no contaremos con molculas naturales o sintticas efectivas ni con blancos viables. Entretanto la esperanza radica en el conocimiento cada vez mayor del problema y su potencialidad para ser cuidadosos en el aporte y utilizacin de las soluciones. El primer gran paso ya est dado: el no desconocer el fenmeno. 4. Lecturas Recomendadas
ALTIERI. M.A. 1994. Biodiversity and Pest Management in Agroecosystems. Ed:TheHaworth Press, Inc. New York, London, Norwood (Australia). 185 pp. ANNIMO. 1957. World Health Expert Committee on Insecticide, 7 th Report, Who Technical Report Series N 125. BENEDICT, J.H. 2003. Strategies for Controlling Insect, Mite and Nematode Pests. In: Plants, Genes and Crop Biotechnology. Chrispeels, M.J. y Sadava, D.E. Ed. Jones y Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusets. 562pp. CASIDA, J.E. Y QUISTAD, G.G. 1998. Golden age of insecticide research: past, present or future?. Ann. Rev. Entomol. 43: 1-16. COATS, J. R. 1994. Risks from Natural versus Synthetic Insecticides. Ann. Rev. Entomol: 39: 489-515. DE BACH, PAUL. 1992. Control Biolgico de las Plagas de Insectos y Malas Hierbas. Ed: Lycsa Impresores. Mxico. 949 pp. FRANCO, O.L.; RODRIGUES MELO, F.; MATTAR DA SILVA, M.C. y GROSSI DE S, M. F. 1999. Resistncia de Plantas a Insetos. Biotecnologia, Ciencia y Desenvolvimiento: 3640. ELLIS, T. R.; STOCKHOFF, L.S.; SCHNEPF, H.E.; SCHWAB, G.E.; KNUTH, N.; RUSSELL, J.; CARDINEAU, G.A. y NARVA, K. E. 2002. Novel Bacillus thuringiensis binary insecticidal

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cristal proteins active on western Rootworm, Diabotrica virgifera virgifera LeConte. Appl. Envirom. Microbiol. 68 (3): 1137-1145. HODKINSON, I.D. y HUGHES, M.K. 1993. La Fitofagia en los Insectos. Ed: Oikos-tau. Barcelona. Espaa. 99 pp. MUNKVOLD, HELLMICH y RICE (1999). Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Maize Bt hybrids and non transgenic hybrids. Plant Disease 83 (2): 130-138 PEDIGO, L. P. 1996. Entomology and Pest Management. Ed. Prentice Hall, New Jersey. 679 pp. RESISTENCIA A INSECTICIDAS: UN PROBLEMA ECOTOXICOLGICO. 1992. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad Nacional de la Pampa. 83 pp. TABASHNIK, B.E.; CARRIERE, Y.; DENNEHY, J.T.; MORIN, S.; SISTERSON, M. .S.; ROUSH, R.T.; SHELTON, A.M. y ZHOU ZHAO, J. 2003. Insecticde Resitance to transgencic Bt Crops. Lesson from the laboratory and field. Journal of Economic Entomology. EC-03-127 Version 2.

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VIII.-Captulo 11
Estrategias para el manejo integrado de malezas: problemtica, resistencia a herbicidas y aportes de la biotecnologa.
Sabbatini, M.R.; Irigoyen, J.H.; Vernav, M.N. 1 Definiciones, caractersticas y daos ocasionados por las malezas Se define a las malezas como plantas que crecen en sitios no deseados por el hombre, por lo que puede ser considerada maleza toda planta que disminuye el rendimiento de un cultivo, resulta txica para el ganado, invade el csped de un jardn o la que crece en el techo de una casa dificultando el desage de sus tuberas. Este concepto de maleza o de planta indeseable causa por lo general un rechazo especialmente por parte de botnicos que no admiten que se catalogue de esta manera a una especie vegetal. Contrariamente, para un productor agropecuario, las malezas constituyen plantas nocivas que deben ser eliminadas de los campos en produccin, debido a que en la mayora de los cultivos y pasturas su presencia ocasiona perjuicios econmicos de mayor o menor grado de severidad. La referencia negativa a estas plantas se traslada a otros pases; as, por ejemplo, en Espaa se las denomina malas hierbas y en Brasil plantas dainas. El concepto de maleza tiene por ello un origen antropocntrico, ya que en realidad no existe ninguna caracterstica morfolgica o fisiolgica que permita caracterizar a una especie vegetal como maleza. As, existen algunas especies que de acuerdo con el lugar donde crecen pueden ser consideradas cultivos o malezas. Un buen ejemplo de ello lo constituye el raigrs ( Lolium multiflorum), en la provincia de Buenos Aires, que es una maleza importante del cultivo de trigo pero paralelamente es una forrajera ganadera muy deseable. Las malezas conforman una pequea proporcin del mundo vegetal: de las 200.000 especies de angiospermas, slo cerca de 30.000 se comportan como malezas y no ms

de 250 representan serios problemas para las actividades humanas. En agroecosistemas, la mayora de las malezas tienen algunas caractersticas claves que aseguran su xito y les otorgan la habilidad de invadir, dominar y persistir. Entre ellas se encontraran una alta dispersin por semillas u otros disemnulos, que les asegura una asociacin cercana a hbitat manejados por el hombre; un alto potencial de colonizacin que les permite incrementar la poblacin rpidamente e integrarse a la comunidad vegetal, y una alta capacidad de persistencia en el sitio, fundamentalmente a travs de comportarse como hbiles competidoras frente a los cultivos y presentar un banco de semillas o propgulos abundante y longevo. El banco de semillas del suelo es la reserva de simientes que se encuentra enterrada en los suelos agrcolas y constituye la nica fuente de reposicin de las especies anuales, que son aquellas que se reproducen nicamente por semillas. Las especies perennes presentan en el banco, adems de semillas, propgulos vegetativos (tubrculos, rizomas, estolones, bulbos) que originan plantas genticamente idnticas a las plantas madres. La eficiencia reproductiva a travs de la va sexual (semillas) permite la formacin de nuevos genotipos capaces de colonizar y dominar nuevos ambientes. Por otro lado, la va asexual (propgulos vegetativos) les permite perpetuarse en los ambientes ya colonizados. Los principales inconvenientes ocasionados por las malezas a los agricultores, que se traducen generalmente en un perjuicio econmico, son los siguientes: - Compiten con los cultivos por nutrientes, agua y luz, disminuyendo el rendimiento de los productos cosechados (granos, tubrculos, frutos, etc.). - Interfieren en las labores de cosecha y disminuyen la calidad de los productos cosechados. - Causan toxicidad directa al ganado y disminuyen la calidad de las pasturas. - Interfieren con el manejo del agua en sistemas de agricultura bajo riego. - Actan como huspedes de insectos, enfermedades y otras plagas de la agricultura.

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- Liberan sustancias alelopticas, que afectan el normal desarrollo de los cultivos. El problema no es menor. Debemos por ejemplo considerar que algunas malezas disminuyen el valor de la tierra, ya que limitan la posibilidad de producir determinados cultivos. Por ejemplo, la abundancia de malezas invasoras perennes como el gramn (Cynodon dactylon) o el sorgo de alepo (Sorghum halepense) reducen el valor de los campos en la provincia de Buenos Aires, ya que es necesario implementar un intenso y costoso programa de control si se deseara implantar la mayora de los cultivos primavero-estivales, producidos normalmente en esa zona. Otro ejemplo lo constituye la zona bajo riego del valle inferior del Ro Negro, en la cual algunas chacras no son cultivadas cuando existe la presencia en abundancia de Centaurea repens, una maleza perenne de muy difcil erradicacin y que impide la produccin rentable de cultivos hortcolas. El problema lo podramos cuantificar indicando que es mayor la inversin que realizan los agricultores para controlar dichas malezas (labores mecnicas, aplicaciones de herbicidas) que la que realizan para controlar otras plagas como insectos, hongos, nematodos, etc. As, por ejemplo, se ha calculado que cerca del 50% del mercado mundial de plaguicidas corresponde a herbicidas. 2 Estrategias en el manejo de las malezas Desde que el hombre comenz a cultivar vegetales necesit extirpar las plantas no deseadas que crecan junto a ellos, de forma tal que el manejo y control de malezas es tan antiguo como el desarrollo mismo de la agricultura. Por miles de aos el control manual y el uso de cultivadores arrastrados por animales constituyeron la principal prctica disponible para solucionar el problema de las malezas. Posteriormente, el control mecnico sustituy dichas prcticas hasta que a mediados del siglo XX, comenz a generalizarse el uso de compuestos qumicos (herbicidas) para el control de malezas. El manejo de las especies consideradas maleza puede ser enfocado a travs de diferentes estrategias. Todo programa de control deber inexorablemente responder con

tcticas de manejo en concordancia con los ciclos de vida, tasa de crecimiento y otros atributos de las malezas. El enfoque tctico es diferente si se trata de malezas de ciclo anual o perenne . Como regla general, se puede aseverar que las especies anuales son vulnerables a los mtodos de control en los estadios de plntula y vegetativo, aunque cierto grado de xito tambin pueda alcanzarse en el estadio de floracin. Las malezas perennes, que cuentan con sistemas de propagacin vegetativa, requieren de un programa a largo plazo que combine diferentes medidas de control previo y durante el desarrollo del cultivo. Existen cuatro estrategias bsicas de control relacionadas con la problemtica de las malezas: a) El control cultural involucra todas las medidas tendientes a generar condiciones favorables o ventajas competitivas que beneficien al cultivo frente a las malezas. As, la siembra de un cultivo con semillas de adecuada sanidad, valor cultural y vigor, puede generar condiciones para el rpido establecimiento y desarrollo del cultivo en relacin con las malezas. b) Los controles manual y mecnico implican la remocin de las malezas emergidas directamente por el hombre o mediante la utilizacin de diferentes implementos como cultivadores, escarificadores, rastras, arados, etc. La topografa y el tipo de suelo, la profundidad de la napa fretica, el tipo de maleza y el estadio fenolgico del cultivo son factores determinantes de su factibilidad de implementacin. Es una de las prcticas de control ms utilizada debido fundamentalmente a su practicidad. c) El control biolgico de malezas consiste en la utilizacin de organismos, agentes biolgicos o enemigos naturales que se encuentran en el ambiente y que a travs de su interaccin (parasitismo, predacin o herbivora, accin patognica, alelopata) afectan negativamente el desarrollo de una poblacin de malezas. Esta tctica de control representa la mxima aspiracin en el manejo de malezas, fundamentalmente en trminos ecolgicos y de preservacin del ambiente. Una condicin necesaria en el control biolgico es la especificidad que debe

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tener el agente controlador, para evitar que afecte a los cultivos o la flora natural. De esta forma, su operatividad potencial se ve restringida debido a la diversidad de la flora de malezas generalmente presente. Adems, el aislamiento y comercializacin de organismos de control biolgico especficos frente a un amplio espectro de malezas determina que esta tctica se adapte, en mayor medida, a situaciones donde una especie de maleza constituye el problema dominante. Un ejemplo en desarrollo en nuestro pas es el del control de yuyo esqueleto (Chondrilla juncea) en la zona del sudoeste de la provincia de Buenos Aires, mediante la liberacin del caro extico (Eriophyes chondrillae) que forma agallas en los tallos de la maleza reduciendo su produccin de flores y semillas. d) El control qumico constituye en la actualidad la estrategia ms difundida en el manejo de malezas. Las principales ventajas son su rpida accin, su versatilidad y adaptacin a diferentes equipos de aplicacin y sistemas de cultivo y su potencialidad de aplicacin en grandes extensiones. Como contrapartida, pueden contaminar suelos, acuferos y alimentos, afectar organismos benficos, disminuir la biodiversidad, causar cambios en las comunidades de malezas, conduciendo al reemplazo de malezas susceptibles por tolerantes y, adems, desencadenar problemas de resistencia, como se ver ms adelante. 3 Caractersticas de los herbicidas y su modo de accin Los herbicidas son sustancias qumicas que ocasionan la muerte de plantas o que inhiben su normal crecimiento. As, existen herbicidas selectivos o especficos, que permiten controlar malezas sin afectar a los cultivos y herbicidas no selectivos o de accin total , que se utilizan generalmente en los barbechos, previo a la implantacin del cultivo. Reemplazan las tareas de labranza tradicional y constituyen la herramienta fundamental de manejo en los cultivos resistentes a herbicidas. La selectividad es la propiedad que presentan algunos herbicidas de ejercer su accin fitotxica sobre algunas especies vegetales (malezas) pero sin afectar a otras plan-

tas (cultivos). As, por ejemplo, el 2,4-D (cido 2,4-dicloro-fenoxi-actico) es un herbicida selectivo para cultivos de cereales o gramneas en general (trigo, avena, maz, etc.), ya que controla malezas de hoja ancha o latifoliadas. Sin embargo, el carcter de selectividad generalmente se restringe a determinados estadios fenolgicos dentro del ciclo de desarrollo del cultivo y a una dosis determinada del herbicida. Efectivamente, el 2,4-D pierde su selectividad en el cultivo de trigo cuando se lo aplica fuera del estadio de macollaje del cultivo (perodo en que emite tallos secundarios) y tambin cuando se aplica en dosis superiores a las recomendadas. El herbicida puede ser pulverizado en cobertura total o en forma parcial (sobre las bandas del cultivo) por lo que se adapta a diferentes tecnologas de aplicacin. A su vez, los mismos pueden ser aplicados sobre la canopia de malezas emergidas denominndose herbicidas postemergentes, o pueden ejercer su accin desde el suelo, denominndose entonces preemergentes. Una de las propiedades ms relevantes de algunos herbicidas llamados sistmicos lo constituye su capacidad de transportarse dentro de los sistemas de conduccin de las plantas hasta alcanzar el sitio o blanco de accin biolgica. Existen algunos herbicidas postemergentes cuya movilidad es reducida o nula, ejerciendo su accin solamente en las reas que alcanza cuando es pulverizado. Estos herbicidas se denominan de contacto. Un ejemplo lo constituye el paraquat, herbicida desecante de contacto que ejerce su accin slo sobre el sistema areo de la planta, sin afectar el sistema subterrneo del vegetal. Para que un herbicida sea efectivo debe tomar contacto con la maleza, ser absorbido, transportarse hacia el sitio de accin sin ser desactivado y alcanzar niveles txicos en el sitio de accin biolgica. Se puede definir como modo de accin de un herbicida a la secuencia de eventos que ocurren en la planta desde que la sustancia herbicida es absorbida hasta la ocurrencia de la muerte del vegetal. Asimismo, se define como mecanismo de accin a la interferencia bioqumica o biofsica primaria impuesta por la presencia de molculas del herbicida que conduce al efecto letal en el vegetal. Algunas plantas son capaces de desactivar o degradar rpidamen-

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te a un determinado herbicida, logrando sobrevivir a su efecto txico. El maz, por ejemplo, es tolerante a los herbicidas de la familia de las triazinas debido a que puede conjugar o enlazar dichas sustancias txicas con compuestos qumicos naturales dentro de la planta de maz. Existe un gran nmero de herbicidas en el mercado. En la Argentina, actualmente se comercializan aproximadamente 100 ingredientes activos, agrupados en familias de herbicidas, que a su vez pueden asociarse de acuerdo con su mecanismo de accin (Tabla 1). Una de las vas de desarrollo del control qumico es el continuo mejoramiento de tcnicas de aplicacin de los herbicidas. As, para que una sustancia alcance su mxima potencialidad biolgica debe garantizarse su traslado desde el equipo aplicador hasta el sitio de accin en el vegetal, donde ejercer su efecto letal. Para ello se han diseado equipos de aplicacin muy precisos y la industria qumica ha perfeccionado la formulacin de los principios activos con el agregado de distintos vehculos, coadyuvantes, diluyentes, etc., que los acondicionan para su mejor desempeo biolgico. En los ltimos aos, debe destacarse el importante avance en el uso de protectores de herbicidas, mal denominados antdotos. Un protector de herbicidas es un compuesto que protege a las plantas de un cultivo de los daos de una sustancia herbicida dirigida al control de malezas. Estos compuestos protectores actan nicamente sobre el cultivo, reduciendo la habilidad de las sustancias herbicidas para alcanzar o interferir el sitio de accin donde actan. En la actualidad existe ms de una decena de protectores disponibles para uso comercial en cultivos de maz, trigo, arroz, sorgo y otros cereales. El alcance de estos protectores ha permitido que herbicidas de accin especfica sobre malezas de la familia de las gramneas puedan ser utilizados selectivamente en cultivos de gramneas, como por ejemplo el trigo o el maz. El desarrollo de esta tecnologa se inici con la aparicin del NA (1,8-naftalen-anhdrico), patentado en 1971, para uso en tratamientos de semillas de maz con el objeto de protegerlo de los daos ocasionados por los herbicidas tiocarbamatos y actualmente se

encuentran registrados protectores para un gran nmero de herbicidas disponibles en el mercado. 4 Resistencia de las malezas a los herbicidas El desarrollo de resistencia a herbicidas en malezas es un proceso evolutivo. Se define como resistencia a herbicidas a la habilidad hereditaria de una poblacin de malezas de sobrevivir y reproducirse luego de ser expuesta a una dosis de herbicida a la cual era originalmente susceptible. La resistencia de malezas a herbicidas es un proceso por el cual, a travs de una alta intensidad de seleccin, escasos biotipos resistentes -presentes en una poblacin susceptible- se vuelven mayoritarios, convirtindose la poblacin en resistente. Se asume que la existencia o no de resistencia en una maleza se limita a la dosis agronmica, o sea la dosis normalmente utilizada a campo para el control de malezas. Algunas plantas (ya sean cultivadas o malezas) son naturalmente resistentes a algunos herbicidas aplicados en la dosis agronmica, caracterstica denominada tolerancia a herbicidas. Lo anterior implica que no hubo seleccin o manipulacin gentica para hacer tolerante a la especie. El reiterado uso de herbicidas en un mismo predio hace que la presin de seleccin acte como un filtro que elimina a las plantas susceptibles, dejando que sobrevivan slo las resistentes. Se dice que existe resistencia cruzada cuando un biotipo ha desarrollado uno o varios mecanismos de resistencia a un herbicida que le permite ser tambin resistente a otros herbicidas. Este fenmeno se observa frecuentemente con herbicidas que pertenecen a una misma familia y que pueden tener o no el mismo sitio de accin. Para ejemplificar lo anterior, se dara resistencia cruzada cuando luego de un intenso empleo del herbicida A en un lote se encuentra que los biotipos resistentes a este herbicida lo son tambin a un herbicida B, que nunca haba sido aplicado antes. La resistencia mltiple se refiere a biotipos que evolutivamente han desarrollado resistencia a varios herbicidas por procesos diferentes de seleccin. Por ejemplo, un biotipo que desarroll resistencia a un herbicida A es tratado con un her-

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Tabla 1. Mecanismo y sitio de accin de las principales familias de herbicidas, frecuentemente utilizadas en el control de malezas en la Repblica Argentina y su riesgo potencial de ocasionar resistencia en las especies de malezas controladas.

bicida B, hacia el cual es inicialmente susceptible; luego de un tiempo de intenso uso del herbicida B la poblacin se torna resistente a ste, por lo cual ahora es resistente a ambos herbicidas. Los mecanismos ms comunes de resistencia son: (i) Modificaciones en los sitios de accin,

o sea en los sitios bioqumicos dentro de la planta con los cuales el herbicida interacta directamente. Cuando el herbicida acta sobre un solo sitio de accin, este tipo de mecanismo normalmente deriva en una resistencia completa, es decir que el biotipo resistente no manifestar ningn sntoma como consecuencia de la aplicacin del herbicida.

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(ii) Cambios en el metabolismo de los herbicidas, referido al proceso bioqumico dentro de la planta que generalmente modifica los herbicidas hacia compuestos menos txicos. Diferencias en la tasa de metabolizacin de herbicidas entre malezas y cultivos es la causa principal de selectividad de los cultivos. En este caso, generalmente la resistencia es parcial (no completa), conduciendo a un control poco efectivo del biotipo resistente. La resistencia de insectos a insecticidas es un hecho ampliamente documentado desde mediados del siglo XX, pero la de malezas a herbicidas fue considerada hasta principios de los 90 ms como una curiosidad que un problema que afecte la produccin agrcola. Sin embargo, la aparicin en el mercado agropecuario, entre 1980 y 1990, de herbicidas que actan en un nico sitio de accin, condujo a que la resistencia de malezas a herbicidas sea actualmente el tema de mayor inters en el manejo de malezas en todo el mundo. Se han identificado aproximadamente 260 biotipos de malezas resistentes a herbicidas, que incluyen 160 especies diferentes. El pas con mayores casos registrados es Estados Unidos, seguido por Australia y Canad. En la Argentina no se ha informado acerca de regiones severamente afectadas con poblaciones de malezas resistentes, aunque en el centro y norte del pas se han aislado biotipos de la maleza Amaranthus quitensis (yuyo colorado), resistentes a herbicidas de la familia de las imidazolinonas. La Tabla 1 indica con cules familias de herbicidas existe un riesgo alto, mediano o bajo de desarrollar poblaciones de malezas resistentes. Las familias que en la actualidad ocasionan mayores perjuicios en la agricultura son aquellas cuyo modo de accin se basa en la inhibicin de la enzima ALS (acetolactato sintetasa) y ACCasa (acetil coenzima A carboxilasa), que afectan en las plantas la biosntesis de aminocidos y de lpidos, respectivamente. Varios herbicidas incluidos en dichas familias son intensamente utilizados en la actualidad en la Argentina, por lo que la resistencia representa una amenaza para los agricultores en el corto plazo, especialmente en cultivos extensivos como trigo, soja, girasol y maz.

El grupo de los herbicidas que presentan un riesgo mediano a adquirir resistencia incluye algunos productos muy utilizados en nuestro pas, como por ejemplo atrazina, trifluralina y paraquat. Entre los que tienen bajo riesgo a adquirir resistencia se incluye el glifosato, herbicida intensamente utilizado en los planos tanto nacional como internacional. El desarrollo de cultivos resistentes a herbicidas (CRH) se ha basado principalmente en el uso de este herbicida, ya que permite controlar un amplio espectro de malezas, es de bajo costo y reducido impacto ambiental. Entre los factores que conducen a acelerar el proceso de resistencia se encuentran: a) Frecuencia inicial de mutaciones en el pool gnico: las mutaciones siempre ocurren, se usen o no herbicidas, siendo letales la mayora de los genes mutantes. Los que no son letales se encuentran en bajas frecuencias porque son competidores dbiles frente a los tipos salvajes, dominantes. La frecuencia de los genes que confieren a la planta resistencia a varios herbicidas es variable en la naturaleza. Por ejemplo, los alelos que confieren resistencia a los herbicidas con sitio de accin en la enzima ALS (caso de las sulfonilureas, por ejemplo) aparecen con una frecuencia de uno en un milln, se heredan a travs del ncleo y se comportan fenotpicamente como dominantes en la mayora de las dosis de aplicacin del herbicida. Contrariamente, las mutaciones que confieren resistencia al afectar la protena D1 quinona del fotosistema II (por ejemplo las triazinas) se heredan recesivamente y ocurren en el genoma de los cloroplastos. Debido a que las mutaciones en los cloroplastos ocurren a frecuencias muy inferiores a las nucleares, la resistencia a ALS evoluciona ms rpidamente que la resistencia a la protena D1 quinona. As, mientras que las malezas resistentes a sulfonilureas se hacen evidentes a campo en un perodo medio de tres a cinco aos, las resistentes a triazinas lo hacen entre 7 a 10 aos, y como consecuencia de un uso continuo y a gran escala de herbicidas de dicha familia. b) Presin de seleccin: cuanto mayor sea el efecto letal del herbicida sobre el

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biotipo susceptible y mayor la supervivencia de los biotipos resistentes, ms rpido ser el proceso. Adems, la presin de seleccin ser mxima con herbicidas persistentes, con larga accin residual en el suelo. Cuanto mayor sea el xito reproductivo del biotipo resistente, mayor ser su potencial para dominar en la poblacin. Asimismo, el tamao del banco de semillas ser crucial para retardar la aparicin de resistencia al diluir las semillas resistentes entre las semillas producidas por las plantas susceptibles. c) Adaptacin del biotipo resistente: si bien en ausencia del herbicida los individuos resistentes poseen en general una capacidad adaptativa menor que los individuos susceptibles, existe una notable variacin de acuerdo con el herbicida. Retomando el ejemplo anterior, los biotipos resistentes a las triazinas se adaptan bastante menos al ambiente que los biotipos susceptibles, lo que implica una rpida vuelta a la situacin previa (es decir, mayora de biotipos susceptibles en la poblacin) una vez que el herbicida deja de aplicarse. Contrariamente, las diferencias de adaptacin entre biotipos resistentes y susceptibles a las sulfonilureas son mnimas, lo que implica un problema mucho ms prolongado en los cultivos enmalezados. Si bien en estos ltimos aos se ha acrecentado la importancia de la resistencia monognica, derivada de herbicidas que actan en un solo sitio de accin, existen casos recientes de malezas que han desarrollado resistencia multignica. En este ltimo caso la resistencia se desarrolla como consecuencia de muchas y diferentes mutaciones en los alelos, cuya acumulacin en la poblacin por repetida seleccin confiere cada vez mayores niveles de resistencia, especialmente cuando la dosis es gradualmente incrementada. Este tipo de resistencia se ha encontrado recientemente en Lolium rigidum en Australia al aplicarse en forma reiterada el herbicida diclofop-metil y se produce como consecuencia del mal uso del herbicida (bajas dosis, herbicidas adulterados, baja calidad en las aplicaciones, etc.). De lo expuesto se desprende que el tema de la resistencia de las malezas a los herbicidas es realmente complejo y si bien la resis-

tencia puede ser demorada, su desarrollo es prcticamente inevitable. Como estrategia general para demorar la aparicin de resistencia podra recomendarse el empleo de los herbicidas en las situaciones en las que sea estrictamente necesario, la combinacin en lo posible del control qumico con mtodos mecnicos y/o biolgicos de control de malezas, la rotacin y mezcla de herbicidas con diferentes sitios de accin y la rotacin de cultivos de verano e invierno, que permitirn ampliar el espectro de malezas controladas y las medidas de control utilizadas. 5 La biotecnologa y su insercin en el manejo de malezas Las malezas han ido adaptndose a los cambios impuestos por el hombre desde los inicios de la agricultura, constituyndose en un claro ejemplo de la teora Darwiniana de la seleccin natural. La reciente introduccin del sistema de siembra directa en la pampa hmeda de la Argentina es un buen ejemplo de cmo modificaciones introducidas en el ambiente se traducen en cambios en la comunidad de malezas. La siembra directa es un tipo de labranza conservacionista que acumula residuos de cosecha en superficie e implica una menor remocin del suelo que el sistema de labranza convencional. Como consecuencia, en pocos aos se han producido cambios importantes en predios cultivados con soja, como por ejemplo un aumento en las poblaciones de malezas gramneas anuales en detrimento de las latifoliadas y una notable disminucin de la riqueza florstica natural. La evolucin de las malezas dentro de los hbitat creados por el hombre fue lograda por diferentes vas: a partir de formas silvestres colonizadoras que se adaptaron al disturbio continuo del ambiente debido a las actividades del hombre; como consecuencia de la hibridacin natural entre formas silvestres y cultivadas; y, aunque menos frecuente, a partir de cultivos que se convirtieron en malezas. De esta forma, actualmente muchas especies de malezas presentan morfologa muy similar a la de los cultivos, mimetizndose con ellos de tal manera que en muchas ocasiones plantas cultivadas y malezas presen-

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tan los mismos requerimientos fisiolgicos y nutricionales. Un ejemplo lo constituye la colza cultivada (Brassica napus), que crece junto a malezas del mismo gnero, como por ejemplo Brassica campestris. Esto implica un riesgo potencial por la posible hibridacin entre ambas. Sin embargo, muchas malezas consideradas como altamente nocivas no son necesariamente las ms exitosas desde el punto de vista evolutivo. Su carcter nocivo est asociado a una dificultad para su manejo o control y a una fuerte tendencia a deprimir el crecimiento y la produccin de los cultivos. El flujo gnico, en sus variadas formas, ha sido clave en la evolucin de las malezas. El accionar del hombre ha acelerado este proceso de transferencia gentica, principalmente como consecuencia de la aproximacin de especies distantes geogrficamente y de las modificaciones producidas en el hbitat, que determinaron la creacin de nuevos nichos para la sobrevivencia, persistencia y diseminacin de nuevos genotipos, productos de hibridacin. El desarrollo de cultivos resistentes a herbicidas (CRH) es otra de las vas que contribuy en el avance del control qumico de las malezas, debido a que ha generado una nueva estrategia de manejo. Un CRH es una variedad o biotipo de un cultivo que es resistente a la accin de un herbicida que normalmente resulta letal para las variedades tradicionales del mismo cultivo. La obtencin de CRH ha sido lograda a travs de procesos de seleccin o a travs de la insercin de genes en el genoma del vegetal que le confieren la propiedad de alterar o bloquear el sitio de accin donde acta el herbicida. Cultivos resistentes obtenidos por las dos vas mencionadas se emplean comercialmente en la Argentina. Un ejemplo del primer proceso es la obtencin de CRH de la familia de las imidazolinonas como el girasol Clearfield, resistente al herbicida imazapir (Clearsol). La seleccin de esta variedad se produjo en Kansas, Estados Unidos, donde los girasoles con tolerancia al herbicida fueron descubiertos bajo condiciones naturales del cultivo. El segundo proceso implica la obtencin de organismos genticamente modificados, en este caso particular, cultivos trans-

Figura 1: Soja RR(surcos a derecha e izquierda) y convencional (surco central) en ensayos de eficacia de aplicacin de herbicida a base de glifosato.

gnicos. Un ejemplo lo constituye la obtencin de resistencia al glifosato por la transferencia de un gen, que codifica para un producto que inhibe la actividad de la enzima EPSP sintetasa (Tabla 1), desde una especie de Agrobacterium al genoma de la soja. Este proceso de transferencia gnica dio como resultado la obtencin de la denominada soja RR (soja Roundup Ready) resistente a la accin herbicida del glifosato (Fig. 1). Posteriormente, dicho gen tambin fue introducido en el maz, generando el hbrido de maz RR (maz Roundup Ready), tambin resistente a glifosato. En este cultivo se ha obtenido tambin la variedad Liberty Link, resistente a glufosinato de amonio, herbicida no selectivo conocido comercialmente como Liberty. En este ltimo ejemplo, el gen incorporado codifica una enzima (fosfinotricin-N-acetil transferasa) que es la responsable de convertir al glufosinato en un metabolito inocuo para maz. El desarrollo de CRH ha generado un impacto econmico y biolgico de magnitud sobre la produccin agrcola, pudindose

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destacar los siguientes beneficios: - Amplan el espectro de malezas controladas, ya que se utilizan herbicidas no selectivos, como glifosato y glufosinato de amonio, que permiten el control de un extenso espectro de malezas, tanto anuales como perennes. - Reducen los daos al cultivo, dada su alta tolerancia a estos herbicidas y al no uso de otros herbicidas normalmente utilizados en cultivos no resistentes, que pueden ocasionar fitotoxicidad. - Un menor costo, debido al bajo precio de los herbicidas empleados y a la reduccin en el nmero de labores culturales y mecnicas, previas o durante el ciclo de crecimiento del cultivo. - Los herbicidas utilizados tienen baja residualidad en suelos y aguas, por lo que presentan escasas restricciones para la rotacin de cultivos, y adems baja toxicidad para el hombre y animales. - Las malezas controladas tienen bajo riesgo de adquirir resistencia, ya que tanto el glifosato como el glufosinato de amonio evitan el empleo de otros herbicidas de alto riesgo, como por ejemplo los inhibidores de ALS (Tabla 1). - Simplifican y flexibilizan el manejo del cultivo. La tecnologa asociada a los CRH no requiere de un entrenamiento especial por parte del productor y asimismo facilitan algunas de las prcticas relacionadas con el cultivo. Un ejemplo de ello es la prolongacin del perodo crtico para la aplicacin del herbicida en comparacin al de los herbicidas selectivos frecuentemente empleados en cultivos no resistentes, en el que dicho perodo suele ser muy limitado. Una prueba de las ventajas de esta tcnica la constituye el hecho de que el 92% de la totalidad de soja cultivada en la Argentina corresponde a soja RR. El uso de este cultivo resistente permite realizar tres o cuatro aplicaciones por ao del herbicida, lo cual elimina casi por completo la competencia de las malezas. No obstante, existen riesgos o amenazas potenciales que es importante considerar en el momento de decidir acerca del uso de los CRH, ellos son: - La aparicin de especies de malezas resistentes como consecuencia del uso conti-

nuo y repetido de un mismo herbicida, as como cambios en las poblaciones de malezas por el incremento de especies naturalmente tolerantes al herbicida. Si bien tanto el glifosato como el glufosinato de amonio tienen bajo riesgo de seleccionar biotipos de malezas resistentes (Tabla 1), existen casos probados en el mundo de la aparicin de resistencia. Asimismo, las especies naturalmente tolerantes encuentran nuevos nichos para su crecimiento y desarrollo y por lo tanto incrementan su frecuencia y abundancia. Un ejemplo de esto ltimo lo constituye la maleza iresine (Iresine difusa) informada por el INTA Oliveros como tolerante a glifosato y que surge como un nuevo problema en esta zona. - El uso de CRH y de los herbicidas asociados a ellos implica un impacto significativo sobre la composicin florstica de las malezas, ya que disminuyen la diversidad gentica de la comunidad (erosin gentica). - La aparicin de las denominadas supermalezas por la transferencia de los genes de resistencia desde los CRH a sus especies salvajes emparentadas a travs del polen. El fenmeno de hibridacin, por polinizacin cruzada, no es raro en la naturaleza y la probabilidad resulta mayor para las especies emparentadas. Ejemplos de cultivos considerados con riesgo de hibridarse con malezas cercanas son: el sorgo cultivado (Sorghum saccharatum) con la maleza sorgo de alepo ( Sorghum halepense) y el girasol (Helianthus annus) con el girasol silvestre (Helianthus petiolaris). Aqu es importante destacar que la transferencia horizontal de genes entre organismos taxonmicamente muy distantes es poco frecuente en la naturaleza pero muy relevante en trminos evolutivos. La produccin de plantas transgnicas acelera en ciertos aspectos la evolucin de las malezas, ya que la hibridacin representa un riesgo potencial de transferencia de la resistencia a herbicidas desde el cultivo hacia la maleza. La aparicin de CRH voluntarios en un predio donde no fueron sembrados y que, por lo tanto, se comportan como una maleza. El problema grave radica en su resistencia al herbicida empleado para el control. - Reduccin en el rendimiento (5 - 10 %) de algunas variedades o hbridos de CRH

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como consecuencia fundamentalmente de la adicin de genes extraos. Esto ha sido informado en algunos casos puntuales. - La contaminacin de cultivos por flujo gnico, especialmente los orgnicos, que se encuentran en predios aledaos mediante la polinizacin cruzada desde los cultivos transgnicos a los no transgnicos. - Riesgos ambientales por la persistencia de algunos de los herbicidas utilizados, como por ejemplo los pertenecientes a la familia de las imidazolinonas, que pueden acumularse en el ambiente y afectar la productividad y sustentabilidad del sistema agrcola. - Riesgo de reduccin en la exportacin de productos de origen transgnico como consecuencia del sentimiento antibiotecnologa que existe en los consumidores de varios pases de Europa. Hasta el momento, Argentina no ha tenido ninguna dificultad de acceso a los mercados de destino para sus exportaciones de soja transgnica y a pesar de las percepciones negativas de algunos consumidores, los diferenciales de precios entre la soja convencional y transgnica en el mercado mundial no penalizan a esta ltima, por lo que no es sorprendente que prcticamente toda la soja cultivada en el pas sea transgnica. Si consideramos los principales cultivos transgnicos en el mundo encontramos que en la actualidad la soja transgnica resistente a herbicidas es el mayoritario en 7 pases (Estados Unidos, Argentina, Canad, Mxico, Rumania, Uruguay y Sudfrica), ocupando una superficie de 41,4 millones de has en el mundo, lo que representa el 61 % del rea total ocupada por cultivos transgnicos que comprende 67,7 millones de has. Le sigue el maz Bt con 12,3 millones de has (13 % del rea total). El tercer cultivo de mayor importancia es la canola tolerante a herbicidas, con 3,6 millones de has (5 % del rea total) y se siembra en dos pases, Canad y Estados Unidos. Otros tres cultivos ocupan, cada uno, un 5 % de la superficie total y son maz tolerante a herbicidas e insectos (3,2 millones de has), maz tolerante a herbicidas (3,2 millones de has) y algodn Bt (3,1 millones de has). El algodn, tolerante a herbicidas e insectos, ocupa 2,6 millones de has (4%) y el algodn tolerante a herbicidas 1,5 milln (2%).

6 Manejo Integrado de Malezas: nica solucin sustentable Debido a que las malezas continuarn adaptndose a las diferentes metodologas de control, los agricultores siempre necesitarn de nuevas tcticas y estrategias. La biotecnologa ha realizado un valioso aporte al suministrar nuevas herramientas para el control de malezas, siendo los CRH la ms importante. Sin embargo, sera un grave error suponer que esta tcnica permitir anular el problema de las malezas en el futuro, ya que debemos enfatizar que todas estas tcnicas son slo herramientas de las que puede valerse el hombre en su afn y esfuerzo para controlar las malezas y que no existe una nica y fcil solucin. Un programa de Manejo Integrado de Malezas es un sistema de manejo que enfoca el problema de las malezas de una manera compatible con la preservacin de la calidad del ambiente, utilizando todas las tcticas y estrategias de control (tcnicas adecuadas y conocimientos existentes) con el objeto de reducir una poblacin de plantas indeseables a niveles tales que los perjuicios econmicos producidos se hallen por debajo de un umbral econmico aceptable para el sistema general de produccin. Este programa puede involucrar, en muchos casos, mtodos de control fsicos, qumicos, mecnicos, genticos y biolgicos juntamente con medidas preventivas y estudios bsicos sobre la biologa y ecologa de malezas. Es un sistema interdisciplinario, ya que no consiste simplemente en la aplicacin de una o dos medidas de control sino que abarca estrategias de control provenientes de varias disciplinas as como tambin involucra el entrenamiento de tcnicos y la extensin a los productores. Tanto la teora ecolgica como la experiencia prctica acumulada durante ms de 50 aos de intentar disminuir los daos ocasionados por las plagas indican que una nica herramienta de control (por ejemplo los CRH) es una solucin slo temporal para el problema de las malezas. Un manejo integrado de malezas, en el que mltiples estrategias son implementadas de una manera racional, es la nica solucin en el marco de un manejo sustentable del sistema productivo.

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VIII.-Captulo 12

Outlook to 2005: an impending crisis predice que si la crisis del agua contina, cabra esperar para el 2025 una reduccin de 350 Tolerancia a factores abiticos millones de toneladas mtricas en la produccin de granos, lo cual representa un poco Puebla, Andrea F.; Del Viso, Florencia ms de la produccin actual de Estados Unidos. Como resultado, el precio del arroz incrementara en un 40%, el del trigo en un 1 Introduccin 80% y el del maz en un 120 % si se considera la demanda actual. Dado que la agricultura La radiacin, la temperatura, el agua y los consume el 70 % de toda el agua utilizada nutrientes son factores del medio ambiente por el hombre, resulta obvio que la mejor que afectan el crecimiento y el desarrollo de forma de ahorrar agua es a travs de la las especies vegetales. La distribucin de las implementacin de prcticas agrcolas que plantas sobre la tierra depende, por lo tan- tiendan a reducir el consumo. Una forma es to, de la existencia e intensidad de estos fac- la reduccin del riego mediante la creacin tores. Para alimentar a una poblacin futura de plantas resistentes a sequa, otra es la disde 8 billones de habitantes con las prcticas minucin en el uso de insecticidas mediante agrcolas actuales se requerira de un incre- la utilizacin de estrategias de control biolmento del 12 % en la cantidad de tierras cul- gico contra insectos (ver VIII.10) y plantas tivables (Fig. 1), lo cual ser imposible dada tolerantes a herbicidas (ver VIII.11). Estas dos ltimas estrategias tambin reducen el riesla densidad demogrfica esperada. go de contaminacin de las fuentes de agua potable disponibles Levitt (1980) define a los estreses ambientales como cambios en las condiciones del medio que reducen o cambian desfavorablemente el crecimiento o desarrollo de las plantas. Los estreses ambientales provocan en las plantas respuestas complejas y constituyen un problema fundamental para la agricultura, ya que influyen sobre la supervivencia y la productividad de los cultivos. Estas respuestas se manifiestan a nivel celular, fisiolgico y del desarrollo (Levitt, 1980) y son caracteres de variacin continua (cuantitativos), controlados por un importante nmero de Fig. 1: La cantidad de tierra destinada a la agricultura, calculada en genes aditivos y probablemente acres/persona ha ido disminuyendo paulativamente. Se estima que sinrgicos (Bohnert y col., 1995). Se para alimentar a una poblacin futura de 8 billones de habitantes, ha visto, por ejemplo, en estudios con las tecnologas actualmente en uso, se requerira de un citogenticos, que al menos diez de incremento de un 12 % en la cantidad de tierra cultivables. Gentileza los veintin pares cromosmicos en Prof. Germn Spangenberg. el trigo estn comprometidos en la respuesta a las bajas temperaturas (Sutka y Por otro lado la agricultura es la principal Vesz, 1988). consumidora de agua en el mundo, uno de Los genes inducidos bajo condiciones de los recursos ms limitantes para el futuro. Las estreses abiticos, tales como las bajas temreservas de agua del planeta han ido dismiperaturas, la salinidad y la sequa, codifican nuyendo a medida que los consumos han ido protenas que tienen funciones de sealizaaumentado con el crecimiento de la humanicin, transduccin de seales y proteccin dad y las prcticas agrcolas (Fig. 2). Un inforcelular, como por ejemplo, protenas constime reciente de IIPRI (2002) Global Water tuyentes de canales de agua que alteran el

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indica que los receptores con caractersticas de proten-kinasas y las histidin-kinasas de dos componentes seran buenos candidatos para cumplir la funcin de sensores potenciales de estas seales de estrs (Xiong y Zhu, 2001). Receptores tipo protenkinasas (RTK): se encuentran tanto en animales como en plantas y estn estructuralmente compuestos por un dominio extracelular, que funciona por unin a un ligando o por interaccin protena-protena, por un dominio transmembrana y por un dominio kinasa intraceFig. 2: Las reservas de agua del planeta son limitadas, siendo la agricultura la principal consumidora de agua en el mundo. Los consumos lular. Las RTK de plantas son tamhan ido aumentado con el crecimiento de la humanidad y las prcticas bin responsables de respuestas agrcolas. Gentileza Prof. Germn Spangengenberg. a patgenos estando adems involucradas en el desarrollo. Espotencial agua celular, enzimas requeridas tas kinasas deberan ser constitutivas, consipara la sntesis de sustancias protectoras derando las rpidas respuestas celulares (azcares, prolina y betana), desaturasas (como las respuestas a inositol-P y Ca 2+) cuanlipdicas para modificar la composicin de las do las plantas son expuestas a un estrs membranas celulares, protenas protectoras (Hong y col., 1997). como las de tipo LEA (Late Embryogenesis Sistema de dos componentes tipo Abundant o protenas abundantes en la histidin-kinasas: en estos sistemas cuando el embriognesis tarda), protenas anticonge- sensor extracelular percibe la seal, una lantes, chaperonas, proteasas y enzimas histidina del dominio citoplasmtico se detoxificantes como la catalasa y la ascorbato autofosforila y el residuo fosfato es pasado peroxidasa. a un aspartato aceptor, en una respuesta regulatoria que se acopla a una cascada de2 Seales para la respuesta a estreses pendiente de MAP kinasas ( Mitogen abiticos activated), o por fosforilacin directa de blancos especficos que inician la respuesta celuLa hiptesis de sealizacin actual postu- lar. Se ha demostrado que, en cianobacterias, la que las seales ambientales son percibidas la fluidez de la membrana podra actuar como primero por receptores especficos, que con el primer sensor para las bajas temperaturas su activacin inician o suprimen una cascada y es el disparador de histidin-kinasas que mode transduccin de seales intracelulares dulan la expresin de genes de desaturasas y, en muchos casos, activan factores de trans- (Murata y Los, 1997; Suzuki y col., 2000). cripcin nucleares, que inducen la expresin de grupos especficos de genes. 2.1 Segundos mensajeros Una forma comn de seal de iniciacin es la fosforilacin de protenas acoplada a Numerosos estudios sugieren que el Ca2+ receptores. Aunque todava no se han de- forma parte de varios procesos de sealizaterminado con certeza en plantas ninguno cin intracelular (revisin de Sanders y col., de los receptores de respuesta al fro, sequa 1999; rvar y col., 200; Sangwan y col., 2001). o de ABA (cido abscsico, la hormona rela- La concentracin intracelular de Ca2+ se encionada al estrs), el conocimiento reciente cuentra firmemente controlada: el Ca 2+ de una va de sealizacin de estrs salino citoslico se encuentra en bajas concentra-

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ciones, aunque luego de la estimulacin se libera de las reservas intracelulares o entra en la clula a travs de varios canales. El Ca2+ extracelular puede entrar en la clula por cambios de voltaje, operado por receptores, o a travs de canales especficos. El Ca 2+ intracelular puede liberarse a travs de canales sensibles a mensajeros ligandos o a segundos mensajeros, entre los que se incluyen a los inositol polifosfatos y la ADP-ribosa cclica (cADPR) (Fig. 3). 3 Induccin de genes en respuesta al estrs Los genes inducidos por estrs incluyen

genes de respuesta temprana y genes de respuesta tarda. Los primeros son inducidos en pocos minutos y a menudo transitoriamente. Su induccin no requiere de sntesis de nuevas protenas, ya que estos componentes de sealizacin seran constitutivos. En contraste, los genes de respuestas tardas son activados ms lentamente (en horas) y su expresin es generalmente sostenida durante el tiempo en que el estrs se encuentra actuando. Los genes tempranos codifican factores de transcripcin que activan a los genes de respuesta tarda, que constituyen la vasta mayora de los genes inducidos por estrs (Figura 3).

Figura 3: Vas principales de sealizacin en plantas en respuesta a estreses abiticos (Fro, Sequa y Salinidad). La va I de sealizacin involucra la produccin de antioxidantes y osmolitos involucrando la transduccin de seales a travs de MAP kinasas. La va II involucra la produccin de diferentes tipos de protenas (tipo LEA y otras) y est mediada por CDPK. La va III involucra a la va SOS, especfica del estrs inico. No se detallan las molculas de sealizacin o segundos mensajeros.

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4 Genmica de la tolerancia a estreses ambientales Los recientes avances en el estudio molecular y gentico de las respuestas a estreses abiticos llevaron a la identificacin de un gran nmero de loci cualitativos nicos, QTL, y genes relacionados con la tolerancia a estreses abiticos. Estos nuevos conocimientos posibilitarn modificar la forma de seleccionar en el mejoramiento de cultivos importantes, desde una seleccin fenotpica a una genotpica (a travs de seleccin asistida por marcadores), aumentando as las posibilidades de mejoras genticas en los cultivos. Como se mencion anteriormente, la tolerancia a estreses ambientales no depende de un nico gen sino que es un carcter polignico, de variacin continua. Recientemente se construyeron mapas que contienen los determinantes que afectan la tolerancia a estreses abiticos en las Triticeae (Cattivelli y col., 2002). Se demostr que el grupo de cromosomas 5 en trigo contiene la concentracin ms alta de loci que controlan la adaptacin de la planta al ambiente, particularmente los relacionados con la tolerancia a las heladas y a la salinidad, mientras que una regin del cromosoma 7 es crucial en la tolerancia a la sequa (Cattivelli y col., 2002). Se identific un locus en el cromosoma 5A de trigo, Vrn-Fr1, que tiene un importante efecto en la tolerancia a las heladas (Galiba y col., 1995). Las variedades de invierno poseen el alelo vrn1, y son ms tolerantes a las bajas temperaturas que las variedades de primavera que poseen el alelo Vrn1. Tambin se demostr que las diferencias en la tolerancia a las bajas temperaturas encontradas entre distintas variedades de invierno pueden ser explicadas, en algunos casos, por las diferencias en este locus (Storlie y col., 1998). Actualmente se conocen dos genes, VRN1 y VRN2 presentes en este intervalo, los cuales estn directamente involucrados en la respuesta a la vernalizacin en el trigo diploide (Triticum monoccocum) (Law y col., 1975; Dubcovsky y col., 1998: Tranquilli y col., 2000). En sorgo se construyeron varios mapas de ligamiento utilizando RFLP y otros marcadores moleculares (Xu y col., 1994; Taramino y col., 1997; Kong y col., 2000) y se identifica-

ron tambin varios QTLs con efectos significativos en la tolerancia a la sequa (Tunistra y col., 1997). Las nuevas tecnologas para el anlisis genmico (microarreglos de ADN, gentica directa y reversa) produjeron una revolucin en el anlisis gentico de las especies y permitieron cambiar el enfoque en el anlisis, yendo desde estudios de un solo gen a estudios que abarcan todo el genoma. Utilizando tanto macro como microarreglos de ADN (Lin y col., 2003; Seki y col., 2001, 2002a, 2002b; Kawasaki y col., 2001; Oono y col., 2003) se estudiaron genes inducidos o suprimidos en condiciones de estrs abitico (fro, sequa, salinidad). La mayor parte de estos estudios se realizaron en Arabidopsis debido al hecho, entre otros factores, de que su genoma ha sido completamente secuenciado, facilitando as la construccin de los microarreglos y el anlisis de las secuencias obtenidas. Los resultados de estos trabajos indicaran la existencia de una mayor interseccin entre las vas de sealizacin de ABA, sequa y salinidad, comparada con las vas en comn entre ABA y fro (Seki y col., 2002b). A partir de estos estudios tambin se identificaron numerosos genes que son inducidos por uno solo de los tratamientos, los cuales se clasificaron como especficos de cada respuesta. Los resultados obtenidos hasta el momento permiten sugerir que la tecnologa de microarreglos ser de mucha utilidad para el aislamiento de nuevos genes, para el estudio de perfiles generales de expresin tejido-especfico ante distintas condiciones de estrs abitico y tambin para la identificacin de genes y potenciales elementos en cis de factores de transcripcin. 4.1 Tolerancia a las bajas temperaturas Las especies vegetales adaptadas a regiones templadas del planeta varan durante transcurso del ao en su habilidad para sobrevivir a las bajas temperaturas. Las plantas capaces de aclimatarse al fro perciben las bajas temperaturas sobre cero durante el avance del invierno y disparan procesos bioqumicos especficos que resultan en la tolerancia, an, de temperaturas de congelamiento (Thomashow, 1999).

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La aclimatacin al fro est asociada a la expresin de novo de genes, sntesis de protenas y varios cambios fisiolgicos (Guy, 1990). Los mecanismos que contribuyen a la tolerancia incluyen la prevencin de la desnaturalizacin de protenas inducida por bajas temperaturas, la prevencin de la precipitacin de molculas y la atenuacin de las consecuencias de la formacin de hielo intercelular. Muchos estudios indican que en las plantas los sistemas de membranas de la clula son los primeros sitios daados por el congelamiento (Levitt, 1980; Steponkus, 1984). Entre estos daos se incluyen la lisis celular inducida por expansin, las transiciones de los lpidos de membrana (de laminares a fase hexagonal II) y las lesiones por fracturas. Los mecanismos involucrados en la estabilizacin de las membranas celulares en respuesta al fro son mltiples. Los ms importantes seran los cambios en la composicin de lpidos, aunque tambin se ha observado la acumulacin de solutos compatibles (molculas que pueden acumularse en la clula sin modificar el metabolismo central) en clulas de plantas sometidas tanto a estrs por fro como por sequa. La acumulacin de sacarosa y otros azcares, que tpicamente ocurre en plantas tolerantes durante la aclimatacin, parece contribuir a la estabilizacin de las membranas. Estas molculas demostraron proteger in vitro a las membranas durante el congelamiento (Strauss y Hauser, 1986; Anchordoguy y col., 1987). En muchas especies de gramneas de clima templado se ha observado la acumulacin de fructanos, polmeros de fructosa, cuando las plantas son expuestas a bajas temperaturas sobre cero. El incremento en el contenido de estos polmeros parece estar relacionado al proceso de aclimatacin a las bajas temperaturas (Pontis, 1989; Tognetti y col., 1989; Santoiani y col., 1993; Puebla y col., 1997,1999a). El metabolismo de los fructanos en gramneas ha sido estudiado en su mayor parte en cereales de importancia agronmica y se lo ha sealado como uno de los mecanismos de tolerancia a bajas temperaturas. En la Argentina existen especies nativas que estn adaptadas a ambientes de climas rigu-

rosos y son tolerantes a condiciones severas de estrs abiticos. Bromus pictus, por ejemplo, es una especie distribuida en las estepas ridas de la meseta patagnica, donde las bajas temperaturas imperan en la mayora de los das del ao (la temperatura media en julio es de 1,9C) y las precipitaciones promedio slo llegan a los 168 mm anuales. Esta especie contiene elevados niveles de fructanos en sus tejidos y una creciente actividad de fructosil-transferasas, enzimas responsables de la sntesis de estos azcares, cuando las plantas son tratadas con bajas temperaturas. Los genes que codifican estas enzimas fueron aislados recientemente y, a travs de la transformacin de tejidos heterlogos con los mismos, fue posible estudiar la funcin de estos azcares en la tolerancia a fro (Puebla y col., 1999b). 4.1.1 Identificacin y caracterizacin de genes de tolerancia a fro Numerosos genes inducibles por bajas temperaturas y sus promotores han sido aislados y caracterizados en varias especies vegetales, incluyendo alfalfa, Arabidopsis, cebada y trigo. Una gran parte de estos genes codifican protenas de funcin conocida, que contribuyen a la tolerancia a las bajas temperaturas. Por ejemplo, el gen de Arabidopsis FAD8 codifica una desaturasa de cidos grasos que alterara la composicin lipdica de las membranas. Tambin se conocen genes de chaperonas en espinaca y Brassica napus que responden a las bajas temperaturas y genes regulados por fro que intervienen en la transduccin de seales (Fig. 3). Sin embargo, muchos genes inducidos durante la aclimatacin a bajas temperaturas codifican protenas de funcin desconocida. Muchas de stas presentan homologa con las protenas LEA, ya mencionadas. Los polipptidos LEA son sintetizados en la semilla durante la embriognesis tarda antes de la desecacin y tambin en plntulas, en respuesta a la deshidratacin. Estas protenas son altamente hidroflicas, tienen una composicin simple de aminocidos y en muchas se predicen regiones capaces de formar -hlices anfipticas. Otras protenas, de funcin desconocida, que no se encuentran agrupadas con las LEA,

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son las codificadas por genes COR (cold resistant o resistente a fro), tambin designados LT1, KIN, RD y ERD, de Arabidopsis. Estas protenas tambin presentan regiones con capacidad para formar -hlices anfipticas que podran tener roles en la estabilizacin de las membranas durante las bajas temperaturas. Algunos de estos genes, bajo promotores constitutivos (35S CaMV), han sido utilizados para transformar plantas susceptibles a fro y se han realizado estudios de adquisicin de tolerancia a estrs con las plantas transgnicas obtenidas. Los resultados sugieren que la tolerancia a bajas temperaturas depende de varios genes de tolerancia y no de un gen particular. 4.2 Regulacin de la respuesta a la aclimatacin: el reguln CBF Los estudios iniciales de la expresin de genes regulados por fro establecieron que algunos promotores de estos genes eran activados en respuesta a bajas temperaturas y sequa. Los anlisis posteriores determinaron que en Arabidopsis existen elementos regulatorios en los promotores de estos genes: las repeticiones C (CRT) en el elemento DRE (elemento que responde a sequa) que estimulan la expresin de genes en respuesta a las bajas temperaturas, a la sequa y a la salinidad. Se identificaron poco despus activadores transcripcionales que se unen a estos elementos CRT/DRE. Las protenas que codifican contienen un dominio de unin al ADN tipo AP2/EREBP y estn codificadas por genes que se encuentran en tandem sobre el cromosoma 4 de esta especie. La expresin constitutiva de estos activadores transcripcionales bajo el promotor 35S del CaMV en plantas transgnicas de Arabidopsis induce la expresin de mltiples genes regulados por bajas temperaturas que poseen los elementos CRT/DRE, sin mediar ningn estmulo de fro. 5 Tolerancia al estrs hdrico La disponibilidad de agua es el factor abitico ms importante que modela la evolucin de las plantas. El estrs hdrico, en su sentido ms amplio, incluye tanto a la sequa como a

la salinidad. Estos estreses, junto al fro, constituyen problemas cruciales para la agricultura, ya que impiden a los cultivos desarrollar su mximo potencial gentico. El estrs hdrico generalmente inhibe el crecimiento celular y las evidencias indirectas sugieren que existen seales de divisin celular y expansin relacionadas con las kinasas dependientes de ciclinas (CDPK) (Zhu, 2002). Las plantas sufren deshidratacin o estrs hdrico, no slo durante la sequa o las altas concentraciones de sales sino tambin durante condiciones de bajas temperaturas. Durante la exposicin de las plantas a temperaturas de congelamiento la formacin de hielo extracelular impone una fuerza deshidratadora a la solucin no congelada intracelular. La formacin de hielo lleva a una rpida concentracin de los solutos extracelulares y el cambio de potencial qumico y osmtico provoca que el agua lquida se mueva hacia fuera de la clula. Tanto la sequa como la salinidad afectan virtualmente cada aspecto de la fisiologa de una planta y su metabolismo. Considerando la complejidad de las respuestas encontradas bajo estos estreses, no es sorprendente que una gran proporcin del genoma est sujeto a regulacin, como lo demuestran algunos trabajos de microarreglos de ADN. Por ejemplo, en la levadura unicelular Saccharomyces cerevisiae, la tolerancia a estrs salino afecta aproximadamente al 8% de los genes de todo el genoma (Posas y col., 2000; Rep y col., 2000). Las respuestas adaptativas al estrs pueden clasificarse de la siguiente manera: a) El control de la homeostasis, que incluye homeostasis inica y la osmtica. b)El control del dao y la reparacin o detoxificacin. c) El control del crecimiento. La seal de homeostasis regula negativamente la respuesta de detoxificacin y estas dos inducen la tolerancia al estrs, que regula negativamente la inhibicin del crecimiento provocada por la aparicin de las condiciones ambientales adversas. La respuesta de las plantas a la alta salinidad se dispara cuando se produce un aumento intracelular de Na+. La seal de

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estrs hdrico incluira posiblemente un cambio de turgencia que provoca el cierre de los estomas, la expresin y/o activacin de enzimas de sntesis de osmolitos y la de sistemas transportadores de stos y de agua. Los genes involucrados en la homeostasis hdrica incluyen los genes de acuaporinas, los genes de enzimas de biosntesis de osmolitos, de cotransportadores de sentido contrario (antiporters) de Na+/H+ asociados a membrana plasmtica para la extrusin de Na+, de antiporters de Na+/H+ para la compartimentalizacin de Na+ en la vacuola y de transportadores de K+ con alta afinidad para la adquisicin de K+. La seal de detoxificacin se disparara ante la desnaturalizacin proteica y la presencia de especies reactivas de oxgeno. La respuesta incluye la hidrlisis de fosfolpidos, cambios en la expresin de protenas tipo LEA/dehidrinas, de chaperonas moleculares y proteasas que remueven las protenas desnaturalizadas, as como la activacin de enzimas responsables de la remocin de especies reactivas de oxgeno, de protenas relacionadas con la ubiquitinacin y de otras protenas detoxificantes. 6 La va SOS (Salt Overly Sensitive o sensible al exceso de salinidad) de tolerancia a la salinidad El estrs salino quiebra la homeostasis inica de las plantas provocando un exceso txico de Na+ en el citoplasma y una deficiencia de iones esenciales como el K+. El clonado y la caracterizacin bioqumica de varios genes y productos de genes SOS (Salt Overly Sensitive) ha permitido establecer recientemente una va de sealizacin para la regulacin de la homeostasis inica y la tolerancia a la salinidad en Arabidopsis. Esta va se dispara por un aumento intra o extracelular de Na + y provoca una seal citoplasmtica de calcio que induce la expresin y cambios de actividad de transportadores de iones como el Na+, K+ y H+. La va contiene tres genes principales llamados SOS1, 2 y 3 (Zhu, 2000) (Fig. 3). El estrs salino provoca una seal citoslica de Ca 2+. Una protena que se une a Ca 2+ , codificada por SOS3 percibe presumiblemente esta seal y desencadena

la respuesta. SOS3 interacta y activa a SOS2, una serin-treonin kinasa y estas dos a su vez regulan la expresin y la actividad de SOS1, un efector de la tolerancia a la salinidad, que codifica un cotransportador de sentido contrario (antiporter) Na+/H+ de la membrana plasmtica. SOS3 es una protena miristoilada, lo que facilita que sta y sus protenas asociadas (tipo SOS2) interacten con la membrana, donde se encuentran ubicados sus transportadores blanco. SOS3 tambin parece interactuar con protenas que median la induccin de la biosntesis de ABA. SOS2 representa una nueva familia de proten-kinasas slo encontradas en plantas que contienen un dominio cataltico y otro regulatorio que interacta con SOS3. SOS1 es un cotransportador de sentido contrario (antiporter) Na+/H+ de la membrana plasmtica con una larga cola que estara inmersa en el lado citoplasmtico y que podra funcionar como sensor de los solutos que transporta. 7 El cido abscsico (ABA) y la tolerancia a estrs El ABA posee muchas funciones durante el crecimiento y desarrollo de las plantas, pero la principal funcin es la de regular el balance de agua y la tolerancia a estrs osmtico. Los patrones de expresin de los genes inducibles por estreses abiticos son complejos y muchos de ellos son inducidos tambin por la aplicacin exgena de ABA. Existen, sin embargo, algunos genes inducibles por estreses abiticos que no responden a esta hormona. Esto sugiere que entre la seal inicial de sequa, salinidad o estrs por fro y la expresin de genes especficos existen cascadas de seales de transduccin dependientes e independientes de ABA. La acumulacin de ABA inducida por estrs osmtico es una combinacin de la activacin de su sntesis y de la inhibicin en su degradacin. Aunque nada se sabe de la sealizacin entre la percepcin del estrs y la induccin de los genes de biosntesis, el conocimiento actual sugiere que estn involucradas seales de Ca 2+ y cascadas de fosforilacin de protenas (Zhu, 2003). En girasol fue descripta una familia de factores de transcripcin caractersticos de plan-

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tas que contienen un homeodominio leucine-zipper (cremallera de leucina) (Chan y Gonzlez, 1994; Chan y col., 1998). Estas protenas pueden unirse al ADN debido a la presencia de una secuencia altamente conservada, conocida como homeodominio, que se encuentra en muchos genes de eucariotas que se expresan durante el desarrollo (Valle y col., 1997). La familia de factores de transcripcin descripta en girasol incluye protenas

raturas revelaron la presencia de un elemento ABRE. Estos genes se expresan en respuesta a ABA, demostrando que las vas regulatorias de fro y las dependientes de ABA se cruzan en algn punto de la seal de transduccin (Shinozaki y YamaguchiShinozaki, 1997). 8 Plantas transgnicas tolerantes a estreses abiticos En muchos pases se investiga activamente la adquisicin de tolerancia a factores ambientales adversos en especies agronmicamente importantes transformadas con genes que codifican para protenas de tolerancia a estreses abiticos, muchas de las cuales ya se encuentran en etapa de experimentacin a campo (Tabla 1). 9 Conclusiones finales

Tabla 1: Plantas transgnicas conteniendo genes de tolerancia a estreses abiticos (fro, sequa, salinidad) en etapa de experimentacin o de pruebas experimentales a campo en pases en vas de desarrollo. (fuente:http:// www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp)
Tolerancia a estreses abiticos Especie Bajas temperaturas Papa Tomate Trigo Arroz Maz Sorgo Tabaco Trigo Arroz Caa de azcar Trigo Pases Bolivia China India Bangladesh, Brasil, China, India, Pakistn, Tailandia China China Argentina Egipto China, Indonesia, Sudfrica, Tailandia Indonesia Croacia

Salinidad

Sequa

involucradas en el desarrollo temprano de las plntulas y otras que participan en la respuesta a sequa. Hahb-4 es un gen de esta familia que mostr estar fuerte y reversiblemente inducido por estrs hdrico y por ABA. La regin promotora de Hahb-4 contiene secuencias consenso presentes en elementos de respuesta a ABA (ABRE), sugiriendo que este gen funciona en la cascada de sealizacin que controla en girasol la respuesta al estrs hdrico mediada por ABA (Gago, 2002). Plantas de Arabidopsis transformadas con este gen mostraron un aumento importante en la tolerancia a estrs hdrico (Chan, comunicacin personal). Estudios de la expresin de genes inducidos por fro en mutantes de Arabidopsis deficientes en ABA (aba) e insensibles a ABA (abi) demostraron que la expresin de genes de fro se encuentra mediada por vas dependientes e independientes de ABA (Ingam y Bartels, 1996; Shinozaki y YamaguchiShinozaki, 1997). Los genes que contienen los elementos CRT/DRE estan relacionados con la va independiente de ABA. Algunos de los genes que responden a bajas tempe-

Las investigaciones en el campo de la tolerancia a factores ambientales adversos tuvieron un desarrollo importante en la ltima dcada. Se identificaron genes y protenas con roles en la tolerancia a fro, sequa y salinidad, se determinaron muchos de sus mecanismos de accin y se avanz en el conocimiento de cmo se desencadenan y activan las respuestas de las clulas vegetales ante estos estreses y sus interrelaciones. Las nuevas tecnologas (micro y macroarreglos de ADN, transformacin gentica de plantas) prometen brindar nuevos descubrimientos, fundamentales para entender cmo las especies vegetales son capaces de adaptarse a un ambiente siempre cambiante. Lecturas Recomendadas
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Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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VIII.- Captulo 13
Aproximacin biotecnolgica integrada para un manejo sustentable del estrs bitico en frutilla
Castagnaro, Atilio Pedro; Salazar, Sergio Miguel; Zembo, Juan Carlos Daz Ricci, Juan Carlos Introduccin La frutilla cultivada (Fragaria x ananassa: 2n=8x=56) es un poliploide con 56 cromosomas resultante de la hibridacin interespecfica entre dos especies de frutillas silvestres, tambin octoploides. Una de estas frutillas es originaria del sur (F. chiloensis: 2n=8x=56) y la otra del norte de Amrica (F. virginiana: 2n=8x=56). La x en el nombre cientfico hace referencia a su condicin de hbrido. Se trata de un importante fruto que se consume en fresco o industrializado y que es muy apreciado en prcticamente todo el mundo. Su cultivo involucra dos actividades agronmicas bien diferenciadas: la produccin de frutas y la viverstica, las cuales generan una gran demanda de mano de obra (alrededor de 500 jornales /Ha /ao), por lo cual en muchos pases es considerado tambin como un cultivo social. Si bien se realiza mejoramiento gentico en distintos lugares de Asia, Europa y Norte Amrica, el mercado de variedades est dominado por empresas estadounidenses. En Argentina, a partir de 1996 comenz a funcionar, en forma organizada, el Programa Nacional de Mejoramiento Gentico de la Frutilla (Pro\Frutilla) a travs de una iniciativa interinstitucional (sectores pblico y privado) e interdisciplinaria (combina el mejoramiento gentico convencional con los mtodos surgidos de la biotecnologa molecular), que en 1999 represent a nuestro pas en la exposicin Flanders Technology InternationalTechnoland, en Gante, Blgica. El objetivo general del Pro\Frutilla es obtener cultivares argentinos adaptados a por lo menos dos agroecosistemas o ambientes de seleccin (el subtropical de Lules en Tucumn y el templado del cinturn hortcola del Gran La Plata, en Buenos Aires), con resistencia incrementada a estrs de origen

bitico que permita evolucionar hacia una agronoma menos reida con la salud humana y ambiental (principalmente sin bromuro de metilo) y para que empresas viveristas locales puedan aprovechar las ventajas comparativas de exportacin de plantines de gentica nacional en contraestacin con los pases del hemisferio norte. Reconocimientos En este captulo se describen en forma resumida los trabajos realizados y los logros obtenidos con este programa donde, adems de los autores, participaron los siguientes investigadores (en orden alfabtico): Marta Arias, Elsa Camadro, Nadia Chalfoun, Paula Filippone, Gabriela Garca, Hugo Lzaro, Cecilia Lemme, Alicia Ins Maman, Gustavo Martnez Zamora, Luis Mroginski, Marta Ontivero, Graciela Terada, Ursula Tonello y Gabriel Vellicce. 1 Mejoramiento gentico El Pro\Frutilla se basa en un esquema de seleccin recurrente (Fig. 1) delimitado por tres niveles de domesticacin: 1) Poblaciones Comerciales, representadas en la Figura 1; 2) Poblaciones Intermedias o Tampones, donde se intenta llevar a cabo hibridaciones interespecficas; 3) Poblaciones Silvestres, en las cuales se realizan cruzamientos dentro de cada especie y/o nivel de ploida. En una primera etapa, se realizaron recolecciones y se estableci un Banco de Germoplasma activo, constituido por genotipos de especies silvestres ( Fragaria vesca : 2n=2x=14; F. chiloensis: 2n=8x=56; Duchesnea indica: serie poliploide 2n=8x y 10x=56 y 70, respectivamente) y de la cultivada F. x ananassa. Estudiando caracteres citogenticos, morfolgicos y anatmicos pudo identificarse una nueva especie silvestre, Potentilla tucumanensis (2n=2x=14), que es endmica del Noroeste Argentino y se encuentra en peligro de extincin. Esta especie fue clasificada de manera errnea a principios del siglo XX como Potentilla

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norvegica, especie decaploide tpica de los pases nrdicos. Paralelamente a la caracterizacin bot-

En la actualidad, se dispone de dos genotipos promisorios en etapas avanzadas de evaluacin y seleccin clonal, llamados 96/

Figura1. Esquema de seleccin recurrente seguido en las poblaciones comerciales (mayor nivel de domesticacin)

nica, en el marco de las mencionadas Poblaciones Intermedias (2) y siguiendo un esquema diallico incompleto, se realizaron 500 cruzamientos interespecficos entre accesiones silvestres de Fragaria vesca, Duchesnea indica, Potentilla tucumanensis y 9 genotipos de la cultivada F. x ananassa. Este estudio permiti detectar barreras pre y poscigticas de aislamiento reproductivo entre estas especies. A fin de conocer la naturaleza de las barreras, se investig el crecimiento del tubo polnico en el pistilo utilizando microscopia de fluorescencia (Fig. 2) y se realizaron estudios histolgicos de aquenios. Este conocimiento permitir disear estrategias que posibiliten la transferencia de genes de inters agronmico desde los genotipos silvestres a los domesticados.

6-5 y 96/6-6, donde el nmero anterior a la barra, indica el ao de cruzamiento (en este caso 1996), el que le sigue indica la familia o cruza, en este caso cv. Chandler x cv. Oso Grande) y el ltimo nmero es arbitrario y responde a un ordenamiento interno del programa. 2 Cultivo in vitro de meristemas, micropropagacin y evaluacin de la variacin somaclonal Debido a que el cultivo de meristemas posibilitara sanear la mayor parte de las virosis, no se ha profundizado demasiado en el estudio y caracterizacin de los virus que afectan a la frutilla y desde un punto de vista agronmico estas enfermedades no estn dentro de los principales problemas del cultivo. Este mismo razonamiento podra aplicarse para la enfermedad sistmica (bacteriosis) provocada por Xanthomonas fragariae. Se estudiaron las condiciones de cultivo in vitro para sanear y multiplicar diferentes genotipos de frutilla, entre ellos el cultivar Camarosa, que es la variedad ms cultivada en el mundo. A su vez y mediante caracteri-

Figura 2. Compatibilidad del cruzamiento. Incompatible: el grano permanece sin germinar en el estigma (izda.). Compatible: varios granos de polen crecen a travs del estilo (centro). Medianamente compatible: Slo unos pocos granos de polen atraviesan el estilo (dcha.).

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CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DAZ RICCI, J.C.

zacin fenotpica y marcadores genotpicos del tipo RAPD (del ingls Randomly Amplified Polymorphic DNA), se investig la eventual induccin de variacin somaclonal en ciclos sucesivos de multiplicacin de este cultivar. La tasa de multiplicacin de las plantas in vitro fue evaluada utilizando dos formulaciones salinas en el medio de cultivo (N30K y MS) y diferentes concentraciones de cinetina (0,25, 0,5 y 0,75 mg/L). La mejor tasa de multiplicacin se obtuvo en el medio N30K suplementado con 0,25 mg/L de cinetina, sin que se detectara variacin somaclonal despus de tres ciclos sucesivos multiplicacin. Este resultado nos permiti proponer por primera vez el uso de un procedimiento para el saneamiento y la micropropagacin comercial de la variedad Camarosa. 3 Interaccin planta-patgeno A diferencia de otros productos agroalimentarios, las hortalizas se consumen mayoritariamente en fresco, lo que implica que no pueden llevar residuos de pesticidas. Por otro lado, la prctica agronmica deber evolucionar, indefectiblemente, hacia nuevos sistemas productivos que minimicen la utilizacin de agroqumicos sintticos. El problema principal del cultivo de la frutilla son las enfermedades fngicas. El manejo de estas enfermedades, donde una de las ms importantes es la antracnosis (Colletotrichum sp.), involucra el uso masivo de pesticidas contaminantes como el bromuro de metilo, que adems de ser txico destruye la capa de ozono, y cuya eliminacin ya fue pautada desde Naciones Unidas. En este contexto el Pro\Frutilla est llevando a cabo una investigacin bsica que permita desarrollar estrategias de biocontrol. Para ello: 1) En primer lugar, se aislaron los agentes etiolgicos locales de las enfermedades ms importantes (especies pertenecientes a los gneros: Colletotrichum, Botrytis, Micophaerella, Xanthomonas, etc.) y se optimizaron metodologas de infeccin controlada que posibilitaron la evaluacin fenotpica certera de la resistencia/ susceptibilidad de los materiales fitotcnicos del Banco de Germoplasma del Pro\Frutilla.

Figura 3. La previa inoculacin con un patgeno avirulento desencadena una respuesta defensiva de proteccin cruzada contra el patgeno virulento (izda.). Planta control infectada con un patgeno virulento (dcha.).

2) Se caracterizaron los hongos patgenos del gnero Colletotrichum relacionados con la enfermedad de la antracnosis. Esto permiti detectar una respuesta sistmica de proteccin cruzada desencadenada por un patgeno avirulento, que adems puede ser inducida por el microorganismo (patgeno) inactivado y/o por extractos del mismo, lo que puede tener tanto implicancias conceptuales como biotecnolgicas (Fig. 3). Los estudios histopatolgicos
Tabla1:

ESPECIE

EC50 (uM)

Bacterias Gram positivas Clavibacter michiganensis Staphylus aureus Enterococcum faescium CRL 35 Bacillus subtilis Listeria monocytogenes Gram negativas Xanthomonas fragariae Xanthomonas axonopodis pv citri Pseudomona auruginosa Pseudomona siringae pv. gladiolii Erwinia carotovora Salmonella newport E.coli D21 Hongos Colletotrichum fragariae Colletotricum acutatum Colletotrichum gloeosporioides

0.07 0.14 0.20 0.25 0.28 0.06 0.07 0.12 0.27 0.95 3.25 4.00 8.92 7.91 9.37

EC50 = concentracin efectiva para el 50 % de inhibicin

en plantas que manifiestan la respuesta de defensa revelaron la presencia de cristales no caractersticos de la especie F. x ananassa, un incremento en la sntesis de almidn (activi-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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dad metablica), un mayor nmero de cloroplastos y un engrosamiento de las paredes celulares, lo que contribuye a aumentar el espesor de la semilmina. Por otra parte, se purificaron y caracterizaron compuestos antimicrobianos preformados (fitoanticipinas, para diferenciarlos de las fitoalexinas , cuya formacin en la planta es inducida por un microorganismo) que fueron llamados Fragarinas. Uno de stos, llamado Fragarina 1, cuando es aplicado en forma exgena, desencadena adems una respuesta defensiva en la planta. Esto implicara que ms all de su efecto como antibitico (Tabla 1), que permeabiliza la membrana plasmtica, estara de alguna manera participando en la sealizacin de la respuesta de defensa. Actualmente, se analiza la potencialidad de extractos o compuestos de este tipo como principios activos en la formulacin de agroqumicos naturales de bajo impacto ambiental. 4 Marcadores moleculares Aprovechando la versatilidad de la tcnica de RAPD lo primero que se plante fue investigar la similitud gentica entre las especies silvestres relacionadas con la frutilla cultivada y se desarrollaron los primeros marcadores moleculares especficos de especie, que permitieran la deteccin de hbridos interespecficos putativos. Del mismo modo, pero usando electroforesis en geles de poliacrilamida de alta resolucin, se generaron 37 marcadores genotpicos actualmente

disponibles para la identificacin inequvoca de las 8 principales variedades de frutilla cultivadas en la Argentina. Utilizando esta aproximacin pudieron diferenciarse tres accesiones distintas del cultivar Pjaro, que haban sido multiplicadas en forma independiente, confirmando la importancia del anlisis del ADN para evitar errores en la identificacin de cultivares (Fig. 4a). Sobre la base de la informacin obtenida en los experimentos donde se evalu la resistencia/ susceptibilidad de los genotipos del Banco de Germoplasma frente a diversos patgenos fngicos, se disearon cruzamientos para obtener poblaciones segregantes que posibilitaran investigar el control gentico de la resistencia. As, para la principal enfermedad del cultivo, la antracnosis, se propuso un modelo basado en una interaccin gen a gen en un fondo gentico octoploide, que asume que la resistencia est determinada por diferentes variantes allicas de un gen R, donde la susceptibilidad es parcialmente dominante sobre la resistencia y la respuesta defensiva sera modulada por la dosis allica y por otros genes que interactuaran epistticamente con el gen R. Mediante BSA (del ingls Bulked Segregant Analysis) se detectaron marcadores AFLP (del ingls A mplification F ragment L ength P olymorphisms) ligados a la resistencia que pueden contribuir a hacer ms eficiente la seleccin en el Pro\Frutilla (Fig. 4b). 5 Transgnesis En virtud de las ventajas que ofrece la transformacin gentica mediada por Agrobacterium tumefaciens, preliminarmente se desarroll un protocolo de regeneracin de brotes a partir de discos de hojas, con el que se consegua que el 70% de los explantos cultivados regeneraran plantas de frutilla. Este sistema de regeneracin fue utilizado para optimizar una metodologa de transformacin con la cepa de Agrobac-terium tumefaciens LBA 4404, portadora del plsmido binario pBI121,

Figura 4. Marcadores moleculares. A. Perfiles diferenciales de RAPD indican diversidad gentica entre distintas accesiones de un mismo cultivar de frutilla. B. Marcador AFLP asociado a la resistencia a C. acutatum, presente en Progenitor (PR) e hbridos resistentes (HR) y ausente en progenitor (PS) e hbridos susceptibles (HS).

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CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DAZ RICCI, J.C.

Figura 5. Transgnesis: A, Construcciones gnicas portadoras de genes que codifican protenas antifngicas (quitinasa, glucanasa y Ap24). B, Hojas desprendidas de frutilla no transgnica (izda.) y transgnica resistente a Botrytis (dcha.).

logrndose una eficiencia del 6,6 plantas transgnicas por cada 100 discos de hojas infectados con la bacteria. Basados en este procedimiento, se obtuvieron 16 lneas transgnicas de frutilla cv Pjaro, que expresaban uno o una combinacin de dos de los siguientes genes heterlogos (Fig. 5a) que codifican protenas antifngicas del grupo de las PR (protenas relacionadas con la patognesis vegetal): ch 5B (codifica para una quitinasa de Phaseolus vulgaris), gln2 (codifica para una glucanasa de Nicotiana tabacum) y ap24 (codifica para una protena del tipo de las taumatinas de Nicotiana tabacum ). Solamente dos de estas lneas transgnicas, ambas portadoras de una copia simple del gen ch5B, mostraron resistencia incrementada a la enfermedad del moho gris (causada por Botrytis cinerea , de gran incidencia en agrosistemas subtropicales), aunque ninguna de las 16 evidenci cambios en su comportamiento frente a Colletotrichum acutatum, una de las especies ms agresivas causante de la antracnosis. De este modo, queda demostrada la utilidad del gen ch5B para introducir resistencia a Botrytis en frutilla (Fig. 5b), un patgeno para el cual todava no se han encontrado fuentes de resistencia gentica en la especie F. x ananassa. 6 Caracterizacin molecular de genes de inters Actualmente se est aprovechando el conocimiento que se tiene, tanto de los materiales fitotcnicos como de los sistemas de compatibilidad, incompatibilidad y de proteccin cruzada caracterizados, para aislar genes implicados en los mecanismos defensivos, si-

guiendo al menos dos aproximaciones distintas: i) Mediante la tcnica de visualizacin de la expresin diferencial de ARNms y la construccin (y posterior anlisis) de genotecas de ADNc por hibridacin sustractiva. ii) El clonado y caracterizacin de anlogos de genes de resistencia (RGA). En el primer caso (i), se clonaron numerosos fragmentos de ADNc que codifican protenas relacionadas con la defensa vegetal como quitinasas de tipo III o PR 8, protenas quinasas con un dominio de unin a calcio, reguladores transcripcionales con dominios hometicos, miembros de la familia de las enoil-CoA-hidratasa /isomerasa, etc. De estos genes que estn siendo analizados al momento de escribir este captulo, se destaca uno que presenta una alta homologa con una glutation S tranferasa (GST) de zapallo (Cucurbita maxima). Esta familia gnica que acta en la detoxificacin de compuestos altamente oxidantes (especies reactivas de oxgeno) generados durante estrs tanto bitico como abitico, en Arabidopsis presenta miembros que slo se expresan en interacciones planta /patgeno de tipo incompatibles (cuando no se produce enfermedad). Respecto de la segunda aproximacin (ii), se utilizaron oligonucletidos cebadores degenerados diseados a partir de secuencias conservadas de la regin NBS (del ingls Nucleotide Binding Site) de genes de resistencia (R) clonados de otras plantas, para amplificar por PCR, anlogos de genes de resistencia en genotipos silvestres y cultivados de frutilla. Se identificaron al menos siete familias distintas de RGAs, de las cuales la mayora perteneca a genes R de tipo TIR (del ingls Toll Interleukin Receptor), similares a los ya caracterizados en Arabidopsis, tabaco y lino.

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7 Conclusiones En general, se podra decir que el caso del Pro\Frutilla es un claro ejemplo de complementacin, interaccin, integracin y coordinacin, entre el mejoramiento gentico convencional y la biotecnologa molecular, para buscar soluciones a problemas de estrs bitico asociados a un cultivo de inters comercial, en un marco de sustentabilidad y competitividad agronmica. 8 Lecturas Recomendadas
ARIAS M, CAMADRO E, DAZ RICCI JC AND CASTAGNARO A. (2003). Breeding barriers between the cultivated strawberry, Fragaria x ananassa, and related wild germplasm. Euphytica 136:139-150. CASTAGNARO A, DIAZ RICCI J, ARIAS M AND ALBORNOZ P. (1998). A new Southern Hemisphere species of Potentilla (Rosaceae). Novon 8: 333-336. DATTA SK and MUTHUKRISHNAN S. Eds. Pathogenesisrelated proteins in plants. CRC Press. 291pp. DIATCHENKO L, LAU YC, CAMPBELL AP, CHENCHIK A, MOQADAM F, HUANG B, LUKYANOV S, LUKYANOV K, GURSKAYA N, SVERDLOV ED and SIEBERT PD. (1996). Suppression Subtractive Hybridization: A Method for Generating Differentially Regulated or Tissue-Specific cDNA Probes and Libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 93: 60256030. DIXON DP, LAPTHORN A and EDWARDS R. (2002). Plant glutathione transferases. Genome Biology 3: reviews3004.1-10. FILIPPONE MP, DIAZ RICCI JC, CASTAGNARO A and FARIAS RN. (2001). Effect of Fragarin on the Cytoplasmic Membrane of the Phythopathogen Clavibacter michiganensis. Molecular Plant-Microbe Interactions 14: 925-928. FILIPPONE MP; DIAZ RICCI J; MAMAN DE MARCHESE A; FARAS RN and CASTAGNARO A. (1999). Isolation and purification of a 316 Da preformed compound from strawberry (Fragaria ananassa) leaves active against plant pathogens. FEBS Letters 459: 115-118. GARCA MG, ONTIVERO M, DAZ RICCI JC and CASTAGNARO A. (2002). Morphological traits and high resolution RAPD markers for the identification of the main strawberry varieties cultivated in Argentina. Plant Breeding 121: 76-80. LEISTER D, BALLVORA A, SALAMINI F, and GEBHARDT C (1996) A PCR-based approach for isolating pathogen resistance genes from potato with potential for wide application in plants. Nat. Genet. 14:421-429.

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CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DAZ RICCI, J.C.

VIII.-Captulo 2
Mejoramiento de Plantas Forrajeras en la Era Genmica
Spangenberg, Germn 1 Introduccin La agricultura de pastizales depende en gran medida de la disponibilidad de fuentes adecuadas de forraje como base primaria para la alimentacin del ganado. En la mayora de las regiones agrcolas del planeta la produccin de forraje es un sistema de baja inversin donde el mejoramiento gentico de plantas es la forma ms econmica de aportar tecnologa de avanzada a los productores. El mejoramiento convencional se basa en el uso de la variacin gentica natural existente entre ecotipos o aquella creada a travs de recombinacin sexual. La biotecnologa permite generar nueva variabilidad y utilizar de manera ms eficiente la variabilidad gentica existente. Esto incrementa la fuente de genes tiles para el desarrollo de nuevos cultivares, acelerando los programas de mejoramiento gentico. En los ltimos aos se han desarrollado numerosas tcnicas biotecnolgicas y moleculares para el mejoramiento de gramneas y leguminosas forrajeras (Spangenberg 1999; Forster et al. 2000). Entre estas tcnicas cabe mencionar el establecimiento de sistemas eficientes de regeneracin de plantas a partir de clulas competentes para la transformacin gentica, la combinacin total o parcial de genomas por hibridacin somtica y cibridacin a travs de la fusin de protoplastos, la produccin de plantas forrajeras transgnicas utilizando Agrobacterium y biolstica, y el establecimiento de sistemas altamente informativos de marcadores moleculares codominantes para ser utilizados en el proceso de seleccin y en el desarrollo de mapas genticos. En este captulo se describen las aplicaciones actuales y futuras y el impacto de la biotecnologa en el mejoramiento de especies forrajeras. 2 Transgnesis La tecnologa gnica y la obtencin de plantas transgnicas brindan la posibilidad de

generar variacin gentica cuando esta es inexistente o tiene una heredabilidad muy baja. En la actualidad se dispone de metodologas eficientes para la transformacin de forrajeras, ya sean gramneas o leguminosas (Fig. 1, ver pg.9), estando en la etapa de evaluacin a campo las primeras plantas forrajeras transgnicas con caracteres simples modificados. Si bien algunos aspectos de la gentica, fisiologa y bioqumica de muchos procesos vegetales complejos no han sido an completamente dilucidados -lo cual podra demorar algunas de las aplicaciones de la transgnesis en el mejoramiento vegetal- la tecnologa gnica es una poderosa herramienta para ampliar los conocimientos en gentica molecular. En consecuencia, las aplicaciones de la transgnesis en el mejoramiento de especies forrajeras estn orientadas hacia el desarrollo de eventos de transformacin con variacin gentica nica y a la diseccin gentica de vas metablicas y procesos de desarrollo relevantes para la produccin de forrajes. Los mejores candidatos en cuanto a caracteres para la aplicacin de transgnesis en plantas forrajeras son: calidad del forraje, resistencia a plagas y enfermedades, tolerancia a estreses abiticos y la manipulacin del crecimiento y desarrollo. 2.1 Calidad del forraje El mejoramiento molecular basado en transgnesis para sortear limitaciones en la calidad del forraje est dirigido al tratamiento de los subcaracteres involucrados, a saber: digestibilidad de la materia seca, contenido de carbohidratos solubles, contenido de protenas, metabolitos secundarios, alcaloides, etc. El enfoque molecular puede incluir la modificacin del perfil de ligninas para mejorar la digestibilidad de la materia seca, la manipulacin gentica del contenido de fructanos para incrementar el contenido de carbohidratos no estructurales, de la sntesis de taninos condensados para desarrollar forrajeras libres de meteorismo y la expresin de protenas resistentes al rumen (rumen by-pass) para mejorar el aporte de protenas y aminocidos esenciales. La mayora de los parmetros de calidad estn aso-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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ciados con vas metablicas o con la produccin de protenas especficas. La tecnologa gnica permite identificar las protenas involucradas y las enzimas clave a ser manipuladas, el aislamiento de los genes correspondientes y la manipulacin de su expresin en plantas transgnicas. 2.1.1 Manipulacin de la biosntesis de lignina El principal objetivo tendiente mejorar el valor nutritivo de las gramneas forrajeras para la industria lechera es el incremento de la digestibilidad de la materia seca, la cual declina marcadamente (> 10%) a medida que estas crecen y maduran, reduciendo el valor nutritivo del forraje. Dado que la heredabilidad de este caracter es baja y el mismo est controlado por un gran nmero de genes, el potencial para un mejoramiento rpido por mtodos tradicionales es reducido. Se calcula que pequeos incrementos en la digestibilidad tendrn un efecto significativo en la calidad del forraje y concomitantemente, en la produccin animal. Incrementos del 1% en la digestibilidad de la materia seca in vitro conducen a incrementos promedio del 3,2% en ganancia media de peso vivo. El principal factor involucrado en la disminucin de la digestibilidad de los tejidos a medida que maduran es la lignificacin de las paredes celulares. Los efectos negativos de la lignina sobre la digestibilidad dependen de su contenido, composicin de monmeros y grupos funcionales y del grado de entrecruzamiento con los polisacridos de la pared celular. La lignificacin es un proceso altamente coordinado y regulado por un conjunto de eventos metablicos que resultan en la biosntesis de precursores de la lignina (monolignoles). Una de las estrategias exploradas para mejorar la digestibilidad de la lignina es la regulacin negativa, en sentido o anti-sentido , de las enzimas involucradas en la biosntesis de monolignoles en plantas transgnicas. Las principales enzimas blanco para la aplicacin de esta tecnologa son la O-metiltransferasa del cido cafeico (COMT), la 4-cumarato: CoA ligasa (4CL), cinamoil CoA reductasa (CCR) y cinamil

alcohol deshidrogenasa (CAD)(Fig. 2 A). Las investigaciones realizadas utilizando plantas modelo como tabaco y lamo demostraron que la regulacin negativa de la expresin de COMT, CAD y 4CL conduce a una alteracin en la composicin de la lignina o a una disminucin de su contenido con incrementos significativos en la digestibilidad de la materia seca. En algunos de estos casos la lignina result ms fcil de extraer qumicamente, en otros esta tecnologa trajo aparejadas alteraciones en el desarrollo de la planta, como reducido tamao y colapso de las clulas del xilema. No obstante ello, estos resultados indican que la introduccin de genes de esta va metablica en sentido o antisentido permite mejorar la digestibilidad de la materia seca sin alterar el desarrollo normal de la planta. Los efectos observados en plantas con regulacin negativa de alguna de estas enzimas son similares a aquellos encontrados en la naturaleza en un tipo particular de mutantes de maz llamados brown midrib (bmr), cuyos genes codifican para enzimas menos activas. El enfoque transgnico brinda la posibilidad de obtener plantas con ligninas diferentes, logrando una mayor variedad de fenotipos que la existente en la naturaleza, a travs de la regulacin negativa de varias enzimas y a la utilizacin de promotores especficos. Estudios tendientes a mejorar la calidad del forraje por esta tecnologa estn siendo explorados en leguminosas como Stylosanthes humilis y Medicago sativa y gramneas como Lolium perenne y Festuca arundinacea. Se cuenta con los genes (ADNc y clones genmicos) que codifican para COMT, 4CL, CCR y CAD de L. perenne. Estos han sido aislados, secuenciados, caracterizados y utilizados para la diseccin gentica de esta va biosinttica en gramneas (Fig.2 A). Los genes correspondientes han sido mapeados en raigrs perenne (Fig. 2 B). A fin de producir cultivares con mayor digestibilidad, aptos para el mercado, es necesario contar con varios eventos de transformacin con regulacin negativa para enzimas individuales o mltiples enzimas involucradas en el metabolismo de los monolignoles, realizar ensayos a campo de estas plantas, evaluando particularmente el

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Los fructanos son molculas de polifructosa producidas por varias especies de gramneas para las cuales constituyen la principal forma de almacenamiento de carbohidratos solubles. Observaciones reali2.1.2 Manipulacin del metabolismo de zadas en lneas de raigrs que almacenan confructanos centraciones elevadas de carbohidratos soL-fenil- PAL cido cinmico lubles indicaron que alanine estas no sufren dismiC4H nuciones en la TAL C3H cido OMT cido F5H 5-hidroxi- OMT cido cido digestibilidad durante L-tirosina p-cumrico cafeico ferlico sinpico el verano, debido a cido ferlico PAL 4CL 4CL 4CL 4CL 4CL que estos carbohiCCoA-3H CCoA-OMT CCoA-OMT dratos parecen con? p-cumaroilcafeoilferuloil5-hydroxysinapoiltrarrestar las disminuCoA CoA CoA feruloyl-CoA CoA ciones en digestiCCR CCR CCR CCR bilidad debidas a lignificacin, favorep-cumaraldehdo coniferaldehyde 5-hidroxisinapaldehdo coniferaldehdo ciendo adems la asiCAD CAD CAD milacin del forraje y de protenas en el alcohol p-cumarlico alcohol coniferlico Alcohol sinaplicol rumen y, concomi(H) (G) (S) tantemen-te, conduPER LAC ciendo a incrementos LIGNINA A en el peso vivo. La sntesis de fructosa en gramLG2 LG7 neas involucra la accin concertada de al menos tres enzimas: sacarosa:sacarosa 1Xc30.1, fructosil-transferasa Xbcd147 e41t50240, Xcdo1417 LpCAD2.2 e41t50144 Xbcd1823 (1-SST), fructano: e33t50120 LpCAD2.1 e33t62340 Xpsr154, Xpsr690 Xbcd135, Xc600.1 fructano 1-fructosilLpOMT1 e33t62760 e38t50244 transferasa (1-FFT) y Lp CCR1 e33t62620 e41t47520 sacarosa: fructano 6Xpsr540.1 fructosiltransferasa (6-SFT) que sintetizan e40t50334 10 cM la mezcla ms comLpCAD1 e40t49173, Xcdo36 pleja de fructa-nos liXpsr546 Xpsr1316 gados que se encuenXc472 Xr738 tra en pastos y cereaXc556, Xc498, Xpsr10 ( Gli-2) Xc847 les. Varios de los B genes involucrados en esta va metablica han sido Figura 2: A) Diseccin de la va metablica de la biosntesis de monolignoles. Las aislados y caracterizaenzimas son: PAL = fenilalanina amonio liasa, C4H = 4-cumarato-3-hidroxilasa, COMT = O-metil transferasa del cido cafeico, F5H = ferulato-5-hidroxilasa, 4CL = dos, como el 6-SFT de hidroxicinamato:CoA ligasa, CC3H = cumaroil CoA hidroxilasa, CCOMT = Cafeoil CoA 3- cebada, el 6G-FFT de O-metil transferasa, CCR = cinamoil CoA reductasa, CAD = cinamil alcohol deshidrogenasa. cebolla y el 1-SST de Las flechas punteadas indican reacciones que no han sido experimentalmente alcaucil. Su introducverificadas. B) Mapeo de los genes correspondientes a la va en los grupos de ligamento cin en plantas desLG2 y LG7 de raigrs perenne. provistas de frucvigor, la tolerancia a estreses y por ltimo llevar a cabo la hibridacin y seleccin para obtener germoplasma elite.

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tanos nativos conduce a la acumulacin de oligofructanos, y en plantas que los producen, a la acumulacin de nuevas variedades de los mismos. La introduccin de un gen microbiano para la fructosiltransferasa (gen SacB ) de Bacilus subtilis en plantas de tabaco y papa que carecen de fructanos y acumulan almidn condujo a la acumulacin de cantidades considerables de fructanos de elevado peso molecular, del tipo de los levanos, que les confierieron un mejor rendimiento en situaciones de estrs. Esto demuestra que la sacarosa, el sustrato para la fructosiltransferasa, puede ser redireccionada en especies que no acumulan fructanos. La manipulacin de la biosntesis de fructanos en plantas transgnicas para mejorar la calidad del forraje y la tolerancia a estreses abiticos est siendo explorada en leguminosas como Trifolium repens y Medicago sativa y gramneas como Lolium perenne y Festuca arundinacea. En trabajos previos se obtuvieron plantas de L. multiflorum con alteraciones en el metabolismo de fructanos por la introduccin de genes quimricos de levansucrasa bacteriana. Actualmente se dispone de ADNc de genes de homlogos de la fructosiltransferasa de raigrs perenne. Estos han sido aislados, caracterizados y utilizados para la diseccin gentica de la biosntesis de fructanos en gramneas transgnicas. Tambin se han aislado y caracterizado otros genes de la va que han sido introducidos y expresados en leguminosas y gramneas. La diseccin molecular de la biosntesis de fructanos en forrajeras clave incrementar nuestro conocimiento del metabolismo de los fructanos y de la distribucin de los carbohidratos en gramneas, aportando informacin acerca de su rol funcional en la tolerancia al fro y la sequa. Este conocimiento es clave para el diseo de experimentos tendientes a la obtencin de plantas transgnicas con mejor calidad de forraje y tolerancia a estreses abiticos. 2.1.3 Expresin transgnica de protenas rumen by-pass Los aminocidos azufrados metionina y cistena son los ms limitantes en la nutricin animal. Estos influyen en el crecimiento de la lana de las ovejas y su aporte es reducido en condiciones naturales de pastoreo. A

esto se suma el problema de la fermentacin en el rumen, ya que la microflora degrada las protenas y en algunas circunstancias resintetiza protenas de menor valor nutritivo. Los suplementos postruminales de metionina y cistena resultan en incrementos del 16 al 130% en la tasa de crecimiento de la lana. Estos efectos positivos tambin se han observado en bovinos, donde han redundado en una mayor produccin de leche y una mayor tasa de crecimiento en animales para carne. Por lo tanto la ingestin de forrajeras que contengan protenas ricas en aminocidos azufrados, relativamente estables en el rumen, incrementar el aporte de aminocidos esenciales para la nutricin de los rumiantes, conduciendo a una mayor produccin animal, particularmente en lo que a lana se refiere. Se ha informado la obtencin de plantas forrajeras transgnicas que expresan genes que codifican para diferentes protenas ricas en aminocidos azufrados, resistentes a la accin del rumen, como la ovoalbmina de gallina y la albmina de arveja y de semilla de girasol. Como ejemplo puede citarse el caso de plantas transgnicas de Festuca arundinacea (Festuca alta) que expresan genes quimricos constitudos por secuencias de ADNc de la albmina de girasol (SFA8) con la seal KDEL del retculo endoplsmico bajo el control de diferentes promotores. Estas plantas expresan el transcripto esperado y acumulan la protena SFA8 a niveles superiores al 0,2% del total de protena soluble. Desde el punto de vista nutricional los valores obtenidos an estn lejos del ptimo, que deber ser del 2 al 5 % del total de protena soluble. Es crucial, por lo tanto, desarrollar estrategias que permitan alcanzar estos niveles a fin de explotar el mximo potencial de la tcnica. 2.1.4 Manipulacin de la biosntesis de taninos condensados Los taninos condensados (proantocianas) son compuestos polimricos derivados del metabolismo fenilpropanoide, sintetizados por la va metablica de los flavonoides. Desde el punto de vista agronmico son importantes en las leguminosas forrajeras donde pueden considerarse beneficiosos o per-

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judiciales de acuerdo a los niveles encontrados en la planta. Niveles de taninos condensados superiores al 4-5% del peso seco son perjudiciales, actuando como factores antinutritivos y generando rechazo por parte del animal. En cantidades moderadas (13%) mejoran la calidad del forraje, ya que reducen el meteorismo (empaste) por disrupcin de la espuma causada por las protenas en el rumen, disminuyen la prdida de protenas debidas a desaminacin microbiana y reduciendo la carga de parsitos en el animal. Las estrategias moleculares utilizadas para la manipulacin de la biosntesis de taninos se han orientado hacia la introduccin de taninos condensados en alfalfa y trbol blanco y a su reduccin en leguminosas que tienen altos contenidos (ver Morris y Robbins 1997 y Gruber et al., 2000). Estas se basan en la disponibilidad de genes involucrados en la biosntesis de antocianas, que afectan las etapas comunes en la biosntesis de flavonoides y la suposicin de que estos funcionarn en la biosntesis de taninos. El estudio de mutantes de la va metablica de los flavonoides en Arabidopsis ha proporcionado abundante informacin acerca de la identidad de las enzimas involucradas en la sntesis de taninos en esta especie. Esto permiti el clonado, entre otros, de los genes CHS, CHI, F3H y DFR. Se identific y clon tambin el gen BAN (BANYULS), que parece ser especfico de la va de biosntesis de los taninos. Se ha intentado la regulacin negativa o positiva de enzimas clave en la biosntesis, como es el caso de chalcona sintetasa (CHS) y leucoantocianina-4 reductasa (LAR) respectivamente, o la activacin de la ruta biosinttica mediante la expresin de genes reguladores apropiados que gobiernen la va a travs de un accionar pleiotrpico (con efectos a varios niveles fenotpicos). El anlisis de los promotores de algunos genes estructurales de esta va demostr la presencia de motivos de secuencia especficos para la interaccin con factores de transcripcin de tipo MYB, bZIP y bHLH. Un ejemplo de esto lo constituye la transformacin de plantas de Lotus corniculatus con el gen regulatorio Sn de maz, que result en una disminucin del contenido de taninos en hojas, conjuntamente con un aumento del

nivel de los mismos en raz. El pastoreo directo de alfalfa presenta el riego de causar meteorismo en los rumiantes que la consumen debido a la ausencia de taninos condensados en hojas y tallos. Sin embargo, la presencia de estos flavonoides en las semillas demuestra que esta especie contiene todos los genes necesarios para la sntesis de taninos condensados. La identificacin y aislamiento de los genes involucrados en la biosntesis de taninos en semillas de alfalfa permitiran manipular su expresin en hojas. Candidatos adecuados podran ser los genes de leucoantocianina-4 reductasa (LAR) y de CHS. 2.2 Resistencia a plagas y enfermedades Los patgenos y las plagas pueden disminuir considerablemente la produccin, la persistencia, el valor nutritivo y la palatabilidad de las plantas forrajeras. En los ltimos diez aos se han desarrollado varias estrategias para manipular la resistencia a los mismos. Estas incluyen la expresin de quitinasas, glucanasas, defensinas, fitoalexinas, protenas inactivadoras del ribosoma, protenas de la cpside viral, replicasa viral, protena del movimiento viral, toxinas Bt , inhibidores de proteasas e inhibidores de -amilasa. 2.2.1 Transgnesis para incrementar la resistencia a enfermedades fngicas El ataque de hongos a las hojas y sistemas radicales de las plantas provocan daos que resultan en un pobre establecimiento, disminucin en el rendimiento y calidad y una limitada persistencia. La expresin constitutiva en plantas transgnicas -especfica de rgano o inducida por el patgeno- de genes que codifican para protenas antifngicas (AFPs), puede conferir nuevas formas de resistencia a enfermedades fngicas. Estas estrategias, utilizando genes que actan individual o concertadamente, se han intentado principalmente en leguminosas, como alfalfa y trbol blanco. Como ejemplo puede citarse la obtencin de plantas de alfalfa que expresan una quitinasa I de arroz, que podra hacerlas resistentes al ataque de Rhizoctonia solani y Sclerotium rolfsii.

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Hongos como Phytophthora clandestina, Kabatiella caulivora, Rhizoctonia solani y Fusarium spp., que atacan a varias especies de trboles, donde no existen fuentes de resistencia natural, provocan cuantiosas prdidas econmicas en Australia. Se han identificado cuatro protenas antifngicas diferentes que en ensayos in vitro demostraron ser efectivas contra estos patgenos y se han utilizado los correspondientes genes quimricos que las expresan para producir plantas fenotpicamente normales de trbol subterrneo. Mientras se trata de determinar la resistencia lograda utilizando estos genes AFPs de manera individual tambin se intenta piramidizar diferentes transgenes a fin de brindar una mayor proteccin contra un amplio espectro de hongos patgenos. 2.2.2 Transgnesis para incrementar la resistencia a enfermedades virales Virus tales como el del mosaico de la alfalfa (alfamovirus,AMV), el del mosaico del trbol blanco (potexvirus,WCMV) y el del amarillamiento de las nervaduras (potyvirus,CYVV) afectan negativamente el crecimiento y desarrollo de las leguminosas. Cada uno de ellos infecta individualmente a un gran nmero de especies distribuidas por todo el mundo, causando prdidas significativas en leguminosas utilizadas para distintos fines. El control de estos tres virus podra incrementar la rentabilidad de las industrias rurales australianas en ms de 860 millones de dlares. La mayora de los mtodos clsicos utilizados para prevenir las infecciones virales son laboriosos y econmicamente inviables. Se han identificado fuentes potenciales de tolerancia o resistencia en alfalfa y en unas pocas especies de Trifolium, pero no existe una resistencia natural a estos virus que sea transferible, efectiva y durable que pueda ser incorporada a cultivares de leguminosas forrajeras. La tecnologa gnica es una opcin atractiva para lograr este objetivo, ya que permite sortear barreras interespecficas, desarrollar resistencias multignicas y manipular niveles y sitios de expresin. La transgnesis se ha usado exitosamente para desarrollar resistencia efectiva y durable en un amplio rango de es-

pecies vegetales. En este sentido se han utilizado resistencias derivadas de distintos patgenos para la obtencin de leguminosas transgnicas con resistencia a AMV, WCMV y CYVV. La estrategia utilizada fue la de expresin de protenas de la cpside viral u otras propias del patgeno como versiones mutadas de distintas protenas. (ver VIII.4). En las gramneas forrajeras dos virus que se encuentran con frecuencia son el del enanismo y amarillamiento de la cebada (BIDV) y el del mosaico del raigrs (RMV). Estos provocan disminuciones en el rendimiento del raigrs de hasta un 24% (BIDV) y de un 5 al 50% (RMV). La infeccin con RMV tambin reduce la competitividad del raigrs perenne como resultado de un mal establecimiento y una reducida persistencia. 2.2.3 Transgnesis para incrementar la resistencia a plagas Las plagas pueden daar a las plantas directamente, por consumo del follaje y races o indirectamente, por transmisin de patgenos a estas durante su accionar sobre la planta. En pasturas infectadas por densas poblaciones de insectos plaga se producen disminuciones en la produccin de materia seca que van del 20 al 40%. Varios insectos como Wiseana spp , Costelytra zealandica , Teleogryllus commodus, Sminthurus viridis, Sitona spp, Coleophora spp , Inopus rubriceps y Acyrthosiphon spp pueden causar daos significativos a leguminosas y gramneas. A fin de incrementar la resistencia a los mismos se han utilizado distintos enfoques transgnicos. Uno de ellos es la utilizacin de la protena cristalina e inhibidores de proteasas de Bacillus thuringiensis (Bt). Para una revisin del tema pueden consultarse a Voisey et al. (1994), Strizhov et al. (1996) y Voisey et al. (2000). Como ejemplo cabe citar la obtencin de plantas de trbol blanco que expresan un gen quimrico Bt cry1Ba modificado y acumulan en las hojas la delta-endotoxina Cry1Ba a niveles del 0,1% de protena soluble. La alimentacin de larvas de Wiseana con hojas de estas plantas promueve una inhibicin en la ingesta, reduccin en el crecimien-

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to de la larva y una mayor mortalidad de estas cuando se la compara en la misma situacin utilizando plantas control . Otro ejemplo lo constituye la utilizacin de inhibidores de proteasas, tales como el inhibidor de tripsina pancretica bovina o aprotinina en trbol blanco, donde la expresin en hoja de aprotinina a niveles de 0,07% de protena soluble reduce el ataque por las larvas de Wiseana. Otra estrategia para proteger contra insectos plaga sera la transformacin indirecta en gramneas, utilizando un endfito (microorganismo que vive y se desarrolla dentro de los tejidos de la planta) transformado, como Neotyphodium. Esto permitira obtener cepas del endfito seguras para los rumiantes que las consuman, que expresen y secreten protenas insecticidas tales como toxinas Bt e inhibidores de proteasas que protejan a las gramneas forrajeras de las plagas. 2.3 Crecimiento y desarrollo 2.3.1 Manipulacin de alrgenos del polen La fiebre del heno y el asma alrgico estacional debido al polen de las gramneas son enfermedades ambientales que afectan hasta el 25% de la poblacin en climas templado-fros. El polen de raigrs es uno de los ms abundantes en estas regiones, siendo el principal alrgeno para el 49-67% de los pacientes alrgicos. Este polen contiene por lo menos 4 clases principales de protenas alergnicas, cada una de las cuales est constituda por mltiples isoformas inmunolgicamente indistinguibles que involucran 17 alrgenos que tienen un tamao que va de 12 a 89 kDa. Al menos una protena de cada una de estas clases ha sido aislada y caracterizada en detalle. Se han aislado clones de ADNc para el principal alrgeno del raigras Lolp1, Lolp2 y Lolp5. En 1997 se obtuvieron las primeras plantas transgnicas de raigrs perenne (Lolium perenne) y de raigrs Italiano (Lolium multiflorum) que llevan genes para Lolp1 y Lolp2 en antisentido, bajo el control de un promotor especfico del polen a fin de regular negativamente los alrgenos del mismo. Estas plantas permitirn estudiar el rol funcional in planta de es-

tos alrgenos y permitirn explorar el potencial para la obtencin de cultivares de raigrs hipoalergnico. Ms recientemente se obtuvieron plantas de raigrs anual (Lolium rigidum) que portan en antisentido un gen quimrico Lolp5. 2.3.2 Manipulacin de cambio de fase y floracin La disminucin del valor nutritivo en algunas forrajeras perennes se encuentra asociada con el comienzo del crecimiento de las caas florales, la floracin y la senescencia. La calidad del forraje podra mejorarse, por lo tanto, inhibiendo la produccin de caas florales, que son poco digeribles, o retardando la senescencia. Se han informado modificaciones en el tiempo de floracin en plantas transgnicas a travs de la regulacin de la expresin de genes involucrados en la iniciacin del meristema floral. La expresin constitutiva de genes de Arabidopsis thaliana como LEAFY o APETALA1 conducen a un desarrollo precoz, como se ha observado en plantas transgnicas de lamo. En A. thaliana, mutaciones en uno o ms de los genes involucrados en la determinacin de identidad del meristema floral conducen a un desarrollo floral incompleto o nulo. Esto ha llevado a pensar en la posibilidad de controlar o inhibir la floracin en forrajeras transgnicas regulando negativamente la expresin de este tipo de genes, tales como los ortlogos (genes que tienen la misma estructura y funcin y un origen comn) de LEAFY o APETALA1. Otro blanco para la manipulacin del desarrollo reproductivo en forrajeras es el gen INDETERMINATE1 (ID1). Este gen desempea un rol importante en el control de la iniciacin floral y en el mantenimiento de un estado floral determinado en maz. Su mutacin es la nica conocida en monocotiledneas que bloquea especfica y severamente la transicin hacia un crecimiento reproductivo. Recientemente fue aislado y caracterizado un ADNc de plantas de raigrs perenne homlogo de este gen. Se espera que la inhibicin de la transicin de un estado vegetativo a la formacin de caas florales e inflorescencias en gramneas incremente la

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calidad del forraje y, en consecuencia tambin disminuya la cantidad de alergenos del polen. La inhibicin o el control de la floracin en forrajeras transgnicas a travs de la supresin antisentido de ortlogos de ID1 o LEAFY y APETALA1 podra conducir a incrementos en la calidad y a una mejora en los patrones de crecimiento estacional. Por otro lado, representara una va para la contencin de transgenes. Para la produccin de semilla este bloqueo de la floracin debera ser revertido. Una posibilidad para lograr este fin sera la utilizacin de un promotor inducible por cobre, por ejemplo, que controlara la supresin de ortlogos de estos genes. Se han utilizado diferentes enfoques para la manipulacin del desarrollo reproductivo que podran conducir a un bloqueo de la floracin, al desarrollo de la apomixis (tipo de reproduccin agmica comn en ciertas especies de gramneas, ver VIII.3) y a la androesterilidad (esterilidad de la parte masculina de la planta), que adems posibilitaran el mantenimiento de los transgenes. Esto es de particular importancia para forrajeras transgnicas de polinizacin abierta, mediada por el viento, ya que la dispersin del polen es un factor importante en la evaluacin de riesgo de las gramneas genticamente modificadas. 2.3.3 Manipulacin de la senescencia Se ha observado en plantas transgnicas que la produccin autorregulada de citocininas conduce a la inhibicin de la senescencia foliar (envejecimiento de la hoja que culmina en la muerte de la misma). Este sistema se basa en la utilizacin de un promotor especfico de senescencia de A. thaliana, el SAG12, que controla la expresin transgnica de un gen para la isopentenil transferasa ( ipt ) de Agrobacterium tumefaciens, que cataliza un paso en la biosntesis de citocininas. Las plantas que expresan este gen presentan un retraso en la senescencia foliar y no presentan anomalas de ningn tipo. En trbol blanco genes anlogos de ipt quimricos, bajo el control de promotores regulados por desarrollo, asociados a senescencia, provocan un retardo

significativos en la senescencia y su aspecto es completamente normal. 2.4 Agricultura molecular Las plantas transgnicas pueden ser utilizadas para expresar protenas recombinantes heterlogas, siendo esta una alternativa atractiva para la produccin de biomolculas en reemplazo de los sistemas microbianos. La perennidad, la produccin potencial de biomasa, la capacidad de fijar el nitrgeno biolgico y la habilidad para crecer en reas marginales que poseen las forrajeras, en particular las leguminosas, las hace atractivas para este fin. La disponibilidad de tecnologas que permitan elevados niveles de expresin y contencin de los transgenes permitiran utilizar a las forrajeras como biorreactores para la obtencin de enzimas industriales, productos farmacuticos, vacunas, anticuerpos y plsticos biodegradables. La alfalfa tiene ciertas caractersticas que la convierten en un interesante biorreactor. Entre ellas se destacan la perennidad y la capacidad de producir dos tres cosechas en el ao, existiendo adems la tecnologa adecuada para extraer las protenas de inters dejando un residuo utilizable para la alimentacin del ganado. Se han desarrollado y evaluado plantas de alfalfa transgnicas productoras de enzimas microbianas involucradas en la degradacin industrial de lignina y celulosa, entre otros. Este cultivo tambin ha sido utilizado para la produccin de polmeros biodegradables como el polihidroxibutirato (PHB) mediante la introduccin de tres genes de Ralstonia eutropha. 2.5 Evaluacin a campo de plantas forrajeras transgnicas A fin de determinar la estabilidad en la expresin de los transgenes, evaluar los nuevos fenotipos e identificar los eventos de transformacin adecuados para el desarrollo de germoplasma y cultivares transgnicos es necesario realizar ensayos de campo planificados, en principio en pequea escala. Solo despus de haber realizado estas evaluaciones se pueden integrar estos materiales en programas de mejoramiento molecular para el desarrollo de cultivares

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transgnicos. Un ejemplo ilustrativo de un diseo para ensayos de campo en escala reducida es el de plantas transgnicas de trbol blanco inmunes al virus del mosaico de la alfalfa. En este ensayo se tuvieron en cuenta importantes caractersticas de bioseguridad, como por ejemplo la presencia de una zona de dos hectreas sembradas con leguminosas forrajeras que se sabe que no se cruzan con el trbol blanco. El uso de leguminosas forrajeras como el trbol rojo, trbol de Persia y alfalfa en esta zona buffer, sembradas en bandas alternadas, asegura que haya un elevado nmero de leguminosas no transgnicas floreciendo en el ensayo en el perodo crtico en que estn floreciendo las plantas transgnicas motivo del experimento. Las dimensiones de esta zona buffer

Figura 1: Transformacin de trbol blanco para resistencia virus. A-H) Sistema prolfico de regeneracin de plantas resistentes al virus del mosaico de la alfalfa (AMV) y al virus del mosaico del trbol blanco (WCMV) a partir de explantos cotiledonales. La transformacin se llev a cabo utilizando Agrobacterium tumefaciens, utilizando npt2 como marcador de seleccin. I) T-ADN del vector binario conteniendo el gen quimrico npt2 y el gen de la protena de la cpside del wcmv4 (wcmv4) J) Anlisis por PCR para la identificacin preliminar de las plantas transformadas utilizando cebadores (primers) para el gen npt2. K) Idem anterior pero utilizando cebadores para el gen wcmv. L) Anlisis por el mtodo de Southern utilizando el gen wcmv4 como sonda. M) Anlisis por el mtodo de Northern de plantas transgnicas de trbol blanco expresando el gen quimrico wcmv4.

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Figura 3: A) Esquema de la liberacin a campo, a pequea escala, de plantas transgnicas de trbol blanco inmunes a AMV. B) Estrategia para el desarrollo de germoplasma elite transgnico de trbol blanco inmune a AMV, basada en la utilizacin de PCR cuantitativa para detectar las plantas homocigotas para los transgenes (npt2 y AMV4).

fueron diseadas teniendo en cuenta consideraciones tales como la conducta de las abejas como polinizadoras del trbol blanco, la dispersin del polen, y determinaciones de flujo gnico utilizando un gen marcador de fcil trazabilidad, denominado Feathermark. A fin de determinar el flujo gnico, dos hileras de trbol blanco no transgnico se incluyeron en el diseo rodeando el permetro del ensayo y las parcelas centrales con las plantas transgnicas. Las semi-

llas cosechadas de las plantas de trbol blanco no transgnico de estas dos hileras se analizaron utilizando una combinacin de resistencia a antibitico (resistencia a G418 mediada por un gen npt2 ubicado en el ADNT integrado en el genoma de las plantas transgnicas) y PCR para detectar la presencia del gen marcador de seleccin. Los resultados de este anlisis confirmaron que este diseo de campo es adecuado para la evaluacin de plantas transgnicas (Fig. 3 A).

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2.6 Integracin de plantas forrajeras transgnicas en programas de mejoramiento y desarrollo de cultivares transgnicos Los ejemplos citados ms arriba acerca del desarrollo de una serie de eventos de transformacin en leguminosas y gramneas forrajeras constituyen una prueba fehaciente de la funcionalidad de esta tecnologa. El desafo actual es utilizar esta tecnologa y las herramientas moleculares actuales para transferir genes valiosos de manera mltiple o individual a fin de obtener nueva variabilidad gentica y nuevo germoplasma transgnico lite e incorporar eficientemente estos factores en programas de mejoramiento para la obtencin de cultivares. Se han desarrollado estrategias eficientes para la introgresin de transgenes en parentales lite para la obtencin subsecuente de cultivares sintticos (polihbridos), asegurando la expresin estable y uniforme del transgn en todas las plantas de la poblacin (Fig. 3B). En la Fig. 3B se muestra la estrategia utilizada para la obtencin de plantas de trbol blanco elite inmunes a AMV, homocigotas para los transgenes. Involucra cruzas iniciales de los eventos de transformacin elegidos luego de su evaluacin a campo con plantas elite no transgnicas (Estado 1); seleccin por resistencia a antibitico de la progenie que lleva el transgen y est ligado al gen marcador npt2, o anlisis por PCR, seguido por cruzas diallicas entre la progenie T1 (Estado 2). Identificacin por PCR cuantitativa o cruza de prueba de las plantas T 2 que son homocigotas para los transgenes (Estado 3). Las plantas lite de trbol blanco homocigticas para los transgenes son entonces sembradas para su seleccin en un criadero junto con lneas parentales lite no transgnicas. De esta manera se identificarn los nuevos parentales de los cultivares sintticos transgnicos experimentales, que posteriormente sern evaluados en distintos ambientes. 3 Genmica El mejoramiento de la plantas forrajeras ha entrado en la era genmica, lo cual significa que se cuenta con gran cantidad de nuevas herramientas y tecnologas para el descubrimiento de genes y para el anlisis glo-

bal de los genomas. Todo esto aportar informacin acerca de todos los aspectos del crecimiento vegetal, desarrollo, diferenciacin y respuestas a estreses biticos y abiticos, revolucionando el mejoramiento vegetal y la produccin. Cientos de miles de etiquetas de secuencias expresadas (ESTs) han sido el punto de partida para dilucidar la funcin de miles de genes vegetales y se han creado bases de datos de las mismas provenientes de los principales cultivos. Esto posibilitar la identificacin, caracterizacin funcional y uso de genes valiosos para los sistemas de produccin de forraje. 3.1 Descubrimiento de genes y micromatrices (microarrays) para el anlisis de la expresin de genes en plantas forrajeras Las especies modelo para las cuales se han encarado proyectos de genmica basados fundamentalmente en el descubrimiento de ESTs son Lotus japonicus y Medicago truncatula. Aproximadamente 80.000 ESTs de la ltima han sido generados por consorcios internacionales financiados por el French Centre National de Sequencage, la International Human Frontier Science Program Organization, la Samuel Roberts Noble Foundation, Stanford University, el US National Science Foundation Plant Genome Program y el US Deparment of Energy Biosciences Program. Un programa asociado entre Agriculture Victoria-DNRE (Australia) y AgResearch Limited (Nueva Zelanda) gener aproximadamente 100.000 ESTs de cultivos forrajeros clave para la agricultura de clima templado, como son el raigrs perenne (L. perenne) y el trbol blanco ( T. repens ). Para ello se secuenciaron a gran escala clones seleccionados al azar de genotecas de ADNc que representaban un amplio rango de rganos, estados de desarrollo y tratamientos experimentales. Fueron generadas, 49503 secuencias de ADN de raigrs perenne, analizadas por bsqueda de BLAST (Ver VII-3) y categorizadas funcionalmente . Dentro de este programa se realizaron micromatrices de ADNc de alta densidad (con 4000-5000 gotas/arreglo) para su utilizacin en la identificacin de secuencias de trboles y raigrases (Fig. 4, ver pg. 13).

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Dentro de las aplicaciones de estos micromatrices basados en ESTs de plantas forrajeras se encuentra la fenotipificacin molecular. Esto comprende el anlisis de patrones de expresin global o patrones de expresin especficos utilizando hibridacin con sondas complejas de genotipos contrastantes o poblaciones y ambientes contrastantes. Todo esto puede utilizarse para integrar los datos de micromatrices con aquellos de seleccin fenotpica convencional. El anlisis comparativo de secuencias y datos de micromatrices de raigrs y trboles con aquellos de Arabidopsis y arroz, conjuntamente con los programas de descubrimiento de ESTs en M. truncatula, aportarn informacin acerca de los aspectos conservados y divergentes en la organizacin y funcin del genoma gramneas y leguminosas. 3.2 Simbio y patogenmica Las leguminosas y gramneas ofrecen la posibilidad de estudiar a nivel genmico interacciones de distinto tipo, como por ejemplo planta-patgeno, simbiosis leguminosa/bacteria fijadora de nitrgeno, asociaciones leguminosa/microrriza y endosimbiosis gramnea/endfito. La informacin obtenida en estos estudios ser de gran valor para desarrollar resistencia a patgenos y mejorar las asociaciones beneficiosas en las forrajeras. El trabajo de descubrimiento de genes en M. truncatula est orientado a estudiar la respuesta de la planta ante los patgenos y a caracterizar diferentes sistemas patognicos que incluyen patgenos fngicos tales como Colletotrichum trifolii y Phytophthora medicaginis y patgenos bacterianos como Xylella fastidiosa y Xanthomonas alfalfae. Para mediados del 2000 el US M. truncatula Functional Genomics Project gener 27.000 secuencias de DNA que incluan 2.828 ESTs de hojas infectadas con Colletotrichum, 2.462 ESTs de hojas infectadas con Phytophthora, 3.259 ESTs de micorrizas de raz y aproximadamente 9.500 secuencias de raz en diferentes tiempos despus de la inoculacin con Sinorhizobium meliloti y de ndulos maduros y senescentes. Existe un proyecto de genmica funcional integrado tendiente a dilucidar los even-

tos conducentes a la nodulacin en las leguminosas utilizando L. japonicus como modelo. Este proceso de nodulacin involucra la interaccin compleja entre genes bacterianos y sus productos con procesos de desarrollo en la planta que involucran percepcin y transmisin de seales y morfognesis. El objetivo es comprender mecanismos genticos de la planta involucrados en esta simbiosis a fin de mejorar las asociaciones naturales beneficiosas para la agricultura y el ambiente. Este y otros recursos genticos de M. truncatula y L. japonicus contribuirn significativamente a conocer y comprender las respuestas a patgenos y estrs y las interacciones de la rizsfera con las leguminosas forrajeras. Agriculture Victioria-DNRE tambin ha encarado un programa de genmica de endfitos de gramneas focalizado en el descubrimiento de genes gramnea-endfito en la asociacin Festuca arundinacea / Neotyphodium coenophialum. A travs de este programa se han generado aproximadamente 8.000 secuencias del hongo que se analizaron por bsqueda de BLAST y se caracterizaron funcionalmente. El principal inters est dirigido al descubrimiento de genes involucrados en la colonizacin del husped, en el aporte de nutrientes para el hongo endoftico y en la biosntesis de metabolitos secundarios activos de pirrolopirazina y pirrolizidina (los repelentes de insectos peramina y N-formilolina respectivamente) y su regulacin. Este proyecto tambin aportar informacin acerca de la interaccin endfito-husped as como de los mecanismos fisiolgicos conducentes a un incremento en el vigor de la planta y a una mayor tolerancia a estreses. Estas herramientas genmicas y el conocimiento generado posibilitarn el desarrollo de tecnologas para manipular las asociaciones gramnea-endfito a fin de incrementar el rendimiento de la planta, mejorar la tolerancia a estreses biticos y abiticos y alterar la especificidad endfitohusped a fin de beneficiar a las industrias semilleras de pasto para csped y forrajes. En otro proyecto similar se ha tratado de aislar y caracterizar genes involucrados en la biosntesis de indol-diterpenos y ergopeptinas responsables de la toxicosis animal en la asociacin Lolium perenne-N. Lolii. La pro-

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SPANGENBERG, Germn

Figura 4: A) Perfiles de expresin a travs de micromatrices de ADN utilizando dos colorantes fluorescentes (Cy5 y Cy3) para marcar dos muestras de RNA total provenientes de distintas situaciones de crecimiento o desarrollo, por ejemplo plantas creciendo en luz (Cy3) y plantas creciendo en oscuridad (Cy5). Luego de la hibridacin, los puntos marcados en verde indican los genes que se encuentran regulados positivamente cuando las plantas se encuentran en condiciones de luz, aquellos marcados en rojo corresponden a los regulados positivamente cuando se hallan en oscuridad y los que estn en amarillo corresponderan a aquellos genes que estn regulados positivamente en ambas situaciones. C) Micromatrices de ADNc de trbol blanco utilizando RNA de hojas y raz. Confirmacin por Northern de la expresin de los genes para la dihidroflavonol reductasa y una protena embrinica.

teccin de los meristemas de Lolium de un exceso de herbivora es vital para el xito reproductivo y la distribucin de esta y otras especies de gramneas. El desarrollo de asociaciones simbiticas entre gramneas y endfitos del grupo Epichlo/Neotyphodium representa una forma nica de proteccin

donde los genomas del husped y el simbionte han co-evolucionado para beneficio mutuo. El hongo le aporta proteccin al husped a travs de la produccin de metabolitos bioprotectores en retribucin por los nutrientes para su crecimiento. Estos compuestos son txicos para los mamferos.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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a estreses abiticos permitir la identificacin de redes de genes asociados con estreses ambientales tales como alta salinidad, sequa y bajas temperaturas, as como la determinacin de vas bioqumicas conserva-das.B) Anlisis de la imgen de micromatrices de etiquetas expresadas de ADN (ESTs) (ImaGene Software). involucradas en las respuestas a estreses. La investigacin genmica utilizando especies vegetales exticas, conocida como xenogenmica, incluye el descubrimiento de genes a travs del secuenciado de ESTs a gran escala y el anlisis de la expresin global de genes con micromatrices basados en las mismas. Esto posibilitar la obtencin de genes clave y variantes de genes de plantas tolerantes a estreses abiticos extremos, muchos de ellos nuevos, y la determinacin de sus patrones de expresin en respuesta a estreses abiticos especficos. Un programa de xenogenmica llevado a cabo por Agriculture Victioria-DNRE se encuentra abocado a seleccionar .B) Anlisis de la imgen de micromatrices de etiquetas expresadas gramneas y leguminosas austrade ADN (ESTs) (ImaGene Software).D) Perfiles de expresin de genes lianas nativas y exticas, adaptade raigrs, comparando genes que se expresan en tallo y raz. das a estreses ambientales extreEl clonado de los genes de estas vas mos. En este marco se estn aislando y cametablicas es un objetivo importante ya racterizando aquellos genes que permiten a que se conoce poco acerca de la enzimologa, estas especies tolerar estreses abiticos como de la biosntesis de toxinas y de las condicio- sequa, salinidad y suelos de baja fertilidad. nes para la sntesis endoftica de estos Entre las especies estudiadas se incluyen metabolitos ex planta. En este sentido se gramneas australianas nativas, tales como han logrado avances al clonar un conjunto las halotolerantes Agrostis adamsonii y A. de genes responsables de la sntesis de robusta y la especie tolerante a aluminio ergopeptina y ergotamina de Claviceps Microlaena stipoides. Tambin incluye espepurpurea y de paxilina, un indol-diterpeno cies exticas como Deschampsia antarctica, estrechamente relacionado al lolitremo B de una de las dos nicas plantas vasculares nativas de la Antrtida. Penicillum paxilli. Estos descubrimientos facilitarn el desarrollo de estrategias efectivas de mejoramien3.3 Xeno-genmica to molecular que permitirn incrementar la La genmica comparativa basada en el tolerancia a estreses abiticos en forrajeras anlisis de ESTs de varias plantas tolerantes y otros cultivos.

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SPANGENBERG, Germn

4 Resumen y conclusiones En los ltimos aos se ha realizado un considerable progreso en el establecimiento de las metodologas requeridas para el mejoramiento molecular de plantas forrajeras. Numerosas estrategias biotecnolgicas estn siendo consideradas en relacin al mejoramiento de la calidad nutritiva a travs de la alteracin de la biosntesis de lignina, carbohidratos solubles y protoantocianas y de la expresin regulada de protenas ricas en aminocidos esenciales, resistentes al rumen. Tambin se pretende incrementar la resistencia a patgenos y plagas, manipular el crecimiento y desarrollo a fin de incrementar la persistencia y demorar la senescencia, impedir la floracin y regular negativamente los alrgenos del polen. Las primeras plantas forrajeras transgnicas han sido evaluadas a campo y eventos de transformacin seleccionados se han utilizado para el desarrollo de cultivares. Las herramientas genmicas permitirn comprender mejor la gentica, fisiologa y bioqumica de varios procesos vegetales complejos y acelerar la aplicacin de estrategias de tecnologa gnica para el mejoramiento de plantas forrajeras. La aplicacin de herramientas y metodologas moleculares para el mejoramiento de estas especies reemplazar en gran medida la seleccin emprica basada en el fenotipo por otra ms directa y predecible, basada en el genotipo. Sin embargo, estas estrategias son promisorias solamente cuando se las considera dentro de un programa de mejoramiento. Los programas ms exitosos sern aquellos que incluyan un equipo multidisciplinario conformado por mejoradores, bilogos moleculares y celulares, bioqumicos, patlogos, agrnomos, expertos en nutricin animal y que adopten las nuevas tecnologas gnicas, de genmica funcional, bioinformtica y de fenotipificacin y que las apliquen de manera apropiada para resolver problemas especficos. El esfuerzo de tales equipos integrados ser crtico para el desarrollo de cultivares destinados al mercado y para el desarrollo de plantas forrajeras destinadas a otros usos. La genmica vegetal tendr un rol vital al acelerar la aplicacin de la biotecnologa para la agricultura de forrajes y pastizales. La in-

vestigacin genmica en las plantas forrajeras permitir el desarrollo de tecnologas que van ms all de los sistemas de produccin de forrajes, incrementando significativamente el valor de las semillas y de los productos agrcolas. Infinidad de genes vegetales sern un recurso invalorable para ser insertados en muchas plantas de cultivo utilizando tecnologa gnica y para ser utilizados como marcadores en seleccin asistida. Esto incrementar la eficiencia y la eficacia de los programas de mejoramiento vegetal. 5 Lecturas Recomendadas
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VIII.-Captulo 3
Manipulacin de la Apomixis y su Aplicacin en la Agricultura
Ortiz, Juan Pablo A.; Pessino, Silvina C.; Quarin, Camilo L. 1 Qu es la apomixis? Algunas plantas con flores presentan un modo asexual de reproduccin llamado apomixis. ste consiste en la formacin de semillas que contienen embriones genticamente idnticos a la planta madre, generados sin que intervengan los procesos de meiosis y fecundacin. La apomixis fue descripta por primera vez en 1841 en la planta australiana Alchornea ilicifolia por J. Smith. Cuando un ejemplar femenino de esta especie dioica fue llevado a los Kew Gardens de Londres desde Asia, la planta aislada floreci y produjo semillas en abundancia, poniendo al carcter en evidencia. Paradjicamente, los primeros experimentos con plantas apomcticas fueron realizados en forma involuntaria por Gregor Mendel, quien utiliz cruzas entre especies del gnero Hieracium para intentar confirmar los resultados obtenidos en sus famosos estudios sobre la herencia de las arvejas de jardn. Mendel atribuy errneamente a una supuesta frecuente autopolinizacin la falta de segregacin observada. Hoy sabemos que muchas especies de este gnero son apomcticas. Se considera que la apomixis ha evolucionado como un sistema de reproduccin alternativo a la sexualidad a travs de la reformulacin de sus programas de desarrollo. Por lo tanto, para comprender su funcionamiento es necesario compararlo con el de la reproduccin sexual. La sexualidad en las angiospermas comprende la alternancia cclica entre los estados de esporfto (la planta misma, 2n) y gametfito (el grano de polen y el saco embrionario, n). La meiosis que ocurre en las flores posibilita la recombinacin y reduccin del contenido gentico y da lugar a la formacin de las esporas femeninas (megsporas) en el ovario y masculinas (micrsporas) en las anteras. La megaspo-

rognesis genera cuatro clulas haploides, tres de las cuales degeneran. La restante constituye la megspora funcional, que por el proceso de megagametognesis desarrolla un megagametfito conocido como saco embrionario. El tipo de saco embrionario ms comn entre las angiospermas (conocido como Polygonum) est formado por 8 ncleos haploides (n) contenidos en siete clulas, a saber: la ovoclula, dos sinrgidas, una clula central binucleada, y tres antpodas. Por otra parte, las micrsporas desarrollan los granos de polen mediante un proceso de microgametognesis. El polen maduro est tpicamente integrado por tres clulas haploides (n), dos de las cuales constituyen los gametos masculinos. La otra tiene una funcin relacionada con el crecimiento del tubo polnico. La formacin de la semilla requiere previamente de un proceso de doble fecundacin: un gameto masculino (n) se fusiona con la ovoclula (n) para originar al cigoto (2n). A partir de este cigoto se desarrolla el embrin. La clula central del saco embrionario con sus dos ncleos (n + n) se fusiona con el otro gameto masculino para originar el endospermo. As, la fusin de dos gametos haploides nicos derivados de la distribucin al azar del material gentico durante las meiosis masculina y femenina resulta en la generacin de progenies genticamente diversas. En resumen, en la reproduccin sexual la meiosis produce la recombinacin gnica de los caracteres de ambos progenitores y genera gametos haploides. La fecundacin fusiona de manera aleatoria un gameto masculino con uno femenino para originar un nuevo individuo con una constitucin gentica nica. La apomixis elude la ruta sexual evitando la reduccin meitica y la fecundacin. El vulo desarrolla una semilla cuyo embrin contiene exactamente el mismo genotipo que la planta que lo origina. Por lo tanto este carcter (tambin llamado agamospermia) ha sido definido como reproduccin asexual a travs de semillas. Fue descripto en ms de 400 especies de plantas pertenecientes a 35 familias diferentes, entre las que se destacan las Gramneas, las Compuestas, las Rosceas y las Rutceas. Presenta formas diferentes y parece haber surgido varias veces

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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en forma independiente durante la evolucin. Brevemente, los embriones apomcticos pueden formarse a travs de una ruta esporoftica o gametoftica. En la primera, tambin llamada embriona adventicia, los embriones surgen directamente de una clula somtica de la nucela o de los tegumentos del vulo. Comnmente se forman embriones mltiples a partir de clulas nucelares (esporofticas) que comparten el vulo junto con el embrin de origen sexual y utilizan su endospermo para desarrollarse. Esta forma de apomixis aparece comnmente en los ctricos, los cuales se convirtieron en un sistema modelo para estudiar el proceso. En la apomixis gametoftica se forman siempre sacos embrionarios que difieren en algunos aspectos del gametfito femenino haploide (n) generado a partir de la megspora funcional. Su principal diferencia es precisamente el hecho de ser diploides (2n) ya que los ncleos que los conforman no han pasado por el proceso meitico y por lo tanto no han reducido su contenido de ADN. Por eso se dice que estos sacos embrionarios o

megagametfitos surgen por un proceso de apomeiosis (apo: prefijo griego de significacin negativa). De acuerdo con el origen de la clula que genera al saco embrionario y al embrin, la apomixis gametoftica puede ser clasificada como: diplospora, cuando el saco embrionario se origina a partir de la clula madre de la megspora misma ya sea por mitosis o luego de una falla en la meiosis o apospora, cuando el saco embrionario se origina directamente por mitosis a partir de una clula somtica, usualmente una clula de la nucela. Los sacos embrionarios, sean stos apospricos o diplospricos, contienen un gameto femenino 2n, la ovoclula, a partir de la cual se desarrolla directamente el embrin por partenognesis sin que exista fecundacin. As, mientras en el proceso sexual la reduccin meitica se complementa con la fecundacin que restaura el nivel de ploida 2n, en la apomixis gametoftica la ausencia de reduccin se complementa con la partenognesis. La apomixis gametoftica fue estudiada ms profundamente que la apomixis esporoftica, principalmente por
Meiosis

Clula madre de la megspora

o meiosis Mitosis modi


Mitosis

ficad

Megasporas haploides (n)

Mitosis
somtica

Clulas somticas

Megagametofito no reducido (2n)

Esporofito (2n)

Endosperma

Divisi

d un fec o a om ci t n n au da
n cu fe

ac i

Embrin
Mi

in ss osi Mit

Megagametofito reducido (n)

Grano de polen Doble fecundacin

is tos Mi

tosi s

Figura 1: La rutas biolgicas de la reproduccin sexual y apomctica. Durante la sexualidad una clula de la nucela del vulo se diferencia como clula madre de la megspora y luego de sufrir un proceso de meiosis da origen a cuatro megsporas haploides. Tres de estas megsporas degeneran y la cuarta da origen a la formacin de un saco embrionario luego de una serie de mitosis, donde todos los ncleos celulares estn reducidos (n). La ovoclula y los ncleos polares del saco son fecundados por los ncleos generativos del polen para generar el cigoto y el ncleo primario del endosperma, respectivamente. El cigoto da origen al embrin a travs de sucesivas mitosis. La apomixis consiste en la formacin de un embrin a partir de una clula no reducida (que no ha sufrido mitosis). En algunos casos hay formacin de un megagametofito con clulas no reducidas, cuya ovoclula (2n) genera un embrin por partenognesis (apomixis gametoftica). En otros casos el embrin es generado directamente a partir de una clula de la nucela en un proceso similar a la embriognesis somtica (embriona adventicia).

284

ORTIZ, J.P.A.; PESSINO, S.C.; QUARIN, C.L.

ser el tipo presente en las gramneas, donde muchas especies con valor agronmico presentan este modo de reproduccin. Un esquema de las diferentes rutas posibles que puede tomar la apomixis se muestra en la Figura 1. Recordemos que en las angiospermas existe una doble fecundacin. En la apomixis gametoftica la partenognesis excluye uno de los procesos de la doble fecundacin: la unin de los gametos masculinos con los femeninos. Sin embargo no necesariamente se anula la fecundacin de los ncleos polares. Aunque en algunos casos el endospermo puede desarrollarse en forma autnoma (sin la unin de un gameto masculino con los ncleos polares del saco embrionario aposprico o diplosprico) en muchas especies apomcticas, como en la mayora de las gramneas tropicales, es necesario que un gameto masculino se fusione con el o los ncleos polares de la clula central del saco embrionario para formar el endospermo. A este proceso se lo llama pseudogamia. Los sacos embrionarios diplospricos conservan la tpica estructura de los sacos embrionarios de origen meitico, generalEsporognesis

mente con siete clulas y ocho ncleos. Sin embargo, en la aposporia por lo general tienen una constitucin distinta y muy variable, tanto en taxones diferentes como dentro de un mismo taxn. Por ejemplo, en gramneas tropicales o subtropicales, el saco aposprico se forma por dos mitosis consecutivas, con permanencia de los cuatro ncleos en un solo polo celular. As se organiza un megagametfito con una ovoclula flanqueada por dos sinrgidas y una clula central uninucleada y extensamente vacuolizada. Esta estructura de saco aposprico fue descripta por primera vez para Panicum maximum y por esa razn a los megagametfitos con esta morfologa se los conoce como sacos apospricos de tipo Panicum. Sin embargo, en las especies apospricas de Paspalum, un gnero tambin perteneciente a la tribu Panceas igual que Panicum, existe una caracterstica en la constitucin de los sacos apospricos que los diferencia netamente del tipo Panicum: en Paspalum los sacos generalmente tienen una clula central con dos ncleos polares y a veces tres. Esta caracterstica es importante porque debido a la pseudogamia, a veces la relacin genmica materna/paterna del endospermo es distinta en

Gametognesis

n 2n
Me io

Meiosis
sis

Mitosis
Mitosis

mo d

Clula madre de la megspora

ific ad a

(tipo A ntenna ria)

2n Mitosis (tipo Taraxacum) 2n

2n Mitosis (tipo Paspalum) Clulas nucelares 2n

Sexualidad

Diplospora

Apospora

Esporfito

Gametfito

Figura 2: Distintos tipos de sacos embrionarios formados durante los procesos de sexualidad y de apomixis gametoftica. En la sexualidad, la clula madre de la megspora realiza un proceso de meiosis y genera cuatro megsporas haploides, tres de las cuales degeneran. La cuarta megspora lleva a cabo una serie de tres divisiones mitticas para formar un saco embrionario reducido y octanucleado. En el proceso de apomixis diplosprica la clula madre de la megspora realiza una serie de mitosis para generar un saco embrionario no reducido y octanucleado (tipo Antennaria) o inicia un proceso de meiosis que falla para generar un saco embrionario no reducido y octanucleado (tipo Taraxacum). En la apomixis aposprica clulas de la nucela cercanas a la clula madre de la megspora realizan varias mitosis consecutivas para generar un saco embrionario no reducido que puede ser pentanucleado (tipo Paspalum) y cuya caracterstica ms notable es la ausencia de antpodas.

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las plantas sexuales y en las apospricas. En las sexuales, hay una relacin 2/1 materno/ paterno (madre n + n; padre n), mientras que en las apospricas esa relacin es generalmente 4/1 (madre 2n + 2n; padre n). En Panicum la relacin es 2/1 tanto en las sexuales como en las apospricas (n + n/n en las sexuales y 2n/n en las apospricas) (Fig. 2). 2 Otros aspectos substanciales del carcter apomixis Hay varias caractersticas particulares de este modo de reproduccin que merecen ser remarcadas. Por una parte la apomixis usualmente no altera la formacin del microgametfito y la meiosis ocurre normalmente en las anteras generando polen perfectamente viable y reducido. Adems, apomixis y sexualidad no son procesos mutuamente excluyentes ya que pueden aparecer simultneamente sacos reducidos (meiticos) y no reducidos (provenientes de apomixis) en una misma planta, en una misma inflorescencia y an en un mismo vulo (Fig. 3). Una planta apomctica capaz de generar al menos una parte de su progenie por medios sexuales se conoce como facultativa. Por lo tanto, en los genotipos apomcticos facultativos las proge-

nies segregan como clases maternas (2n + 0) y no-maternas o aberrantes. Hay tres tipos diferentes de individuos aberrantes que pueden encontrarse en la progenie de una planta apomctica: 1) hbridos BIII (2n + n) que resultan de la fecundacin de una ovoclula no reducida, 2) hbridos BII (n + n) que resultan de la fecundacin de una ovoclula reducida y 3) haploides (n + 0) generados por partenognesis a partir de una clula huevo reducida. Por otra parte, la apomixis gametoftica se relaciona siempre con la poliploida. En general aparece en especies que presentan razas de bajos niveles de ploida (usualmente diploides) que se reproducen por sexualidad y otras de mayor nivel de ploida (por ejemplo tri, tetra o pentaploides) que se reproducen por apomixis. Estos complejos integrados por individuos sexuales y apomcticos de distinto nivel de ploida se conocen como complejos agmicos y se consideran estructuras reproductivas complejas y evolucionadas donde la sexualidad permite la generacin de nuevos genotipos y la apomixis la propagacin clonal muy eficiente de las combinaciones genticas superiores. Existen evidencias que sugieren que la diversidad generada a niveles menores de ploida puede ser impulsada hacia los niveles

Figura 3: Microfotografas de secciones de vulos de razas tetraploides de Paspalum notatum. A: vulo conteniendo un saco embrionario meitico (las dos sinrgidas y algunas de las antpodas no se observan porque estn en una seccin adyacente del corte del vulo). B: vulo conteniendo dos sacos embrionarios apospricos. Referencias: a, antpodas; e, clula huevo, p, ncleos polares; barra = 30 micras

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poliploides por medio de eventos sucesivos de hibridizacin 2n + n. 3 Mejoramiento gentico de especies naturalmente apomcticas Algunas especies apomcticas tienen un valor agronmico muy importante, como es el caso de varias gramneas forrajeras, los citrus, el mango y las fresas. Hasta el presente, slo se dispone de programas de mejoramiento avanzados en algunas gramneas forrajeras entre las que se encuentran especies de los gneros Brachiaria, Cenchrus , Eragrostis, Panicum, Paspalum, Pennisetum y Poa. En principio, las plantas apomcticas facultativas pueden ser mejoradas por metodologas de cruzamiento convencionales, ya que producen al menos algunos sacos embrionarios meiticos que posibilitan la hibridacin y seleccin. En cambio en los apomcticos obligados, que se reproducen completamente o casi completamente en forma clonal, la hibridacin y el anlisis de segregacin son impracticables. Las progenies de tales plantas exhiben siempre el fenotipo materno o pueden ocasionalmente aparecer variantes que probablemente surjan de mutaciones ms que de segregacin sexual. Por ello, la disponibilidad de individuos sexuales o con algn grado de sexualidad (apomcticos facultativos) es un requisito fundamental para el mejoramiento de estas especies. Estos individuos presentan un cierto grado de variabilidad como para aumentar las posibilidades de supervivencia de la especie frente a cambios ambientales y aportan asimismo germoplasma til para el mejoramiento. Uno de los principales requisitos para llevar adelante un programa de mejoramiento de una especie apomctica es la coleccin de germoplasma diverso desde las fuentes de origen para ampliar la base gentica disponible e identificar introducciones sexuales o altamente sexuales (apomcticas facultativas con alta expresin de sexualidad). La evaluacin de especies relacionadas es tambin una alternativa importante cuando no se dispone de plantas sexuales de la especie de inters. Ejemplos de cruzamientos interespecficos e incluso intergenricos empleados como punto de partida en programas de mejoramiento se encuentran en Brachiaria,

Zea x Tripsacum y Pennisetum, entre otros. El adecuado conocimiento de la biologa, citologa y modo de reproduccin de los materiales disponibles es asimismo un requisito fundamental para cualquier estrategia de mejoramiento. Como se ver mas adelante, los estudios realizados para determinar la base gentica de la apomixis en varias especies de gramneas indican que el carcter presenta un tipo de herencia simple, haciendo posible entonces su manipulacin en programas de mejoramiento una vez que son detectados individuos sexuales o apomcticos facultativos. En estos casos los genotipos apomcticos obligados con caractersticas deseables pueden ser usados como dadores de polen. Debido a que los gametos masculinos son completamente normales (reducidos) y que la mayora de las especies apomcticas son altamente heterocigotas, los cruzamientos entre individuos sexuales (utilizados como progenitores femeninos) y apomcticos (empleados como dadores de polen) pueden conducir a la generacin de progenies F1 variables donde es posible seleccionar. Hay que tener en cuenta que si bien son necesarios individuos sexuales o con adecuada expresin de sexualidad para realizar las cruzas, en el momento de la seleccin habr que usar el criterio contrario, es decir, seleccionar por un alto grado de expresin de la apomixis. Esto conducir a la obtencin de variedades estables. El objetivo final de un programa de mejoramiento de una especie apomctica en el cual ha sido posible obtener recombinacin gentica es la identificacin en la poblacin segregante de los genotipos superiores, con reproduccin completamente (o casi completamente) apomctica que puedan ser transformados en cultivares mediante su multiplicacin por semillas. El camino no es sencillo porque en cada generacin es necesario distinguir en la progenie, cules son los individuos generados por sexualidad y cuales por apomixis. Dentro de los generados por sexualidad, habr que seleccionar los que al mismo tiempo posean las mejores caractersticas agronmicas y presenten un alto grado de expresin de la apomixis. Otro aspecto a tener en cuenta es el nivel de ploida de los progenitores que sern empleados en los cruzamientos. Los primeros estudios de hibridacin indicaron la necesidad de realizar cruzas

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entre especies sexuales y apomcticas con el mismo nivel de ploida ya que varios intentos realizados entre diploides sexuales y poliploides (en general tetraploides) apomcticos condujeron a la generacin de progenies estriles. En las gramneas tropicales y subtropicales se ha hecho un buen uso del carcter en el mejoramiento, especialmente en la domesticacin de algunas especies. Dos grandes lneas de trabajo han sido llevadas adelante en estos programas: 1) la seleccin de los mejores genotipos naturales partiendo de una amplia coleccin de germoplasma y estudiando caractersticas como la productividad de materia seca, calidad, adaptabilidad al cultivo y a distintas condiciones ambientales, capacidad de produccin de semilla y persistencia al pastoreo. Esta seleccin puede llevarse a cabo entre diferentes especies o dentro de la misma especie, considerando cules son los mejores genotipos entre distintas poblaciones apomcticas disponibles. Hay numerosos ejemplos de cultivares de pastos forrajeros apomcticos que se mejoraron usando este tipo de seleccin. As se obtuvieron todas las variedades apomcticas cultivadas de Paspalum, Brachiaria, Panicum, Themeda y Melinis. Tomando como ejemplo a Paspalum, en primer lugar se seleccionaron algunas especies como P. notatum (apomctico, 4X), P. dilatatum (apomctico, 5X), P. plicatulum, P. atratum, y luego se eligieron algunos ecotipos por sus cualidades agronmicas y su adaptabilidad al cultivo. En el sur de los Estados Unidos se han popularizado algunas variedades tetraploides apomcticas de P. notatum (Argentine, Paraguay, Wilmington, Tifton 7 y otras). Tambin se cultivan algunas variedades apomcticas de Dallisgrass (P. dilatatum) seleccionadas de la misma manera. En nuestro pas se cultivaron durante mucho tiempo dos variedades apomcticas de P. guenoarum: el Pasto Rojas y el Pasto Ramrez, seleccionadas por este mismo mtodo en Paraguay. Recientemente se han inscripto otras dos variedades que han sido seleccionadas en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional del Nordeste: el Pasto Camb (P. atratum) y el Pasto Chan (P. guenoarum); 2) la segunda posibilidad de mejoramiento (en la que an se ha avanzado poco) consiste en realizar

cruzamiento con genotipos sexuales poliploides naturales, que son muy raros. Un buen ejemplo de esto es son las variedades Nueces y Llano de Buffelgrass (Pennisetum ciliaris) desarrolladas en USA en la dcada del 70 a partir de cruzamientos entre una rara planta tetraploide sexual (natural) con plantas apomcticas tetraploides (que son las comunes en esta especie). Tambin se han conseguido obtener plantas tetraploides sexuales por duplicacin cromosmica de una planta sexual diploide. Mediante este tipo de tratamientos se han generado tetraploides sexuales en B. ruziziensis y P simplex, P. notatum y P. hexastachium. La disponibilidad de estas plantas, adems de facilitar los planes de cruzamientos, permiti la realizacin de estudios detallados de la herencia del carcter apomixis en ambos gneros. Actualmente se estn llevando a cabo programas de mejoramiento que utilizan esta estrategia para Paspalum y Brachiaria, aunque an no se ha inscripto ninguna variedad nueva. 4 Usos potenciales de la apomixis en el mejoramiento de plantas naturalmente sexuales La ausencia de recombinacin durante la megagametognesis y de fecundacin de la ovoclula por un gameto masculino posibilita la generacin de embriones que presentan una constitucin gentica idntica a la de la planta madre. La apomixis es un carcter utilizable en el mejoramiento de plantas y la produccin de alimentos, ya que puede ser percibida como una herramienta ventajosa para la estabilizacin de genotipos superiores y la fijacin combinaciones hbridas. En teora cualquier combinacin gentica que lleve los factores determinantes de la apomixis podra ser mantenida y multiplicada como una rplica exacta por innumerables generaciones va semillas. La perspectiva de clonar genotipos superiores hbridos podra representar una ayuda importante para los productores agropecuarios de los pases en desarrollo, permitindoles sostener altos rendimientos ao tras ao usando parte de las semillas cosechadas sin prdidas en la produccin debidas a la segregacin. Entre otras ventajas, la expresin de la apomixis reducira al mnimo el aislamiento fsico reque-

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rido para preservar lneas genticas homocigotas. Podran ser obtenidos y propagados fcilmente nuevos hbridos interespecficos e intergenricos, permitiendo el desarrollo de genotipos mejor adaptados a los distintos ambientes. Asimismo podra facilitarse el uso de transformantes considerando que una planta transgnica apomctica fijara inmediatamente el nuevo carcter y se convertira en un cultivar luego de su multiplicacin. 5 El control gentico de la apomixis

La apomixis es un carcter heredable, pero su control gentico no fue an completamente esclarecido. Tradicionalmente se consider que sus determinantes bsicos podran haberse originado por mutacin y que la mayora de los otros genes involucrados son similares a los de la sexualidad. A pesar de su amplia distribucin en las angiospermas, el carcter no es muy comn en los cultivos mayores o en sistemas modelos. Esta condicin forz a que los estudios en este campo deban ser realizados en especies silvestres que son poliploides, altamente heterocigotas y con una pobre caracterizacin gentica. La diseccin de las bases genticas del carcter es por lo tanto dificultosa y compleja. Los estudios de herencia slo son posibles si pueden cruzarse progenitores completamente sexuales y apomc-ticos y la progenie F 1 segregante puede ser examinada por mtodos citoembriolgicos. Alternativamente, el anlisis de progenies usando marcadores moleculares, puede ser empleado como un indicador de la tasa de plantas con genotipo materno formadas por cada uno de los hbridos F1. En las cruzas de este tipo (que pueden ser intra o interes-pecficas) se utiliza un poliploide sexual natural o generado artificialmente como planta ma- Figura 4: Los estudios con marcadores moleculares permiten la dre, mientras que un genotipo localizacin del locus que controla la apomixis. A la izquierda se apomctico contribuye como dador muestra un gel de AFLP obtenido durante la construccin del mapa de polen. Los diferentes estudios gentico de Paspalum notatum. A la derecha vemos la regin genmica que contiene al locus responsable de la apomixis (apodesarrollados en las gramneas co- locus) definida por marcadores moleculares, varios de los cuales inciden en sealar que tanto la segregan completamente ligados al apo-locus y evidencian una fuerte apospora como la diplospora pa- restriccin de la recombinacin (tomado de Martnez et al 2003).

recen estar controladas por un nico locus en donde un gen mayor dominante o un grupo de genes ligados y coadaptados, que funcionan como una sola unidad gentica a causa de una fuerte supresin de la recombinacin, son los responsables de la expresin del carcter. El modelo gentico ms simple propuesto para especies tetraploides de Panicum y Brachiaria, supone que la constitucin gentica de las plantas sexuales sera del tipo nuliplexo (aaaa) mientras que los individuos apomcticos seran uniplexos (Aaaa), siendo A el alelo dominante responsable de la apomixis. Los cruzamientos de individuos de este tipo generan progenies F1 que segregan en una relacin 1:1 (sexuales vs. apomcticos). Sin embargo, en este modelo existen ciertas cuestiones que no han sido resueltas. Por ejemplo en el caso de Panicum maximum (que es una especie apomctica facultativa) si bien se postula que las plantas apomcticas son uniplexas (Aaaa) hasta ahora no se han encontrado en la naturaleza plantas completamente sexuales (aaaa). Esta situacin se repite en otras especies apomcticas. Tampoco se puede explicar el hecho de que siempre que se utiliz como polinizador a una planta apomctica sta result ser un genotipo Aaaa. Cmo es posible que el genotipo uniplexo

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sea el nico existente en las poblaciones apomc-ticas, cuando la especie no es completamente apomctica?. El modelo tampoco es aplicable a otras especies como las incluidas en el gnero Paspalum, en donde la regin genmica involucrada parece estar asociada con algn factor letal que afecta parte de los gametos masculinos (Fig. 4). 6 Transferencia del carcter apomixis a especies de inters agronmico Aunque desde el punto de vista del mejoramiento gentico la apomixis puede considerarse como un sistema que restringe la recombinacin gentica, esta forma de reproduccin constituye una herramienta nica para desarrollar cultivares superiores y preservar combinaciones hbridas indefinidamente. Por ello la transferencia del carcter a las especies cultivadas ha sido perseguida desde hace tiempo. Bsicamente se consideran tres grupos generales de procedimientos para la transferencia potencial de la apomixis a especies sexuales: i) hibridizacin clsica entre una planta sexual y un pariente apomctico natural; ii) iniciacin de la expresin de la apomixis por experimentos de bloqueo de genes (mutantes T, etiquetado transposicional, mutagnesis); iii) transformacin de cultivares sexuales con genes que controlan la expresin del carcter. Las dos primeras aproximaciones ya fueron intentadas, aunque los proyectos no han sido exitosos hasta el momento, mientras que la tercera opcin todava contina siendo hipottica. Los primeros experimentos dirigidos a introducir la apomixis a travs de cruzamientos fueron realizadas cerca de 40 aos atrs por D. F. Petrov, quien realiz hibridaciones entre maz y razas tetraploides de Tripsacum dactiloydes (una especie diplosprica tambin perteneciente a la tribu de la Andropogneas igual que el maz). Posteriormente otros grupos de investigacin produjeron hbridos interespecficos de mazTripsacum que se reproducen por apomixis. Sin embargo, como los genotipos obtenidos luego de una serie de retrocruzas con maz son completamente macho-estriles, el progreso en la recuperacin del genoma de esta especie est fuertemente asociado con la posibilidad de generar hbridos con algn gra-

do de reproduccin sexual (apomcticos facultativos). La imposibilidad de generar este tipo de individuos es la principal dificultad que enfrenta este sistema. Una dificultad adicional es el fuerte requerimiento de una relacin 2:1 en el nmero de genomas haploides maternos y paternos que contribuyen a la formacin del endospermo en maz. Estos problemas han demorado el progreso de la introduccin de la apomixis en maz en los ltimos aos. La transferencia de la apomixis al mijo perla (Pennisetum glaucum) desde P. squamulatum por un programa de mejoramiento iniciado al final de los 70 es considerado el ms avanzado de su clase. En este esquema las retrocruzas con Pennisetum glaucum han avanzado hasta la generacin BC7, mediante la seleccin de grandes progenies para identificar individuos apomcticos parcialmente macho frtiles. Estas plantas son morfolgicamente muy parecidas al mijo perla, aunque producen un bajo nmero de semillas viables. Este hecho estara vinculado a la formacin del endospermo y es un inconveniente que an resta resolver. En resumen, la factibilidad de la transferencia est an por demostrarse. Los principales obstculos son: equilibrar el balance endosprmico y lograr la expresin de la apomixis a nivel diploide. Aqu se debera lograr, seguramente a travs de un esfuerzo multidiciplinario internacional, un conocimiento profundo de la relacin entre la expresin de la apomixis y la poliploida, especialmente de la autopoliploida. En gramneas de la subfamilia Panicoideas ( Paspalum , Panicum, Tripsacum, Brachiaria, Melinis y otras) es posible que el sistema apomctico difiera del que existe en Pooideas ( Poa , Elymus y otras). Son necesarios conocimientos bsicos ms profundos de la embriologa de especies silvestres con sistemas apomcticos, para determinar qu gnero o qu especie son los ms adecuados como fuente para obtener los genes que podran utilizarse hipotticas transformaciones genticas que permitan usar la apomixis en los cereales. Los intentos para generar mutantes apomcticas inactivando genes de la sexualidad por etiquetado transposicional o mutagnesis no han tenido xito an en re-

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crear el carcter pero permitieron la identificacin de varios genes involucrados en el control de etapas particulares de su desarrollo, como la proliferacin del endospermo en ausencia de fertilizacin. La transformacin gentica de cultivares sexuales con genes que controlan el inicio del carcter es an hipottica, ya que la identificacin de esos genes no se ha logrado. 7 Caracterizacin molecular de la apomixis En los ltimos aos la tecnologa de marcadores moleculares y los procedimientos de biologa molecular han generado una cantidad considerable de conocimientos nuevos sobre las bases moleculares de la apomixis que pueden ser tiles para el futuro aislamiento del/los genes que controlan el carcter. Han sido identificados varios marcadores que cosegregan con la apomixis en distintos gneros de gramneas como Tripsacum , Pennisetum, Brachiaria y Paspalum. Estos marcadores ligados al carcter pueden emplearse en el estudio de la transmisin del mismo en los programas de mejoramiento de especies apomcticas y eventualmente intentar cualquiera de las estrategias de clonado basadas en el mapeo gentico para aislar el/los disparadores del fenmeno. El anlisis molecular posibilit la identificacin de una regin genmica especfica de la apospora (ASGR) en Pennisetum squamulantum que est ausente en individuos sexuales y donde la recombinacin est severamente restringida. En Tripsacum dactyloides, Paspalum simplex y Paspalum notatum se detectaron regiones similares en donde numerosos marcadores aparecen completamente ligados al carcter (ver figura 4). La ausencia de recombinacin bien podra estar asociada a una estrategia para evitar la dispersin de los factores que necesitan cosegregar estrictamente para determinar la apomixis. La existencia de una regin ASGR de baja recombinacin puede enmascarar la presencia de varios genes que gobiernan al carcter, hacindolos aparecer y funcionar como una sola unidad gentica. Una caracterizacin molecular detallada de este segmento cromosmico revelar en el futuro la variedad y el nmero de genes

involucrados. Dado que varios elementos diferencian a la apomixis de la sexualidad (apomeiosis, partenognesis, pseudogamia y a veces desarrollo autnomo del endospermo) la cuestin de si la apomixis es consecuencia de la expresin de un solo gen mayor o de un grupo de factores ligados y coadaptados es uno de los problemas a resolver en el futuro cercano. Varios trabajos recientes enfocados en estudios de expresin han informado el aislamiento de transcriptos de mRNA especficos del desarrollo apomctico en varias gramneas La mayora de los transcriptos aislados hasta el momento no muestran similitudes con genes de funcin conocida. En Paspalum notatum se identific una familia gnica de expresin aumentada en flores de plantas apospricas cuyo producto proteico presenta sitios de control por el complejo de cdc2 ciclinas tpicos de protenas del citoesqueleto. Asimismo, por comparaciones de los perfiles proteicos en geles de dos dimensiones se identific una a tubulina caracterstica de lneas partenogenticas. Anlisis de expresin de este tipo pueden conducir en el futuro a la identificacin y el clonado de genes involucrados en las primeras etapas del desarrollo apomctico y al eventualmente al aislamiento del disparador mismo de la apomixis. 8 Perspectivas A pesar de que an necesitan ser respondidas numerosas cuestiones sobre la accin de genes, la funcin y la regulacin de la apomixis, se vislumbra para el futuro un escenario promisorio. Nuestro entendimiento de las bases moleculares de la apomixis se ha incrementado a causa del desarrollo de tcnicas poderosas de biologa molecular y al creciente inters en el tema despertado en las instituciones cientficas e investigadores. Por otra parte, con el advenimiento del anlisis genmico a gran escala se dispone de nuevas herramientas para el descubrimiento de genes y los anlisis de expresin. Los resultados obtenidos hasta ahora han contribuido al mejoramiento de las especies apomcticas, muchas de las cuales son recursos naturales importantes y al uso de las ventajas intrnsecas de este modo de reproduc-

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cin en la generacin de variedades mejoradas, como es el caso de las gramneas forrajeras tropicales y subtropicales. Es de esperar que en los prximos aos el conocimiento de las bases genticas y moleculares del carcter se incremente considerablemente. Esto har posible la comprensin del mecanismo biolgico responsable de la apomixis, as como su transferencia a las especies de gran cultivo. Para esto se requerir un fuerte apoyo financiero a los estudios bsicos sobre el tema. Por otra parte, dado que la problemtica del carcter es muy compleja ser indispensable fortalecer la cooperacin internacional ya existente para mantener un espacio de discusin y de intercambio de materiales e informacin. 9 Lecturas recomendadas
ASKER, S.E. and JERLING, L. (1992). Apomixis in plants. CRC Press, London. DO VALLE, C.B. and MILES, J.W. (2001) Breeding of apomictic species. In: SavidanY, Carman JG and Dresselhaus T (eds.) 2001. The flowering of apomixis: from mechanisms to genetic engineering. Mexico DF. CIMMYT, IRD, European Commission DG VI (FAIR). pp. 137-152. GRIMANELLI, D.; LEBLANC, O.; PEROTTI, E. and GROSSNIKLAUS, U. (2001) Developmental genetics of gametophytic apomixis. Trends in Genetics 17: 597-604.

KOLTUNOV, A.M. (1993). Apomixis: embryo sacs and embryos formed without meiosis or fertilization in ovules The Plant Cell 5: 1425-1437. KOLTUNOW, A.M.; BICKNELL, R.A. and CHAUDHURY, A.M. (1995) Apomixis: molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilisation. Plant Physiol. 108: 1345-1352. MARTNEZ, E. J.; HOPP, E.; STEIN, J.; ORTIZ, J.P. y QUARN, C.L. (2003) Genetic characterization of apospory in tetraploid Paspalum notatum based on the identification of linked molecular markers. Molecular Breeding 12: 319-327 NOGLER, G.A. (1984) Gametophytic Apomixis. In: Johri BM (ed) Embryology of Angiosperms. Springer-Verlag, Berlin. PESSINO, S.C.; ORTIZ, J.P.A.; HAYWARD, M.D. and QUARN, C.L. (1999). The molecular genetics of gametophytic apomixis. Hereditas 130: 1-11. SAVIDAN, Y. (2000) Apomixis: Genetics and Breeding. In: Plant Preeding Reviews, volume 18. J. Janick (Ed.). John Wiley & Sons, Inc. London. VIELLE-CALZADA, J.P.; CRANE, C.F.; STELLY, D.M. (1996a) Apomixis: The Asexual Revolution. Science 274:1322-1323.

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VIII.-Captulo 4
Tcnicas de ingeniera gentica para conferir resistencia a virus en plantas
del Vas, M.; Distfano, A.J.; Vazquez Rovere, C.; Hopp, H.E. 1 Introduccin Las enfermedades de las plantas causan la prdida de aproximadamente el 15% de la produccin agrcola mundial. En particular, las infecciones virales producen perjuicios econmicos significativos de manera directa, a travs de una disminucin del rendimiento por efecto de la enfermedad e indirecta, a travs de un incremento en los costos debido a la utilizacin de semilla libre de virus (por ejemplo, en plantas de propagacin clonal como papa, ajo y batata). Por otro lado, la exportacin de ciertos productos se ve restringida debido a las limitaciones internacionales impuestas a la exportacin de materiales fuera de la calidad y tolerancia fitosanitaria permitidas. Clsicamente, las enfermedades virales en plantas se controlan mediante distintas estrategias como el mejoramiento gentico, el uso de semillas libres de virus, la rotacin de cultivos y la tcnica de proteccin cruzada (que se describe brevemente ms adelante). A partir de 1983, cuando Fraley y col. obtuvieron plantas de tabaco y petunia transgnicas, se public un gran nmero de trabajos detallando la transferencia de genes forneos a una cantidad creciente de especies de plantas. La ingeniera gentica permite incorporar en las plantas nuevos caracteres de inters agrcola en forma horizontal, evitando as el traspaso de caracteres indeseables. De esta forma, la variedad transgnica adquiere un carcter nuevo al tiempo que mantiene intactos el fondo gentico y el potencial productivo original, lo que permite encarar el mejoramiento rpido de cultivares ya utilizados por el agricultor. Los transgenes introducidos pueden provenir de otras variedades de la misma especie vegetal, de plantas de otras especies

sexualmente incompatibles e incluso de organismos pertenecientes a otros reinos incluyendo animales y microorganismos. En sentido amplio existen dos formas de modificar plantas por ingeniera gentica de manera de conferirles resistencia al virus: desencadenar resistencia mediante la expresin de secuencias genmicas derivadas del propio virus al que se desea combatir (llamada resistencia derivada del patgeno o PDR) o desencadenar resistencia mediante la expresin de genes no-virales que poseen actividad antiviral. 2 Resistencia a virus conferida por genes virales La prevencin del desarrollo de enfermedades virales utilizando genes derivados del patgeno fue propuesta por primera vez a comienzos del siglo XX, cuando se demostr que las plantas de tabaco podan ser protegidas frente a la infeccin con una cepa severa del virus del mosaico del tabaco (Tobacco mosaic virus o TMV) si, previamente, se las haba inoculado con una cepa menos virulenta del mismo virus (McKinney, 1929). Este tipo de estrategia, comnmente denominada proteccin cruzada, ha sido empleada para varios cultivos de importancia econmica, incluyendo tomate, papaya, ctricos, etc. (Gadani y col., 1990). En 1985, Sanford y Johnston propusieron que la expresin de ciertos genes del patgeno en un hospedante alterara el balance normal de los componentes virales y predijeron que esto conducira al impedimento de la replicacin o del movimiento del virus dentro de la planta ms all de la primera clula infectada (Sanford & Johnston, 1985). Las primeras plantas transgnicas con resistencia a virus se obtuvieron en 1986 mediante la expresin del gen que codifica para la cpside del TMV (Abel y col., 1986). Utilizando esta estrategia se logr obtener plantas resistentes a virus pertenecientes a casi todos los gneros de virus de plantas, principalmente en tobamo-, potex- y alfamovirus (Tabla 1). En general, las plantas protegidas muestran un retardo temporal del desarrollo de sntomas, una atenuacin en la sintomatologa caracterstica de cada virus en parti-

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tas estrategias no se detallarn debido a que actualmente hay Gneros de transgn Virus Especies vegetales virus evidencias de que en varios casos su efectiTobamovirus CP TMV; ToMV; AIMV tabaco; tomate vidad se debe a la induccin del mecanisPotexvirus CP PVX; CyMV; WCIMV tabaco mo de resistencia Potyvirus CP PVY; TEV; PRV; PPV PPV; tabaco; papa; papaya; mediada por ARN maz MDMV; SMV; WMV II; que se describe a conZYMV tinuacin. Carlavirus CP tabaco; papa PVS En 1992 se demostr, por primera Luteovirus CP PLRV papa vez, que se poda Comovirus CP SLRSV tabaco obtener resistencia a virus mediante la exNepovirus CP ArMV tabaco presin de un ARNm Tobravirus CP TRV tabaco de cpside viral no Ilavirus CP TSV tabaco traducible, es decir, no era necesaria la Geminivirus CP TYLCV tomate expresin de la proTospovirus Gen N TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco tena codificada por el transgn (Lindbo Los acrnimos utilizados (en orden alfabtico) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: & Dougherty, 1992). Arabis mosaic virus; CMV: Cucumber mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; A partir de entonces GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV: Impatiens necrotic spot virus; MDMV: Maize se publicaron numedwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum pox virus; PRV: Papaya rosos trabajos proringspot virus; PVS: Potato virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV: Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato fundizando la caracchlorotic spot virus; TEV: Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: terizacin de este Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle virus; TSV: Tobacco streak virus; TSWV: tipo de resistencia a Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV: White virus, llamada en senclover mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow tido amplio resismosaic virus. tencia mediada por ARN . Las plantas que muestran este tipo cular, una menor cantidad de sitios de infecde resistencia presentan un fenotipo de incin y un menor ttulo viral. Se demostr que munidad que se caracteriza porque no hay hay una correlacin entre la resistencia y el replicacin viral detectable, no hay diseminanivel de expresin de la protena de la cin viral dentro de la planta y no hay sntocpside, que la proteccin acta en el pla- mas debido a la enfermedad, o un fenotipo no celular y es superada por altas dosis de de recuperacin que se caracteriza por una inculo (viriones). En algunos casos es su- infeccin inicial (con produccin de sntomas) perada por inoculacin con ARN viral. que es seguida por un crecimiento posterior La proteccin es ms efectiva para el vi- resistente a la infeccin y asin-tomtico. En rus homlogo al que dio origen al transgn. cualquiera de los dos casos, las plantas son Sin embargo, abarca tambin a virus y cepas solamente resistentes a la infeccin producirelacionadas aunque la eficiencia se va redu- da por virus mucho ms estrechamente relaciendo a medida que la relacin filogentica cionados con el virus que dio origen al transgn que en el caso de proteccin mese hace ms lejana. Adems, se logr obtener resistencia a diada por cpside. El anlisis de estas planvirus mediante la expresin de otras prote- tas en el plano molecular demostr que en nas virales tales como las protenas respon- general contienen copias mltiples del sables de la multiplicacin viral (por ejem- transgn y que si bien presentan un alto niplo ARN polimerasas dependientes de ARN) vel de transcripcin en el ncleo, los niveles y las protenas responsables del movimien- estables del ARNm del transgn en el citoto viral de clula a clula disfuncionales. Es- plasma son muy bajos. Usualmente se ob-

Tabla 1: Ejemplos de resistencia a virus mediante la expresin de la protena de cpside (CP) o nucleocpside (Gen N) viral en plantas transgnicas.

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serva adems metilacin de la regin codificante del transgn. 2.1 Mecanismo de proteccin debida a la expresin de la protena de cpside viral (CP) Como se mencion, las primeras plantas transgnicas con resistencia a virus se obtuvieron mediante la expresin del gen que codifica para la cpside del TMV. Estas plantas resultaron resistentes a la inoculacin con partculas virales de TMV pero la resistencia era sobrepasada si se las inoculaba con ARN viral infectivo. Se postul entonces que la proteccin se deba a la inhibicin del desnudamiento viral en las clulas infectadas inicialmente. Varias lneas de evidencia apoyan esta hiptesis. Por ejemplo si se inoculan protoplastos derivados de plantas transgnicas que expresan la CP de TMV o plantas no transformadas con pseudoviriones (partculas formadas por la CP viral que contienen en su interior un ARNm no viral) de TMV que contienen ARNm que codifica para la enzima indicadora glucuronidasa (GUS), se observa que hay una marcada disminucin de la actividad GUS en los protoplastos derivados de las plantas transgnicas. Esto se debe probablemente a la falla en el desnudamiento de los viriones (Osbourn y col., 1989). Ms adelante se demostr que las protenas de cpside mutagenizadas para anular la habilidad de autoagregarse no son capaces de conferir proteccin frente a TMV, y que las protenas mutantes capaces de interactuar entre ellas con afinidad ms alta conferan mayor proteccin que la protena de cpside salvaje. Es decir que se estableci una relacin directa entre el nivel de agregacin de la protena de cpside y el nivel de proteccin frente a TMV (Bendahmane y col., 1997). Si bien estos trabajos apoyan la hiptesis de que en las plantas transgnicas para CP hay una inhibicin en una etapa temprana de la infeccin, no se puede descartar que, adems, la expresin de protena de cpside impida o modifique etapas ms tardas de la infeccin. Si se injerta una porcin de planta transgnica que muestra proteccin mediada por cpside entre una base y un pice no transgnicos y se inocula la planta injertada

en la base no transgnica, se observa que el virus no puede moverse hacia el pice, es decir que no puede atravesar la zona transgnica protegida (Wisniewski y col., 1990). Sin embargo, la supresin del movimiento vascular involucra tambin el empaquetamiento y desnudamiento viral, y cabe la posibilidad de que la supresin del movimiento vascular sea una consecuencia secundaria de la inhibicin del desnudamiento viral en las plantas expresando protena de cpside. Otro caso muy estudiado es el del virus PVX de la papa. Las plantas transgnicas para la cpside de PVX resultan protegidas ante la inoculacin con virus o con ARN viral (Hemenway y col., 1988). Se postula que la protena de cpside se une al origen de ensamblado localizado en el extremo 5 del ARN viral, suprimiendo de esta manera la traduccin de la replicasa viral (cuyo gen est localizado en el mismo extremo). Tambin es posible que inhiba el movimiento de PVX de clula a clula, ya que la protena de cpside es un cofactor esencial de la traslocacin sistmica (Chapman y col., 1992). Como se desprende de los dos ejemplos descriptos, el mecanismo de proteccin mediado por la protena de cpside no es nico, y es particular para cada sistema virus-planta. 2.2 Mecanismo de proteccin debida al desencadenamiento de resistencia mediada por ARN Es conocido que distintos eventos de transformacin obtenidos con la misma construccin gentica pueden dar lugar a una variada gama de expresin del gen de inters (efecto de posicin). Hay muchos ejemplos en los que la caracterstica que uno desea expresar no se expresa o su expresin desaparece a lo largo de las distintas generaciones. Esta prdida de la caracterstica deseada (pero no del transgn correspondiente) se denomina silenciamiento gnico y el primer ejemplo se describi en petunias para el gen de la chalcona sintetasa (Napoli y col., 1990). Dependiendo del nivel de accin en el cual ocurre el silenciamiento gnico, se pueden distinguir el silenciamiento transcripcional (TGS) y el silenciamiento postranscripcional de genes (PTGS). El TGS se

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manifiesta por una falta de expresin del gen en cuestin debido a la metilacin de la regin promotora, lo cual impide la normal transcripcin del gen. Este tipo de silenciamiento se hereda meiticamente y se desencadena por interaccin entre varias copias de un transgn que tienen homologa en sus regiones promotoras. El PTGS se manifiesta por una supresin del efecto del gen en cuestin ocasionado por una degradacin inducible y especfica del ARNm transcripto. Para desencadenar este tipo de mecanismo se requiere de homologa en la regin transcripcional entre los genes que interactan y puede estar acompaado de metilacin de la secuencia de ADN codificante. Este mecanismo de degradacin de ARN especfico de secuencia evolucion como un mecanismo de defensa antiviral en plantas. Si bien se describi por primera vez en plantas, se lo ha encontrado tambin en hon-

gos (donde se denomina quelling) y animales como nematodos, moscas o mamferos (donde se lo denomina interferencia mediada por ARN). El PTGS puede ser desencadenado eficientemente por transgenes nucleares que dan lugar a transcriptos con estructura de ARN de doble cadena (ARNdc) o que expresan altos niveles o niveles aberrantes de transcriptos. En plantas tambin puede ser desencadenado por la replicacin de virus que generalmente produce intermediarios replicativos de ARNdc. Una vez desencadenado el proceso, los intermediarios que contienen ARNdc son reconocidos por una nucleasa especfica de ARNdc que los procesa en fragmentos de ARNs pequeos (llamados pequeos interferentes -small interfering- ARNs o ARNsi) de ambas polaridades y de 21 a 25 nucletidos de longitud (Hamilton & Baulcombe, 1999). A su vez, se postula que

Figura 1: Mecanismo propuesto para la iniciacin, diseminacin de la seal mvil y degradacin del ARNm blanco durante el proceso de silenciamiento gnico postranscipcional (PTGS) dentro de una planta. RdRP: ARN polimerasa dependiente de ARN.

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los ARNsi actan como guas para dirigir la maquinaria de degradacin de ARN contra todo aquel ARN con homologa a la secuencia desencadenante. Un aspecto a destacar es que el silenciamiento mediado por ARN es desencadenado localmente y luego transmitido a toda la planta va una seal de silencia-miento mvil (Palauqui y col., 1997, Voinnet & Baulcombe, 1997). Si bien se desconoce por el momento la naturaleza de la seal, se postula que sta contiene un componente de cido nucleico que explicara la especificidad de secuencia del mecanismo de degradacin y un componente proteico. Asimismo, por prospeccin gentica de mutantes de Arabidopsis se han identificado numerosos genes que codifican para una serie de factores que intervienen en el proceso de PTGS, como por ejemplo ARN polimerasas dependientes de ARN que sintetizan ARNdc, protenas que forman parte de los complejos de degradacin del ARN blanco, etc. Las plantas mutantes para estos genes no son capaces de desencadenar PTGS. Recientemente se han publicado numerosas recopilaciones del tema (Vzquez Rovere y col., 2002, Voinnet, 2001, Waterhouse y col., 2001). En la Figura 1 se esquematiza el mecanismo subyacente al PTGS. Dado que el PTGS es un mecanismo de defensa antiviral en plantas, resulta esperable que se haya seleccionado en los virus de plantas la capacidad de contrarrestar a este mecanismo. Congruentemente con esta especulacin, se encontr que varios virus de plantas codifican para protenas supresoras del PTGS (Anandalakshmi y col., 1998, Beclin y col., 1998, Brigneti y col., 1998). Luego de una bsqueda exhaustiva de supresores de silenciamiento en una gran cantidad de virus de plantas, Voinnet y col., concluyeron que prcticamente todos los virus llevan supresores de silenciamiento, que los genes que los codifican tienen secuencias y origen evolutivo diversos, y que los distintos supresores actan inhibiendo el silenciamiento a distintos niveles (Voinnet y col., 1999). Algunos, como la protena HC-Pro codificada por los potyvirus previenen la acumulacin de los ARNsi, pero no eliminan la seal mvil que propaga el silenciamiento (Llave y col., 2000). Otros supresores, como la protena p25 del virus PVX interfieren con la seal de propa-

gacin sistmica (Voinnet y col., 2000), y finalmente otros, como el codificado por el virus del achaparramiento del tomate (Tomato bushy stunt virus o TBSV), suprimen el silenciamiento slo en las nervaduras (Voinnet y col., 1999). Incluso se han encontrado en virus animales supresores de silenciamiento que son funcionales en plantas (Li y col., 2002). Es interesante destacar que varios de los supresores de silenciamiento virales descriptos haban sido previamente caracterizados como protenas responsables de la sintomatologa, del movimiento viral y/ o del fenmeno de sinergismo en la virulencia combinada de dos o ms virus. La posibilidad de la supresin del silenciamiento por parte de un virus que coexista con las plantas transgnicas protegidas por el mecanismo de silenciamiento gnico debe ser tomada en cuenta ya que la infeccin de una planta silenciada con un virus heterlogo que lleva un supresor de silenciamiento puede dar lugar a la reversin del silenciamiento tornndola susceptible a la infeccin viral (Beclin y col., 1998). Resulta importante entonces estudiar qu virus coinfectan un mismo hospedador en condiciones naturales y en lo posible utilizar plantas transgnicas con resistencia a ambos virus. Un aspecto interesante a recalcar es que, debido a que el mecanismo de PTGS implica una muy baja acumulacin del ARN derivado del transgn y una nula acumulacin de protenas, la estrategia de obtener resistencia a virus mediante el desencadenamiento de este fenmeno en plantas transgnicas es ms atractiva desde el punto de vista de la evaluacin de riesgos en cuanto a la bioseguridad de estos organismos genticamente modificados u OGMs, que la sobreexpresin de genes que interfieran con el ciclo de multiplicacin viral, como es el caso de la cpside u otras protenas virales. Esto se debe a que la baja acumulacin de ARN transgnico minimiza las posibilidades de una potencial recombinacin homloga con ARN de origen viral infectante. Por otro lado, la ausencia de la protena codificada por el transgn minimiza drsticamente el anlisis de riesgo alimentario del OGM y evita el riesgo de transcapsidacin (la encapsidacin del material gentico de otros virus) en el caso

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en que el transgn codifique para la protena de cpside viral funcional. 3 Resistencia a virus conferida por genes no virales Adems de la resistencia derivada del patgeno (PDR), en los ltimos aos se han explorado estrategias alternativas para la obtencin de plantas transgnicas con resistencia a enfermedades virales. Entre ellas se destaca el uso de inhibidores naturales y especficos de la replicacin viral como la protena antiviral pokeweed (PAP), la expresin de anticuerpos en plantas o plantibodies, la expresin antisentido de genes de plantas esenciales para el ciclo de vida viral y la expresin de la enzima 2-5oligoadenilato sintetasa de mamferos en plantas (Truve y col., 1993). A continuacin se describirn brevemente las dos primeras estrategias debido a que son las consideradas ms promisorias. 3.1 Expresin de protenas antivirales de origen vegetal

Las protenas antivirales de la planta Phytolacca Tabla 2: Plantas transgnicas con resistencia a virus autorizadas para su comercializacin. americana (lla- (fuente AGBios: http://www.agbios.com/dbase.php) mada pokeweed en ingls) (PAP) conforman uno de los grupos ms importantes de protenas usadas como inhibidores naturales de la replicacin viral. Las protenas PAP inactivan los ribosomas (pertenecen a la familia de las RIP o protenas inactivadoras de ribosomas) y su aplicacin exgena protege a plantas

heterlogas de infecciones virales. Se demostr que la expresin de esta protena en plantas de papa y tabaco transgnicas las protega frente a una variedad de viruses, sea que stos fueran inoculados mecnicamente o por fidos vectores (Lodge y col., 1993). El estudio de esta resistencia demostr que la protena PAP inhiba un paso temprano de la infeccin. Estas protenas son potencialmente txicas para la planta husped (Wang & Tumer, 2000). En los ltimos aos se encontraron o redisearon variantes menos txicas o no txicas de estas protenas las que, expresadas en plantas transgnicas, confieren resistencia a virus sin producir el efecto de la inactivacin de los ribosomas (Wang y col., 1998, Zoubenko y col., 2000). Por otro lado, se estudi la actividad antiviral de la protena IRIP (protena RIP obtenida de bulbos de iris) en plantas transgnicas de tabaco. Esta protena es una ARN-N-glicosidasa y su expresin en plantas transgnicas no produjo cambios fenotpicos observndose una reduccin significativa de las lesiones producidas por el virus TMV con respecto a las plantas control (Desmyter y col., 2003).

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Tabla 3: Plantas transgnicas con resistencia a virus en etapas avanzadas de experimentacin en laboratorio (e) o de pruebas piloto a campo (c) en pases en vas de desarrollo (fuente: FAO.Bio.Dec www.fao.org/biotech/ inventory_admin/dep/default.asp).

Cultivo

Virus

Pas

moscada

Los acrnimos utilizados fueron: BGMV: Bean golden yellow mosaic virus; BYDV: Barley yellow dwarf virus; CLCV: Cotton leaf curl virus; CMV: Cucumber mosaic cucumovirus; CPsV: Citrus psorosis virus; CVBMV: Chilli vein-banding mottle virus; MSV: Maize streak virus; PAMV: Potato aucuba mosaic virus; PLRV: Potato leafroll luteovirus; PMV: Papaya mosaic virus; PRSV: Papaya ringspot virus; PStV: Peanut stripe virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; RDV: Rice dwarf virus; RRSV: Rice ragged stunt virus; SCMV: Sugarcane mosaic virus; SMV2: Soybean mosaic virus; SPMFV: Sweet potato feathery mottle virus; TMV: Tabaco mosaic virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TuMV: Turnip mosaic virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; ZAMV: Zantedeschia mosaic potyvirus. ZYMV: Zuchini yellow mosaic potyvirus.

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La ventaja de expresar protenas de tipo PAP en plantas transgnicas es que se logra resistencia a un amplio espectro de virus mediante la expresin de un nico gen a diferencia de los mtodos descriptos previamente que son especficos para un tipo de virus o virus cercanamente relacionados. 3.2 Expresin de anticuerpos en plantas transgnicas Una estrategia alternativa que se comenz a utilizar en los ltimos aos es la expresin de anticuerpos completos o fragmentos de los mismos en plantas transg-nicas para obtener resistencia a virus. En 1993 se demostr que la expresin constitutiva de un anticuerpo de cadena nica (scFv) dirigido contra la protena de cpside del virus del moteado crujiente de la achicoria (Artichoke mottled crinkle virus) causaba una reduccin en la susceptibilidad al virus, que se pona de manifiesto por una baja en la incidencia de la infeccin y un retraso en la aparicin de los sntomas (Tavladoraki y col., 1993). En 1996 se expres un anticuerpo monoclonal de cadena nica (scFv) contra la protena de cpside del virus de la vena necrtica amarillenta de la remolacha (Beet necrotic yellow vein virus) en Nicotiana benthamiana (Fecker y col., 1996) y en el 2000, Schillberg y col. mostraron que la expresin de la cadena Fv contra la protena de cpside del virus TMV en la membrana plasmtica de plantas de tabaco transgnicas confera resistencia al virus (Schillberg y col., 2000). Hasta el momento se desconoce el mecanismo por el cual la expresin de anticuerpos o fragmentos de los mismos confiere resistencia a virus, pero se demostr que para que la estrategia sea efectiva es indispensable lograr altos niveles de expresin y que los anticuerpos se expresen en el compartimento celular donde ocurre la replicacin viral para que sta sea inhibida en forma efectiva. Por ltimo, los anticuerpos deben seleccionarse correctamente para que bloqueen los pasos cruciales en la replicacin o transmisin del virus. En los ltimos aos se han desarrollado protocolos sencillos para mejorar los anticuerpos a utilizar, que incluyen la seleccin de anticuerpos monoclonales usando las tec-

nologas de hibridoma y construccin de genotecas utilizando la tcnica de exhibicin de epitopes en bacterifagos o phage display (Schillberg y col., 2001). Es importante destacar que los anticuerpos monoclonales que reconocen a la polimerasa viral o alguna otra protena viral con actividad cataltica, son ms promisorios que los que reconocen protenas estructurales como es el caso de la cpside viral. Por lo tanto, la expresin de anticuerpos dirigidos contra protenas virales esenciales podra proveer una alternativa interesante para obtener resistencia a virus. 4 Plantas transgnicas con resistencia a virus cultivadas comercialmente o en etapas avanzadas de experimentacin En los ltimos aos se ha autorizado el cultivo comercial y consumo de una variedad de plantas transgnicas con resistencia a virus basada en alguno de los mecanismos descriptos (Tabla 2). Existe otro grupo muy importante de plantas transgnicas con resistencia a virus que se encuentran en etapas avanzadas de experimentacin o de pruebas piloto a campo. Es interesante constatar que los pases en vas de desarrollo han adoptado esta tecnologa y trabajan activamente en la obtencin de plantas de cultivos de inters local con resistencia a virus (Tabla 3). 5 Lecturas Recomendadas
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VIII-Captulo 5
Obtencin de plantas libres de virus
Conci, Vilma C. 1 Eliminacin de virus Los virus de plantas son responsables de importantes prdidas en los rendimientos, llegando en algunos casos a ser limitantes para el cultivo. La mayora de los virus no se transmiten por semilla, por lo tanto, las especies que se multiplican por esta va tienen la posibilidad de liberarse de ellos en forma natural. Por otra parte, cuando las especies que se propagan exclusivamente en forma agmica son infectadas sistmicamente por virus ellos son transmitidos, con alta eficiencia, desde la planta madre a la descendencia. Esta situacin. que es normal en especies que se multiplican por bulbos, tubrculos, esquejes o estacas permite que la infeccin contine de generacin en generacin y se disemine a diferentes regiones a travs del comercio de estos propgulos. Ejemplo de ello son ajo, frutilla, frutales de carozo o pepita, yuca, papa, batata y numerosas especies ornamentales. En estos casos, la obtencin y multiplicacin de plantas libres de virus por medios artificiales juega un papel importante para mejorar la produccin y calidad de estas especies. Existen numerosos ejemplos respecto a los beneficios obtenidos como consecuencia del empleo de plantas libres de virus, no slo por los incrementos en la produccin sino que adems ha permitido la recuperacin de reas de cultivo que haban sido prcticamente abandonadas. Una larga lista de especies han sido liberadas de virus a travs de la regeneracin de plantas in vitro. El sistema ms frecuentemente utilizado y con mayores xitos es el cultivo de meristema, suplementado en muchos casos por tratamientos de termoterapia o quimioterapia. 1.2 Cultivo de meristemas Esta tcnica consiste en aislar el meristema y sembrarlo en un medio de cultivo adecuado que posibilite el desarrollo de

una planta completa. El trmino cultivo de meristema, por lo general, no es correctamente empleado, ya que en la mayora de los casos se siembra el domo meristemtico acompaado por uno o dos primordios foliares. El domo es una estructura de menos de 0,1 mm de dimetro muy difcil de extraer con xito en forma aislada, y de la cual resulta con frecuencia complicado obtener plantas completas. Para ello es necesario un medio de cultivo con una concentracin de nutrientes muy equilibrada y condiciones ambientales muy estrictas. Por consiguiente los resultados en ese sentido han sido muy pobres. Por esta razn, en la mayora de los casos, se utiliza el domo acompaado de uno ms primordios foliares. Tal vez lo ms aconsejable sera utilizar el trmino cultivo de yema, o brote, o tallo. A pesar de ello, en este captulo utilizaremos la denominacin cultivo de meristema por ser esta la terminologa ms difundida, aunque no sea estrictamente correcta. En general se considera que las plantas provenientes del cultivo de meristema son idnticas u homlogas a la planta madre de donde se extrajo el explanto. Por el contrario, las plantas derivadas de otros tejidos como callos, nucela, primordios florales o protoplastos, usualmente presentan distintos grados de variabilidad. Esto ltimo no es deseable para la produccin de plantas libres de virus, donde el objetivo que se persigue es mejorar la sanidad de la planta pero conservar el resto de sus caractersticas agronmicas. Sin embargo, es importante aclarar que han sido sealadas ciertas mutaciones en plantas provenientes de cultivo de meristema, pero con mucha menos frecuencia y menos importantes que las detectadas con otros sistemas de obtencin de plantas in vitro. El cultivo de meristema ha sido utilizado con xito para distintos objetivos, entre ellos los ms frecuentes son la rpida clonacin de material deseable (micropropagacin), conservacin de germoplasma a baja temperatura o criopreservacin y para la obtencin de plantas libres de patgenos sistmicos, entre ellos los virus, que son el objetivo de este captulo.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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2 Distribucin de los virus en la planta Los virus en la planta no estn uniformemente distribudos. En las infecciones sistmicas algunos estn limitados al floema o a pocas clulas parenquimticas adyacentes; otros involucran a todas, o casi todas, las clulas de la planta. Existen otros virus que dejan sectores de tejidos sin infectar y slo unos pocos invaden los nuevos tejidos meristemticos. Los meristemas suelen tener pocos o ningn virus. Las razones para que ello ocurra no estn esclarecidas completamente pero se mencionan como posibles las siguientes: 1.- Sistema vascular poco diferenciado. Los virus son rpidamente transportados a lo largo de toda la planta por el floema y as se distribuyen sistmicamente. Los meristemas no tienen tejido vascular formado, por lo tanto, el avance es solamente a travs del movimiento clula a clula. Se comprob que el Tobacco mosaic virus (TMV) y el Potato virus X (PVX) avanzan 1 a 8 cm/h por el tejido vascular y 5 a 15 /h de clula a clula. Por esta razn se supone que las clulas meristemticas no estn completamente invadidas por virus cuando estn en activo crecimiento. 2.- Elevada actividad metablica. Presumiblemente es ms difcil para un virus invadir clulas con elevada actividad metablica, como es el caso de las clulas meristemticas, donde tiene lugar una activa mitosis. 3.- Elevadas concentraciones de auxinas. Se ha observado que elevadas concentraciones de 2,4-D en el medio de cultivo inhiben la multiplicacin de los virus. Por lo tanto se puede suponer que las altas concentraciones de auxinas endgenas existentes en los pices meristemticos pueden producir un efecto similar. 3 Meristema apical El meristema apical incluye las clulas meristemticas iniciales y sus derivadas inmediatas del pice de la raz o del brote. El nmero de clulas iniciales es variable y pueden presentarse en una o ms filas.

Dentro del meristema apical se distinguen dos zonas de tejido: la tnica, que consta de una o ms capas perifricas de clulas, y el cuerpo, masa celular rodeada por la tnica. La demarcacin entre ambas zonas se deduce de las diferencias en la divisin de las clulas. Las capas de la tnica presentan predominantemente divisiones anticlinales, es decir, experimentan un crecimiento en superficie. Las clulas del cuerpo se dividen segn varios planos y la masa crece en volumen. El concepto de tnica-cuerpo fue desarrollado refirindose a las angiospermas pero resulta poco apropiado para la caracterizacin del meristema apical de las gimnospermas. En este grupo se presentan comnmente varias zonas de crecimiento derivadas de un grupo de clulas iniciales superficiales. El dimetro de los pices oscila entre 90 en algunas angiospermas a 3,5mm en el caso de Cyca revoluta. La forma y el tamao del pice cambian notoriamente durante el desarrollo de la planta. Las hojas se inician mediante divisiones periclinales de un pequeo grupo de clulas situadas al lado del meristema y su situacin en relacin al meristema apical vara en las diferentes especies (Fig. 1).

Primordios foliares Nudos

Figura 1: Esquema ilustrativo de la iniciacin de la hoja en el pice del brote de dicotilednea de hojas opuestas (Esau, 1959).

4 Factores que pueden afectar la produccin de plantas libres de virus Varios factores pueden afectar el buen desarrollo in vitro de una planta a partir de un meristema: el medio de cultivo empleado, el estado fisiolgico del explanto, la concentracin de hormonas endgenas del

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explanto, las contaminaciones internas o externas producidas durante el desarrollo del cultivo, el tamao y localizacin del explanto, etc. Mencionaremos aqu algunas consideraciones haciendo especial referencia a aquellas que afectan la obtencin de plantas libres de virus. - Localizacin del explanto: frecuentemente se utilizan meristemas apicales y axilares con buenos resultados. Sin embargo es aconsejable el uso de yemas terminales ya que tienen un mayor crecimiento potencial que las yemas laterales. En general, los meristemas ms jvenes se desarrollan mejor que los viejos y producen mayores cantidades de plantas libres de virus que las yemas laterales, probablemente porque tienen un crecimiento ms activo que las axilares. No obstante, tambin es posible la obtencin de plantas sanas a partir de yemas axilares. - Estacin o momento de la extraccin: los meristemas en activo crecimiento son los ms recomendados por su alto potencial de desarrollo, situacin que favorece las posibilidades de obtener plantas libres de virus. Para especies vegetales con perodos de dormancia definidos los mejores resultados se obtienen cuando los meristemas estn despiertos y comienzan a brotar. En el caso de ser necesario se recomienda despertar el material. Los tratamientos ms usados consisten en someterlo a perodos de fro (variable segn la especie) y/o el uso de cido giberlico. - Tamao del explanto utilizado : el meristema tiene una serie de requerimientos nutricionales para cumplir sus funciones de autoperpetuacin y de generar clulas para formar tejidos definidos. Por lo tanto, al ser retirado de la planta debe ser sembrado en un medio de cultivo apropiado, as rpidamente desarrolla en una planta completa. Cuanto ms pequeo sea el meristema (explanto) ms difcil ser encontrar el medio de cultivo adecuado que permita un buen desarrollo. Se ha observado que sembrar slo el domo meristemtico, en general no da buenos resultados. En la mayora de los casos no se desarrolla una planta, slo produce callo que luego puede, o no, regenerar

plantas. Como se mencion anteriormente, la diferenciacin a partir de callo implica un incremento en la posibilidad de aparicin de mutaciones y de variabilidad no deseada cuando se intenta obtener plantas genticamente iguales a las donantes de explantos. Por esta razn generalmente se cultiva el domo, con uno o dos primordios foliares, a partir del cual se obtiene con frecuencia una planta completa. El tamao del explanto, as como el nmero de primordios que deba poseer, depender, en cada caso, del objetivo que se persiga, la especie vegetal que se trate y el o los virus involucrados. En trminos generales, cuanto ms grande sea el explanto, mayor ser la posibilidad de regenerar plantas, pero menor la posibilidad de obtener plantas libres de virus. Si por el contrario se parte de plantas ya saneadas, o lo que se desea es slo la multiplicacin del material in vitro, se podrn usar yemas o brotes de mayor tamao y asegurar as el desarrollo de una planta sin mayores requerimientos nutricionales. Existe un gradiente de incremento en la concentracin de virus desde el domo meristemtico hacia los sucesivos primordios foliares coincidiendo con el grado de diferenciacin. Esto significa que la probabilidad de obtener plantas libres de virus es inversamente proporcional al tamao del explanto utilizado. Explantos de entre 0,2 y 0,5 mm son los que ms frecuentemente producen plantas libres de virus. Tambin se han informado, sin embargo, buenos resultados con el empleo de meristemas ms grandes. El tamao recomendado es variable y depende del hospedante, de tratamientos previos (termoterapia, quimioterapia, etc.) y del (o los) virus involucrados. En algunos casos no slo es importante considerar la especie hospedante sino tambin el cultivar, ya que se han detectado notables diferencias entre ellos. Por otra parte, es probable que el tamao del meristema por si solo no sea el factor que determina el xito en la obtencin de plantas libres de virus. Se han detectado numerosos virus en meristemas apicales de 0,10,5mm en diferentes especies (clavel, poroto, tabaco, tomate, petunia, papa, etc.). Sin embargo se ha logrado la obtencin de plantas sanas con explantos de esos tamaos o

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mayores, por lo que se podra suponer que la eliminacin de virus ocurre tambin durante el proceso de cultivo in vitro o por alguna otra razn no aclarada todava. 5 Desarrollo del cultivo El primer paso es la extraccin del meristema o explanto. Para ello se corta una porcin de tejido de aproximadamente 1cm que incluye el meristema y se desinfecta. Esto frecuentemente se realiza mediante la inmersin en alcohol seguida de inmersin en hipoclorito de sodio o calcio. Luego en la cmara de flujo laminar y con la ayuda de instrumental estril y bajo microscopio estereoscpico se procede a la escisin del explanto. Una vez extrado se coloca en un medio de cultivo adecuado en el cual es mantenido, para su desarrollo, bajo condiciones apropiadas de luz, temperatura y humedad. - Fase I: Etapa de iniciacin: el objetivo de esta primera etapa es iniciar el desarrollo del explanto cultivado en forma asptica. En general ocurre primero un aumento del tamao y luego el tejido puede ir adquiriendo lentamente pigmentacin verde. Posteriormente irn desarrollndose brotes o plantas completas a partir de las cuales pueden obtenerse yemas axilares. - Fase II: Etapa de multiplicacin: en esta etapa el objetivo es la multiplicacin activa del explanto para la produccin de numerosas plantas a partir de una, constituyendo as un clon proveniente de un solo meristema, denominado en este caso mericlon. La multiplicacin o micropropagacin puede efectuarse por proliferacin de brotes axilares, brotes adventicios, formacin de embriones somticos, etc., tratando siempre de evitar la formacin de callo como paso previo a la diferenciacin. La etapa de multiplicacin puede involucrar varios repiques del material a medio de cultivo fresco. Se ha visto con frecuencia que la tasa de multiplicacin vara con el tiempo de permanencia del explanto en el medio de cultivo. Es frecuente que despus de 2 o ms subcultivos aumente el nmero de yemas que se producen a partir de un explanto. Sin embargo no es aconsejable mantener el material indefinidamente en

esta etapa, ya que se ha observado un aumento de la variabilidad cuando las plantas son mantenidas por largos perodos en estas condiciones. En general, se considera que 10-12 subcultivos es lo mximo que debera mantenerse el material en esta etapa. - Fase III: Etapa de acondicionamiento para el transplante a tierra: frecuentemente las plantas desarrolladas in vitro no poseen races o, si las tienen, muchas veces no son funcionales. En general tienen malas conexiones vasculares entre la raz y el tallo. A nivel foliar puede estar alterada la produccin de clorofila. Los estomas no funcionan o lo hacen muy lentamente y la capa de cera epicuticular es muy reducida. La formacin de races adventicias es relativamente fcil de conseguir en plantas herbceas, y dificultosa en leosas. Existe una etapa de induccin de races, de iniciacin del crecimiento y de elongacin de las mismas. En esta fase del crecimiento se suele incrementar la intensidad de luz para favorecer la rusticacin de las plantas pero hay que tratar de que la misma no afecte a las races. Esto puede mejorarse cubriendo la base de los tubos con papel de aluminio o usando 0,3% de carbn activado en el medio de cultivo para proporcionar sombra a las races. Las plantas que se propagan por bulbos, tubrculos, rizomas, etc., pueden ser inducidas a formarlos in vitro para mejorar la eficiencia en el transplante, ya que stos pueden ser cosechados del tubo de ensayo y sembrados directamente en tierra sin mayores dificultades. -Transplante: en el momento del transplante es importante no daar las races. Es necesario lavarlas cuidadosamente para retirar los restos de agar, debido a que los medios de cultivo ofrecen un buen sustrato para el desarrollo de hongos y bacterias que pueden afectar el desarrollo de la planta en el suelo. El mayor problema en esta etapa es la deshidratacin debida a algunas caractersticas anatmicas que presentan las plantas creciendo in vitro (reducida cera epicuticular, lentitud de movimiento estomtico, abun-

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dantes espacios intercelulares, dificultades en la conexiones entre el tallo y la raz). Conviene transferir las plantas a macetas y mantenerlas con alta humedad relativa durante los primeros 15 das. Se han observado buenos resultados con el uso de roco artificial o neblina. Otra prctica frecuente es cubrir las plantas con polietileno o recipientes de vidrio transparente, a modo de cmara hmeda, y descubrirlas progresivamente hasta destaparlas completamente al cabo de 3 4 semanas. 6 Multiplicacin del material libre de virus ex vitro Las plantas libres de virus deben ser multiplicadas bajo condiciones controladas para evitar su recontaminacin. Una vez rusticadas y adaptadas nuevamente a las condiciones ex vitro ellas pueden ser multiplicadas bajo jaulas antivectores todo el tiempo que se considere necesario. En esta etapa es importante evitar que las plantas se reinfecten. Es recomendable la esterilizacin del suelo para evitar la contaminacin con nematodes y hongos, que en algunos casos son transmisores de virus. Las jaulas deben estar revestidas de una malla muy fina para evitar la entrada de los vectores. Es recomendable, para evitar la entrada de los vectores, utilizar una doble puerta que permita abrir una de las hojas y recin cuando est cerrada, abrir la otra. Peridicamente la malla debe ser controlada para detectar inmediatamente la presencia de roturas que dejen expuestas a las plantas. A pesar de estos cuidados, es recomendable aplicar insecticidas y mantener libre de malezas dentro y fuera de la jaula, ya que las mismas pueden actuar como reservorios de vectores. Si bien la sanidad del material introducido a las jaulas debe ser previamente controlada, es conveniente, en esta etapa, repetir los anlisis para detectar rpidamente la presencia de una infeccin a fin de eliminarla antes de que se propague. En estas condiciones es posible mantener como plantas madres, por mucho tiempo, un stock de material libre de virus a partir del cual se pueden hacer las sucesivas multiplicaciones. La etapa de multiplicacin masiva, o a gran escala, se realiza a campo en reas ais-

ladas de focos de contaminacin. Esta etapa se extiende todo el tiempo necesario hasta la obtencin del nmero requerido de individuos para realizar la produccin a nivel comercial. Si el rea protegida est lo suficientemente alejada de plantas infectadas y se evita el acceso de los vectores, es posible mantener las plantas libres de virus por muchos ciclos de cultivo. Son fundamentales los anlisis peridicos que permitan llevar un registro del estado sanitario del material. 7 Algunas alternativas para mejorar la eficiencia en la produccin de plantas libres de virus - Termoterapia: es la tcnica ms antigua utilizada para la liberacin de patgenos en plantas. No obstante, es difcil la obtencin de plantas libres de virus con el empleo de altas temperaturas solamente. Mantener las plantas enfermas por perodos prolongados en termoterapia disminuye la concentracin de virus, pero al llevar las plantas nuevamente a condiciones normales, en poco tiempo recuperan la concentracin original. Una prctica muy usada es la combinacin de la termoterapia y el cultivo de meristemas. Esto implica mantener las plantas en termoterapia por un perodo variable de tiempo y temperatura (generalmente entre 34 y 38C desde una a varias semanas), luego se realiza la extraccin del meristema, se siembra en el medio de cultivo y se contina con los pasos convencionales para su desarrollo. Esta prctica no es efectiva para todos los virus por igual, depende del virus y del hospedante. Se ha observado que un mismo virus en distintas especies se inactiva en forma diferente. Generalmente, esta prctica ha resultado ms efectiva en virus de partculas alargadas, y menos eficiente para virus polidricos. Podra suponerse que cuanto ms largo es el tratamiento de calor, resulta ms efectivo; sin embargo, no siempre es as. En crisantemo y en ajo se ha mencionado, por ejemplo, que tratamientos de 10-30 das pueden ser efectivos para la liberacin de algunos virus; en cambio, tratamientos ms prolongados no siempre producen mayor porcentaje de plantas sanas. Estos tratamien-

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tos prolongados, por otra parte, dificultan la implantacin in vitro del tejido, lo cual se traduce en un nmero ms reducido de plantas obtenidas. En algunos casos las bajas temperaturas (5C) seguidas del cultivo de meristemas fueron utilizadas con xito para la eliminacin de virus. Esta prctica fue aplicada principalmente en el caso de viroides, los cuales se desarrollan bien con altas temperaturas. - Quimioterapia: el uso de antivirales sera la solucin definitiva para estas enfermedades; sin embargo, hasta ahora no se ha encontrado un producto que por s solo cumpla esta funcin. Algunas sustancias qumicas ocasionan una disminucin en la concentracin de virus existentes en la planta y atenan, o suprimen, los sntomas tpicos de los virus, pero, una vez suspendido el tratamiento se recupera la concentracin original. Han sido evaluadas diferentes sustancias pero la ms utilizada es el Ribavirin o Virazole (1--Dribofuranosyl-1, 2, 4 triazole 3- carboxamide). Un modo adecuado de emplear los antivirales es combinndolos con el cultivo de meristemas. Tambin han sido aplicados directamente a los meristemas in vitro. En este caso, el antiviral es colocado en medio del cultivo en concentraciones variables, que van desde 10 a 50 mg/l, y en algunos casos hasta 100 mg/l. Las plantas son mantenidas bajo la accin del antiviral por largos perodos que incluyen varios subcultivos. Un problema importante con el Virasole es su fitotoxicidad, que a su vez depende de la dosis empleada y de la especie de planta utilizada. El xito del proceso en muchos casos requiere de varios meses de tratamiento y la fitotoxicidad del antiviral constituye una dificultad. Tambin se han obtenido plantas libres de virus a partir de callos a los que previamente se les aplic Virasole, aunque esta prctica no ha sido eficiente en todos los casos. - Electroterapia: el mtodo consiste en aplicar corriente elctrica a yemas por un perodo variable de tiempo para obtener plantas libres de patgenos. Se menciona que la aplicacin de electricidad produce de-

gradacin de las partculas y prdida de infectividad. Esta tcnica ha sido citada para liberar del mosaico al almendro cv Caetanuccia. Para ello los brotes fueron sometidos a 500V por tiempos variables y luego injertados sobre pies sanos (obtenidos por semilla). Se seal que con 5 minutos de tratamiento los resultados fueron buenos y con 20 minutos se obtuvo completa inactivacin. El mtodo tambin ha sido empleado para eliminar bacterias de caa de azcar, Potato leaf roll virus de papa, Dasheen mosaic virus de araceas y Banana streak virus de banana, entre otras, aplicando 5-30V a las yemas por un perodo de 5 minutos. En este caso se obtuvo una eficiencia del 3 al 60%, dependiendo del cultivar y el patgeno. - Cultivo de domos proveniente del disco basal (stem-disc dome culture): el procedimiento consiste en la obtencin de plantas libres de virus a partir del cultivo de estructuras con forma de domo, diferenciadas a partir del cultivo del disco basal de dientes de ajo. Se ha informado la diferenciacin de 2030 brotes a partir del cultivo del disco basal de dientes de ajo en 1 mes de cultivo. Este mtodo fue designado por los autores (Ayabe y Sumi, 1998) como cultivo del disco basal (stem-disc culture). Una modificacin posterior de esta tcnica consiste en la extraccin de las estructuras con forma de domo y su posterior cultivo en un medio adecuado para la obtencin de plantas. - Microinjerto de pices caulinares in vitro para obtencin de plantas de naranjo libres de virus: consiste en extraer el pice caulinar de la variedad a injertar, constitudo por el domo apical y primordios foliares, y luego sembrarlo sobre la superficie decapitada del epictilo de una plntula de 2 semanas de edad (patrn) proveniente de semilla crecida in vitro. Ver VIII-7 (plantas ctricas libres de enfermedades) 8 Anlisis de las plantas obtenidas o indexing De lo expuesto previamente surge que existen varias alternativas para obtener plantas libres de virus a partir del cultivo de meristemas. Si bien existen algunos

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lineamientos, o consideraciones generales para tener ms probabilidades de xito, no hay proceso que ofrezca total seguridad. La etapa decisiva en este sistema es el anlisis que permite comprobar si realmente se ha producido la total erradicacin de los virus. En la bibliografa se sealan distintos porcentajes de xito en el proceso. Esto significa que empleando el mismo protocolo, en el mismo momento, con el mismo material, se consiguen plantas sanas y plantas que an permanecen infectadas. Por lo tanto, la nica forma de separar las plantas sanas de las enfermas es un anlisis que permita distinguirlas para luego multiplicar solo aquellas que fueron liberadas de los virus. El xito de un programa de produccin de plantas libres de virus no depende de la obtencin de un alto porcentaje de plantas sanas en al primera etapa, sino en la obtencin de al menos unas pocas plantas madres realmente libres de patgenos. Si el nmero es escaso pueden ser multiplicadas por diferentes sistemas, pero si alguna de ellas est contaminada, todo el trabajo ser intil, porque al final, despus de las multiplicaciones a campo, lo ms probable es que tengamos todas las plantas enfermas. Las plantas deben ser analizadas una por una para hacer una buena seleccin de plantas madres a partir de las cuales se iniciarn los procesos de multiplicacin del material. Es recomendable hacerle ms de un anlisis para asegurar su sanidad, es preferible que sea en etapas diferentes a lo largo del proceso, y en lo posible por tcnicas distintas. Para realizar un anlisis confiable hay que tener en cuenta varios factores que son especficos para cada combinacin planta-patgeno. Es importante el empleo de sistemas de alta sensibilidad que nos permitan detectar los virus aun en bajas concentraciones; sin embargo, no existe un sistema que sea infalible, siempre hay un lmite de concentracin por debajo del cual el virus no puede ser detectado. Para evitar errores en este sentido es recomendable tener en cuenta algunos factores. Como ya se ha mencionado, la concentracin de virus no es igual en todas las partes de una planta; por lo tanto, si queremos hacer un anlisis confiable hay que establecer qu tejidos y rganos son los que concentran ms el patgeno y realizar

la prueba a partir de ellos. Del mismo modo tambin se ha comprobado que existen fluctuaciones a lo largo del ciclo de cultivo; por lo tanto, es conveniente realizar el anlisis cuando la concentracin de virus es mayor. Esto es importante cuando se prueba el material a campo. La eleccin de la tcnica de anlisis depender del patgeno que se desea eliminar y de las posibilidades para realizarla. Cuanto ms temprano se descarten las plantas contaminadas ms seguro ser el sistema. Una planta infectada siempre es un foco de contaminacin. Por ms cuidados que se tengan siempre se corren riesgos. Cuando las plantas estn in vitro, en general, la concentracin de virus es muy baja, probablemente debido a las condiciones de cultivo, la concentracin de hormonas en el medio, u otros factores no bien establecidos. Sin embargo, es recomendable hacer un anlisis riguroso antes de empezar con la micropropagacin para hacer el primer descarte de individuos enfermos. Frecuentemente se menciona en esta etapa el empleo de la tcnica inmunoenzimtica de doble sndwich de anticuerpos (DAS-ELISA). Esta prueba se realiza en una placa de poliestireno con 96 celdillas en la cual se lleva a cabo una prueba por celdilla. En el primer paso cada celda es tapizada por el anticuerpo especfico para el patgeno que se est analizando. Luego se coloca el extracto de la planta a probar. Si los virus estn en el mismo sern atrapados por el anticuerpo previamente colocado. En el tercer paso se aplica un anticuerpo combinado con una enzima y en el ltimo paso se coloca el sustrato especfico para la enzima. Si el virus est presente en la muestra se produce el sndwich anticuerpo-virus-anticuerpo conjugado con la enzima, el sustrato es desdoblado y la reaccin vira al color amarillo (respuesta positiva, planta enferma). (Fig. 2). Esta tcnica tiene varias ventajas, ya que permite el anlisis simultneo de muchas muestras (96 celdillas por placa y se pueden hacer varias placas simultneamente). Es relativamente fcil de usar y de bajo costo. Sin embargo, nuestra experiencia nos indica que esta prueba no es lo suficientemente sensible para detectar los virus en algunos casos. Muchas de las plantas in vitro que dan resul-

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tados negativos mediante DAS-ELISA resultan positivas cuando se prueban por otra tcnica. Algunas variantes, como ELISA en membrana de nitrocelulosa o Dot Blot, han sido empleadas con resultados ms satisfactorios; sin embargo, estas tcnicas por s solas permiten el escape de muchas plantas infectadas. Mejores resultados se han obtenido con el empleo de tcnicas que combinan la

Figura 3: Extracto vegetal conteniendo una mezcla de virus probado por ISEM-D con antisuero para Garlic virus A. Izq., partcula viral decorada con el antisuero utilizado. Der., partcula viral no decorada de una especie viral diferente.

Figura 2: Placa de DAS-ELISA mostrando resultados positivos (celdillas oscuras) y negativos (celdillas claras).

serologa con la microscopia electrnica como son la inmunoelectromicroscopa con o sin decoracin (ISEM o ISEM-D). En esta tcnica se tapiza una grilla porta especimen con anticuerpo y luego se coloca sobre ella el extracto de la planta a probar. Si las partculas virales estn presentes quedarn atrapadas al anticuerpo. Luego se contrasta y se observa por el microscopio electrnico (ME), donde se pueden ver las partculas de virus que han sido selectivamente atrapadas. Esto es lo que se llama ISEM. Si antes de contrastar se aplica otra vez el antisuero y ste es atrapado por las partculas virales las mismas se vern ms oscuras al ME, decoradas (ISEM-D) y sern ms fciles de detectar (Fig. 3). Estas tcnicas son altamente sensibles, permiten la observacin directa del virus por lo cual no hay falsos positivos y no se requiere un antisuero de alta calidad para su desarrollo. El grave inconveniente con ellas es que no son de uso masivo, porque es engorroso analizar gran cantidad de muestras, y por otra parte, se requiere de un ME, que es un equipo altamente costoso.

Las tcnicas basadas en la deteccin de los cidos nucleicos han mostrado un gran desarrollo y evolucin en la ltima dcada, y son utilizadas con frecuencia debido a su alta sensibilidad y especificidad. El uso de sondas moleculares ha dado buenos resultados. Consiste en dar condiciones para que el cido nucleico del patgeno, fijado sobre un soporte slido (membrana de nylon), se una con un fragmento de cido nucleico complementario, marcado con molculas radioactivas, o con un antgeno que luego ser reconocido por un anticuerpo especfico que ser detectado por colorimetra o fluorescencia. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes son las tcnicas de mayor sensibilidad con que se cuenta actualmente. Entre ellas se mencionan: PCR anidado, transcripcin reversa (RT), inmuno captura (IC) PCR post. transcripcin reversa (RT-PCR), entre otras. La PCR consiste en amplificar un fragmento del genoma del virus mediante la utilizacin de dos iniciadores que hibridan especficamente en el genoma del patgeno. La tcnica permite producir, en corto tiempo, muchas copias del segmento del genoma comprendido entre los 2 iniciadores, de tal forma que luego es posible observarlo con facilidad en un gel (Fig. 4). Esto posibilita la deteccin de los virus, aun en bajsimas concentraciones. Esta tcnica adems puede ser combinada con la serologa y ser realizada en placas como las de ELISA, lo que permite el anlisis simultneo de muchas plantas. Estas pruebas, si bien son altamente sensibles, no son an de uso masivo porque tienen un costo muy elevado. Para obtener resultados en forma prctica y confiable es posible tambin la combi-

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Figura 4: Fragmentos amplificados por IC-RTPCR. Lneas 1-4, segmentos de 489pb correspondientes a Onion yellow dwarf virus; lneas 4-5, segmentos de 566pb correspondientes a Leek yellow stripe virus; lnea 6, marcador de peso molecular.

nacin de varias pruebas, pudiendo, por ejemplo, aprovechar la practicidad del ELISA y la sensibilidad de las tcnicas moleculares, o de ISEM u otras. En este caso, las plantas que resultan negativas para el test de ELISA pueden ser luego analizadas por una tcnica ms sensible y disminuir as el nmero de pruebas complicadas o costosas. Esto depende de la cantidad de plantas que ELISA sea capaz de detectar, porque si no es lo suficientemente sensible tendremos que repetir la prueba con todas, o casi todas las muestras. Como se mencion anteriormente, la concentracin de virus en las plantas in vitro en general es baja, por lo tanto, se corre el grave riesgo de considerar como sanas plantas que, en realidad, estn infectadas. Por esta razn se hace casi obligatorio repetir los anlisis cuando las plantas son transferidas al suelo. Es necesario dejar pasar cierto tiempo antes de hacer el anlisis, para que si el virus est presente, tenga la posibilidad de incrementar su concentracin y ser entonces fcilmente detectado. En esta etapa se utiliza con frecuencia el test de ELISA en cualquiera de sus variantes, que generalmente conduce a resultados confiables. En algunos casos el sistema que resulta ms eficiente para hacer el indexing es el empleo de plantas indicadoras. El injerto es la forma ms segura de transmitir un virus y esto es lo que se emplea como sistema de diagnstico. Se realiza un injerto desde la planta que se desea probar a plantas que son susceptibles al virus (planta indicadora) y que desarrollan sntomas claros y evidentes de la presencia del patgeno. El inconveniente, en este tipo de anlisis, es que hay que

esperar que la planta obtenida in vitro sea transferida al suelo, luego que se desarrolle lo suficiente como para extraer una porcin de tejido (hoja, yema, brote, etc., segn el tipo de injerto). Se requiere adems de un operador con habilidad para realizar el injerto con xito y luego mantener las plantas injertadas en condiciones adecuadas hasta la aparicin de los sntomas. En algunos casos, este tiempo puede ser muy prolongado. A pesar de los inconvenientes que se mencionan, para algunas especies este sigue siendo el mtodo ms seguro. Por ejemplo la frutilla, que es afectada por ms de 20 enfermedades diferentes y que en muchos casos ni siquiera ha sido todava caracterizado el agente causal, la transmisin del virus a plantas indicadoras resulta la prueba ms efectiva. En este caso se injerta el fololo medio de una hoja perteneciente a la planta que se desea probar en plantas indicadoras en las cuales los patgenos van a dar sntomas claros. Algunos virus se van a manifestar despus de 2 3 semanas de realizado el injerto; en otros casos, la bibliografa menciona que los sntomas aparecen entre los 6 y 12 meses. Con frecuencia, no es posible identificar que virus es el que est presente, pero es posible determinar si la planta est infectada. En vid, parte de los virus son analizados mediante ELISA. Pero otros son probados por injerto a plantas indicadoras. Algunos de los virus pueden ser detectados en pocas semanas, pero para el stem pitting/grooving sindrome, por ejemplo, es necesario esperar entre 8 y 12 meses. 9 Algunas consideraciones respecto a los anlisis de virus En general, cuando se habla de las plantas liberadas de virus se emplean trminos como plantas libres de virus planta sana o saneada sin que se defina qu virus fueron eliminados ni qu pruebas se emplearon para comprobar su eliminacin. El concepto de plantas libres de virus debera estar acotado al, o a los virus, analizados. En el caso de plantas que son afectadas por un conjunto de virus diferentes sera necesario realizar un anlisis independiente para cada uno de

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ellos y sealar el o los virus de los cuales ha sido liberada o probada. Por otra parte debe definirse la tcnica de anlisis empleada. Como se mencion previamente pueden emplearse diferentes mtodos de diagnstico con distintos grados de sensibilidad. As, por ejemplo, si se cuenta con un DAS-ELISA calibrado para detectar hasta 10 ng/ml y un RT-PCR que puede detectar 10 pg/ml y se analiza una planta con 50 pg/ml; la tcnica de DAS-ELISA no va a detectar el patgeno y el resultado ser negativo, mientras que el RT-PCR arrojar un resultado positivo. Todas las tcnicas tienen un lmite de sensibilidad por debajo del cual no son capaces de detectar la presencia del patgeno. Por consiguiente, dependiendo de la sensibilidad de la tcnica que se use, el porcentaje de plantas supuestamente libres de virus puede variar. Lo correcto sera entonces hablar de plantas negativas a un virus probado mediante una tcnica determinada. Por ejemplo, plantas negativas a Onion yellow dwarf virus mediante DAS-ELISA, lo que no significa que realmente est libre de virus sino que la tcnica no lo detect. Por esa razn se aconseja evaluar las plantas en ms de una oportunidad y repetir los anlisis cuando las plantas estn a campo, para darle al patgeno, si est presente, la posibilidad de multiplicarse. 10 Agradecimientos A los Ing. Agr. MSc Delia Docampo, Sergio Nome y al Dr. Luis Conci por la revisin del presente manuscrito; y a la Ing. Agr. Eva Cafrune por su colaboracin en la bsqueda de informacin.

11 Lecturas Recomendadas
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VIII.-Captulo 6
Produccin de plantas de ajo libres de virus
Conci, Vilma C.; Cafrune, Eva E.; Lunello, Pablo; Nome; Sergio; Perotto, Cecilia 1 Introduccin De los cultivos de Alliaceae, el ajo (Allium sativum L.) es considerado como una especie valiosa por muchas culturas diferentes. Adems de su conocida utilizacin en el arte culinario, hoy es un producto apreciado por sus beneficios medicinales, especialmente en Europa y Asia. Algunos de sus productos derivados, poseen actividades biolgicas tales como antibiticas, antiparasitario, reductores de riesgo de enfermedades cardiovasculares y como potenciales agentes anticancergenos. El ajo es la principal hortaliza exportable de Argentina desde el punto de vista de la entrada de divisas, siendo este pas el segundo exportador mundial despus de China. Las exigencias cada vez mayores del mercado y la aparicin permanente de nuevos competidores obligan a replantear las estrategias de produccin nacional. Entre las enfermedades que afectan a este cultivo, los virus son los responsables de las mayores prdidas (entre un 20 y 80% de disminucin en el peso de los bulbos). Las infecciones son causadas por un complejo viral que incluye Potyvirus (Onion yellow dwarf virus, OYDV, y Leek yellow stripe virus, LYSV); Carlavirus (Garlic common latent virus, GCLV y Shallot lantent virus, SLV), y Allexivirus (Garlic virus-A, -B, -C, -D, -E, -X, GarV-A B C- D- E -X; Garlic mite-borne filamentous virus, GarMbFV). Este conjunto causa un mosaico que si bien no mata la planta produce una infeccin crnica. Debido a la exclusiva propagacin agmica de esta especie, la totalidad de las plantas estn infectadas por virus, por lo tanto es evidente la importancia que tiene la obtencin de propgulo libre de virus como salida de control. En Argentina se ha detectado la presencia de OYDV y LYSV, GCLV, GarMbFV, GarV-C y otros Allexivirus todava no caracterizados completamente.

A modo de ejemplo se detalla a continuacin un protocolo de produccin de ajo libre de virus. 2 Procedimiento para la obtencin de ajo libre de virus A) Termoterapia: en trabajos realizados en la Argentina se ensayaron tratamientos de termoterapia con agua y con aire caliente, antes de la extraccin del meristema. Los mejores resultados se obtuvieron con aire caliente. Para ello dientes de ajo fueron sembrados en terrinas con una mezcla de tierra/ mantillo/arena (1/1/1) y mantenidos en una cmara a 36C. Cuando plantas de ajo Blanco fueron sometidas 60 das a 36C y luego se hizo el cultivo de meristema, se regeneraron pocas plantas, pero las que se obtuvieron resultaron libres de virus. Cuando se probaron 5 cultivares de ajo durante 40 das a 36C se pudo observar valores de supervivencia del cultivo de meristema que variaron entre 40 y 82%, resultando libres de virus entre 30 y 100% de las plantas obtenidas, dependiendo del cultivar. Los controles en los cuales se obtuvieron plantas slo por cultivo de meristema, sin termoterapia, el porcentaje de plantas desarrolladas vari entre 70 y 100%, y de ellas, en algunos cultivares, no se obtuvieron plantas libres de virus y en otros lleg hasta el 21%. Trabajos realizados posteriormente pusieron en evidencia que la posibilidad de liberar de virus por termoterapia es muy variable. En algunos monoclones de ajo Blanco y Colorado se observ que a pesar de ser sometidos a perodos prolongados (ms de 60 das) a 36C, no fue posible eliminar todos los virus integrantes del complejo; paralelamente, otros genotipos fueron liberados de virus slo con el empleo del cultivo de meristema. B) Cultivo de meristema, primer anlisis y micropropagacin: para la extraccin del meristema se corta un trozo de tejido en forma cbica, incluyendo el disco basal donde est el meristema. Este se desinfecta mediante una inmersin en alcohol 70% y luego con hipoclorito de Na al 5 % durante 10-15 min. Posteriormente, el trozo de tejido es colocado sobre papel estril bajo una lupa estereoscpica dentro de una cmara de flu-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

313

jo laminar y con la ayuda de instrumental estril se procede a la extraccin del explanto constituido por el domo ms 1 primordio foliar (0,3 mm aproximadamente). Luego de la escisin es rpidamente sembrado en medio de iniciacin donde se desarrollar una planta completa (Fig. 1, A). Las plantas obtenidas son analizadas mediante ISEMD con un antisuero producido a partir de plantas de ajo enfermas con la mezcla de virus que naturalmente infectan al cultivo. Aquellas plantas que resultan negativas a esta prueba son evaluadas con antisueros especficos para OYDV, LYSV, GCLV, SLV, GarMbFV y con un antisuero que detecta fundamentalmente una mezcla de diferentes Allexivirus . Las plantas negativas a todos ellos son transferidas a un medio de micropropagacin. En este Figura 1: Produccin de ajo libres de virus. A: planta en medio de iniciacin. B: medio es posible micropropagacin. C: bulbillos obtenidos in vitro (microbulbillos). D: planta transferida a tierra y mantenida en cmara hmeda. E: planta adaptada a las condiciones ex vitro. una tasa de multipli- F: plantas en suelo bajo jaula antifidos. G: multiplicacin a gran escala bajo jaula cacin de 1:2-1:8 de- antifidos. H: bulbos de ajo libre de virus (arriba) e infectados (abajo). pendiendo del cultivar (Fig. 1, B).. Esta tasa vara con el nmero de repiques en el C) Rusticacin y transplante a tierra bajo medio de cultivo, siendo baja en los prime- condiciones controladas: despus de varios ros y aumenta a partir del segundo o tercer ciclos in vitro, muchas plantas bulbifican esrepique, adems se detectaron diferencias pontneamente y otras deben ser inducidas entre los distintos meristemas. (Fig. 1, C). Repicando los plantines a un me-

314

CONCI, Vilma C.; CAFRUNE, Eva E.; LUNELLO, Pablo; NOME, Sergio; PEROTTO, Cecilia

Lneas selectas Termoterapia

Cultivo de meristema (medio de iniciacin)

Plantas in vitro

ANALISIS por ISEM-D


(OYDV, LYSV, GCLV, SLV, GarV A, y otros - Allexivirus

Multiplicacin in vitro (en medio de multiplicacin)

Bulbificacin in vitro (medio de bulbificacin)

Planta in vitro

1 generacin en suelo (bajo jaula)

ANALISIS por DAS-ELISA (Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus)

2 mas generaciones en suelo

(bajo jaula)

ANALISIS por DAS-ELISA (Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus)


ANALISIS por DAS-ELISA

Multiplicacin en reas aisladas

(productores, semilleros)

(Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus)

zando las plantas, una por una, mediante pruebas de DASELISA (Fig. 1, F y G). Los bulbos producidos son entregados a semilleros que realizan la multiplicacin en reas aisladas de otros cultivos de Alliaceae, hasta obtener el nmero de bulbo-semilla suficiente como para iniciar una produccin comercial. Cuando se comparan los bulbos producidos por las plantas libres de virus con respecto a los producidos por plantas infectadas las diferencias en peso y tamao son notables Fig.1, M. Esquema de produccin Fig.2. 3 Certificacin

Transferencia a productores (produccin comercial)

Figura 2: Esquema de produccin de plantas de ajo libres de virus, IFFIVE-INTA, Argentina.

dio sin hormonas, con alto contenido de sacarosa y luz continua se consigue mejorar el porcentaje de bulbificacin en algunos clones, o bien, se obtienen plantas ms robustas que soportan mejor el transplante a suelo. Los minibulbillos obtenidos in vitro son cosechados y sembrados en suelo estril compuesto por una mezcla de tierra/mantillo/ arena (1/1/1). Las plantas que no forman bulbos son transferidas a suelo y mantenidas en cmara hmeda por un tiempo variable entre 15 y 20 das luego son paulatinamente adaptadas a las condiciones naturales de humedad y temperatura (Fig. 1, D y E). Las plantas ex vitro son probadas mediante DAS-ELISA para constatar su estado sanitario y mantenidas bajo jaulas antivectores. Los bulbos cosechados son conservados en lugar fresco y seco hasta la poca de siembra. Las sucesivas multiplicaciones se realizan en jaulas donde se contina anali-

La implementacin de programas tendientes a la produccin de plantas de ajo libre de virus y el control de la enfermedad adquiere fundamental importancia ya que han comenzado a regir en Argentina normativas para la fiscalizacin de semilla de ajo. Estas normas establecen las categoras de Bsica (subcategora Preinicial, Inicial y Fundacin) Registrada (subcategora A y B) y Certificada. Cada una de estas categoras contempla diferentes porcentajes de OYDV. Por ahora slo se controla este virus; sin embargo, con el avance de los conocimientos respecto del dao que producen el resto de los integrantes del complejo, seguramente algunos otros sern considerados en el futuro. 4 Lecturas recomendadas

CANAVELLI, A; NOME, S. F. y CONCI, V. C. 1998. Incidencia de las virosis en ajo Rosado Paraguayo. Fitopatologa Brasilera 23 (3): 354-358.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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CONCI, V. C.; CANAVELLI, A.; LUNELLO, P.; DI RIENZO, J.; NOME, S. F.; ZUMELZU, G. and ITALIA, R. 2003. Yield Loss of Virus-Free Garlic in the Field During Successive Crop Cycles. Plant Disease 87 (12):1411-1415. CONCI, V.C. 1997. Virus y Fitoplasmas de ajo. In Burba, J. L. 50 temas sobre produccin de ajo. Vol. 3: 267-293. EEA-INTA La Consulta, Mendoza, Argentina. CONCI, V.C. y NOME, S.F. 1991. Virus free garlic (Allium sativum L) plants obtained by thermotherapy and meristem tip culture. J. Phytopathology 132: 189-192. RAVNIKAR, M.; PLAPER, I.; UCMAN, R. and ZEL, J. 1994. Establishment of an efficient method for virus elimimation in meristem cultures and regeneration of high quality plants. Proc. of IPBA, Rogla. December, 5-7: 97-102. SENULA, A; KELLER, E. R. J. and LESEMANN, D. E. 2000. Elimination of viruses through meristem culture and thermotherapy for the establishment of an in vitro collection of garlic (Allium sativum). Acta Hoticulturae 530: 121-128.

TSUNEYOSHI, T. and SUMI, S. 1996. Differentation Among Garlic Viruses in Mixed Infections Based on RT-PCR Procedures and Direct Tissue Blotting Immunoassays. The American Phytopathological Society. Vol 86, N 3:253259. VAN DIJK, P. 1993. Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses. Neth. J. Pl. Path. 99: 233-257. VAN DIJK, P. 1993. Survey and characterization of potyviruses and their strains of Allium species. Neth. J. Pl. Path. 99. Supplement 2:1-48. WALKEY, D.G.A.; WEBB, M. J. W.; BOLLAND, C.J. and MILLER, A. 1987. Production of virus-free garlic (Allium sativum L.) and shallot (A. ascalonicum L.) by meristemtip culture. Journal of Horticultural Science, 62 (2): 211220.

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CONCI, Vilma C.; CAFRUNE, Eva E.; LUNELLO, Pablo; NOME, Sergio; PEROTTO, Cecilia

VIII.-Captulo 7
Plantas ctricas libres de enfermedades
Costa, Norma; Plata, Mara Ins; Anderson, Catalina 1 Introduccin Para competir en un mercado citrcola globalizado se necesita de la mxima eficiencia en todas las fases de la produccin. Para lograrlo es primordial partir con material de excelencia desde el vivero. La planta es el primer escaln para iniciar una citricultura exitosa. Las exigencias de calidad en los ctricos producidos en los viveros comerciales de todo el pas aumentan da a da. El material de multiplicacin para la produccin de plantas de vivero debe provenir de un origen cierto y certificado. El citricultor espera que la planta que pondr en sus explotaciones tenga un porte adecuado, un sistema radicular desarrollado y la garanta sanitaria y varietal correspondiente para obtener una produccin rentable y duradera. Las enfermedades producidas por virus, viroides y otros organismos similares producen importantes prdidas econmicas en los ctricos de todo el mundo. Algunas enfermedades provocan la muerte de las plantas y otras disminuyen la produccin y la calidad de la fruta, causando prdida de vigor y de longevidad de la planta. Algunas de las principales enfermedades causadas por este tipo de microorganismos son la psorosis, tristeza, exocortis y cachexia. Estas enfermedades se han extendido debido a la propagacin vegetativa de material infectado. Es normal encontrar varias virosis en una misma planta y en muchos pases como la Argentina casi la totalidad de las plantas adultas estn afectadas por alguna virosis. La psorosis y otras enfermedades se transmiten mediante el injerto de yemas. Una vez hecho el injerto, la planta puede permanecer con la enfermedad latente durante muchos aos. Las yemas que se extraigan de una planta con enfermedad latente originarn plantas enfermas.

Los pases con citricultura de avanzada han basado su xito en el empleo de Programas de Certificacin utilizando plantas libres de enfermedades, especialmente las causadas por virus u organismos similares. Estas plantas libres de virus se obtienen a partir de plantas de variedades ctricas agronmicamente ideales pero afectadas por una o ms enfermedades causadas por virus u organismos similares. Para esto se recurre a tcnicas que permitan la obtencin de plantas libres de virus a partir de individuos enfermos. La termoterapia y la obtencin de plantas nucleares han sido tcnicas usadas para conseguir aquel objetivo. Otra tcnica que cumple este objetivo es la tcnica de microinjerto de pices caulinares in vitro. Dicha tcnica es la que actualmente se utiliza en gran parte de los pases citrcolas que tienen programas de eliminacin de virus y viroides. Con la combinacin de las tcnicas de termoterapia y de microinjerto de pices caulinares in vitro es posible obtener un elevado porcentaje de plantas ctricas libres de virus, cosa que una tcnica sola no permite lograr. La tcnica de microinjerto se basa en la hiptesis de que los virus vegetales no llegan a infectar el meristema. Una vez obtenida la planta por esta tcnica debe ser sometida a las pruebas de comprobacin sanitaria (pruebas biolgicas, qumicas, inmunoqumicas, serolgicas, moleculares, etc.) que determinen con certeza que esa planta esta libre de lo que se est analizando. El PROCITRUS es un proyecto que el INTA desarroll para la obtencin, produccin, mantenimiento y distribucin de material de portainjertos y cultivares de especies ctricas con identidad varietal y estado sanitario controlados y en su esquema bsico (Tabla 1) emplea estas tcnicas para cumplir dichos objetivos. 2 Tcnica de microinjerto de pices caulinares in vitro La planta a microinjertar es seleccionada de las introducciones de variedades ctricas de copa y portainjerto que se realizan a los Bancos de Germoplasma, de selecciones locales y de variedades obtenidas en los Pro-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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Tabla 1: Esquema operativo del proyecto PROCITRUS: para la obtencin de una planta libre de enfermedades
- Introducciones. - Selecciones locales. - Programas de Mejoramiento. Planta candidata Termoterapia 32C Cultivo de Tejidos Diagnstico Sanitario Planta Madre Original Protegida

gramas de Mejoramiento. Una vez obtenida esta planta candidata a planta madre, es sometida a termoterapia y cultivo de tejidos empleando la tcnica de microinjerto de pices caulinares in vitro. Esta tcnica comprende las siguientes etapas: preparacin del portainjerto, preparacin del pice, injerto, cultivo de plantas injertadas e injerto sobre un plantn vigoroso. Las plantas obtenidas por microinjerto no presentan caracteres juveniles y en las mismas no se han observado anormalidades con respecto a la planta madre. El xito de la tcnica depende del tamao del tejido extrado (0.1-0.2 mm) y del patgeno que se quiera eliminar. En el caso de exocortis, tristeza y cachexia, el porcentaje de plantas libres es superior al 90%. El ms
Tabla 2: Pruebas de Diagnstico para Plantas Madres
Enfermedad Tristeza Metodologa Inmunoimpresin ELISA Plantas indicadoras ELISA DAS Plantas indicadoras ELISA TAS Plantas indicadoras Hibridacin Molecular Electroforesis Plantas indicadoras Hibridacin Molecular Electroforesis ELISA DAS Infiltracin de tejido susceptible Medio Selectivo Inmunofluorescencia indirecta ELISA DAS Duracin 4h 12 meses 48 h 12 meses 48 h 12-24 meses 3 meses 3 meses 12 meses 3 meses 3 meses 48 hs 10 das 7 das 7 das 48 hs

difcil de eliminar es el virus de la psorosis de los ctricos (CPsV). Una vez obtenida la planta de microinjerto y cuando tiene tamao suficiente, se realizan las pruebas de diagnstico para comprobar que estn libres de patgenos (Tabla 2). Las tcnicas de diagnstico para cada enfermedad pueden ser varias pero deben emplearse aquellas reconocidas internacionalmente por organismos de referencia. Para el PROCITRUS y para el Programa Nacional de Certificacin de Ctricos las tcnicas empleadas son las recomendadas por las Normas para la Produccin, Comercializacin e Introduccin de Plantas Ctricas de Vivero (RES N 149/98) y las Normas de Funcionamiento de Laboratorios de Diagnstico para Enfermedades de Plantas Ctricas de Vivero y sus partes, aprobadas por el INASE y el SENASA dependientes de la SAGPyA (Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentacin). 3 Lecturas recomendadas:
1- Enfermedades de los Ctricos. 2000 Monografa de la SEF (Sociedad Espaola de Fitopatologa). Editores Cientficos: Nria Duran-Vila y Pedro Moreno 165 pp 2-Proceedings of the IOCV (International Organization of Citrus Virologists): 1957-2002 (15 Conferencias) 3-Improvements in serodiagnosis of Citrus Psorosis Virus (CPsV). 2000. Aliotto, D.,M. Gangemi,P. Sposato, S. Deaglio, E. Luisoni and R.G. Milne.14th Proceedings of the IOCV 353-356pp 4- Indexing of Citrus viroids by imprint hybridisation. 1999.Palacio-Bielsa, A.,X. Foissac and N. Duran-Vila. European Journal of Plant Pathology 105:897-903
Repeticin

1 ao 3 aos

5- Cancrosis de los Citrus en el Litoral Argentino.2001. Canteros, Blanca I. IDIA XXI Ao I- Nro.1 23-27pp 6- Citrus Canker in Argentina- Control, Eradication, and Current Managment. 2000 International Citrus Canker Research Workshop. Ft. Pierce, Florida USA. 12-13pp 7- Manual para Productores de Naranja y Mandarina de la Region del Ro Uruguay. 1996. INTA Manual Serie A Nro. 2 Diversificacin Productiva. Eds. A. Fabiani, R. Mika, L. Larocca y C. Anderson. 238 pp 8- Graft-Transmissible Diseases of Citrus. Handbook for detection and diagnosis. 1991. Roistacher, C.N. FAO and IOCV 286 pp.

Psorosis

Exocortis

6 aos

Cachexia-xiloporosis CVC

6 aos 6 aos 1 ao

Cancrosis

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COSTA, Norma; PLATA, Mara Ins; ANDERSON, Catalina

VIII.-Captulo 8
Certificacin sanitaria de especies frutales de Prunus
Docampo, Delia M. 1 Introduccin Monitoreos realizados en especies frutales del gnero Prunus (durazneros, ciruelos, cerezos, guindos) del rea frutcola templada (provincias de Mendoza, Crdoba y Buenos Aires) evidenciaron el deterioro de la condicin sanitaria de las plantaciones en produccin y de propagacin. Los anlisis pusieron de manifiesto que una de cada cuatro plantas analizadas se encontraba infectada por uno o ms virus. Varios factores han sido decisivos para la distribucin de estos patgenos. La carencia de controles sanitarios, la ineficacia de los mtodos usados en los anlisis, su dispersin por vectores y la diseminacin de materiales infectados a larga distancia, por el hombre a travs de la comercializacin. Un Sistema de Certificacin Sanitaria de Plantas Perennes se fundamenta en producir el nmero de plantas requeridas por el mercado a partir de una Planta Inicial. El Sistema contempla cuatro etapas bsicas: 1) Eleccin de la Planta Inicial (selecta de variedades y de portainjertos) seleccionada sobre la base de sus caracteres agronmicos deseables, por su pureza varietal (deben coincidir con los Descriptores del Registro Nacional de Cultivares) y su estado sanitario, (analizado por las tcnicas ms rigurosas establecidas en el Sistema de Certificacin). Constituye el material fundacional de un Sistema de Certificacin del cual derivar todo el material certificado; 2) Establecimiento de un Monte Fundacin. Constituido generalmente por tres plantas de cada cultivar (de variedad y de cada portainjerto) obtenidas por propagacin agmica de la Planta Inicial. Constituye un monte de reserva y es donante de materiales de propagacin; 3) Organizacin de un monte de Plantas de Base que deber mantener al menos diez plantas por cultivar y/o portainjerto como plantas madres de la propagacin, sometidas a rigurosos contro-

les sanitarios y varietales anuales; 4) Produccin de Plantas Certificadas. Est destinada a producir las plantas que demanda el mercado (viveros expendedores). Cada etapa puede tener subetapas. Todas estn reglamentadas y sometidas a estrictos controles sanitarios y varietales. El Material Certificado producido por los Sistemas de Certificacin referidos al saneamiento de virus puede considerar dos calificaciones segn su programacin: Material Libre de Virus (virus free - VF) cuando los materiales estn exentos de todos los virus conocidos en esa especie y Material Testado (virus test - VT) cuando los materiales se encuentran exentos de los principales virus. Por lo comn ninguna planta seleccionada como candidata a Planta Inicial resulta libre de patgenos sistmicos. El cultivo in vitro de meristemas precedido por la aplicacin de termoterapia ofrece la posibilidad de recuperar materiales contaminados para obtener una Planta Inicial. El cultivo in vitro es, adems, una prctica de rutina para la rpida multiplicacin de portainjertos en los cuales injertar yemas para propagar cultivares. Una planta de un cultivar (variedad) puede donar numerosas yemas que requieren igual nmero de portainjertos (Fig. 1). Esta clonacin permite obviar el empleo de carozos como generadores de portainjertos y de esta manera uniformar su respuesta a estrs bitico o abitico. 2 Micropropagacin de portainjertos para Prunus de Sanidad Certificada, mediante cultivo in vitro Los Sistemas de Propagacin de Portainjertos Certificados establecen procedimientos para su micropropagacin mediante el cultivo in vitro que en general contemplan el siguiente desarrollo: 1 .- Tomar explantos de Plantas Iniciales o de Plantas de Propagacin (Monte Fundacin, Plantas de Base) que hayan superado todos los controles sanitarios y de pureza varietal anuales. 2.- El nmero de multiplicaciones in vitro no deber superar los diez ciclos una vez superada la fase de adaptacin. 3 .- Iniciar la micropropagacin empleando meristemas de 0,3-0,5 mm (meristema con uno o dos primordios foliares), e identificar el material

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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MICROPROPAGACIN Seccionado de yemas CONTROL SANITARIO Estaca de planta seleccionada enraizada Yemario generado por pice caulinar a
a a1a2a3a4a5a6 a: explanto inicial a1, a2, ... a6: clon

CONTROL SANITARIO Toma de muestras abcdefghij Termoterapia Iniciacin del cultivo in vitro. Cada pice caulinar originar un clon MICROPROPAGACIN Seccionado de brotes

Clones libres

Yema tratada

Cultivo de pices caulinares Micropropacin (hasta 10 ciclos) RIZOGNESIS

Desinfeccin superficial

pice caulinar

Remocin de hojas

TRANSPLANTE A SUELO BAJO CONDICIONES CONTROLADAS EN INVERNADERO

Figura 1: Esquema de micropropagacin de Prunus

sembrado. 4.- Los meristemas generarn yemas (un yemario), en general, entre las 6 y 12 semanas de implantado. 5.- Repicar las yemas del yemario. La propagacin de cada meristema se deber identificar con una sigla, de manera que cada pice caulinar d origen a un clon (una lnea de descendencia). 6.- Control sanitario. Antes de la tercera multiplicacin debern tomarse al menos 3 plantas de cada clon para realizar el anlisis de los patgenos que se estableci eliminar. Las plntulas seleccionadas debern permanecer destapadas por al menos una semana, fuera de la cmara de cultivo, bajo luz, temperatura y humedad relativa controladas a fin de dar oportunidad a el o los patgenos, si los hubiera, de incrementar su poblacin lo cual facilitar su deteccin. El control sanitario deber realizarse en plantas leosas y

herbceas por indexacin, testado mediante tcnicas inmunoenzimticas (DAS-ELISA o sus variantes), microscopa electrnica (dips, secciones ultrafinas, ISEM + D) y tcnicas moleculares (dsRNA viral, PCR, PCR anidado). La lnea de descendencia que no supere este control ser eliminada. 7.- Los medios de cultivo no deben contener sustancias nocivas ni antibiticos que puedan enmascarar la presencia de microorganismos. 8.- Es motivo de rechazo el material cultivado en medios contaminados. 9.- Consignar en un Libro de Registro las acciones realizadas durante la micropropagacin (ciclos de micropropagacin, medios de cultivo, nmero de individuos logrados, toma de muestras para anlisis, tipo de anlisis, resultados, depuraciones, etc.) por cada lnea de descendencia. 10.- Trasplantar a suelo (mezcla de turba,

320

DOCAMPO, Delia M.

perlita, mantillo 1:1:1:) estril las plantas regeneradas in vitro. 2.1 Aclimatacin 1.- Descalzar del medio las plantas regeneradas lavando cuidadosamente sus races bajo chorro de agua hasta retirar la totalidad del agar. 2.- Plantar en terrinas plsticas desinfectadas con NaOCl al 15% (Cl activo 80 g/dm3), en una mezcla de turba, mantillo y perlita 1:1:1 esterilizada en autoclave durante 1 h sin presin. 3.- Colocar las terrinas en cmaras con HR del 90-100%, con luz continua de 4000 luxes provista por tubos fluorescentes de luz blanca fra, temperatura mnima 15C, mxima 35C. 4.- A los 30 das transplantar a cestillos plsticos (6 cm de dimetro) y mantenerlos bajo tneles de polietileno en invernadero con HR 70-90% y 16 h de luz. 5.- Levantar el plstico por los costados lentamente cada 2-3 das hasta su retiro definitivo. 6.- Control varietal: tomar al menos tres plantas por lnea de descendencia clonal para el control varietal. Dentro de un Sistema de Certificacin, el productor cultivar las plantas en sus instalaciones de aclimatacin e informar al organismo oficial responsable para que efecte las correspondientes inspecciones. Toda planta fuera de tipo y las afectadas por plagas sern eliminadas. Esta depuracin debe ser anotada en el Libro de Registro. 7.- Control sanitario: realizar un segundo control sanitario (indexing y testado serolgico, microscopia electrnica, tcnicas moleculares) al ao de desarrolladas las plantas en todos los clones. 8.- Identificar con una clave, que debe figurar en el Libro de Registro, cada lnea de descendencia. En los recipientes de multiplicacin figurar la clave y el nmero de multiplicacin que corresponda. 9.- En la etiqueta debe figurar Producido in vitro. 3 Obtencin de una Planta Inicial (cultivar y/o portainjerto) libre de patgenos mediante cultivo in vitro asociado con termoterapia 1 .- Seleccionar plantas (cultivares y/o protainjertos) por su pureza varietal y condiciones agronmicas deseables (candidata a Planta Inicial). 2.- Investigar su condicin sa-

nitaria por indexacin en plantas leosas y herbceas, testeado mediante tcnicas inmunoenzimticas (DAS-ELISA y/o sus variantes), microscopia electrnica (dips, secciones ultrafinas, ISEM-D) y tcnicas moleculares (dsRNA viral, PCR, PCR anidado). 3.- Si ninguna de las plantas resultase libre de patgenos sistmicos, aplicar termoterapia seguida de cultivo de meristemas de las yemas tratadas. Los controles sanitarios de las plantas regeneradas permitirn seleccionar las plantas libres de patgenos. 3.1 Termoterapia Se aplica sobre materiales activos (barbados con brotes, plantas jvenes). 1.- Enraizar individualmente en suelo estril estacas de la planta seleccionada para el tratamiento o estacas de portainjertos de Sanidad Certificadas para injertar yemas de las variedades seleccionadas. 2.- Colocar las plantas enraizadas y con brotes (en actividad) en cmaras donde reciban una corriente de aire caliente. 3.- Temperatura: vara con la relacin cultivar-patgeno. Algunos patgenos son eliminados con facilidad por el calor mientras otros disminuyen su concentracin pero permanecen en los tejidos. Los Prunus tienen intolerancia a los tratamientos prolongados con calor, pero pueden soportarlos si se utiliza calor moderado (34-38 C). 4 .Fotoperodo: 16 h de luz suministrada por tubos fluorescentes de luz blanca. Intensidad lumnica: 48.000M S-1m-2 (3,54,0 klux). Riego: diario. Humedad relativa: entre 60 y 80%. 5.- Tiempo: vara con la relacin planta patgeno. Oscila entre 3 y 7 semanas, aunque, por lo comn, vara entre 3-4 semanas. 6.Retirar las plantas de la termoterapia y a continuacin aislar y cultivar los meristemas de las yemas desarrolladas durante el tratamiento. Evitar la recontaminacin de los meristemas prolongando el tiempo entre la finalizacin de la termoterapia y el cultivo de los materiales. 7 .- Continuar la micropropagacin como se desarrolla desde el tem 2 en Micropropagacin de portainjertos para Prunus de Sanidad Certificada, mediante cultivo in vitro. 4 Obtencin de variedades (cultivares) libres de patgenos mediante el microinjerto de pices caulinares in vitro

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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La tcnica es adecuada para injertar meristemas de frutales de carozo infectados sometidos a termoterapia. 1 .- Cultivar in vitro explantos de un portainjerto libres de infeccin. 2.- Colectar brotes de la variedad sometida a termoterapia y desinfectarlos. 3.Extraer bajo lupa el meristema (0,2-0,4 mm). 4.- Decapitar los portainjertos cultivados in vitro. 5.- Colocar el meristema de la variedad sobre el extremo decapitado de la plntula portainjerto cuidando que las zonas vasculares entren en contacto. 6.- Colocar los microinjertos en ambiente controlado (16 h de luz aportada por tubos fluorescentes de luz blanca. Intensidad lumnica: 3,54,0 klux, HR: 60 y 80%). 7.- Dejar desarrollar la planta injertada en un medio adecuado durante 5 a 15 semanas bajo luz. 8.- Transplantar a suelo estril. Se inicia su aclimatacin en invernadero bajo condiciones de luz, temperatura y humedad controlada por varias semanas. 9.Continuar con la aclimatacin de las plantas generadas como se sealara previamente. 5 Lecturas recomendadas
CHANG, T.T. 1988. The case for large collections. En: The use of plantgenetic resources (A.H.D. Brown, O.H. Frankel, D.R. Marshall y J.T. Williams, eds.). Cambridge University Press, Reino Unido. p. 123-35. DOCAMPO D. M., HAELTERMAN, R. M., GUERRA, G. D. 1990. Distribucin del PNRSV, PDV y PLV en Prunoideas de Areas Frutcolas de la Repblica Argentina. RIA 22 (1): 280-285. GELLA FAANAS, R. 1993. Obtencin de planta certificada. Servicio de Investigacin Agraria. Diputacin General de Aragn. Espaa. pp. 33 GEORGE, J., DAVIDSON, T. 1962. A technique for detecting virus infected Montmorency cherry seeds. Canadian Journal of Plant Science 42: 193-203.

GEORGE, J., DAVIDSON, T. 1963. Pollen transmission of necrotic ring spot and sour cherry yellows virus from tree to tree. Canadian Journal of Plant Science 43: 276288. GILMER, R. M., BRASE, K. D. 1963. Nonuniform distribution of Prune dwarf virus on sweet and sour cherry. Phytopathology 53: 369-370. HAELTERMAN, R. M., DOCAMPO D. M. 1998. Presencia del virus de las manchas foliares clorticas del manzano (apple chlorotic leaf spot virus) en tres reas de Argentina. XXI Congreso Argentino de Horticultura. San Pedro. Buenos Aires. Argentina. pp 70. JARAMILLO, S. y M. BAENA. 2000. Material de apoyo a la capacitacin en conservacin ex situ de recursos fitogenticos. Instituto Internacional de Recursos Fitogenticos, Cali, Colombia. NEMETH, M. 1986. In: Virus, mycoplasma and rickesttia diseases of fruit trees. Martinus Nijhoff and Dr. W. Junk publishers. Academiai Kiado, Budapest, Hungary. Pp. 545. NOME, S.F. Aspectos tcnicos de la produccin de materiales de sanidad controlada en Pagliano, Daniel coord. Calidad gentica y sanitaria: un instrumento para la competitividad de la cadena agroindustrial / Coord. Daniel Pagliano. Montevideo : IICA-PROCISUR, 1999. 100 p. ISBN 92-9039-400 5. OGAWA, J. M., ZEHR, E. I., BIRD, G. W., RITCHIE, D. F., URIU, K., UYEMOTO, J. K. 1995. Compendium of stone fruit diseases. APS press. The American Phytopathological Society. Pp. 95. PAGLIANO, DANIEL coord. Calidad gentica y sanitaria: un instrumento para la competitividad de la cadena agroindustrial / Coord. Daniel Pagliano. Montevideo : IICA-PROCISUR, 1999. 100 p. ISBN 92-9039-400 5.

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DOCAMPO, Delia M.

VIII.-Captulo 9
Biotecnologa aplicada al control de enfermedades fngicas y bacterianas
Zappacosta, Diego 1 Introduccin Desde la domesticacin de las plantas por el hombre las enfermedades han causado enormes prdidas en la produccin. El uso intensivo de monocultivos con baja diversidad gentica en la agricultura moderna ha redundado en una elevada susceptibilidad a algunas enfermedades y en un incremento de la agresividad de algunos patgenos. Con excepcin de las enfermedades epidmicas, que llegan a destruir cultivos completos, se estima que las prdidas ocasionadas por patgenos en el plano mundial representan un 12% del potencial de produccin, teniendo mayor incidencia en hortalizas, frutales y arroz. Adems de causar prdidas en la produccin, algunos patgenos tambin reducen la calidad de los alimentos, como es el caso de algunas especies de Fusarium y Aspergillus, que dejan en los tejidos infectados toxinas que afectan la salud humana y animal. Existen varias formas de controlar las enfermedades, entre los que podemos mencionar: a) las prcticas culturales, como la rotacin, la sanidad del material inicial, el control de restos vegetales, etc., b) la aplicacin de agroqumicos y c) la resistencia gentica. Aunque las tres alternativas son utilizadas, la ltima, por su mejor implementacin y menor impacto ambiental, es una de las mejores opciones. Es frecuente, sin embargo, encontrar inconvenientes para su aplicacin, tales como la falta de genes de resistencia, la rpida evolucin de nuevas razas virulentas del patgeno, etctera. La incorporacin de genes de resistencia es uno de los mayores desafos para los mejoradores durante el desarrollo de nuevos cultivares. Tradicionalmente se ha llevado a cabo a travs de mtodos convencionales de mejoramiento, que involucran seleccin y evaluacin de grandes poblaciones derivadas de cruzamientos entre materiales

susceptibles y resistentes y la posterior seleccin bajo condiciones propicias para la enfermedad. Si bien estos mtodos convencionales han resultado exitosos en muchos casos, son lentos y laboriosos, ya que involucran cruzas, retrocruzas y seleccin, siendo adems difcil seguir la evolucin de nuevas razas virulentas de los patgenos. Esto ha llevado a un uso masivo de agroqumicos a pesar de su alto costo y su alto impacto ambiental. La biotecnologa y la biologa molecular ofrecen nuevas herramientas a los mejoradores, aumentando las posibilidades y la eficiencia en la obtencin de variabilidad gentica y en la seleccin de caracteres deseables, brindando adems alternativas viables para identificar, seleccionar y transferir genes de resistencia. El cultivo in vitro fue una de las primeras herramientas de la biotecnologa utilizadas en la bsqueda de resistencia a enfermedades. Desde sus distintas alternativas brinda soluciones para sortear barreras en los cruzamientos, colaborando adems en la seleccin de genotipos resistentes. En lo que respecta a la ingeniera gentica, la resistencia a enfermedades fngicas y bacterianas no ha alcanzado el mismo nivel de desarrollo que la resistencia a insectos o virus. Sin embargo existen numerosos proyectos de investigacin en curso y se prev un gran desarrollo comercial en los prximos aos. En este captulo se intentar ofrecer un panorama actualizado de las herramientas que la biotecnologa vegetal brinda al mejorador para el estudio y control de las enfermedades fngicas y bacterianas. 2 Cultivo in vitro Es posible encontrar genes de resistencia en muchas de las especies cultivadas o en especies muy cercanas filogenticamente y transferirlos por cruzamientos convencionales a especies susceptibles. Sin embargo, a veces, es necesario recurrir a especies no tan cercanas filogenticamente, pudiendo existir barreras de incompatibilidad. En estos casos es posible obtener hbridos viables con la utilizacin de tcnicas tales como el rescate de embriones, la hibridizacin somtica, la

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fusin de protoplastos, la polinizacin in vitro, etc. Estas tcnicas ya fueron descriptas en captulos precedentes y son utilizadas para la incorporacin de diversas caractersticas entre las que encontramos la resistencia a enfermedades. Una tcnica promisoria es la seleccin in vitro de materiales resistentes utilizando al patgeno vivo o algn metabolito purificado o no del mismo u otras sustancias qumicas como agente de seleccin. Esta tcnica ser tratada con ms detalle a continuacin. 2.1 Seleccin in vitro de genotipos resistentes Los ensayos para la seleccin de resistencia a patgenos (screening) y el estudio de la interaccin hospedador-patgeno bajo condiciones de campo se encuentran sujetos a una gran variacin entre experimentos. Esto se debe principalmente a la distribucin no uniforme de los patgenos y a la falta de control sobre las variables ambientales. Por ejemplo, en el caso de enfermedades del suelo, los perodos relativamente largos de crecimiento favorecen el desarrollo de otras enfermedades que pueden interferir y afectar la validez de los resultados. Por esta razn, queda claro que los ensayos de seleccin por resistencia a enfermedades deben realizarse, en lo posible, bajo condiciones controladas. Estas condiciones raramente pueden encontrarse a campo. Se han planteado alternativas utilizando invernculos o ambientes controlados, lo cual soluciona algunos de los problemas mencionados anteriormente. En estas situaciones, la seleccin de genotipos resistentes se basa en la observacin de la respuesta de genotipos individuales en la poblacin de plantas ante la presencia del patgeno. Otras metodologas plantean el uso de metabolitos producidos por el patgeno, que en algunos casos han demostrado tener el mismo efecto que el microorganismo mismo. Esto ltimo se observa principalmente cuando las toxinas producidas por el hongo son factores de virulencia importantes. La seleccin in vitro se basa en exponer plantas, rganos, tejidos o clulas vegetales

a patgenos o sus metabolitos simulando la interaccin hospedador-patgeno que tiene lugar en la naturaleza. Esta tcnica permite estandarizar la evaluacin, hacindola repetible y confiable, con la ventaja adicional de que en un espacio reducido y en un corto perodo se puede chequear la resistencia o tolerancia de gran cantidad de individuos. Esto brinda adems la posibilidad de poder ensayar callos y plntulas, sin necesidad de trabajar con plantas adultas. Presenta, sin embargo, algunos inconvenientes, tales como la falta de correlacin in vitro-in vivo y la posible aparicin de modificaciones genticas no deseables originadas por el pasaje por cultivo in vitro. No obstante, en algunos casos, la respuesta obtenida in vitro ha demostrado tener una estrecha correlacin con la resistencia-tolerancia obtenida in vivo (Yoder, 1980). Diferentes tcnicas in vitro pueden ser explotadas para seleccionar o inducir variantes con mayor resistencia a enfermedades o para establecer modelos de estudio de interacciones planta-patgeno. Sin embargo, la eleccin de la estrategia experimental depende del sistema hospedador-patgeno considerado. Las principales variables a tener en cuenta son (Daub, 1986):

La naturaleza y complejidad de las tcnicas de cultivo in vitro requeridas (cultivo de embriones, regeneracin de plantas desde suspensiones celulares, callos, etc.). El nivel en que se realiza la seleccin o screening (in vitro o en plantas regeneradas luego de realizar manipulaciones in vitro) Los agentes utilizados para la seleccin de resistencia (el patgeno mismo, filtrados, toxinas especficas o toxinas de otro patgeno muy relacionado, agentes qumicos, etc.). El origen de la nueva resistencia buscada (recuperacin de variacin existente, cambios espontneos, mutagnesis, etc.).
Muchos microorganismos patgenos de plantas producen fitotoxinas , que son metabolitos txicos, no enzimticos, que, no obstante hallarse a bajas concentraciones, daan a las plantas (Tabla 1). Una toxina especfica es un metabolito producido por el patgeno que posee la misma especificidad por el material vegetal que el patgeno mis-

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Tabla 1: Principales toxinas de microorganismos patgenos de plantas

mo. En cambio, las toxinas no especficas son metabolitos producidos por el patgeno que pueden tener alguna relevancia en el desarrollo de la enfermedad, pero no son responsables de todos los daos causados por el mismo. Sin embargo, en algunas interacciones compatibles estas toxinas no especficas pueden ser necesarias para una infeccin exitosa y en otros casos son slo determinantes secundarios de la enfermedad. El mecanismo responsable de su toxicidad vara con el patosistema y, en muchos de ellos, el(los) rol(es) de las toxinas en la patogenicidad no est(n) claramente establecido(s), especialmente en los casos de toxinas no especficas, como por ejemplo el cido fusrico. En general se considera que actan como factores de virulencia, debilitando al hospedador o inhibiendo o retardando las respuestas de defensa (Johal, 1995). Buscando resistencia a toxinas se puede hallar resistencia a patgenos, ya que la toxina puede tener un rol decisivo en la patognesis (McCormick y col., 1998). En algunas especies de plantas se ha tenido xito en la seleccin de materiales resistentes a patgenos utilizando toxinas especficas como presin de seleccin in vitro. Entre las interacciones ms estudiadas podemos mencionar el caso de avenaCochliobolus victoriae , caa de azcarDrechslera sacchari y pltanoMycosphaerella fijiensis. Tambin se pueden usar toxinas no especficas para la seleccin de materiales resistentes. Muchos patgenos producen es-

tos metabolitos txicos y la resistencia a alguno de ellos puede mejorar la resistencia a la enfermedad en forma cuali y cuantitativa. Ejemplos de seleccin usando toxinas no especficas se encuentran en las interacciones: arroz-C. miyabeanus , tomateFusarium oxysporum, apio-Septoria apiicola, caf- Colletotrichum kahawae, esprrago-F. o x y s p o r u m , Arabidopsis-F. moniliforme, cebolla-Phoma terrestris, entre otras. Una de las principales limitaciones de este sistema de seleccin es precisamente el desconocimiento del tipo de toxina(s) o la importancia de ellas en muchas enfermedades. Tambin es de destacar que en algunas interacciones donde se conocen toxinas especficas, las mismas no son activas en todos los tejidos y clulas. Descifrar el fundamento bioqumico de la resistencia a una toxina facilitara el proceso de seleccin. Aunque los comentarios anteriores se aplican fundamentalmente a patgenos fngicos, las bacterias tambin producen fitotoxinas. En general, estas toxinas son no especficas y causan sntomas en muchas plantas que no son hospedadores del patgeno que las produce. Aunque las fitotoxinas bacterianas son generalmente no requeridas para la patognesis, ellas tpicamente funcionan como factores de agresividad y su produccin resulta en un incremento de la severidad de la enfermedad (Bender, 1998). Otra alternativa para la seleccin de materiales resistentes es usar como presin de seleccin enzimas pectolticas, cuando stas cumplen un rol importante en la patognesis, como es el caso de los patgenos que producen la maceracin de los tejidos que atacan. Un ejemplo de ello lo constituye la interaccin entre Rhizoctonia fragariae y Botrytis cinerea con la frutilla, donde se logr seleccionar plantas con mayor resistencia a los patgenos mencionados utilizando

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enzimas pectolticas purificadas a partir de 3 Obtencin de resistencia utilizando herramientas de ingeniera gentica cultivos lquidos de los mismos. La falta de toxinas relevantes en la patoUna de las alternativas biotecnolgicas gnesis de muchas enfermedades y/o activas a nivel celular, ha llevado a establecer y ms promisorias para obtener resistencia a estudiar sistemas in vitro con el patgeno enfermedades es la incorporacin de genes mismo. Uno de los mayores problemas en de resistencia mediante tecnologa gnica. estos sistemas es controlar el crecimiento Estas tcnicas han sido descriptas previamenexcesivo del patgeno, sea bacteria u hon- te (ver III.-3), por lo que en esta seccin slo go, sobre el material vegetal y sobre el me- se tratarn las situaciones especficas de redio de cultivo y la dificultad para interpretar sistencia a bacterias y hongos patgenos. Como resultado de los estudios tendienlos resultados. Otro inconveniente es la correlacin entre las interacciones hospedador- tes a la identificacin, clonacin y caracteripatgeno in vitro e in vivo (la resistencia in zacin de genes involucrados en la resistenvitro puede no ser expresada in vivo o la si- cia a enfermedades han sido identificados tuacin recproca). Un prerrequisito para una muchos mecanismos que las plantas utilizan eficiente seleccin in vitro utilizando al pa- para responder a la infeccin de patgenos, tgeno es que el sistema in vitro sea consistente con los eventos que suceden a nivel de planta (hay que tener en cuenta cules son los tejidos susceptibles, el estado fisiolgico de la planta, etc.). En el caso de hongos bitrofos obligados y en muchos necrtrofos las tcnicas de cocultivo han resultado ser una solucin para cultivarlos en condiciones controladas. El cultivo dual de hongos necrtrofos y tejidos vegetales puede resultar ptimo para estudios bsicos y aplicados, constituyendo un sistema simplificado en el cual factores nutricionales y ambientales pueden ser cuidadosamente controlados. Se ha establecido exitosamente este sistema de cultivo para las interacciones alfalfaP h y t o p h t h o r a megasperma , tabaco- P. parasitica var. nicotianae, tabaco-Peronospora tabacina, caa de azcarSclerospora sacchari, abeto- Ceratocystis polonica y Lamium purpureumConiothyrium palmarum, Figura 1: Principales mecanismos de defensa que presentan las plantas frente al ataque de microorganismos (modificado de Kombrink y Somssich, entre otras (Miller, 1985).
1995).

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logrndose avances en el conocimiento de los genes que participan en estas respuestas (Fig. 1). La identificacin de estos genes permiti la evaluacin de su rol especfico y su forma de activacin mediante el empleo de plantas transgnicas. Numerosos trabajos detallan los distintos mecanismos de defensa que las plantas poseen para contrarrestar

ducto del metabolismo secundario) o fortalecen las defensas estructurales (por ejemplo fortificacin de la pared celular). Algunas respuestas normales de resistencia son relativamente lentas, detectndose, en algunos casos la expresin 48 hs luego de la infeccin (Fig. 2). En el caso de plantas transgnicas la idea sera lograr expresin temprana o sobreexpresin del producto, generalmente a travs de promotores constitutivos. Otros genes interesantes son aquellos que participan en las vas de induccin de los mecanismos naturales de resistencia. Recientemente, la clonacin de numerosos genes R (de resistencia) ha precipitado el inters en el uso de estos genes para obtener resistencias de amplio espectro. Las principales estrategias de control de enfermedades fngicas mediante el uso de plantas transgnicas pueden ser agrupadas en cinco categoras (Punja, 2001):

Expresin de productos gnicos que son directamente txicos para los patgenos o que reducen su crecimiento. Incluyen protenas relacionadas a la patognesis (proFigura 2: Tiempo relativo de induccin de las principales defensas contra patgenos fngicos (modificado de Kombrink y Somssich, tenas PR), como enzimas hidrolticas (quitinasas, 1,3--glucanasas), prote1995). nas antifngicas (osmotinas y tauel ataque de microorganismos y son reco- matinas), pptidos antimicrobianos (tioninas, mendados como una lectura accesoria al defensinas, lectinas), protenas de transfematerial que sigue a continuacin (Kombrink rencia de lpidos (LPT), protenas inactivay Somssich, 1995; Durand-Tardif y Pelletier, doras de riboso-mas 28S rRNA fngicos (RIP) 2003). y fitoalexinas. Expresin de productos gnicos que 3.1 Resistencia a hongos fitopatgenos destruyen o neutralizan componentes de La seleccin de genes de resistencia para ataque del patgeno. Por ejemplo: ser introducidos en plantas por tecnologa inhibidores de poligalacturonasas (enzimas gnica se basa, en parte, en la evaluacin de que degradan algunos componentes de la la toxicidad de productos gnicos sobre el pared celular vegetal), cido oxlico o lipasas. crecimiento y desarrollo de los patgenos in Expresin de productos gnicos que vitro y del rol del gen en las respuestas de mejoran las defensas estructurales de la resistencia. Muchos productos gnicos per- planta. Consiste en la elevacin de los nivetenecen al grupo de las protenas relaciona- les de ligninas y peroxidasas asociadas a la das a la patognesis (van Loon, 1999), mien- pared celular. tras que otras pertenecen a las vas Expresin de productos gnicos que biosintticas de las fitoalexinas (compuestos participan en las vas de seales que reguantimicrobianos de bajo peso molecular pro- lan las defensas. Incluyen la produccin de
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elicitores especficos, perxido de hidrgeno (H2O2), cido saliclico o etileno. Expresin de productos de genes de resistencia (genes R). Participan en la reaccin de hipersensibilidad y en la interaccin con factores de avirulencia. 3.2 Enzimas hidrolticas La estrategia ms ampliamente utilizada es la sobreexpresin de enzimas hidrolticas tales como 1,3--glucanasas o quitinasas, que degradan la pared celular de hongos y han demostrado tener actividad antifngica in vitro. Con la expresin de diferentes tipos de quitinasas en varias especies vegetales se ha logrado reducir el tamao, el nmero y el desarrollo de lesiones causadas por varios hongos patgenos, algunos de amplio rango de hospedadores, como por ejemplo Botrytis cinerea y Rhizoctonia solani. La expresin de quitinasas ha sido inefectiva, sin embargo, para el control de Cercospora nicotianae , Colletotrichum lagenarium y Pythium spp., indicando que en los hongos existen diferencias en la sensibilidad a este tipo de enzimas. Las diferentes quitinasas presentan variacin en caractersticas tales como especificidad de sustrato, pH ptimo y localizacin celular, lo cual trae aparejadas diferencias en su actividad antifngica. Aunque los resultados de estos estudios no han sido espectaculares en trminos de niveles de control de la enfermedad, la tasa de progresin y la severidad de la misma pudieron ser significativamente reducidas, como se ha demostrado en cultivos transgnicos evaluados a campo (Melchers y Stuiver, 2000). Los resultados obtenidos utilizando 1,3 -glucanasas son similares a los de quitinasas. La expresin combinada de ambas enzimas en varias especies ha revelado un comportamiento mucho ms efectivo en la prevencin del desarrollo de varias enfermedades que la expresin de una sola de ellas, corroborando los resultados obtenidos en los ensayos in vitro. Lo mismo sucede con otras protenas PR con actividad antifngica in vitro, tales como osmotina y taumatina (TLP), que en plantas transgnicas muestran una disminucin de los daos causados por enfermedad, pero los resultados ms alen-

tadores aparecen cuando se expresan en combinacin con quitinasas y 1,3-bglucanasas. Como regla general, el uso de estrategias de ingeniera gentica que involucren la expresin de dos o ms productos de genes antifngicos en un determinado cultivo debera proveer un control de la enfermedad ms efectivo y de ms amplio espectro que el uso de estrategias con un solo gen (Shah, 1997). 3.3 Pptidos antimicrobianos Las defensinas y tioninas son pptidos de bajo peso molecular, ricos en cistena, que poseen actividad antimicrobiana. La sobreexpresin de estas protenas en plantas transgnicas reduce el desarrollo de varios patgenos como Fusarium y Alternaria y confiere resistencia a Verticillium en papa en condiciones a campo. Tambin se han desarrollado plantas transgnicas que expresan pequeos pptidos antimicrobianos sintticos (10-20 aminocidos) que pueden afectar a las hifas, a la pared celular o aumentar la permeabilidad de las membranas celulares fngicas. La habilidad para crear recombinantes sintticos o variantes combinadas de pptidos ofrece nuevas oportunidades para lograr resistencia a un amplio rango de patgenos de manera simultnea, siendo alternativas promisorias para mejorar la eficacia de las plantas transgnicas en el futuro (Lassner y Bedbrook, 2001). 3.4 Fitoalexinas Son otro grupo de compuestos antimicrobianos, productos del metabolismo secundario, presentes en un amplio rango de especies vegetales cuya expresin es inducida por la infeccin de patgenos y elicitores. Son sintetizados a travs de complejas vas bioqumicas, como la del shikimato. La manipulacin gentica para suprimir o mejorar la produccin de fitoalexinas no es sencilla, ya que se hallan involucradas varias enzimas. Como en el caso de las enzimas hidrolticas, no se ha demostrado concluyentemente su rol en mejorar la resistencia a enfermedades en muchas interacciones

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hospedador-patgeno. En plantas transgnicas se ha demostrado que la sobreexpresin de genes que participan en la sntesis de ciertas fitoalexinas como el resveratrol y la medicarpina resulta en una demora en el desarrollo de la enfermedad y en la aparicin de los sntomas producidos por varios patgenos en distintas especies vegetales. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las fitoalexinas son potencialmente txicas para los animales y tienden a no ser especficas en su accin, por lo tanto es necesario realizar ms evaluaciones de los riesgos potenciales de su utilizacin, adems de las relacionadas con sus caractersticas de conferir resistencia a enfermedades (Essenberg, 2001). 3.5 Compuestos que mejoran las defensas estructurales de la planta La pared celular vegetal es una barrera que los patgenos tienen que superar en su ataque y lo logran a travs de enzimas que la degradan (como las poligalacturonasas) o mediante la accin de toxinas. Se han diseado plantas transgnicas que expresan inhibidores de poligalacturonasas, pero los resultados por el momento no son concluyentes. Otra estrategia considerada ha sido la sobreexpresin de peroxidasas, enzimas que participan en la lignificacin de la pared celular. La lignificacin alrededor de los sitios de infeccin es un mecanismo natural que presentan las plantas para restringir el ataque de patgenos. Mediante esta estrategia se logr un aumento en los niveles de lignina de la planta, que no brind, sin embargo, una mejora en la resistencia a enfermedades en varios sistemas hospedadorpatgeno estudiados. Una opcin ms reciente es la expresin de enzimas que degradan toxinas fngicas, como la expresin en tabaco de una enzima degr adador a de t r i cot ecenos de Fusarium sporotrichloide, que reduce el dao a los tejidos y mejora la emergencia de plntulas en presencia de la toxina. La inactivacin de factores de virulencia especficos por productos gnicos expresados en plantas transgnicas es una estrategia promisoria para reducir el desarrollo de patgenos especficos.

3.6 Elicitores Las vas de seales que coordinan las respuestas de defensa en las plantas, que incluyen la reaccin de hipersensibilidad (RH), la produccin de protenas PR y de fitoalexinas, pueden ser activadas por molculas llamadas elicitores. La induccin de RH y necrosis, que resulta en la activacin de respuestas de defensa, podra resultar en una induccin de resistencia a un amplio espectro de enfermedades. El uso de estas estrategias requerira, sin embargo, de la cuidadosa manipulacin de vas metablicas complejas, cuya alteracin podra tener efectos secundarios no deseables sobre otros caracteres del cultivo, ya que intervienen en varios procesos vegetales. Mediante el uso de plantas transgnicas se han disectado genticamente muchas de estas vas, identificndose muchos de los compuestos intervinientes en las respuestas de defensa a patgenos. El perxido de hidrgeno (H2O2) inhibe el crecimiento de patgenos y activa ciertas vas de trasmisin de seales que inducen respuestas de defensa. La expresin de niveles elevados de H2O2 en plantas transgnicas a travs de la expresin de la glucosa oxidasa reduce los efectos causados por patgenos como Rhizoctonia, Verticillium, Phytophthora y Alternaria en varias especies cultivadas. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que niveles elevados de H2O2 son fitotxicos. Otros activadores de defensas son el cido saliclico, el etileno y el cido jasmnico. La manipulacin de los niveles de cido saliclico en plantas transgnicas tiene un gran potencial para mejorar la resistencia a enfermedades, ya que no slo inducen la expresin de protenas PR, sino tambin la de otros productos de defensa, los cuales, en conjunto, han demostrado tener una interaccin sinrgica y conferir elevados niveles de resistencia (Lawton, 1997). 3.7 Genes R Estos genes son los ms utilizados en mejoramiento convencional ya que son determinantes simples de una resistencia efectiva y especfica. En su mayora, los productos de estos genes actan reconociendo in-

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afectan al mismo tiempo varios tipos de rganos como hojas, tallos y frutos. Sin embargo, cuando la accin de los patgenos es especfica de rganos o tejidos es recomendable el uso de promotores especficos. En ciertos casos la actividad antifngica de determinados compuestos mejora cuando actan en el espacio apoplstico o son volcados en la vacuola. En este aspecto es necesario orientar los esfuerzos hacia la bsqueda de promotores especficos inducibles por patgenos y a la evaluacin de los sitios ms adecuados de expresin de los transgenes a fin de desarrollar planFigura 3: Modelos de interaccin entre productos de avirulencia tas transgnicas con elevados nivedel patgeno (Avr), sitio target de este producto en la clula vegetal les de resistencia a un amplio espec(T) y productos de genes de resistencia R (R1 y R2). (modificado de tro de enfermedades. Hammond-Kosack y Parker, 2003). Las expectativas puestas en el directamente factores de avirulencia de desarrollo de plantas transgnicas son granpatgenos a travs de correceptores, pero des, ya que podran brindar soluciones para tambin hay casos de interaccin directa (Fig. el control de distintas enfermedades, como 3). Existen varios ejemplos de plantas las provocadas por patgenos de amplio rantransgnicas que expresan genes R; sin em- go de hospedadotes, entre los que se enbargo, debido a la complejidad de las vas de cuentran Rhizoctonia solani y Botrytis seales involucradas en las respuestas de cinerea, para los cuales existen muy pocas defensa, es improbable que la expresin de fuentes convencionales de resistencia. un solo gen mejore la tolerancia a enfermeLas plantas transgnicas expresando redades. Se dispone de una gran cantidad de sistencia a enfermedades podran ser cuesgenes R clonados cuyo anlisis permitir la tionadas porque: obtencin de genes R sintticos con dominios funcionales adecuados que confieran Los productos gnicos antimicrobianos resistencias de amplio espectro (Rommens y podran tener efectos adversos sobre la Kishore, 2000). microflora no patognica que habita sobre o en las inmediaciones de las plantas. 4 Perspectivas Los productos antifngicos expresados podran tener efectos indeseables en la saEl desarrollo de plantas transgnicas con lud de los organismos que consumen dichas resistencia a enfermedades fngicas no ha plantas, en particular el hombre. alcanzado el xito logrado en el desarrollo Una fuerte presin sobre los patgenos de otras resistencias, como por ejemplo a podra llevar a la aparicin de nuevas cepas herbicidas, insectos o virus. La mayora de los resistentes y la ruptura de genes de resistenestudios se han realizado sobre sistemas cia nuevos o existentes. modelo como tabaco, habiendo pocos estu Algunos productos de genes de resisdios a campo, estimndose la aparicin en el tencia, como las protenas PR, los compuesmercado de materiales transgnicos con re- tos antifngicos y los inhibidores de sistencia a hongos en los prximos aos. poligalacturonasas (PGIP), reducen el desarroEn la mayora de los casos mencionados llo de la enfermedad, pero no la previenen anteriormente, la expresin de los totalmente. transgenes ha sido constitutiva, lo cual es La induccin de muerte celular y de RH positivo para el control de patgenos que pueden ser peligrosas, ya que si no son co-

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rrectamente controladas pueden provocar importantes alteraciones metablicas. La existencia de un escudo general de resistencia, que es lo que se busca con niveles elevados de resistencia de amplio espectro, puede llevar a la prdida de genes menores de resistencia en el cultivo y, si un patgeno logra eludir esta barrera, no existiran otras para detener su avance. 5 Resistencia a bacterias Slo una pequea proporcin de las bacterias son fitopatognicas y han desarrollado mecanismos para invadir y colonizar plantas hospedadoras y causar enfermedades. Por ello los esfuerzos invertidos en lograr resistencia a bacterias por tecnologa gnica han sido escasos. La mayora de los mismos se han centrado en una bacteriosis importante en el mbito mundial para la cual no se han hallado genes de resistencia potencialmente transferibles por cruzamientos convencionales, como es el caso de la podredumbre blanda y pie negro de la papa, causados por Erwinia carotovora (During, 1996). Las principales estrategias para lograr resistencia a bacterias fitopatgenas son las siguientes:

Expresin de pptidos bactericidas (cecropinas) provenientes de insectos y ranas, que actan a nivel de la membrana bacteriana. Expresin de tioninas, que son polipptidos ricos en cistena presentes en endosperma y hojas de los cereales, cuya accin, no especfica, se basa en la permeabilizacin de las membranas celulares. Expresin de la lisozima del bacterifago T4 y de huevo de gallina. Cambio de la enzima blanco de toxinas bacterianas o expresin de enzimas detoxificantes provenientes del mismo patgeno u otro organismo. Sntesis de fitoalexinas, que generalmente involucra la modificacin de vas biosintticas complejas, las cuales no siempre son accesibles a la ingeniera gentica. Los resultados, en algunos casos, han sido promisorios, aunque la estrategia ms inten-

samente investigada, la expresin de cecropinas, no ha producido resultados concluyentes, especialmente en los ensayos a campo. Este pptido es degradado por enzimas vegetales, por lo cual sera necesario el desarrollo de anlogos resistentes a proteasas. La expresin de tioninas de cereales en tabaco mejora la resistencia a Pseudomonas syringae . Estas protenas poseen actividad antimicrobiana in vitro y su expresin constitutiva trae aparejada una disminucin significativa del crecimiento de la bacteria y una reduccin en el porcentaje de lesiones necrticas. Las lisozimas son enzimas que catalizan la hidrlisis de la murena, constituyente de la pared celular bacteriana. Se localizan en las vacuolas de varias especies vegetales y comnmente poseen fuerte actividad quitinasa. Antes del inicio de una enfermedad las bacterias patgenas se acumulan en grandes cantidades en los espacios intercelulares de la planta. Las lisozimas slo entran en contacto con las mismas luego de la ruptura de la clula, cuando las bacterias son demasiado numerosas como para ser efectivamente controladas. Por ello, las estrategias se han centrado en dirigir las lisozimas hacia el espacio intercelular. Pocas lisozimas vegetales han sido caracterizadas y clonadas, por lo que se han buscado lisozimas de otros orgenes para ser expresadas en plantas transgnicas, como la del bacterifago T4 y la de huevo de gallina. Esta estrategia ha dado buenos resultados en varios casos y es una de las ms prometedoras. Algunas bacterias producen toxinas que son clave en el desarrollo de la enfermedad, como por ejemplo la tabtoxina de Pseudomonas syringae pv. tabaci, que acta sobre la sntesis de glutamina, provocando clorosis. La expresin del gen trr que codifica para una enzima bacteriana que protege de la accin de la tabtoxina ha logrado disminuir los sntomas de la enfermedad, mejorando la resistencia. Otra ejemplo es la expresin en plantas de tabaco de ornitil transcarbamilasas insensibles a la toxina de P. syringae pv. phaseolicola, que inhibe la actividad de la misma en poroto. Los hospedadores resistentes y algunos no hospedadores son capaces de reconocer

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y combatir las bacterias fitopatgenas. Estas plantas resistentes reaccionan con una muerte celular localizada en el sitio de infeccin (RH), que es inducida por compuestos bacterianos llamados elicitores, tales como protenas de avirulencia (protenas Avr), que son reconocidos por protenas receptoras del hospedador (Fig. 1). La dilucidacin de los mecanismos de resistencia en hospedadores resistentes posibilita la obtencin de plantas transgnicas que expresen diferentes receptores que reconozcan una variada gama de elicitores bacterianos (harpinas, protenas Avr, etc.) y que activen las respuestas de defensa. Varias de las estrategias mencionadas previamente son potencialmente aplicables en el control de bacterias fitopatgenas. Las que implican la expresin de protenas antibacterianas, tales como cecropinas y lisozimas, tienen la ventaja de implicar a un solo gen y conferir resistencia amplia. La inactivacin de toxinas bacterianas o la modificacin del sitio blanco de dichas toxinas puede brindar una estrategia mucho ms especfica y eficiente. 6 Genmica y enfermedades causadas por bacterias En este rea tambin est incursionando la genmica. Xylella fastidiosa es una bacteria que vive en el xilema de las plantas, causando enfermedades que producen grandes prdidas econmicas, incluyendo clorosis variegada en ctricos. Un grupo de biotecnlogos brasileos seleccion este patgeno para secuen-ciacin genmica debido a la gran importancia de los ctricos para la economa de Brasil. Los frutos de las plantas afectadas son ms pequeos y no tienen valor comercial. Utilizando programas de prediccin de secuencias se han encontrado en el genoma de esta bacteria, que consta de ms de 2.5 millones de pares de bases, unos 2.904 genes. A la mitad de los mismos se les ha asignado funciones sobre la base de comparaciones realizadas con otros genomas. Entre estos genes se encuentran algunos que estn involucrados en la patogenicidad, generando compuestos que actan en diferentes procesos, como: - Protenas involucradas en la sntesis y secrecin de toxinas.

- Enzimas involucradas en la ruptura de las paredes celulares. - Enzimas para detoxificar de compuestos de defensa de la planta. - Transportadores eficientes de azcares, que permiten la existencia en el xilema, pobre en nutrientes. - Protenas regulatorias, que ayudan a regular la expresin gnica para mantener el crecimiento en distintos ambientes. - Sntesis y excrecin de polisacridos extracelulares. - Genes involucrados en la eliminacin de antibiticos, que podran se producidos por la planta para matar a la bacteria. - Captacin y secuestro de hierro y otros metales. 7 Situacin en la Argentina La Comisin Nacional Asesora de Biotecnologa Agropecuaria (CONABIA) ha venido autorizando la realizacin de pruebas de laboratorio-invernculo o a campo de plantas transgnicas que expresan resistencia a enfermedades. Del total de autorizaciones realizadas en el periodo 1998-2002, 39 (aproximadamente el 10%) corresponden a solicitudes presentadas por distintas empresas o instituciones para la evaluacin de distintos materiales con resistencia a enfermedades. En la tabla 2 se presenta una lista de algunas de las liberaciones autorizadas. 8 Resumen Los hongos y bacterias fitopatgenos son responsables de gran parte de las prdidas que se producen sobre los cultivos. Una de las formas de control ms eficiente es a travs de la resistencia gentica. Sin embargo, no siempre es posible incorporar genes de resistencia en plantas de cultivo por mejoramiento convencional. La biotecnologa brinda al mejorador nuevas herramientas para la bsqueda e incorporacin de resistencias a travs del cultivo in vitro y la ingeniera gentica. Mediante el cultivo in vitro es posible sortear barreras a la hibridizacin y seleccionar rpida y eficientemente materiales resistentes a enfermedades. La seleccin in vitro se basa en exponer plantas, rganos, tejidos o clulas vegetales a patgenos o sus metabolitos simulando la interaccin

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Tabla 2: Lista de algunas de las liberaciones de plantas transgnicas con resistencia a enfermedades autorizadas por la CONABIA (recopilacin de la pgina web de la CONABIA, http://www.sagpya.mecon.gov.ar)

hospedador-patgeno que tiene lugar en la naturaleza. Mediante tecnologa gnica es posible transferir genes que confieren resistencia a enfermedades. Las estrategias ms utilizadas son la expresin de compuestos antimicrobianos (enzimas hidrolticas, protenas antimicrobianas), la expresin de enzimas o compuestos que neutralizan componentes de ataque del patgeno (inhibidores de poligalacturonasas, inactivadores de toxinas), fortalecimiento de las defensas estructurales (aumento en los niveles de ligninas o peroxidasas) o la modificacin de las vas de seales que regulan las defensas por la produccin de elicitores especficos (perxido de hidrgeno, cido saliclico o etileno). La genmica brinda nuevas herramientas para la deteccin de genes involucrados en la patognesis y, aunque actualmente no existen en el mercado plantas transgnicas que expresen resistencia a enfermedades fngicas o bacterianas, el nivel de desarrollo alcanzado indica que en un futuro muy prximo aparecern plantas resistentes a enfermedades logradas por ingeniera gentica. 9 Lecturas Recomendadas
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PARTE IX Bioseguridad y regulacin de organismos vegetales genticamente modificados (OVGM)

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IX.-Captulo I
Criterios cientficos para la evaluacin de la bioseguridad de organismos genticamente modificados.
Rubinstein, Clara

Si bien las tecnologas de mejoramiento de variedades tradicionalmente utilizadas introducen modificaciones genticas y producen efectos no intencionales, las tecnologas de ADN recombinante presentan caractersticas propias que se han considerado lo suficientemente novedosas a nivel de las organizaciones internacionales que han recomendado su regulacin. Las caractersticas de un organismo vegetal genticamente modificado (OVGM) son estudiadas y evaluadas desde las etapas ms tempranas de su desarrollo desde el punto de vista de su bioseguridad. Para ello, se utiliza un enfoque comparativo que ha sido desarrollado con anterioridad a la aparicin de cultivos transgnicos o sus derivados alimentarios en el mercado. Fue descripto por primera vez en este contexto, en un documento de la OECD (Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico) de 1993, que fue el resultado de dos aos de discusiones que reunieron a ms de 60 expertos de 19 pases. Este enfoque, as como Figura 1: Aumento en la capacidad de modificacin gentica a travs del tiempo Fuente: Informe de Expertos del IFT (2000), adaptado de NRC, los criterios cientficos utilizados 1989 para su implementacin, son presentados en este captulo, con nfasis en la Al mismo tiempo, organismos internacioinocuidad para el consumo. nales como FAO y OMS (la Organizacin para A lo largo de la historia, los mejoradores la Alimentacin y la Agricultura y la Organizahan apelado a todo tipo de tecnologas para cin Mundial de la Salud, respectivamente) generar diversidad gentica, de la cual poder se han ocupado de la bioseguridad de las seleccionar aquellas caractersticas deseadas. nuevas tecnologas aplicadas a la produccin En los captulos y secciones anteriores se han de alimentos. Un informe conjunto de 1991 descripto las ms recientes, que se suman a afirma que la biotecnologa tiene una larotras, utilizadas durante siglos con el mismo ga historia de uso en produccin y procefin. samiento de alimentos. Representa un conLa aplicacin de las tcnicas de ADN tinuo abrazo entre las tcnicas de reprorecombinante al mejoramiento vegetal en duccin tradicionales y las ltimas tcnicas la dcada de 1980, sin embargo, marcan un basadas en la biologa molecular. El uso punto de inflexin, dada las preocupaciones de estas tcnicas no resulta en alimentos

que han generado en diferentes mbitos y posteriormente, tambin debido a su impacto en la percepcin pblica, en especial en la Unin Europea. El National Research Council de los EE.UU., public en 1989 un informe en el cual analiza las diferencias entre el mejoramiento tradicional y las nuevas biotecnologas para la modificacin gentica de plantas y microorganismos. En este informe, se incluye a las tecnologas de ADN recombinante como parte integrante de la secuencia de los avances del conocimiento y de la tecnologa cientfica, a lo largo de 10.000 aos de desarrollo humano (NRC, 1989, ver Fig 1). Tambin concluyen en que las mismas leyes fsicas y biolgicas gobiernan la respuesta de los organismos modificados por los modernos mtodos moleculares y celulares y aqullos producidos por mtodos clsicos.

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inherentementes menos seguros que los producidos por tcnicas convencionales. Se desprende de esto, as como de lo expuesto en captulos anteriores, que todas las especies mejoradas por el hombre son, de un modo u otro, genticamente modificadas. A pesar de esto, la aplicacin de las tcnicas de ingeniera gentica a la produccin de alimentos ha sido considerada lo suficientemente nueva y diferente, como para justificar el control de su desarrollo e implementacin. Esto tiene sus antecedentes en las primeras etapas del desarrollo de la ingeniera gentica, en los aos 70. En 1974 y 1975, los Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. (NIH) convocan a las Conferencias de Asilomar (California), ste fue el primer paso para la creacin de polticas para el control de la seguridad de organismos recombinantes. Desde all, y en todo el mundo, han evolucionado estas polticas y las regulaciones que controlan el desarrollo de nuevos organismos y sus productos mediante tcnicas de ADN recombinante. Estas regulaciones se basan en criterios cientficos y tambin empricos, en particular, en lo que hace a la seguridad de los alimentos. En efecto, muchos de nuestros conocimientos sobre la inocuidad de lo que comemos, proviene de cientos o miles de aos de experiencia, ensayos y errores. Aunque los alimentos tradicionalmente disponibles en las diferentes culturas se aceptan como seguros, se sabe que algunos pueden ser txicos, segn la parte de la planta que se consuma por ejemplo el tallo se puede consumir, pero no as las hojas o las races o el estado de su desarrollo. Tambin hay alimentos de origen vegetal que deben ser cocinados para ser seguros (por ej. porotos), as como sabemos que hay grupos de alimentos que pueden provocar alergias en individuos sensibles (man, leche, nueces, huevo, soja). En 1986 la OECD (Organizacin para el Desarrollo y la Cooperacin Econmica) convoca a reuniones de expertos que renen sus recomendaciones en el llamado Blue Book. Ms adelante, en 1993, OECD resumi estos conceptos: La seguridad de los alimentos para consumo humano se basa en que debe existir una certeza razonable

de que no resultar dao alguno del uso debido bajo las condiciones de consumo anticipadas. Histricamente, los alimentos preparados y utilizados bajo las condiciones tradicionales han sido considerados seguros, por su historia de uso y experiencia, aun cuando pudieran contener txicos naturales o antinutrientes. En principio, los alimentos se han considerado seguros, a menos que un peligro significativo se haya podido identificar. En este captulo se intentar dar un panorama de los criterios cientficos que se utilizan internacionalmente para evaluar la seguridad de los cultivos transgnicos, tambin llamados genricamente OGM (Organismos Genticamente Modificados). 1. El anlisis de riesgos y la identificacin del peligro Se ha establecido que el anlisis de riesgos consta de tres etapas fundamentales: La identificacin del peligro: es la identificacin y cuantificacin de un efecto adverso, en general, a partir de ensayos experimentales; por ejemplo, de tipo toxicolgico en modelos animales. Valoracin de la exposicin: estima y si es posible cuantifica la frecuencia y el tiempo de exposicin a dicho peligro. Caracterizacin del riesgo: es la estimacin que surge de evaluar el peligro en funcin de la exposicin y evaluar diferentes escenarios de exposicin mxima, para establecer qu grado de exposicin es aceptable en cuanto a la seguridad. Este proceso se aplica a casos muy diferentes, y existe amplia experiencia en su aplicacin a la evaluacin de riesgos para aditivos alimentarios, agroqumicos y compuestos especficos en general. En esos casos, es relativamente simple someter cantidades exactas y conocidas de un compuesto a ensayos toxicolgicos clsicos en modelos animales, o evaluaciones de residuos en alimentos, aguas, suelos, etc. De esta forma, se establecen parmetros como el NOAEL (por No Adverse Effect Level ), que es el nivel de exposicin en el que no se observan efectos adversos. Este da una medida de la peligrosidad del compuesto: cuanto mayor el

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NOAEL, menor el potencial txico del compuesto. Basndose en el NOAEL, es posible estimar un nivel de exposicin seguro, que define el ADI (dosis diaria aceptable, expresada por kg de peso corporal) y que dependiendo del tipo de sustancia y otras variables, suele estar unas 100 veces por encima del NOAEL. Este factor de multiplicacin se conoce como margen de seguridad para la exposicin. Sin embargo, estos principios no son tan directamente aplicables al anlisis de riesgos para OVGM o sus derivados de uso alimentario, ya que constituyen mezclas complejas, que contienen miles de compuestos, macro y micro nutrientes, txicos naturales (compuestos txicos que estn naturalmente presentes en la especie), antinutrientes (compuestos que inhiben la absorcin o biodisponibilidad de algunos nutrientes), metabolitos secundarios, etctera. Por lo tanto, la evaluacin de estos cultivos es ms una evaluacin de seguridad o inocuidad ms que un anlisis de riesgos clsico, ya que hasta ahora no se han determinado peligros cuantificables en los OGM estudiados. De hecho, en la prctica, en caso de identificarse efectos adversos, estos cultivos no se autorizaran para su salida al mercado. Por todo lo anterior, se ha desarrollado para los OGM un enfoque que ha sido utilizado para otros casos de alimentos y que se basa en la comparacin del nuevo alimento o cultivo con el tradicionalmente utilizado y considerado seguro. Este enfoque se ha desarrollado consensuadamente con la colaboracin de diferentes organismos internacionales (OECD, FAO ,OMS, International Life Sciences Institute o ILSI) que peridicamente convocan a paneles de expertos que revisan y actualizan las recomendaciones de acuerdo con los avances tecnolgicos y el estado del conocimiento. Es en este contexto dinmico y cambiante, que se ha desarrollado el sistema de evaluacin de la seguridad alimentaria de OGM, como resume el documento de OECD, 1993: Nuestra comprensin de la naturaleza y composicin de los alimentos aumenta cada da y estamos investigando y conociendo ms acerca de la importante relacin entre dieta y efectos sobre la salud. En el futuro, segura-

mente descubriremos nueva informacin importante acerca de beneficios especiales y riesgos ocultos en los alimentos que comemos, que nos podrn ayudar a conducirnos hacia dietas ms saludables. 2. El enfoque comparativo y la equivalencia sustancial En 1993 la OECD formul el concepto de Equivalencia Sustancial. Este concepto no constituye en s la evaluacin de inocuidad sino que es un marco de referencia que orienta la evaluacin, que s se basa en un Enfoque Comparativo. Este enfoque no hace otra cosa que tomar como referencia los cultivos o alimentos conocidos y aceptados como seguros y compararlos con sus versiones mejoradas mediante ingeniera gentica. Es oportuno aclarar que estas tcnicas no en todos los casos van a tener como resultado la introduccin de un transgn, sino que hay otras estrategias experimentales - antisentido, silenciamiento por regulacin epigentica o anulacin de la actividad de un gen por knock out, que si bien involucran manipulacin in vitro y transformacin, no resultan en la adicin de un gen y/o una protena nuevos. El Enfoque Comparativo fue evolucionando desde las primeras propuestas de recomendaciones que formularon OECD; FAO/ OMS e ILSI desde 1988. La base de esta estrategia para establecer inocuidad de nuevos alimentos, es la historia de uso seguro del cultivo parental (es decir aquel que es la base de la modificacin) . - Qu se compara y por qu Es claro que toda modificacin tiene un objetivo, sea obtener una mejora de tipo agronmica (a esta categora pertenecen los OVGM conocidos como de primera generacin) como resistencia a plagas o enfermedades, una mejora nutricional o de calidad (segunda generacin) o bien la sntesis de un producto en particular (tercera generacin) desde un frmaco, hasta biocombustibles, pasando por vacunas comestibles. Es decir que la modificacin tiene efectos intencionales medibles, que se traducen en una caracterstica fenotpica dada. Por otro lado, es posible que se produzcan efectos no intencionales de la modifica-

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cin, que pueden o no tener un impacto negativo en la seguridad de la planta modificada, pero que es pertinente estimar. Y es aqu donde la comparacin tiene un papel relevante. Los impactos no deseados de la introduccin de un gen o secuencia en el genoma de una planta, comprenden diferentes aspectos que son examinados durante el proceso de evaluacin: Toxicidad o alergenicidad de la(s) protenas expresadas Influencia de los productos de expresin sobre el metabolismo de la planta, que lleve a cambios en el valor nutricional o la concentracin de txicos o alrgenos naturales. Insercin no intencional en otros genes (knock out no intencional) que sean esenciales o activacin de otros, que no se expresen normalmente. Efectos pleiotrpicos de los genes insertados (efectos sobre la actividad de otros genes o vas metablicas, que se manifiesten a diferentes niveles en el fenotipo de la planta). Es importante tener en cuenta que estos efectos tambin pueden producirse durante el mejoramiento convencional (definido como el que no utiliza ingeniera gentica), si bien los cultivos mejorados mediante tecnologas no recombinantes no se someten por el momento, a este tipo de evaluacin, con la excepcin de Canad, que s regula algunos casos especiales. La normativa canadiense, evala aquellas variedades con rasgos suficientemente novedosos, independientemente del proceso utilizado para su obtencin, si bien menciona particularmente ciertas metodologas de mejoramiento, como la mutagnesis acelerada (inducida por agentes qumicos o irradiacin) o la fusin celular. Como veremos en detalle a continuacin, el proceso evaluativo recorre una serie de pasos que se basan en evidencia experimental, y que van llevando a conclusiones que permiten tomar decisiones respecto de la inocuidad del OGM en cuestin (ver Figura 3). Las evaluaciones de seguridad, entonces, se concentran: a) en la caracterstica introducida: para ello, se caracteriza completamente el gen insertado en el cultivo GM y se

evala la seguridad de la/s protena/s resultantes. Si bien esta evaluacin la deben realizar los obtentores previamente a la transformacin , ya que no ser aprobado un cultivo que pueda presentar algn problema toxicolgico o de alergenicidad, las agencias regulatorias encargadas del control de estos productos efectan un exhaustivo anlisis de seguridad de los genes insertados y sus productos de expresin. b) en el cultivo o alimento como un todo: sobre el cultivo GM, se analizan los rasgos fenotpicos / agronmicos y la composicin y se los compara con los de sus contrapartes no-GM o convencionales. Las diferencias encontradas, sean intencionales o no, se convierten en el centro de ulteriores evaluaciones de seguridad. El objetivo de estas evaluaciones es demostrar que el cultivo o alimento GM es tan seguro como el alimento tradicional conocido, independientemente de su grado de equivalencia (Figura 2). a. El rasgo introducido: Para caracterizar el gen introducido se requiere conocer la secuencia completa del inserto o insertos, el nmero de copias y su estabilidad a lo largo de varias generaciones. La seguridad (o inocuidad) de la/s protena/s producidas por el inserto se evala basndose en informacin relativa a su fuente de origen (el organismo donante, historial de uso seguro, etc.), su estructura (secuencia de aminocidos, cambios postraduccionales, incluso su estructura tridimensional), su funcin / especificidad / modo de accin, su expresin en diferentes tejidos de la planta, su toxicidad aguda, su potencial de alergenicidad, su digestibilidad in vitro y su estabilidad al procesamiento, que son indicadores de esta potencialidad. Se utiliza la toxicidad aguda determinada en ensayos estndares en ratones por va oral, ya que la gran mayora de las protenas ejercen sus efectos txicos por esta va, fundamentalmente debido a su naturaleza (que hace que se degraden rpidamente en el tracto intestinal). Para detectar otros efectos que podran dejar fuera a algunos casos especiales, se realizan estudios de alimentacin en animales y toxicolgicos subcrnicos (en general, estudios de 90 das en rata, cuando se considera justificado por

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comparar los patrones de protenas del suero de pacientes sensibles, que se unen a inmuglobulinaE (la responsable de las reacciones alrgicas severas) en anlisis de Western sobre geles bidimensionales, para determinar si hay nuevas protenas o si el patrn endgeno se ha visto alterado por la modificacin. Como ya se dijo, an no se cuenta con modelos animales que se encuentren lo suficientemente desarrollados para ser validados a nivel internacional en cuanto a su capacidad predictiva de alergenicidad, pero numerosos organismos e instituciones internacionales se encuentran trabajando en ello.
Figura 2. Enfoque comparativo

las dems evidencias experimentales). En cuanto a la estimacin del potencial alergnico, la aproximacin que se utiliza, es la del peso de la evidencia. Este concepto se basa en el hecho de que no existe un solo parmetro que defina a un alrgeno, y que no es posible hoy contar con modelos que predigan adecuadamente la alergenicidad en humanos. Dado que existe una serie de parmetros fisicoqumicos que son compartidos por los alrgenos proteicos conocidos (que son un grupo reducido de protenas de origen animal y vegetal), stos pueden ser utilizados para estimar la posible alergenicidad de la protena introducida. Por ejemplo, la resistencia a la digestin, la prevalencia en el alimento (normalmente, los alrgenos proteicos son mayoritarios en la composicin final) y la similitud con otras protenas alergnicas, son algunos de estos parmetros. En efecto, se realizan anlisis bioinformticos que comparan la secuencia de los productos de expresin presentes en los OGM, contra bases de datos de todos los alrgenos conocidos. En el caso de cultivos con actividad alergnica conocida, como la soja, es posible

b) El cultivo o alimento GM : Sobre la base de los 50 aos de experiencia ganada en mejoramiento tradicional (breeding), y evaluacin de seguridad de otros productos como medicamentos, alimentos, y qumicos, las agencias internacionales recomiendan comparar los siguientes parmetros de los OGM respecto de contrapartes convencionales, para poder contar con suficiente informacin que permita arribar a una certeza razonable de inocuidad: - Parmetros fenotpicos: La caracterizacin fenotpica/agronmica del cultivo GM se hace tempranamente durante el proceso de seleccin. Los puntos evaluados ( por ej. morfologa, rendimiento) son muy sensibles a los cambios genticos y a las perturbaciones desfavorables en el metabolismo, por lo tanto son buenos indicadores de equivalencias entre el cultivo modificado y su contraparte tradicional. Se observan y miden cuidadosamente las caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, y reproductivas, la resistencia o susceptibilidad a plagas y enfermedades, e incluso caractersticas como perfume o sabor de los frutos. Este proceso, que dirige la seleccin de aque-

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llas plantas transformadas (o eventos) que tengan las caractersticas deseadas, es crtico para eliminar efectos no intencionales. -Composicin qumica: sta es la evaluacin en la que se fundamenta gran parte del anlisis comparativo. Se realiza la determinacin analtica de la composicin en diferentes tejidos de la planta, sobre muestras de ensayos a campo controlados, realizados en ambientes representativos de aquellos donde ese cultivo va a ser sembrado, a lo largo de varias campaas de produccin (aos). Se determina la composicin 1: Ensayos de alimentacin con OGM en modelos animales (adaptado de macro y micronutrientes Tabla de Kuiper y col., 2001, Faust and Glenn, 2002) (protenas, grasas, hidratos de carbono, aminocidos y cidos grasos, vitaMientras que la evaluacin de seguriminas, etc.), minerales, txicos naturales y dad de las protenas introducidas se lleva compuestos bioactivos y/o metabolitos a cabo con la protena (s) purificadas y gesecundarios, dependiendo del cultivo. Por neralmente sintetizadas en modelos bacteejemplo, se miden niveles de fitoestrgenos rianos (por la cantidad que se necesita para y antinutrientes (inhibidores de tripsina, los ensayos toxicolgicos), los estudios de lectinas) en soja, glucosinolatos en colza, alimentacin se realizan con el alimento cumarinas en apio y solaninas en papa. Tam- completo, por ejemplo, grano o forraje en bin se pueden medir alrgenos en soja el caso de maz, harinas de soja tostadas , o (glicinina), beta carotenos en zapallo, y semilla de algodn como suplementacin de gosipol en algodn. La OECD ha publicado la dieta . (Ver Tabla 1). recientemente recomendaciones que especifican qu componentes son ms apropiaSegn los resultados de todos los pundos analizar para cada cultivo en particular. tos analizados, es posible clasificar al cultivo A parte de la comparacin en compo- o alimento GM en una de estas tres categonentes especficos, se realizan, general- ras posibles (FAO/OMS/OECD): mente, ensayos de aptitud nutricional en * El producto GM es sustancialmente modelos animales. Estos apuntan a detec- equivalente a la contraparte tradicional, no tar cualquier efecto no intencional de la mo- existiendo diferencias significativas. Esta situadificacin que pudiera haber afectado el va- cin se da principalmente en productos altalor nutricional del alimento o su inocuidad. mente refinados. El aceite o la fructosa deriEs comn que se utilicen ensayos de alimen- vados de maz GM, son totalmente equivatacin de duracin variable (entre 42 y 120 lentes a los derivados de maz convencional. das) dependiendo del modelo elegido. Uno * El cultivo o alimento GM es sustancialde los ms utilizados y sensibles es el de po- mente equivalente a su contraparte tradillos parrilleros, ya que pasan de pesar 35 gra- cional con la excepcin de diferencias clamos a ms de 2 kg en 42 das. Este crecimien- ramente definidas (presencia de la/s proteto rpido hace que se puedan detectar pe- nas introducidas y/o diferencias bien caracqueas deficiencias nutricionales del alimen- terizadas en otros elementos individuales). Dentro de esta categora caen la mayora to.

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de los cultivos de primera generacin, que expresan un rasgo nico, tal como la resistencia a herbicidas o la proteccin contra insectos, y algunos de segunda generacin, con mejoras nutricionales o de calidad. Para demostrar que los cultivos o alimentos GM son tan seguros como su contraparte tradicional, se debe mostrar que cada diferencia encontrada no tiene consecuencias toxicolgicas ni nutricionales. Esta evaluacin se lleva a cabo caso por caso, y segn se considere necesario, pueden conducirse ensayos de toxicidad o estudios de alimentacin en animales grandes con el cultivo entero. * El cultivo o alimento GM no es sustancialmente equivalente a su contraparte tradicional o no existe un cultivo equivalente con el cual compararlo. Ejemplo de esto seran cultivos con ciertos rasgos combinados o cultivos con valor nutritivo aumentado que contienen nuevas vas metablicas o modifican las endgenas. La evaluacin de seguridad se va a enfocar en las caractersticas de los nuevos productos expresados. En cada caso en particular se

determinar el programa de estudios que corresponda. Actualmente, todos los cultivos modificados y sus productos alimentarios derivados presentes en el mercado han sido analizados en profundidad para evaluar su seguridad, demostrndose que son sustancialmente equivalentes, con la excepcin de la/s protenas introducidas y son tan seguros como su contraparte tradicional. En un futuro se introducir una segunda generacin de cultivos con rasgos de calidad y valor nutritivo mejorado. Por definicin, es menos probable que sean sustancialmente equivalentes a las variedades tradicionales. La evaluacin de la seguridad en estos casos requerir enfocarse en los cambios composicionales intencionales que se hayan introducido en cada caso, y en la evaluacin de los efectos no intencionales (esperados o no) que pudieran haberse producido por modificacin de las vas metablicas involucradas. Como ejemplo de este tipo de casos, se puede mencionar el arroz conocido como arroz dorado, debido a la modificacin introducida para expreTabla 2: componentes analizados en semillas enteras de soja y en varias fracciones de soja procesada (Tomado del Cuadernillo sar altas concentraciones de betaTcnico No1, Seguridad de la Soja RR tolerante a Glifosato (Monsanto caroteno, precursor de vitamina A Agricultura Espaa, 2001) (que le da esta coloracin particular). Como efecto no esperado de esta modificacin, se encontr que tambin se expresaban mayores niveles de xantofilos, un cambio que fue detectado aplicando tcnicas de croma-tografa de alta presin (HPLC) para carotenoides, y que no hubiera sido aparente en un anlisis general de composicin. Este tipo de anlisis, por lo tanto, puede ser apropiado en casos de modificaciones nutricionales (de segunda generacin) dirigidas a cambiar algn paso en vas metablicas especficas, pero que pueden tener efectos en el mbito de otros componentes. Es en estos casos, en los que las nuevas tecnologas analticas que se estn desarrollando pueden aportar soluciones al anlisis de riesgo (ver prxima seccin). Asimismo, este tipo de modifica-

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ciones puede implicar un cambio significativo en la ingesta de ciertos nutrientes (por ejemplo, vitamina A), y requerir un seguimiento luego de su comercializacin para verificar el posible impacto nutricional (positivo o negativo) que esto pueda tener en una determinada poblacin. En la Tabla 2 se resume como ejemplo el tipo de componentes analizados en diferentes fracciones, para la evaluacin de seguridad alimentaria para el evento de soja GM 40-3-2, tolerante a glifosato (ver Parte VIII, captulo 6). En la Tabla 1 se listan los diferentes modelos animales utilizados para la evaluacin de aptitud nutricional de OGM y los parmetros que se analizan en cada caso. 3. Evaluacin de impacto ambiental Toda tecnologa tiene un cierto riesgo que debe ser evaluado 1) en funcin del beneficio o beneficios que aporta y 2) en el contexto de las tecnologas que se utilizan con el mismo fin y de tecnologas alternativas, en caso de existir. La evaluacin del impacto ambiental de nuevos cultivos GM es una parte fundamental de su proceso de aprobacin y control y debe enfocarse dentro de los parmetros enunciados. En los captulos 2 y 3 se desarrolla este aspecto en mayor detalle, por lo que en este punto se enunciarn los posibles impactos sobre el ambiente, que son evaluados antes de la introduccin de un OGM en los agroecosistemas, y que se resumen en los siguientes puntos: Capacidad de convertirse en maleza: en caso de que la planta GM tuviera caractersticas que la hicieran ms resistente a las condiciones ambientales, o tuviera mayor poder reproductivo que su contraparte convencional. Posible impacto en especies benficas o sobre la flora o fauna circundante: es evaluado el impacto que el cultivo podra tener en especies propias del agroecosistema. Por ejemplo, efectos sobre especies que no son el blanco de su actividad en el caso de cultivos GM protegidos de insectos. Mayor capacidad de cruzarse con plantas de su entorno que la contraparte convencional. Incluso en caso de ser idntica, se evala cules seran las consecuencias de di-

chos cruzamientos (debido al llamado flujo gnico mediado por polen). El flujo gentico entre poblaciones es un fenmeno natural, responsable de una gran diversidad gentica. Para estimar qu peso puede tener un rasgo nuevo introducido por ingeniera gentica en el flujo gnico general, es importante tener en cuenta qu efecto en particular producir ese gen si se establece en otra poblacin. Todo esto se examina en funcin de la existencia de parientes silvestres de ese cultivo en la zona donde se lo quiere introducir. Por ejemplo, en el caso de la soja o el maz, no existen parientes silvestres en la Argentina, pero s en Mxico (en el caso de maz) y en China (en el caso de la soja). En el caso de cultivos resistentes a insectos, la aparicin de insectos resistentes. Es conocida la plasticidad gentica de los insectos para desarrollar estrategias adaptativas que les permiten sobrevivir a insecticidas qumicos. De igual modo, es posible pensar que lo mismo ocurrir con las protenas de control biolgico utilizadas en los cultivos transgnicos tolerantes a plagas. Por este motivo, se han desarrollado procedimientos y estrategias para minimizar o prevenir el desarrollo de estas resistencias en las plagas blanco. Si bien no se han reportado casos de aparicin de insectos resistentes por el uso de la tecnologa de proteccin de insectos en plantas desde 1996, es importante desarrollar estrategias que apunten a conservar el recurso biolgico. Estos programas se conocen como de Manejo de Resistencia de Insectos o MRI (IRM en ingls: Insect Resistance Management) y se disean a medida de cada cultivo y plaga que se va a controlar, basandse en el conocimiento del modo de accin de esta protenas y la dinmica de las poblaciones de los insectos plaga. Es requisito presentar un plan de MRI, para que las agencias regulatorias evalen el impacto ambiental antes de la introduccin comercial de un cultivo GM protegido de insectos. Todos estos puntos son analizados, del mismo modo que la inocuidad alimentaria, caso por caso. Tambin se estima el cambio que podra provocar en el manejo agronmico, la introduccin de un dado cultivo GM .

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mtica han potenciado la identificacin y caracterizacin de genes (genmica) y el estudio de su funcin (genmica funcional). Otras tecnologas derivadas de las primeras y en constante evolucin, se ocupan del estudio del transcriptoma, el proteoma, el metaboloma, que abarcan todos los transcriptos, proteinas o metabolitos de una especie , respectivamente. Hoy se habla de las tecnologas micas en referencia global a este tipo de aproximacin. Paralelamente, estas tecnologas permi4. Nuevas tecnologas potencialmente ten el desarrollo de nuevos campos de la cienaplicables a la evaluacin de la cia, como la farmacogenmica, la toxicogebioseguridad nmica y la nutrigenmica, que son versiones micas de las especialidades tradicioLos avances en la tecnologa cientfica de nales que abordan el mismo problema. los ltimos aos han transformado profunEstas tecnologas hoy se encuentran en damente la forma en la que se hace ciencia y una etapa inicial de generacin de enormes se obtiene informacin de los sistemas bio- cantidades de datos; sin embargo, el potenlgicos. La enorme capacidad de secuen- cial que presentan a corto y mediano plazo ciacin en combinacin con la bioinfor- para el descubrimiento y la comprensin de procesos biolgicos, no tiene precedentes. En el campo del anlisis de riesgos, especialmente en los aspectos toxicolgico y nutricional, ser valioso contar con tecnologas que permitan determinar los perfiles bioqumicos de OGM y sus contrapartes convencionales (profiling), ya que ser posible de un vistazo, detectar cambios en los patrones de expresin gentica y en los proteicos o metablicos por efecto de la modificacin. El problema es que seguramente, al penetrar en niveles de resolucin tan altos, se encontrarn una serie de cambios que incluso son evidentes entre individuos del mismo grupo Figura 3: Diagrama para la estimacin de seguridad de OGM. Adaptado de (por ejemplo, individuos Cockburn , 2002 de la misma variedad no El objetivo de las evaluaciones de riesgo ambiental, es identificar impactos en el ambiente, cuantificarlos y proporcionar elementos para aquellos que deben manejar y minimizar estos riesgos, siempre en el contexto del balance riesgo-beneficio y de las tecnologas alternativas disponibles (por ejemplo, cultivos Bt evaluados en relacin con las aplicaciones tradicionales de insecticidas qumicos, y en el contexto del Manejo Integrado de Plagas, como una herramienta ms de control biolgico).

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GM), debido a la variabilidad natural. Esta variabilidad, hace muy difcil en estos momentos poder interpretar de manera clara muchos de los resultados que se obtienen, y su significacin biolgica real, para poder sacar conclusiones en cuanto a su relevancia en la bioseguridad. Sin embargo, en un futuro cercano, y a medida que se avanza en el conocimiento de los sistemas biolgicos, ser posible aplicar nuevas tecnologas a la evaluacin de la seguridad alimentaria, no slo de OGMs sino de cualquier alimento. Conclusin El objetivo del anlisis de riesgos para organismos y/o alimentos derivados del uso de la ingeniera gentica (GM) es estimar el impacto que los efectos intencionales y los no intencionales de la modificacin, pudieran tener sobre la inocuidad del alimento o del organismo GM, o sobre su impacto ambiental. El enfoque utilizado para aplicar este proceso (el enfoque comparativo) ha sido consensuado a partir de consultas y discusiones en el plano internacional, y se basa en la comparacin de parmetros como composicin, txicos naturales o aptitud nutricional, con la contraparte convencional que tiene historia de uso seguro y es aceptado como alimento inocuo (OECD, 2000). Lecturas sugeridas :
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IX.- Capitulo 2
Bioseguridad de Organismos Genticamente Modificados - Marcos Regulatorios
Dr Burachik, Moiss 1. Panorama Internacional Desde 1986, algunos pases como Japn, por ejemplo, se han ocupado de elaborar y desarrollar regulaciones para controlar la entrada en el mercado de productos derivados del uso de tcnicas de ADN recombinante. En ese momento el foco estaba puesto en los ingredientes o aditivos alimentarios producidos por microorganismos recombinantes, pero a medida que la tecnologa avanzaba y se aplicaba a otros organismos, estas reglamentaciones se vieron extendidas a plantas y animales modificados. Numerosos pases en los cinco continentes, tienen en este momento un marco regulatorio disponible para la evaluacin y aprobacin de OGMs antes de su entrada en el mercado. Entre los primeros pases que han desarrollado estos procesos, se encuentran los pases europeos, siendo la Comisin Europea, el rgano de evaluacin y control de la Unin Europea. En los Estados Unidos, diferentes agencias estn involucradas en estas evaluaciones: la Agencia de Alimentos y Drogas (FDA), la Agencia para la Proteccin del Medio Ambiente (EPA) y el Departamento de Agricultura (USDA). Canad y Australia-Nueva Zelanda, han establecido sus sistemas regulatorios ms recientemente (a partir de 1993). En cuanto a Amrica Latina, Argentina fue el pas pionero en esta materia, con la creacin de CONABIA en 1991, en el mbito de la Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentacin (ver ms adelante). Es importante notar que despus de los EEUU, Argentina es el pas con mayor grado de adopcin de cultivos agrobiotecnolgicos, seguido por Canad.

Otros pases de la regin han comenzado desde entonces a establecer sistemas para la evaluacin de la bioseguridad de OGMs. Colombia, Chile, Brasil, Uruguay, Paraguay, Bolivia, poseen comisiones tcnicas evaluadoras, y en algunos de estos pases ya se han aprobado la comercializacin y el cultivo de variedades GM. Estos sistemas estn siendo establecidos en muchos otros pases, especialmente apuntando a la implementacin del Protocolo de Bioseguridad, tambin conocido como Protocolo de Cartagena , vigente desde Septiembre de 2003. Este protocolo, firmado en el ao 2000 por ms de 130 estados, regular los movimientos transfronterizos de OGMs vivos o OVGMs , con el objeto de asegurar un nivel adecuado de bioseguridad en el comercio internacional y la conservacin de la biodiversidad . Para una actualizacin sobre marcos regulatorios en America Latina, ver el listado de sitios recomendados. 2. Cules son los riesgos? Uno de los problemas inherentes a la concepcin de un marco regulatorio para los ensayos de campo de plantas GM es el de la identificacin de los riesgos que deben considerarse. Esta identificacin depende de las opciones que se acepten de un conjunto de posibilidades y de los valores de los que optan, sean ellos cientficos, funcionarios, polticos, empresarios o pblico en general. Esto es, deben compatibilizarse criterios sobre lo que se consideran riesgos aceptables, en un marco de intereses muy variados. Por otra parte, si bien la identificacin de los riesgos se basar en conocimiento cientfico disponible ahora, existir siempre un componente de extrapolacin (si bien plausible) cuando se estimen efectos adversos potenciales, que es la materia misma y el objetivo del anlisis de riesgos. No obstante estas limitaciones, la evaluacin de efectos potenciales de una entidad y sus implicaciones, para verificar y estimar la posiblidad de ocurrencia de un efecto adverso y caracterizar la naturaleza de tal efecto es (definible como) una actividad cientfica (Natl. Acad. Sci., 1983). Con estas limitaciones en mente, lo que sigue es una lista acotada de caractersticas

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comnmente asociadas con los riesgos de los ensayos de campo de plantas GM, que son los que se han tenido en cuenta al fundamentar los requerimientos necesarios para evaluar su impacto en cada caso . I Prdida de Diversidad Biolgica: Aqu nos referimos a la prdida debida a la presin del mercado y de los costos sobre los productores, induciendo cambios en las prcticas agronmicas (menor uso de herbicidas e insecticidas) por la utilizacin (ventajosa) de OGMs, en desmedro de razas locales adaptadas (landraces) empleadas en la actualidad. Tambin podra producirse si se cultivan OGMs en la vecindad de centros de origen o de diversidad de sus parientes silvestres o de especies sexualmente compatibles, por fenmenos de introgresin gnica (este riesgo es relativamente ms importante en el hemisferio Sur). II Transferencia gentica a especies silvestres o malezas sexualmente compatibles, con el resultado de la formacin de hbridos viables con fenotipos no deseados (p.ej., tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos u otras plagas). (Ver Captulo 3, de esta parte). III Incremento de la presin de seleccin, tal que favorezca un aumento de la tolerancia de plagas a insumos defensivos actualmente empleados. En el caso de insumos que por razones ambientales, econmicas o de manejo agrcola, son apreciados por el productor y/o por la sociedad (p.ej., herbicidas postemergentes, productos biodegradables, insecticidas biolgicos, productos de menor costo, o sin restricciones relacionadas con la propiedad intelectual, etc.), el aumento de la tolerancia de la plaga al producto es un efecto desfavorable, ya que puede convertir a dicho insumo en intil en el futuro. IV Modificacin de las relaciones predador-plaga entre insectos, en detrimento de los insectos benficos. Aqu se incluyen los efectos sobre organismos no-blanco (caso de cultivos con incorporacin de genes de resistencia a insectos). El conocimiento

insuficiente sobre especies amenazadas de extincin (p.ej., insectos benficos, sus plantas-refugios, etc.), tambin es un factor a tener en cuenta. V Persistencia en estado funcional (transferible, integrable y expresable) del DNA residual en suelos u otros hbitats (p.ej., el intestino de mamferos), y de los posibles mecanismos de su eventual transferencia (p.ej. genes de resistencia a antibiticos hacia microorganismos patgenos humanos). Este riesgo se incluye en esta lista limitada, pero su ocurrencia se considera en general muy poco probable. VI Modificaciones en la relaciones ecolgicas con otros organismos en el largo plazo. VII Fenmenos no esperados de recombinacin (relacionados con promotores, enhancers, cpsides virales, etc) que cambien caractersticas epidemiolgicas, ecolgicas o rango de husped de patgenos. Este es tambin un fenmeno de ocurrencia muy poco probable. La existencia de una zona potencialmente recombinognica en el promotor 35S del virus del mosaico del coliflor, ampliamente utilizada en las construcciones insertadas en OGMs, no parece tener consecuencias biolgicas significativas. En cuanto a la resistencia a virus por sobre-expresin de la cpside viral (un mecanismo que ms probablemente se trate de silenciamiento gnico que de reencapsidacin del cido nucleico viral. Ver VIII4) es tambin muy poco probable que genere fenmenos de trans-capsidacin con cambios hipotticos en el rango de husped (cpside A tomada por un virus B, de modo que el rango de husped de B pasa a ser el de A). VIII Efectos del ingreso de protenas de inactivacin de antibiticos en la cadena alimentaria. Posible necesidad de cambiar los marcadores de seleccin utilizados en la obtencin de las plantas transgnicas. Este riesgo no ha sido probado, y por el contrario existen muchas pruebas (y barreras biolgicas) de que tiene una muy baja probabilidad de ocurrencia. Sin embargo se inclu-

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ye en esta lista por el impacto que tiene en la legislacin europea en este sentido. IX Posibles cambios en los flujos comerciales. En el rea del manejo de riesgos, es importante el manejo de las modificaciones esperables en la resistencia de las plagas, por parte de los productores, mediante un control post-liberacin. Este no es un riesgo, sino una condicin necesaria para el mantenimiento de la utilidad del OGM con determinadas caractersticas. Por ejemplo, la liberacin de plantas conteniendo genes de resistencia a insectos (genes Bt), debe estar acompaada con programas de manejo (establecimiento de refugios, control de plantas y cultivos vecinos) para prevenir que la presin selectiva del evento seleccione poblaciones de insectos resistentes que harn inefectiva la proteccin inicialmente lograda con la modificacin gentica. En realidad este fenmeno slo se puede retrasar, ya que toda presin de seleccin generar individuos tolerantes, en tiempos ms o menos cortos. 3. Fundamentos de las normativas Definiciones La elaboracin y evolucin de un marco regulatorio para la bioseguridad de una tecnologa novedosa como la biotecnologa aplicada al mejoramiento vegetal, no est exenta de dificultades. Por una parte est la responsabilidad de asegurar la aplicacin sustentable de la nueva tecnologa, y de preservar al hombre, la flora, la fauna y el ambiente de los potenciales efectos perjudiciales de las innovaciones, tanto en el presente como en el futuro. Por otra parte, hay razones para no obstaculizar el desarrollo de las innovaciones biotecnolgicas , que ya han demostrado poseer un gran potencial para brindar beneficios a la sociedad. Toda actividad humana (especialmente la innovacin tecnolgica) implica peligros (riesgos) y por lo tanto requiere la atencin (gestin) de su seguridad. La seguridad se obtiene definiendo, evaluando y gestionando los riesgos asociados con la innovacin.

Aplicando estos conceptos a la biotecnologa, que implica el uso de organismos vivos, podemos enfocar el anlisis de los riesgos de los ensayos hacia los siguientes aspectos generales:

Identificacin de los todos organismos involucrados (donantes, receptores, etc), Caractersticas de los organismos involucrados en la obtencin del OGM (familiaridad, patogenicidad, etc), Manera en que sern utilizados los OGMs (escala, contencin) Caractersticas de las zonas y de los otros organismos (lugares, medio receptor potencial, incluyendo seres humanos)
La normativa argentina ha tomado en consideracin estos aspectos, entre otros, para elaborar un marco regulatorio detallado para los Ensayos a Campo de Plantas Transgnicas, que se describe a continuacin en sus rasgos principales. Consideramos una definicin aceptable de bioseguridad, como la proteccin de la salud humana y del ambiente con respecto a los riesgos conocidos y/o percibidos de la tcnica o proyecto en cuestin, de acuerdo al estado actual de nuestros conocimientos. Est implcita en esta definicin que una regulacin para la bioseguridad, que significa una regulacin de los riesgos aceptables para la sociedad, conlleva una condicin de flexibilidad y de adaptacin permanentes. Para la normativa argentina, un OGM es:

un organismo (vegetal, animal, microorganismo o virus) en el cual se ha introducido informacin gentica precisa y definida en forma deliberada y dirigida a obtener un determinado fenotipo siendo aquella introduccin realizada de tal manera que dicha informacin gentica no podra haber sido adquirida por ese organismo por la va de mutaciones, recombinaciones u otras formas de transferencia gentica reconocidas como mecanismos que operan en la Naturaleza sin intervencin humana. 389

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Esta definicin hace referencia al mtodo de obtencin del OGM, con el propsito de establecer el campo de aplicacin de la norma, excluyendo, por ejemplo, los cruzamientos tradicionales. Sin embargo, en el anlisis del riesgo de la liberacin de un OGM, la caracterstica dominante, esto es, aquella que constituye el foco del anlisis de la Comisin, es el inserto, esto es, la porcin de DNA efectivamente presente en el genoma transformado, cuya naturaleza y consecuencias (geno- y fenotpicas) caracterizan al OGM como tal. Al OGM o conjunto de OGMs con un dado inserto se los denomina colectivamente evento. Varios OGMs pueden contener el mismo evento, y por lo tanto sus anlisis de riesgo sern equivalentes. Ocasionalmente, en etapas tempranas del desarrollo de un OGM, se admite que el evento puede no estar inequvocamente caracterizado, en el sentido de que no se ha definido el inserto con la debida precisin (por ejemplo, el inserto puede estar en diferentes posiciones en el genoma del vegetal). En estos casos, el anlisis se enfoca en la construccin gentica utilizada en la transformacin. Definimos como transformacin, el mtodo utilizado para introducir la nueva informacin gentica, vehiculizada por el vector. Si bien la normativa argentina atiende aspectos del proceso de obtencin de un OGM en el anlisis de riesgo, esa atencin slo se enfoca en aquellas caractersticas que interesan en la evaluacin del producto (y no del proceso de su obtencin), en el sentido de que esas caractersticas se encontrarn finalmente en el OGM obtenido. Otra caracterstica del marco regulatorio administrado por la CONABIA es que considera cada producto o liberacin caso por caso. Si bien los antecedentes (si los hubiera) se tienen en cuenta, y los casos similares son identificados y considerados como objetos de informacin vlida para la evaluacin, los datos no son transferibles, y cada caso y/o solicitante deben ser coherentes y autosuficientes en cuanto a la informacin que provee a la Comisin. La definicin de caso es entonces relevante. Un caso est definido por:

La empresa o ente solicitante. El evento de transformacin (es decir:


un inserto definido introducido en el genoma de la planta, admitindose un conjunto de eventos con un nico vector en las etapas muy preliminares del desarrollo del OGM). La escala de la liberacin. Cualquiera de estas condiciones que no se conserve (p.ej., el mismo evento presentado por dos empresas o entes diferentes) representar un caso diferente. La normativa puesta en prctica es proactiva, en el sentido de que requiere un anlisis previo de todas las previsibles consecuencias de una liberacin antes de que tal liberacin sea autorizada. 4. Marco Regulatorio en Argentina Argentina dispone desde 1991 de un marco regulatorio para el Anlisis y la Gestin de los Riesgos asociados con los Ensayos a Campo de Organismos Genticamente Modificados (OGMs). Esta normativa es administrada por la Comisin Nacional Asesora de Biotecnologa Agropecuaria (CONABIA), que opera en el mbito de la Secretara de Estado de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos (SAGPyA). Esta Comisin es multisectorial (la forman representantes de los sectores pblico y privado), multidisciplinaria, y es la encargada de emitir las recomendaciones con respecto a la autorizacin para los ensayos solicitados (experimentacin y/o liberaciones a campo). Estas recomendaciones son remitidas a la autoridad decisoria, que es el Secretario de la SAGPyA. En el presente trabajo se analiza esta normativa y se exponen algunas consideraciones sobre los factores que deben ser atendidos. La consideracin bsica que gua el funcionamiento y los dictmenes de la CONABIA es la Bioseguridad, y su caracterstica esencial es que funda sus procedimientos operativos en consideraciones exclusivamente tcnicas, fundadas en los conocimientos cientficos disponibles. Los principales criterios aplicados en la normativa argentina para decidir si una libe-

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racin puede autorizarse, pueden resumirse as: a) el criterio de bioseguridad: la definicin, evaluacin y gestin de los riesgos, es la consideracin primaria y su aplicacin es proactiva, esto es, debe realizarse antes de autorizarse la liberacin; los ensayos son evaluados caso por caso; el foco del inters est en el producto, pero aquellas caractersticas del procedimiento de su obtencin que terminan afectando o manifestndose en el producto final, son tambin analizadas b)el enfoque precautorio : el marco regulatorio acompaa el desarrollo del producto, y no se requiere la fundamentacin cientfica completa para detener dicho desarrollo; basta que se presente alguna de las siguientes situaciones: i) no existe suficiente informacin sobre el sistema, ii) los riesgos no son aceptables en base a presunciones razonables, iii) la evaluacin no sea concluyente, o iv) el sistema es demasiado complejo

CONABIA dictamina sobre la historia de bioseguridad de la planta transgnica, para informacin de las agencias especficas del Estado encargadas de aquellos pasos. Si bien el marco regulatorio inicial ha experimentado algunas modificaciones a lo largo de los aos (como respuesta a las necesidades de su adaptacin en un campo tecnolgico de rpido crecimiento), sus principios bsicos se han mantenido y han demostrado su eficacia, desde varios puntos de vista que se describen ms abajo. La versin que se presenta aqu resume las principales caractersticas de la normativa vigente en la actualidad. 5. El Ente Regulatorio Argentino: CONABIA

La CONABIA es una Comisin multisectorial, formada por miembros de los sectores pblico y privado. Su Coordinacin Tcnica est a cargo de tres profesionales que pertenecen al sector pblico (vase la Tabla). Dada las caractersticas de esta composicin, la operatoria de la Comisin hace especial La CONABIA no interviene en las etapas nfasis en mantener una elevada tica de ulteriores (aprobacin alimentaria, dictamen transparencia, evitando rigurosamente la sobre el impacto en las exportaciones y re- posible interferencia de conflictos de interegistro, para la comercializacin) del camino ses. Para ello, los miembros deben declarar de una planta GM hacia el mercado (Ver Fi- la existencia y naturaleza de sus intereses, gura 1). Sin embargo, emite un dictamen sean ellos comerciales o cientficos, y excluirparticular fundado sobre la bioseguridad de se totalmente de la discusin de solicitudes la produccin masiva a escala comercial del de liberacin de OGMs que provengan de las cultivo en cuestin. De este modo, la empresas o institutos a los que estn vinculados. Fase I La Comisin es profesioliberacin nalmente multidisciplinaria, experimental los criterios para la toma de CONABIA Informacin Solicitantes decisiones son exclusivamenrequerida te tcnicos y el principio bFase II sico que rige esas decisiones, SENASA liberacin (seguridad alimentaria) Aprobacin que se toman por consenso, extensiva o Rechazo /comercial es la bioseguridad. En los documentos que presentan a la CONABIA, los Secretario de Direccin de Mercados Dictmenes solicitantes de autorizaciones Agricultura Internacionales fundamentados de ensayos tienen la opcin de hacer reserva de informacin que consideren confidenEvaluacin del OGM a tres niveles cial. La informacin as considerada, ser examinada por FIGURA 1: el sistema de regulacin y aprobacin de OGMs en Argentina solamente uno de los miem-

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bros de la Comisin, quien deber emitir un juicio fundado sobre la bioseguridad de la propuesta y exponer esta opinin (aunque no la informacin reservada) ante la Comisin. A continuacin se resumen los ms importates logros luego de once aos de trabajo de CONABIA :

El anlisis de riesgo y autorizacin de unas 550 liberaciones de OGMs. El nmero de presentaciones muestra un pronunciado crecimiento hasta 1999, en que la gestin a cargo de la Secretara de Agricultura Ganadera Pesca y Alimentos desde esa fecha, y hasta 2001, demor la aprobacin de muchos ensayos. Procedimientos operativos giles, que mantienen la alta calidad de los anlisis de riesgos sin obstruir ni producir demoras innecesarias en el normal desarrollo y aplicacin de la tecnologa. Juicios positivos manifestados sobre su actuacin por varias autoridades representativas de los entes regulatorios de pases como el Reino Unido de Gran Bretaa, Estados Unidos de Norteamrica y Canad, entre otros. Organizacin y Co-organizacin de Reuniones Internacionales sobre Bioseguridad y Manejo de Riesgo, con la participacin de representantes de pases con amplia experiencia regulatoria. Misiones de asesoramiento institucional a pases limtrofes en la elaboracin de sus marcos regulatorios. Desarrollo de varias iniciativas de armonizacin regulatoria regional. Asesoramiento a los negociadores de la Cancillera y participacin institucional en las discusiones sobre la poltica nacional con relacin a la implementacin de la Convencin de Diversidad Biolgica sobre Bioseguridad para la Biotecnologa.
Esta operatoria de CONABIA permite asegurar, tanto para la sociedad como para los sectores empresariales, un balance correcto entre la proteccin de la salud, la preservacin de la calidad ambiental y la sustentabilidad de los proyectos aprobados, con la implementacin regulada, en tiempo y forma, de las innovaciones tecnolgicas

propuestas por los solicitantes. La CONABIA realiza las evaluaciones de todas las Solicitudes de liberaciones de OVGM al ambiente, y recomienda al Secretario de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos sobre la conveniencia o no de autorizar dichas liberaciones. Estas evaluaciones comprenden dos fases: 1) las evaluaciones de las liberaciones experimentales cuyo propsito es determinar que la probabilidad de efectos sobre el ambiente es no significativa primera fase de evaluacin-, y 2) las evaluaciones de las liberaciones extensivas cuyo propsito es determinar que dichas liberaciones del OVGM no generarn un impacto sobre el ambiente que difiera significativamente del que producira el organismo homlogo no GM segunda fase de evaluacin-. (Ver Figura 1) 6. Primera Fase de Evaluacin: Ensayos experimentales Los solicitantes deben presentar un legajo de informacin especfica, que consta de una Informacin General sobre la liberacin y sobre el OGM en cuestin y de un apartado sobre las Condiciones de Bioseguridad que se pondrn en prctica. El campo del anlisis de los riesgos abarcado por estas informaciones, que debe proveer el solicitante, es amplio, e incluye tanto las caractersticas de la liberacin como las del OGM. Con respecto a las caractersticas de la liberacin, la Informacin General sometida al anlisis incluir:

Si el material es importado: status regulatorio en el pas de origen. Propsito de la liberacin (objetivo, cronograma, protocolos, antecedentes). Si es a escala de invernadero o a campo Operaciones de transporte de OGM (ingreso al pas, transportes internos). Cantidad y tipo de material a liberar, antecedentes en otros pases. Lugar de la liberacin. Detalles operativos para auditar la liberacin (fechas, instituciones, personas). Con respecto a las caractersticas del OVGM, se analizar el genotipo del evento

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(es decir, las nuevas caractersticas genticas introducidas), para lo cual el solicitante debe proveer informacin con respecto a:

En ensayos a campo: distancias, tiempos de floracin, jaulas, cobertura para evitar la diseminacin del polen, por viento o insectos, control de vectores potenciales de polen u otro material con capacidad de propagacin, etc. En ensayos en laboratorio o invernadero: mtodos o estructuras de contencin contra el ingreso de vectores potenciales de material gentico. b) En los movimientos de materiales: semillas, material vegetal acompaante, as como los lugares, normas e identificacin del material que sea almacenado. c) En lo relacionado con el destino del material cosechado: el solicitante deber informar sobre su utilizacin, aclarando si ser local o si ser exportado o destrudo, e identificando los lugares de su almacenaje final o transitorio. d) En lo relacionado con la disposicin final (OGM y materiales remanentes): se requiere informacin sobre el tratamiento del suelo post-cosecha, el uso futuro del terreno, los controles posteriores (deteccin de plantas voluntarias) y su duracin. e) En el caso de un eventual escape del OGM y/o de cualquier material asociado: El solicitante debe exponer con claridad los procedimientos que seguir en el caso de un eventual escape del OGM y/o de cualquier material asociado. Normalmente, esto incluye mtodos de identificacin del OGM, procedimientos para limitar y controlar el escape, as como la obligacin de notificar perentoriamente a la autoridad regulatoria. f) Tcnicas que se usarn para detectar la transferencia de genes desde el OGM al ambiente bitico. g) Usos previstos del terreno con posterioridad a la liberacin solicitada. Control posterior de la parcela, duracin de los controles post-cosecha. Una vez completados los ensayos, es requisito indispensable para poder acceder a nuevas autorizaciones, la entrega de un Informe de Cierre de la Liberacin, que incluye observaciones relativas al comportamiento agronmico del OVGM en cuanto a germinacin, crecimiento vegetativo, floracin, susceptibilidad a enfermedades y plagas, as como efectos sobre organismos no

Descripcin de la biologa molecular del sistema donante-vector-receptor Mtodo de transformacin utilizado Genes principales (y sus organismos donantes). Genes auxiliares (marcadores de seleccin). Secuencias regulatorias (promotores, terminadores, enhancers, etc.). Otros elementos genticos introducidos. Productos de expresin, tejidos de la planta en los que se expresan, niveles de expresin. Homologas de secuencia con protenas txicas o alergnicas. Descripcin fenotpica del organismo receptor, centros de origen o diversidad gentica. Estabilidad fenotpica y nmero de generaciones en los que se verific.
En cuanto a la seccin sobre las Condiciones de Bioseguridad, la informacin solicitada depende de la escala de la liberacin: desde laboratorio/invernadero hasta pruebas a campo. En el caso de eventos que an no han obtenido la autorizacin de comercializacin en el pas, es decir, eventos regulados, que se siembran a gran escala para producciones de semilla en contraestacin para el hemisferio Norte, o con otros fines, existe un protocolo especfico que es necesario presentar para obtener la autorizacin. En todos los casos el solicitante debe proveer informacin relativa a varios aspectos bsicos de los Procedimientos de Bioseguridad, a saber: a) Durante la liberacin: Descripcin y ubicacin del lugar o instalacin donde se realizar la liberacin. Localizacin precisa (mapas detallados): distancia a caminos, lugares transitados, lmites del predio bajo control del solicitante. Caractersticas constructivas de bioseguridad (laboratorio o invernadero) y normas de acceso. Tamao y nmero de parcelas, su diseo, plano de siembra y superficie a sembrar. Medidas de aislamiento

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blanco y caractersticas de la cosecha, los tratamientos realizados y la disposicin final . Es importante notar que estas liberaciones son peridicamente inspeccionadas por agentes habilitados por la SAGPyA. La normativa completa, as como los requerimientos de informacin detallados en los formularios que deben completarse para obtener una autorizacin de liberacin, se encuentran a disposicin para la consulta a travs del sitio de CONABIA (ver en la lista de lecturas y sitios recomendados). 7. Segunda Fase de Evaluacin : el camino hacia el mercado Como ya se ha enfatizado antes, la incumbencia bsica de la CONABIA est limitaTabla I: COMPOSICION DE LA CONABIA
Representantes del Sector Pblico
Coordinacin Tcnica de la Comisin: Direccin de Agricultura (Secretara de Estado de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos)

La informacin suministrada por la CONABIA sobre el comportamiento del OGM en cuestin a lo largo de los ensayos autorizados que se han realizado.
Esta ltima informacin constituye una parte crucial del camino de la planta GM hacia el mercado, y es solicitada y analizada por la CONABIA. En la normativa argentina actual se la denomina Segunda Fase de Evaluacin. La condicin necesaria para dar una respuesta positiva a estas solicitudes en la prctica, es que la CONABIA considere que: No existen riesgos para la salud humana, para el agroeco-sistema, y para la flora y la fauna asociados, derivados del cultivo no confinado del OGM en consideracin. Esta categorizacin requiere del solicitante la presentacin de un breve Resumen (caractersticas del OGM; el evento, breve descripcin molecular del inserto; usos del OGM, destacando los que difieran del organismo no transformado; condiciones especiales, si las hubiera, para el cultivo extendido en gran escala) y de una Solicitud que se compone de:

REPRESENTANTES DEL SECTOR PRIVADO


Asociacin de Semilleros de Argentina

INASE: Instituto Nacional de Semillas SENASA: Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Secretara de Recursos Naturales y Desarrollo Sustentable

Foro Argentino de Biotecnologa Cmara de Productos de Sanidad Agropecuaria y Fertilizantes Cmara Argentina de Productos Veterinarios

Institutos Nacionales de Investigacin: De Investigaciones Agropecuarias De investigaciones Cientficas y Tcnicas Universidad de Buenos Aires
Sociedad Argentina de Ecologa

da a la gestin de los riesgos y la bioseguridad de los ensayos a campo de plantas GM a diferentes escalas. Los pasos siguientes hacia el mercado, es decir la aprobacin de su uso como materia prima alimentaria, la verificacin de que su liberacin comercial no afectar negativamente nuestro comercio internacional, el registro de la nueva variedad, y la autorizacin para la produccin comercial, son resorte de otras agencias del Estado (Ver Figura 1). Esas dependencias basan su decisin en dos clases de informacin: La informacin requerida a los solicitantes que es especfica a sus necesidades (la aptitud alimentaria, la estructura de nuestro mercado de exportacin).

A) Informacin General, que se refiere a la informacin anterior, pero de manera ms detallada. Deber incluir, entro otras informaciones, Caracterizacin del OVGM, incluyendo protenas y/o RNAs que expresa el OGM originados en el inserto y el fenotipo que resulta de esa expresin; las ventajas aportadas por la modificacin gentica; resultados de los ensayos de campo realizados, en el pas y en el extranjero, en lo que respecta a la bioseguridad . Una declaracin de equivalencia, diferencia o no equivalencia del OVGM. El solicitante declarar aqu si el OVGM es equivalente al organismo no GM de la misma especie, excepto por el fenotipo aportado por la modificacin gentica introducida. La declaracin se referir a todas aquellas caractersticas del OVGM que no fue intencin modificar en el evento. Se deben citar los trabajos que sostienen esta declaracin. La equi-

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valencia se referir al menos a: a) composicin centesimal, procesamiento, productos y subproductos y b) caractersticas y prcticas agronmicas, reas geogrficas, tipos de ambientes, precauciones especficas para el cultivo extensivo, si las hubiera, con relacin a efectos ambientales. Asimismo, se declararn aqu las observaciones sobre cualquier diferencia no intencional o no esperada, observada en cualquier aspecto de la expresin fenotpica del OVGM en comparacin con el organismo no GM de la misma especie. Se deber incluir toda observacin que haya surgido en el monitoreo post- comercializacin de este evento (si ste ha sido liberado comercialmente en otros pases), como as tambin las que resultaran de investigaciones realizadas con posterioridad a dichas liberaciones comerciales. En caso que corresponda, el solicitante declarar aqu si el tipo de modificacin gentica tiene el propsito de introducir diferencias que determinan que el OVGM no pueda considerarse sustancialmente equivalente al no OVGM, explicando sucintamente aquellas diferencias. (Ver tambin Captulo1). Una historia de experimentaciones y ensayos previos, instrucciones sobre manejo (agronmico y del producto) y almacenaje (producto, subproductos y remanentes) si difieren del organismo no transgnico. Propuestas para el envasado, rotulado y procesamiento, si difieren del organismo no transgnico y medidas que deben tomarse en caso de liberacin accidental o mal empleo. B. Caracterizacin general del OVGM : esta informacin se concentra en la metodologa y la construccin utilizada en la obtencin del OGM y en la caracterizacin exhaustiva del mismo a nivel molecular y fenotpico. Se debe proporcionar informacin sobre:

La especie receptora (caractersticas fenotpicas, centros de origen y diversidad, distribucin geogrfica en Argentina, estabilidad gentica, potencial de transferencia y/ o intercambio de genes con otros organismos, reproduccin, supervivencia, diseminacin, interacciones con otros organismos, caractersticas patognicas, txicas, antinutricionales, alergnicas u otras, e his-

toria de modificaciones genticas previas). La modificacin gentica : mtodo de transformacin empleado, descripcin detallada del vector (cada elemento gentico componente, su origen, tamao y funcin; mapa del vector; secuencias nucleotdicas o regiones de la construccin cuyos productos o funciones no sean conocidas; capacidad para transferir genes, o para ser movilizados por conjugacin, recombinacin o integracin; regiones del vector que se incorporan al OGM, es decir que constituyen el inserto). Caracterizacin del inserto: anlisis molecular de la insercin en el genoma del OVGM (nmero de sitios de integracin, nmero de copias de cada gen, incorporacin de porciones de genes), origen y funcin de cada elemento insertado en el OVGM, informacin sobre si el inserto (esto es, alguno de sus elementos) confiere alguna funcin no requerida para la expresin del fenotipo esperado en el OVGM, transposiciones y/o rearreglos dentro del inserto presente en la planta (con respecto a las posiciones que los elementos genticos tenan en el vector) y/ o de/con porciones del genoma de la planta dentro del inserto y en sus regiones flanqueantes; informacin detallada de las secuencias del genoma vegetal que flanquean del inserto y sobre la presencia/ausencia de fragmentos del inserto en regiones del genoma vegetal fuera del inserto funcional. Los organismos donantes: caractersticas patognicas (con relacin a las resultantes de la expresin de los elementos presentes en la construccin utilizada en la transformacin). Caractersticas perjudiciales para la salud humana o animal (con la observacin del punto anterior), potencial y/o antecedentes de transferencia natural (esto es, en hbitats y condiciones naturales) de los elementos que constituyen la construccin, desde los organismos donantes a otros organismos, su probabilidad o frecuencia, y fenotipos posibles u observados de los organismos receptores. Caracterizacin del OVGM propiamente dicho: caractersticas fenotpicas incorporadas, si alguna caracterstica fenotpica del organismo receptor no GM no se expresa en el OVGM. Estabilidad gentica, segregacin y transferencia a la progenie. Anlisis molecular (Southern blot, PCR). Caractersticas de la expresin del nuevo material

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gentico. Productos expresados (debe incluir todos los elementos genticos que se incorporan al OVGM, total o parcialmente), caractersticas de la expresin (p.ej., constitutiva, tejido-especfica), tejidos del OVGM en que se expresan los genes introducidos y niveles de expresin y su evolucin temporal, en relacin con el ciclo de la planta. Actividad biolgica de las secuencias expresadas, ARNs transcriptos no traducidos, sus niveles, funcin y caracterizacin. Anlisis detallado de las posibilidades de transcripcin, por ejemplo, que comience dentro del inserto y se extienda hacia el genoma de la planta ignorando seales de terminacin, as como de transcripcin y traduccin de protenas de fusin o de marcos de lectura nuevos, generados como consecuencia de la insercin. Tambin, se deben detallar las tcnicas de deteccin del OVGM en el ambiente: Mtodos moleculares y Mtodos biolgicos: Efectos sobre la salud humana: posibles efectos txicos o alergnicos del OVGM, sus materiales derivados, sus productos metablicos, los productos resultantes del procesamiento industrial habitual (incluyendo pero no limitado a alimentos), o los resultantes de interacciones de estos productos con otros componentes normales de la dieta humana. Efecto de la modificacin gentica sobre aquellas caractersticas del organismo no GM que constituyan un peligro o riesgo para la salud (incluyendo, pero no limitados a, los niveles de antinutrientes). Interacciones del OVGM con el ambiente: supervivencia en el ambiente, tasa de germinacin y dormicin, vigor vegetativo (calidad agronmica, susceptibilidad a patgenos, a insectos, a factores de estrs ambiental), ventajas adaptativas presentes o potenciales del OVGM frente al organismo no GM, en hbitats y condiciones naturales, y en condiciones de agroecosistemas para la misma especie y para otros cultivos geogrficamente compatibles. Los modos y tasas de multiplicacin y las formas naturales de propagacin. Informacin cuantitativa sobre interacciones: susceptibilidad a patgenos, plagas e insectos y rendimiento. Impacto ambiental del OVGM en el agroecosistema: efectos del OVGM sobre la flora, fauna y poblacin microbiana, con nfasis en las especies benficas. Efectos deri-

vados de cambios en las prcticas agronmicas (si los hubiera). Conceptos para el manejo de los efectos mencionados en los puntos anteriores y condiciones especficas para el manejo de efectos ambientales debidos al OVGM. Estudios realizados sobre el escape de genes va polen. C. Comportamiento esperado en la produccin del OVGM a escala comercial: esta informacin se refiere especficamente al impacto ambiental, a informacin general sobre la inocuidad del OVGM o sus derivados alimentarios y a su perfil composicional.

Impacto Ambiental: efectos sobre la flora y fauna, manejo de efectos no deseados potenciales (p.ej., desarrollo de resistencia a Bt en insectos previamente sensibles), programa de investigaciones de seguimiento propuesto, para monitorear posibles efectos sobre el ambiente en el largo plazo. Efectos sobre la salud humana: conceptos y programa de investigaciones que se realizaron para la evaluacin de la inocuidad de las nuevas protenas expresadas en el OVGM; evaluacin de la toxicidad, digestin en jugo gstrico simulado, a diferentes pH: velocidad, caracterizacin de los fragmentos originados y su actividad biolgica. Toxicidad aguda de las nuevas protenas en animales de laboratorio; determinacin del nivel de efecto adverso no observable (sigla del ingls NOAEL), si es posible. Clculo de la ingesta diaria aceptable (IDA), y su comparacin con la ingesta habitual para humanos en dietas normales. Evaluacin del potencial alergnico, homologas de las secuencias de aminocidos de las nuevas protenas con otras protenas relevantes (toxinas, alrgenos, etc.). Composicin centesimal del OVGM, y comparacin con el correspondiente organismo no GM, en todos los tejidos de la planta; protenas y composicin en aminocidos, lpidos y composicin de cidos grasos, carbohidratos y otros componentes (cenizas, fibra, materia seca, vitaminas, etc.). Como se presenta en el esquema correspondiente, la evaluacin completa y detallada de la inocuidad y aptitud alimentaria de los OVGMs es llevada a cabo por otra Comisin Evaluadora, que funciona en la rbita del SENASA (Servicio Nacional de Calidad y

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Sanidad Agroalimentaria). Las caractersticas de esta etapa de evaluacin son similares a las que lleva adelante CONABIA, y basa sus conclusiones en toda la informacin presentada a CONABIA, ms otra serie de datos, evidencias experimentales y estudios que deben ser presentados especficamente en relacin con los aspectos nutricionales y/o toxicolgicos del OVGM en cuestin, de acuerdo a los requisitos de la resolucin oficial. En ambas instancias de evaluacin de bioseguridad se aplica el enfoque comparativo desarrollado en el Captulo 1 y la conclusin a la que como mnimo, debe arribarse

para poder recomendar la autorizacin comercial, es: El OGM es tan seguro como su contraparte no modificada, para el medio ambiente y la salud humana o animal. 8. Eventos con aprobacin para su produccin o consumo en pases Latinoamericanos De acuerdo con el ultimo informe de ISAAA ( International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications, 2003), hay seis pases en la regin que han aprobado cultivos transgnicos para su pro-

Tabla 2. Pases de Amrica Latina que han aprobado cultivos GM

Pas
Argentina

Maz

Soja

Algodn
-Algodn resistente a lepidpteros -Algodn tolerante al herbicida glifosato

Otros

-Maz resistente a -Soja tolerante al lepidpteros (evento Bt herbicida glifosato 176) -Maz tolerante al herbicida glufosinato de amonio -Maz resistente a lepidpteros (evento MON 810) -Maz resistente a lepidpteros (evento Bt 11) -Maz tolerante a glifosato (evento Nk603) -Soja tolerante al herbicida glifosato

Brasil* Colombia

-Algodn resistente a lepidpteros -Algodn tolerante al herbicida glifosato

Clavel azul

Honduras Mxico**

-Maz resistente a lepidpteros -Maz resistente a lepidpteros -Maz resistente a coleptero -Maz tolerante a herbicidas -Soja tolerante al herbicida glifosato Papa resistente a escarabajo de la papa y virus Y -Algodn tolerante (New leaf Y) al herbicida glifosato Tomate de maduracin retrasada. (TH) Canola tolerante -Algodn RLxTH (evento combinado) a herbicidas -Algodn resistente a lepidpteros (RL)

Uruguay

-Maz resistente a -Soja tolerante al lepidpteros (MON 810) herbicida glifosato

*Siembra permitida durante la campaa 2003-2004 ** maces aprobados para importacin en alimentos. Soja y algodn, siembras pre-comerciales.

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duccin o para su importacin como alimentos. Lecturas /sitios recomendados


BURACHIK, M. y TRAYNOR, P. 2002. Anlisis of a Nacional Biosafety System: Regulatory Policies and Procedures in Argentina. ISNAR Country report 63. www.isnar.cgiar.org McLEAN, M.A.; MACKENZIE, D.J. and COLE, BA, 2001. Policy Choices in the Development of National Frameworks for Biosafety Regulation. Report for the International Service for National Agricultural Research (ISNAR), The Hague. www.sagpya.gov.ar (ir a Biotecnologa , Conabia y SENASA): resolucin 39/2003. www.senasa.gov.ar : resolucin 412/2002 www.agbios.com: sitio canadiense con informacin detallada sobre cultivos GM y seguridad www.ctnbio.gov.br: sitio de la Comisin de Bioseguridad de Brasil

www.oecd.org: Organizacin para el Desarrollo y la Cooperacin Econmica www.fda.gov: Agencia de Drogas y Alimentos de los EEUU www.fao.org: Agencia para la Agricultura y la Alimentacin de la Naciones Unidas www.redbio.org: ir a Marco Regulatorio, para informacin sobre bioseguridad en America Latina y el Caribe http://www.unep.ch/biosafety/: Programa ambiental de las Naciones Unidas . Informacin sobre el Protocolo de Bioseguridad y marcos regulatorios internacionales www.cibiogem.gob.mx: sitio de la Comisin evaluadora de bioseguridad de OGMs del gobierno de Mxico. www.ica.gov.co: sitio del Instituto Colombiano Agropecuario www.anbio.org.br: Asociacin Brasilera de Bioseguridad www.usbiotechreg.nbii.gov: sitio con informacin regultoria unificada de los EEUU

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IX.-Captulo 3
Flujo gnico mediado por polen y su posible impacto ambiental
Poverene, Mnica; Ureta, Soledad El flujo de genes es un proceso biolgico natural. Puede ocurrir flujo mediado por polen entre plantas de la misma especie o de especies relacionadas y depende del modo de polinizacin y la compatibilidad gentica entre la planta receptora y la dadora de polen. Tambin puede ocurrir flujo gnico por movimiento de semillas o de otras partes vegetales hacia poblaciones sexualmente compatibles. Los agricultores pueden adoptar prcticas de manejo para minimizar y controlar este flujo. 1. Flujo gnico y riesgo de escape de transgenes al ambiente El flujo gnico es el proceso de incorporacin de genes de una poblacin dentro de otra. En plantas, donde el concepto de especie es frecuentemente puesto a prueba, el intercambio de material gentico ocurre entre individuos formalmente considerados una especie o entre especies relacionadas. El flujo gnico tiene lugar a travs de la migracin de polen o semillas, dispersados por viento, agua o la accin de animales y el hombre. En el contexto de la agricultura, el intercambio de genes entre plantas y poblaciones es un proceso bien conocido en todos los cultivos mejorados por tcnicas tradicionales o mediante ADN recombinante y en las plantas silvestres relacionadas con ellos. El flujo gnico es un poderoso mecanismo para prevenir la diversificacin de las poblaciones, pero tambin para permitir la difusin de mutaciones favorables (Rieseberg y Burke, 2001). La utilizacin de cultivos transgnicos plantea la posibilidad de que el flujo de transgenes hacia otras poblaciones (escape al ambiente) represente un riesgo para los ecosistemas, dependiendo de las caractersticas que aporten y sus efectos sobre la poblacin receptora. Se denomina escape a la

diseminacin no intencional de la construccin gentica de un OGM (plantas, microorganismos o animales) hacia otras poblaciones, mediante mecanismos biolgicos naturales como la reproduccin sexual o la transferencia horizontal. La reproduccin sexual implica la unin de gametos femeninos y masculinos, uno de los cuales debera ser portador del transgen. La transferencia gnica horizontal o lateral consiste en el intercambio de material gentico entre especies no relacionadas e involucra fenmenos diferentes. Estos procesos son bien conocidos en microorganismos, mediados por diferentes sistemas moleculares de insercin (Kurland y col., 2003). En el caso de las plantas, el escape gnico a travs del polen es el mecanismo ms probable y de all que la atencin se enfocar sobre este aspecto. El flujo de genes desde cultivos GM hacia cultivos no transgnicos, la aparicin de nuevas malezas difciles de erradicar y la reduccin de la biodiversidad son las inquietudes ms frecuentemente invocadas del escape de transgenes. Excepto el primero, no se han informado casos concretos donde las otras dos situaciones se hayan observado. La literatura sobre los riesgos del escape es especulativa y los estudios cientficamente documentados hasta el momento confirman la imposibilidad de extraer conclusiones generales y la necesidad de efectuar pruebas para cada caso particular (Carpenter y col., 2002; Conner y col, 2003), tal como lo recomiendan las principales agencias regulatorias del mundo. Estas exigen ensayos experimentales con todos los eventos en desarrollo y generalmente, la informacin obtenida a partir de los mismos as como las conclusiones de los comits evaluadores se pueden consultar en Internet (ver lista de sitios recomendados). Las construcciones genticas en las variedades GM son caracterizadas a nivel molecular y en cuanto a sus efectos fenotpicos antes de su liberacin (ver captulos 1 y 2 de esta Seccin). El nmero de insertos y de copias es conocido y la transmisin de los caracteres introducidos se estudia para evaluar su comportamiento y estabilidad. En algunos casos de transgnesis la transmisin puede ser variable. El cultivar de zapallo Freedom II posee tres insertos

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de un transgen que confiere resistencia a virus y su descendencia puede heredar una, dos o las tres copias del gen (Spencer y Snow, 2001). Normalmente, el carcter conferido se expresa como dominante y aun cuando no se conozca exactamente el nmero de copias de un transgen en un genoma, la probabilidad de transmisin a travs del polen mediante el proceso normal de meiosis, es de al menos 50%. En especies algamas o parcialmente algamas, la difusin del transgen hacia variedades no transgnicas de la misma especie depender exclusivamente de los mecanismos de polinizacin, generalmente por el viento (anemfila) o los insectos (entomfila). En la mayor parte de los cultivos se conocen las distancias mnimas de aislamiento necesarias para prevenir la polinizacin cruzada entre variedades. Estas constituyen la base para determinar las medidas de bioseguridad que se exigirn en cada caso durante la fase de liberacin experimental. Una vez aprobado el cultivo para su siembra a escala comercial, esas distancias no son necesariamente aplicadas en la prctica agronmica. La cuestin queda en manos de los agricultores y depende de los intereses econmicos que para ellos represente la comercializacin de un cultivo transgnico, tradicional u orgnico. Un ejemplo de conflicto se dio en 1998 en Canad, donde se registraron denuncias de contaminacin de lotes de colza tradicional con polen de colza GM, posiblemente provenientes de lotes cercanos o de plantas subespontneas, escapadas de los cultivos (http://news.bbc.co.uk/ go/pr/fr/-/2/hi/science/nature/ 3116713.stm). En lugares donde se ha autorizado la siembra de cultivos transgnicos, stos pueden coexistir con cultivos tradicionales u orgnicos, lo que requiere medidas adecuadas durante el cultivo, cosecha, transporte y almacenamiento, a fin de evitar la mezcla accidental de materiales GM y no GM, que puede tener consecuencias econmicas para productores que comercialicen productos no transgnicos. Las recomendaciones tendientes a evitarla consisten en: 1. Medidas a tomar dentro del establecimiento, como respetar las distancias de aislamiento, colocar barreras a la dispersin del polen, o intercalar lotes con cultivo de una

especie distinta. 2. Cooperacin entre establecimientos vecinos sobre planes de siembra, o uso de variedades con tiempo de floracin diferente. 3. Utilizar los servicios de extensin para informar a los productores, monitoreo, intercambio de informacin tcnica y servicios de alarma. La modificacin gentica en plantas ha sido exitosa en ms de 20 familias botnicas diferentes, comprendiendo cereales, oleaginosas, forrajeras, especies hortcolas, frutales, forestales y ornamentales (www.agbios.com). La mayor parte de las especies domesticadas como cultivos posee parientes silvestres, los que frecuentemente se utilizan como donantes de caracteres tiles para el mejoramiento gentico, tales como resistencia a estreses biticos y abiticos. Esto implica que entre la especie domesticada y la silvestre existe suficiente relacin gentica como para transferir esos caracteres mediante cruzamientos y seleccin. Los cruzamientos ocurren naturalmente en regiones donde las especies conviven y muchas malezas han evolucionado a travs de la adquisicin de genes de los cultivos (Keeler, 1989; Ellstrand y col., 1999). Es posible que un transgen sea transferido de un cultivo GM hacia poblaciones silvestres o malezas relacionadas. Los transgenes que confieren tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos o a patgenos podran conferir las mismas caractersticas a plantas silvestres relacionadas en la vecindad, determinando una mayor supervivencia bajo la presin de seleccin natural (insectos herbvoros o patgenos) o de prcticas agronmicas usuales para el control de malezas, plagas o enfermedades (uso de pesticidas, agentes de control biolgico). En consecuencia, aumentara el nmero o tamao de las poblaciones silvestres. El concepto de supermaleza ha surgido como consecuencia de reconocer la dificultad que implicara el control de esas poblaciones. El potencial impacto ambiental depende tanto de la probabilidad de transferencia del transgen a la poblacin silvestre como de la consecuencia de esa transferencia (Ahl Goy y Duesing, 1996). Segn la probabilidad de transferencia, los cultivos pueden clasificarse en tres grupos: I. Mnima probabilidad de transferencia a especies silvestres, sea porque stas no exis-

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ten en el rea o no hay compatibilidad sexual entre el cultivo y su pariente silvestre. II. Cultivos con baja probabilidad de transferencia, cuando la compatibilidad sexual es limitada. III. Cultivos con alta probabilidad de transferencia, cuando especies silvestres sexualmente compatibles crecen en la vecindad del rea sembrada. Las consecuencias de la transferencia dependen de la capacidad potencial del transgen para aumentar la aptitud biolgica y conferir ventajas selectivas a la especie silvestre receptora. De acuerdo con este criterio, tambin se pueden agrupar los genes en diferentes clases. En la clase I se sitan los transgenes que confieren pequea o ninguna ventaja adaptativa, como los marcadores de seleccin, genes de androesterilidad o de madurez retrasada. La clase II, de escasa ventaja adaptativa, comprende genes que pueden conferir alguna ventaja bajo la adecuada presin de seleccin, como los de tolerancia a herbicidas o de resistencia a insectos y enfermedades. En la clase III se sitan genes para mejorar el crecimiento y la supervivencia, que conferiran ventajas adaptativas en cualquier ambiente. La Tabla I presenta una clasificacin de los cultivos GM autorizados o bajo ensayo en la Argentina, segn esos criterios. La reduccin de la biodiversidad por causa del uso de cultivos GM es probablemente la consecuencia ms difcil de visualizar. La erosin o prdida de variabilidad gentica atribuida al monocultivo o al uso de unas pocas variedades que dominen el mercado de semillas, no es privativa de los cultivos GM y puede prevenirse mediante una adecuada planificacin de la agricultura regional. Por otra parte, algunas especies crecen en ambientes especializados o geogrficamente limitados como raras especies silvestres o razas locales domesticadas (landraces) constituyendo reservorios de diversidad gentica de potencial uso en el mejoramiento gentico. Cuando crecen en la vecindad de cultivos a gran escala, existe la posibilidad de cruzamientos naturales y flujo gnico a travs del polen del cultivo hacia la especie local. Esto puede resultar en una prdida de vigor y fertilidad en los descendientes depresin por alogamia o de identidad gentica por sucesivos ciclos de cruza-

miento con el cultivo, de manera que paulatinamente la especie local se va perdiendo hasta la completa extincin. El proceso es dependiente de la frecuencia de cruzamiento, la cual a su vez depende de la cantidad relativa de individuos de cada especie. Nuevamente, el proceso puede evitarse mediante adecuadas medidas de conservacin y manejo del cultivo. Se puede concluir que la posibilidad de escape de transgenes es de orden diferente segn la poblacin recipiente. Una variedad no GM de la misma especie ciertamente adquirir el transgen si es expuesta al flujo de polen del cultivo GM. Una rara variedad local domesticada perder asimismo identidad por contacto gentico con el cultivo. En Mxico se ha informado la deteccin de razas nativas de maz portadoras de transgenes provenientes de variedades GM, cuyo cultivo est vedado (Quist y Chapela, 2001), lo que ha generado controversias y estudios cientficos adicionales. Algunos autores hacen notar que las prcticas de cultivo de los pequeos productores de maces criollos en Mxico tambin contribuyen al flujo gnico entre hbridos, variedades mejoradas, GM y los maces criollos, como parte de sus hbitos de seleccin y ensayo (Christou, 2002; MartnezSoriano y col., 2002; CIMMYT 2003). Cuando no existen barreras biolgicas al flujo gnico, el escape depende exclusivamente de factores antrpicos y puede ser prevenido mediante un manejo cuidadoso. La situacin no es tan simple si se trata de una poblacin silvestre emparentada, ya que depender de las relaciones genticas con el cultivo, que determinan la probabilidad de hibridacin. Se requerir de una evaluacin de la probabilidad de escape y del impacto que el transgen podra ocasionar en la poblacin silvestre. 2. Factores que determinan el escape de transgenes y su impacto ambiental La mayor parte de los cultivos actuales est emparentada con una o ms especies silvestres o malezas, con las que puede hibridar y producir descendientes total o parcialmente frtiles. Trigo, arroz, avena, sorgo, cebada, maz, soja, girasol, colza, man, po-

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roto, caa de azcar, remolacha azucarera, algodn, papa, zapallo, frutilla, rbano, zanahoria, vid, trboles y otras especies cultivadas son objeto de experimentacin biotecnolgica. El flujo gnico a travs del polen permite la transmisin de caracteres heredables a parientes silvestres. Si esos caracteres son beneficiosos para la supervivencia o la fertilidad, aumentarn la aptitud biolgica de las poblaciones recipientes. El intercambio gentico de los cultivos con sus parientes silvestres es uno de los mecanismos de origen de las malezas (Keeler, 1989; Ellstrand y col., 1999). Aproximadamente la mitad de los caracteres que determinan invasividad estn controlados por genes nicos, de modo que existe la posibilidad de que transgenes relacionados con la aptitud biolgica persistan y modifiquen poblaciones silvestres. Podra resultar que stas se vuelvan ms abundantes en su hbitat o invadan nuevos hbitat. Tambin podran tener efectos adicionales sobre poblaciones de insectos o patgenos. La evaluacin del riesgo de escape de transgenes comprende tres etapas: 1. Investigacin de barreras genticas o geogrficas para el escape del transgen desde el cultivo hacia las poblaciones silvestres. 2. Investigacin del efecto del transgen sobre la aptitud biolgica de las plantas silvestres. 3. Investigacin de las consecuencias ecolgicas de la difusin del transgen en la poblacin silvestre. Hasta el momento existe escasa informacin sobre situaciones reales y no sera posible generalizar las conclusiones, ya que stas dependen del evento de transformacin, la poblacin recipiente y las condiciones ambientales donde tiene lugar el escape. A continuacin se expondrn algunos factores a tener en cuenta en ese esquema. 3. Barreras geogrficas y genticas entre el cultivo y especies silvestres Las especies silvestres suelen difundirse desde su centro natural de origen, pero no siempre estn presentes en la misma rea geogrfica del cultivo. Por ejemplo, la soja (Glycine max) y su pariente silvestre G. soja conviven naturalmente en China y

Corea, donde producen un hbrido interfrtil, G. gracile, pero no en el resto del mundo. El maz (Zea mays) hibrida con el teosinte (Z. m . ssp. mexicana , Z. diploperennis , Z. luxurians) presente en Mxico, aunque existe evidencia que muestra que el flujo gnico entre hbridos de maz y teosinte va en la direccin teosinte-hbrido y no en la direccin opuesta (Evans y Kermicle, 2001). En la Argentina, estas especies no conviven con parientes silvestres, mientras que colza, arroz y girasol s lo hacen y pueden cruzarse con ellos. El primer paso consiste en el estudio sistemtico de la flora local. An cuando se encontraran especies silvestres emparentadas, la hibridacin con la especie cultivada depender de la afinidad gentica que tengan entre ellas, la cual determina desde completa fertilidad de los hbridos hasta grados variables de esterilidad y an la imposibilidad de cruzamiento. Para que la cruza tenga lugar, ambos taxa deben florecer al mismo tiempo y el polen debe ser capaz de germinar y efectuar la fecundacin. La descendencia suele tener una fertilidad menor que las especies parentales, pero raramente es por completo estril. La fertilidad parcial de los hbridos permite la introgresin, la incorporacin estable de genes de una especie en otra mediante sucesivas retrocruzas de sus descendientes con una o ambas especies parentales. Caracteres morfolgicos y fenolgicos intermedios entre la especie cultivada y la silvestre constituyen un buen diagnstico de hibridacin e introgresin, pero el estudio de marcadores moleculares resulta invalorable. Este ha demostrado que la mayor parte de los cultivos hibrida con sus parientes silvestres y que los alelos de las especies domesticadas persisten durante generaciones en las poblaciones silvestres, an cuando no se adviertan cambios morfolgicos. Este es el caso del girasol con sus parientes silvestres Helianthus annuus ssp. annuus y H. petiolaris en Norteamrica (Whitton y col., 1997, Riesberg y col., 1999, Snow y col., 2000). En la Argentina, donde ambas especies silvestres se han naturalizado, hemos encontrado numerosas evidencias de hibridacin e introgresin con el cultivo en la regin central del pas, tanto por caracteres morfolgicos y fenolgicos como por mar-

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cadores moleculares, constatando adems la fertilidad parcial de los hbridos mediante estudios del polen y de la produccin de semillas (datos propios no publicados). En girasol se ha estudiado la transmisin a plantas silvestres de un transgen Bt (ver Parte VIII) para resistencia a lepidpteros (Show y col., 2003) y uno de oxalato oxidasa, OxOx que confiere resistencia al hongo Sclerotinia (Burke y Rieseberg, 2003). En zapallo GM (Cucurbita pepo) se estudi la transferencia de la resistencia a dos virus, ZYMV y WMV2 (Spencer y Snow, 2001). El flujo gnico a travs del polen es una poderosa fuerza evolutiva y el impacto sobre las poblaciones silvestres depende de su magnitud, as como del efecto de los alelos transmitidos sobre la poblacin recipiente. La magnitud del flujo mediado por polen puede medirse a travs de la frecuencia de marcadores moleculares caractersticos del cultivo presentes en una poblacin silvestre o sus descendientes. Estos han demostrado que la ubicacin de un gen en el genoma tiene una importancia crucial para su difusin mediante hibridacin. En colza, un aloploide (AACC), la introgresin de tolerancia a herbicidas y androesterilidad hacia la especie diploide Brassica rapa (AA) sera menos probable si los transgenes que codifican esos rasgos estuvieran en el genoma C, porque implicara una recombinacin intergenmica. (Jorgensen et al. 1996). En girasol (Helianthus annuus) donde ha ocurrido una extensa remodelacin cromosmica mediante inversiones y translocaciones, la transferencia de un transgen hacia la especie silvestre H. petiolaris es improbable si este no est situado en las porciones colineares entre ambos genomas (Rieseberg y col., 1999). La cuantificacin de la tasa de hibridacin e introgresin entre el cultivo y la especie silvestre mediante experimentos adecuados es previa a la investigacin de las consecuencias gnicas y ecolgicas del escape del transgen, ya que si la tasa de hibridacin fuera despreciable, no cabra preocuparse por las consecuencias. 4. Efecto del transgen sobre la aptitud biolgica de las plantas silvestres Una vez comprobada la posibilidad de hibridacin y la presencia de un transgen en plantas silvestres, surge la pregunta: se es-

pera que el transgen incremente su frecuencia en las poblaciones silvestres? El destino de un alelo en una poblacin depender de su efecto sobre la aptitud biolgica de los individuos que lo adquieren. Si no tiene efecto alguno en ese ambiente ecolgico, se trata de un alelo neutro y su destino depender del azar, o sea que su frecuencia en la poblacin estar sujeta a la deriva gnica y persistir o eventualmente se perder. Si su efecto es deletreo conducir a una depresin alogmica, con disminucin de la viabilidad y fertilidad de los hbridos. El efecto nuevamente depender de la magnitud del flujo gnico y cuanto mayor sea, mayor ser el riesgo de extincin de la poblacin silvestre. Si el alelo es beneficioso, el flujo gnico acelerar su diseminacin en la poblacin silvestre y la frecuencia allica aumentar rpidamente, en forma proporcional al movimiento de polen desde el cultivo a la poblacin silvestre (Ellstrand y col., 1999). La diseminacin de un transgen en la poblacin silvestre requiere que los hbridos cultivo/silvestre se reproduzcan en condiciones naturales. Estudios previos de hibridacin entre cultivos no transgnicos de colza, sorgo, girasol, rbano, poroto y trigo y sus parientes silvestres han demostrado que no slo lo hacen sino que su aptitud biolgica puede ser incluso mayor que la de sus progenitores silvestres. En uno de los primeros estudios de transmisin de un transgen a poblaciones silvestres, Scott y Wilkinson (1998) encontraron una baja frecuencia de plantas hbridas de Brassica rapa portadoras de un transgen de colza, considerado neutral y concluyeron que el riesgo de transmisin era bajo. En tanto, Spencer y Snow (2001) demostraron que los hbridos entre calabaza GM y zapallo silvestre eran suficientemente vigorosos como para permitir la rpida introgresin de transgenes neutrales y beneficiosos en las poblaciones silvestres. En girasol, un transgen beneficioso que confiere resistencia a lepidpteros mediante la produccin de la protena Bt Cry1Ac, aument considerablemente la fecundidad de las plantas silvestres recipientes, aunque este efecto vari entre localidades y aos (Show y col., 2003). De acuerdo con estas observaciones, podra esperarse que el gen Bt aumente la aptitud biolgica de girasoles silvestres

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e incremente rpidamente su frecuencia en las poblaciones naturales, debido a que reduce el dao producido por varias especies de insectos herbvoros. Sin embargo, el transgen OxOx, que confiere resistencia al hongo Sclerotinia , no aument significativamente la fecundidad de plantas de girasol silvestre, sugiriendo que su diseminacin sera prcticamente neutral luego de un escape hacia poblaciones naturales (Burke y Rieseberg, 2003). En Brassica rapa un transgen Bt adquirido por cruzamiento con colza transgnica disminuy su agresividad como maleza en un 20% comparado con B.rapa no GM (Adam, 2003). Estos son ejemplos contrastantes de los efectos de transgenes sobre la aptitud y comportamiento ecolgico de poblaciones silvestres. Cmo estimar los costos y beneficios de un transgen para la aptitud biolgica de una especie silvestre? La aptitud o valor adaptativo es una medida relativa de la eficacia reproductiva de un genotipo, cuando se lo compara con otro genotipo. En este caso, los genotipos a comparar son el que ha adquirido el transgen por hibridacin con el cultivo y el que no lo ha adquirido, o sea el genotipo silvestre de la poblacin en ausencia de flujo gnico del cultivo. Los componentes de la aptitud son la supervivencia y la fecundidad, que pueden resultar afectadas en distintos momentos del ciclo vital. La medicin de la aptitud puede hacerse a travs del porcentaje de germinacin, supervivencia de plntula, nmero de flores, produccin de semilla, peso de la semilla, etc. y en cada caso de estudio ser necesario determinar cules parmetros reflejan mejor la supervivencia y la fertilidad de los individuos. Los resultados obtenidos deberan indicar la velocidad de diseminacin del transgen y la probabilidad de que las poblaciones que lo incorporen, adquieran ventajas adaptativas. En general, las poblaciones silvestres son menos susceptibles a patgenos y plagas que sus parientes cultivados. Mayor diversidad genotpica, menor densidad de plantas y ausencia de laboreo son algunas de las causas de esa diferencia. Por ello, un transgen que confiera resistencia a una plaga o patgeno puede no representar para la especie silvestre una ventaja tan grande como para

el cultivo. Por el contrario, puede representar un costo para la planta que lo adquiera debido a efectos pleiotrpicos sobre otros caracteres fenotpicos que a su vez afecten la aptitud. El beneficio de un transgen asociado a la resistencia a determinada plaga debe ser evaluado comparando la aptitud biolgica de plantas con el transgen y sin l que hayan sido expuestas a esa plaga. Por el contrario, el costo de adquirir el transgen debe ser medido comparando la aptitud biolgica de plantas que lo llevan o no, en ausencia de la plaga. Adems, los caracteres que determinan supervivencia y fecundidad pueden ser afectados por las condiciones ambientales, por lo que es necesario estimarlos en distintos ambientes y a lo largo de varias estaciones de crecimiento. Las diferencias significativas entre plantas silvestres GM y no GM en cada sitio, entre sitios y entre aos pueden ser probadas para cada carcter relacionado con la aptitud mediante un anlisis de la varianza. 5. Consecuencias ecolgicas de la difusin del transgen en la poblacin silvestre La teora de la seleccin natural predice que un fenotipo cuya aptitud biolgica sea superior a la de otros fenotipos de la poblacin, dejar mayor cantidad de descendientes y que si estos a su vez heredan el genotipo favorecido, su frecuencia aumentar en detrimento de los dems genotipos. Sin embargo, el impacto ambiental depender no slo de la frecuencia sino del cambio en las interacciones biticas y abiticas de ese genotipo silvestre en su ambiente. La prediccin de las consecuencias de un escape de transgenes requiere del estudio de la alteracin de las interacciones ecolgicas existentes entre las especies. Un gen de resistencia a insectos o a enfermedades modificar la herbivora o la relacin husped-patgeno entre la especie silvestre y otras especies de su hbitat, as como un transgen que favorezca el crecimiento modificar las relaciones de competencia intra e interespecficas. Cuanto ms se conozca acerca de la dinmica poblacional de una especie, ms fcilmente se podr evaluar el impacto ambiental. En Cucurbita pepo, hbridos entre

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un cultivar GM y plantas silvestres mostraron amplias variaciones en fecundidad entre aos y localidades, que fueron atribuidas a condiciones de suelo y clima, densidad de herbvoros, competencia con malezas, enfermedades y otros factores ambientales (Spencer y Snow, 2001). El crecimiento poblacional a travs de la produccin de semilla es uno de los parmetros ms informativos y es ms probable que sea limitante para especies anuales; por ello, caracteres que aumenten la produccin o germinacin de semilla tienen un gran efecto ecolgico. Asimismo, est relacionado con la dispersin, la dinmica del banco de semillas y la longevidad de las poblaciones. Resultados preliminares en poblaciones experimentales de girasol silvestre sometidas a flujo gnico de un cultivo GM (Bt) indicaron que el aumento de la produccin de semilla determin mayor nmero de plntulas, mayor supervivencia hasta la edad reproductiva, mayor nmero de inflorescencias con semilla y mayor rea total de captulo al ao siguiente (Pilson y col., 2002). El incremento en tamao y nmero de las poblaciones silvestres de una especie afectar a otras especies vegetales del hbitat, cuya frecuencia relativa podra disminuir. El escape de un transgen Bt de resistencia a insectos a una poblacin silvestre podra tener un impacto negativo en varias especies de herbvoros, algunas de las cuales pueden ser especialistas, alimentndose con exclusividad de la especie silvestre receptora. Como parte de los estudios necesarios para la evaluacin del impacto ambiental de eventos Bt, se incluyen estudios del impacto de estos genes sobre especies no blanco (aquellas que no son las controladas especficamente por esos genes) (Wolt y col., 2003). Las toxinas Bt son altamente especficas para determinados tipos de herbvoros (lepidpteros, colepteros, dpteros) y la disminucin de uno de ellos puede alterar las relaciones de competencia con los dems. Las relaciones ecolgicas entre herbvoros suelen implicar un delicado equilibrio demogrfico cuyo colapso podra contribuir a mayores niveles de infestacin y dao (Groot y Dicke, 2002). El uso comercial de cultivos Bt ejerce una

presin selectiva que podra favorecer la seleccin de insectos resistentes a las toxinas, que llevan una mutacin recesiva de resistencia en condicin homocigota. La descendencia podra heredar los genes de resistencia y en unos pocos aos, la biotecnologa desarrollada para el control de insectos se volvera inefectiva. Para evitar esta situacin se ha ideado la estrategia del cultivo refugio, que consiste en sembrar una franja de variedad no transgnica junto a la variedad Bt. Los insectos se reproducen libremente en esa franja, de modo que los raros portadores de resistencia se mantendrn en una frecuencia relativamente baja en la poblacin total de insectos. La prdida de la eficacia Bt es actualmente una de las mayores preocupaciones ambientales en relacin con el uso de biotecnologa agrcola aplicada al control de insectos. Hasta el momento no se han detectado insectos resistentes en condiciones de produccin a campo de cultivos Bt (Shelton y col., 2002; Tabashnik y col., 2003). Conclusiones El estudio del impacto ambiental precede la liberacin de cualquier nuevo evento de transformacin en plantas para tener resultados confiables en el ambiente de la liberacin. La mayor parte de los efectos no deseados del escape de un transgen pueden evitarse mediante acciones adecuadas que pueden planificarse anticipadamente (manejo del cultivo, bancos de germoplasma, cultivos refugio, etc.). Sin embargo, la difusin de un transgen hacia poblaciones silvestres emparentadas es difcil de evitar debido a que el polen de los cultivos puede alcanzar grandes distancias. En las prximas dcadas, los cultivos GM se utilizarn en gran escala, por lo que ser necesario evaluar cuidadosamente el riesgo de escape de transgenes para cada uno de ellos. Esa evaluacin, realizada por equipos multidisciplinarios, debe considerar los siguientes aspectos: a) Presencia de especies silvestres sexualmente compatibles con el cultivo y la probabilidad de que el transgen difunda en ellas. b) Cambios en las caractersticas de poblaciones de patgenos, insectos y malezas relacionadas con el cultivo GM y medidas para evitar o retardar la aparicin de biotipos resistentes. c) Cambios

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Tabla I. Clasificacin de las especies GM en Argentina segn la probabilidad de transferencia del transgen (Grupo 1,2,3) y las consecuencias biolgicas de la modificacin gentica( Clase 1,2,3).

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en la dinmica de poblaciones de otras especies vegetales y animales que comparten el hbitat (polinizadores, parsitos y predadores, microflora y fauna del suelo). Esos estudios tambin tienen en cuenta el fondo gentico y las condiciones ambientales para cada caso en particular (Burachik y Traynor 2002, Ver Captulos 1 y 2 de esta seccin). Referencias y sitios sugeridos

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IX-Captulo 4
Deteccin de OGM en la cadena alimentaria
Tozzini, Alejandro C. Una gran cantidad de plantas genticamente modificadas (GM) han sido aprobadas para su cultivo en el mbito mundial luego de haber pasado por rigurosos controles de seguridad alimentaria y ambiental. Sin embargo, algunos mercados, en particular la Unin Europea, tienen estrictos requerimientos para su etiquetado. En este caso, la normativa de etiquetado que rige a partir de abril de 2004, establece el etiquetado obligatorio de los alimentos y piensos derivados de un OGM, independientemente de la detectabilidad de ADN o protenas, y slo admite la presencia adventicia (accidental) de hasta un 0.9% de OGM aprobados o de 0,5% en el caso de eventos, an no aprobados pero con un dictamen de bioseguridad favorable. La Argentina es uno de los pases con mayor adopcin de OGM, segundo despus de los EE.UU. y antes que Canad. El aprovechamiento a campo de los beneficios de la biotecnologa vegetal implic inmediatamente la necesidad de implementar procedimientos de campo y laboratorio para poder discriminar mercaderas conteniendo un nivel de OGM superior a un determinado umbral, de aquellas que estaban por debajo. A partir del ao 1997 los exportadores comienzan a demandar el anlisis de partidas de granos destinados a la Comunidad Europea. En ese momento el contenido aceptable era inferior al 1%, los protocolos de deteccin requeran de la germinacin de los granos (para extraer ADN de las hojas) y en algunos casos hasta el uso de sondas radioactivas. Desde entonces, se ha avanzado sensiblemente en una serie de aspectos que han hecho evolucionar el panorama, tanto en el pas como en el mundo: - Se han desarrollado protocolos de purificacin de ADN y de PCR para aplicar a gran escala. - Los mtodos de PCR han evoluciona-

do hacia tcnicas cuantitativas (PCR en Tiempo Real) - Se han desarrollado tcnicas inmunolgicas y kits especficos de fcil aplicacin. - Hay ms informacin molecular sobre los eventos y los primers especficos correspondientes. - Los operadores de mercado se han familiarizado con el concepto de OGM. - Se han desarrollado y aplicado programas de Trazabilidad e Identidad Preservada para la caracterstica genticamente modificado. - Se discuten protocolos y materiales de referencia a nivel de normas de CODEX Alimentarius, ISO (International Standards Organization) e ISTA (International Seed Testing Asociation) entre otras. - En el pas se ha desarrollado una logstica de segregacin de granos y semillas capaz de abastecer con distintos productos, los requerimientos especficos de mercados de exportacin, o del nacional, en aquellos casos en los que la demanda est dispuesta a cubrir los costos derivados de la segregacin. A grandes rasgos, una planta genticamente modificada es aquella a cuyo genoma se han incorporado uno o ms transgenes mediante alguna de las tcnicas de ingeniera gentica. Estos transgenes poseen una secuencia nucleotdica especfica y algunos de ellos se expresan generando una protena nueva en el organismo, lo cual le va a conferir un nuevo fenotipo a la planta. En cualquiera de estos tres niveles, ADN, protenas o fenotpico, es posible hacer un anlisis para determinar cualitativa o cuantitativamente la presencia de una modificacin gentica. La deteccin a nivel de ADN se realiza mediante amplificacin por PCR, a nivel de protenas por tcnicas inmunolgicas (tiras reactivas o ELISA), mientras que la fenotpica implica la evaluacin de la nueva caracterstica producida por el transgen. Desde el punto de vista de los requerimientos tcnicos, el anlisis fenotpico puede ser el ms sencillo, mientras que el anlisis por PCR es en general, el ms complejo. Los protocolos analticos son muy sensi-

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bles ya que detectan un gen en decenas de miles de genes del genoma, o una nueva protena entre varios miles de protenas. A esto hay que sumarle la dilucin no OGM / OGM, que en muchos casos requiere detectar y cuantificar un grano GM entre varios miles. Actualmente, los protocolos pueden detectar un evento o grupo de eventos en un cultivo en particular pero ninguno puede hoy detectar en un nico ensayo todos los eventos, por eso no se puede asegurar que una muestra est libre de OGM; slo se puede asegurar que est libre de los eventos para los cuales se hayan realizado los anlisis pertinentes. Deteccin fenotpica En referencia a los mtodos de deteccin fenotpica, nos concentraremos en el fenotipo como resultado de algn proceso metablico de la planta (y no restringirnos a una definicin de fenotipo que implique la medicin de alguna protena). Las plantas genticamente modificadas (PGM) que se encuentran actualmente a campo presentan la caracterstica de resistencia a herbicida y/o a insectos. La evaluacin de la resistencia a insectos de una planta se realiza mediante ensayos biolgicos complejos y de larga duracin, por eso sta no es una alternativa prctica parael anlisis de granos. Sin embargo, la resistencia a herbicidas s puede ser evaluada mediante ensayos sencillos en laboratorio y a campo. Las semillas o granos pueden ser puestos a germinar en presencia del herbicida (para soja, 0.5 ml glifosato 48% en 1 litro de agua; Monsanto America Latina. 2001), y slo germinarn aquellos individuos portadores del gen de resistencia (Fig. 1). La cantidad de semillas GM puede ser estimada en la muestra mediante un clculo sencillo: semillas RR = semillas germinadas con glifosato/semillas germinadas con agua. Una vez que un lote ha sido sembrado y mientras el cultivo se encuentre en una etapa en la que es susceptible al herbicida, se pueden hacer aplicaciones de herbicida en pequeas parcelas representativas (Fig. 2) para luego hacer el recuento de plantas so-

Figura 1: mezcla de semillas de maz no GM y GM (evento GA 21, Monsanto) puestas a germinar con agua (superior) y con solucin de glifosato (inferior). (gentileza de Ing. Agr. Silvia Passalacqua y Mnica Abal. Lab. del SENASA)

brevivientes sobre total de plantas tratadas. Si los individuos GM y no GM tienen el mismo rendimiento entonces, los granos que se cosechen en ese lote tendrn una proporcin de GM/ no GM igual al porcentaje de plantas sobrevivientes. Estas alternativas de evaluacin son usadas en soja por los propios productores que abastecen a parte de la industria nacional productora de jugos y alimentos a base de soja. La industria, por su parte, controla esta materia prima mediante el uso de tests inmunolgicos a la entrada de la planta procesadora. Generalmente de un conjunto de lotes as controlados se toma una muestra que se enva a un laboratorio para realizar un anlisis por PCR para as tener un lmite de deteccin menor y una cuantificacin del contenido de GM, lo que adems les permite obtener un certificado de una tercera parte (laboratorio independiente) para el control de procesos de produccin. Deteccin inmunolgica o por PCR? La eleccin del mtodo de deteccin depende de varios factores, uno de ellos es el producto que se va a analizar: la matriz (granos, harina, galletita, sopa, etc). En el caso de grano y los primeros productos de molienda de stos, tanto la protena como el ADN conservan sus propiedades fsicoqumicas intactas, por lo tanto ambos mtodos pueden aplicarse. Sin embargo, a medida que la materia prima es elaborada ha-

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Procedimientos inmunolgicos Bsicamente dos son los formatos que toman los ensayos inmunolgicos para la deteccin de OGM: las tiras reactivas (o strips de flujo lateral) o ELISA (ensayo de inmunodeteccin ligado a enzimas). Flujo lateral o lateral flow
Figura 2: representacin esquemtica de la aplicacin de herbicida en parcelas representativas en un lote de soja para determinar y cuantificar la presencia de individuos GM con resistencia al herbicida.

En este formato se renen todos los reactivos en un soporte slido y mediante el flujo por capilaridad de la muestra en solucin se logra determinar la presencia o au-

cia alimentos terminados, los distintos tratamientos a que son sometidos los componentes, hacen que se vayan degradando el ADN y las protenas. Especialmente estas ltimas pierden su estructura disminuyendo rpidamente sus propiedades inmunolgicas, por lo tanto no es apropiado aplicar mtodos inmunolgicos a alimentos con alto grado de procesamiento. El ADN, por su parte, se corta en fragmentos pequeos, hasta que la mayora tiene un largo menor al segmento a amplificar y por lo tanto ya no resulta amplificable. A esto hay que sumarle las modificaciones qumicas de las bases del ADN que hacen que pierdan su capacidad de servir como templado en el proceso de copia in vitro que ocurre durante la PCR (Fig. 3), por eso en determinadas ocasiones la presencia de OGM en las materias primas usadas deja de ser detectable en el producto final. Algo similar ocurre con aquellas materias primas usadas como sustrato de procesos fermentativos, como la fabricacin de cerveza, al final del cual la mayora de las molculas han sido digeridas y resintetizadas. Junto con esto cabe acotar que los costos de extraccin/purificacin del ADN son mayores a partir de matrices elaboradas y/o complejas. Otro de los factores que atenta contra las posibilidades de deteccin es el grado de purificacin del producto: en productos como los aceites, la lecitina o la glucosa no queda una cantidad suficiente de ADN como para ser purificado y amplificado.

Figura 3: Representacin esquemtica de la degradacin de las propiedades fisico-qumicas de las protenas y del DNA con el grado de procesamiento de la materia prima hasta el alimento terminado. De alli la eleccin de la tcnica adeacuada para detectar OGMs segn la matriz a analizar.

sencia de una determinada protena (anlisis cualitativo ). Este formato ha sido exitosamente aplicado para la deteccin de un sinnmero de molculas de importancia en el diagnstico veterinario y humano, como es el caso de los tests rpidos de embarazo. Para el ensayo debe molerse una cantidad determinada de granos y una alcuota de esta harina mezclarse con un buffer (provisto con el kit) o agua, para generar una solucin que incluya la protena de inters. La tira posee en la parte inferior un fieltro que sirve para absorber la solucin con las protenas y filtrar las partculas que se hallan en suspensin (Fig. 4). Al mismo tiempo, en el otro extremo se encuentra un material absorbente que recibe el flujo que asciende por capilaridad. El lquido en su ascenso, pasa primero por una zona en donde se halla un anticuerpo monoclonal (Atb) contra la protena a detectar, conjugado con una molcula coloreada (con oro o ltex). Si la protena est presente en la muestra, en esta zona se producir el reconocimiento

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por el Atb y ambos seguirn migrando juntos. La segunda zona es la de pegado o lnea de resultado. En sta se halla inmovilizado un segundo anticuerpo monoclonal contra la protena en cuestin, de forma que cuando sta llega a esa zona, queda retenida y concentrada en una lnea delgada, y al traer consigo al conjugado coloreado, la regin comienza a ser visible. Finalmente, hay una tercera zona llamada de control, en la cual un segundo anticuerpo contra el anticuerpo conjugado est inmovilizado y retiene al conjugado que no haya quedado retenido en la lnea de resultado, generando tambin una lnea visible en esa zona. Esto indica que se produjo el flujo ascendente de lquido y que el anticuerpo conjugado se halla en buenas condiciones. La aparicin de esta lnea avala los resultados negativos, al indicar que la falta de color en la linea de resultado no se debe a una falla del kit. Cuando el resultado es positivo (visualizacin de color en la zona de resultado) no es necesario que aparezca la banda de control. En la prctica, la banda de control presenta menor intensidad en las muestras positivas que en las negativas debido a que el conjugado que llega a esta zona es slo aquel que no se adhiri a la protena y no qued retenido en la lnea de resultado (ver foto en Fig. 4). En casos excepcionales todo el conjugado queda retenido en la lnea de resultado quedando sin color la banda de control. Para realizar el ensayo a partir de granos es necesario moler los mismos y resuspender en un buffer una muestra representativa de la harina obtenida. En esta suspensin se introduce la parte inferior de la tira y se espera de 10 a 20 minutos el desarrollo de color. El resultado es cualitativo (positivo o negativo) y la sensibilidad (o lmite de deteccin) oscila entre el 0.5 y 2% para los eventos Bt11 y Mon810 en maz (eventos protegidos de insectos con el gen cry1Ab de B.thuringiensis) y de 0.1-0.3% para soja RR (evento GTS 40-3-2, tolerante a glifosato, con el gen para la enzima CP4EPSPS). Como se mencion, el ensayo es cualitativo, pero a partir de los resultados se pueden hacer clculos estadsticos para determinar la probabilidad de que la muestra tenga un contenido de granos GM inferior a un determinado

valor para un dado nivel de confianza. Para esto, es imprescindible conocer la sensibilidad del strip expresada en granos GM/ granos no GM, y trabajar con submuestras que no excedan este nmero para evitar resultados falsos negativos. Por ejemplo, la sensibilidad de deteccin de la protena CP4 EPSPS es de 1 grano GM en 1000 no GM, por lo tanto el nmero mximo de granos a incluir en cada submuestra es de 1000. Entonces, para una submuestra de 1.000 granos de resultado negativo y aceptando un nivel de confianza de 95% (i.e. la probabilidad de resultado negativo del anlisis es de 5%), la frecuencia de no GM (probabilidad de no GM) ser la raz unmilsima de 0.05; esto es 0.997 y por lo tanto el contenido mximo de GM esperado es de 0.003 (0.3%). Si de la misma muestra se analizan dos submuestras de 1.000 granos y ambas resultan negativas, el clculo ahora involucra la raz dosmilsima de 0.05, lo que determina un contenido mximo de GM de 0.0015 (0.15%). Realizando el anlisis de submuestras, la sensibilidad de anlisis de una muestra se puede mejorar combinando estadsticamente los resultados de cada una de ellas. Los manuales de los distintos kits incluyen tablas de clculo que estn basadas en estos conceptos. En general, los strips reactivos tienen una versin optimizada para la deteccin a partir de tejido vegetal para poder realizar el anlisis en los perodos en que el cultivo an no presenta granos. La mayor ventaja de realizar el anlisis en granos es la facilidad para muestrear cientos de individuos y combinarlos en una misma muestra; esto es mucho ms difcil de lograr a partir de la recoleccin de hoja. Por otro lado, algunos eventos (ej, maiz Bt 176, de Syngenta) tienen niveles de expresin de las protenas transgnicas altos en hojas y prcticamente nulos en granos, por lo tanto en estos casos resulta ventajoso el anlsis de hojas y desaconsejado el de granos. Como se observa en la Figura 5 los eventos Bt11 y MON810 pueden ser detectados hasta en una concentracin de 0.5%, mientras que el evento 176 no se detecta, an en una concentracin de 10%. Resultados similares se obtienen con los strips provistos por Envirologix o por Strategic Diagnostic Inc (A. Tozzini, datos no publicados). Otros datos de perfomance de

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Figura 4: Esquema de las partes de un strip reactivo (ver texto) y foto de dos strips para la deteccin de la protena CP4 EPSPS (resistencia a glifosato) mostrando un resultado negativo (izq.) y otro positivo (der). (Gentileza de Mnica Porcio, Agricheck Argentina, representante de Strategic Diagnostic Inc. www.sdix.com )

Figura 16: Lectura de un microchip luego de la hibridacin con DNA marcado. Suponiendo que se tratara de un micro-array para identificar GMO, los puntos fluorescentes representaran secuencias pertenecientes a GM presentes en la muestra. En primer plano se muestra una ampliacin de uno de los 16 campos que conforman el micro-array.

reactivos inmunolgicos en formato de strips o de ELISA para distintos eventos y proveedores puede verse en http:// www.usda.gov/gipsa/techservsup. Obviamente la gran ventaja de esta metodologa de anlisis radica en su simplicidad y rapidez, por eso se la utiliza a campo como control inicial en la conformacin de conjuntos que luego sern analizados por algn mtodo cuantitativo, o como primer control a la entrada de un proceso o industria. ELISA ( enzyme-linked immunosorbant assay)
Figura 5: Ensayo de lmite de deteccin de granos de maz Bt utilizando el Quickstick TM de Envirologix (www.envirologix.com). Los porcentajes expresan granos de un evento/granos no GM. Entre parntesis figura el tiempo en minutos transcurridos desde el inicio del ensayo y en el cual se iniciaron las lecturas de los resultados. No hubo cambios en una lectura posterior a los 20 min. (A. Tozzini, Instituto de Biotecnologa INTA)

En este caso, el anlisis inmunolgico se resuelve sobre el soporte slido de placas de poliestireno en el formato de 96 pocillos o de tiras de 8 o 12 pocillos. Estos pocillos estn recubiertos con el anticuerpo de

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captura, en los cuales se agrega la solucin con la muestra (preparaPrimers (en exceso) Separada de las hebras (95C) y cin similar a la anterior). Si la propegado de los primers (60C) tena en cuestin (antgeno) est presente, sta queda capturada en el pocillo por los anticuerpos. Primers complementarios a la secuencia genmica CICLO 1 Finalizado el perodo de incubacin con la muestra sta se vuelExtensin de los primers (72C) por la Taq polimerasa ca del pocillo y se realizan lavados con buffer para retirar las molcuNuevas cadenas de DNA sintetizada a partir de los las que no hayan sido capturadas. primers y sobre las hebras genmicas Luego se coloca un segundo anticuerpo que se unir a la protena Separado de las hebras, pegado de los primers y extensin capturada por el anticuerpo anteCICLO 2 rior, y que est conjugado con una Nuevas cadenas de DNA sintetizada sobre DNA enzima que transformar el sinttico (tamao del fragmento a detectar) cromgeno (ver ms adelante). Finalizada la incubacin con el Separado de las hebras, pegado de los primers y extensin conjugado, se lava con buffer para retirar todo el conjugado libre (no CICLO 3 DNA doble cadena del tamao esperado (amplicn) unido al antgeno). El ltimo reactivo que se agrega es una solucin conteniendo un cromDuplicacin de la cantidad de amplicn geno, una sustancia incolora que por cada ciclo de amplificacin es modificada por la enzima del CICLO 30 conjugado en un compuesto co1.000.000.000 copias de amplicn loreado y que revela, por lo tanto, la presencia del antgeno en la Figura 6: Esquema del proceso de PCR (Polimerase Chain Reaction). muestra. La intensidad de color Amplificacin de un fragmento especfico de DNA mediante un proceso generada en un pocillo determide sntesis in vitro. nado en un tiempo dado es medible en un espectrofotmetro
DNA genmico

Figura 14: Desarrollo de la amplificacin en una PCR en Tiempo Real para distintas muestras (incluyendo la curva de calibracin, el control sin DNA (lnea horizontal marrn) y el control negativo (inicia fase exponencial en ciclo 39.

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para placa de ELISA y es proporcional a la cantidad de antgeno inicial. Por lo tanto, esta lectura puede transformarse (con una curva de calibracin apropiada) en una estimacin cuantitativa del contenido del OGM en la muestra. La sensibilidad de estos anlisis se encuentra entre el 0.3 y 1%, y requiere de un laboratorio de complejidad baja a media y personal calificado. El resultado se obtiene en 3 a 4 horas (sin contar la molienda de la muestra). Como en el caso de las tiras, tambin son varias las empresas que ofrecen anticuerpos y placas para realizar este tipo de ensayo (ver http:/ /www.usda.gov/gipsa/tech-servsup). Este ensayo es adecuado para asistir un proceso de segregacin de granos, para aquellos eventos que tengan una buena expresin de la protena transgnica en granos y en casos que se necesite hacer un anlisis cuantitativo sencillo. Para un determinado tipo de protena, por ejemplo la de Bacillus thuringiensis Bt Cry1A, la secuencia de aminocidos codificada es la misma (o muy similar) en las distintas construcciones utilizadas para generar los distintos eventos de transformacin, an cuando sus secuencias nucleotdicas sean muy distintas. Por eso, el mismo anticuerpo puede ser usado para detectar distintas construcciones presentes en los distintos eventos (los maces tolerantes a lepidpteros MON 810, Bt11 y Bt176, tienen Bt Cry1A). En algunos casos no es posible generar un anticuerpo para detectar la protena introducida debido a que es muy similar a protenas propias de la planta original y por lo tanto no es posible generar un anticuerpo que detecte a la protena introducida sin detectar tambin la ya presente en la planta (reaccin cruzada). Este es el caso de la protena que determina la resistencia a glifosato introducida en el evento GA21, en el cual la protena modificada (mEPSPS, la enzima tolerante al herbicida) presenta slo dos aminocidos de diferencia en 450, con respecto a la EPSPS nativa de maz, la cual es sensible al glifosato. Deteccin del ADN Existen varias tcnicas para determinar la presencia de una determinada secuencia de

ADN; sin embargo, los servicios de deteccin de secuencias transgnicas utilizan casi exclusivamente PCR. El transgen es uno ms entre las decenas de miles de genes originales de la planta. Adems, en la prctica, se requiere de la capacidad de poder detectar un grano GM entre 1.000 o 10.000 granos no GM, y la PCR ha demostrado tener la sensibilidad suficiente como para cumplir este cometido. Sin embargo, la mayor dificultad de un anlisis dirigido a detectar niveles mnimos de OGM no radica en las tcnicas analticas sino en la posibilidad de hacer un muestreo representativo en la prctica, acorde a los niveles a detectar. Las muestras de granos (de al menos 15.000 granos para detecciones de 0.1%) deben ser molidas y reducidas en su granulometra para tomar una muestra de harina menor a un miligramo y de all, purificar su ADN. La reaccin en cadena de la polimerasa es una sntesis in vitro de ADN, mediada por una ADN polimerasa ADN-dependiente a partir de un cebador o primer (segmento de ADN simple cadena de 18 a 25 nucleotidos). Un par de primers son utilizados para determinar la especificidad y el tamao del fragmento a amplificar. Una ADN polimerasa termo-rresistente proveniente de Termophilus aquaticus, Taq polimerasa, es la enzima encargada de la replicacin del ADN bajo un programa de ciclos repetidos que alterna normalmente tres temperaturas: una temperatura de desnaturalizacin (9495C) en la cual el ADN doble cadena se abre en hebras simples, le sigue una etapa de hibridacin de los primers (de 45 a 68 C) en la cual stos se unen por complementariedad de bases con el ADN simple cadena y sirven de punto de inicio de la sntesis de ADN por la Taq polimerasa. Finalmente la temperatura se eleva a 72C, en la fase de elongacin, ya que sta es la temperatura ptima de fun-

Figura 7: Ubicacin de distintos pares de primers con respecto a la construccin y al sitio de insercin en el genoma de la especie.

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cionamiento de la enzima y de esta forma se acelera la reaccin. As termina un ciclo de copia y se inicia el siguiente elevando nuevamente la temperatura hasta 94-95C (Fig. 6, ver pg.6). Estos ciclos tienen una duracin de 2 a 4 minutos y se repite de 35 a 50 veces multiplicando una copia del fragmento inicial en ms de 1.000 millones de copias al final del proceso. El producto de la amplificacin se resuelve por electroforesis en gel de agarosa y se visualiza con un colorante fluorescente (bromuro de etidio) bajo radiacin UV. Este aparece como una banda de un tamao predeterminado de pares de bases, correspondiente al fragmento amplificado. La tcnica de PCR es muy sensible, y por lo tanto, niveles nfimos de contaminacin con ADN en una muestra pueden generar un resultado positivo falso. La amplificacin repetida del mismo fragmento de ADN (amplicn) va generando cientos de miles de millones de copias dentro del mismo laboratorio y estas copias pueden contaminar las nuevas muestras y los reactivos si no se tienen cuidados especiales. En primer lugar se

Tabla 1: Nmero de copias por genoma de distintas secuencias regulatorias en diferentes eventos (P35S = promotor 35S CaMV. Tnos = terminador de la nopalin sintetasa. T35S = terminador del 35S de CaMV)
Evento GA21 GTS 40-3-2 MON 810 NK 603 P 35S 0 1 1 1 1 1 1 2 3 3 2 1 3 2 1 2 3 Tnos 1 1 T35S

3 T25
TC1507 176 Bt11 MON 809 T14

MON 832 DBt418 CBH 351

4 5 5

plificacin y se resuelve por electroforesis. En este ltimo cuarto se abre el tubo de reaccin y es donde se liberan los 810 amplicones. Es conveniente que el primer y ltimo cuarto tengan presin negativa, mientras que en el de purificacin la presin debe ser positiva. Cada cuarto debe ser limpiado regularmente con hipoclorito de Bt11 sodio, tener un sistema de luz UV para la destruccin del ADN y tener 40-3-2 sus propios equipos e instrumentos. Slo personal capacitado puede inFigura 8: Representacin esquemtica de las partes componentes de gresar en los laboratorios para las construcciones de los eventos aprobados en la Argentina en soja y minimizar el transporte de maz (no estn los dos eventos en algodn). P35S: promotor 35S, T35S: terminador 35S, Tnos: terminador de la nopalin sintetasa, Pmaz: amplicones de un cuarto a otro. El reactivo clave en una reaccin promotor no especificado de un gen de maz, Cry 1Ab: protena Bt que confiere resistencia insectos, CP4 EPSPS: protena que confiere de PCR son los primers que deterresistencia al herbicida glifosato, PAT: fosfinotricin acetil transferasa, minarn el fragmento a amplificar. determina resistencia a glifosinato. Para esto, se requiere conocer la requiere de un laboratorio especialmente di- secuencia de nucletidos de un segmento seado con cuartos separados para las dis- de la construccin usada para generar el tintas tareas del anlisis y con un flujo evento, para as poder disearlos. Esta inunidireccional de la muestra desde las reas formacin no siempre est disponible, pero limpias hasta la ltima zona sucia. En el una vez que se la conoce, la sntesis de primer cuarto se muele la muestra, en el se- primers es mucho ms barata y sencilla que gundo se purifica el ADN y se prepara la reac- la produccin de anticuerpos para reactivos cin de PCR y en el ltimo se produce la am- inmunolgicos. Segn sea la secuencia so-

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Figura 9. Evolucin de la acumulacin de DNA en una reaccin de PCR positiva. La fase exponencial de crecimiento est marcada entre barras.

Figura 10: Evolucin de la acumulacin de DNA en funcin de los ciclos para distintas reacciones de PCR correspondiente a diferentes concentraciones iniciales del fragmento de DNA a amplificar. La lnea umbral corresponde a un determinada cantidad de DNA, que es superado por las distintas reacciones en diferentes ciclos.

bre la cual se ubiquen los primers, los mismos tendrn propiedades de deteccin distintas. Los primers generales o universales estn diseados sobre secuencias presentes en la mayora de las construcciones vegetales (promotores, terminadores, genes marcadores, etc.), por lo tanto, permiten detectar varios eventos (Fig. 7). Los primers especficos permiten detectar uno o pocos eventos. Si estos estn ubicados sobre la secuencia codificante pueden detectar un mismo tipo de construccin, por ejemplo, los eventos Bt11 y MON810. Normalmente, con una construccin se obtienen muchos eventos en una misma especie, pero slo uno alcanza la fase comercial; sin embargo, a veces una misma construccin se usa para transformar varias especies y por ello, una misma construccin se repite en el mercado en varios cultivos. En estos casos, los primers que amplifican esta construccin detectan varios eventos. Por ejemplo, con los mismos primers se puede amplificar el evento GTS 403-2 de soja y el NK603 en maz (as como tambin los mismos reactivos inmunolgicos).

Los primers evento-especficos estn diseados sobre el inserto y sobre la regin genmica adyacente al sitio de integracin; por eso, permiten detectar un solo evento (de todos los que hayan sido obtenidos con una determinada construccin). Todos los eventos aprobados en la Argentina hasta la fecha (ver: Biotecnologa CONABIA en www.sagpya.mecon.gov.ar) tienen en su estructura por lo menos una copia de la secuencia del promotor 35S, sea para dirigir la transcripcin del gen principal o del gen marcador (Fig. 8 y Tabla 1); por eso, una reaccin de PCR con primers ubicados sobre el p35S permite detectar la presencia de cualquiera de estos eventos. Existen dos tipos de PCR desde un punto de vista tcnico: la primera versin de PCR, ahora denominada de Punto Final ( End Point PCR), debido a que el resultado de la amplificacin se obtiene al finalizar la reaccin (electroforesis en gel), y la otra versin, ms reciente, la PCR en Tiempo Real (Real Time PCR), ya que el resultado de la amplificacin se lee ciclo a ciclo (sistema de tubo cerrado). Desde el punto de vista del objetivo de la reaccin, un ensayo puede hacerse a los fines de detectar la presencia de OGM o de un evento en particular (anlisis cualitativo) o para cuantificar su presencia (anlisis cuantitativo). La cintica de acumulacin del producto de PCR se puede describir en tres etapas, la primera de lenta acumulacin del producto, una segunda en la cual en virtud de la cantidad de copias acumuladas, el crecimiento del producto es exponencial y la tercera en la cual el sistema se satura y alcanza un plateau. (Fig. 9). Los momentos (ciclos del proceso) en los cuales se alcanzan las distintas etapas dependen del nmero inicial de copias del segmento de ADN a amplificar en la muestra; una muestra con mayor nmero de copias iniciales alcanzar la fase exponencial antes que una con menor nmero. Otra caracterstica del sistema es que la fase estacionaria o de plateau, determina que las cantidades de producto totales acumuladas en las distintas muestras tiendan a igualarse aunque hayan iniciado con un nmero distinto de copias. (Fig. 10).

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El resultado de una PCR en Punto Final (PCR PF) se obtiene una vez que se han cumplido todos los ciclos de amplificacin programados y el producto se resuelve por electroforesis en un gel de agarosa. El bromuro de etidio agregado al gel o despus de haberlo corrido se intercala en el ADN y permite visualizar los productos de amplificacin cuando se lo irradia con iluminacin UV. De esta manera se puede determinar la presencia del producto esperado (amplificacin

cado entre el 0.01 y 0.05% de genomas GM. Esto equivale a detectar de 5 a 25 copias de transgen por reaccin segn el tamao del genoma de la especie y de la cantidad de ADN usado en cada reaccin. Programando un alto nmero de ciclos (45 a 50 ciclos) se permite que an las muestras con un bajo

Figura 11: Resultado semicuantitativo por PCR de Punto Final. Scanning de una foto de trabajo, los trazos verticales a mano alzada separan las distintas calles del gel. Las primeras 6 calles corresponden a la Curva de Calibracin con los siguientes puntos, 0.05%, 0.1%, 0.25%. 0.5%. 1% y 5% (genomas GM/genomas totales). Le siguen dos calles correspondientes al control negativo (maz no GM, molido en la misma tanda que las muestras siguientes). Los pares de calles de 1 a 7 corresponden a 7 muestras con dos repeticiones cada una (dos extraccin de DNA y una PCR de cada extraccin), muestras 1, 2 y 3, GM no detectado con LOD 0.05%; muestras 6 y 7 GM detectado, con contenido estimado inferior al 0.1%; muestras 4 y 5 debe repetirse la PCR y/o extraccin hasta igualar los resultados entre las repeticiones (generalmente esto ocurre con muestras con bajo contenido de GMO por un tema de muestreo de la harina y del DNA).

Figura 12: PCR competitiva. Co-amplificacin de las diluciones crecientes del estandar y decrecientes del DNA de la muestra. En el punto de equivalencia se igualan las masas de los productos de amplificacin

especfica ), identificado por su peso molecular (en pares de bases), relativo a un marcador de peso conocido. Tambin se puede observar la presencia de productos inespecficos si los hubiera. Anlisis cualitativo por PCR PF La PCR en Punto Final es adecuada para anlisis cualitativos, es decir, donde el resultado se medir como amplificacin positiva (OGM detectado) o como negativa, (OGM no detectado), considerando la sensibilidad lograda , lmite de deteccin o LOD . Optimizando todos los parmetros de la reaccin: ADN de muy buena calidad, primers bien diseados, reactivos de mxima calidad y con un programa y un equipo adecuados, se puede lograr un lmite de deteccin ubi-

nmero de copias iniciales alcancen la fase exponencial y acumulen una masa visible de producto, a costa de saturar las muestras con contenidos mayores. En estos ensayos, adems de los controles negativos compuestos por una muestra con ADN de material no GM y el control sin ADN (slo agua), se debe incluir como controles positivos al menos dos puntos de concentracin conocida de GM. Una de stas debe tener un contenido de GM igual al lmite de deteccin deseado de forma tal de verificar que el LOD se ha alcanzado y otro superior como segundo control en caso de que la eficiencia del proceso no haya sido ptima. Estos valores podran ser 0.05% (LOD) y 0.20%. Es muy conveniente que estos controles positivos se inicien en el proceso de anlisis a partir del momento de la purificacin del ADN. De esta manera, se est controlando en ellos la calidad del ADN obtenido, adems de la eficiencia del proceso de PCR. El anlisis cualitativo es tambin denominado screening test, ya que permite hacer un primer anlisis a un determinado nmero de muestras y luego derivar a PCR cuantitativa aquellas que resultaron positivas. Anlisis semicuantitativo por PCR PF En un anlisis en PF puede obtenerse una estimacin del contenido de OGM en un rango dinmico acotado. Un resultado po-

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Figura 13: Esquema de la estructura optica del ABI prism 7700 (PE Biosystem). Este sencillo esquema muestra como a partir de uan fuente de luz (laser en este caso) se direcciona la luz hasta cada muestra y la emisin de retorno es dirigido hacia una cmara. Un detalle de equipos como este es que la tapa caliente que apoya sobre las muestras debe ser transparente. Fuente PE Biosystems

sitivo se expresa como deteccin de OGM y un contenido estimado por una curva de calibracin con valores prximos al LOD del ensayo. Para esto hay que estandarizar muy bien las condiciones intralaboratorio, especialmente cantidad y calidad de ADN y cantidad de ciclos de amplificacin (teniendo en cuenta que alcanzado el plateau de la reaccin, la cantidad de ADN acumulado tiende a igualarse entre muestras con distintas concentraciones de OGM). El resultado positivo se expresa como: OGM detectado con un LOD de ensayo X; la cantidad de producto generado se ubica entre las seales producidas por los estndares A y B (controles positivos). Por ej.: amplificacin de promotor 35S positiva con un LOD = 0.05%; la cantidad de producto amplificado se ubica entre los generados por los estndares de 0.1 y 0.5%. Cuando este ensayo se realiza con una curva de calibracin puede verse, por ejemplo, una seal dbil en los estndares de 0.05 y 0.1%, una seal media en 0.25 y 0.5% y fuerte en 1 y 5% (Fig. 11). Anlisis cuantitativos por PCR PF, PCR competitiva Una de las estrategias desarrolladas para cuantificar por PCR de Punto Final fue la PCR competitiva (Hardegger y col., 1999) y est basada en la co-amplificacin (en la misma reaccin y a partir del mismo par de primers) de un estndar interno de concentracin conocida. Cuando la seal de amplificacin generada a partir de la muestra y a partir del estndar interno son iguales, se asume que

ambos procesos partieron de igual nmero de copias iniciales del ADN blanco. El estndar interno se construye clonando en un plsmido el fragmento a amplificar y producindole una insercin o delecin de manera tal que cuando se resuelvan en un gel los productos de amplificacin a partir de la muestra y del estndar, se distingan por sus pesos moleculares. Para lograr una reaccin donde se igualen los productos de amplificacin (muestra: control interno) se arma una serie de diluciones crecientes del estndar y se combina con una serie de diluciones decreciente de la muestra

(Fig. 12.). Esta estrategia, adems de laboriosa (para obtener una reaccin donde se igualen los productos de amplificacin), requiere del desarrollo del control interno, pero se puede realizar en un laboratorio de PCR tradicional. PCR en Tiempo Real (Real Time PCR) En un sistema de PCR en Tiempo Real, el proceso de amplificacin se va siguiendo ciclo a ciclo, observando el incremento de la masa de ADN presente en cada reaccin. Esto se logra gracias a un termociclador que tiene adosado un sistema ptico que emite un haz de luz sobre cada muestra y registra la emisin de fluorescencia a partir de las misma y de uno o ms reactivos fluorescentes agregados a la reaccin y que emiten luz de manera proporcional a la cantidad de ADN presente (Fig. 13). La ventaja de este sistema es que permite detectar en qu momento cada reaccin alcanza su fase exponencial de amplificacin (Fig. 14, ver pg.6), y sta correlaciona con la cantidad de copias del ADN blanco que haba inicialmente en la muestra. Para poder cuantificar se necesita incluir en el experimento una curva de calibracin con la cual comparar las muestras incgnitas. A partir de esta curva, se determinar en qu ciclo alcanza la fase exponencial cada concentracin de OGM. Una muestra con un 10% de OGM alcanzar la fase exponencial antes que una muestra con un 1%; y sta antes que una con 0.1%. La cuantificacin del contenido de OGM se obtiene comparativamen-

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Figura 15: Ajuste matemtico de los resultados de las muestras que integran la curva de calibracin y a partir del cual se calcular la concentracin de GM en las muestras. Los puntos incluidos en esta curva son 0.05, 0.1, 0.25. 0.5,1 y 5% (Genomas/ genomas totales).

te con la curva de calibracin usada y en sus mismas unidades (nmero de copias, porcentual, etc) (Fig. 10 y Fig. 15). Una de estas expresiones relativas se logra cuantificando genomas modificados, respecto de los genomas totales de la especie. Para determinar el nmero de genomas modificados se mide el nmero de copias del segmento de ADN transgnico (una copia por genoma), mientras que para medir el nmero de copias de genoma de la especie se cuantifica el nmero de copias de un gen endgeno, de copia nica y propia de la especie, esto siempre dentro de la misma muestra de ADN. Por lo tanto, en este ensayo se necesita utilizar dos curvas de calibracin, una para el nmero de copias del transgen y otra para la cuantificacin del gen endgeno, para lo cual se utilizan plsmidos conteniendo las secuencias en cuestin. Cuando la cuantificacin de una muestra se realiza por evento, la suma de los porcentuales de cada evento determina el contenido total de la muestra. Para granos, la curva de calibracin puede prepararse mezclando distintas proporciones de granos modificados con no modificados. De esta manera, la extraccin de ADN a partir de estas mezclas ya tiene una proporcin fija y conocida de genomas modificados/no modificados. Si en la reaccin de PCR se utiliza la misma cantidad y calidad de ADN en los estndares y en las muestras, se puede hacer la comparacin directa entre stos para realizar la cuan-tificacin. Como en todo anlisis cuantitativo, el material de referencia es de suma importancia. Para maz y soja existen preparados (harinas) comerciales con distintas concentraciones de GM (de 0 a 2%). Este material de

referencia, es preparado por el IRMM de Europa (Institute for Reference Material and Measurements, www.irmm.-jrc.be ) y por su costo se lo usa generalmente para calibrar los materiales preparados en el laboratorio; sin embargo, es muy difcil lograr la estabilidad y reproducibilidad de los valores entre lotes e incluso algunos productos se han discontinuado. En materia de plsmidos, una firma japonesa comercializa uno que contiene 8 secuencias que estn presentes en un gran nmero de eventos comerciales (www.fasmac.co.jp). Al tema de los materiales de referencia se le agrega el de las unidades de medicin. En la mayora de los contratos comerciales de granos en los cuales se estipula un determinado contenido de OGM, este contenido se expresa de manera porcentual pero sin especificar las unidades. Lo mismo ocurre dentro de la legislacin europea de etiquetado (EC 49/2000) y su reciente modificacin hacia un lmite de 0.9% para cada especie ingrediente (EC 1829/2003), donde tampoco se especifica las unidades de esta medicin relativa. En general se asume que se trata de una medicin relativa de peso en peso. Sin embargo, ninguno de los mtodos analticos cuantitativos, ELISA cuantitativo o PCR cuantitativa, puede medir estas unidades e incluso cuantifican elementos distintos entre ellos. Si en una muestra de granos se conoce el nmero de granos GM, se puede calcular con precisin el contenido porcentual en peso. Sin embargo, conocer el nmero de granos GM a partir de un contenido de genomas modificados medidos por la presencia del promotor 35S, implica conocer informacin precisa de la muestra o suponerla. Por ejemplo, en una especie diploide, si

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el evento est en estado homocigota, tendremos el doble de copias del p35S que si est en estado de heterocigosis (lo ms probable es que en una muestra tengamos proporciones distintas de ambos estados). Adems, en los granos heterocigotas, el tejido triploide del endos-perma genera diferencias en la densidad del transgen por unidad de masa; si el transgen lleg al grano por la gameta masculina (polen), el endosperma tendr una relacin modificado: no modificado de 1:2, mientras que si ingres por la gameta femenina, la relacin ser 2:1, debido a la contribucin gentica desigual de ambos padres en el endosperma 3n. Tambin hay que conocer los eventos involucrados, ya que algunos tienen una copia del p35S por genoma, mientras que otros tienen dos, tres y hasta 5 copias (Tabla 1). Cuando se est cuantificando la contaminacin accidental con GM de un lote de granos, es poco probable que se tenga la informacin precisa de la misma y su origen. Cmo detectar OGM en el futuro? En un futuro cercano sern muchos los eventos aprobados y liberados en el mundo, y las secuencias hoy presentes en la mayora de los eventos, como son el promotor 35S y el terminador NOS, ya no sern comunes. El desarrollo de nuevos promotores especficos de la especie y la funcin har que los distintos eventos prcticamente no tengan ninguna secuencia en comn. Con la tecnologa actual, esto implica que deberamos realizar una reaccin de PCR por cada evento posible para poder finalmente decir que la muestra no contiene (con un lmite de deteccin dado) una determinada lista de eventos correspondiente a todos los que hayan sido ensayados. Hoy, un ensayo de PCR dirigido al P35S y cuyo resultado sea negativo permite descartar la presencia de ms del 90% de los eventos del mercado mundial. El consumidor, especialmente el europeo, ha solicitado la eliminacin en las plantas transgnicas de los genes de resistencia a antibiticos. Estos son usados como marcadores de seleccin en los procesos de transformacin y regeneracin vegetal. Estas secuencias tambin son comunes a muchos

eventos y por lo tanto tiles a la hora de detectar la presencia de modificaciones genticas, pero estos genes ya no estarn presentes en los nuevos materiales GM. Por otro lado, los prximos desarrollos planean agregar o modificar varias caractersticas en el mismo genotipo o la introduccin de pasos metablicos complejos. Esto implicar la introduccin de varios genes distintos en transformaciones sucesivas. Las tcnicas actuales de integracin al azar en el genoma tienen una muy baja eficiencia de produccin. Por eso, para estos desarrollos se requerir el uso de sistemas de integracin al genoma que sean dirigidos a sitios especficos del mismo (sistemas de integracin por recombinacin). Unos pocos sistemas se presentan como promisorios para su uso, entre ellos el sistema Cre/Lox, (Srivastava V, Ow DW, 2001). Por lo tanto es posible que las secuencias requeridas para el funcionamiento de estos sistemas sean, en el futuro, blanco para la detecccin de OGM. En diversos mbitos se est discutiendo la posibilidad de introducir secuencias no codificantes en el genoma de las plantas junto con los genes de inters de una modificacin gentica, para generar blancos de deteccin universales frente a la diversidad de eventos que habr en el futuro. Frente a esta perspectiva de diversidad de modificacin gentica y tan heterognea mundialmente, la nueva tecnologa de los microchips, microarrays o micromatrices, podra permitir detectar y cuantificar en un solo ensayo la presencia de cientos o miles de secuencias . A grandes rasgos, un microchip es un pequeo soporte slido del tamao de un cubreobjetos para microscopia ptica, en el cual se han fijado puntos ordenados y microscpicos de secuencias de simple cadena conocidas. Estas secuencias tienen la capacidad de hibridar con su ADN complementario, y si ste est marcado con un fluorforo, el punto de la micromatriz quedar marcado. Luego de la hibridacin con la muestra de ADN marcado, un aparato de barrido especial realiza la lectura punto por punto, identificando los puntos marcados y por lo tanto las secuencias que estn presentes en la muestra bajo anlisis (Fig. 16, ver pg.5). Desde el ao 2001 una comisin europea

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de investigacin est encargada de desarrollar el GMO chip, un chip de baja densidad (1000 puntos /cm2) que permita detectar la presencia de distintos OGM simultneamente (ver: www.gmochips.org). Segregacin, trazabilidad e identidad preservada para GMO El objetivo de un programa de trazabilidad es generar un producto de identidad preservada, esto es un producto del cual se puede conocer su origen y los procesos a que fue sometido hasta alcanzar el producto final en destino. La identidad preservada se aplica para obtener un producto identificado por su origen geogrfico, y/o por su contenido y/o por su mtodo de produccin. Esto implica el trabajo de auditores, ensayos de laboratorio y documentacin a lo largo de todo el proceso. La trazabilidad est asociada a la reastreabilidad (identificar el origen de los productos) y a la segregacin, para evitar las mezclas y para descartar todo aquello que no cumpla con lo requerido. Muchas veces se confunden los trminos trazabilidad y segregacin y no se refieren a los mismos conceptos. Segregacin implica mantener separado un producto de otros, mientras que trazabilidad significa conocer su origen y no forzosamente separacin. La trazabilidad de un producto puede mostrar que en sus composicin hay ingredientes diferentes, por ejemplo derivados de OGMs. Lo que suele ocurrir es que se utiliza a la trazabilidad como una herramienta para asegurar la segregacin e identidad de un producto. Para que un programa de trazabilidad se justifique se necesita de la demanda de un sector dispuesto a pagar un precio mayor al normal por una determinada caracterstica de calidad. En el caso de los granos, existen programas para asegurar calidad y origen y recientemente se le ha acoplado un nuevo atributo que es el contenido de OGM. Los niveles requeridos varan de acuerdo al destino del producto. Actualmente stos, van de menos del 0.1% al 5% en algunos casos. En funcin de este requerimiento, se arma un programa de trazabilidad y/o segregacin que requerir de mayores controles cuanto menor

sea el nivel admitido de OGM. Cuanto menor sea el nivel exigido, mayor ser el costo del producto. Esto no slo es por los mayores controles en todo el proceso sino tambin por la mayor cantidad de mercadera que quedar fuera de la tolerancia y que se descartar del programa. El primer paso es identificar los puntos crticos del proceso productivo en los cuales la mercadera pueda sufrir una mezcla accidental que pueda incrementar los niveles de OGM por encima del mximo nivel requerido. En granos, los programas de trazabilidad no se disean para una sola caracterstica. Adems del contenido de OGM, tambin se analiza la pureza del tipo de grano, el contenido de aflatoxinas, ausencia de materiales extraos y contaminantes, etctera. El desarrollo de un programa de trazabilidad implica la participacin y capacitacin de numerosos agentes; entre ellos el productor agropecuario, los transportistas, los acopiadores y, por supuesto, todo el personal que ejecuta y audita el programa. El primer paso del programa, y el ms importante, es el control y seleccin de los lotes de semillas. El contenido de OGM en la semilla determinar el mnimo contenido del producto final, ya que por lo general las mezclas accidentales en el proceso tendern a elevar el contenido de OGM. Por esto, el contenido de OGM en la semilla debe ser holgadamente inferior el mximo nivel admitido al final del proceso. En programas avanzados, la auditora se inicia dentro del semillero multiplicador, controlando las lneas parentales que formarn el hbrido. Controlada la semilla, se reparte entre los distintos productores que participan del programa, quedando registrada la identidad de los lotes y la superficie sembrada de los mismos (algunos programas incluyen los datos de informacin satelital, GPS, para la ubicacin y el seguimiento de los lotes). Una segunda instancia de control es la toma de muestra en precosecha, con el objetivo de corroborar que se utiliz la semilla indicada en el lote asignado y que no hubo mezclas con semillas de otras fuentes. Tambin en este momento se toman muestras de hojas o granos de lotes linderos para

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determinar la presencia o no de material genticamente modificado de la misma especie que pueda mezclarse con el lote del programa por polinizacin cruzada. En caso de que el lote lindero resulte positivo se descartarn del programa las hileras del lote ms prximas al lote lindero para descartar los granos que pudieran haber recibido polen del lote GM positivo. Las cosechadoras y todos los vehculos de transporte de los granos (carros y camiones) deben ser limpiados y controlados de restos de granos de tareas anteriores En el momento de la cosecha los diferentes camiones que ingresan en el acopio con los granos del programa son controlados antes de la descarga mediante ensayos inmunolgicos rpidos ( strips reactivos) para detectar a tiempo posibles errores de destino o identificacin. Una muestra de granos del conjunto de camiones (cada 20 a 30 camiones) se enva al laboratorio para su anlisis por PCR para tener un anlisis ms sensible y cuantitativo. As se van conformando conjuntos con material identificado de mayor cantidad (silos, celdas) hasta lograr el volumen requerido. Del ltimo continente (celda o bodega) se realiza un nuevo ensayo de PCR que confirma el cumplimiento con el nivel de OGM solicitado. Sin embargo, no slo tiene valor el ltimo resultado obtenido de la mercadera sino todos los procesos para asegurar y controlar la calidad realizados a lo largo del proceso de produccin con segregacin y trazabilidad. Por esto, el producto se entrega con una carpeta que contiene toda la informacin generada por el programa de trazabilidad y que valida el ltimo resultado analtico obtenido. Conclusiones Combinando estratgicamente las distintas tcnicas para detectar OGM, en programas sencillos o complejos de trazabilidad, es posible producir granos con distintos contenidos de OGM, segregados del resto de la produccin de commodities (a granel). As es posible abastecer al sector exportador, a los productores de especialidades (speciailties), para quienes es vital que sus productos estn diferenciados e identifica-

dos, o a la industria en general que requiera de un producto diferenciado; mientras al mismo tiempo se producen commodities de precio no diferenciado, aprovechando las ventajas econmicas y tcnicas de la biotecnologa. La trazabilidad y segregacin por contenido de OGM es slo una de las muchas caractersticas que se utilizan para definir productos, y ms all del caso de los productos de la biotecnologa moderna en el contexto actual, uno de los desafios de la produccin argentina de granos y alimentos parece ser la de poder segregar e identificar la mayor cantidad de productos dentro de sus commodities. Finalmente hay que mencionar que los materiales genticamente modificados que no mantengan una equivalencia sustancial con los materiales tradicionales, por definicin, van a ser segregados e identificados de acuerdo a la nueva caracterstica de valor (nutricional, por ejemplo) y sern producidos dentro de distintos tipos de programas con segregacin positiva y de etiquetado de producto para asegurar su pureza, calidad y su valor de uso diferencial. Lecturas recomendadas
A. C. TOZZINI, M.C. MARTINEZ, M.F. LUCCA, C. V. ROVERE, A. J. DISTEFANO, M. DEL VAS and H. E. HOPP. Semiquantitative detection of genetically modified grains based on 35S promoter amplification. www.ejb.org/ content/vol3/issue2/full/6 (2000). A. HOLST-JENSEN, S. RNNING, A. LVSETH and K. G. BERDAL (2003) PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs). Anal. Bioanal Chem 375: 985-993. AGBIOS GM DATABASE: http//64.26.159.139/dbase.php BIOTECNOLOGA CONABIA en www.sagpya.mecon.gov.ar) ECLIPSE PROBES PARA REAL TIME: http://www1.amershambiosciences.com FARID AHMED (2002) Detection of genetically modified organisms in food. Trend in Biotechnology. 20, 215-223. GMO Chip: www.gmochips.org JEANNE JORDAN (2000). Real Time detection of PCR products and microbiology. Journal in Microbiology (review). 61-65. JOHN FAGAN , B. SCHOEL, A. HAEGERT, J. MOORE and J. BEEBY (2001). Perfomance assessment under field

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SRIVASTAVA V, OW DW . Single-copy primary transformants of maize obtained through the co-introduction of a recombinase-expressing construct. Plant Mol Biol. 2001 Jul;46(5):561-6. STRATEGIC DIAGNOSTIC INC: www.sdix.com TAQMAN PROBES: http://www.appliedbiosystems.com TOZZINI, A; MARTNEZ, M. C; ASURMENDI, S; LPEZ, M.V, HOPP; H. E. (2004) Analytical method for detection and quantification of genetically modified organisms in seeds based on PCR. Seed Science and Technology (en prensa) TRAINING COURSE ON GMO DETECTION: http:// gmotraining.jrc.it USDA Guidance document entitled Sampling for the Detection of Biotech Grains http://www.usda.gov./ gipsa/biotech/sample1.htm http://www.usda.gov./ gipsa/biotech/sample2.htm

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