jotogia Resumen Dactylopius coccus Costa (grana 0 co- chinilla fina), homéptero originario de México, se cultiva sobre nopales para producir dcido carminico. Las especies silvestres de Dactylopius son plaga del nopal y del cultivo de grana fina. En este trabajo estudiamos variacio- nes genéticas entre las poblaciones finasy silvestres de cochinilla, utilizan- do la amplificacién arbitraria de polimorfismos de DNA mediante PCR (RAPD-PCR), sobre el DNA de ninfas ly machos adultos; las ninfas silvestres y los machos de D. coccus presentaron patrones de amplificacion con un nu- mero discreto de bandas polimérficas; mientras que las ninfas de D. coccus mostraron patrones marcadamente polimérficos, 10 cual sugiere gran can- tidad de rearreglos en su DNA. 16 easy eR] DEL See eee an Prati CUP EW ree De ae Ce eC a ca Fernando Garcia, Alterto Rojas, Eduardo Pétriey Fidel Herndndez InTRODUCCION Las cochinillas de! nopal o de la grana son insec- tos homopteros que pertenecen al género Dactylopius; crecen sobre el nopal Opuntia sp., el cual se considera originario de México. La es- pecie Dactylopius coccus Costa 0 grana fina se cultiva para la produccién de dcido carminico, colorante natural con multiples aplicaciones en la industria de alimentos, farmacolégica y de cosméticos (Santibsfiez, 1988). Haste ahora se han descrito varias especies de cochinilla silves- tre, las cuales se identifican de acuerdo con sus caracteristicas morfolégices y segiin la variedad del nopal que parasitan. Las especies silvestres (0. indicus, D. confusus y D. tomentosus) tienen gran velocidad de dispersién y crecimiento, lo que las hace capaces de destruir cultivos de no- pal y de grana fina. La cochinilla silvestre se ha difundido a diferentes partes del mundo debi- do ala introduccién de nopales infestados. Estos insectos presentan resistencia a insectici- das (Brana, Mann y MacGregor, 1975); sin em- bargo, en Sudafrica, las especies silvestres D. austrinus y D. confertus se utilizan para el con- trol biolégico de los nopales Opuntia stricta, O. streptacantha y O. ficus indica que invaden los imaggenpastizales dedicados a la produccién ganadera. En estudios comparativos se menciona que entre 12 especies de in- sectos cactéfagos introducidos, 5 tipos de cochinilla resultaron efectivos para controlar a invasién de estos nopales en los pastizales (Zimmermann, 1998). De las experiencias obtenidas usando Dactylopius para control biolégico, se ha establecido la importancia de con- tar con los medios para identificar las especies de cochinilla, monitorear su y4mica poblacional y favorecer la dis- persion de la especie o especies para Fig 1. Principio de RAPD-PCR Sr > a s FRAGMENTO ALEATORIO DE DNA Biologia controlar una variedad de nopal y evitar interferencia entre las variedades de Dactylopius (Zimmermann, 1991). Estos mismos conocimientos serian utiles en las especies de cochinilla presentes en México, tanto para implementar técnicas de mejoramiento en el caso de D. coccus, como. en el disefio de métodos de control para la cochinilla silvestre. En la técnica de RAPD-PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA by Polymerase Chain Reaction) se busca amplificar secuencias pequefias de DNA de los individuos en estudio para analizarlas y compararlas por electro- foresis. En las bandas del DNA amplificado se identifican secuencias que son constantes (monomérficas) o aquellas que cambian entre individuos (polimérficas) (Fig. 1). 8 oor o S FRAGMENTO ALEATORIO DE DNA INoMOU + TNoW/ove 8 DESNATURALIZACION | ¢ (94°C) 5 3 5 =. 3 AaoRUneo +S WOAH Setincapon Pee 3 2 @+ ; 3 3 | morgage + onthe —_—> SINTESIS DE UNA SOLA ay { ioe AMPLIFICACION + NO AMPLIFICAGION (POLIMCRFISMO ENCONTRADO EN UNO DE LOS IMDIVIDUOS) [== Secuencia de DNA individvo 4 Iniciador de secuencia arbitraria @e = secuoncia de DNA individuo 2 El esquema muestra una de las cadenas de amplifiacién para dos individuos con diferencias en una regién de su DNA, utiizando e ‘mismo iniciador. El iniiador no reconoce una de las cadenas del DNA enel individuo 2, uno de les sitios de acoplamienta por lo que solo amplifica aquella donde si existe reconocimiento entre las secuencias del iniciador y el DNA molde. sedicado a la Investigacion WwBiologia Las secuencias polimérficas corresponden a regiones del DNA que han sufrido cambios a lo largo del tiempo y pue- den funcionar como marcadores genéticos para recono- nes (Williams et a/,, 1990) cer especies y poblai En este trabajo nos propusimos conocer las variaciones que existen a nivel de secuencia de DNA entre individuos y poblaciones de varias especies de Dactyiopius, con el pro pésito de establecer marcadores genéticos utiles para la identificaci6n y seleccién de mejores individuos producto- res de carmin, asi como para conocer la dindmica pobla- cional de las especies de cochinilla. MateRIALES Y METODOS Insectos. Se colectaron 13 individuos del estado ninfal | y 20 machos adultos de la especie D. coccus (grana fina) —obtenidos en el estado de Oaxaca— y 13 ninfas | de la especie Dactylopius sp. (grana silvestre). La cochinilla fina se cultivé sobre cladodios colgados de la especie Opuntia ficus indica dentro de un invernadero, con una tempera- tura anual de 23 °C maxima y 10 °C minima. Los individuos silvestres se obtuvieron de pencas plantadas a cielo abier- to de Opuntia ficus indica (variedad Atlixco) en el munici- pio de Teotihuacan, Estado de México. Aislamiento de DNA. | DNA de los insectos se preparé a través del método descrito por Coen et al., (1982), el cual se basa en la obtencion de un homogeneizado de tejido que es lisado y las proteinas precipitadas con SDS y acetato de potasio. Posteriormente los acidos nucléicos se precipitaron con etanol. RAPD-PCR, Para las reacciones de amplificacién el DNA individual (40-50 ng/jil de DNA genémico por reaccién) fue amplificado en reacciones de PCR seguin técnicas estandar (Ivinson y Taylor, 1992), uti- lizando com® iniciadores 7 oligo- nucledtidos de 10 bp denominados OPAO7, OPA10, OPC11, OPROB, OPAOS, OPB10 Y OPAO2, a partir de un kit de oligonucléotdos (Operon Biotechnologies) disefiados para RAPD-PCR (Black, 1993a). Las reaccio- nes se realizaron en un termociclador Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400, bajo las siguientes condiciones: 1. 95°C por 5 min 2. 92°C por 1 min 3, 35°C por 1 min 4, 72°C por 2 min 5. 72°C por 7 min Las condiciones 2-5 se repitieron 44 veces para un total de 45 ciclos (Black y Duteau, 1996). Andlisis de los fragmentos amp! ficados. E! DNA amplificado obtenido por PCR se analiz6 por electroforesisen geles de agarosa, utilizando un amor- tiguador de corrida TAE 1X (Sambrook et al, 1989). Los geles se tifieron con bromurode etidio, se observaron bajo luz UV y se fotogratiaron. Las bandas polimorficas se registraron individual- mente; los datosse analizaron median- te losprogramas RAPDPLOTy NEIGHBOR; yse construyeron dendrogramas que incluyeron a los individuos de cada poblacién. imaggen