El efecto de diferentes fuentes de carbono y sales en la produccin de naranginasa por Aspergillus niger Biotecnologa Alimentaria

Hernndez Rangel Lessly Karina Loredo Torres Emmanuel Quintero Carrillo Anabel Rojas Vzquez Eva Luz Vega Rivera Carlos Alberto Hernndez Hernndez Juan

INTRODUCCIN
La naringina es un flavonoide (flavanona glicosilada) que se extrae de la cscara de algunos Citricos y es el principal responsable de su sabor amargo. Est presente tambin en la pulpa de los frutos, en hojas, flores y semillas de la planta, la cantidad en cscara vara de mayor a menor en frutos inmaduros y maduros respectivamente .

FLAVONOIDES
Los flavonoides son metabolitos secundarios, se biosintetizan en todas las "plantas terrestres. Poseen propiedades muy apreciadas en medicina, como antimicrobianos, anticancergenos, disminucin del riesgo de enfermedades cardacas, entre otros efectos. Son los causantes de dar el color a las hojas y plantas.

BIOTECNOLOGA ALIMENTARIA
La presencia de la naringina ha sido una limitacin importante en la aceptacin comercial de zumos de frutas ctricas, debido a que es el pricipal glucosido amargo. Para mejorar las propiedades sensoriales y para estabilizar zumo de fruta, el nivel de naringina puede ser disminuido por diferentes tecnologas tales como: Eliminacin del amargor por adsorcin Mtodos qumicos Tratamientos con resina de intercambio inico

Como desventajas tienen los cambios desfavorables en lo sensorial propiedades y valor nutricional (Del Nobile et al., 2003).

USOS DE LA NARANGINA
Usada en perfumera Para dar sabor a golosinas, bebidas y productos de panadera, Propiedad antioxidante como estabilizante de aceites Antimutagnico Como precursor del compuesto naringina dihidrochalcona por su importante capacidad endulzante y para su aplicacin potencial como edulcorante.

NARANGINASA
Naringinasa es una enzima que hidroliza naringina debido a su -Lramnosidasa y actividades glucosidasa.
El -L-ramnosidasa es la enzima que hidroliza naringina en ramnosa y prunin, que la amargura es menos de un tercio de la naringina. Naringinasa se ha aislado a partir de semillas, tejidos animales, plantas y microorganismos (Gallego et al., 2001). Naringinasa es secretada por especies de hongos del gnero Aspergillus y Penicillium. La produccin de naringinasa depende de la fuente de inductor o de carbono determinado para el microorganismo.

MATERIALES Y METODOS

Qumicos Naringina, comercial naringinasa (Penicillium decumbens), ramnosa glucosa, extracto de malta y Agar Sabouraud se obtuvieron de Sigma, St. Louis, EE.UU.. La melaza se obtuvieron de una Miguelito San molino de azcar en el estado mexicano de Veracruz. Todos los dems reactivos utilizados fueron de grado analtico.

Preparacin del inculo de A. niger por turbidimetra

Una suspensin que contiene 9? 108 esporas / mL Se prepar para cada ensayo utilizando turbidimetray la escala de MacFarland, de acuerdo con el mtodo descrito por Sutton (2006), que estableci hasta que la escala de Mc Farland, representa espec co concentraciones. El espectrofotmetro (Thermo Spectronic, Genesys 20) utilizado en la presente estudio fue calibrada para la microbiano estimado concentraciones de medida de la turbidez a 540 nm (Li et al., 1993).

Microorganismo
Aspergillus niger ATCC 1015 se obtuvo a partir de una coleccin de cultivos microbianos, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados (Mxico) y se mantuvieron en medio de Sabouraud a 5oC. Este microorganismo se inform como el cido ctrico y antgeno productor (CDBB: 177). La cepa se cultiva para obtener la cantidad requerida para las fermentaciones.

PREPARACION DEL INOCULO DE A.NIGER POR TURBIDIMETRIA

Una suspensin que contena 9 x 108 esporas/mL fue preparada para cada ensayo usando turbidimetria y la escala de MacFarland (determinan concentraciones especificas). Se midieron a 540 nm.

CONDICIONES DEL CULTIVO

Se esterilizaron 500 mL de BM (medio basal)en un matraz Erlenmeyer de 1000 mL por 15 minutos a 15 psi. El pH inicial del medio fue de 4.5 El medio fue inoculado con 9 x 10 8 esporas. mL -1, suspendido en 85% de cloruro de sodio esteril. Los matraces fueron incubados a 30 C en un agitador por 5 dias.

CRECIMIENTO Y PRODUCCIN DE PROTENA

El crecimiento de A. niger fue determinado por filtracin de 20 mL de cada muestra, , desecndolo durante la noche a 50 C y manteniendo el peso constante. La cuantificacin de protena extracelular fue determinada por el mtodo de Bradford.

ACTIVIDAD ENZIMTICA
Una muestra de 0,5 ml de cada medios de cada medio diferente de fermentacin se mezcl con 1,5 ml de solucin naringine como sustrato de cada reaccin.
La reaccin se lleva a cabo a 35 C durante 15 min. Despus, la reaccin se detuvo por la adicin de 4 ml de cido 3,5-dinitrosaliclico, y se dejo en ebullicin por 5 min. Las muestras fueron ledas a 540 nm.

Cada prueba fue echa por triplicado

CONCENTRACION DE PROTEINA

Se selecciono el medio basal con actividad enzimtica mas alta para concentrar y separar la protena Por cada 100 ml de medio se agregaron 65 gr de sulfato de amonio para precipitar la protena en bao de agua, alcanzando una saturacin del 95% Se hizo una dilisis de nuevo en agua usando una membrana de celulosa (Sigma Qumicos Co). La suspension se centrifugo a 19000 x gr a 5 min 4 C, el sedimento fue resuspendido en buffer citrato 0.05 M pH 6. L Se determinaron proteinas por M. Bradford

RESULTADOS Y DISCUSIONES

CRECIMIENTO MICROBIANO El crecimiento de A. niger ATCC 1015 se observo durante 7 das de fermentacin para todos los tratamientos. Solo cuando las melazas como fuente de carbono fue favorecido significativamente. La adicin de los factores de crecimiento tuvieron un efecto positivo en el crecimiento cuando se hizo uso de las melazas.

Ca

Mg

Se observa mas peso del micelio en carbonato de Calcio

Fig 1. Peso de micelio seco usando como fuente de carbono melazas agregando (0.01 mM.) o (0.01 mM.)

Los resultados no estn de acuerdo con lo que reporta Bram y Solomons en 1965, lo cual reporta que la adicin de los factores de crecimiento, como el 3 y 3 no eran relevantes para la cepa A. niger NRRL 72-4 Los resultados de que ellos dieron se pueden explicar por el hecho de que emplearon concentraciones de sal mas altas (0.5 y 1%). Se observo que las concentraciones de 1 y 0.1 mM no permitan crecimiento.