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Guia de Inmuno

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  • SISTEMA DE EVALUACIÓN
  • CONDICIONES PARA PROMOCIONAR
  • CONDICIONES PARA REGULARIZAR
  • CONDICIONES PARA QUEDAR EN CONDICIÓN DE ASISTENCIA CUMPLIDA
  • BIBLIOGRAFÍA FUNDAMENTAL
  • BIBLIOGRAFÍA AMPLIATORIA
  • PROGRAMA ANALÍTICO
  • Conceptos Básicos de Bioseguridad
  • Toma de muestras para la evaluación del Sistema Inmune
  • Técnicas de evaluación de inmunidad innata
  • Complemento
  • Anticuerpos
  • Purificación y fraccionamiento de anticuerpos
  • Proteínas del plasma y suero
  • Electroforesis
  • Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)
  • Introducción a las técnicas serológicas
  • Conversión serológica o seroconversión
  • ELISA
  • RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
  • Inmunocromatografía
  • Inmunohistoquímica
  • Inmunofluorescencia
  • Citometría de flujo
  • Técnica de Seroneutralización
  • Inhibición de la Hemoaglutinación
  • Técnica de Fijación de Complemento

INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2013 La Inmunología estudia un sistema sumamente interrelacionado y dinámico, pero la metodología de estudio por temas

, obliga a separar contenidos íntimamente relacionados que deben ser finalmente integrados. Es importante considerar esta característica desde el primer día de clases para encarar su estudio intentando incorporar paulatinamente los temas y alcanzar la comprensión global. Nuestro objetivo es que puedan comprender el funcionamiento del Sistema Inmune y utilizarlo como herramienta de decisión en el diagnóstico, profilaxis y solución de problemas de la práctica profesional. En la cursada 2013 hemos decidido abordar los contenidos de Inmunología Básica a través de diferentes metodologías de Trabajos Prácticos:  Durante las clases teórico-prácticas se analizarán y resolverán preguntas y problemas en forma grupal. El objetivo de estas preguntas es utilizarlas como eje temático, para que guíen al alumno en el estudio de cada tema. Se espera que los alumnos sean capaces de contestar éstas u otras preguntas similares después de haber estudiado el tema.  Algunas clases consistirán en la discusión de trabajos científicos relacionados con los temas tratados durante el curso. Nuestro objetivo es que comprendan la metodología de trabajo y de investigación en Inmunología y que a través de esta discusión puedan integrar contenidos de la materia.  Los trabajos prácticos de laboratorio serán realizados en forma directa por los alumnos y supervisados por los docentes. Los alumnos, formarán grupos de trabajo y presentarán un informe por cada trabajo práctico realizado en el laboratorio. La presente guía de Inmunología está destinada a facilitar el abordaje de los contenidos que se tratarán en las clases prácticas, por lo que es complementaria y de ninguna manera reemplaza a la bibliografía recomendada. Esperamos que la información presentada en esta guía les sea útil. Si tienen dudas o dificultades, acerquen sus inquietudes a los docentes participantes del curso y responsables de la redacción de la presente guía. La Sra. Viviana Chevaga, secretaria del área, los orientará administrativamente en el horario de 13.30 a 19.30 en forma telefónica (4524-8450) o por mail a inmuno@fvet.uba.ar.

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Docentes del curso 2013
Dra. Med. Vet. Silvia L. Mundo Dra. Lic. Silvia Colavecchia MS. Méd. Vet. Adriana M. Fontanals Dra. Méd. Vet. Ana M. Jar MS.Vet. Ana Jolly Vet. Laura Bass Vet. Bárbara Fernández Med. Vet Liliana Gilardoni Vet. Lucas Goldman MS. Méd. Vet. Federico Hoffman Med. Vet. Liliana Ramayo Vet. Pablo Regner Vet. Ana Stempler Med. Vet. Adriana Suraniti Alumna María Laura Fortuny Profesora Adjunta a cargo J.T.P. J.T.P. J.T.P. J.T.P. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 2da

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INDICE
Sistema de evaluación Condiciones para promocionar Condiciones para regularizar Condiciones para quedar en condición de asistencia cumplida Bibliografía fundamental Bliografía ampliatoria Programa analítico Conceptos básicos de bioseguridad Toma de muestras para la evaluación del sistema inmune Técnicas de evaluación de inmunidad innata Complemento Anticuerpos Purificación y fraccionamiento de anticuerpos Proteínas del plasma y suero Electroforesis Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) Introducción a las técnicas serológicas Diliciones Conversión serológica o seroconversión Sensibilidad y especificidad ELISA RIA (radioinmunoensayo) Inmunoblot Inmunocromatografía Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Citometría de Flujo Técnicas de interacción secundaria: precipitación y aglutinación Grupos sanguíneos Linfoproliferación Técnica de seroneutralización Inhibición de la hemoaglutinación Técnica de fijación de complemento 4 4 4 4 5 5 5 8 12 16 23 25 27 36 37 42 48 48 50 52 53 62 63 66 67 69 73 79 90 94 98 104 106

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 Aprobar los parciales con por lo menos el 80% de los contenidos de cada uno. Microbiología.  Aprobar un coloquio integrador en fecha a convenir con los alumnos. c) Dos parciales obligatorios. b) La aprobación de los informes de laboratorio. Los días de laboratorio. CONDICIONES PARA PROMOCIONAR  Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos.  Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos prácticos de laboratorio.  Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos prácticos de laboratorio. CONDICIONES PARA REGULARIZAR  Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos  Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos prácticos de laboratorio. REQUISITOS PARA DAR EL FINAL APROBADAS: Fisiología. REQUISITOS PARA CURSAR REGULARES: Parasitología Fisiología Microbiología APROBADAS: Quìmica biológica Histología SISTEMA DE EVALUACIÓN Los alumnos serán evaluados a través de: a) El desempeño en los trabajos prácticos. 4 .  Aprobar los parciales con por lo menos el 60% de los contenidos. CONDICIONES PARA QUEDAR EN CONDICIÓN DE ASISTENCIA CUMPLIDA  Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos. No olvide traer el guardapolvo.Técnica de polarización fluorescente Citotoxicidad Técnicas para la detección de anticuerpos maternales Inmunoelectroforesis Ejercicos y problemas de aplicación Guía de Lectura para un trabajo científico modelo 109 112 117 120 124 142 El cronograma de las clases se encuentra en el diarito y aparacerán en cartelera web. Parasitología. consulte con su docente dónde y en qué horario debe concurrir.

A. Mecanismos celulares: fagocitosis y lisis. TIZARD. PARSLOW T. 2008. TRAVERS P. Editorial Manual Moderno. “Clinical Immunology of the Dog and Cat” 2da. REGUEIRO GONZALEZ J. Glándulas de Harder. 10ma ed. 8Va. “Inmunología Veterinaria”.. Diferencias en las especies domésticas: Bolsa de Fabricio. Edic. 2010   BIBLIOGRAFÍA AMPLIATORIA  ABBAS. 2008. PROGRAMA ANALÍTICO      Unidad 1: Mecanismos de Defensa  ÓRGANOS Y TEJIDOS LINFOIDES Órganos linfáticos primarios y secundarios: Estructura. PILLAI.. adaptabilidad y memoria.  SISTEMAS INMUNES Barreras naturales: piel y mucosas. MURPHY K. “Inmunología: Biología y Patología del Sistema Inmunitario”. Editorial Panamericana. proteínas de fase aguda. 5 .. MARTINEZ NAVES E. 2008.. ed. 6ta. Citotoxicidad natural. Edic.. Guía de Trabajos Prácticos. 2010. ed. ed. Patrones de migración celular: moléculas asociadas. LOPEZ LARREA C. Editorial Mc Graw Hill. Ganglios linfáticos en cerdos. 2010 ROITT I. ed. Editorial Harcourt Grade de España SA. 2005. A.. 11va. “Inmunología Celular y Molecular”. I.  SISTEMA INMUNE ESPECIFICO Propiedades: especificidad.BIBLIOGRAFÍA FUNDAMENTAL  FAINBOIM. interferones. Importancia de la respuesta T gama-delta y LB1 en las especies domésticas y de producción.. L.J. Editorial Elsevier... “inmunología. Mecanismos humorales: vía alternativa del complemento. STITES D. Editorial Blackwell. GONZALEZ RODRIGUEZ S. WALPORT M. J. Organización clonal. Editorial Panamericana... 5ta Edic. 2005 editorial Médica Panamericana. Moléculas de superficie: concepto de receptor. “Inmunología Básica y Clínica”. 7ma. DAY M. 4ta.  FILOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA  ONTOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA EN LAS ESPECIES DOMESTICAS Y DE PRODUCCIÓN. Células que reconocen al antígeno en forma específica: Linfocito B (LB). LICHTMAN. S. “Introducción a la Inmunología Humana”. 2009. y GEFFNER.. Área de Inmunología. 592PP. Fundamentos”. Linfocito T (LT). “Inmunobiología de Janeway”.

hipermutación. Colaboración T-T: Citotoxicidad ejercida por LT citotóxicos. Mapa genético en las especies domésticas y de producción. Splicing alternativo. Tipos de Antígenos: propios (de órgano. CD4. IgY en aves e Igs en camélidos. Estructura físico-química: cadenas pesadas y livianas. Funciones biológicas de las diferentes clases de Igs.  ANTICUERPOS Inmunoglobulinas (Igs) de membrana y secretadas. Influencia del antígeno y el microambiente en la cooperación celular: Perfiles Th 1 y Th 2. conversión génica. Interleuquinas. de la madre al feto en las especies domésticas. Función. Distribución en el organismo. del calostro y leche. Exclusión alélica. Ontogenia del linfocito B.  PASAJE DE IGS MATERNO FETAL. dominios constantes y variables. de transplantes).Unidad 2: Inmunoquímica  ANTÍGENOS Antigenicidad e Inmunogenicidad. Memoria inmune. La Ig como antígeno: isotipo.  MECANISMOS DE AUTOTOLERANCIA  PROCESAMIENTO Y PRESENTACION ANTIGENICA Vía endocítica y vía biosintética. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).  MADURACION DE LOS LINFOCITOS T Generación de diversidad de los receptores T. diversidad N-Terminal. Haptenos. Moléculas de histocompatibilidad no clásicas. de género H-Y) y extraños (de patógenos. Colaboración T-B: Activación de LB y producción de Igs: Switch isotípico.  RECEPTOR ANTIGENICO DEL LT Estructura. alotipo e idiotipo. Estructura físico-química de los antígenos. Carriers. Técnicas de determinación de la ingestión de calostro. Composición en Igs. Complejo mayor de histocompatibilidad: nomeclatura y herencia. Mecanismos característicos en las diferentes especies. Unidad 4: Respuesta Inmune  COLABORACIÓN CELULAR Activación de los LT. Neutralización. moléculas asociadas (CD3. 6 . Características de las Igs en las diferentes especies domésticas y de producción: IgT en equinos. de grupos sanguíneos. Localización. de tumores. Clases y subclases. CD8) y otras moléculas de adhesión. Activación del Complemento. Incidencia de los diferentes tipos de placentación en el pasaje de Igs. exclusión isotípica. Concepto y tipos de determinantes antigénicos.  MOLECULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Moléculas de histocompatibilidad clase I y clase II: Estructura. Antígenos timodependientes y timo-independientes. Importancia de la ingestión de calostro. Colaboración T-Macrófagos: Macrófagos activados. Unidad 3: Moléculas de membranas relacionadas con el reconocimiento antigénico  MADURACION DE LOS LINFOCITOS B Generación de diversidad de las Igs: Recombinación somática.  RESULTADO DE LA UNION DEL ANTICUERPO CON EL AG. Opsonización. Educación tímica de los LT.

Regulación en sitios privilegiados: ojo..  RESPUESTA INMUNE A TUMORES Unidad 6: Respuesta Inmune a Patógenos  RESPUESTA INMUNE A BACTERIAS.  CINÉTICA DE LA RESPUESTA INMUNE Respuesta inmune sistémica.  TRANSPLANTES Mecanismos de rechazo del injerto.  INMUNODEFICIENCIAS Inmunodeficiencias primarias y secundarias.  HIPERSENSIBILIDAD TIPO V Anticuerpos anti-receptores. sistema nervioso central.  INMUNOPROFILAXIS ACTIVA Tipos de vacunas. placenta.  HIPERSENSIBILIDAD TIPO III Daños por complejos inmunes en enfermedades autoinmunes y en enfermedades infecciosas crónicas.  HIPERSENSIBILIDAD TIPO II Daños por anticuerpos en enfermedades autoinmunes y en reacciones alogeneicas. Ejemplos de enfermedades autoinmunes específicas de órgano y sistémicas. Mecanismos de evasión. Respuesta inmune en mucosas: características diferenciales en las especies domésticas.  ELABORACIÓN DE SUEROS HIPERINMUNES Uso de aves en la elaboración de sueros hiperinmunes.  HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV Bases celulares de la hipersensibilidad retardada. Anemia hemolítica en equinos y cerdos. Niveles de Igs: retroalimentación. Consecuencias desfavorables. Virus inmunosupresores que afectan las diferentes especies. PARÁSITOS Y HONGOS Antígenos involucrados. Granuloma tuberculoso. Unidad 5: Daños producidos por el Sistema inmune  HIPERSENSIBILIDAD TIPO I Alergia. Regulación extrínseca: neuroinmunoendocrinología. Mapeo de epitopes. Shock anafiláctico: Órgano de choque en las diferentes especies. Producción de anticuerpos por biotecnología. Regulación por linfocitos T (Th 3). Piómetra en caninos. 7 . Unidad 7: Inmunoprofilaxis  INMUNOPROFILAXIS PASIVA Ventajas e inconvenientes de su uso. Vacunas inactivadas. VIRUS. Dermatitis por pulgas en caninos. REGULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE Regulación intrínseca: Efecto de la desaparición del Ag.  FENÓMENOS DE AUTOINMUNIDAD Concepto. Inmunidad específica. Ciclo biológico del patógeno. Inmunidad innata. Ventajas e inconvenientes de su uso: Vacunas atenuadas.

Aplicaciones. Cromatografía. Por ello. equipo de protección y 8 . Vacunas recombinantes (a vectores). su patogenia y otros factores como las maniobras o procedimientos empleados. Seroneutralización. Uso de adyuvantes. Linfoproliferación. el medio ambiente e incluso toda la comunidad. Aglutinación. se efectúa una evaluación de los riesgos biológicos para darles a las personas una contención (instalaciones. Requisitos de bioseguridad. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). Reacciones adversa a la vacunación. Seroprotección.  ADMINISTRACIÓN DE VACUNAS Vías de inmunización.  TÉCNICAS DE INTERACCIÓN (AG-AC) SECUNDARIA Inmunodifusión. Inmunofluorescencia. Citotoxicidad. Detección de la respuesta inmune frente a patógenos.  HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS MONOCLONALES Hibridomas: Producción y selección. Vacunas a DNA desnudo. Controles durante las diferentes etapas de producción.  METODOLOGÍA DE PREPARACIÓN DE VACUNAS Proceso de producción de inmunógenos a escala industrial. Unidad 8: Técnicas Inmunológicas de Diagnóstico  TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE IGS. Anticuerpos monoclonales: Producción. Precipitación salina. Vacunas mixtas. Intradermorreacción. Intradermorreacción. Conceptos Básicos de Bioseguridad Cuando en un ambiente se manipulan agentes infecciosos se producen una serie de riesgos a los que están expuestas las personas. esterilidad y potencia. Esquemas de vacunación en las diferentes especies animales.Vacunas a subunidades. Evaluación del resultado de la inmunoprofilaxis.  TÉCNICAS DE INTERACCIÓN (AG-AC) PRIMARIA Técnicas inmunoenzimáticas: ELISA. Radioinmunoensayo. Las Normas de Bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso. Aprobación de vacunas por organismos oficiales. Inmunoelectroforesis. Inmunoblot. Métodos de atenuación. Inmunohistoquímica. Fracasos de la vacunación. Métodos de inactivación.  TÉCNICAS DE INTERACCIÓN (AG-AC) TERCIARIA Inhibición de la hemoaglutinación. Vacunas a péptidos. Diagnóstico de hipersensibilidades. Citometría de flujo. Lisis por Complemento. Controles de inocuidad. Fijación de Complemento.  TÉCNICAS CELULARES Fagocitosis. Estos riesgos varían según el agente. Electroforesis.  APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS Evaluación del sistema inmune en un individuo. Vacunas deleteadas.

Cryptococcus neoformans. Grupo 2. Toxoplasma. Candida sp.). son capaces de originar patologías infecciosas humanas de gravedad moderada o limitada. perteneciendo a la propia flora habitual del hombre. y suponen un serio peligro para otras personas expuestas. etc. de tres elementos de seguridad biológica: la técnica microbiológica.prácticas de trabajo) que reduzca la exposición hasta límites mínimos. Chlamydia trachomatis. a) Nivel de contención 1: Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo 1. Generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Subtilis. coli K12. b) Nivel de contención 2: Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que. etc. El propósito de la contención es reducir al mínimo la exposición del personal de los laboratorios. Coccidioides inmitis. Clostridium sp. que consisten en la combinación. Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patógenas (E. con muchas probabilidades de que se propague a la población. en menor o mayor grado. Ejemplos: Bacillus subtilis. Ejemplos: Actinomyces sp. Enterobacterias. c) Nivel de contención 3: 9 . causan enfermedades graves en el hombre. El término "contención" se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. a agentes potencialmente peligrosos. de otras personas y del entorno. Aquéllos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden suponer un peligro para las personas expuestas. Virus de la encefalomielitis equina. Histoplasma capsulatum. Shigella sp. B. Cada combinación está específicamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan. de forma que estén expuestos al menor riesgo posible (aclarando que. Grupo 3. Salmonella sp. Bacteroides sp. especialistas en Microbiología) y son los que con más frecuencia se estudian en el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario (Ascaris sp. Machupo y Ebola. con riesgo de que se propaguen a la población. Saccharomyces sp. Generalmente no se cuenta con profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Brucella sp. etc. Ejemplos: Virus de Lassa. Neisseria meningitidis. embutidos. Generalmente existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos típicos son todos los microorganismos que se utilizan en la industria de la alimentación para la elaboración de quesos. el equipo de seguridad y el diseño de la instalación. Se suelen describir cuatro niveles de contención o de seguridad biológica. Naegleria sp. el riesgo cero no existe). Salmonella. siendo poco probable que se propaguen a la población. Estafilococos.). Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y bovis. Grupo 4. Microorganismos que pueden causar enfermedades graves en el hombre y presentan un serio peligro para las personas expuestas. cerveza. Agentes que. las vías de transmisión de los agentes infecciosos y la función o actividad del laboratorio. Saccharomyces cerevisiae. Microorganismos que presentan poca probabilidad de causar enfermedad en el hombre. Clasificación de agentes biológicos Los agentes biológicos se clasifican en grupos según su peligrosidad hacia el hombre: Grupo 1. Niveles de contención El primer principio de Bioseguridad es la contención. Deben ser manipulados por personal especializado (técnicos de laboratorio.

de alta mortalidad y para la cual no existe tratamiento o el tratamiento existente es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. son analizadas por laboratorios de diagnóstico externos a la clínica. orina. producción y exposición. Además. con aire acondicionado independiente. Es común la toma de muestras (sangre. Por ello. el profesional se encuentra expuesto a agentes patógenos pertenecientes a los grupos 2. materia fecal. el profesional veterinario tiene que tener una clara conciencia del riesgo de su profesión y conocer en cada una de sus actividades los riesgos a los cuales puede verse expuesto. 10 . Agentes del grupo 4 ó animales de experimentación infectados con ellos: Ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo.  Si se toman muestras de orina o muestras de órganos para diagnóstico histopatológico (conservados en formol al 10%). debe desinfectarse la camilla y todos los elementos empleados durante la consulta. Por esto. etc. etc. etc. que son potencialmente peligrosos tanto para él mismo como para sus pacientes y otras personas. con gradiente de presión. preferiblemente de telgopor (con refrigerantes.Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biológicos del grupo 3.  Todas las muestras deben remitirse dentro de cajas. deben incluirse en este nivel de contención los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran propiedades patógenas que los eleven al grupo 4. tuberculosis. En los Laboratorios de Diagnóstico Veterinario debe evitarse la contaminación ambiental y la infección del operador con patógenos como M. en general. etc. que produce una enfermedad infectocontagiosa. virus Ebola. su forma de transmisión. cabinas de seguridad. Nunca se deben colocar muestras de diferentes órganos en la misma bolsa. En la práctica veterinaria diaria. por lo tanto debe evitarse la diseminación de patógenos durante su traslado:  Los tubos de sangre deben estar correctamente tapados e identificados. es decir. se podrán realizar las acciones correspondientes a fin de prevenirlas. Virus de la encefalomielitis equina. d) Nivel de contención 4: Es el nivel requerido cuando se trabaja con un agente patógeno exótico o no.  Las muestras de órganos remitidas en frío para diagnóstico microbiológico deben colocarse en bolsas plásticas cerradas. los frascos deben estar cerrados herméticamente. Brucella sp. Sólo si se conocen las posibles enfermedades a las que se expone el veterinario. Un ejemplo sería Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso terapéutico. Bioseguridad en el consultorio veterinario. de difícil y largo tratamiento. que pueden curar con secuelas y son capaces de producir la muerte. las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulación y la utilización de cabinas de seguridad.) para efectuar análisis complementarios que ayuden al diagnóstico o al seguimiento de un caso clínico. 3 y eventualmente al grupo 4. sin recirculación de aire. Por lo tanto. cuando se requiera) y adecuadamente precintadas para evitar su apertura accidental. Estos microorganismos sólo pueden ser procesados por personal calificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contención 3. El mayor y más frecuente peligro que entrañan éstos es la infección adquirida a través de aerosoles y fluidos biológicos. microorganismos que cursan con patologías graves. Durante la revisación clínica se contaminan las manos del profesional. deben tomarse todas las precauciones y establecer y respetar medidas de contención adecuadas para evitar el riesgo de la diseminación a la comunidad. El inicio de algunas enfermedades profesionales es lento y muchas veces enmascarado por otros trastornos físicos. Nunca se debe enviar la sangre dentro de la jeringa de extracción. biopsias. Asimismo. Estas muestras. por lo tanto deben lavarse entre la atención de pacientes.

inmunización o provisión de servicios. (Ley 154 de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. hemoterapia. Desinfectarlas y lavarlas muy bien luego del uso. jeringas. El tratamiento de estos residuos es llevado a cabo por empresas especializadas que cuentan con la infraestructura necesaria para esterilizarlos sin riesgo de eliminar patógenos al medio ambiente. objetos cortantes o punzantes. 18 de febrero de 1999). en agua a 90ºC. Residuos patogénicos son. cepos. Estas bolsas se colocan en cajas de cartón o en recipientes plásticos debidamente sellados e identificados. etc. Bioseguridad en la producción agropecuaria Son varias las zoonosis que el profesional puede adquirir durante prácticas rutinarias en la producción agropecuaria. tratamiento. edad. que se generen en áreas de alto riesgo infectocontagioso (Niveles de bioseguridad 3 y 4). La práctica dependerá de la enfermedad de la que se sospeche. verificar que no tengan pérdidas cuando se inyecta.  Enterrar o incinerar los cadáveres de animales sospechosos de haber muerto por enfermedades infecciosas graves o zoonóticas. que sean generados en la atención de la salud humana o animal por el diagnóstico. puertas laterales. gasas. Todos los residuos patogénicos deben colocarse en bolsas rojas de más de 120 micrones de espesor. toxicidad o actividad biológica que puedan afectar directa o indirectamente a los seres vivos o causar contaminación del suelo. así como también en la investigación o producción comercial de elementos biológicos o tóxicos”.  Algodones.  Luego del trabajo en la manga. materiales descartables y otros elementos que hayan estado en contacto con agentes patogénicos y que no se esterilicen (Nivel de bioseguridad 3). de manera que el destinatario esté advertido de los riesgos potenciales antes de tomar contacto con la muestra.  Frascos de medicamentos y vacunas vacíos.  Revisar el estado de la manga.  Usar mameluco descartable o de algodón resistente al lavado intenso y botas de goma. separada de otras. vendas. Esta actividad está reglamentada en la ley Nº 154 de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. líquido o gaseoso que presumiblemente presenten o puedan presentar características de infecciosidad. sintomatología observada. andenes.  Restos orgánicos provenientes del quirófano.  No reutilizar las jeringas descartables. anatomía patológica. Los residuos patogénicos deben tratarse de manera especial hasta su destino final.  Restos. 11 .  Comprobar el buen funcionamiento de las jeringas metálicas. Las muestras deben ir acompañadas de un protocolo de remisión de muestras que incluya el tipo de muestra que se envía. Esta reseña debe contener la especie animal de la que provienen las muestras.  Restos de animales provenientes de clínicas veterinarias. el análisis solicitado y una reseña clínica del caso. Residuos patogénicos: “Son considerados residuos patogénicos todos aquellos desechos o elementos materiales en estado sólido. centros de investigación y académicos.  Todos los residuos. del agua o de la atmósfera. por lo tanto también deben tomarse precauciones. morgue. sexo. semisólido. hallazgos de necropsia y el diagnóstico presuntivo. de servicios de hemodiálisis. por ejemplo:  Los provenientes de cultivos de laboratorio. desinfectar las botas y colocar la ropa en una bolsa plástica y luego lavarla. cualesquiera sean sus características. carcasas y excrementos de animales de experimentación biomédica.  Usar guantes para realizar tacto rectal o necropsias. En general los residuos patológicos son incinerados en hornos a temperaturas mayores a los 1200ºC que dejan como residuo vapor de agua y cenizas inocuas (hornos pirolíticos). restos de sangre y sus derivados.

por lo cual es el primer tema que se trata. Toma de muestras para la evaluación del Sistema Inmune La toma de muestras es el primer paso antes de indicar cualquier prueba de laboratorio. carcinogénica. inocua. etc.  Nunca pipetear con la boca.. para buscar anticuerpos). obteniendo como resultado: presencia o ausencia de anticuerpos. se realiza con dos objetivos principales: 1. si la técnica es cualitativa.Identificar y tipificar antígenos en una muestra: por ejemplo. la fecha de vencimiento y la peligrosidad de la solución o sustancia química (irritante. antes de empezar a trabajar. se nombran a continuación algunos conceptos a tener en cuenta en la toma de muestras. Por lo tanto. como primer paso. los miligramos de anticuerpos específicos. En estos casos se utilizan anticuerpos específicos contra el patógeno o contra subtipos o cepas del mismo. etc. 12 . el título de estos anticuerpos. sin ella no hay sustrato sobre el cual comenzar a trabajar. usar pipetas automáticas. y la obtención de suero a partir de sangre es frecuente en inmunología (por ejemplo. beber o fumar en el laboratorio. Se entiende la importancia de detenerse en algunos puntos sobre ellas si se piensa qué pasaría si se cometen errores durante su recolección: el estudio de muestras inapropiadas o mal conservadas puede llevar a resultados falsos que invaliden la prueba. por ejemplo: anticuerpos anti–Brucella abortus.  Debe usarse guardapolvo u otra indumentaria diferente a la ropa de calle. si la técnica es semicuantitativa. propipetas o peras de goma. la evaluación de la respuesta inmune sistémica se realiza a partir de sangre periférica.).  Luego de trabajar. si la técnica es cuantitativa. Se hace hincapié en las muestras de sangre y suero ya que.  Rotular todos los frascos utilizados en el laboratorio indicando su contenido. Bioseguridad en el laboratorio de diagnóstico El laboratorio de diagnóstico recibe muestras que deben ser consideradas como potencialmente peligrosas y deben tomarse todos los recaudos necesarios para evitar el contagio y la diseminación de los agentes infecciosos.  Luego de procesadas. Parvovirus canino o Coronavirus bovino en materia fecal.  Utilizar guantes para manipular las muestras. la fecha de apertura o preparación.  No comer. Remitir las muestras al laboratorio siguiendo las indicaciones descriptas anteriormente. desinfectar las mesadas y todos los elementos utilizados. Identificar la producción de anticuerpos específicos contra un determinado patógeno. en laboratorios de inmunología. En el caso del diagnóstico de enfermedades infecciosas: . anticuerpos anti–Virus de la Fiebre Aftosa. tratar las muestras como residuos patogénicos. Las pruebas sobre estas muestras.

especie. sino también adjuntar fecha. La presencia de hemoglobina puede afectar algunos resultados. .Rotular las muestras de forma inequívoca y acompañar las muestras con el correspondiente protocolo que contenga la mayor cantidad de información posible. relación CD4/CD8. Es por eso que. ovinos. el manipuleo brusco y la formación de espuma cuando trasvasamos la muestra de la jeringa al tubo de ensayos pueden producir hemólisis. . .Las pruebas que requieren células viables hacen necesario que la sangre se transporte en hielo hasta el laboratorio en pocas horas.Trabajar cuidadosamente para obtener la muestra en las condiciones más asépticas posibles. previo a la extracción debe ser consultado el laboratorista. *Tomar la muestra correcta.2. De acuerdo con estos objetivos.Determinar la relación entre las células pertenecientes al sistema inmune. consecuente con la toma de muestras se describirán las técnicas. según las especies y en orden creciente es: equinos. En el caso de la evaluación del sistema inmune (SI): . Es por ello que es importante conocer algunos conceptos básicos para que la maniobra realizada resulte en datos que nos puedan servir de base para formular un diagnóstico exacto. Es importante aclarar no sólo las pruebas que se solicitan al laboratorio. Si esto no es posible. Se realiza en razón de múltiples objetivos. Los más usados son los quelantes del Ca++ como el citrato de Na o la solución de Alsever que tiene glucosa para proteger a los eritrocitos y citrato de Na como anticoagulante.Consultar con el laboratorio que procesará la muestra. por ejemplo. quien indicará el más conveniente para las pruebas que deba realizar. Conocer la técnica que se va a usar permitirá: *Elegir la técnica más adecuada. esto es de particular importancia en los estudios que impliquen evaluación de células o de los factores del complemento. sexo.Determinar los niveles de inmunoglobulinas en general o de alguna clase de inmunoglobulina en particular. Algunas de las pruebas realizadas en los laboratorios de Inmunología clínica deben tener una notificación previa (como la prueba de estimulación de linfocitos) y requieren del envío de una muestra control junto con la muestra del paciente.Tener en cuenta que lo óptimo es obtener la muestra en el mismo laboratorio para evitar el deterioro que sufre durante el envío. . Cuando la muestra debe ser extraída con anticoagulante. midiendo su proliferación o la producción de citoquinas. Esto es crítico cuando se deben hacer sangrías sucesivas a pequeños animales. . La susceptibilidad a ésta. diagnóstico 13 . felinos y caninos. . entre los cuales tenemos desde una prueba bioquímica hasta un examen de funcionalidad celular.Extraer la cantidad mínima necesaria para las pruebas. bovinos. .Evaluar la funcionalidad de las células del sistema inmune. el nombre de la mascota en tratamiento. se debe enviar la muestra acondicionada del modo más conveniente para cada caso y lo más rápidamente posible. aves. . A continuación se enumeran algunos consejos particularmente útiles: . Toma de muestras de sangre: La toma de muestras de sangre es una de las prácticas más habituales en la clínica diaria. por ejemplo. según el objetivo del inmunodiagnóstico. varía la manipulación y preparación de las muestras. El uso de elementos sucios o mojados (excepto con anticoagulantes). *Evaluar los resultados de forma de cumplir los objetivos planteados. cuando queremos saber si un animal tiene niveles normales de IgG en suero. Es común observar que los profesionales remitan muestras en las cuales sólo se detalla.Evitar la hemólisis. Siempre es recomendable usar jeringas y agujas descartables o esterilizadas por calor seco. por ejemplo. ya que es necesario conocerlas para saber qué muestra tomar y cómo prepararla.

sí la hay durante cada ciclo de congelación – descongelación. pero en general se pueden fijar con calor o con distintos alcoholes. Para esto se utilizan las últimas gotas de sangre que quedan en la aguja. para obtener la mayor retracción del coágulo. Los extendidos fijados son de estabilidad casi indefinida.presuntivo y una breve reseña del caso en cuestión. 14 . ya que esto será de suma utilidad a la hora de interpretar los resultados por parte del personal del laboratorio. (Se adjunta como ejemplo el protocolo de envío de muestras utilizado en el servicio que brinda el área de Inmunología). estos extendidos son estables aún si no están fijados. nunca congelada.p. Si no se va a usar dentro de ese lapso. Para los exámenes serológicos de diagnóstico específico no tiene mayor importancia. Para obtener la mayor cantidad posible de suero. lo mejor es enviar el suero ya separado. También se puede enviar la sangre entera. se puede centrifugar el tubo (a 3000 r. El suero puede mantenerse a 4oC durante 48-72 horas. Pueden teñirse hasta varios días después si se conservan secos y protegidos de la humedad. Preparados correctamente.m. pero para exámenes electroforéticos conviene evitar el congelamiento si es posible Es conveniente aclarar en el protocolo si la muestra ha sido congelada o mantenida a 4oC y cualquier otra observación que se considere necesario. se coloca el tubo en una estufa a 37oC durante 30 minutos a 1 hora y luego. siempre que no se tarde más de unas pocas horas. Envueltos en papeles limpios y colocados en un recipiente hermético. conviene agregarle una pizca de azida sódica (este conservante puede ser tóxico por lo que es conveniente consultar al profesional del laboratorio antes de hacerlo). El método de fijación puede variar según la tinción. se la deja coagular. durante 30 minutos) o extraer directamente el suero (sobrenadante) con una pipeta. pueden remitirse por correo. se lo deja en heladera (4 oC) durante una noche. el suero debe congelarse a temperaturas inferiores a -20oC (lo óptimo es a 70oC). En ambos casos debe operarse cuidadosamente tratando de evitar tocar el coágulo para no producir hemólisis. Una vez formado el coágulo. La sangre entera se conserva refrigerada. A partir de aquí. se lo desprende del vidrio con la ayuda de una aguja o varilla. junto al animal. Si bien a estas temperaturas prácticamente no hay degradación proteica. pero si se prevén demoras entre la extracción y la llegada al laboratorio. Extracción de Suero: Para extraer el suero de la sangre total obtenida. Si hay riesgo de contaminación. Extendidos de Sangre: Los extendidos de sangre conviene hacerlos inmediatamente después de extraída la muestra.

.......................... Teléfono:.......................................................................................................................................................................................................................................................................... 15 .... Teléfono:............................................................................................................................................................................................. MEDICACIÓN RECIBIDA:..................................................................Ej...................................................................................................................................................................................................................................... Pertenece al Hospital Canepa: SI – NO N° de Historia Clínica:....... Sexo: M H DATOS DEL PROPIETARIO Apellido y Nombre:..... DATOS DEL PACIENTE Especie: C F Raza:................................................................... ANALISIS COMPLEMENTARIOS REALIZADOS:.............. DIAGNOSTICO PRESUNTIVO:............................................................ Observaciones de la muestra:......................................................................................................................................... Muestra remitida:............................................. : PROTOCOLO DE ENVÍO DE MUESTRAS FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS AREA INMUNOLOGÍA SERVICIO DE DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO N° DE PROTOCOLO Fecha de recepción: / / Examen solicitado:...................................................................................................... Edad:.......................................................... DATOS DEL PROFESIONAL Apellido y Nombre:........................

C3bi. el sistema inmune de los vertebrados ha evolucionado para contrarrestarlo. Ambos mecanismos son independientes de la polimerización de la actina.Técnicas de evaluación de inmunidad innata La respuesta inmune innata representa la primera línea de defensa del huésped a la infección. En cambio. las proteínas de unión al lipopolisacárido (LBP) y proteínas de alto peso molecular llamadas fibronectinas. Estas moléculas pueden ser vistas como firmas moleculares de los microorganismos invasores. entre ellas. los receptores de tipo Toll (TLR) son capaces de reconocer distintos PAMPs. El LBP se une al LPS bacteriano y aumenta la unión de éstos a la molécula de CD14 presente en la membrana de las células fagocíticas. Las principales opsoninas son los anticuerpos (IgG e IgM).) y las proteínas de fase aguda. Entre las proteínas de fase aguda se encuentran la proteína C reactiva. la fagocitosis. ocurre por mecanismos dependientes de la actina. Por ejemplo. La 16 . Entre los PRRs se describen varias familias. La partícula puede ser degradada o no luego de la fagocitosis dependiendo de la naturaleza de la misma. etc. el TLR 2 reconoce peptidoglicano y ácido lipoteicoico del S. macrófagos y neutrófilos a los que se los denomina fagocitos profesionales. Las células más eficientes para fagocitar partículas son los monocitos. muchos de ellos tratan de evadir el reconocimiento que es la primera etapa de la fagocitosis. Esta capacidad inherente del sistema innato se debe a su habilidad de reconocer estructuras muy conservadas y compartidas por diversos patógenos. células muertas y partículas inertes como el carbón. Mediante el proceso de pinocitosis ingresan a las células fluidos y solutos. Por medio de la endocitosis mediada por receptores específicos. Las partículas pueden ser bacterias. Se conocen factores séricos denominados opsoninas que favorecen el reconocimiento e ingestión de microorganismos. Si bien las bacterias de distintas cepas presentan algunas diferencias estructurales. El reconocimiento de los PAMPs está mediado por estructuras también muy conservadas en la evolución y que son conocidas como receptores para el reconocimiento de patrones (PRRs. acrónimo proveniente del nombre en ingles: pattern recognition receptors). El TLR 4 reconoce LPS de bacterias gram negativas incluyendo a E. etc. acrónimo proveniente del nombre en ingles: pathogen associated molecular patterns) entre los que podemos ejemplificar a componentes de la pared bacteriana como lipopolisacáridos (LPS). el sistema inmune innato puede responder a muchas infecciones sólo con un repertorio limitado de receptores. Al menos diez miembros de la familia de TLR se identificaron en mamíferos y cada miembro es capaz de reconocer distintos PAMPs. solutos y partículas desde el medio externo son: pinocitosis. entran a la célula macromoléculas. Una de sus características primordiales es la capacidad de responder a patógenos que no ha visto previamente. aureus. Se conoce como fagocitosis al proceso por el cual una partícula es ingerida por una célula. Fagocitosis Los mecanismos que tienen las células para incorporar en su interior fluidos. No todos los microorganismos son fagocitados. mientras que el antígeno O es variable entre las distintas especies y no es reconocido por el sistema inmune inespecífico. los factores del complemento (C3b. De esta forma. se describen patrones conservados. Dichas estructuras son conocidas como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs. parásitos. virus y otras partículas de pequeño tamaño. La fagocitosis fue descripta por Metchnikoff en 1882 y es uno de los mecanismos asociados al sistema inmune que aparece más tempranamente en la escala filogenética. Por ejemplo. peptidoglicanos y ácido lipoteicoico entre otras estructuras. Simultáneamente con esta evasión. que es la ingestión de partículas de mayor tamaño. endocitosis mediada por receptores específicos y fagocitosis. coli. el lípido A que forma parte del LPS de las bacterias Gram negativas es siempre constante y es el responsable de los efectos proinflamatorios.

Estos receptores pueden estar involucrados tanto en la adherencia como en la activación del proceso de fagocitosis. y el receptor scavenger o carroñero. Los monocitos se originan también en MO y pasan a la circulación. etc. o para la proteína C3 (CR3 o CD11b/CD18). diacilglicerol (DAG). los macrófagos alveolares en el pulmón y los histiocitos en el tejido conectivo. por ejemplo. Estos receptores existen en estados interconvertibles de alta y baja afinidad a consecuencia de que desarrollan un ciclo de intercambio del nucleótido guanina e hidrólisis de GTP durante el cual estas proteínas sufren varios cambios conformacionales. Los factores quimiotácticos son principalmente componentes bacterianos. desde donde se extravasan a los tejidos y se diferencian en los distintos órganos. ácido araquidónico (AA). la modificación en la calidad y cantidad de enzimas lisosomales. productos de degradación de las bacterias. Este último es uno de los mecanismos citotóxicos que entran en juego luego de la fagocitosis. Se ha observado que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios para inducir la ingestión de un microorganismo se reduce alrededor de 100 veces si éste además está recubierto por C3b. La activación de los segundos mensajeros permite la remodelación de la membrana citoplasmática. C y D. no sólo para iniciar la polimerización de la actina sino también para activar la NADPH-oxidasa para la producción de O2. se adhieren al endotelio celular activado y se mueven a través de la barrera endotelial hacia el sitio de la lesión. factores derivados de la activación del complemento como el C5a.fibronectina puede unirse a algunas bacterias como el Staphylococcus aureus y actuar como puente entre la bacteria y el polimorfonuclear (PMN). Estos estados de alta o baja afinidad dependen del microambiente y los niveles de factores quimiotácticos. Activación del polimorfonuclear / macrófago Los PMN responden a una gran variedad de factores quimiotácticos. Algunos de los receptores de los factores quimiotácticos han sido identificados como miembros de la superfamilia de los receptores unidos a la GTPasa (proteínas G). Estos receptores actúan cooperativamente para estimular vías de señalización. la polimerización de la actina y el estallido respiratorio. Los eventos tempranos de activación están interrelacionados y son fundamentalmente cuatro: 17 . Células efectoras de la fagocitosis Los polimorfonucleares se originan en la médula ósea (MO) y son continuamente enviados a la circulación. La transformación de monocito a macrófago tisular involucra una serie de cambios morfológicos y metabólicos en la célula. los leucotrienos B4 (LTB4). El reconocimiento del microorganismo está mediado por diferentes receptores de membrana del fagocito pertenecientes a los PRRs o aquellos que reconocen a las opsoninas. Las proteínas G funcionan como intermediarios entre los receptores de superficie celular y las enzimas efectoras responsables de la generación de segundos mensajeros: AMPc inositoltrifosfato (IP3). como son el aumento del tamaño celular. Ca2+. el receptor para el fragmento cristalizable constante de la inmunoglobulina G (FcR). Viven pocos días y tan pronto como los microorganismos invaden los tejidos dejan el torrente circulatorio. el aumento del metabolismo de los fosfolípidos. cuya característica estructural es que poseen 7 dominios transmembrana. Estos segundos mensajeros son generados directa o indirectamente como consecuencia de la activación de las fosfolipasas A2. tomando características propias como es el caso de las células de Kupffer en el hígado. el receptor para la proteína C3b del complemento (CR1)). ácido fosfatídico (PA). incluyendo los Nformilpéptidos. y los receptores de patrones (PRRs) como el receptor de manosa. Son considerados como la primera barrera de defensa frente a los microorganismos. mediadores de la inflamación y restos de tejidos alterados por la invasión. la interleuquina 8 y el factor activador de plaquetas (PAF). Algunos de ellos son. ya que son los primeros en llegar al sitio de invasión atraídos por los factores quimiotácticos que se generan en el foco inflamatorio.

los gránulos citoplasmáticos se funden con la membrana del fagosoma y se produce un fagolisosoma. que cliva los mucopéptidos de la pared celular bacteriana. El consumo de oxígeno es utilizado para la producción de metabolitos tóxicos como anión superóxido. señalando algunos de los estímulos necesarios para su activación. peróxido de hidrógeno. oxígeno singulete. ambos asociados con la actividad antimicrobiana. glicosidasas y lisozima. este fenómeno se denomina estallido respiratorio. Debido al gran consumo de oxígeno. Pueden actuar tanto intra como extracelularmente en el caso de que la partícula sea muy grande para ser ingerida generando lesión en el tejido subyacente y efecto conocido como fagocitosis frustrada.  Moléculas efectoras dependientes del oxígeno Durante el proceso de fagocitosis las células pueden incrementar en 50 veces la cantidad de oxígeno consumido y metabolizar grandes cantidades de glucosa. coli (LPS) y forbomiristil acetato (PMA). Las vías oxidativas productoras de estos dos metabolitos son diferentes y no comparten precursores comunes. 18 . Mecanismo de fagocitosis La interacción receptor-ligando entre el fagocito y la partícula a ingerir activa la maquinaria de la fase de ingestión para lo cual es necesario la modificación de las proteínas involucradas en el remodelamiento de la membrana y el citoesqueleto: actina. la partícula ingerida queda expuesta a sistemas microbicidas que pueden clasificarse como oxígeno independientes y oxígeno dependientes. En los sobrenadantes de cultivo de macrófagos activados por citoquinas se encuentran niveles elevados de nitritos inorgánicos (NO2-) y de anión superóxido (O2-). Los microfilamentos de actina en la porción de citoplasma que subyace al sitio de unión comienzan a polimerizarse.1234- fosforilación en tirosina de proteínas de membrana y citoplasmáticas hidrólisis del fosfolípido inositol de membrana incremento del Ca2+ citoplasmático incremento de la actividad de la proteinquinasa C (PKC) Los neutrófilos contienen una gran variedad de quinasas de serina/treonina y de tirosinas. la fagocitina y las leucinas que actúan sobre las membranas bacterianas. Estos agentes incluyen proteasas y enzimas hidrolíticas como fosfolipasas. En el interior del fagolisosoma. Macrófagos y PMN defectivos para estas quinasas exhiben una considerable disminución de la fagocitosis y producción de O2. lipopolisacárido de E.  Moléculas efectoras independientes del oxígeno Estas sustancias están localizadas en los lisosomas o gránulos citoplasmáticos. miosina y proteínas de unión a la actina. la lactoferrina fija el hierro privando a las bacterias de este elemento indispensable para su crecimiento y la lisozima. Estas enzimas son blanco específico de los segundos mensajeros. radicales hidroxilo. se liberan dentro de los fagolisosomas y no requieren la producción de oxidantes para ser activas. Estos rodean a la partícula y finalmente se fusionan formando la vesícula fagocítica o fagosoma primario. hipocloritos y cloraminas. Esta polimerización lleva a que la membrana envuelva la partícula. El entrecruzamiento de FcR induce la activación de diversas familias de quinasas y de tirosinas. formándose seudópodos (extensiones de la membrana en forma de dedos). a saber: interferón gamma (IFN). El siguiente esquema muestra las vías de producción de moléculas efectoras. Mientras esto ocurre. Se ha confirmado experimentalmente la relación entre la citoxicidad de los macrófagos y la producción aumentada de los reactivos del nitrógeno e intermediarios del oxígeno.

en determinados pacientes sospechados de padecer una inmunodeficiencia. que cataliza la oxidación y halogenación de diferentes estructuras presentes en los microorganismos. Las pruebas de quimiotaxis se utilizan. Durante la incubación las células migran. Los valores normales deben determinarse para cada especie y en el laboratorio de referencia. La migración de los PMN se evalúa microscópicamente comparando la distancia recorrida en dirección al factor quimiotáctico (dirigida) y la migración espontánea de las células (al azar). se desprende la capa de agarosa y se tiñen las células. Los factores quimiotácticos provienen principalmente de componentes bacterianos. podemos citar la Enfermedad Granulomatosa Crónica que se presenta en individuos genéticamente deficientes en la enzima NADPH oxidasa. que posee una membrana microporosa con poros de 3 micrones de diámetro. Se colocan las células en un compartimento y los factores quimiotácticos en otro y se 19 . En presencia de oxígeno y agua. ubicando frente a las mismas la sustancia quimiotáctica y una sustancia control. Uno de ellos es la acción de la mieloperoxidasa (MPO). interactúa con una serie de moléculas dando como resultado citotoxicidad. para evaluar la capacidad de sus células principalmente neutrófilos frente a factores comprobadamente inductores de migración Técnica de migración celular bajo capa de agarosa: Consiste en preparar un medio soporte de agarosa sobre un portaobjeto en el cual se siembran las células en posición central. Los niveles de formación de los reactivos del oxígeno y producción de NO están relacionados con el grado de susceptibilidad a las infecciones. el NO genera otros reactivos intermedios del nitrógeno y por último se descompone para formar NO2y NO3-. A modo de ejemplo. Luego se fijan con metanol. El óxido nítrico (NO) posee una vida media de pocos segundos.L-arginina Activación por INF y LPS Oxido nítrico sintasa (INOS) oxígeno Estimulación por fagocitosis o tratamiento con PMA NADPH oxidasa Óxido nítrico (NO) anión superóxido (O2) nitrito (NO2-) Otros reactivos intermediarios y moléculas efectoras peróxido de hidrógeno (H2O2) radicales hidroxilo (OH) nitrato (NO3-) Existen mecanismos para incrementar la capacidad microbicida del H2O2. Métodos de evaluación de las fases de la fagocitosis a) Quimiotaxis: La quimiotaxis es el movimiento de los PMN a través de un gradiente de concentración de sustancias (como la formil-metionina) que producen migración dirigida. de la degranulación de los mastocitos durante el proceso inflamatorio y de la activación del complemento (el C5a está considerado como uno de los más potentes factores quimiotácticos). b) Quimiotaxis y adherencia Técnica de migración y adherencia a través de una membrana: para ello se utiliza la cámara de Boyden.

Esta actividad se relaciona con el número de partículas radiactivas ingeridas y por lo tanto con la capacidad de ingestión de las células fagocíticas del individuo evaluado. La utilización de levaduras como por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae. Los resultados se comparan con los obtenidos con células del mismo animal (sin estímulo) y con PMN de un individuo normal utilizado como control de valor de animal sano. -Marcación de componentes bacterianos como proteínas. permite identificar el primer paso de activación de las células fagocíticas. Los métodos microscópicos requieren una laboriosa observación para determinar la asociación de los microorganismos a las células y discriminar si estos microorganismos fueron ingeridos o no. El recuento de las partículas o microorganismos ingeridos puede ser realizado mediante diversas metodologías: .lleva a incubar. Las bacterias se marcan durante su fase de crecimiento con aminoácidos o nucleótidos marcados con 14C. La posibilidad de identificar proteínas fosforiladas con el uso de anticuerpos monoclonales que detectan. tirosinas fosforiladas. La capacidad de las células para migrar hacia el estímulo se evalúa tiñendo las que quedan retenidas en la membrana.Tinción de las células con las coloraciones de Wright o Giemsa. DNA y/o RNA con sustancias radiactivas. se utiliza la marcación de la partícula con isotiocianato de fluoresceína u otro colorante fluorescente previo a la incubación con las células. -Marcación de las partículas a ingerir con fluoresceína. c) Ingestión: La etapa de ingestión se puede evaluar utilizando como partícula a ingerir diferentes microorganismos. luego se elimina por lavado las partículas no ingeridas y se detectan las células que ingirieron por microscopia de fluorescencia o citometría de flujo (ver capítulo correspondiente en la presente guía). de esta manera se diferencian las células que han ingerido de las que no. La utilización de la coloración combinada diferencial con bromuro de etidio permite identificar las bacterias extracelulares (fluorescen en color rojo-naranja) de aquéllas internalizadas (permanecen de color verde correspondiente a la fluoresceína).. La capacidad de ingestión de las células provenientes del individuo a evaluar se determina realizando una cuantificación del número de levaduras ingeridas en un determinado tiempo de incubación. La identificación de la migración de proteínas del citoplasma al núcleo celular para regular la trascripción de moléculas relacionadas con la inflamación y fagocitosis constituye también una manera de identificar los primeros eventos de activación celular. 35S amino 3H nucleótidos: tritio y luego del experimento de ingestión en el que se incuban las células y las bacterias durante un periodo de tiempo generalmente entre 30 a 60 minutos a 37ºC se lavan las células para eliminar las bacterias no ingeridas y se utiliza un detector de radioactividad como un contador de centelleo líquido o sólido para cuantificar la radiactividad retenida por el sedimento celular. Para esta evaluación es necesario recurrir a las técnicas de PAGE e Inmunoblot a partir de las células activadas (ver capítulos correspondientes en la presente guía). se fundamenta en el tamaño de las partículas (fácil de ver en el microscopio óptico) y la estructura de manosas que poseen estos microorganismos que son fácilmente detectados por los PRRs. b) Activación: La activación de las células fagocíticas se señaliza a través de eventos de fosforilación y desfosforilación de las proteínas celulares involucradas en la trasmisión de la señal de activación. por ej. Como ejemplos de estos sistemas podemos incluir la activación del factor NF-kB que involucra la degradación del factor inhibidor de kB citoplasmático (proteína IkB) y el incremento de sus componentes p50 y p65 en el núcleo celular. Esta modificación en los componentes proteicos celulares también se estudia utilizando anticuerpos marcados y mediante el uso de técnicas de SDS-PAGE e inmunoblot. Se deben contar por lo menos 200 células y determinar cuentas partículas por citoplasma celular es considerado como ingestión positiva. 20 .

se transforma en formazán de color azul e insoluble que precipita intracelularmente. 21 . Quimioluminiscencia El estallido respiratorio en los PMN normales está asociado con la generación de energía luminosa conocida como quimioluminiscencia. la evaluación de su producción se realiza mediante la cuantificación de nitritos en el medio de cultivo. la formación del formazán puede ser evaluada cuali o cuantitativamente. La sensibilidad del ensayo se incrementa por el uso de hidracina cíclica. La vida media del NO es de segundos. por esto. Este oxígeno se produce cuando uno de los electrones desapareados de oxígeno es elevado a una órbita superior con la inversión del spin. Se realiza una curva patrón utilizando diferentes concentraciones conocidas de NaNO2 y reactivo de Greiss.N dimetilformamida y realizar la cuantificación por espectrofotometría obteniendo los datos en densidad óptica. Evaluación de la producción de Óxido Nítrico (NO) Puede realizarse mediante la evaluación de la producción de NO o de la enzima que cataliza su producción (iNOS o NOS2) Producción del NO Los niveles de producción de NO en los cultivos de macrófagos estimulados con bacterias o productos bacterianos nos permiten evaluar el grado de activación de estas células. El oxígeno singulete es producido por la reacción entre H2O2 y el hipoclorito: H2O2 + OCl----------› 1 O2 + H2O + Cl- La luz emitida se mide por la detección fluorométrica apropiada. De esta curva se obtiene la relación que permite estimar la producción de NO in vitro.3-dihidro-1. El NBT de color amarillo y soluble. la cual es dependiente de la producción del oxígeno singulete (1O2). NBT (color amarillo y soluble) + O2.----------› Formazán (color azul e insoluble) + O2 Para esta prueba se pueden utilizar PMN provenientes de sangre entera aislados del individuo. Los cristales pueden identificarse intracelularmente por microscopía y realizar un recuento del número de células que sufrieron estallido respiratorio. La luminiscencia se mide en un contador de centelleo usando el canal del 3H. 5-amino-2. o bien los cristales pueden ser solubilizados utilizando N. estimulados con levaduras o forbolmiristilacetato (PMA) Luego de una incubación de 30 minutos a 37C.d) Digestión:  Evaluación del estallido respiratorio Reducción del colorante nitroazul de tetrazolio El nitroazul de tetrazolio (NBT) es un aceptor de un electrón utilizado para detectar en forma indirecta la producción de superóxido por parte de los PMN estimulados. El cambio de color se evalúa por espectrofotometría a 550 nm. La identificación de este metabolito en los sobrenadantes de cultivo se realiza mediante la utilización del reactivo de Greiss (sulfanilamida y naftiletilendiamina) que se colorea cuando reacciona con nitritos y nos permite relacionar la coloración con los niveles producidos en un cultivo.4-phthalazinedione (luminol) que actúan como substrato para el 1O2. La luz se emite cuando el electrón retorna a su nivel inicial y se mide como quimioluminiscencia. La síntesis de nitritos comienza 4 a 6 horas luego del tratamiento con IFN y LPS en un cultivo de macrófagos y es lineal por 72 horas.

poseen acción inhibitoria de la producción de nitritos a partir del NO por la vía de la iNOS por un fenómeno competitivo. La utilización de estas moléculas permite confirmar que el aumento de producción de nitritos en un cultivo está dado por este mecanismo.) 2. Evaluación del efecto bacteriostático o bactericida La digestión de las partículas ingeridas depende no sólo de los mecanismos O dependientes y O independientes descriptos sino de la capacidad del microorganismo de evadir o inhibirlos. las bacterias intracelulares pueden permanecer en estas células fagocíticas que se transforman en su habitat. Ensayos de nivel complejo: 1. Estudios enzimáticos: mieloperoxidasa. Deficiencias en el mecanismo de fagocitosis Las deficiencias pueden estar dadas en el número de células fagocíticas que posee un individuo (diferencias cuantitativas) o sobre la funcionalidad de alguno de los mecanismos descriptos (diferencias funcionales). Las deficiencias funcionales pueden afectar la movilidad y adherencia o la capacidad de ingestión y digestión. 22 . etc.como la NG-monomethyl-L-arginina (L-NMA). Ensayos de quimiotaxis. etc. b) Quimioluminiscencia. Las granulocitopenias son frecuentes en las deficiencias secundarias a enfermedades linfoproliferativas. Ensayos de nivel básico: 1. tratamientos inmunosupresores o excesiva destrucción mediada por anticuerpos anti-leucocitarios. La expresión de esta enzima se produce por la acción de IFN y LPS en los cultivos y se relaciona con la activación de macrófagos in vivo. Para la evaluación del aumento en la producción de esta enzima se utilizan anticuerpos monoclonales que reconocen su estructura marcados con enzimas que se utiliza para identificarla en los extractos proteicos celulares evaluados mediante las técnicas de SDS-PAGE e Inmunoblot. 2. glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa. Incremento de la síntesis de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS o NOS2) La producción de NO en altos niveles se cataliza por la acción de la enzima óxido nítrico sintasa inducible. a) Prueba de la reducción del nitroazul de tetrazolio. Estos mecanismos pueden ser evaluados utilizando técnicas de cultivo bacteriano y determinando el número de unidades formadoras de colonias sobrevivientes al proceso de fagocitosis. Algunas de las deficiencias descriptas como entidades clínicas son:  Enfermedad Granulomatosa Crónica  Deficiencia en la adhesión leucocitaria  Deficiencia en glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa  Deficiencia en los gránulos secundarios Para el diagnóstico de estas inmunodeficiencias se trabaja con niveles de complejidad crecientes.Los análogos de la L-arginina. 3. Determinación cuantitativa y morfológica de los granulocitos y monocitos. En el caso de bacterias extracelulares u otros patógenos este mecanismo se constituye como capaz de contener o eliminar al agente agresor constituyéndose en un mecanismo efector bacteriostático o bactericida. Estudio de la expresión de las proteínas de adhesión (antígenos LFA-1. Estudios de mecanismos microbicidas oxigeno dependientes. CD11b/CD18.

a través de la interacción del C con inmunocomplejos. Ann Rev Immunol 1999. 5. La vía alternativa. el complemento puede ser utilizado como un indicador de que la reacción Ag-Ac tuvo lugar. Las tres rutas comparten las últimas fases. 23 . 2. pero que se inicia sin necesidad de anticuerpos 3.A.Bibliografía 1. Aderem A. Nathan DG. Complemento El sistema de complemento (C) está formado por unas 30 proteínas del suero que interaccionan entre sí de modo regulado formando una cascada enzimática que permite una amplificación de la respuesta inmune humoral. Editorial Médica Panamericana S A 1996. ya sea para identificar antígenos como anticuerpos. 2. Lisis del microorganismo o célula diana 2. Margni R. El complemento puede ser estudiado para determinar su concentración o funcionalidad en un animal sospechoso de padecer una inmunodeficiencia o una enfermedad autoinmune. la técnica de fijación de complemento se emplea para detectar Acs específicos para el diagnóstico de algunas enfermedades infecciosas. Los extremos de la curva. La concentración de los factores del complemento en un suero problema se miden por inmunodifusión simple radial o prueba de Mancini (ver capítulo sobre reacciones secundarias). Underhill DM. 5. con la consiguiente mejora de la fagocitosis y destrucción del microorganismo fagocitado 3. J. Esto tiene una explicación clara si se analiza la curva que resulta de graficar los porcentajes de hemólisis en función de la cantidad de complemento agregado al sistema. Currents Protocols in Immunology. en la que interacciona directamente con la superficie del microorganismo. Mientras que. La funcionalidad del complemento en un suero problema se evalúa por la técnica de hemólisis. Baehner RL. Opsonización.1994. Méd. Por otra parte. Esta concentración de Hb está en función directa con el grado de hemólisis que tuvo lugar en la muestra y puede ser evaluada por absorción a 542 nm en un espectrofotómetro. 1992. 278: 971-976. Eliminación de inmunocomplejos circulantes El complemento puede activarse por tres vías: 1. Acción anafilotóxica. una especie de variante de la vía clásica. 1968.Engl. Por ejemplo. 3. Wheeler JG. Abramson JS. sino a una curva sigmoidea que presenta una marcada pendiente en la zona que va del 25 al 75% de hemólisis. utilizando un Ag de referencia. N. se produce la hemólisis y la consiguiente liberación de hemoglobina (Hb) en el sobrenadante. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous disease. consistentes en el ensamblaje del denominado complejo de ataque a la membrana (CAM). Fundamentos. Wyllie J. Los estudios de cinética de esta inmuno-hemólisis han demostrado que la sensibilidad de estas valoraciones es mayor cuando el título se establece sobre la base de la dosis de complemento que produce la lisis del 50% de los hematíes del sistema. The Neutrophil. 17:593-623. La vía de las lectinas. Mechanisms of phagocitosis in macrophages. Las principales consecuencias de la activación del C son: 1. Quimiotaxis sobre los fagocitos 4. La vía clásica. puede observarse que dicho gráfico no corresponde a una recta. Inmunología e Inmunoquímica. Oxford University Press. 4. la lisis por complemento se puede utilizar para tipificar grupos sanguíneos en animales utilizando anticuerpos específicos. Fundamentos de la hemólisis mediada por complemento: Cuando a una suspensión de GR sensibilizados con anticuerpos específicos se le agrega complemento.

Fuente de complemento: suero fresco de cobayo. la técnica es más sensible basándose en el 50% de hemólisis. a una fuerza iónica y a un pH óptimo para cada especie. El porcentaje de hemólisis es proporcional a la concentración de complemento dentro de cada dilución de cada suero en particular. De este gráfico se deduce que. La hemoglobina liberada se mide en un espectrofotómetro luego del período de incubación.DO (0%lisis) % de hemólisis = x 100 DO (100% lisis) . El complemento presente en el suero se activa por los Acs que recubren los GR (complejos inmunes) y causa la lisis de los eritrocitos (hemólisis).DO (0%lisis) 24 . el consumo de pequeñas cantidades de complemento produce cambios significativos en el porcentaje de hemólisis. Por esto. Se deben realizar los siguientes controles:  0% de hemólisis (buffer + GR sensibilizados). Esta relación no se observa cuando las cuantificaciones de C se realizan sobre la base del 100% de hemólisis. El porcentaje de hemólisis se mide como la concentración de Hb que se obtiene en el sobrenadante por absorción a 542 nm. Figura 1: Porcentaje de hemólisis en una muestra de GR sensibilizados en función de la cantidad de complemento agregado. durante una hora de incubación a 37ºC. en presencia de concentraciones óptimas de Calcio y Magnesio. Evaluación de la funcionalidad del complemento en un suero problema En la prueba para evaluar la funcionalidad del complemento. La unidad CH50 se calcula sobre 5 X 108 eritrocitos óptimamente sensibilizados. resuspendidos en un volumen total de 7.5 ml. El porcentaje de hemólisis para cada dilución de suero evaluado se calcula de la siguiente forma: DO (problema) . que corresponde a los mililitros de suero fresco completo (como fuente de complemento) que son necesarios para producir la lisis del 50% de los GR sensibilizados con anticuerpos. cuando se hacen cuantificaciones de C a 50% de hemólisis. Luego se agrega una suspensión estándar de eritrocitos óptimamente sensibilizados a cada dilución de suero. y  100% de hemólisis (agua destilada + GR sensibilizados).que corresponden a la zona que va del 0 al 25% y del 75 al 100 % de hemólisis. los sueros de los animales problema y de referencia se diluyen en forma seriada en un rango que va desde 1/20 a 1/320. presentan una pendiente significativamente menor o nula. Se define así la unidad de complemento hemolítica 50% (CH50).

El suero se agrega en hoyos cavados en la placa de agarosa y se permite que difunda durante 20 hs a 4ºC. el cual puede presentar diferentes epitopes. Las muestras de suero que van a ser utilizadas para evaluar la función del C deben ser conservadas a -70ºC dentro de las 2 hs de extraídas. El valor del 50% de hemólisis es el elegido para definir el título de un suero como la inversa o recíproca de la dilución del suero que produce un 50% de hemólisis. dada la labilidad de las proteínas del C. cuyo diámetro es proporcional al logaritmo de la concentración del complemento en el suero. y cada uno de ellos ser reconocido por varios clones de linfocitos B que producirán inmunoglobulinas específicas. Mediante esta técnica se evalúa la vía clásica de activación del complemento. Anticuerpos Obtención de anticuerpos policlonales o sueros hiperinmunes: Cuando se inmuniza un animal con un antígeno y se provoca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Igs específicas frente al antígeno empleado. Las placas se incuban luego a 37ºC por 90 min para permitir la hemólisis. Este ensayo también puede ser realizado usando placas de agarosa que contienen GR sensibilizados. posiblemente elevado. que se ve como un anillo rodeando los hoyos. la dilución del suero problema. de diferentes moléculas de inmunoglobulinas específicas frente al antígeno en el suero del animal inmunizado.Este ensayo produce también una curva sigmoidea si se grafica el % de hemólisis vs. 25 . (Figura 1) Anticuerpo policlonal Figura 1: Producción de anticuerpos policlonales. Esto es la consecuencia de la selección clonal de los linfocitos B que producen anticuerpos contra el antígeno. Se trata de un suero producido por la acción de síntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal. Como consecuencia de esta respuesta inmune humoral específica se acumulan un número desconocido.

los anticuerpos policlonales consisten en una mezcla de inmunoglobulinas provenientes de distintos clones de linfocitos B. Son químicamente homogéneos. Las aplicaciones son numerosas. Anticuerpos monoclonales Kohler y Milstein desarrollaron una técnica que permitió la producción de anticuerpos producidos a partir de un solo clon de linfocitos B. por ejemplo. lo que facilita la puesta a punto y repetitividad de varias técnicas inmunológicas. pero la calidad de la respuesta en niveles de anticuerpos y células específicas puede ser incrementada y mejorada en dosis sucesivas. cabra y gallina. En conclusión. con idéntica secuencia aminoacídica en sus regiones variables. con una afinidad hacia el antígeno determinada e invariable y presentan un único isotipo. Los híbridos resultantes presentan dos propiedades: secretan anticuerpos específicos hacia el antígeno empleado en la inmunización. conejo. se denomina suero hiperinmune al obtenido de animales que han respondido a múltiples inoculaciones de un antígeno determinado. La primer dosis induce la sensibilización del individuo generando la expansión de los clonos específicos y la aparición de células de memoria. La cantidad de antígeno dependerá del animal empleado. Estos sueros contendrán anticuerpos policlonales en alta concentración contra los distintos componentes de un antígeno. Cuando nuestro objetivo es obtener sueros hiperinmunes para utilizar como reactivos de diagnóstico o inmunidad pasiva. la utilización de la gallina como especie para obtención de anticuerpos tiene dos ventajas: la distancia filogenética existente con los mamíferos. poseen las propiedades individuales de la secuencia de aminoácidos de ese particular anticuerpo. por lo tanto en los planes de inmunización se aplican diversas dosis. El fundamento de la técnica consiste en fusionar linfocitos B provenientes de un ratón inmunizado con el antígeno de interés con líneas celulares provenientes de mielomas no secretante murino. a la primera dosis se la describe como: inmunización primaria o respuesta primaria.25 a 5 mg por dosis en el caso de la cabra o los 15 mg en el caso de caballo. 2. Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas secretadas por un único clon de linfocitos B y por lo tanto. como reactivos para el diagnóstico de ciertas enfermedades. y la purificación de los anticuerpos de la yema del huevo. Como ejemplo. los planes están compuestos por varias dosis. Esta tecnología ha revolucionado el empleo de los anticuerpos. Cuando la inmunización se realiza sobre animales vírgenes o “naive”. Poseen una especificidad única. Existen numerosos protocolos de inmunización. proliferan indefinidamente y pueden ser mantenidos como líneas celulares. debemos considerar la distancia filogenética para la elección de la especie dadora de suero. y el proceso puede durar de 3 a 6 meses (puede variar también de acuerdo con la especie a inmunizar). Si nuestro objetivo es sueros anti-sueros de diferentes especies. aunque una fase de inmunización primaria suele durar de 1 a 3 meses con inyecciones cada 15 a 21 días. A continuación se enumeran las principales diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales: Anticuerpos monoclonales: 1. Las cantidades oscilan de los 50 a 1000 μg de antígeno para una dosis en ratón a los 0. rata.El proceso de inmunización es aquel en el que se inyecta al animal el antígeno sólo o con adición de adyuvantes. Los más comúnmente utilizados son ratón. es engorrosa pero su obtención no afecta la vida del animal dador. Es importante destacar que mediante esta metodología se pueden obtener anticuerpos homogéneos (ya que proviene de un único clon de linfocitos B) y de muy alta especificidad. Son de especificidad definida porque todas las moléculas tienen la misma región hipervariable. con una duración variable. Por el contrario. tanto en lo referido al enfoque diagnóstico como terapéutico. cuya función es favorecer su inmunogenicidad. En estas características residen las principales ventajas que presentan los anticuerpos monoclonales para su uso en investigación y diagnóstico. 26 .

es difícil de estandarizar. pp726. Su avidez y afinidad corresponden al conjunto de la mezcla de anticuerpos y varían en función del momento de la respuesta inmune en que se realizó la determinación. Pueden ser sensibles a cambios de pH. Son una mezcla de anticuerpos con especificidades propias para cada epitope del inmunógeno. Ed. En la tabla 1 se muestran las posibles fuentes de anticuerpos para su purificación. Así. Por lo tanto. Existe una amplia variedad de métodos utilizados para purificar anticuerpos. 5. Tabla 1: Comparación de diferentes fuentes de anticuerpos Fuentes Tipo de Anticuerpo Concentración de Anticuerpos totales (mg/ml) Concentración de Anticuerpos específicos (mg/ml) Anticuerpos contaminantes Posible pureza de anticuerpos específicos (%) Suero Sobrenadante de cultivo de hibridoma (con 10% de Suero Fetal Bovino) Sobrenadante de cultivo (sin Suero Fetal) Líquido ascítico policlonal 10 1 (10% máximo) Otros Ac del suero Anticuerpos bovinos 10% como máximo Monoclonal 1 0. no poseen reactividad secundaria. se produce la maduración de la afinidad de los anticuerpos.05 1-10 0. Poseen una única avidez y afinidad. 4. Poseen reactividad secundaria debido a la presencia de múltiples anticuerpos dirigidos contra distintos epitopes en la molécula antigénica. la clase y subclase de Ig (en el caso de un anticuerpo monoclonal). Son estables como consecuencia de su heterogeneidad. la especie y el material a partir del cual se parte. Se producen en animales inmunizados.05 (100%) 0. no forman complejos antígenoanticuerpo insolubles con antígenos mono o bivalentes. Purificación y fraccionamiento de anticuerpos 1-Aislamiento y Purificación de Anticuerpos El aislamiento o la purificación de anticuerpos se requiere para un gran número de técnicas. Pueden hacerlo si el antígeno tiene epitopes repetitivos. 27 . Estos se debe a que a medida que la respuesta inmune se va desarrollando. Por lo tanto. Se pueden producir en cantidades ilimitadas. o sea. Harlow y David Lane. 1988.9-9 (90%) Ninguno >95% Anticuerpos de 90% ratón Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. La correcta elección del método de purificación dependerá de un número de variables. Sus propiedades constituyen un promedio de las propiedades de los distintos anticuerpos constituyentes (del antisuero). lo que permite que sean más resistentes frente a distintos cambios físico-químicos.05 (5%) > 95% Monoclonal Monoclonal 0. temperatura. liofilización y marcación con enzimas o isótopos. Ed. 3. Su estabilidad físico-química depende de cada anticuerpo monoclonal en particular. 4. 5. la probabilidad de reacciones cruzadas con epitopes de otros antígenos es mayor a la de los anticuerpos monoclonales. Son heterogéneos. la afinidad media de los anticuerpos detectada al comienzo de una respuesta inmune será menor que la detectada a medida que la respuesta inmune avanza. 6. 6. En general.3. tanto de diagnóstico como de investigación. Cold Spring Harbor Laboratory. 2. lo que permite la formación de una red antígeno-anticuerpo. Anticuerpos policlonales: 1. que incluyen: el uso posterior de los anticuerpos purificados.

forma. mayor solubilidad proteica y viceversa. éstas se hallan en solución. Las sales mas comúnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio. Los diferentes componentes de la muestra experimentan repetidas interacciones entre la fase móvil y la fase estacionaria. precipita la mayoría de las proteínas con excepción de las IgGs.Métodos de Aislamiento y purificación 1-a Precipitación Las interacciones de una proteína en agua ocurren entre las moléculas de proteína-agua y proteína-proteína. La separación de las muestras entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades fisicoquímicas de cada uno de los componentes de una muestra dada. Es conveniente trabajar con sulfato de amonio a 4ºC: A mayor temperatura. éstas precipitan. que los métodos cromatográficos más comunes para la purificación de estas moléculas sean: 28 . los componentes de la muestra se separan en función de su interacción con la fase estacionaria: el componente que menos interactúa es el menos retenido y eluye primero.el pH de la solución. Durante el proceso. hidrofobicidad y arreglo de sus grupos funcionales dentro de su estructura tridimensional. le quita el agua y hace que predominen las interacciones proteína-proteína. carga. La concentración de sal a la cual precipitan los anticuerpos varía según la especie. Es lógico. por lo tanto.el peso molecular de la proteína a purificar. cuando predominan las segundas (proteína-proteína). esto se cumple para el rango de 0 a 40ºC. el que más interactúa resulta retenido más fuertemente y eluye último. Esta metodología. como lo hace el sulfato de sodio.el número y la posición de los grupos polares. 4. Por ejemplo. la carga neta de dicha proteína es cero y por lo tanto sus moléculas no se repelen. La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas ni a temperatura ambiente. por lo que es transportada a lo largo de una columna que contiene la fase estacionaria homogéneamente distribuida.la temperatura a la que se desarrolla la precipitación. la mayoría de los anticuerpos de conejo precipitan con una solución saturada al 40%. se aglomeran y precipitan. La muestra a purificar se introduce en la fase móvil. como la sal es más hidrofílica que la proteína. los factores que afectan la concentración salina a la cual una proteína en particular precipitará son: 1. Cuando predominan las interacciones proteína-agua. mientras que los anticuerpos de ratón necesitan entre 40-50%. 2. Las macromoléculas biológicas difieren en sus características fisicoquímicas: tamaño. cromatografía de intercambio iónico). permite obtener IgG purificada a partir de suero si se la realiza en combinación con otras metodologías (por ejemplo. Cuando a una proteína que se encuentra en solución acuosa agregamos una sal. Una separación óptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el componente que eluye en segundo término es retenido lo suficiente como para impedir su superposición con el componente que eluyó en primer término. interacciona con el agua. 1-b Cromatografía La característica que distingue a los métodos cromatográficos es la presencia de dos fases mutuamente no miscibles (una móvil y una estacionaria) que se hallan en contacto. Es importante considerar el pH de la solución de trabajo: Cuando el pH de la solución es igual al punto isoeléctrico (pI) de la proteína. la proteína precipita.  Precipitación con ácido caprílico La adición al suero de ácidos grasos de cadena corta como el ácido caprílico en condiciones medianamente ácidas. En resumen.  Precipitación salina La precipitación salina es un método que permite separar las distintas fracciones proteicas del suero. por lo tanto. 3. Por lo tanto.

 Cromatografía de Exclusión Molecular Fundamentos: Este tipo de cromatografía utiliza como soporte esferas de gel con poros de diferente tamaño. sólo se equilibrarán en el Vo. que se expende en forma de polvo y puede tener diferentes tamaños de poro. Cuando una muestra compleja de proteínas y otros componentes. constituido por el volumen intersticial (el espacio que queda entre las esferas de gel). mientras que las proteínas de menor tamaño. Las muestras deben ser clarificadas por centrifugación a fin de eliminar todo el material insoluble que pueda disminuir el flujo de la columna y contaminar la matriz de la misma previo a la cromatografía. y el volumen interno (Vi) que es el volumen de las esferas a los que los solutos y solventes pueden acceder cuando se introducen dentro de aquéllas a través de sus poros. debido a que su tamaño es mayor al de los poros. el volumen externo (Vo).  Cromatografía de intercambio iónico (discriminación por carga).  Cromatografía de interacción hidrofóbica (discriminación por superficie hidrofóbica). Una columna construida de esta manera tendrá dos volúmenes medibles. inmovilización de metales).  La fuerza iónica de los solventes cromatográficos debe ser lo suficientemente elevada como para impedir la adsorción inespecífica del soluto a la matriz por interacciones electrostáticas o uniones de Van Der Waals  Como las moléculas de IgM son mucho más grandes que las moléculas de IgG y de otras proteínas que se encuentran en el suero. disuelta en un pequeño volumen. lo que implica la separación de proteínas de diferente tamaño. es aplicada a una columna con estas características. Las moléculas que no puedan acceder al Vi. Las proteínas de mayor peso molecular eluirán con el Vo y por lo tanto eluirán primero. mientras que las de menor tamaño se equilibrarán en ambos volúmenes. filtrará a través de la misma.  Cromatografía de afinidad (distribución de aminoácidos específicos en la superficie de las proteínas. Cromatografía de exclusión molecular (discriminación por tamaño y forma).  Las muestras no pueden contener una concentración proteica de más de 50 mg/ml. eluirán más tardíamente y en un volumen de elución (Ve) determinado que dependerá de su peso molecular. que pueden acceder al Vi. la cromatografía de exclusión molecular puede 29 . Ver esquema Aspectos metodológicos:  La matriz más utilizada en este tipo de cromatografía es ”Sephadex ®”.

según sea el pH del medio. Existen numerosas matrices comerciales disponibles en su forma activada o sin activar para ser utilizadas como soporte para el ligando. ADN. virus. un anticuerpo) usualmente tiene un sitio de reconocimiento a través del cual puede interactuar con otra molécula natural o artificial a la que se llama ligando. Esta unión es de tipo electrostático y reversible: La fuerza de esta unión puede ser modificada variando la concentración salina y el pH de la solución buffer utilizada como eluyente.  Cromatografía de Afinidad Fundamentos: La técnica de cromatografía de afinidad es una de las técnicas más utilizadas para la purificación de proteínas. enzima-inhibidor. etc. Consiste en una cromatografía de adsorción en la que se aprovecha la especificidad de interacciones biológicas como las interacciones antígeno-anticuerpo. se puede utilizar esta técnica combinada con la precipitación con sulfato de amonio. receptores. La naturaleza de los grupos cargados es la que determina el tipo y la fuerza de unión del ión intercambiador. La biomolécula deseada puede ser eluída del ligando por cambios en las condiciones externas (pH. lectinas. proteínas unidas a vitaminas. tendrán carga neta cero y no se fijarán a ningún tipo de resina intercambiadora. glicoproteínas. podrán unirse a resinas aniónicas o catiónicas. células y proteínas producidas por ingeniería genética.ser usada para separar IgM. anticuerpos. su carga neta dependerá del pH del medio. La naturaleza de la matriz a la que se fijan los ligandos es muy importante. cuando ésta se encuentra en una mezcla impura. Existe una gran diversidad de biomoléculas que pueden purificarse por este método cromatográfico. bacterias. fuerza iónica. ARN. Matrices y solventes: La matriz puede estar constituida por silicato de aluminio. proteínas unidas a hormonas. a una matriz estacionaria de carga opuesta. mediante la variación del pH o fuerza iónica del eluyente se conseguirá que cada una de ellas eluya por separado. resinas sintéticas. El ligando es inmovilizado sobre una matriz polimérica y es usado para capturar selectivamente a la biomolécula que se desea purificar. hormona-receptor. Cuando se requiere obtener una preparación pura de IgM. ya que en las condiciones experimentales debe ser física y químicamente estable. Los dos tipos de resinas más utilizadas son:  de intercambio catiónico (con matrices con carga negativa) y  de intercambio aniónico (con matrices con carga positiva). fagos. En los casos de moléculas anfotéricas como las proteínas. Las biomoléculas se unen a resinas de intercambio iónico cuando tienen carga opuesta a la de los iones fijos de la resina. enzimas. que consiste en la fijación inicial y posterior remoción de tales sustancias a una resina estabilizada.  Cromatografía de Intercambio Iónico Fundamentos: La cromatografía de intercambio iónico trabaja mediante la unión de biomoléculas con una carga determinada. La biomolécula que se quiere purificar (por ejemplo. que poseen grupos cargados positiva y negativamente. en especial en lo que se refiere al grupo funcional que le aporta la carga. solventes y temperatura) que desestabilizan la interacción biomolécula– ligando y permiten que la molécula deseada sea eluida en forma purificada. Estas sustancias. Si las sustancias fijadas tienen diferentes propiedades eléctricas. etc. en su punto isoeléctrico (pI). no debe actuar como tamiz molecular y debe asegurar un buen flujo durante la elución. polisacáridos como la celulosa o el dextrano. La activación de la matriz se realiza para que el 30 . La elección correcta de la resina. entre ellas: antígenos. dependerá de la carga neta de la sustancia que se desea separar. lectina-hidrato de carbono. La separación de dos o más sustancias mediante la utilización de resinas de intercambio iónico se consigue por un mecanismo de adsorción reversible.

Ed.ligando quede inmovilizado en ella a través de una interacción química que produzca una unión estable entre matriz y ligando. Se han encontrado proteínas similares en otras bacterias (por ejemplo proteína G en Streptococcus sp. 2. estas matrices tienen la característica de ser casi inertes. Estas afinidades muy altas corresponden a la interacción hormona-receptor para lo cual este método no resulta útil. si el ligando es un anticuerpo. A partir del estudio de estas proteínas.que la afinidad de unión del ligando sea específica y reversible por la sustancia que será purificada. Las demás moléculas presentes pero no unidas a la matriz (no reconocidas por el ligando) se eliminan por lavado. de forma que no producen interacciones inespecíficas. La selección del ligando utilizado en cromatografía de afinidad debe tener en cuenta: 1. pp726. 1988. Al agregar un antígeno. La proteína A se acopla a una matriz de sepharosa activada. Por ejemplo. Ed. En general. Aunque se desconoce la explicación biológica de la fuerte afinidad que tienen la proteína A y la proteína G con las moléculas de IgG. en su mayoría derivados de la agarosa. Harlow y David Lane. En la Tabla 2 se muestran las afinidades de las proteínas A y G con anticuerpos de diferentes especies: Tabla 2 Especie Afinidad por Proteína A Afinidad por proteína G Humano ++++ ++++ Caballo ++ ++++ Vaca ++ ++++ Cerdo +++ +++ Oveja +/++ Cabra ++ Conejo ++++ +++ Hamster + ++ Pollo + Cobayo ++++ ++ Rata +/++ Ratón ++ ++ Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. se las comenzó a utilizar para purificar específicamente anticuerpos a partir de una muestra impura. quedará libre el sitio de unión al antígeno. y por lo tanto. se utilizan matrices de naturaleza polisacárida. se supone que representaría un mecanismo de escape de las bacterias a la respuesta inmune del huésped. El ligando idealmente debería tener una afinidad de unión de 10-4 a 10-8 M-1 en solución. Debido a su estructura química. Esto es esencial porque la cromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas. éste se va a unir a la matriz a través de su porción Fc. 31 . Si la constante de disociación es mayor que 10-8 M-1 esta técnica no puede ser utilizada para la purificación de estas moléculas pues la unión es muy estable y la separación de la biomolécula del ligando se hace muy difícil. el antígeno unido al anticuerpo de la columna se eluye y se obtiene en forma pura. Ejemplos: Purificación por columna de proteína A-sepharosa: La proteína A se encuentra en las paredes celulares de Staphylococcus aureus y tiene la particularidad de unirse al fragmento Fc de anticuerpos.). Cold Spring Harbor Laboratory.que el ligando posea grupos químicamente modificables que permitan su unión a la matriz sin que se destruya su capacidad de unión a la sustancia que será purificada. éste será reconocido y unido por el anticuerpo inmovilizado en la columna. Posteriormente.

Pueden usarse los siguientes compuestos: NaOH 1M. etc.Purificación por columnas de inmunoafinidad En este caso se puede utilizar una columna a la que se une un anticuerpo específico frente al antígeno que se va a purificar o una columna a la que se une un antígeno. luego de la elución por cualquier método de elección. Es menos frecuentemente utilizada que la elución ácida.5. Citrato de sodio pH 2. se obtiene una baja recuperación con este tipo de metodología. presencia de calcio o magnesio. En la Figura 1 se esquematiza la metodología de purificación de proteínas por columna de afinidad. pureza y estabilidad. urea-HCl 6M etc. entre las cuales se encuentran alto pH. Purificación por columnas de afinidad a metales El níquel es un metal que tiene afinidad por el aminoácido histidina. 1-Elución específica: Utiliza soluciones de elución con diferentes características. Antígenos y anticuerpos están unidos por una variedad de fuerzas. Se utilizan para romper interacciones iónicas como los puentes de hidrógeno y algunas interacciones hidrofóbicas.5. Este paso es importante dado que las columnas pueden reusarse y tras sucesivos lavados con soluciones buffer se pueden utilizar para otras muestras.5. es la regeneración de las columnas de afinidad. 3-Elución básica: Este tipo de elución se utiliza para obtener proteínas de membrana que se unen por interacciones hidrofóbicas y otros antígenos que precipitan en condiciones ácidas pero son estables en condiciones básicas. al colocar la muestra a purificar solo se unirán los anticuerpos específicos frente a ese antígeno. Los agentes caotrópicos más utilizados son: guanidinio. 2-Elución ácida: Se puede utilizar Glicina-HCl 0. 4-Elución por agentes caotrópicos: Estos agentes desestabilizan la estructura terciaria de las proteínas. etc. presencia de agentes quelantes como el EDTA. Para ello es necesario recuperar los antígenos o anticuerpos provenientes de los inmunocomplejos. La columna unida al níquel permite la purificación de dichas proteínas por su afinidad al aminoácido histidina. La disociación de estos complejos inmunes puede hacerse más efectiva si se incorpora ácido propiónico 1M o 10% de dioxano o etilenglicol al eluyente ácido. 32 . La orientación estérica.02M pH 2. etc.05 M pH 11. las cuales incluyen: -Fuerza iónica -Interacciones hidrofóbas -Puentes de hidrógeno -Fuerzas de Van Der Waals El objetivo de la elución es recuperar la proteína unida específicamente con un alto rendimiento. la densidad de acoplamiento y las interacciones no específicas pueden también influenciar la unión. Posibles métodos de elución de la muestra: La fuerza de los complejos antígeno-anticuerpo depende de la afinidad relativa y la avidez de los anticuerpos. En algunos casos en que las soluciones que se utilizan aumentan las interacciones hidrofóbicas entre antígeno y anticuerpo. Esta propiedad es aprovechada para la purificación de proteínas recombinantes a las que se le agrega una cola de 6 histidinas. Dietilamina 0. Regeneración de las columnas El último paso.

Generalmente es necesario utilizar varias técnicas para obtener una mejor purificación 33 .Figura1: Esquema de purificación de una proteína a través de una columna de afinidad Interacción ligando-receptor (unión reversible) a) Inmovilización del ligando Matriz + Ligando b) Adsorción del ligando al receptor en una muestra compleja + impurezas Muestra c) Elución de la muestra unida (receptor) en forma pura pura + En la tabla 3 se muestran los métodos de purificación de anticuerpos.

Diluye la muestra. Cromatografía de afinidad: Anticuerpo (Inmunoafinidad) Purificación de clases y subclases de anticuerpos específicos de sueros policlonales. Antígenos puros. En la figura 2 se muestran los resultados esperados de la digestión de los anticuerpos con las diferentes enzimas. denominada (Fab’)2. Presenta. expresando una única valencia. por lo tanto. Anticuerpos puros. Fácil. Rinde anticuerpos impuros. Útil para grandes volúmenes. Concentra la muestra. Caro. Cromatografía de afinidad: Proteína A Obtención de IgG. Rinde anticuerpos casi puros. dos sitios de reconocimiento antigénico por lo que su valencia es dos. Muchos pasos. Dos de estos fragmentos. Rinde anticuerpos específicos de especie. Por ejemplo. la tripsina y la pepsina. Útil para grandes volúmenes. cliva el fragmento Fc en piezas pequeñas y deja el resto de la molécula intacta. Rinde anticuerpos puros y específicos.  La papaína cliva la molécula de IgG en tres fragmentos de semejante peso molecular (45 a 50kDa). son denominados Fab (fragmento de unión al Ag). lisis. por su parte. Un paso. Inactivación de anticuerpos. Bajo costo. Ácido caprílico para IgG. En ellos reside la capacidad de reconocimiento antigénico. Rinde anticuerpos impuros. idénticos entre sí. Fácil. Aislamiento Sulfato de amonio/ Ac. El tercer fragmento. Requiere múltiples pasos. Estos problemas se pueden resolver si se utilizan fragmentos de anticuerpos. No como paso único. No se usan solas. No para IgG.Tabla 3: Métodos de aislamiento y purificación de anticuerpos Aplicaciones Ventajas Desventajas Precipitaciones y cromatografía de intercambio iónico (DEAE) Aislamiento y concentración de anticuerpos de todas las fuentes y espacios. se halla constituida por dos fragmentos Fab unidos a través de los puentes disulfuro intercatenarios. No como paso único. 34 . Esta porción intacta. Ácido caprílico no se usa para IgM. Altos rendimientos. Las enzimas que más se utilizan son la papaína. muchas células tienen receptores para el fragmento Fc de los anticuerpos y al interaccionar con ellos puede ocurrir activación celular. 2. Rendimiento bajo a moderado.  La pepsina. se han empleado enzimas proteolíticas que clivan a los anticuerpos en diferentes fragmentos. Caro. Exclusión molecular Obtención de IgM.Fraccionamiento de anticuerpos El uso de un anticuerpo intacto en algunas técnicas inmunoquímicas introduce ciertos problemas.  La tripsina actúa de manera similar a la papaína y permite obtener los mismos fragmentos. etc. Purificación Cromatografía de afinidad: Antígeno (Inmunoafinidad) Purificación de líquido ascítico y sueros policlonales. Con ácido caprílico solo IgG. denominado Fc (fragmento cristalizable) no participa en el reconocimiento antigénico. Como método de estudio de la estructura de las inmunoglobulinas. Bajo costo. Muchos pasos. Caro. Caprílico – DEAE/ Sulfato de amonio Aislamiento a partir de líquido ascítico y suero policlonal. Rendimiento moderado. Separa IgM de otros anticuerpos en sueros policlonales.

Harlow y David Lane. Validated Biosystems. J and Male. Gagnon. Tanto el fragmento Fab como el fragmento (Fab’)2 están estabilizados por los puentes disulfuro intercatenarios. 3. 2. A. La estructura que se obtiene recibe el nombre de “single chain fracción variable” (scFv) que se puede sintetizar mediante técnicas de ADN recombinante. Purification tools for monoclonal antibodies. 6. M and Anfinsen. P. Editorial panamericana Buenos Aires quinta edición. Natl. D. Subramanian. 976pp 7. Wilchek. Cuatrecasas. Satz L y Geffner. Ed. Papaina Pepsina Bibliografía: 1. Pharmacia fine chemicals. A. Roitt. debe estabilizarse agregando un péptido de unión o “linker”. Fundamentos. 387 pp 5. es de gran utilidad para los estudios de afinidad de antígeno y anticuerpo. 8.Un tercer fragmento de anticuerpos. Antibodies A Laboratory Manual. Fainboim.249 pp. Inc. 2000 Methods in Molecular Biology Vol 147: 95-104. 1999.1996. Affinity Chromatography: principles and methods. I. 423 pp. Mosby International. Ed. Introducción a la Inmunología Humana. R. C. 1996. Selective enzyme purification by affinity Chromatography. 4. El fragmento linker es una pequeña secuencia que une el extremo amino terminal de la cadena liviana con el extremo carboxiterminal de la cadena pesada. 35 . Inmunología e Inmunopatología. Cold Spring Harbor Laboratory. Sci. LTD. Este fragmento está compuesto por las porciones variables de las cadenas liviana y pesada. el Fv. Fifth Edition. L. pp726. B. 1968. Brostoff. P. J. Immunology . Dado que el fragmento Fv no posee estas uniones. USA 61: 636-643. Immunoaffinity Chromatography. 1988. con lo cual posee un sólo sitio de combinación al antígeno. Margni. Proc. Acad.

que no posee fibrinógeno ya que es el precursor de la fibrina. Vols 147: 1-6. Methods in Molecular Biology. I. Kent. *Globulinas: la fracción globulínica de las proteínas plasmáticas es una mezcla muy compleja que se agrupa en cuatro fracciones con funciones diferentes: alfa-1. El sobrenadante que se obtiene. Purification of Antibodies Using Affinity Chromatography. 1999. 2000. Methods in Molecular Biology Vol 115: 23-28. alfa-2. posee un 10% de solutos disueltos. a saber: *Albúminas: es la proteína más abundante del suero. -globulinas:  Transferrina  Fibrinógeno  Factores del Complemento  Proteína C reactiva 36 . beta y gamma 1. Además es transportadora de sustancias poco solubles en agua (ej: ácidos grasos libres). Es sintetizada por el hígado y su principal función es el mantenimiento del volumen (equilibrio osmótico). es producido por el hígado y constituye el 4 – 6 % de las proteínas totales del plasma. M and chailen. precursor de la fibrina. El fibrinógeno. compuestos a su vez por un 2 % de nutrientes orgánicos y sustancias de desecho. Si por el contrario dejamos que la sangre extraída coagule y luego la centrifugamos. An Overview of Affinity Chromatography. 10. U.9. obtendremos lo que denominamos suero. -1 globulinas:  Glicoproteínas  Globulina fijadora de tiroxina  Protrombina  Antitripsinas  HDL (lipoproteína de alta densidad) 2. Wilchek. los elementos celulares en suspensión pueden ser separados por centrifugación. Proteínas del plasma y suero La sangre está compuesta por células (eritrocitos. Si se somete un suero a una corriente eléctrica y bajo determinadas condiciones (electroforesis) las proteínas del suero se distribuyen en diferentes fracciones.M. varía según la especie entre un 35 y 50% de las proteínas totales. un 1% de sales inorgánicas y un 7% de proteínas plasmáticas. denominado plasma sanguíneo. proteína formadora del coágulo sanguíneo y se consume durante la coagulación. Cuando se extrae sangre venosa con anticoagulantes. leucocitos y plaquetas) y plasma. -2 globulinas:  Factor IX  Antiplasmina  Haptoglobina  Ceruloplasmia  Amiloide A  VLDL (Lipoproteína de muy baja densidad)  LDL (Lipoproteína de baja densidad) 3. El suero contiene las mismas proteínas del plasma excepto el fibrinógeno y los factores V y VIII de la coagulación que son consumidos durante la formación del coágulo.

De ambas. Por lo tanto. El punto isoeléctrico (PI) de una molécula (en este caso una proteína) es el pH en el cual la carga neta de la misma es cero. La velocidad de migración de una sustancia en un campo eléctrico depende de varios factores tales como la carga. migran a distintas velocidades. ocurre la separación de estas sustancias. IgA e IgG en especies domésticas. 4. Cuando una mezcla de moléculas que presentan diferente carga neta y tamaño es colocada en un campo eléctrico uniforme. Existen dos métodos generales para separación de proteínas por electroforesis:  electroforesis libre o de frente móvil. el tamaño de la partícula.1.1.7.75 g/dl 0. la proteína no migra cuando se la somete a la acción de un campo eléctrico.2.70 .60 g/dl 0.33 . dependiendo del pH de la solución. Las proteínas y los aminoácidos poseen cargas positivas y negativas debido a la presencia de grupos ionizables como el grupo carboxilo o el grupo amino. como el papel de filtro. y  electroforesis de zona. Como resultado.0. el pH.66 . lo que hace que en una solución se comporten como anfolitos. Así. agar o agarosa. El PI es inherente a la estructura primaria de la proteína.04 . J.17 g/dl 0. la fuerza iónica.57 g/dl 1. distintas proteínas con distinto punto isoeléctrico tendrán distinta carga neta. por ejemplo. la electroforesis de zona es la que tiene mayor aplicación en el laboratorio clínico por su sencillez y mayor capacidad de resolución. a modo de ejemplo se muestran los Valores Normales en suero para caninos Proteínas Totales 5.20 Electroforesis Se conoce como electroforesis al movimiento de partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.50 g/dl Albúminas  Globulinas  Globulinas  Globulinas Relación A/G 2. Si se mantiene a este pH. Tiselius fue el primero que utilizó la electroforesis en 1937 para separar los componentes del suero. lo que permitirá separarlas e identificarlas por medios electroforéticos. Para la separación de las proteínas del suero.47 . la temperatura e intensidad de la electricidad. membranas de acetato de celulosa o geles de almidón. la viscosidad del medio y además. que utiliza una matriz sólida o soporte. Fracción  globulinas:  IgM  IgA  IgE en concentraciones ínfimas  IgG Cada especie posee un perfil electroforético caracteristico. pues depende de cuáles aminoácidos forman la cadena polipeptídica.50 . a determinado pH.3. poliacrilamida. que se realiza en una fase líquida. se utiliza frecuentemente acetato de celulosa como matriz y se escoge un 37 . Estos materiales son porosos e hidratados y permiten retener las proteínas. pueden existir en tres formas iónicas: *Cargados positivamente *Cargados negativamente *Sin carga o como moléculas neutras (en una solución con pH igual a su punto isoeléctrico).   Amiloide A Ferritina Pueden aparecer trazas de IgM.

pero cada una de ellas lo hará a una velocidad diferente según su punto isoeléctrico. varía según sea la especie de la que de proceda la muestra y depende del tiempo de corrida y del voltaje aplicado. se podrán sembrar 1. El pH del buffer utilizado es de 8. 4. no pueden superarlo tan fácilmente y quedan detenidas en el punto de siembra o incluso son arrastradas hacia el polo negativo. Por lo tanto. seguidas por las alfa. Para diferenciarlas. 2. 3. Se sumergen las tiras en la solución amortiguadora (buffer) durante por lo menos 10 minutos. En estas condiciones. la albúmina es la que migra más rápidamente hacia el polo positivo.6) Cuba de electroforesis Fuente de poder Solución colorante Solución decolorante Solución transparentizante Densitómetro Integrador Procedimiento Es fundamental que todo el material que se vaya a utilizar esté bien limpio y seco. 6. El grado de separación obtenido para las proteínas de una muestra dada. Los sembradores están estandarizados para sembrar siempre el mismo volumen de muestra. en el que todas las proteínas están cargadas negativamente y migran hacia el polo positivo (ánodo). La más cargada es la albúmina. la otra no es penetrable de tal manera que no debe ser utilizada para la siembra. se conecta a la fuente de poder y se aplica una corriente constante de 200 voltios durante 30 minutos. las menos cargadas. son las gammaglobulinas. cuya carga negativa es menor. las albúminas logran superar ampliamente el efecto. seguida por: alfa. Se coloca el portaobjetos sobre el puente de la cuba de electroforesis.8-7. El paso de la corriente provoca la migración de las diferentes proteínas que conforman la muestra. Se siembran las muestras con el sembrador. Los equipos generalmente traen 3 sembradores de diferente volumen. beta y gammaglobulinas. Al efecto de la carga se suma el efecto electroendosmótico. a este pH. Se extienden las tiras sobre un portaobjetos teniendo la precaución de que no queden burbujas entre el vidrio y la tira. estos parámetros deben estandarizarse previamente según las 38 . Las tiras de acetato de celulosa tienen dos caras diferentes: una es la superficie penetrable donde deben sembrarse las muestras.4-8. con un PI mucho más cercano al pH del buffer (PI de las gamaglobulinas: 6. que consiste en un movimiento en sentido opuesto a la corriente eléctrica que detiene parcialmente la corrida de las proteínas. Según el ancho de sembrador que se utilice.2). 1. Materiales Tiras de acetato de celulosa para electroforesis Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8. las tiras tienen uno de sus ángulos recortado. todas las proteínas están cargadas negativamente. Se elimina el exceso de líquido entre dos hojas de papel de filtro. mientras que las gammaglobulinas. Una de las muestras se tiñe con azul de bromofenol. 2 ó 3 muestras por tira. 5. beta y por último las gammaglobulinas. el cual se asocia a las moléculas de prealbúmina y permite identificar el frente de corrida. Técnica La muestra se siembra sobre un soporte de agar o acetato de celulosa y se somete a corriente eléctrica. por el contrario. Este es causado porque la mayoría de los soportes no son neutros. La cuba se llena hasta una altura determinada con el buffer de corrida. las albúminas son las que migran más rápido hacia el polo positivo. con un PI mucho menor que el pH del medio (PI de la albúmina: 4. este debe quedar ubicado en el ángulo inferior derecho. Debido a su carga fuertemente negativa.pH alcalino.6.4). Por lo tanto.

La tira de acetato debe quedar completamente transparente para que pueda efectuarse la medición por densitometría.Infecciones virales. orina y líquido cefalorraquídeo (LCR). Las diferentes bandas de proteínas separadas a partir de la muestra original sobre la tira de acetato de celulosa. Mediante esta técnica se puede diagnosticar un aumento. 8. el largo de la tira que vamos a medir y la concentración de proteínas de la que partimos. 9. No deben quedar burbujas entre el vidrio y la tira. Las tiras se colocan sobre un portaobjetos con el ángulo cortado de la tira ubicado en el ángulo inferior izquierdo (en forma invertida a como lo sembramos). 10. asociada a hallazgos anormales en la electroforesis de orina (proteína de Bence-Jones)  Hipogammaglobulinemias: Disminución de las gammaglobulinas.  Enfermedades infecciosas o neoplásicas agudas: Aumento de alfa-1 globulinas. una muestra de suero equino se corre a 200 voltios durante 25 minutos. teñidas y transparentizadas.necesidades de cada caso en particular. Poliartritis .  Déficit de alfa-1 antitripsina: Disminución de las alfaglobulinas. bacterianas (brucelosis. sumergiéndolas durante 5 minutos en la solución colorante de proteinas. una muestra de suero canino se corre a 180 voltios durante 20 minutos).  Hipoproteinemias por pérdida de proteínas por el sistema digestivo: Disminución general de todas las proteínas. Debe hacerse hincapié que la electroforesis es casi siempre una prueba que puede llevar a un diagnóstico presuntivo de las anormalidades de las proteínas del suero.Enfermedades inmunomediadas: Lupus eritematoso sistémico Trombocitopenia inmunomediada Anemia hemolítica autoinmune. (Por ejemplo. Ejemplos de hiperglobulinemias  Policlonales .Neoplasias (generalmente no relacionadas con el sistema inmune) 39 . Artritis reumatoidea. son leídas en un densitómetro. Se procede luego a la decoloración de la tira. .  Esclerosis Múltiple: Aparición de bandas oligoclonales en el LCR (en humanos). Una vez finalizada la corrida. El densitómetro detecta y registra los datos de absorción de luz de cada banda de proteína y los transforma en un valor numérico de concentración y en un gráfico (ver figura al final del tema) Aplicaciones de la electroforesis La electroforesis es un método extraordinariamente valioso para el diagnóstico de las alteraciones en los componentes proteicos del suero. 7. de esta forma la cara sembrada queda boca abajo. Este procedimiento se repite hasta que las tiras queden blancas (es conveniente ir renovando la solución decolorante durante este procedimiento). orina o LCR. 11. Las tiras se sumergen en metanol puro durante 30 segundos y luego en la solución transparentizante durante 1 minuto.  Síndrome nefrótico o procesos hemolíticos: Aumento de alfa-2 globulinas. se desconecta la cuba de la fuente de poder y se procede a colorear las tiras. mirando el vidrio. Los portaobjetos se colocan en una estufa a 80 ºC hasta su transparentización total. El aparato debe ser previamente calibrado según la longitud de onda que vamos a utilizar (generalmente 520 nm). hongos. parásitos (dilofilarias). El objetivo del decolorante es barrer con el colorante que no se unió a las proteinas. piodermis). Pénfigo. 12. sumergiendo las tiras en solución decolorante. disminución o alteración de las proteínas (paraproteínemias) Por ejemplo ciertas patologías como:  Mieloma múltiple: se detecta la aparición de una banda o curva restringida en la región de las gamma globulinas.

) Ejemplos de hipoalbuminemias  Resultado de enfermedades como insuficiencia hepática crónica y síndrome de mala digestión – mala absorción.Neoplasias (Mieloma múltiple.  Hipergammaglobulinemia  Secuestro de proteínas en cavidad pleural. linfosarcoma.  Quemaduras Ejemplos de hiperalbuminemia  Deshidratación Patrones de electroforesis de anomalías de las proteínas séricas en diversas enfermedades ACETATO DE CELULOSA PROTEINOGRAMA 40 .  Patologías renales (glomerulopatías). Monoclonales . macroglobulinemia. peritoneal y tejido subcutáneo.  Dilución por fluidoterapia.

Capítulo 6. y Bautista C. Manual de Inmunología México: Editorial Diana. Edición consultada: 5º edición septiembre de 1996. Año 2000. 4. Capítulo V.: Editorial médica Panamericana 1º edición. y Terr Abba I.As.A. Inmunología e Inmunohistoquímica Fundamentos. 7° edición.Patrón electroforético del LCR en un sujeto normal y en un enfermo con esclerosis múltiple ACETATO DE CELULOSA PROTEINOGRAMA Patrón electroforético de las anomalías urinarias en mieloma ACETATO DE CELULOSA PROTEINOGRAMA Bibliografía 1. septiembre de 1986. R. Veterinarias. 3.1º edición. Capítulo 18. Margni R. 41 . 2. Inmunología Básica y Clínica Editorial El Manual Moderno S. octubre de 1972. 1993 Sección II. México D. de C. Guía de trabajos prácticos. Morilla A. Cs. Inmunología básica. Stites Daniel P. Fac. V.F. A. Bs.

El gel utilizado en esta técnica resulta de la polimerización en largas cadenas de acrilamida monomérica y su entrecruzamiento con la NN-metilenbisacrilamida. presente en exceso y un agente desnaturalizante (2mercaptoetanol o 2-ME). más pequeño es el poro obtenido. Existen sistemas de geles continuos y discontinuos. La polimerización necesita un iniciador del proceso. como el NNNN-Tetrametildiamina (TEMED) y el persulfato de amonio (PSA). La carga del polipétido se hace insignificante ante el exceso de carga negativa del SDS. lo que facilita la comparación entre muestras y los patrones de PM. la carga de todas las moléculas será idéntica y su desplazamiento en el campo eléctrico dependerá exclusivamente de su tamaño molecular. apilamiento o stacking) que permite que todos los componentes de la muestra se concentren en una zona estrecha y comiencen la migración por el gel de separación en forma simultánea. La concentración de los componentes del gel (acrilamida y bis-acrilamida) utilizados en su armado determina el diámetro de poro. En estas condiciones.4g SDS/g de proteína). el grupo tiol del 2-mercaptoetanol rompe los puentes disulfuro que puedan existir y hace que la proteína se desdoble en sus polipéptidos constitutivos. para separar los componentes de una muestra simple o compleja. De acuerdo al PM que necesitemos estudiar se seleccionará un determinado poro de gel.Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE) La técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) es un método analítico de mezclas de proteínas u otras sustancias que combina la velocidad de migración por acción de un campo eléctrico (relacionado con el tamaño molecular de la sustancia) con el tamizado molecular (relacionado con el tamaño del poro del gel soporte). Los geles de poliacrilamida pueden ser: PAGE no desnaturalizante: La muestra se analiza en su estado natural y este método nos permite identificar el peso molecular (PM) de sus componentes. Cuanto mayor es el porcentaje de acrilamida/bisacrilamida utilizado. SDS-PAGE: La muestra se analiza luego de un proceso de disociación de la muestra con detergentes. En consecuencia. En los sistemas discontinuos (los más usados) los buffers utilizados para los geles de apilamiento y de separación poseen diferente fuerza iónica y pH. El SDS-PAGE permite determinar aproximadamente el PM de una proteína si se la compara con patrones conocidos que hayan sido analizados simultáneamente. los que fijan SDS en una relación constante (1. A continuación describiremos las características del SDS-PAGE. El TEMED cataliza la formación de radicales libres a partir del persulfato de amonio. por ejemplo: 15% de acrilamida permite separar un PM de 12 a 45 kD 10% de acrilamida permite separar un PM de 17 a 50 kD 5% de acrilamida permite separar un PM de 60 a 200 kD Las muestras se siembran en un gel de poro grueso (gel de paso rápido. 42 . Este método es el más utilizado en Inmunología y nos permite identificar antígenos o epitopes secuenciales ya que la muestra que se analiza está desnaturalizada o disociada. Las muestras a analizar son hervidas a 100C en presencia de un agente disociante (dodecilsulfato de sodio o SDS).

 Ubicar el sándwich en la abrazadera de manera que la placa más pequeña quede hacia delante (introducir entre ambos platos la tarjeta alineadora).Siembra de las muestras en el gel D. Armado del gel entre de placas de vidrio:  Realizar una delicada limpieza de las placas de vidrio con alcohol etílico. Las proteínas del mismo PM corren en forma conjunta.Preparación de las muestras C.  Verificar que no existan pérdidas de líquido: colocar agua entre ambos platos con una pipeta plástica y observar si el nivel de agua desciende. se describen los pasos necesarios para realizar un gel de poliacrilamida al 15% utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios Bio-Rad). 1.Análisis e interpretación de los resultados Los geles teñidos muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se observarán un número de bandas variables dependiendo de las distintas proteínas que componen la mezcla. por lo tanto.  Si existen pérdidas. La distancia que recorrió cada proteína en el gel desde el sitio de sembrado de la muestra es proporcional a su peso molecular.Corrida electroforética E.  Formar un sándwich con ambos vidrios ubicando entre ellos los espaciadores.En forma de síntesis los pasos a seguir son: A.  Ajustar los tornillos de la abrazadera en forma manera cruzada.Armado del gel de poliacrilamida B. Algunas de las utilidades son: Identificar el PM de los componentes en muestras complejas Identificar pureza en extractos purificados Constituir el primer paso para el análisis antigénico en muestras que se conoce como inmunoblot Anexo A modo de ejemplo. rehacer el armado. 43 . cuanta más distancia recorrida menor el PM de esta proteína.Tinción del gel F.

2.  Dejar que la acrilamida polimerice durante 60 minutos a temperatura ambiente. Una vez gelificado. 3. Por lo tanto. El oxígeno inhibe la polimerización. Es fundamental que la cámara que se genera entre los dos geles no pierda.  Preparar el gel de separación: Agregar al frasco las respectivas cantidades de agua. Si esto sucede es posible sellar los bordes de la cuba con agar al 1%. Preparación de la solución de poliacrilamida-bisacrilamida La preparación del gel de poliacrilamida debe realizarse en un frasco limpio y desengrasado. Los geles de poliacrilamida quedarán comunicando las dos cámaras (una anódica y otra catódica) y el pasaje de corriente a través del gel producirá la corrida del material a analizar.  Verter la solución con una pipeta plástica entre ambas placas hasta 2 cm por debajo del borde superior. retirar el peine. se coloca el soporte dentro del tanque y se llena la cámara exterior con un volumen de buffer que llegue aproximadamente hasta la mitad de su altura. del correcto armado dependerá el éxito del análisis de la técnica. Debe trabajarse siempre con guantes y preferentemente con barbijo (la acrilamida es una sustancia neurotóxica que se absorbe a través de piel y mucosas).  44 . hasta lograr el aislamiento de la cámara interior.  Una vez ocurrida la gelificación. Para comprobar esto se debe cargar con buffer la cámara interna fuera del tanque y observar que no se produzcan pérdidas. retirar el agua.  Preparar el gel de apilamiento o stacking. evitando la formación de burbujas.5 M Tris y SDS 10%.  Agregar los agentes iniciadores de la polimerización: PSA y TEMED. que generalmente demora entre 20 y 30 minutos. verter el gel de stacking y colocar el peine (para generar las calles) suavemente. Una vez logrado esto. 1.8). mezcla de acrilamida: bisacrilamida (en una proporción de 30:0. de manera que los pasos a seguir deberán realizarse con la debida celeridad. Se debe tener en cuenta que la mezcla comenzará a gelificarse. Se colocan ambos geles en el soporte ad hoc tomando en cuenta la limpieza de las gomas y su lubricación. Hacer esto mientras gelifica el gel de separación. No agregar el PSA ni el TEMED a la solución de gel de apilamiento hasta que el gel de separación haya gelificado. por lo que se recomienda desgasificar el agua y todas las soluciones a utilizar. El buffer con que se llenan las cámaras y que se utiliza para la corrida es denominado buffer electrodo. Armado de la cuba  Con el armado de la cuba se generan las dos cámaras entre las cuales pasará la corriente eléctrica. Agregar rápidamente unas gotitas de agua sobre la solución para evitar el ingreso de oxígeno que retrasa la polimerización de la acrilamida.

se desconecta la fuente de poder y se desarma la cuba. permite determinar en qué momento la muestra ha alcanzado la parte inferior del gel. 70 volts durante 2 a 3 horas. pero el rango de detección se encuentra entre 1 a 10g. Preparación de las muestras El volumen máximo de muestra que puede sembrarse por cada calle es de 20l. tomando nota del orden en el que fueron sembradas para poder identificarlas más tarde. Con guantes y una espátula se despega el gel de los vidrios. 5. marcado por el colorante presente en el buffer muestra.4. El destino de este gel puede ser la tinción o la 45 . y por lo tanto el volumen real de la muestra será de 10l. En este caso. Corrida La cuba se conecta a la fuente de poder y se corre a voltaje constante. Como control se agrega una calle con marcadores de PM. Nota: La sensibilidad de la técnica depende del colorante de proteínas que se va a utilizar para ver las bandas. En el caso de muestras complejas conviene sembrar de 50 a 100g de proteína total. Una vez diluida la muestra en su buffer se debe hervir durante 10 minutos a fin de que se produzca la desnaturalización de las proteínas a estudiar. El frente de corrida. Siembra de las muestras Las muestras se siembran una por cada calle. Una vez concluida la corrida. Estos marcadores son una mezcla de proteínas con PM conocido que permiten confirmar el tamaño de un fragmento cualquiera en el gel. hay que considerar que la muestra está diluida en buffer muestra (preparado a una concentración de 2X). 6.

La tinción argéntica. 1996. se lo sumerge en colorante Azul de Coomassie (Coomassie Blue). Interamericana. 46 . 7. Ed. R. se puede utilizar la tinción argéntica (Silver stain) que permite detectar hasta 2 ng de proteínas por banda. además es útil para detectar polisacáridos y proteínas altamente glicosiladas. 1988.2 a 0. Cold Spring Harbor Laboratory. Coloración de las proteínas corridas Si el destino es la coloración para proteínas. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. En los casos en que la sensibilidad de la tinción con Coomassie Blue no sea suficiente.transferencia a una membrana de nitrocelulosa para posteriormente identificar la proteína por inmunoreactividad. Ed. La solución colorante contiene ácido acético que permite fijar las proteínas a la vez que se tiñen. Bibliografía  Antibodies A Laboratory Manual.  Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell Instruction Manual.A. pp726.5 g de proteínas. Bio-Rad  Margni. Ed. Este colorante permite detectar entre 0. Harlow y David Lane.

47 .

o sea el total de la solución. A tal fin.Introducción a las técnicas serológicas El diseño de una técnica inmunológica está relacionado con el resultado que pretendemos obtener. Controles internos y externos Para que una técnica sea convalidada necesitamos incluir controles internos y externos. El título es una manera indirecta de cuantificar la sustancia reaccionante y es directamente proporcional a la cantidad de "sustancia" presente en la muestra y al límite de detección de la técnica utilizada. cuando tenemos un resultado expresado en título debemos indicar cuál fue la técnica empleada. Este resultado permite clasificarlas en:  TÉCNICAS CUALITATIVAS Indican la presencia o ausencia de una "sustancia" (antígeno o anticuerpo) en una muestra. llamados “laboratorios de referencia”. Antes de realizar la lectura de las muestras problemas debe confirmarse que los resultados de los controles internos se encuentren dentro de los rangos esperados. un suero) más una cierta cantidad de diluyente (por ejemplo solución fisiológica o medio de cultivo) Puede expresarse como una fracción donde el numerador representa la unidad del soluto (S) y el denominador la suma del soluto más el diluyente (D).  TÉCNICAS SEMICUANTITATIVAS Brindan una idea de la cantidad de “sustancia” presente en una muestra.Dilución 1/8 (factor de dilución 8): . Por ejemplo . La cantidad de la sustancia presente en la muestra se calcula a partir de la curva patrón. 48 . Generalmente son históricos y deben corresponder a sueros o muestras cuyos resultados son positivos y a otros cuyos resultados deben ser fehacientemente negativos. Método de obtención del título en las técnicas semicuantitativas Las técnicas semicuantitativas utilizan la dilución de la muestra a fin de evaluar los niveles de antígeno o anticuerpo presentes en ella. por interpolación del resultado obtenido en la medición de la muestra problema. 1 parte de S + 7 partes de D. 1 parte de S + 9 partes de D. o soluto (en el ejemplo.  Consideramos controles internos a aquéllos que se corren simultáneamente en cada prueba que se realiza.Dilución 1/10 (factor de dilución 10): 1 parte de S + 1 parte de D. que es la inversa de la última dilución que da resultado positivo. Por esto. En algunos casos el resultado es suficiente para confirmar un diagnóstico.  TÉCNICAS CUANTITATIVAS Determinan la cantidad o la concentración de la "sustancia" presente en una muestra. .  Nos referimos a controles externos a aquéllos que son evaluados en otros laboratorios. Diluciones Una dilución es una mezcla volumen/volumen en proporciones conocidas. Requieren utilizar estándares de concentraciones conocidas que se evalúan simultáneamente con la muestra y nos permiten realizar curvas patrones.Dilución 1/2 (factor de dilución 2): .Dilución 1/5 (factor de dilución 5): . formada por una cierta cantidad de la sustancia que queremos diluir. que controlan y avalan nuestros resultados. de no ser así la prueba debe descartarse y repetirse para obtener un resultado confiable. 1 parte de S + 4 partes de D. la técnica se realiza sobre varias diluciones de la muestra para obtener el título.

precipitación. . (Factor de dilución=2) 1/2 x2 1/4 x2 1/8 x2 1/16 x2 1/32 x2 1/64 (2=1+1) 1+1 1+1 1+1 1+1 1+1 Dilución seriada en base 10. La reacción observada entre antígeno y anticuerpo dependerá de la técnica que se use (aglutinación. 49 .3) se expresa como 10 -0. La principal aplicación de este concepto se refiere al nivel de anticuerpos específicos (contra un antígeno dado) presente en un suero u otra muestra biológica. (Factor de dilución =10) 1/10 x10 1/100 x10 1/1000 x10 1/10000 (10=1+9) 1+9 1+9 1+9 En todos los casos. 32. se descarta del último tubo la misma cantidad que tomamos de cada uno de los tubos anteriores. 1/5 ó 1/2.5 = 1/3) Una dilución seriada es aquélla en la que se realizan diluciones sucesivas del soluto. Para obtener el título de anticuerpos. Así. El título nos da una idea de los niveles de antígeno o anticuerpo presentes en una muestra. si deseamos mantener el volumen constante. se hace una dilución seriada de dicho suero y a cada dilución se la enfrenta con una cantidad fija del antígeno para el cual es específico.5 ml de volumen final: 0. es decir.1 ml de S + 0.2 ml de D .(0.1.3 ml de volumen final: 0. por ejemplo. El título de anticuerpos presentes en el suero (título del suero) será la inversa de la mayor dilución en la que se observa reacción positiva. que la mayor de estas cuatro diluciones es 1/10. por ejemplo. En el siguiente ejemplo: Dilución 1/2: reacción positiva Dilución 1/4: reacción positiva Dilución 1/8: reacción positiva Dilución 1/16: reacción positiva Dilución 1/32: reacción positiva Dilución 1/64: reacción negativa El título será la inversa de la dilución 1/32.3 = 1/3) . de un suero. Por ejemplo: Dilución seriada en base 2.).5 ml de S + 1.0. con sólo colocar el logaritmo del denominador de la fracción como potencia negativa.5/1.3) O sea. Para preparar una dilución 1/3.1/0.(0. ELISA. por ejemplo: la dilución 1/2 (log 2= 0.Las diluciones pueden expresarse también en forma logarítmica. se pueden usar diferentes volúmenes según el requerimiento de la técnica a usar: Dilución 1/3: 1 parte de S + 2 partes de D. S está más diluido en la dilución 1/10 (10-1) que en 1/8.0 ml de D .3 la dilución 1/10 (log 10=1) se expresa como 10 -1 Como se ve. (10-0. de forma tal que el factor de dilución se mantiene constante y la dilución anterior se utiliza como fuente de soluto para la dilución siguiente. etc.

tonicidad. La forma complementaria de las nubes de electrones en el sitio de combinación entre el anticuerpo (paratope) y el determinante antigénico (epitope) hace que las dos moléculas encajen de manera ajustada. la especificidad de la reacción se emplea además para diferenciar e identificar virus. En medicina veterinaria. para establecer diagnósticos y desarrollar planes sanitarios frente a distintas enfermedades. se produce superposición de las nubes electrónicas y se generan fuerzas de repulsión que determinan que la fuerza de unión (afinidad) sea diferente en distintos anticuerpos que reconocen un mismo epitope. sólo una comparación con valores propios (previos y posteriores) puede determinar si ha aumentado o disminuido la respuesta frente al antígeno. Conversión serológica o seroconversión Se dice que hay conversión serológica cuando el título de anticuerpos contra determinado antígeno en un individuo aumenta en por lo menos dos diluciones seriadas entre una primera y una segunda muestra de sangre obtenida esta última. El nivel o título de anticuerpos específicos contra un antígeno en particular presentes en el suero de un individuo refleja la respuesta inmune humoral de ese individuo frente a ese antígeno. Cuando la complementariedad espacial no es la ideal.Si la dilución 1/64 hubiese dado un resultado positivo. de modo que la distancia intermolecular se torna muy pequeña y aumentan en grado considerable las fuerzas de interacción no covalentes que participan en la unión. La seroconversión aporta datos referentes a la etapa de la infección en la que se encuentra un individuo. La reacción Ag-Ac implica una unión de tipo no covalente. sobre todo en enfermedades tales como toxoplasmosis o leptospirosis. La especificidad de la reacción antígeno–anticuerpo es de tal magnitud que el cambio de un solo aminoácido de una proteína puede provocar el reconocimiento nulo por parte de un anticuerpo o al menos variaciones significativas de su afinidad por la proteína modificada. etc. en las que únicamente el aumento del título de anticuerpos contra los respectivos microorganismos indica enfermedad aguda. bacterias. glóbulos rojos (determinación de grupos sanguíneos) u otros antígenos en diferentes muestras biológicas (sangre. deberíamos haber seguido diluyendo el suero hasta llegar al primer resultado negativo: cuando nuestro objetivo es obtener el título de un suero debemos llegar hasta la dilución límite o final de reacción. el análisis serológico poblacional es empleado para realizar estudios epidemiológicos. o sea al error experimental aceptado. Independientemente de la técnica utilizada para determinar el título podemos decir que dado que la capacidad de respuesta es propia de cada individuo y está influenciada genéticamente. orina. Una variación menor a 2 diluciones podría deberse sólo a variaciones en el procedimiento. Las técnicas inmunológicas pueden ser de interacción primaria o secundaria 50 . En el campo de la investigación aplicada y el laboratorio de diagnóstico. suero. tejidos. tales como hormonas. por lo menos 15 a 20 días después de la primera. reversible entre ambas moléculas. Esta característica se emplea en diferentes campos de la investigación científica para la identificación y caracterización in vitro de infinidad de moléculas. drogas. etc). temperatura) y pueden emplearse como una herramienta diagnóstica de rutina tanto en laboratorios de investigación básica como en la clínica médica veterinaria. Fundamentos de las técnicas serológicas Las reacciones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) pueden llevarse a cabo in vitro si se respetan las condiciones fisiológicas en las que normalmente ocurren (pH.

Esta confirmación constituye el denominado estándar de oro (gold standard). como la concentración del anticuerpo y del antígeno. Dado que no siempre es posible la identificación del agente involucrado. Según la solubilidad del antígeno involucrado en la reacción (soluble o particulado) recibe diferentes nombres:  SI EL ANTÍGENO ES SOLUBLE. que se obtienen al comparar los resultados obtenidos en la prueba evaluada con los obtenidos con la prueba estándar de oro o de referencia. Sin embargo. la detección de anticuerpos específicos contra ese agente se puede emplear como herramienta para arribar al diagnóstico. Si el antígeno es polivalente (varios determinantes antigénicos) y el anticuerpo actúa como divalente o polivalente. Estos métodos transforman la reacción primaria en señales (radiactivas. La reacción no se puede reconocer a simple vista. Existen dos parámetros empleados generalmente para evaluar las pruebas diagnósticas en general y las pruebas serológicas en particular: la sensibilidad y la especificidad. Características de una prueba serológica Las interacciones primarias Ag-Ac no siempre son detectables por interacción secundaria o terciaria. colorimétricas o fluorescentes) que pueden interpretarse y cuantificarse. que son de tipo cuantitativo. como las propiedades de la clase de inmunoglobulina comprometida en la reacción y las características del antígeno. una enzima (en las pruebas de ELISA. y cualitativo. 51 . por lo tanto. pueden presentarse manifestaciones visibles en el animal evaluado. se forma una red o entramado en el que un anticuerpo está unido a por lo menos 2 partículas antigénicas diferentes y cada partícula antigénica está unida a una o más moléculas de anticuerpo. el estándar de oro puede ser una biopsia u otro criterio que pueda diagnosticar inequívocamente la enfermedad. SE DENOMINA PRECIPITACIÓN. Inmunoblot e Inmunohistoquímica) o un fluorocromo (en la Inmunofluorescencia). No todas las pruebas serológicas tienen la misma capacidad para diferenciar los individuos sanos de los enfermos. Las pruebas serológicas aplicadas al diagnóstico de enfermedades infecciosas: El estado de enfermedad de un individuo se confirma por el aislamiento del agente causal. para determinar si la misma tuvo lugar se emplean métodos en los que el antígeno o el anticuerpo se marcan con una molécula que puede ser un radioisótopo (en la prueba de RIA). Los anticuerpos calostrales y los producidos por vacunaciones son reconocidos de la misma manera que los producidos por el agente salvaje. En enfermedades no infecciosas.  De Interacción SECUNDARIAS: Es la consecuencia de la unión antígeno-anticuerpo luego de ocurrida la reacción primaria.  SI EL ANTÍGENO ES PARTICULADO. dadas por las características del antígeno y del anticuerpo. Existen requisitos mínimos para que las reacciones secundarias o terciarias se produzcan. SE DENOMINA AGLUTINACIÓN.  De interacción TERCIARIAS: Cuando el reconocimiento del antígeno por el anticuerpo ocurre in vivo. debemos considerar que la sola detección de anticuerpos específicos contra un microorganismo no significa que el individuo esté enfermo. Esta reacción puede observarse a simple vista. además de la concentración de sales en el medio. De Interacción PRIMARIA: Ocurren en milisegundos y están determinadas por la afinidad del paratope del anticuerpo por el epitope de un antígeno.

52 . ESPECIFICIDAD: Es la habilidad de una prueba para detectar SOLO a los animales probadamente enfermos (verdaderos positivos). E: Proporción de verdaderos negativos que son detectados. (D) Negativos por ambas técnicas (Negativos Verdadero) Población sana S E Población enferma Resultado de la prueba: + Valor de corte S: Proporción de verdaderos positivos que son detectados. (B) Negativos reales que la técnica objeto de valoración da como positivos (Falsos Positivos). Dicho de otra manera.Podemos definir entonces: SENSIBILIDAD: Es la habilidad de una prueba para detectar a TODOS los animales probadamente enfermos (positivos reales). (C) Positivos reales que la técnica objeto de valoración da como negativos (Falsos Negativos). Técnica de Referencia o Infección Real + (enfermo) Técnica Objeto de Valoración + (sano) B A C D Los cálculos se realizan mediante las fórmulas: SENSIBILIDAD = A / A+C ESPECIFICIDAD = D / B+D En las que: (A) Positivos en que coinciden ambos métodos (Positivos Verdadero). es la capacidad detectar como negativos a los que verdaderamente negativos.

Este concepto se refiere a la cantidad mínima de anticuerpos reaccionantes necesaria para que éstos puedan ser detectados por una determinada técnica. como método alternativo al uso de radioisótopos radioinmunoensayo (RIA). Inmovilización del inmunorreactante (antígeno o anticuerpo) en la fase sólida. Esta técnica se denomina ELISA. posee un equilibrio dinámico con una primera etapa reversible y una etapa irreversible.5000 1 . Como toda reacción antígeno-anticuerpo.utilizados) y del tiempo y temperatura en que se produce la reacción (incubación). al mismo tiempo que Van Weemen y Schuurs en Suecia (1971) describieron una técnica inmunoenzimática para detectar antígenos o anticuerpos en líquidos corporales. Detección del antígeno o anticuerpo mediante la utilización de un segundo anticuerpo conjugado con una enzima.0000 ELISA Engval y Perlmann en Holanda.0003 0. Ambas (ELISA y RIA) son técnicas de interacción primaria.  Deben ofrecer un amplio rango de linealidad entre su concentración y la intensidad de color formado. Enzimas utilizadas en los ensayos inmunoenzimáticos Las enzimas a ser utilizadas en estos ensayos deben reunir ciertos requisitos.  No deben ser fotosensibles.0001 0.4. 53 .  Deben ser estables al almacenamiento y luego de la detención de la reacción enzimática. Reacción del inmunorreactante con su correspondiente antígeno o anticuerpo. 3.  Los sustratos de estas enzimas deben poseer un alto coeficiente de extinción molar. 2. En la tabla se ejemplifican los valores de sensibilidad como límite de detección de las técnicas inmunológicos a fin de compararlas Técnica RIA ELISA AGLUTINACIÓN INMUNOFLUORESCENCIA PRECIPITACIÓN (*) (*) Difusión doble en agar Límite de detección (mg/ml de Ac) 0.  Deben ser solubles en agua. El revelado de esta interacción Ag-Ac se realiza utilizando alguno de los dos componentes de la interacción (generalmente un anticuerpo) marcado con una enzima (conjugado).El término sensibilidad posee otra acepción que se refiere al nivel de detección mínimo o límite de detección de una técnica inmunológica. El ELISA es una técnica de interacción primaria que permite evidenciar la presencia de anticuerpos (o antígenos) a través de la unión específica con su antígeno (o anticuerpo) correspondiente que se encuentra unido a un soporte inerte. La presencia de la enzima en la reacción se revela a través de la transformación de un sustrato incoloro en un producto coloreado. Existen diversos esquemas de la técnica que comprenden generalmente tres etapas: 1.0300 0. inodoras y atóxicas. incoloras. Esta cinética depende de la molaridad del medio (soluciones tamponadas -o buffers. con un máximo de absorbancia entre 400 y 600 nm. por el acrónimo del término en inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay o Ensayo Inmuno-absorbente Ligado a Enzimas.

Para revelar la reacción química producida se utilizan diferentes cromógenos.6 o en buffer fosfato (PBS) pH 7 y se adsorbe sobre los hoyos de una microplaca de plástico durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. Se agrega una solución que contiene proteínas que no son reconocidas por los anticuerpos específicos (solución bloqueante).-bencenodiamina.2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfonato de diamonio (ABTS). obtenida del rabanito (HRP: Horse-Radish Peroxidase).  orto-fenilendiamina (OPD) o 1. que reacciona con el ácido 3-(dimetilamino) benzoico (DMAB). que absorben a 492 nm. Cuando se oxida vira al color ocre  Diaminobenzidina (DAB): cuando se oxida vira al color pardo El sustrato más utilizado con peroxidasa es el agua oxigenada o peróxido de hidrógeno (H2O2): La acción de la peroxidasa sobre el peróxido de hidrógeno degrada este compuesto dando agua y liberando oxígeno (O-). La peroxidasa más utilizada.  -5.05-0. El Ag (ej: Brucella abortus) se resuspende en buffer Carbonato-Bicarbonato pH 9.  3-metil-2-benzotiazolinona hadrazona (MBTH). 1. posee un alto contenido en hidratos de carbono que facilita la conjugación a anticuerpos. la peroxidasa acelera el proceso de degradación del sustrato sin perder su funcionalidad. a su vez. oxida al cromógeno que pasa de incoloro en su estado reducido a coloreado en su estado oxidado. Estas enzimas hidrolizan una amplia gama de ésteres de fosfatos (como los de alcoholes primarios. Se puede 54 . -galactosidasa y glucosa-oxidasa.(dador de electrones) Cromógeno (-) incoloro (-) reducido. a) Procedimiento general de la técnica de ELISA aplicada a la medición de anticuerpos: La muestra a evaluar puede ser un suero. tienen un pH óptimo alcalino (por lo que se emplean soluciones a base de dietanolamina con pHs cercanos a 9) y requieren Mg y Zn como cofactores. secundarios. para limitar la unión inespecífica de proteínas. fenoles y aminas). Fosfatasa alcalina Las fosfatasas alcalinas utilizadas en los ELISAs se aíslan a partir de intestino bovino o de Escherichia coli.1% de Tween 20 en PBS (PBST). que absorbe a 590 nm. se encuentra en condiciones de reaccionar nuevamente una y otra vez es por eso que debe agregarse una sustancia de solución de freno o stop que modifica el pH. 3. El exceso de Ag se remueve mediante lavados con 0. Peroxidasa Las peroxidasas son hemoproteínas que transfieren Hidrógeno desde un donante (DH) al O del H2O2. cuando se oxida vira al color verde. (+) oxidado Cromógeno (+) coloreado Como todas las enzimas.bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazolium (NBT/BCIP) que vira de incoloro a azul. por lo tanto. 2. Desde hace algunos años se ha difundido el uso de ureasa.2. H2O2 (sustrato) PO H2O + O.La peroxidasa y la fosfatasa alcalina son las dos enzimas más utilizadas. un producto de secreción o de excreción. Los cromógenos más utilizados para esta enzima son:  -pNPP (paranitrofosfato) que vira de incolora a amarillo. El oxígeno. que absorbe a 405 nm. entre ellos:  2.

éste no reconoce ninguna molécula específica y se elimina al realizar el último lavado. La enzima queda adherida y se produce así la reacción al agregar el sustrato. 4. 4. 5. el anticuerpo conjugado reacciona con él y queda unido. Se agrega el suero problema y los sueros control positivo y negativo por duplicado o triplicado. un producto de secreción o de excreción. ambos modifican el pH y la reacción se frena. 3. se observará la aparición o cambio de color en el sustrato. El anticuerpo específico para ese antígeno se resuspende en buffer Carbonato-Bicarbonato pH 9. 6. 9. para limitar la unión inespecífica de proteínas. Se agrega el sustrato de la enzima. Por lo tanto. Se agrega una solución que contiene proteínas que no son reconocidas por los anticuerpos específicos (solución bloqueante). abortus). El exceso de solución bloqueante se remueve mediante lavados con PBST. Al agregar el Ac anti-bovino marcado con la enzima. a fin de eliminar las proteínas unidas de manera inespecífica a los soportes sólidos. La reacción cromática puede ser leída a simple vista o cuantificada por espectrofotometría. en este caso es un suero bovino en el que se analiza la presencia de Acs anti-B.utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS.1% de Tween 20 en PBS (PBST). Al agregar los anticuerpos conjugados a la enzima. éstos reconocen y se unen a los anticuerpos del suero.05-0. el resto de los anticuerpos se eliminan con el lavado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. 7.6 o en buffer fosfato (PBS) pH 7 y se adsorbe a los hoyos de la placa durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. 2. Por esto es tan importante que después de cada incubación se proceda al lavado con soluciones salinas con detergentes suaves. De no haber anticuerpos específicos en el suero problema. El exceso de Ac se remueve mediante lavados con 0. Si el Ac específico está presente. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. al agregar el sustrato no se producirá ninguna reacción específica. El freno depende de la enzima utilizada y es en el caso de peroxidasa ácido sulfúrico y para fosfatasa se utiliza el hidróxido de sodio. 10. La intensidad de la reacción es proporcional a la cantidad de enzima activa presente en cada hoyo. 1. Dado que las enzimas pueden continuar degradando el sustrato dependiendo del tiempo y la temperatura se realiza el frenado de la actividad enzimática a tiempo de reacción determinado que se relaciona con la aparición de color en los controles negativos de sustrato. En un primer paso. Se agrega un anticuerpo unido a enzima (conjugado) que reconoce a las inmunoglobulinas de la especie de la cual estamos evaluando el suero (En este caso. el conjugado será un Ac anti-Ig bovina). Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. El exceso de solución bloqueante se remueve mediante lavados con PBST. los anticuerpos del suero se unen al antígeno pegado a la placa. Se puede utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS. (El suero problema es aquél del cual se quiere conocer si posee Acs específicos contra el Ag que se encuentra pegado en la placa. 8. 55 . El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST. 11. Lectura: En caso de haber anticuerpos antibrucella en el suero bovino problema. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. Se puede observar un nivel bajo de señal por autodegradación del sustrato o debido a la presencia de enzima por lavado ineficaz de la placa. Los anticuerpos no unidos al Ag se remueven mediante lavados con PBST. La reacción de la enzima con el sustrato resulta en un producto coloreado y es un indicador visual de que la reacción antígeno-anticuerpo ha tenido lugar. b) Procedimiento general de la técnica de ELISA aplicada a la medición de antígenos: La muestra a evaluar puede ser un suero.

5. Se agrega la muestra a evaluar (muestra problema) y los controles positivos y negativos por duplicado o triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. (Muestra problema es aquélla en la que se quiere determinar la presencia del Ag para el que son específicos los Acs fijados a la placa) 6. Los antígenos no unidos al Ac se remueven mediante lavados con PBST. 7. Se añade un segundo anticuerpo específico para ese antígeno, pero unido a una enzima (conjugado). Si el Ag específico está presente, el anticuerpo conjugado reacciona con él y queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST. 8. Se coloca el sustrato de la enzima y se relaciona la actividad enzimática observada con la concentración del antígeno presente en la muestra.

Clasificación de los ELISAs
Los ELISAs pueden clasificarse: - Según busque antígenos (Directo) o anticuerpos (Indirecto) Según la metodología utilizada en:

1- De amplificación de actividad o no competitivos En estos ELISAs se emplea un exceso del inmunorreactante con el objeto de obtener una señal máxima debida a la presencia del compuesto a medir. Estos ELISAs se subdividen de acuerdo a que el antígeno o anticuerpo a identificar sea inmovilizado en la fase sólida (ELISA directo) o capturado por la molécula complementaria (ELISA indirecto y ELISA sándwich). ELISA DIRECTO: La muestra problema (de la cual no se sabe si contiene o no Ac o Ag) se inmoviliza sobre la fase sólida. En caso de analizar Ac, estos se detectan por medio de Ags conjugados, y en el

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caso de analizar la presencia de Ag, estos se detectan por Ac conjugados. (Fig. 1).

Positiva Negativa

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ELISA INDIRECTO: En el ELISAs indirecto el antígeno o anticuerpo a identificar es capturado en la placa por la molécula complementaria (Ag o Ac), según corresponda. O sea, si se desea detectar Acs específicos en un suero, se inmoviliza el antígeno en la fase sólida y se lo hace reaccionar con el suero problema. Luego se utiliza un Ac anti-Ig de la especie conjugado a una enzima. Este sistema tiene alta detectabilidad debido a que varias moléculas del conjugado enzimático (AntiIg marcados con la enzima) pueden unirse a cada molécula de Ac que reaccionó a su vez con el Ag inmovilizado, este efecto se traduce en una amplificación de la señal. (Fig. 2)

= Ac problema o incógnita

ELISA DE CAPTURA O SANDWICH: Este sistema se emplea para la cuantificación de Ags o para la detección de Acs contra el Ag capturado. En general es deseable que el conjugado enzimático y el Ac inmovilizado provengan de la misma especie para evitar interferencias en el sistema, originadas por reacción cruzada del conjugado con el Ac de captura. Para la detección de antígenos: se inmoviliza un Ac con el que se “captura” el Ag y se revela su presencia con un conjugado enzimático anti-Ag, (Fig. 3).

Para la detección de anticuerpos: se inmoviliza un Ac con el que se “captura” el Ag, se agrega el anticuerpo problema o incógnita y se revela su presencia con un conjugado enzimático antiAc o anti especie, (dibuje el esquema basándose en la Fig 3).

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2. Existen dos diseños generales de ensayos de modulación de la actividad: a) Incubación simultánea: El compuesto marcado con enzima y el compuesto sin marcar (compuesto a dosar) se incuban simultáneamente en el sistema. Como se observa se inmoviliza el Ag patrón conocido en la placa y se cuenta con Acs anti-Ag específicos marcados con enzima. Cuanto más antígeno problema haya reaccionado en la fase líquida menos cantidad de anticuerpo marcado podrá reaccionar en la placa con el Ag patrón. respectivamente). aplicando cualquiera de estos dos diseños generales. Cantidades pequeñas del conjugado enzimático permiten obtener una mayor detectabilidad. En una segunda etapa se incuba el compuesto marcado enzimáticamente. por lo que los resultados (cantidad de antígeno en la muestra) son inversamente proporcionales a la densidad óptica obtenida. 59 . Por ejemplo: en el ELISA competitivo se puede inmovilizar el anticuerpo en la fase sólida y agregar el antígeno marcado con la enzima. Se observará una disminución de la actividad enzimática a medida que aumenta la cantidad de antígeno libre no marcado presente en una solución patrón o en la muestra problema.De modulación de actividad o competitivos Estos ELISAs se basan en la competición del analito a evaluar (antígeno o anticuerpo incógnita) con un reactivo patrón de similar estructura y afinidad (antígeno o anticuerpo conocido o patrón) y se detecta el resultado de esta reacción luego de la estabilización del sistema. En la Fig 4 se muestra un ELISA de competición en etapas una de las cuales se realiza en fase líquida. el que reaccionará con los sitios no ocupados por el compuesto que reaccionó en la primera etapa. El producto coloreado formado es inversamente proporcional a la concentración de antígeno libre. La muestra problema (en la cual se quiere conocer la presencia y cantidad del antígeno) se incuba en fase líquida con el anticuerpo marcado y luego se realiza el ELISA en placa con el antígeno patrón adsorbido en la placa. El conjugado enzimático puede ser antígeno o anticuerpo según el esquema. el que modula por competición con el compuesto a analizar (antígeno o anticuerpo. b) Incubación en etapas o por saturación: El compuesto no marcado (a ser dosado) se incuba en una primera etapa.

Muestra negativa Muestra positiva o incógnita o patrón Cálculo del valor de corte Para la interpretación del ensayo y a fin de poder diferenciar entre muestras positivas y negativas. En muchos casos existe una zona de solapamiento en la distribución de la reactividad de sueros positivos y negativos.O promedio de los controles del suero negativo + 2 desvíos estándar del suero negativo.Control negativo: suero de un animal sano y virgen (libre de anticuerpos específicos). Valor de corte = D. ya sean positivos o negativos.Control positivo: suero de un animal convaleciente o polivacunado. Los controles deben permitirnos afirmar que el cambio de color detectado corresponde a la interacción específica entre Ag y Ac y no a reacciones inespecíficas. El valor de corte debe ser tal que minimice los resultados falsos. B. Podemos ejemplificar los controles en un ELISA indirecto de la siguiente manera:  Controles de los sueros Los valores obtenidos con estos controles repetidos en todos los ELISAs a través del tiempo nos permite detectar repetitividad del ensayo y comparar resultados de diferentes días o entre laboratorios. Si las reacciones inespecíficas se detectan estas deben ser minimizadas y tomadas en cuenta en el momento de establecer el valor de corte. Por este motivo el valor de corte se determina de manera tal de tener más falsos positivos o falsos negativos. debe calcularse el valor de corte utilizando la siguiente fórmula. 60 . A. según qué tipo de error produzca consecuencias menos graves. en la que no puede establecerse con certeza si una muestra es positiva o negativa. Controles Para una correcta interpretación de los resultados deben realizarse controles de todos los reactivos utilizados. con alto título de anticuerpos específicos.

se coloca el anticuerpo conjugado y por último el sustrato. Este control debe dar positivo. Controles del conjugado A. el cual no debería reaccionar ya que no hay antígeno pegado en la placa. Ambas se caracterizan por su elevada afinidad por la biotina (Ka=1015 M1 ).  Control del sustrato: Este control nos permite determinar que el sustrato de la enzima no reacciona con ningún otro componente del sistema excepto con la enzima.Control positivo del Conjugado: Este control se realiza a fin de determinar que el anticuerpo conjugado a la enzima interactúa correctamente con el anticuerpo primario. ya que no hay en los hoyos enzima que catalice la reacción. sin que se afecte su actividad biológica. Sistema avidina-biotina / estreptavidina-biotina: La avidina es una proteína de la clara de huevo y la estreptavidina es una proteína producida por ciertas levaduras. y no se coloca el anticuerpo conjugado. Ac y enzimas) por unión covalente. es decir debe haber color en los hoyos indicando el correcto funcionamiento del conjugado. La utilización de sistemas alternativos en algunas etapas de las reacciones de ELISA permiten amplificar los límites de las reacciones Ag-Ac y/o facilitar la técnica. y se coloca el sustrato el cual no debería modificar su color.Control negativo del Conjugado: Dicho control se realiza para determinar que el anticuerpo conjugado a la enzima no interacciona con ningún otro componente del sistema que no sea el anticuerpo primario. se bloquea. Proteína A: Es una proteína de la pared de Staphylococcus aureus que tiene alta afinidad por los fragmentos Fc de algunos isotipos de Igs (Ka=108 M-1). no se incuba con el suero o anticuerpo primario (se mantiene el bloqueante). Por ejemplo si el anticuerpo conjugado es un anticuerpo anti ratón se coloca en la placa suero de ratón. se han desarrollado métodos inmunoenzimáticos basados en la interacción avidina-biotina. 61 . Sistemas alternativos de reconocimiento Los límites de la reacción Ag-Ac están determinados por la valencia del Ac (2 para la IgG y 5 para la IgM) y por la constante de afinidad de unión del Ac (Ka =108 a 1010 M-1). se incuba con el anticuerpo 1º. B. Se realizan todos los pasos del ELISA. Se realiza de la siguiente manera: Se pega un suero de la especie frente a la cual es específico en conjugado. es decir. Se coloca un suero positivo. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antígeno. pero en la placa no se pega el antígeno.  Control del bloqueante: Permite determinar que el bloqueo se realizó correctamente. no se coloca anticuerpo primario y se coloca el anticuerpo secundario marcado con la enzima. el suero. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antígeno. dando reacción negativa. continuando el resto de la técnica de la misma manera. sino que se comienza a partir del bloqueante. Este no debería reaccionar con el antígeno pegado a la placa. aunque generalmente reaccionan sólo dos. se bloquea. Tiene 4 sitios de unión. Debido a que la biotina es fácilmente acoplable a distintas proteínas (entre ellas.

posea muy alta afinidad y se halle en muy baja concentración.  Que el anticuerpo sea altamente específico. 62 . siempre que se cumplan los siguientes requisitos:  Que el trazador sea altamente radiactivo y por lo tanto pueda colocarse en concentraciones infinitesimales. En estos experimentos se halló que la cantidad de insulina marcada con átomos radiactivos que se unía in vitro a una fracción de globulinas de individuos diabéticos. y Ac-Ag es el complejo soluble con el antígeno no marcado. Dado que el RIA es una técnica que se utiliza generalmente para medir sustancias que se encuentran en muy baja concentración. Entre las ventajas que tiene esta técnica se encuentran:  Alto límite de detección  Sencillez con respecto a las técnicas utilizadas en endocrinología. la detección de anticuerpos específicos se realiza con los correspondientes antígenos marcados. El desarrollo del radioinmunoensayo (RIA) comienza en 1956 en trabajos sobre el metabolismo de la insulina. se puede determinar la concentración de antígeno en muestras complejas de fluidos biológicos con suficiente sensibilidad y especificidad. Como guía general puede considerarse que la determinación de los antígenos se efectúa con anticuerpos específicos marcados radiactivamente y que inversamente. ensayo que se realiza por el sistema de inhibición competitiva de un antígeno marcado radiactivamente (trazador) a su anticuerpo específico por parte del antígeno no marcado. de modo que cuanto mayor sea la cantidad de antígeno frío presente. determinación de hormonas o niveles de IgE séricas específicas.  Versatilidad para su utilización en pequeños volúmenes y en grandes series. Bajo este principio. por lo tanto se utilizan en casos puntuales en los que la concentraciones del analito lo requieran. El sistema descrito puede esquematizarse como una interacción reversible combinada: Ag* Ac + Ag  Ac-Ag  Ac-Ag* Donde Ac representa al anticuerpo específico. menor será la cantidad de trazador que se une al anticuerpo.  Que el anticuerpo no reconozca con diferente afinidad el antígeno frío del marcado. Ag es el antígeno libre no marcado de las soluciones patrones o de las muestras desconocidas. Ag* es el antígeno marcado (trazador) libre. Un ejemplo de la técnica es la determinación de TSH. Ac-Ag* es el complejo soluble entre el anticuerpo y el antígeno marcado. los esquemas utilizados corresponden a la modalidad competitiva (ver descripción referente a la técnica de ELISA). se relacionaba con la concentración de insulina fría (no marcada) existente en el suero del paciente. El anticuerpo no discrimina entre antígeno no marcado (frío) y antígeno marcado (trazador). Por ejemplo.RADIOINMUNOENSAYO (RIA) Los inmunoanálisis radiométricos comprenden un conjunto de técnicas en las cuales las moléculas utilizadas se marcan radiactivamente. La reacción obedece a la ley de acción de masas. La desventaja más importante consiste en la manipulación de componentes radioactivos que requieren de condiciones de bioseguridad estrictas tanto para la protección del operador como del medio ambiente.

Las moléculas transferidas a la membrana son identificadas posteriormente por interacciones con anticuerpos específicos. se encuentran desnaturalizados (por acción del beta-mercaptoetanol y del SDS sobre la muestra). Utilidades del Inmunoblot: Mediante este método podemos identificar cuál o cuáles de las moléculas componentes de una mezcla son reconocidas por un anticuerpo. Por lo tanto son sinónimos. En esta técnica hay una relación directa entre la radiactividad medida y la concentración de IgE. Mosby International. si utilizamos como método de separación previo el SDS-PAGE. Bibliografía 1. a una membrana. Harlow y David Lane. Southern. 1º edición. se agrega el suero del paciente. Si el animal tiene en su suero IgE específica contra el alérgeno previamente adsorbido a un soporte. 1988. J and Male. Immunology . Manual de Inmunología México: Editorial Diana. pp726. Brostoff. La posibilidad de separar los componentes biológicos de una muestra por peso molecular. Las moléculas proteicas se movilizan y contactan con la membrana. y Bautista C.Ejemplos de aplicación de la técnica de RIA RAST (RadioAlergoSorbent Test) o prueba de radialergoadsorción: Es utilizado para la detección de IgE específica de alergenos. y luego de la incubación y el lavado se revela con la utilización de una anti-IgE marcada radiactivamente. R. También podemos evaluar la monoespecificidad de un anticuerpo como en el caso de los monoclonales para lo cual se realiza el PAGE del antígeno complejo luego la transferencia a 1 La transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis desde un soporte gelificado a una membrana. Cold Spring Harbor Laboratory. Se adsorbe la anti-IgE al soporte inerte. Esta transferencia se realiza poniendo en contacto el gel con una membrana de nitrocelulosa y aplicando una corriente eléctrica a pH alto. esta técnica se denominó Southern-blot. El reactivo marcado es un Ac (generalmente monoclonal) anti-IgE. Recuerden que los antígenos evaluados con esta metodología. 4. septiembre de 1986. Editorial Panamericana. sumado al reconocimiento con anticuerpos. I.Antibodies A Laboratory Manual. D. 3. Inmunoblot o Western-blot1 El análisis de una muestra por la técnica de inmunoblot requiere realizar una primera etapa de separación de los componentes en un campo eléctrico en geles de poliacriamida (PAGE) y posteriormente la transferencia de esas proteínas ya separadas por peso molecular (PM). 1996 Inmunología e Inmunoquímica.Roitt. por lo tanto estamos identificando antígenos de tipo secuenciales y no conformacionales. Ed. La unión a la membrana de nitrocelulosa es debida fundamentalmente a interacciones de tipo hidrofóbico. Fifth Edition.Margni. 2. a la cual se fijan. Debido a ello. la radiactividad detectada por el RIA será directamente proporcional a la concentración de esa IgE. R. Fundamentos. 423 pp. 63 .Morilla A. PRIST (Paper RadioImmunoabSorbent Test) o prueba radioinmunoabsorbente en papel: Es usado para la cuantificación de niveles séricos de IgE. potencia la caracterización del antígeno. La aplicación de esta técnica para el estudio de RNA se denominó Northern-blot y cuando ésta se desarrolló para proteínas se la llamó Western-blot. Ed. LTD. fue descripta inicialmente por el Dr.

Anexo A modo de ejemplo.Transferencia del gel obtenido a una membrana de nitrocelulosa C. Se coloca el gel sobre el papel Whatman. 4. Se debe evitar levantar y re-posicionar la membrana sobre el gel. se coloca la esponja. utilizando una pipeta de vidrio a modo de palo de amasar Las burbujas de aire se observarán posteriormente como manchas blanquecinas en las membranas. 6.Preparación de las muestras a analizar y realización del SDS-PAGE B. se describen los pasos necesarios para realizar un inmunoblot utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios Bio-Rad). se desarma la cuba y se retiran los geles. Se pueden equilibrar 30 minutos a temperatura ambiente en buffer de transferencia. Se deben eliminar las burbujas de aire como en el paso 4. Se llena el contenedor con buffer para que el soporte de transferencia quede cubierto. ya que algunas proteínas comienzan a transferirse tan pronto como el gel toma contacto con la membrana. Ambos deben ser del mismo tamaño que el gel y deben estar embebidos en buffer de transferencia.Bloque de los sitios libres de la membrana con una mezcla de proteínas irrelevantes para el análisis D. Se humedece la superficie del gel y se coloca la membrana sobre su superficie.Utilización de una anticuerpo conjugado con una enzima específico para la especie que fue origen del anticuerpo primario (Anticuerpo secundario) F. En forma de síntesis los pasos a seguir son: A. 64 . Se quita cualquier burbuja de aire que haya quedado entre el gel y el papel. Cuando la electroforesis ha concluido. 2. Sobre la base negra de una mitad del soporte. Esto previene el cambio de tamaño del gel durante la transferencia y elimina el exceso de SDS que puede interferir en ella.Análisis e interpretación de los resultados Las membranas teñidas muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se observarán un número de bandas variables dependiendo de las distintas proteínas que sean reconocidas por el anticuerpo primario que componen la mezcla. El armado del sándwich se realiza en un contenedor lo suficientemente grande para que quepa el soporte abierto. 1. 5. Materiales necesarios: Guantes libres de talco 2 Esponjas finas tipo Scotch Brite 2 hojas de papel Whatman 3MM o equivalente Membrana de nitrocelulosa Aparato de electrotransferencia o electroblotting Lapicera que permita marcar la membrana aunque esté humedecida.Utilización de un anticuerpo para identificar el antígeno a analizar sobre la membrana (Anticuerpo primario) E. 3. Como resultado se espera el reconocimiento de un sólo componente por parte del anticuerpo. Se corta la membrana a transferir unos milímetros más grandes que los bordes del gel y se la equilibra durante 10 a 15 minutos sumergida en el buffer de transferencia. seguida por un papel de filtro Whatman.Revelado con el sustrato que corresponda que precipite en el papel o que pueda ser revelado sobre una placa fotográfica G.una membrana de nitrocelulosa la que se usa como antígeno para interaccionar con el anticuerpo monoclonal. El soporte debe armarse sumergido para evitar en lo posible la formación de burbujas de aire. Al dato del PM se le suma la antigenicidad de estos componentes analizados.

La transferencia se puede realizar durante 1 hora a 100 V agregando un refrigerante en la cuba durante 16 horas a 15-30 V en una habitación refrigerada y con agitación del buffer. El anticuerpo secundario. 8. 9. La membrana se bloquea con 10% de leche descremada en PBS (buffer de bloqueo).45m cuando se requiere retener proteínas.3¨. 12. 10. Si el anticuerpo usado está conjugado con peroxidasa. 6. es decir.7. a temperatura ambiente en agitación constante. éste se puede utilizar como control de la transferencia. se desconecta la cuba de la fuente de poder y se desarma el aparato. Como las proteínas están cargadas negativamente porque están recubiertas con SDS. Se colocan los dos soportes armados en la cuba “ad hoc”. 5. la membrana se coloca en un recipiente limpio. se mueven hacia el ánodo (+: base roja). 5. Esto puede solucionarse utilizando membranas de poro más pequeño. como por ejemplo. 9. El anticuerpo primario. 4. Se lava la membrana igual que en el punto 3. pero algunos polipétidos pueden atravesar estas membranas sin unirse. a temperatura ambiente en agitación constante. 3. Se coloca una segunda pieza de papel Whatman pre-humedecido y de esponja y se completa el armado cerrando el soporte de transferencia. Una vez retirada del aparato de transferencia. El revelado se realiza dependiendo del substrato que corresponda según la enzima utilizada. Cuando la imagen es óptima. 8. 65 . 11. como el TMB (3. se frena la reacción diluyendo el substrato y el colorante con agua destilada. Detección por anticuerpos de los antígenos trasferidos a una membrana 1. se debe agregar H2O2 como substrato y un colorante que cambia de color al oxidarse y precipita sobre la membrana. La membrana se lava 4 veces con PBS durante 10 a 15 minutos por vez. Cuando el tiempo se ha cumplido. se diluye en el buffer de bloqueo. durante 1 hora a temperatura ambiente o durante 16 horas a 4C en agitación constante. es decir.1m. o en una bolsa de nylon sellable 2. se diluye en el buffer de bloqueo. el fondo del papel donde no ocurrió la unión se observa blanca. Se incuba la membrana con el conjugado durante 1/2 a 1 hora a temperatura ambiente en agitación constante. Luego la membrana se coloca entre papeles absorbentes y se puede registrar el resultado mediante un scanner o cámara fotográfica. Las membranas deben ser marcadas en sus extremos y calles para poder luego determinar la identidad de la muestra. de 0. Se coloca el contenedor con hielo dentro de la cuba y se llena la cuba con buffer de transferencia. con el objetivo de que ésta quede sumergida por completo y la transferencia sea pareja. Si se utilizó un marcador de peso molecular preteñido. 7. El bloqueante se reemplaza por el anticuerpo primario y se incuba la membrana con el anticuerpo primario durante 1/2 a 1 hora a temperatura ambiente en agitación constante. se puede usar BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt) como substrato y NBT (nitroblue tetrazolium clhoride) como colorante. Los geles pueden ser teñidos con Coomassie blue para determinar la eficiencia de la transferencia. Las bandas donde hubo reacción antígeno-anticuerpo se hacen visibles por la precipitación del colorante sobre la membrana. conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa. Se debe tener la precaución de controlar los códigos de colores que indican los electrodos. preferentemente de vidrio o polipropileno. el anticuerpo específico para el antígeno que se quiere detectar. En este procedimiento se logra tener las muestras (antígenos) adheridas a la membrana y en una posición conocida y determinada por su PM. El nivel del buffer debe superar el borde superior de la membrana. En el caso de usar un anticuerpo conjugado con fosfatasa. 10.5¨ tetramethylbenzidine). La membrana se lava 4 veces con PBS durante 10 a 15 minutos por vez. El poro de la membrana puede ser de 0. El objetivo del bloqueo es llenar todos los sitios libres con proteína no reactiva.

R. Ed. malaria. VILEF) y parvovirus canino en Veterinaria. son más resistentes (no se rompen al secarse) y con su utilización se obtiene una capacidad de unión de proteínas de hasta 500g/cm2.Las membranas de nitrocelulosa tienen una capacidad de unión de 80g de proteína por cm2 de superficie. Chlamydia. Esta reacción se visualiza a través del depósito localizado del Ac secundario marcado con oro coloidal. pero por otro lado puede ser una desventaja. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Interamericana. Anticuerpos de detección marcados con Oro Coloidal Antígeno en la muestra Siembra de la muestra NITROCELULOSA Anticuerpo de Captura contra anticuerpo de detección Anticuerpo de Captura contra antígeno Específico Resultado positivo Resultado negativo El papel de nitrocelulosa con los anticuerpos de captura se incorporan a un casete de plástico y al agregar el fluido biológico sospechoso como suero u orina este migra a través del papel por cromatografía y reacciona o no en los sitios correspondientes a los anticuerpos. a través de la detección de antígenos en diversos líquidos biológicos. dando bandas coloreadas.A. siendo el objetivo principal de estas técnicas alcanzar la señal específica más intensa con una mínima o nula reacción inespecífica En la actualidad. Ed. pp726. Ed. como las catiónicas de nylon (Zeta-Probe o Bio-Rad). Cold Spring Harbor Laboratory. 1996. tales como en infecciones por Streptococcus betahemolítico. Harlow y David Lane. ya que hace que las membranas sean difíciles de bloquear. Se realiza gracias a que el complejo de oro coloidal con los antígenos migran sobre el papel de nitrocelulosa para reaccionar específicamente con los anticuerpos inmovilizados en el papel. Otras membranas. 1988. virus de la hepatitis. esta técnica se viene utilizando para el diagnóstico rápido de varias enfermedades. Inmunocromatografía La inmunocromatografía es una técnica inmunológica que permite visualizar la reacción antígeno-anticuerpo por la acumulación de oro coloidal en zonas específicas del papel de nitrocelulosa donde se fijan previamente anticuerpos o antígenos de captura. El papel de nitrocelulosa permite la migración por capilaridad de líquidos y solutos y a la vez conserva activos los anticuerpos fijados. Bibliografía  Antibodies A Laboratory Manual. Bio-Rad  Margni.  Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Instruction Manual. virus de la inmunodeficiencia felina y virus de la leucemia felina (VIF. El uso de anticuerpos conjugados con oro coloidal en las técnicas de diagnóstico rápido permiten la detección de antígenos en muestras biológicas. 66 . Esta característica es ventajosa.

En el caso de los sueros inmunes. Los anticuerpos monoclonales han permitido aumentar la especificidad y sensibilidad de esta técnica. De esta forma pueden ser usados en diluciones altas (muy baja concentración) y se evita la aparición de falsos positivos Si los anticuerpos no tienen elevada especificidad pueden producir reacciones inespecíficas que lleven a falsos positivos. Para evitar estas falsas interpretaciones. es deseable que tengan títulos elevados. Engler KH. el uso de las técnicas inmunohistoquímicas ha ido creciendo progresivamente hasta consolidarse como tecnología esencial en el diagnóstico anatomopatológico de rutina. Algunos reactivos son carcinógenos potenciales y su manipulación debe ser cuidadosa. es decir. requieren de estandarización precisa y estricto control de calidad. Immunochromatographic strip test for rapid detection of diphtheria toxin: description and multicenter evaluation in areas of low and high prevalence of diphtheria. especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. A short guide for developing inmunochromatographic test strips (en línea). por cada anticuerpo primario que reaccione lo reconocerán dos o más moléculas de anticuerpos secundarios. dirigido contra el antígeno. Las ventajas de las técnicas inmunohistoquímicas son que permiten una localización más precisa de la reacción antígeno-anticuerpo. La inmunohistoquímica (IHQ) y la inmunocitoquímica (ICQ) son técnicas cualitativas de detección y de localización de antígenos presentes en células y tejidos. El material así estudiado puede archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción. Existen diversos métodos:  Directo: el anticuerpo primario (dirigido contra el antígeno de interés) se encuentra conjugado con la enzima. Glushkevich TG. estable. Más tarde se desarrollan la inmunofluorescencia indirecta y las técnicas inmunoenzimáticas. Millipore A. Koslov RS. et al. puede contrastarse y puede evaluarse con microscopio óptico. 4(l): 80-3. Todas las técnicas de IHQ e ICQ utilizan anticuerpos o sistemas amplificadores (sistema avidina: biotina) conjugados con enzimas y un cromógeno que precipita sobre los tejidos generando una reacción coloreada. 2001 (Fecha de acceso: diciembre 2001). Norn D. URL disponible en: http://www.com/oemproducts. J Clin Microbiol 2002. El límite de detección de este método es 4 a 5 veces mayor que el método directo La ventaja del uso de dos anticuerpos es la amplificación de la reacción en cada paso. algunas veces.  Inmunohistoquímica La historia de la inmunohistoquímica comienza en 1941 cuando Coons identifica neumococos usando un método de fluorescencia directa. En ambos casos tienen que tener alta afinidad y especificidad por el antígeno. 2nd edition. que reconoce específicamente al anticuerpo primario (anti-Ig de la especie). En las últimas décadas. puede aparecer reactividad cruzada cuando los anticuerpos reconocen sitios similares en moléculas relacionadas. También. la técnica necesita realizarse con controles estrictos de todos lo pasos y de todos los reactivos. Tiene algunas desventajas como la presencia de reacciones inespecíficas o cruzadas. Los anticuerpos utilizados en estas técnicas pueden ser monoclonales o policlonales. Selga I. pero tiene bajo límite de detección. 67 . la tinción es permanente. Efstratiou A. no está marcado luego se agrega un anticuerpo secundario conjugado con la enzima.  Indirecto: el anticuerpo primario. Es fácil y rápido de realizar.

congelado o fijado en formalina) y de los antígenos a estudiar (de superficie o membrana. La necesidad de mantener la estructura tisular hace de la fijación un paso fundamental en las técnicas histológicas. En los tejidos. La estreptavidina es una proteína tetramérica de 60 kDa procedente de Streptomyces avidinii. Enzimas utilizadas: Las enzimas más utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina. anticuerpos. se aumenta ostensiblemente el límite de detección de la técnica. puesto que a medida que se amplifican las señales. La biotina es una proteína soluble en agua (vitamina H) de peso molecular bajo (244 Da) con un grupo carboxílico que permite su unión a los restos amino de las proteínas. las uniones inespecíficas se pueden bloquear con albúmina bovina. las cadenas glucídicas de la avidina tienen una carga tal que las hace adhesivas con regiones cargadas del tejido. citoplasmáticos o nucleares). La biotinilización es una reacción bioquímica que permite unir biotina por unión covalente a una gran variedad de moléculas como enzimas. con leche descremada. La conservación de los tejidos por congelación puede afectar los tejidos y la estructura celular. que posee en su superficie regiones hidrofóbicas que unen con gran afinidad la biotina. con alta afinidad por la biotina. por el enmascaramiento del antígeno debido a cambios conformacionales 68 . presente en la clara de huevo. Se han desarrollado varios métodos que combinan los tres reactivos mencionados. En IHQ. El pequeño tamaño de la biotina hace que la biotinilización no afecte drásticamente las propiedades biológicas de las moléculas a las que se conjuga la biotina. etc. lo cual servirá para detectar distintas uniones antígeno-anticuerpo.Existen diversos tipos de técnicas. o con suero normal de alguna especie distinta y alejada filogenéticamente de la que se esta estudiando. usualmente positivos y negativos. Estas técnicas necesitan de controles internos o paralelos. El esquema general del método IHQ sería: 1º paso: Preparación histológica de los tejidos o células a estudiar 2º paso: Bloqueo de las peroxidasas endógenas 3º paso: Incubación de los tejidos con el anticuerpo primario 4º paso: Incubación con el anticuerpo secundario unido a biotina (anticuerpo biotinilado) 5º paso: Incubación con una solución de estreptavidina marcada con enzima peroxidasa 6º paso: Agregado del sustrato de la enzima y el cromógeno. Esta necesidad de fijación se contrapone al riesgo de provocar cambios estructurales y moleculares asociados a cualquier tratamiento de las células o tejidos destinados a la observación microscópica. la fijación y el tratamiento previo de los tejidos debe satisfacer diferentes criterios como:  Retener los antígenos  Preservar la antigenicidad  Preservar la estructura  Permitir la interacción antígeno. debido a la formación de cristales de agua intracelulares.anticuerpo Fijación: El mayor problema que suelen presentar los fijadores químicos es que pueden impedir la unión antígeno-anticuerpo. lectinas. que reaccionan dando distintos colores con los diferentes sustratos según la reacción. Preparación de tejidos para inmunohistoquímica: El éxito de la inmunohistoquímica depende de la preservación de los antígenos y del manejo de los anticuerpos. Métodos que utilizan la interacción avidina-biotina: La avidina es una glucoproteína tetramérica de 67 kda. lo que aumenta el ruido de fondo (uniones inespecíficas). Por otra parte. cuya indicación dependerá del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal). ácidos nucleicos. del material disponible (fresco.

en todos los casos hay que realizar distintas pruebas con diferentes fijadores (y diferentes condiciones de fijación) para cada antígeno y para cada tejido. Diagnóstico de enfermedades autoinmunes: detección de depósitos de anticuerpos o complejos inmunes en los tejidos afectados. Diagnóstico de infecciones: detección de microorganismos en los tejidos afectados. Esta técnica puede ser:  Directa  Indirecta Inmunofluorescencia Directa: Consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante la reacción directa con un anticuerpo específico marcado con un colorante fluorescente. Investigación: por ejemplo. El fijador mas utilizado es el formol tamponado. El anticuerpo es obtenido a través de la inoculación del antígeno en un animal de experimentación. (formaldehído al 10 % en fosfato disódico y monobásico) debido a que es más accesible por costos y es menos agresivo a los tejidos que el formol puro.que ocurren en el antígeno (epitope). Inmunofluorescencia La inmunofluorescencia es una técnica de interacción primaria que permite la localización de antígenos en tejidos. Generalmente todas las preincubaciones se realizan en soluciones fosfato o tris-HCl o bien en solución salina tamponada. II. Otro método consiste en hacer reaccionar las peroxidasas endógenas (inespecíficas) con un cromógeno y luego efectuar la reacción inmunohistoquímica (específica) con otro cromógeno que desarrolle un color contrastante con el anterior. No existe un fijador universal. se han de hacer diversas preincubaciones y lavados a fin de facilitar la penetración de los anticuerpos y disminuir el marcaje inespecífico. células o cultivos en monocapa. En el caso de que el proceso se realice sobre portaobjetos gelatinizados. Diagnóstico de neoplasias: detección de marcadores tumorales específicos en las células neoplásicas. El método es muy eficiente y lleva a la neutralización de las peroxidasas de los tejidos. sin afectar la inmunoreactividad. Bloqueo de peroxidasas endógenas Los tejidos tienen sus propias peroxidasas que interfieren con la reacción cuando se utilizan anticuerpos marcados con peroxidasa. También permite la búsqueda de anticuerpos específicos. utilizando marcadores leucocitarios (CD “Cluster of diferentiation”) a fin de determinar poblaciones leucocitarias predominantes en ciertas afecciones o tejidos. Utiliza como reactivo una inmunoglobulina marcada con colorantes fluorescentes. Aplicaciones de la IHQ en medicina veterinaria I. hay que calentarlos previamente entre 37 y 50ºC (dependiendo de la sensibilidad de los antígenos a la temperatura) durante 10 min. Para bloquear las peroxidasas endógenas se pueden incubar los cortes con una solución de peróxido de hidrógeno y metanol absoluto (entre 10 y 30 minutos) a temperatura ambiente. III. IV. frotis de microorganismos. Preincubaciones Una vez obtenidos los cortes y antes de iniciar las incubaciones con los anticuerpos. 69 .

Para unir los fluorocromos a un anticuerpo. La ventaja de la técnica indirecta es que no se necesita un anticuerpo marcado para cada antígeno Ventajas y desventajas de las técnicas de inmunofluorescencia directa e indirecta: Ventajas: 1) Son muy versátiles y seguras para la detección de antígenos o anticuerpos. etc. en el suero del paciente la presencia de anticuerpos específicos para un antígeno determinado. Desventajas: 1) Es necesario tener un microscopio de fluorescencia. Para hacer ostensible esta unión antígeno-anticuerpo. ya que los solventes pueden producir la desnaturalización de las proteínas durante la unión. habrá formación de complejos inmunes. . Se preparan improntas de los antígenos sobre portaobjetos. la señal es más brillante que en la técnica directa debido a que varias moléculas de anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada uno de los complejos antígeno-anticuerpo formados en la primera etapa (es decir que la señal se amplifica). Fluorocromos Los fluorocromos son sustancias que se utilizan para marcar estos anticuerpos específicos. células infectadas por virus.  Que sea soluble en soluciones acuosas. gondii. ya que habitualmente las células tienen un mínimo de autofluorescencia. permite ahorrar tiempo y dinero. Si la reacción es positiva. 3) En la IF indirecta. que puede llevar a error cuando quien efectúa la lectura no tiene experiencia suficiente. 70 . 4) Se necesita personal muy entrenado para poder determinar entre una reacción positiva y una impronta negativa. Sobre las improntas se coloca el suero en el cual se sospecha la presencia de anticuerpos específicos. se debe utilizar una inmunoglobulina (anti-especie o antigamma) marcada.  Que no pierdan fluorescencia al unirse con los anticuerpos. Estos colorantes permiten identificar la presencia de las sustancias marcadas con ellos.  Que tenga un grupo funcional capaz de fijarse a la molécula de anticuerpo. 4) En la IF indirecta. 3) Las preparaciones tienen vida muy corta debido a la pérdida de color de los fluorocromos.Inmunofluorescencia Indirecta: En este caso se busca. estos deben cumplir con una serie de requerimientos:  Que el fluorocromo desarrolle suficiente fluorescencia para que la señal emitida sea visible y no se vea interferida por la autofluorescencia del tejido. cuando son excitados por luz ultravioleta. por ejemplo T. 2) Es difícil la evaluación de detalles básicos. el uso de un reactivo conjugado anti-especie único. que reaccionará con el anticuerpo del paciente. para estudiar los anticuerpos problema frente a diferentes antígenos. 2) Permiten implementar rápidamente nuevos ensayos.

Luego se mantiene el preparado en heladera toda la noche. azida. El suero se recoge 7 a 10 días luego de la última inyección. se corre el riesgo de tener marcación inespecífica.un sistema de filtros: a) El primer filtro es el de excitación o selección de luz. Cuando sucede lo contrario. ya que la conjugación es del orden del 100% en 24 horas. c) El tercer filtro es el de barrera. amonio. 71 . glicina. particularmente de la lisina. Además. es decir. cuando hay mucho fluorocromo unido al anticuerpo. Produce una muy buena señal de color verde. Se agita en baño de hielo añadiendo fluorocromo en un período de 15 minutos.una lámpara de mercurio o halógena que emite luz ultravioleta . y entre la fuente de luz y el espejo dicrómico en los microscopios de luz incidente. La marcación de los anticuerpos con los fluorocromos se basa en complejas reacciones que llevan a la formación de uniones covalentes entre ellos y las moléculas de inmunoglobulinas. Esta unión se hace a pH alcalino. Preparación de los reactivos: Obtención de los anticuerpos: Se obtienen mediante inmunización en animales. Tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud tal que caiga en el rango azul. en agitación. ubicado entre la fuente de luz y el preparado. Microscopio de fluorescencia El microscopio de fluorescencia consta de: . El isotiocianato de fluoresceína (FITC) es el fluorocromo más usado para la conjugación con anticuerpos. Se debe añadir al suero buffer carbonato-bicarbonato para mantener condiciones óptimas de pH (9. se obtienen conjugados que emiten escasa fluorescencia. Purificación del conjugado: Se logra mediante la eliminación por diálisis de las sales del buffer y de los elementos utilizados como solventes del fluorocromo (acetona) que podrían dañar al conjugado. colocado antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioletas que escapan por reflejo en el espejo dicrómico. El inconveniente más importante es que pierde color rápidamente. Además se utiliza extracción con carbón o filtración en columna de sephadex para eliminar los restos de fluorocromo que no se conjugaron y que pueden ocasionar tinción inespecífica. la conjugación entre ambas moléculas depende de la temperatura y del tiempo de reacción. b) El segundo filtro es el de calor y está ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitación en los microscopios de luz transmitida. Las inmunoglobulinas se aplican en 2 ó 3 inyecciones a intervalos de 3 a 4 semanas. La respuesta de anticuerpos se mide mediante métodos serológicos.  Que al formar los conjugados no pierdan su fluorescencia con la acción de la luz. La fluoresceína es muy sensible a las variaciones de pH: La mayor emisión se obtiene a pH 8-9.el microscopio óptico . Es importante entonces que los buffers usados para la conjugación no tengan grupos aminos (tris. Conjugación: Es posible conjugar las inmunoglobulinas a partir de suero completo o fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos. durante el tiempo que se mantengan las improntas teñidas hay que tener la precaución de guardarlas envueltas en papel de aluminio y en un sitio oscuro. Los isotiocianatos reaccionan con los grupos aminos libres de los aminoácidos de los anticuerpos. con el fin de que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente. para evitar el deterioro que les produce la exposición a la luz. Que no alteren la especificidad ni la actividad de los anticuerpos. Por ello. Cuando hay un exceso de anticuerpo con respecto al fluorocromo. Los anticuerpos precipitados pueden permanecer en solución salina de fosfatos (PBS) a pH 7. Concentración del Anticuerpo: Se logra mediante precipitación con soluciones saturadas de sales de amonio. que se diferencia notablemente de la autofluorescencia generalmente más amarillenta y pálida de los tejidos.1. etc).0).

protegidos con resina de poliéster. WA 99163. Cubrir con cubreobjetos y observar en microscopio de fluorescencia a 100 a 250X. Mark. 9) Colocar una gota de líquido de montaje. Travers. acetona o formol. P. Procedimiento recomendado para la tinción por inmunofluorescencia directa: 1) Llevar el portaobjetos que contiene la muestra (células o tejido a analizar) a temperatura ambiente.. Janeway. 72 . 8) Secar la parte posterior y los bordes del portaobjetos con una toallita de papel . Instituto Malbrán. 7) Lavar como en el paso 4. 6) Incubar como en el paso 3. Vol. Walport. Lett. Mark. Inc. Box 502. 2001. Colocar sobre la muestra 10 a 50 l de anti-IgG o anti-IgM conjugado con FITC. Bibliografía 1) Roum. No deben secarse las superficies teñidas. Pullman. Confirmar a 400X. Procedimiento recomendado para la tinción con inmunofluorescencia indirecta 1) Llevar el portaobjetos que contiene la muestra (células o tejido a analizar) a temperatura ambiente. No lavar con agua. 5) Secar la parte posterior y bordes del portaobjetos. Confirmar a 400X. Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antígeno-anticuerpo.206. alcohol metílico. Para bacterias es muy útil la fijación mediante calor. 4) Lavar el portaobjetos con buffer de lavado (PBS) y luego sumergirlo por 10 minutos en el mismo buffer. 2) Colocar de 10 a 50 l (dependiendo del tamaño de la muestra) de anticuerpo anti-antígeno conjugado en el portaobjetos. No lavar con agua 6) Colocar una gota de líquido de montaje. 2) Colocar de 10 a 50l (dependiendo del tamaño de la muestra) de suero problema diluido en el portaobjetos.O. Paul. 3) Immunobiology 5th ed. se pueden proteger por inmersión en carbowax y almacenamiento a -20°C. 3) Incubar el portaobjetos en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos. No. Los cortes liofilizados. 177. U.html 5) Manual de procedimientos.A.fsu. Roumanian Society of Biological Sciences 2) Veterinary Medical Research and Development.magnet. Biotechnol. se pueden conservar varios meses en un desecador a 0°C sin que pierdan sus antígenos. Center for Research in Enzymology and Biotechnology. Bucharest University. 3) Incubar en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos 4) Lavar el portaobjetos con buffer de lavado (PBS) y luego sumergirlo por 10 minutos en buffer de lavado (PBS) 5) Secar la parte posterior y los bordes del portaobjetos con una toallita de papel.. pp. Garland Publishing c 2001 4) http://micro.edu/primer/techniques/fluorophase. 3.Manejo de cortes y tejidos: Los cortes y frotis montados sobre portaobjetos que no se estudien de inmediato. 2003 VMRD.S. La inclusión en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr una localización más precisa y una tinción más viva que con cortes en congelación. 6. No se deben secar las superficies teñidas. Es preferible trabajar con cortes fijados ya que la tinción inmunofluorescente en cortes sin fijar se acompaña de difusión o pérdida del antígeno. Cubrir con cubreobjetos y observar en microscopio de fluorescencia a 100 a 250X. los más empleados son alcohol etílico al 95% entre 4-30°C. Charles A. Schlomchik.

Citometría de flujo
La citometría de flujo es una técnica que permite la medición y análisis de múltiples características de una misma partícula. Estas partículas, generalmente células, fluyen a través de una tubuladura sobre la cual incide un rayo láser. Las propiedades que pueden ser medidas incluyen el tamaño de las partículas, la granularidad relativa (que es una medida de la complejidad interna) y la intensidad de la fluorescencia emitida. Estas características se determinan usando simultáneamente un sistema óptico y un sistema electrónico que permiten conocer cómo la célula o partícula desvía el rayo láser incidente y la fluorescencia que emite. Un citómetro de flujo consta de tres sistemas: 1. Sistema de fluidos 2. Sistema óptico 3. Sistema electrónico. El sistema de citometría de flujo permite analizar partículas de 0,2 a 150 micrómetros. La luz desviada por las partículas así como la fluorescencia emitida por ellas es captadas por lentes posicionados para tal fin. Luego la información es trasmitida a detectores que producirán señales electrónicas proporcionales a la señal óptica recibida Es decir que el sistema electrónico convierte las señales ópticas en electrónicas para que puedan ser procesadas por una computadora. En algunos casos, cuando el aparato tiene sistema de separación de partículas, el sistema electrónico identifica cuáles de las células o partículas guardar y cuáles desechar. . 1-Sistema de fluidos La zona del citómetro donde las células (o partículas) se juntan con el fluido se la conoce como cámara de flujo El fluido del citómetro se encuentra a presión y conduce la muestra a través de la cámara de flujo. Las partículas de la muestra a ser analizadas llegan separadas y en una corriente de fluido presurizado. El propósito de este sistema es permitir que el rayo láser atraviese la muestra justo por el centro 2-Sistema óptico Está formando por un sistema de excitación y uno de recolección. El sistema de excitación consiste en un láser y lentes que se usan para enfocar el rayo láser El sistema de recolección consiste en lentes que colectan la luz emitida por la interacción entre el rayo láser y la partícula y un sistema de espejos y filtros que encausan rangos de ondas determinados de la luz colectada a detectores ópticos específicos. Generación de dispersión: Cuando una partícula es incidida por el rayo láser se produce una desviación de la luz que dependerá de las propiedades físicas de las partículas, es decir: su tamaño y complejidad interna. La membrana celular, el núcleo, y cualquier material granular que se encuentre dentro de la célula, afectan la desviación de la luz. La forma de la célula y la topografía de la superficie celular también contribuyen a la desviación total de la luz. La luz desviada hacia adelante (Forward Scattered light: FSC) es proporcional a la superficie o tamaño celular. FSC es una medida de la luz difractada y es detectada por un fotodiodo en dirección frontal. La luz desviada hacia el costado (Side Scattered light: SSC) es proporcional a la granularidad celular y a la complejidad interna de las células. SSC es, esencialmente, una medida de la luz refractada que ocurre en cualquier interfase dentro de la célula donde hay un cambio en el índice de refracción. SSC se colecta aproximadamente a 90 grados del rayo láser mediante lentes colectoras y luego es redireccionada a un detector.

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Correlacionando las mediciones de FSC y SSC se pueden diferenciar tipos celulares en una población heterogénea. La mayoría de las poblaciones leucocitarias pueden diferenciarse usando FSC y SSC. Fluorescencia: Un compuesto fluorescente absorbe energía de cierto rango de longitud de onda que es característico para ese compuesto. Esta absorción de luz provoca que un electrón de la sustancia fluorescente alcance un mayor nivel de energía. El electrón así excitado decae en energía emitiendo el exceso como un fotón. Esta transición de energía se denomina fluorescencia. Cuanta más energía es consumida en la absorción, más energía es emitida en la fluorescencia. - El rango de onda en el cual un compuesto fluorescente puede ser excitado se conoce como su espectro de absorción. - El rango de onda emitido por este compuesto es denominado su espectro de emisión. El láser de argón es comúnmente usado en citometría debido a que su longitud de onda de 488 nm puede excitar más de un fluorocromo. Entonces, se puede usar más de un fluorocromo simultáneamente, siempre que todos sean excitados a 488nm y que sus picos de emisión se encuentren lo suficientemente alejados entre sí. La combinación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y ficoeritrina (PE) satisfacen este criterio. La magnitud de la señal detectada es proporcional al número de moléculas de fluorocromo en la partícula. En una mezcla de células se pueden usar diferentes fluorocromos conjugados a anticuerpos monoclonales para distinguir las diferentes subpoblaciones celulares. El tipo de tinción captada por cada subpoblación junto con la FSC y SSC, pueden ser usadas para identificar qué tipos celulares están presentes en una muestra y los porcentajes relativos de las mismas. Filtros ópticos: Una vez que la partícula pasó a través del láser, la SSC y la señal fluorescente emitidas van al fotomultiplicador, mientras que el fotodiodo colecta la FSC. La especificidad de un detector para una tinción fluorescente en particular se puede optimizar colocando un filtro que permite que sólo un rango estrecho de longitudes de onda alcance el detector. Detección de señales: Los fotodetectores convierten las señales de luz en señales eléctricas. La intensidad de las señales eléctricas es proporcional a la intensidad de las señales de luz. Cuando la partícula se interpone en el haz de láser y comienza a desviar la luz o producir fluorescencia, se crea un pulso. El punto más alto de este pulso ocurre cuando el rayo incide sobre el centro de la partícula y se capta el máximo de luz desviada o fluorescencia emitida. A medida que la partícula se aleja del rayo, el pulso baja a la línea de base. Una vez que las señales de luz (fotones) golpean al fotodiodo, son convertidos en un número proporcional de electrones que se multiplican para crear una corriente eléctrica mayor. La corriente eléctrica viaja al amplificador y se convierte en un pulso de voltaje; este pulso depende del número de fotones detectados por el fotomultiplicador. 3-Sistema electrónico: recolección de datos. Las señales de luz se convierten finalmente en señales electrónicas, lo que permite que los datos puedan guardarse en una computadora. Pero cómo se define la muestra a tomar? Adquisición de las muestras: Se denomina así a la toma de muestra por parte del citómetro Qué tipo de datos guardará la computadora, dependerá de los parámetros que previamente establezca el operador. Estos parámetros varían de acuerdo con las muestras a analizar.

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Umbral: Se usa para limitar el número de eventos que adquiere un citómetro. El umbral se establece en un parámetro. Por ejemplo si el umbral se establece en FSC, sólo serán registradas las señales generadas por partículas cuyo tamaño sea mayor que el umbral establecido. Este control se usa para eliminar señales generadas por polvo, restos celulares, o ruido electrónico en el sistema. En aquellos equipos que tienen más de un láser, se puede establecer un segundo umbral. En ese caso la señal emitida por la partícula a ser analizada deberá alcanzar los dos umbrales para ser procesada como un evento. Los datos se guardan en un formato standard denominado “Flow Cytometry Standard Format”. Una sola célula analizada para cuatro parámetros FSC, SSC, FITC y PE genera 8 bytes de datos. Si se multiplica este valor para un sólo dato, por el número de eventos que se adquieren en cada muestra y teniendo en cuenta que cada operador procesa cerca de treinta muestras por día, se puede tener una idea de la capacidad de almacenamiento de datos que tiene un citómetro. Una vez que los datos han sido guardados, pueden ser presentados y graficados en el citómetro de diversas maneras: como histogramas, gráficos tridimensionales, gráficos de puntos, etc. Determinación de regiones o “Gating”: Un grupo de datos puede ser definido por un “gate” que es una barrera numérica o gráfica. Esta barrera se usa para definir las características de las partículas que se analizarán. Por ejemplo, en una muestra de sangre, el operador puede querer analizar sólo la población linfocitaria. Basado en la FSC o el tamaño celular la barrera (gate) puede establecerse en una curva de FSC vs SSC para permitir el análisis de células que tengan sólo el tamaño de los linfocitos. Otro ejemplo. De la muestra sólo se desea tomar la población indicada en color amarillo, entonces se establece una barrera (gate) en esa zona y el equipo sólo adquiere las partículas de esa región.

Gate 1

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se analizan en otros gráficos: histogramas de un parámetro.Esquema de un citómetro de flujo Muestra Lámina de líquido Flujo celular vibratorio Fluorescencia Roja Láser Fluorescencia Verde Dispersor de luz de 90º (granulosidad) Collar de carga Dispersor de luz frontal (tamaño) - + Tubos colectores Desechos Una vez adquirida la muestra. esos datos los perdió. Estos marcadores son usados para especificar el rango de eventos que serán considerados positivos para un parámetro. un histograma permite analizar un parámetro contra el número de eventos. etc. Esto quiere decir que si el operador se equivocó cuando definió los parámetros de adquisición de la muestra. Cabe aclarar. para obtener y analizar los datos de los eventos que se encuentran exclusivamente en esa región determinada. los datos son guardados en la computadora del citómetro y pueden ser analizados en cualquier momento y de diversas maneras. Por ejemplo. Siempre se usa un control negativo para saber dónde hay que ubicar los marcadores sobre el histograma (Ver figura1a y b derecha). A partir de estos datos luego se obtienen análisis estadísticos. que en este caso los gates o barreras establecidos no son para la toma de muestras. gráficos de puntos de dos parámetros. curvas tridimensionales. Por eso es muy importante conocer el material en análisis. Por ejemplo: Análisis de datos para la determinación de subpoblaciones: Consiste en mostrar en un gráfico los datos colectados en un archivo y luego evaluar la distribución de los eventos dentro de la curva. sino para el análisis de muestras ya adquiridas por el citómetro. Los datos obtenidos de esta región delimitada. Los datos pueden ser subdivididos creando barreras (gates) sobre poblaciones específicas. se puede establecer un gate sobre la población linfocitaria. Por ejemplo. que también son producidos por el sistema de análisis de datos del citómetro. Una vez que se ha 76 .

Un gráfico de puntos (dot plot) muestra los datos de dos parámetros. positivas y doble positivas.establecido el primer marcador sobre el control negativo (M1) se ubica el segundo marcador sobre el pico del histograma que contiene la población considerada positiva (M2). Cada punto puede representar uno o más eventos. .El cuadrante superior izquierdo (UL) muestra la población que es positiva para el parámetro graficado sobre el eje vertical.El cuadrante inferior izquierdo (LL) muestra la población negativa para ambos parámetros.El cuadrante superior derecho (UR) muestra la población positiva para ambos parámetros. .El cuadrante inferior derecho (LR) muestra la población positiva para el parámetro graficado sobre el eje horizontal. FiGURA 1a Negativo M1 Nº de células Positivo M2 Fluorescencia 77 . . (Ver figura 1b izquierda y figura 2) El marcador de cuadrantes divide un gráfico de dos parámetros en cuatro secciones y permite distinguir poblaciones negativas. de acuerdo a lo establecido por el operador. .

Figura 1 b: Gráfico de puntos e histograma SSC-H: Granulosidad y complejidad de la partícula FSC-H: Tamaño de la partícula Counts: Número de eventos FL1-H: Parámetro Figura 2: Gráfico de puntos (dot plot) 78 .

Una vez colectadas. es constante. el equipo determina si la misma pertenece a la población de interés. hablamos de una reacción de aglutinación. Center for Research in Enzymology and Biotechnology.edu/primer/techniques/fluorophase. 79 .html TÉCNICAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA: PRECIPITACIÓN Y AGLUTINACIÓN Las reacciones secundarias pueden observarse a simple vista y reciben diferente nombre según el antígeno involucrado en la reacción sea soluble o particulado. Schlomchik. Una vez que la población de interés ha sido identificada en una curva de adquisición de datos. estas partículas pueden ser examinadas microscópica. Garland Publishing c 2001 http://micro. 2003 VMRD. WA 99163. esos complejos Ag-Ac iniciales se agregan y originan micelas de diferentes tamaños.A.  Si el antígeno es particulado.Pullman. No todos los citómetros están equipados para hacer separación de partículas. Cuando las micelas crecen por encima de cierta masa crítica. puede durar minutos e incluso horas para que se complete. Vol. Bibliografía: 1. que es además electrolito–dependiente. 2001. P. Roumanian Society of Biological Sciences Veterinary Medical Research and Development.magnet.. U. 4.fsu. Walport. Mark . Box 502. Biotechnol. que se desarrolla rápidamente. Esta segunda etapa es más lenta que la inicial. Travers. El sistema de separación de partículas permite capturar aquéllas consideradas de interés para análisis posteriores.S. Esta región identifica aquellas células que serán separadas de la corriente de fluido por donde transita toda la muestra. 3. Luego se carga esta información en el citómetro como “región de separación”. 3. En una segunda etapa. una vez que la partícula ha pasado a través del rayo láser. Paul . virus) contra el cual el Ac es específico. A medida que cada célula pasa por el láser. se tornan insolubles y precipitan espontáneamente. Bucharest University. La temperatura acelera esta segunda etapa. Inc . 2. Para efectuar la separación de partículas. el equipo debe primero determinar cuáles son las de interés. pp. es enviada a desecho. Mark. hablamos de una reacción de precipitación. 1. bioquímica o funcionalmente. PRECIPITACIÓN Cuando un anticuerpo bivalente es puesto en contacto con un antígeno polivalente soluble (proteínas. Lett. Immunobiology 5th ed Janeway. 6. Algunos complejos no alcanzan a hacerlo y quedan en solución. No.. La precipitación se produce en dos etapas. a medida que el tiempo transcurre.Separación de partículas (SORTING) En la mayoría de las aplicaciones. Las micelas precipitadas tienden a sedimentar por acción de la gravedad y la velocidad de sedimentación. se forman los complejos Ag-Ac primarios. Charles A. es específica y muy poco influida por la temperatura y la concentración de electrolitos. es proporcional al volumen de las partículas y a las densidades de las partículas e inversamente proporcional a la densidad del solvente. Dado que el alineamiento del láser y la velocidad de la corriente son fijos.O. el tiempo que toma el pasaje de las células a separar desde el láser hasta el tubo de captura. 177. En la etapa inicial. se forman complejos Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) que se insolubilizan y dan lugar a una reacción de precipitación. Roum. se dibuja una región alrededor de ella.206.  Si el antígeno es soluble.

Dada la bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antígeno.  Cuando se utilizan sueros inmunes obtenidos a partir de animales inoculados con estas mismas macromoléculas la precipitación sí tiene lugar. cada molécula de antígeno está unida a más de una molécula de anticuerpo y cada molécula de anticuerpo está unida a más de una molécula de antígeno. la precipitación no se produce. La formación de estos complejos ha sido explicada mediante la teoría del enrejado. exceso de anticuerpo o equivalencia de ambos (figura 2). lo que les impide formar agregados (micelas) aunque el antígeno sea una macromolécula (figura 1).  Cuando los complejos Ag-Ac se producen con haptenos monovalentes o antígenos que poseen un solo determinante antigénico por molécula. lo que posibilita la formación de complejos mixtos Ag-Ac insolubles. que en su mayor parte no muestran actividad precipitante. pues en estos sueros hay una mezcla de anticuerpos que reconocen distintos epitopes del mismo antígeno. las posibilidades de combinación varían según sea que en la mezcla exista exceso de antígeno. que considera que la composición del precipitado formado es una consecuencia del modo en que el anticuerpo y el antígeno se han unido. Figura 1 80 .  Un hecho particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales.En los agregados de complejos Ag-Ac. Esto se debe a que en muchos de los casos los anticuerpos monoclonales reconocen a un único epitope no repetido.

los anticuerpos coprecipitantes constituyen del 10 % al 15% de la población total y están presentes a lo largo de toda la respuesta inmune. pero no son protectores frente a la infección. sumado al efecto bloqueante de los anticuerpos asimétricos. Cua ndo esto ocurre.La relación de IgG simétrico / asimétrico varía según el antígeno sea soluble o particulado. llamados coprecipitantes.Figura 2 La capacidad de producir una reacción de precipitación es una propiedad de la mayor parte de los anticuerpos (a los que originalmente se llamó anticuerpos precipitantes). Cuando el antígeno se encuentra en solución. los anticuerpos coprecipitantes se convierten en precipitantes. . Existen anticuerpos no precipitantes. .Durante la preñez hay un aumento de moléculas IgG asimétricas específicas contra antígenos paternos.Por inmunodifusión no se han detectado diferencias antigénicas entre anticuerpos precipitantes (o simétricos) y coprecipitantes (o asimétricos) con la misma especificidad. no activan el complemento y su poder protector es diferente al de los anticuerpos precipitantes. . sugiere que estos anticuerpos con especificidad para los antígenos de origen paterno deben participar en la protección del feto en el útero materno. Los anticuerpos coprecipitantes carecen de la capacidad para precipitar el antígeno. que puede ser removido mediante el empleo de enzimas. . estos anticuerpos se producen en gran cantidad y se fijan firmemente al agente patógeno. Esto. convirtiendo al anticuerpo en monovalente.Se ha demostrado que en los anticuerpos coprecipitantes hay un resto glucídico del tipo “rico en manosa”. interviniendo en la tolerancia de baja dosis. . . podrá resultar beneficioso o perjudicial para el huésped según el carácter propio o no propio de los antígenos involucrados y de la situación particular en la que actúan los anticuerpos. 81 . que pertenecen a la clase IgG. . Se especula que los anticuerpos asimétricos serían capaces de bloquear antígenos o epitopes. disminuyendo su concentración y como consecuencia. mientras que cuando el antígeno es particulado esta relación se invierte y puede llegar hasta 30 / 70. esta relación en general es de 90 / 10.La glicosilación afecta a uno solo de los fragmentos Fab y es la responsable del particular comportamiento inmunoquímico y biológico de estos anticuerpos. .Cuando un animal es inoculado a repetición.Se ha demostrado que en infecciones microbianas o parasitarias crónicas como brucelosis o tripanosomiasis.El comportamiento biológico de los anticuerpos coprecipitantes de tipo IgG.

La turbidez que se observa se debe a la precipitación de los complejos inmunes formados entre el anticuerpo específico presente en el suero y el antígeno presente en la muestra. 1.  Se añade luego por las paredes 0. Precipitación en medios con geles Las macromoléculas pueden difundir libremente a través de geles. pero no aporta datos sobre su concentración. las pruebas que se basan en reacciones de interacción secundaria (como precipitación.2 ml de la muestra sospechosa de contener el antígeno. la difusión doble y la difusión radial. Según sea el medio en que se realice la prueba. Consiste en colocar en un tubo de ensayo pequeño agar fundido (solución al 1%) mezclado con un volumen igual del antisuero a analizar. El antígeno difunde a través del gel y crea un 82 .Los anticuerpos asimétricos deben ser tenidos en cuenta en la interpretación de los resultados de las pruebas de diagnóstico. aglutinación y fijación de complemento). semicuantiativas y cuantitativas entre las que pueden citarse la difusión simple. Empleando soportes adecuados. Producida la solidificación. Por el contrario. En estos casos. los precipitados que se originan se visualizan como nítidas bandas de precipitación. se añade la solución de antígeno.a. que se puede utilizar para analizar un antisuero. la precipitación puede ser en medios líquidos o en medios con geles. Las pruebas que se basan en reacciones de interacción primaria (como ELISA o IFI) miden todos los anticuerpos específicos presentes en la muestra. correlaciones entre nivel de anticuerpos y evolución de un proceso infeccioso o grado de protección contra el antígeno en estudio. Estas diferencias deben tenerse en cuenta cuando se realizan estudios de respuesta inmune humoral. Se han descrito numerosas técnicas cualitativas. es decir correspondencia entre Ag y Ac específicos que producen el enrejado en el tubo que contiene las concentraciones óptimas de ambos reactantes. en diluciones seriadas. Precipitación en medios líquidos  Precipitación cualitativa Si una muestra biológica sospechosa de contener un antígeno en particular se mezcla con igual volumen de una solución que contiene los anticuerpos específicos (antisuero) y se observa turbidez del medio de reacción. en especial aquellos que como base tienen agar disuelto en soluciones salinas. Se deja en baño de María a 37 ºC durante una hora y se observa si en alguno de los tubos aparece un precipitado anular blanco que indica reacción positiva en ese tubo. las soluciones de antígenos en diferentes diluciones y los anticuerpos que se corresponden. ya que sólo indica la presencia del antígeno en estudio. se basa en la reacción que se produce en la interfase entre dos sustancias cuando en una serie de pequeños tubos se colocan sucesivamente y evitando que se mezclen. El “Método del anillo”. dado que una misma muestra arrojará diferentes títulos de anticuerpos en las diferentes pruebas a las que sea sometida.  Difusión simple en tubo Este método es conocido también como técnica de Oudín simple. significa que la reacción Ag-Ac tuvo lugar. 1.b. es posible hacer migrar antígenos y anticuerpos de modo que al encontrarse interaccionen.2 ml del suero con Ac específicos para el antígeno en estudio. La reacción es cualitativa. según sea el tipo de anticuerpos que identifique la prueba. Las proporciones relativas de anticuerpos simétricos / asimétricos presentes en los sueros hacen que cada prueba deba interpretarse de manera diferente. MÉTODO:  Se coloca en una serie de tubos 0. sólo detectan anticuerpos funcionalmente bivalentes o polivalentes (no así los anticuerpos monovalentes).

 Transferir 1 ml de la mezcla al tubo de reacción.5 ml de agar al 0. Los anticuerpos y las partículas antigénicas difunden desde la zona de agar al 1% hacia la zona de agar al 0.  Inmediatamente después. En la interfase líquido-gel no se forma precipitado debido a la alta concentración antigénica en esta zona. los que deben estar situados a distancias convenientes entre sí para evitar interferencias. se puede confeccionar una recta con los resultados obtenidos.  Difusión bidireccional En este caso ambos reactivos (antígeno y anticuerpo) migran hacia un gel intermedio (sin reactivos) por diferencias de concentración y forman el enrejado (precipitación visible) en la zona en la cual se encuentran la mayor concentración de complejos inmune asociados. Inmunodifusión radial o técnica de Mancini Este método ha dado magníficos resultados para la cuantificación de antígenos. Después de la solidificación. en la que se relaciona el diámetro de cada círculo de precipitación (X) con la correspondiente concentración antigénica (Y). La precipitación aparece en forma de bandas en la zona donde la concentración del antígeno que ha difundido es la óptima. De acuerdo a los principios básicos de la difusión.  En uno de los orificios de la placa. éste difunde en forma radial. 83 . Si esta operación se repite colocando en diferentes orificios de la placa cantidades variables y conocidas del antígeno en estudio (por ejemplo.5% fundido y enfriado a 50 ºC. Una vez solidificado.5%. colocar 2 microlitros de la solución antigénica a valorar (muestra problema).  Cubrir inmediatamente la placa con la mezcla anterior y dejar en reposo hasta su solidificación. el antígeno que difunde formará complejos inmunes con los anticuerpos disueltos en el agar. procurando que la mezcla sea lo más homogénea posible.  Mediante un sacabocados. La difusión radial se utiliza con muy buenos resultados para la valoración de proteínas que se encuentran presentes en mezclas complejas como por ejemplo los componentes del suero. Si en la matriz del agar hay anticuerpos monoespecíficos. añadir 0. Cuando un antígeno es colocado en un orificio practicado en una placa de agar. MÉTODO:  Mezclar partes iguales de agar al 1% (fundido y enfriado a 50 ºC) y el antisuero con especificidad contra el antígeno en estudio. dejar los tubos a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas convenientemente tapados para evitar evaporaciones (*2)  Proceder a la lectura de los resultados. o una dilución conveniente de esta solución. Esta reacción se observa como un halo de precipitación. Es indispensable disponer para ello de anticuerpos específicos contra cada uno de los antígenos que se quiere valorar. MÉTODO:  Añadir 5-10 % del suero específico (que contiene los anticuerpos) al agar fundido y enfriado a 50ºC.  Difusión simple en placa.gradiente de concentración. agregar 1 ml de una mezcla en partes iguales de agar al 1% y antígeno. estableciendo el diámetro del halo de precipitación de la muestra problema. efectuar sobre el gel una serie de orificios. diluciones en base 2) y se incuba hasta que el halo de precipitación no se modifique. Esta recta permite calcular la concentración de ese mismo antígeno en cualquier muestra desconocida. y enfriarlo rápidamente para que solidifique. Si en el suero hay más de un anticuerpo y en la solución añadida hay más de un antígeno que se correspondan. el diámetro del halo de precipitación estará en relación directa con la concentración de antígeno. (Se necesita un orificio para cada muestra a valorar y cuatro a cinco orificios para las distintas concentraciones del antígeno patrón que se utilizan para la elaboración de la recta de calibración). La concentración de la muestra podrá determinarse luego por simple cálculo o por interpolación a partir de la curva de calibración. se formarán tantas bandas de precipitación como sistemas hayan interaccionado. En el punto de encuentro se forma la banda de precipitado.

Si la banda de precipitación formada es recta. Los resultados pueden leerse sobre el material fresco o después de lavar las placas (Ver método más adelante). pues cada uno de ellos dará una banda de precipitación específica. 84 . hasta que el halo de precipitación no varíe. cuando se trabaja con concentraciones óptimas de Ag y Ac. señala que el peso molecular de éste es menor que el del anticuerpo Los dos fenómenos descritos son una consecuencia de las leyes generales de la difusión.  Evaluar los resultados mediante la determinación del diámetro de los halos de precipitación. que establecen que la distancia a la que una sustancia difunde está en relación directa con su concentración y en relación inversa con su peso molecular.Si la banda es convexa con respecto al reservorio del antígeno. indica que los pesos moleculares de ambos son muy próximos.  Mantener las placas a temperatura ambiente. Originalmente Ouchterlony describió tres tipos de reacciones: de identidad. el cual consiste en enfrentar las soluciones de antígeno y anticuerpo en perforaciones efectuadas en el gel (agar) a distancias convenientes. Dependiendo de la cantidad de muestras a analizar o del tipo de estudio a realizar. ab) y dos anticuerpos (A: anti-a. b. colocar 2 microlitros de cada una de las diluciones del antígeno patrón. De esta manera. Además. . la banda de precipitación se forma aproximadamente en la distancia media que separa esos reservorios. En los orificios restantes. señala que el peso molecular de éste es superior al del anticuerpo. ambos difunden a través del agar. pues en estos casos habrá fusión de bandas. se emplean distintos esquemas reactivos. en cámara húmeda. se ponen en contacto y producen una banda de precipitación cuando las respectivas concentraciones están en relación óptima. no-identidad e identidad parcial. Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony Ouchterlony describió un método interesante de difusión doble en placas.Si las concentraciones de Ag y Ac colocados en los reservorios son las que corresponden a la zona de equivalencia. AB: anti-a y anti-b). .  Difusión doble en placa. como por ejemplo: 1) 2) 3) 4) Esta metodología permite determinar si hay más de un sistema reaccionando en forma simultánea. la banda de precipitación se forma próxima al reservorio del anticuerpo .Cuando hay exceso de antígeno. . de concentración conocida.Si la banda es cóncava con respecto al reservorio del antígeno. . Con esta técnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los antígenos y anticuerpos reaccionantes. nos permite identificar reacciones cruzadas. Estas reacciones se esquematizan en la figura 3 para el caso hipotético de tres antígenos (a.Cuando hay exceso de anticuerpo. . la banda de precipitación se forma próxima al reservorio del antígeno.

.Figura 3 .En el caso I. ya que la precipitación se hace visible cuando los reactivos exceden valores mínimos. se forma una banda de precipitación entre el suero problema y el antígeno que se fusiona con las bandas de precipitación de los dos sueros positivos adyacentes (reacción de identidad). . La difusión doble en placa es un excelente método para el estudio de la homogeneidad de antígenos y anticuerpos purificados. uno de los antígenos tiene un epitope que no existe en el otro. S2 y S3). los dos sistemas Ag-Ac que reaccionan son iguales y se funden en una única banda de precipitación (reacción de identidad). en una perforación central se coloca un purificado proteico del virus de la anemia infecciosa equina y en seis perforaciones equidistantes del antígeno y entre sí. por ejemplo para el diagnóstico serológico de la Anemia Infecciosa Equina.En el caso III. el suero problema es considerado positivo débil (S1). Resulta muy útil también para la búsqueda de impurezas.Si el suero problema es negativo (S3) las bandas de precipitación de los dos sueros positivos adyacentes se introducen en la perforación. se intercalan sueros de animales positivos (suero control positivo) y sueros de animales que se desea investigar (sueros problema: S1. En cualquiera de estos dos últimos casos el animal se considera infectado. lo que está limitado por la concentración en que éstas se encuentren presentes.Si la banda del suero positivo se dobla pero no forma una banda de identidad completa.En el caso II hay dos sistemas Ag-Ac diferentes que reaccionan independientemente y cada uno produce una banda de precipitación que se cruzan (reacción de no-identidad) evidenciando la presencia de reacciones Ag. La inmunodifusión doble es utilizada ampliamente en el diagnóstico serológico de varias enfermedades en Medicina Veterinaria. apareciendo una prolongación o espolón en la banda correspondiente al antígeno que contiene los dos epitopes.-Ac diferentes. Por lo tanto ambas bandas de precipitación se unen y funden parcialmente en una banda. . Este esquema también se emplea para el diagnóstico serológico de otras enfermedades como Fiebre Aftosa en bovinos. . Este espolón indica que en este antígeno “ab” hay componentes antigénicos no compartidos con el antígeno “b” (reacción de identidad parcial).Si el suero problema es positivo (S2). 85 . método denominado “Test de Coggins” (figura 4). . se emplean generalmente altas concentraciones de Ag y Ac. Para obviar este inconveniente. En esta prueba. Brucelosis en caninos (Brucella canis) u ovinos (Brucella ovis ) o la Enfermedad de Marek en aves. lo que permite aumentar la concentración de las impurezas y asegurar su precipitación.

Esta reacción puede observarse micro o macroscópicamente como agregados o grumos de número y tamaño variable. previa desecación. . Este lavado es necesario para eliminar las proteínas no precipitadas.  Si interesa conservar los resultados.Luego del lavado. La concentración óptima de electrolitos es de 0. bacterias. el agar debe lavarse previamente por inmersión en solución salina durante un total de 24 a 48 horas. 86 . células). . la ocurrencia de uno u otro fenómeno depende de que el antígeno sea particulado (se encuentre en suspensión) o soluble (en solución).72 horas. efectuando el recambio de la solución salina cada 12 horas. Los principios que regulan la aglutinación son los mismos que regulan la precipitación. si este antígeno es polivalente y se encuentra en estado particulado (hematíes.En este caso. La lectura de los resultados se efectúa a las 48 . El exceso de colorante se elimina por inmersión en solución decolorante y se procede luego al secado en estufa a 50 ºC. De esta manera se inicia la formación de los complejos inmunes que llevan a la aglutinación. el agar puede colorearse.Figura 4 S1 + Ag S3 + S2 + Ag: antígeno +: suero control positivo S 1: suero positivo débil S 2: suero positivo S3: suero negativo MÉTODO:  En una placa de Petri o un portabojetos se vierte el agar fundido y enfriado a 50ºC.  Las placas o portaobjetos se mantienen en cámara húmeda. Se cree que el mecanismo de aglutinación se debe a que los iones neutralizan en parte las cargas superficiales de las partículas antigénicas.Ac que dan lugar a una reacción de aglutinación. se retira el papel y se lo sumerge en la solución colorante Azul de Coomasie durante aproximadamente 1½ hora. Se deja solidificar y se confeccionan los orificios con un sacabocados. evitando el rechazo entre ellas y asegurando la aproximación indispensable para que una molécula de anticuerpo reaccione con al menos dos partículas antigénicas. .  Para las pruebas diagnósticas de rutina en Medicina Veterinaria. se forman complejos Ag . 2. La aglutinación se lleva a cabo en medio salino.Una vez seco. se coloca el antígeno en el orificio central y en los orificios exteriores se intercalan el suero control positivo y cada uno de los distintos sueros problema. el agar se cubre con un trozo de papel de filtro húmedo y se deja secar a temperatura ambiente.15 M. AGLUTINACIÓN Cuando un anticuerpo (bi o polivalente) es puesto en contacto con el antígeno para el cual es específico.

 La aglutinación rápida es muy usada en serología diagnóstica.2. El “Plan 87 . dado que las bacterias que le daban turbidez se encuentran en los grumos. Por ejemplo para el diagnóstico de brucelosis (por Brucella abortus.a. Antígeno y anticuerpo se incuban en tubos de ensayo a 37ºC durante tiempo variable según el estudio. la reacción se efectúa en placas de vidrio. si la dilución 1/1024 aglutina y no lo hace la dilución 1/2048. La presencia de aglutinación indica la especificidad del sistema reaccionante. La aparición de grumos o agregados en alguna de las mezclas indica la identidad de la bacteria en estudio. El portaobjetos se agita suavemente por rotación manual. coli K99 y suero anti E.b. empleando como diluyente una solución salina. 2. Aglutinación semicuantitativa: Los métodos semicuantitativos consisten en determinar cuál es la máxima dilución del suero que se está analizando que es capaz de producir aglutinación. (Buffered Plate Antigen). Las mezclas (de aspecto turbio blanquecino debido a las células bacterianas) se incuban a 37ºC durante 48 horas y luego se observan con luz tangencial sobre fondo oscuro. 1/50.  En un portaobjetos se coloca una gota de cada uno de los anticuerpos específicos (por ejemplo. etc. El antígeno que se emplea está 20 veces más concentrado que el usado en la aglutinación lenta y la lectura de los resultados se hace a los 8 minutos. En estos casos es indispensable disponer de anticuerpos monoespecíficos. Tal es el caso de la prueba de Wright para el diagnóstico de brucelosis y de la prueba de Microaglutinación de Martin y Petit para el diagnóstico de leptospirosis En la prueba de Wright la reacción se realiza en tubos.  En el primer caso (lectura lenta) se emplean suspensiones diluidas y estandarizadas de un antígeno. 1/100 y 1/200 del suero problema con una cantidad estandarizada de bacterias (Brucella abortus cepa 19). Las diluciones se hacen generalmente en base dos y el título se expresa por la inversa de la máxima dilución aglutinante. En la práctica diaria el uso de las pruebas de aglutinación se encuentra muy estandarizado.A. La determinación de anticuerpos por aglutinación puede hacerse mediante reacciones de lectura lenta o rápida. Estos grumos son de tamaño variable. por ejemplo. coli F41) y otra de solución salina (control negativo).  A cada una de estas gotas. de modo que estén a una distancia tal que se evite su mezcla accidental. en los que se enfrentan diluciones 1/25. Por ejemplo. Aglutinación cualitativa. por antígenos hemáticos. mellitensis y suis) se emplea la Reacción de B. tipificar grupos sanguíneos. el título será 1024. suero anti Escherichia coli K88. suero anti E. El título se determina buscando cuál es el tubo con la máxima dilución del suero que presenta aglutinación. Paralelamente se observa la clarificación del medio líquido.P. que se mezclan con volúmenes iguales de diferentes diluciones del suero a valorar. se añade un volumen igual de la suspensión bacteriana y se mezcla para homogeneizar. La aglutinación se manifiesta como formación de grumos grandes que sedimentan en el fondo del tubo.  Se incuba durante unos minutos a temperatura ambiente y se observa. Los valores obtenidos son groseros y pueden aproximarse efectuando diluciones intermedias. al punto que son las pruebas oficiales para el diagnóstico de la brucelosis bovina. En este caso. A veces son visibles a simple vista pero otras veces es necesario el uso de lupa o microscopio para observarlos. MÉTODO (Identificación de microorganismos):  Se suspende el cultivo microbiano en estudio en solución salina. procurando que la suspensión sea lo más densa posible (no menos de 2 x 1010 bacterias/ ml). Estas reacciones se efectúan en portaobjetos mezclando las suspensiones de bacterias o hematíes a identificar. El estudio de la cinética del título de anticuerpos específicos permite seguir la evolución de una infección bacteriana o de una iso-sensibilización. Los métodos de aglutinación cualitativa son muy utilizados en serología diagnóstica con el objeto de identificar bacterias. con una batería de anticuerpos con diferente especificidad.

Los tubos de la prueba de 2-mercaptoetanol (2-ME) son tratados previamente con una solución de 2-ME que destruye los puentes disulfuro de las IgM. Teniendo en cuenta que la aglutinación es más sensible. Aglutinación pasiva Los anticuerpos específicos contra un antígeno soluble no pueden detectarse por precipitación si su concentración es inferior a los 20 g/ml. se ha procurado fijar antígenos solubles a partículas de modo de 88 .A. son analizadas luego por las pruebas de Wright y por la Prueba del 2-mercaptoetanol.Nacional de Erradicación de la Brucelosis Bovina” se basa en la vacunación obligatoria de las terneras entre los 3 y 8 meses de edad y en la posterior identificación y segregación de los animales infectados. con niveles de IgM que se mantienen en el tiempo y niveles bajos de anticuerpos de tipo IgG. Abortus. la vacunación desencadena en el animal una respuesta inmune primaria.c. Esta prueba es muy sensible pero poco específica y además no permite discriminar si los anticuerpos que reaccionan son de tipo IgG o IgM. También en este caso.P. Otra aplicación de la técnica de aglutinación es la determinación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos antitoxoplasma. descartar el excedente del pocillo número 8).A. De esta manera. significa que la aglutinación es debida a la presencia de anticuerpos de tipo IgG. La ausencia de aglutinación se traduce por la aparición de un pequeño botón netamente destacado.  Diluir el suero en el buffer borato utilizando un microdilutor. En caso de aglutinación positiva. por lo que estos anticuerpos pierden su poder aglutinante.  Colocar una gota de antígeno de toxoplasma en todos los pocillos. las muestras que resultan positivas a B. El título del suero corresponde a la dilución más elevada que muestre una aglutinación total o casi total. Las técnicas serológicas de aglutinación rápida y lenta se emplean para diferenciar los animales que presentan anticuerpos de tipo IgM a consecuencia de la vacunación de aquellos que presentan anticuerpos de tipo IgG inducidos por una infección activa con la cepa de campo. Por lo tanto. si se observa aglutinación aún en los tubos tratados con 2-ME. La lectura se facilita si se efectúa sobre un fondo oscuro o mediante iluminación oblicua.P. Los sueros problema son analizados por la prueba de B. 2.  Colocar una gota de buffer borato a temperatura ambiente desde el pocillo número 2 al número 8. para diferenciar si el anticuerpo que actúa es de isotipo IgM o IgG se utiliza la prueba del 2-ME. Los animales que resultan positivos a esta prueba son considerados como infectados y deben ser segregados del rodeo. La identificación de los animales infectados se realiza a través de la detección de anticuerpos específicos contra Brucella abortus. el diámetro del tapiz debe ser superior a la mitad del diámetro del pocillo.  Colocar un film plástico a fin de evitar la desecación e incubar 24 horas a temperatura ambiente. En ambos casos se enfrentan diluciones seriadas del suero problema con una suspensión estandarizada de Brucella abortus cepa 19. El control del antígeno debe ser totalmente negativo. En este último caso. Los valores límite de esta técnica son 1/128 para el perro y 1/256 para el gato. MÉTODO:  Colocar 60ul de suero a analizar en el pocillo número 1 de una placa de microaglutinación con pocillos de fondo cónico.  Agitar las placas enérgicamente durante 30 segundos cuidando de que no se derrame el contenido de los pocillos. se observa un tapiz homogéneo de células o un botón de mayor tamaño que el anterior y con contornos irregulares. En el caso particular de la cepa 19 de B. que permite la identificación de los animales que presentan anticuerpos específicos contra Brucella abortus.

No obstante ello.A. Inmunología básica. Bs. 2. Guerrero R. al igual que la aglutinación. Guía de trabajos prácticos.Capítulo 6. Gonzalez C. Año 2000. Editorial medica Panamericana 5º edición septiembre de 1996. Fenómeno de Prozona: Cuando se valora un antisuero. Este fenómeno además está relacionado con los anticuerpos asimétricos o monovalentes mencionados anteriormente.L.1° edición. septiembre de 1986. orina y otros fluidos. Todo esto indica la necesidad de evaluar los sueros a más de una dilución para descartar los falsos negativos debidos al fenómeno de prozona. la disminución de la concentración de los anticuerpos por el efecto de la dilución del suero hace que la reacción de aglutinación decrezca hasta hacerse nula. por la parte inferior. A. Los tubos se observan sin centrifugar. aún en ausencia de aglutinación. en general a temperatura ambiente. Capítulo I. Fac. Veterinarias. Generalmente las uniones de los antígenos a los soportes son no covalentes y la fijación se obtiene por mezcla directa. Cs.transformar la reacción de precipitación en una reacción de aglutinación. Manual de Inmunología México: Editorial Diana. 89 . 3. Margni R.. 1986. Capítulo 14. el anticuerpo está unido al antígeno. Mediante el empleo de anticuerpos marcados se ha podido demostrar que en estos tubos..: Editorial: Addison-Wesley Iberoamericana.U. en algunos sueros se observa un comportamiento particular que está caracterizado por la ausencia de aglutinación en los primeros tubos de la serie. en cambio para la fijación de proteínas es necesario el tratamiento previo de los glóbulos rojos con aldehídos simples como el fórmico o pirúvico. la fijación de hidratos de carbono no necesita intermediarios. En el caso de los hematíes. Medina E. Es cuatro veces más sensible que la aglutinación y mucho más aún que la precipitación. La aglutinación pasiva es un método semicuantitativo que. El número de moléculas de anticuerpo que intervienen en uno y otro caso difieren muchísimo. R.E. en tanto que en la aglutinación pasiva se ha transformado al antígeno en una partícula de gran tamaño. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. capaz de dar aglutinados visibles con unos pocos complejos Ag-Ac. A este fenómeno se lo llama prozona. Esto se ha logrado con magníficos resultados mediante la fijación de antígenos solubles a hematíes o partículas inertes como el poliestireno. el antígeno es pequeño y se necesitan muchos complejos Ag-Ac agregados para que la reacción se visualice. La reacción se efectúa colocando en tubos distintas diluciones del suero a valorar y un volumen determinado del antígeno fijado al soporte. 1981. y aglutinación positiva a diluciones mayores del suero. y simplemente Aglutinación pasiva cuando se utilizan otros soportes. A la reacción que resulta del empleo de glóbulos rojos como soporte se la llama Hemoaglutinación pasiva. estadísticamente es muy poco probable que los dos fragmentos Fab del anticuerpo puedan unirse a dos epitopes ubicados en partículas diferentes. (Ver capítulo de grupos sanguíneos y reacciones posttransfusionales). y Bautista C. Anticuerpo y antígeno se mezclan mediante agitación suave y se incuban durante un tiempo determinado. Edición consultada. As. de ahí la distinta sensibilidad (límite de detección). en los que la concentración de anticuerpos es máxima. Epidemiología. La reacción de Coombs permite identificar estas reacciones incompletas.L. Esta técnica se emplea para investigar hormonas y antígenos solubles en sangre..1º edición. Bibliografía 1. el látex y la bentonita. para determinar si ha habido aglutinación. Esto es consecuencia del tamaño de las partículas antigénicas que intervienen en la reacción. Puesto que existe un marcado exceso de anticuerpos respecto a los determinantes antigénicos. permite determinar concentraciones relativas de anticuerpos sobre la base de la máxima dilución aglutinante. Morilla A. En la precipitación. 4.

Retardada. Se sintetizarían por estímulos antigénicos provocados por sustancias que están en la naturaleza. la reacción post-transfusional aguda no tiene lugar en una primera transfusión a un receptor DEA1. Desconocida. No se han identificado reacciones post-transfusionales relacionadas con el grupo sanguíneo DEA4. (1) DEA = Dog erythrocyte antigen. especialmente en plantas y bacterias. los animales portadores de este grupo sanguíneo son considerados dadores universales.1 1.1 es el más inmunogénico (siguiéndole el DEA1.5. secuestro de células. Sin embargo. TABLA 1: Grupos sanguíneos del canino Grupo sanguíneo (DEA) (1) 1. Son heredados en forma independiente entre ellos y por herencia mendeliana de dominancia autosómica. están constituidos por Ags débiles. Ninguna.1 negativo. no hemólisis. secuestro de células. El resto de los grupos sanguíneos (a excepción de DEA4). La denominación internacional de grupos sanguíneos caninos y sus características de muestra en la Tabla 1. secuestro de células. La importancia de los diferentes Ags de grupos sanguíneos en las reacciones posttransfusionales se relaciona con su inmunogenicidad. El carácter retardado y no agudo de este tipo de respuesta determina que aún con presencia de anticuerpos naturales en los animales negativos. tampoco resulte crítica una primera transfusión de sangre incompatible. 5 y 7.2 3 4 5 6 7 8 Incidencia en la población (%) (2) 42 20 6 98 23 98-99 45 40 Presencia de anticuerpos naturales (3) No No Sí No Sí No Sí No Importancia en la transfusión Reacción hemolítica aguda. Por esta razón. Las características de los grupos sanguíneos caninos en lo que respecta a su inmunogenicidad (y consecuentemente. que son de estructura muy similar a los Ags eritrocitarios. Reacción hemolítica aguda. Manual de Procedimientos para el Diagnóstico de la Brucelosis Bovina. debido a que no hay anticuerpos naturales contra este Ag. Departamento de Brucelosis. no hemólisis. como es el caso de los grupos DEA 3. Retardada. El grupo sanguíneo DEA1. Ninguna. Están presentes en la sangre sin que haya habido exposición previa a dichos Ags. Retardada. al tipo de reacción que provocan) y la presencia o ausencia de anticuerpos naturales en la población.2) y es capaz de provocar reacciones agudas de fuerte hemólisis intravascular por activación de la vía clásica del complemento. determinan que una primera transfusión de sangre 90 . su frecuencia en la población y la presencia de anticuerpos naturales. DILACOT – SENASA. no hemólisis. (antígeno eritrocitario canino) (2) La incidencia en la población está basada en una compilación de estudios internacionales. que no provocan hemólisis intravascular sino una reacción de secuestro y destrucción extravascular de los eritrocitos incompatibles por parte del sistema mononuclearfagocítico. (3) Los anticuerpos naturales son anticuerpos específicos contra los antígenos de grupo sanguíneo que el individuo no posee. 2000 Grupos sanguíneos en caninos y reacciones post-transfusionales Los antígenos de grupos sanguíneos son glucolípidos y glucoproteínas localizados en la superficie de la membrana celular de los glóbulos rojos.

pues los mismos son destruidos progresivamente a medida que la respuesta inmune se desarrolla. pero no garantiza que se eviten las consecuencias a mediano y largo plazo descriptas en el primer apartado. En la prueba menor se incuban los eritrocitos del receptor con el suero o plasma del donante. se elimina la posibilidad de reacciones hemolíticas agudas graves. en futuras transfusiones con sangre incompatible de igual grupo que la primera se producirá una respuesta inmune secundaria. El resultado de la prueba cruzada no indica identidad de grupos sanguíneos entre dador y receptor. Una reacción positiva en la prueba menor resulta significativa cuando se van a transfundir volúmenes grandes de sangre y nos indica la conveniencia de transfundir sólo eritrocitos y no sangre entera. La presencia de aglutinación indica que se ha producido reacción antígeno-anticuerpo y en consecuencia. De este modo. sino las siguientes consecuencias: . .2). Prueba cruzada: En el caso de que no sea posible realizar la tipificación. debido a que un resultado negativo sólo indica que la transfusión no provocará reacciones post-transfusionales inmediatas. De este modo.Sensibilización del animal receptor a los Ags del grupo sanguíneo incompatible transfundido. .incompatible. en su defecto. cualquiera sea el grupo sanguíneo al que pertenezcan los eritrocitos transfundidos. realizar la “prueba cruzada (cross-match)”. En la prueba mayor se incuban los eritrocitos del donante con el suero o plasma del receptor. Dada la alta probabilidad de reacciones falsas negativas. La mayor eficacia en la transfusión se logra cuando los eritrocitos del donante pertenecen a igual grupo sanguíneo que los del receptor. sólo manifiesta la presencia o ausencia de Acs contra los Ags eritrocitarios en el plasma. éste puede llegar a tener problemas de hemólisis intravascular al mamar calostro que contiene los anticuerpos maternos contra su grupo eritrocitario (ver isoeritrólisis neonatal). Este efecto es importante para grupos que provocan reacción fuertemente hemolítica (DEA1. 91 . si bien no se evita la disminución de la vida media de los eritrocitos transfundidos debido a la posible incompatibilidad con otros grupos sanguíneos. Es frecuente que sólo se tipifique el grupo sanguíneo DEA1.1 del feto durante la preñez (25 % de incidencia). se recomienda tipificar previamente la sangre de donante y receptor o. el resultado positivo hace contraindicada la transfusión. En el caso de la prueba mayor. En cuanto al recién nacido.Posible sensibilización de la madre DEA1. no produzca una rápida destrucción masiva. hay certeza de que esos eritrocitos tienen el antígeno de grupo sanguíneo para el cual es específico el antisuero o los Acs monoclonales utilizados.Vida media más breve de los eritrocitos transfundidos si la incompatibilidad se debe a antígenos contra los cuales el receptor posee anticuerpos naturales. o cuando se transfunden eritrocitos del grupo DEA4. Tipificación de los antígenos de grupos sanguíneos: La tipificación consiste en incubar una suspensión de eritrocitos del individuo con antisuero o Acs monoclonales específicos para cada antígeno eritrocitario.1 y en menor medida DEA1.1.1 negativa a los eritrocitos DEA1. Para prevenir las situaciones mencionadas. que consiste en la presencia de aglutinación en el sedimento y/o de hemólisis en el sobrenadante. se impone la realización de una prueba cruzada. indica que el plasma tiene Acs contra los Ags eritrocitarios. . Se procede luego a la centrifugación. Esta situación es equivalente a la sensibilización por transfusión.Estimulación de una respuesta inmune primaria que disminuye la vida media de los eritrocitos transfundidos. Esta prueba se subdivide en prueba mayor y prueba menor. debe confirmarse el resultado mediante la prueba de Coombs (ver más adelante). Es una medida indirecta y parcial de compatibilidad sanguínea. La reacción positiva.

Las anti-Igs agregadas (también llamadas suero de Coombs).PRUEBA DE COOMBS La aglutinación es la manifestación visible de una reacción Ag-Ac en la cual el Ag es particulado. sería imposible la formación del enrejado pues no se producirían puentes de Acs entre las moléculas de Ag. Los Acs contra Ags eritrocitarios pertenecen en su mayoría a este grupo. La prueba de Coombs indirecta resulta de suma utilidad para evidenciar los fenómenos de prozona y para la tipificación de grupos sanguíneos. La prueba de Coombs. b. imposibilitando la formación del enrejado. de los resultados negativos reales debidos a la ausencia de Acs específicos. Sin embargo. en algunos casos. Diversas son las causas que pueden concurrir para producir este efecto: a. cualquiera sea la causa que los provoque. permite evidenciar estas reacciones Ag particulado-Ac mediante el agregado de anti-Igs de la especie. La técnica de Coombs directa consiste en el agregado de la anti-Ig a una suspensión de partículas de la que nos interesa saber si ya llevan unidas anticuerpos. Así. implica dos pasos: una primera incubación de la suspensión de Ag particulado con el antisuero y una segunda incubación luego del agregado del suero de Coombs. De este modo podemos diferenciar los resultados falsos negativos.Presencia de Acs monovalentes: Son Acs que debido a determinadas características de glicosilación se comportan como monovalentes. en tanto. también llamada de la antiglobulina.Exceso de Acs: En este caso. cada molécula de Ac se uniría con la totalidad de sus valencias a una misma partícula antigénica. la formación de lo que se denomina “enrejado” y que se visualiza en forma de aglutinación. La reacción de Coombs se esquematiza en la figura 1. caracterizada por la presencia de auto-Acs contra los eritrocitos propios. El diagnóstico de la anemia hemolítica autoinmune.Defecto de Acs: La cantidad de Acs específicos contra el Ag es muy escasa. consiste en el agregado de anti-Ig de la especie a una reacción previa de aglutinación que ha resultado negativa. harán de puente entre las regiones Fc de los Acs unidos a las partículas antigénicas. La técnica de Coombs indirecta. y no alcanza para formar un enrejado del tamaño suficiente como para que resulte visible. o sea. Por lo tanto. constituye un ejemplo de uso de esta técnica directa y consiste en el agregado del suero de Coombs a una suspensión de eritrocitos de un animal sospechoso de sufrir la enfermedad. como por ejemplo las bacterias y los eritrocitos. formando de este modo el enrejado que se ve en forma de aglutinación. Figura 1 92 . La prueba de Coombs puede ser directa o indirecta. c. si bien tiene lugar la reacción Ag-Ac no se produce la esperada manifestación visible.

estimula la producción de una respuesta inmune específica de tipo primaria en la madre. Esta respuesta dará lugar a una rápida síntesis de una elevada tasa de Acs que serán transmitidos al recién nacido mediante el calostro.Que alguna vez haya recibido una transfusión de sangre DEA1. provocando en el cachorro una reacción de hemólisis intravascular aguda. etc) APENDICE Grupos sanguíneos del felino Grupo sanguíneo A B AB Genotipo (1) A/A . pero dado que el calostro es un alimento fundamental. aún en la primera transfusión.1 al momento de la producción de calostro. Grupos sanguíneos del equino La determinación de grupo sanguíneo en el equino se puede utilizar para la determinación de paternidad. 93 . Hay peligro de reacción post-transfusional entre receptor de grupo B y donante de grupo A. Es posible realizar esta prueba antes del parto utilizando los eritrocitos del padre.1. por lo que no hay riesgo de isoeritrólisis neonatal en esta primera preñez. Los Acs anti-DEA1. No obstante. se produce cuando la madre transmite Acs contra los Ags eritrocitarios del cachorro a través del calostro.1 al unirse a los eritrocitos del neonato. provocarán la activación de la vía clásica del complemento con la consecuente hemólisis intravascular aguda. búsqueda de nodriza.ISOERITRÓLISIS NEONATAL Esta enfermedad. es la herramienta con que se cuenta para tomar la decisión: Un resultado positivo hace contraindicado el mamado de calostro. previamente sensibilizada al Ag eritrocitario DEA1. no conviene privar de él al cachorro a menos que exista la seguridad de la presencia de Acs anti-eritrocitos. los eritrocitos del feto hayan pasado a la circulación sanguínea materna. También es una técnica corriente en esta especie debido a la incidencia de anemia hemolítica del recién nacido.7%) Anticuerpos naturales (3) Puede haber una mínima reacción anti-B Altos títulos de anticuerpos naturales anti-A Ninguno (1) (2) (3) El alelo A es dominante.1 positivo. la madre queda sensibilizada para futuras gestaciones. Estos datos están basados en una compilación de estudios internacionales. La sensibilización de la madre puede suceder por dos circunstancias: a. La isoeritrólisis neonatal puede prevenirse si se evita que el recién nacido mame calostro. debido a que son Ags débiles y no provocan reacciones de hemólisis intravascular. de este modo obtenemos el dato con anticipación para poder preparar el manejo adecuado del recién nacido en caso de que la prueba arroje resultado positivo (administración de calostro artificial. también denominada ictericia hemolítica del recién nacido.1 negativa. tiene un cachorro DEA1. En una posterior gestación de un cachorro DEA1.1 positivo. Esta respuesta da lugar a una muy baja o nula cantidad de Acs anti-DEA1.1.A/B B/B A/B Frecuencia de expresión (2) El más común (74-100%) Menos común (0-26 %) Menos común (0.1-9. Puede producirse cuando una madre DEA1. b. El resto de los Ags de grupos sanguíneos carecen de relevancia en lo que respecta a esta enfermedad. que cuando sucede tiene lugar en fecha cercana al parto. El fenotipo AB es el resultado de un tercer alelo que permite la expresión codominante de A y B. Este hecho.1 y en el caso de que los eritrocitos del feto pasen a la circulación materna.Que en una anterior preñez de un cachorro DEA1. la hembra ya sensibilizada (cualquiera sea la causa de la sensibilización) responderá a este estímulo antigénico con una respuesta de tipo secundaria. La realización de una prueba cruzada entre el suero o plasma de la madre y los eritrocitos del recién nacido.

q C–c K–k T–t U–u Grupos sanguíneos (1) A1 .Sistemas A D P Q C K T U Alelos o factores A1 . A. 1995. por ejemplo.R .C. 94 . la proteína A y el PWM estimulan la diferenciación de linfocitos B y la PHA activa ambas poblaciones linfocitarias.P` . Este reactivo tiene la propiedad de crear un gradiente de densidad durante la centrifugación. Giger U et al. polimorfonucleares. no heredándose los factores componentes por separado. entre otros.p Q .H . células mononucleares y plasma. en asociaciones definidas de factores sanguíneos que constituyen los grupos sanguíneos.A . Margni R. An acute hemolytic transfusion reaction caused by dog erythrocyte antigen 1. De mayor a menor densidad (desde el fondo a la boca del tubo) se obtienen los siguientes estratos: eritrocitos. May 1. JAVMA. Tizard. 1358-1362. 2. Nov. inducen la activación y proliferación de los linfocitos en forma policlonal e inespecífica.(-) (1): Los complejos antigénicos se heredan en bloques.A1A` . Interamericana.A1A`H . 1323-1332. 1995.(-) Q . Vol.H . Metodología (Figura 1): A) Obtención de las células mononucleares por separación en gradiente de densidad Se centrifuga sangre heparinizada sobre una columna de un reactivo denominado FicollHypaque o similar.R .A` .A1H . la Con-A se clasifica como mitógeno de células T en tanto que el LPS. Bs.A`H .QRS .a D-J–d P1 .DJ .J . Ficoll-Hypaque.S .1 incompatibility in a previously sensitized dog. As.QR . Canine blood groups and their importance in veterinary transfusion and medicine. 3. septiembre de 1996. Son ejemplos de estos mitógenos la Concanavalina-A (Con-A). 5º edición.P1P` . la Fitohemaglutinina (PHA).(-) U . el mitógeno de la hierba carmín (PWM). Las poblaciones linfocitarias sobre las que actúan estos mitógenos varían según la especie animal. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. Editorial Médica Panamericana. El halo formado por las células mononucleares (linfocitos y un mínimo porcentaje de monocitos) se aspira con una pipeta. el Lipopolisacárido (LPS) y la proteína A del Staphylococcus.RS .(-) K . Ed.(-) C .(-) D . Number 6. 25. oligoclonal y específica. Las células obtenidas se lavan con solución salina y se resuspenden en medio de cultivo a la concentración celular de uso. I. 4° Edición. es decir.P` . Evaluación de Inmunidad celular por linfoproliferación La prueba de linfoproliferación consiste en la evaluación de la expansión clonal de los linfocitos de sangre periférica en cultivos estimulados en forma inespecífica (con mitógenos) o específica (con antígenos).RS . Halle A. M.A` .H . A diferencia de los mitógenos. Los mitógenos son sustancias que tienen afinidad por determinadas estructuras químicas de la superficie linfocitaria y que.(-) T . en el que cada componente de la sangre se ubica en un diferente nivel. En la especie canina. 1995. los antígenos activan sólo los linfocitos de los clones específicos y desencadenan una respuesta proliferativa.QR . Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Bibliografía: 1.S .Graw – Hill. Inmunología Veterinaria. 206. Vol. al unirse a ellas.(-) P1 .QS . 4.

que contienen la suspensión celular sin estimular. En estas placas vamos a tener: Hoyos controles. de acuerdo a la siguiente fórmula: I. Los resultados se expresan como índice de estimulación (I. las células de cada hoyo se aspiran con un cosechador quedando retenidas sobre filtros especiales. D) Revelado de la proliferación El tritio que marca las moléculas de timidina emite radiación beta que puede ser leída en un contador de centelleo líquido y cuantificada como cuentas por minuto (cpm) o desintegraciones por minuto (dpm). mayor será la radiactividad retenida en cada filtro.E. Transcurridas 12 a 16 horas de cultivo con el medio que contiene timidina tritiada. que contienen la suspensión celular a la que se le agrega el estímulo proliferativo. Las placas se incuban a 37°C en estufa con ambiente húmedo y 5% de CO2.B) Cultivo en microplacas de 96 hoyos Las células se resuspenden en medio de cultivo y se siembran en microplacas de cultivo de 96 hoyos.E. que ahora tendrán ADN tritiado en sus núcleos. se agrega timidina tritiada a cada cultivo. Se realiza el promedio de los triplicados correspondientes a cada muestra. o sea mayor el número de cpm leído. A mayor proliferación en cada hoyo. Las moléculas de timidina marcadas con tritio (3H) se incorporan al ADN de las células en proliferación. = promedio de cpm en los hoyos estimulados promedio de cpm en los hoyos controles 95 . Hoyos estimulados. Ambos tipos de cultivo se realizan al menos por triplicado.). C) Marcación con timidina tritiada Luego de varios días de cultivo. ya sea mitógeno inespecífico o antígeno.

m.Figura 1 Sangre periférica Gradiente de Ficoll-Hypaque Plasma Halo mononucleares Ficoll Hypaque Polimorfonucleares Eritrocitos Suspensión de células mononucleares (SCM) Cultivo Controles (SCM + medio de cultivo) Incubación Estimulados (SCM + medio de cultivo + estímulo: mitógeno o Ag) Pulso de timidina tritiada Cosecha c.p. controles 96 .m.p.m. estimulados X c.p. IE: X c.

69 (1999).000 10. Se postula que tiene la ventaja de reproducir mejor las condiciones in vivo y evitar la pérdida de células (supoblaciones de L con diferentes funciones) que conlleva el proceso de purificación en gradiente utilizado en la metodología convencional.  El efecto que tienen las interleuquinas que se secretan frente a diferente tipo de situaciones (stress. se vacuna a los animales in vivo y se mide la respuesta proliferativa al Ag in vitro. 97 . Como puede observarse en el gráfico que se reproduce. aquellas enfermedades que provocan inmunodeficiencia (ej. En caninos.). Para ello. Aplicaciones La técnica de linfoproliferación puede aplicarse para evaluar:  La capacidad funcional de los linfocitos. se ha demostrado que esta metodología es comparable y aún más reactiva que la técnica clásica descripta. moquillo canino. J et al. En el trabajo que se cita infrascripto. quemaduras. parvovirosis canina. cpm 30. sino directamente en cpm.  La acción inmunosupresora de ciertos fármacos como medicamentos inmunosupresores (utilizados para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o linfoproliferativas) o de medicamentos cuyos efectos colaterales inmunosupresores requiere un seguimiento del paciente. 127-135).  La respuesta linfocitaria frente a un antígeno determinado. esta anomalía se evidencia in vitro mediante la prueba de proliferación linfocitaria en cultivos estimulados con fitohemaglutinina (PHA).  El efecto de los inmunoestimulantes sobre la inmunidad celular  El efecto de diferentes tipos de vacunas o esquemas de vacunación sobre la inmunidad celular. Por ejemplo. Canine X-linked severe combined immunodeficiency.Se ha desarrollado una variante de la metodología descripta. leishmaniasis canina. Veterinary Immunology and Immunopathology. que utiliza directamente la sangre entera heparinizada diluida en medio de cultivo como fuente de linfocitos. Los resultados no están expresados en índice de estimulación. traumatismos. etc.  El efecto que tienen sobre la capacidad funcional de los linfocitos. Los linfocitos normales deben presentar una respuesta proliferativa a la estimulación con mitógenos inespecíficos. la respuesta proliferativa de los linfocitos en los caninos con inmunodeficiencia severa combinada es significativamente menor a la de los linfocitos provenientes de caninos normales.000 20. la inmunodeficiencia severa combinada de los caninos (XSCID) es un desorden genético caracterizado por la falta de funcionalidad de linfocitos B y T. etc. que nos permite identificar la sensibilización previa del individuo frente al antígeno.) sobre los linfocitos.000 0 Normal XSCID (Felsburg.

Steven. 14 (1986/1987). Freitag KA et al. Ramayo. and lipopolysaccharide on the replication and immunoglobulin synthesis by canine peripheral blood lymphocytes in vitro. Leukoc. Millen. Algunos autores afirman que hay dos etapas en la neutralización: 1) Formación de partículas no infectivas pero absorbibles a las células por los sitios libres del virus. Técnica de Seroneutralización Se define como seroneutralización a la prueba que detecta la pérdida de infectividad de un microorganismo (virus o bacteria) o de toxicidad (toxinas) que se produce in vitro por la acción de anticuerpos específicos presentes en el suero. 8. Hockberger PE. G. variaciones de pH o simplemente dilución y las partículas virales vuelven a ser infecciosas. L G.. etc. Vaccination of racing greyhounds: effects on humoral and cellular immunity.). 1999 Dec. Cook G. 2005. etc. Acute starvation and subsequent reffeding affect lymphocyte subsets and proliferation in cats. Immunosuppression by canine distemper virus: modulation of in vitro immunoglobulin synthesis. et al. 98 .lymphocytes. La combinación de virus y suero generalmente es débil y en ocasiones el virus no se inactiva durante el proceso. Veterinary Immunology and Immunopathology. Fundamentos de la reacción La reacción consiste en mezclar un virus y el suero que se intenta evaluar y determinar si la capacidad infectante del virus se modifica (por la presencia de anticuerpos neutralizantes) o no. la explicación de la misma será realizada basándonos en estos microorganismos. 15 (1987). Nutr. 49 (1995). phytohemagglutinin. 5. Una de las explicaciones del fenómeno de neutralización es que el anticuerpo específico envuelve a la partícula viral e impide que ésta se ponga en contacto con las células susceptibles. Veterinary Immunology and Immunopathology. secundarios o líneas celulares). Am. Immunology Letters. la reacción en un primer estadio puede ser reversible si se somete la mezcla a ciertas condiciones como vibración iónica. Steven et al. La temperatura y el tiempo utilizados dependen del tipo de virus y el huésped con que se trabaja. interleukin release and prostaglandin E2 production. Physiol. 181-201. hámster. 11 (1986). 66 (6): 981-988. Existe una relación entre la reversibilidad de la reacción virus-anticuerpo y el tiempo y la temperatura de incubación. animales de laboratorio (ratones. 281-289. 277 (6 Pt 2): R1741-8. 7.and T. Effects of concanavalina-A. venosa. Mundo S L. Activation specificity of commonly employed mitogens for canine B. Ringer. cavidad amniótica. Letwin.Bibliografía 1. 1999 Dec. Susan. 4. La presencia del virus no neutralizado se detecta a través de diferentes sistemas como cultivos celulares (ya sean primarios. 2) Formación de partículas no infectivas ni absorbibles. Soba M G. Veterinary Immunology and Immunopathology. 101-113. Fred. pero los protocolos varían según el sistema y se fijan para poder comparar resultados. 3. Generalmente se utiliza 1 hora a 37 ºC. Por esta razón. PGE2 suppresses mitogen-induced Ca2+ mobilization in T cells.) o embriones de pollo (utilizando distintas vías de inoculación: corioalantoidea. cerebral. Biol. pokeweed mitogen. Sayeed MM. Krakowa. 2000 Oct. Bruce and Quimby. J.. 6. Choudhry MA. la reacción virusanticuerpo será cada vez más estable. Krakowa. 79-85. Cuanto mayor sea el tiempo de incubación.130 (10): 2444-9. por bloqueo de todos los sitios activos. 7 (1): 63-70. et al. Transforming growth factor beta from multiple myeloma cells inhibits proliferation and IL-2 responsiveness in T lymphocytes. J. 2.L. alantoidea. J. centrifugación. Dada la importancia que tiene la aplicación de esta técnica en virología. InVet. Evaluación de la inmunidad celular en caninos: prueba de proliferación de linfocitos in vitro.

Por esta razón conviene contar con sueros testigos positivos (con anticuerpos neutralizantes) y negativos. Con esta prueba se pueden seleccionar los animales vírgenes para las pruebas de potencia de vacunas y también evaluar la eficacia de una vacuna en desarrollo. a) Seroneutralización como método de tipificación de un virus: Cuando los virus tienen una constitución antigénica única (como rubéola). La reacción consiste en mezclar volúmenes iguales de virus purificado (ya sea por filtración o centrifugación) con cada uno de los sueros hiperinmunes monoespecíficos. . todas las cepas de ese virus pueden ser neutralizadas con un mismo suero. En esta reacción. ya que evalúa únicamente inmunidad humoral.el sistema de detección. . Por ejemplo. no tiene en cuenta la actividad inmunitaria de base celular. Recordemos que uno de los objetivos de la vacunación es estimular la producción de anticuerpos protectores. se encuentran el de la Fiebre Aftosa.la vía de inoculación (si se utilizan animales susceptibles). Sin embargo. CPV2a y CPV2b por separado y en forma combinada para poder identificar con que anticuerpo (s) específico (s) se logra la neutralización. 99 . puede deberse a la pérdida de infectividad del virus y no a la capacidad neutralizante del suero. cuando un virus presenta diferencias antigénicas entre sus distintas cepas. cada una de ellas deberá ser neutralizada con un suero específico que permita distinguir serotipos o serovariedades virales. algunos enterovirus como el de la Poliomielitis. . Esta operación de neutralización se denomina “tipaje o tipificación”.la estabilidad del virus a cambios de temperatura. Las mezclas se incuban 1 hora a 37ºC. La verificación de la presencia eventual de dos o más tipos de virus en una muestra se facilita si la neutralización se hace con todos los anticuerpos existentes. es necesario disponer de tantos sueros neutralizantes específicos como tipos serológicos (serotipos) existen. que constituyen el grupo más numeroso. ya que representan una población de riesgo. La seroneutralización permite también identificar individuos que carecen de anticuerpos neutralizantes en su suero.el pH y otros diversos factores físicos y químicos. que son los que se evalúan por esta metodología y corresponden a anticuerpos capaces de evitar la infección.la especie y edad del individuo del cual provienen los anticuerpos . el antisuero que neutraliza indica qué cepa o virus es el responsable de la destrucción o lesión del sistema sensible. (anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales absorbidos). incluyendo los controles de virus y sueros. después de lo cual cada una de ellas se siembra en cultivos celulares o se inocula en animales de laboratorio. la prueba de seroneutralización no revela el estado inmunitario del animal en su conjunto. en el caso de parvovirus canino. Cuando se procede al estudio de neutralización de algunos de los virus mencionados.Factores que influyen en la reacción Los resultados de las pruebas de seroneutralización varían según: . y adenovirus como el de la Hepatitis Canina. Aplicaciones Esta técnica serológica puede ser utilizada para detectar y tipificar virus en animales infectados o para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes en animales que han superado la infección o han sido vacunados. Por el contrario. pues un aumento aparente del título neutralizante por elevación de temperatura de incubación o por un tiempo de incubación más prolongado. Entre estos virus. estos individuos se deben seleccionar con preferencia en casos de vacunaciones. la seroneutralización se lleva a cabo con los tres anticuerpos específicos para las cepas CPV2. Esto significa que como muchas otras pruebas.

b) Seroneutralización como método de identificación de anticuerpos neutralizantes: En ciertos casos es útil determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes homólogos en el suero de un animal, ya que éstos indican una infección o vacunación anterior. Cuanto mayor sea el título obtenido indicará que cualquiera de estos eventos es más reciente. En seroneutralización existen dos técnicas: 1- Suero variable–virus fijo (SV - VF) 2- Suero fijo–virus variable (SF - VV) Para ambas técnicas se debe contar con sueros de referencia negativos y positivos. Los sueros positivos se obtienen de animales que han estado en contacto anteriormente con el antígeno (virus) y los negativos de animales que no han tenido contacto alguno con el mismo. Los sueros se inactivan durante 30 minutos a 56ºC para destruir los factores termosensibles del complemento y se titulan varias veces en cualquiera de los sistemas sensibles (células, embriones de pollo, ratones, etc.) Por último se calcula la media de los títulos obtenidos en las diferentes repeticiones. Estos sueros se conservan fraccionados a -70ºC. Los sueros problema se procesan de la misma manera, es decir, se inactivan 30 minutos a 56 ºC antes de proceder a su estudio y se prueban en las diluciones de uso sobre el sistema seleccionado para evaluar la seroneutralización, para determinar si presentan efecto de toxicidad. En general, en bajas diluciones, la mayoría de los sueros poseen efecto tóxico. En estos casos se debe aumentar las diluciones y considerarse en el cálculo del Índice de Seroneutralización (ver anexo). Los resultados se pueden expresar como: Índice de seroneutralización (IS): Este se obtiene a partir de diferentes cálculos, por ej:  Título del virus - Título del virus incubado con suero problema, o  Título del virus incubado con suero normal negativo - Título del virus incubado con suero problema Por ejemplo, Título de virus= 106.33 Título del virus incubado con suero problema= 103.40 IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93 10 2.93expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema. Ventajas y desventajas de la elección de cada una de estas técnicas:  En la técnica a SF - VV en general no se deben descartar los resultados por problemas de título viral, a no ser que se produzca contaminación.  La técnica a SV - VF es más precisa, pero si las dosis infectantes obtenidas no son las correctas, la prueba debe ser desechada. Las técnicas descriptas para cultivos celulares se pueden realizar en frascos de cultivo o en microplacas de cultivo, modificando los volúmenes de reacción. A fin de facilitar la lectura del efecto citopático, se pueden utilizar colorantes sensibles al pH en el medio de cultivo, como por ejemplo rojo fenol, que permiten determinar el estado metabólico de la microplaca. El color será amarillo en los hoyos donde las células mantienen su viabilidad y será rojo en los hoyos donde hubo efecto citopático. Bibliografía 1. Guía de trabajos prácticos. Inmunología. Año 1980 2. Harris, RJC. Techniques in Experimental Virology. New York/London: Academic Press. 1964.

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3. Robson, DS; Gillespie, JH; y Baker, J.A. The neutralization test as an indicator of immunity to virus diarrhea. Cornell Vet. 50: 503-509. 4. Sorenson, DK; Chow, TL; Kowalczyk, T.; Hanson, RP.; y Brandly, CA. Persistence in cattle of serum-neutralizing antibodies of vesicular stomatitis virus. Am. J. Vet. Res. 19: 74-77. 1958. Anexo Seroneutralización a Suero fijo-virus variable (SF–VV):  En esta técnica el suero problema se diluye entre 1/2,5 y generalmente no más de 1/10, dependiendo del virus con que se trabaje. Esta dilución se siembra en cuatro tubos a razón de aproximadamente 1ml por tubo.  Simultáneamente se procede a la dilución del virus en base 10.  Las diluciones de virus a utilizar en la seroneutralización dependen de que los animales a evaluar sean libres o vacunados. Los rangos utilizados son arbitrarios, pero para su selección debemos tener en cuenta el origen de los animales a evaluar: - En el caso de ser animales libres de infección, se emplea un número bajo de dosis infectivas ya que al tener el suero niveles mínimos o nulos de anticuerpos, se necesita poco virus para superar el efecto neutralizante de los anticuerpos y llegar a determinar el efecto citopático viral necesario para calcular el título. - En cambio, si se trabaja con suero de animales vacunados, se utiliza un número más alto de dosis infectivas ya que los niveles de anticuerpos esperados son mayores.  Una vez obtenidas las diluciones del suero y el virus, se mezclan en partes iguales y se incuban 1 hora a 37ºC.  Luego de la incubación se siembran o se inoculan en el sistema elegido (células, ratones o embriones de pollo). No hay que olvidarse de colocar los controles con sueros de referencia positivos y negativos.  Estas reacciones se incuban por un período variable que depende del sistema y del tipo de virus, pero que en general es de 3 a 10 días.  Las lecturas se realizan diariamente buscando el efecto de la infección viral según el sistema utilizado. - En el caso de los cultivos celulares, las lecturas se efectúan por observación microscópica del efecto citopático que se pone de manifiesto como muerte celular, modificación de la morfología celular, etc. - En el caso de los huevos embrionados pueden ser la aparición de pústulas, muerte del embrión, etc. - En el caso de los animales de laboratorio se tendrá en cuenta si sobreviven o no.  El cálculo de los títulos se realiza utilizando el método de Reed y Muench, referido a las dosis infectivas en cultivo de tejido al punto final 50% (TCID50, por las siglas en inglés Tissue Culture Infectious Dosis 50%). Este término también se lo puede encontrar descrito como dosis de efecto citopático 50% (DEC50). En la titulación, el punto final se toma como la dilución en la cual cierto porcentaje de cultivos o animales muestran lesiones. Se ha demostrado estadísticamente que el valor más apropiado es aquél en el que la mitad de éstos muestran efecto producido por la infección viral y la otra mitad no. Esta región es la que ofrece mínimo error en lo que atañe a la variación individual en la sensibilidad al virus. La obtención de resultados estadísticos requiere inocular el mayor número posible de réplicas y hacer diluciones poco espaciadas. Reed y Muench idearon un método simple, denominado “método de los totales acumulativos”. Éste se basa en considerar que los animales o cultivos celulares que recibieron menor dosis de virus infectante y presentaron lesiones, hubieran mostrado las mismas lesiones con virus más concentrado. El objetivo de este método es conocer la dilución del virus que corresponde al 50% de infección. Se utiliza un sistema de sumas para obtener los totales acumulados y obtener el cálculo del punto final. Los valores acumulados se obtienen sumando en el sentido de las flechas, como se esquematiza en el siguiente cuadro.

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Muestras o No animales Infectados o Valores Valores Dilución infectados o infectados / muertos acumulados acumulados de virus vivos No (positivos) positivos negativos (negativos) infectados

Relación acumulados % positivos / (1) Total de acumulados

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 0/4 0/4

4 4 4 4 3 0 0

0 0 0 0 1 4 4

19 15 11 7 3 0 0

0 0 0 0 1 5 9

19 / 19 15 / 15 11 / 11 7/7 3/4 0/5 0/9

100 100 100 100 75 0 0

(1) El porcentaje de cultivos o animales infectados representa la relación entre el total de infectados y el total de cultivos o animales inoculados. Se observa que el punto final 50% está entre el 75% y 0%, que corresponde a las diluciones 10-5 y 10-6. Por lo tanto el valor debe estar comprendido entre ellos, debe ser mayor a 10-5 pero menor que 10-6. Para estimar cuál es este valor se calcula la distancia proporcional (DP) entre dichas diluciones, utilizando la siguiente fórmula: DP =. % de positivos superior a 50 – 50 % de positivos superior a 50 - % de positivos inferior a 50 .

En este ejemplo,  DP = 75 - 50 = 0.33 75 - 0 Luego, (DP x log. del factor de dilución) se suma en valor absoluto al exponente de la dilución superior a 50. En este ejemplo,  El factor de dilución es 10 y el logaritmo de 10 es 1.  La dilución que da un porcentaje de positivos superior a 50 es 10-5  Por lo tanto, (0.33 x 1) + 5, determina que el valor es 10 5.33 El título se expresa con exponente positivo y su valor corresponde a 1 ml de inóculo. En este ejemplo,  El volumen de virus inoculado fue de 0.1 ml.  El título, por lo tanto, será: 10 5.33 x 10 = 10 6.33 TCID50/ml. Índice de seroneutralización (IS): Se puede obtener a partir de diferentes cálculos, por ej:  Título del virus - Título del virus incubado con suero problema, o  Título del virus incubado con suero normal negativo - Título del virus incubado con suero problema Por ejemplo, Título de virus= 106.33 Título del virus incubado con suero problema= 103.40 IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93 10 2.93expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema.

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9 1.20 103 . se debe conocer el título previo del virus. fraccionado y congelado a bajas temperaturas (en nitrógeno líquido a -196ºC.  En total. a fin de comprobar que las dosis infectantes inoculadas fueron las correctas.6 0.5 de este virus habrá 1000 TCID50/ ml. Para preparar el inóculo.50 = 0. de la Infectados dilución muertos o No infectados Valores o vivos acumulativos infectados o muertos 4 0 4 0 3 1 1 4 0 8 Valores acumulativos no infectados o vivos 12 8 4 1 0 % de no infectados o vivos 100 100 80 20 0 1/4 1/8 1 /16 1 / 32 1 / 64 0. por ejemplo 10 7.5. se debe calcular la distancia proporcional (DP).8 0 0 1 3 4 Al igual que en el caso SF-VV.2 1. A partir de esta dilución.% de no infectados inferior a 50 DP = 80 .16 se realiza a partir del tubo 10–4.50 . se obtiene una dilución 1/31600) que equivale a 10–4. se realiza el siguiente cálculo:  1 TCID50/ ml se obtendría en una dilución 10-7. se realizan tres diluciones más en base 10 para titular el inóculo viral en simultaneidad con la prueba (control de título viral).5  1000 TCID50/ ml se obtiene en una dilución 1000 veces más concentrada y ya que 1000 corresponde a 103.5.  Si los animales se trata de animales vírgenes se usarán diluciones de 1/2 a 1/8. % de no infectados superior a 50 .16.5 80 .5 es 3. dependiendo del tipo de vacuna. Dichas mezclas se incuban 1 hora a 37ºC y luego se siembran (sobre cultivos celulares) o se inoculan (en ratones o embriones de pollo). Es decir que una dilución 1/3.5  Es decir. por lo tanto. que en este caso en una dilución 10–4.Seroneutralización a Suero variable – virus fijo (SV-VF): En esta técnica se preparan diluciones (generalmente 1:2) de los sueros problemas y testigos en un buffer. si la dilución 1/3.  La fracción de dilución que falta realizar es la representada por 10–0.5 1. DP = % de no infectados superior a 50 . Para realizar esta técnica es necesario tener el virus que se va a utilizar previamente titulado. Para obtener 103 TCID50/ml hay que diluir el virus. Para calcular qué dilución del virus stock hay que efectuar para tener esa dosis. La dilución 10–4.5 y que contiene 1000 TCID50/ ml. por ejemplo con diluciones seriadas en base 10 mediante la cual se llega a la dilución 10-4. El antilogaritmo de 0. A partir de este punto las consideraciones son iguales que para la técnica SF–VV. El inóculo con las 1000 TCID50 se mezcla en partes iguales con los sueros problema y con los sueros de referencia. con el siguiente criterio:  Si los animales son vacunados se usará generalmente una dilución entre 1/4 y 1/32 o más. Simultáneamente se realiza la dilución del virus de manera de obtener un inóculo con las dosis infectantes deseadas con el que se enfrentarán los sueros.5 se puede realizar de diversas formas.5 TCID50/ ml. en este caso es 10-4. En esta técnica debe incluirse siempre la titulación del virus en la misma prueba. Ejemplo de análisis de resultados: Dilución del suero Log.16 equivale a 10–0. Generalmente para esta prueba se utilizan 1000 dosis infectantes/ml. o en freezers ultrafríos a -80ºC).

entonces.IH) se realizan en microplacas de 96 hoyos con fondo en U o V. que evalúa la capacidad de un suero de bloquear el efecto hemaglutinante del virus se conoce como Inhibición de la Hemoaglutinación (IH). por lo tanto  IS = 0. Esta característica viral nos permite identificar y clasificar virus hemaglutinantes. Las proteínas virales responsables de esta propiedad se conocen como “hemaglutininas”.  La dilución con un porcentaje de no infectados superior al 50% es 1/16 (log 16 es 1. en el control de GR).2 es 0.35 es 22. así como evaluar la capacidad de un suero de inhibir esta hemaglutinación. aislados a partir de individuos infectados y propagados en huevos embrionarios o cultivos celulares. Como diluyente de los Ag y GR se utiliza solución salina buffereada (PBS) con 0. Inhibición de la Hemoaglutinación Introducción: Hemoaglutinación La capacidad de aglutinar glóbulos rojos de ciertas especies animales (Hemoaglutinación o HA) fue descripta para los virus de las familias Paramixoviridae. que 1/22.Agregar 50 μl de la suspensión de eritrocitos al 0. Podemos decir.Utilizando una micropipeta de 50 μl. de la dilución que presenta un porcentaje de no infectados superior al 50%. permitiendo la unión de varios eritrocitos adyacentes a una unidad de hemaglutinina. . En este caso se calcula el porcentaje de animales vivos o no infectados ya que se desea conocer el poder de protección del suero.“DP x log.3). los glóbulos rojos (GR) capaces de ser aglutinados se colocan a una concentración final de 0. efectuar diluciones seriadas en base 2 del Ag (de 1:2 a 1:2048). agitar levemente para mezclar los reactivos. PROTOCOLO DE TITULACIÓN VIRAL POR HA: . Hemoaglutinación negativa: se observa la formación de un botón de hematíes de borde liso. se puede titular virus por su efecto hemaglutinante. Esta interacción entre los viriones y los hematíes resulta en la producción de un cuerpo compacto. ocasionado por la sedimentación de los GR (Ej.5 o 1% a cada hoyo.  El antilogaritmo de 1. La HA se produce cuando la proporción entre la hemaglutinina viral y los eritrocitos es óptima. del factor de dilución” se suma al log.Cubrir la microplaca e incubar a 4 ºC durante 16 hs.4 es la dilución del suero que protege al 50% de los animales.2)  El factor de dilución es 2 (log. La HA se lleva a cabo utilizando diluciones del virus en base 2 a partir de la dilución 1:2. La técnica. . Lectura: Con la ayuda de un espejo se observa el fondo de cada pocillo. .1% de seroalbúmina bovina (BSA). con el fin de obtener el Índice de Seroneutralización.3 log (una dilución) por encima o por debajo del mismo. dejando el último hoyo de la fila sin Ag para que sirva como control de eritrocitos. 104 . Además. Ortomixoviridae y Parvoviridae. Estas son proteínas de superficie de los viriones que se unen con receptores de la membrana de los hematíes que poseen ácido acetil neuramínico en su composición.Agregar 50 μl de virus puro (obtenido del cultivo en huevos embrionados o en cultivos celulares) en el primer pozo de la fila A. . . Primero se realiza la lectura de los hoyos control.2 = 1.5 x 0.Leer una vez que esté bien delimitado un “botón” en el fondo de cada pozo control de eritrocitos. Ambas pruebas (HA .35.4.Colocar 50 μl de diluyente para el virus en cada uno de los 12 hoyos de la fila A de la microplaca.5% o 1%. La prueba será considerada como válida si el título de virus obtenido es el mismo que el título previo con un margen de error de 0.3 + 1.

Virus A B C D E F G H Ejemplo de titulación de virus por hemoaglutinación Hemoaglutinación positiva: se observa la formación de un halo de hematíes de mayor diámetro. 1/10240).. Por lo tanto. Hay que tener en cuenta que los resultados pueden verse afectados por la presencia en los sueros de inhibidores inespecíficos (por ej. Se considera que en esta dilución existe una (1) unidad hemoaglutinante (UHA). Por cada suero se utilizan dos hileras. De esta manera se obtiene una diluc ión seriada (en base 2) del suero y un volumen homogéneo de 25 μl. algunos autores sugieren el tratamiento previo de los sueros con Kaolín o glóbulos rojos para eliminar estas aglutininas. Descartar los 25 μl excedentes del hoyo 11.H. PROTOCOLO DE TITULACIÓN DE ANTICUERPOS POR I.. b) Colocar 25 μl de cada suero en el primer pocillo de cada dos hileras. color claro y borde irregular.H). enzimas) y hemaglutininas naturales. Los títulos obtenidos figuran a la derecha de la placa. 1/2048 105 . ocasionado por la aglutinación de los GR por acción del virus. En la siguiente figura se esquematiza la titulación por Hemoaglutinación de ocho muestras de virus (filas A . descripta originalmente por Hirst (1942) y modificada posteriormente por Salh (1944) nos permite detectar y cuantificar anticuerpos (Ac) que poseen la propiedad de bloquear la actividad hemaglutinante de ciertos virus. uniéndose a las hemaglutininas virales e impidiendo de este modo su unión con los receptores eritrocitarios.: a) Distribuir 25 μl de solución PBS 1X en los hoyos 1 a 11 de las filas que vayan a utilizarse de una placa de microtitulación (utilizar placas con pocillos de fondo en V o en U) y 50 μl a los hoyos 12 de las mismas hileras. 1/20.. esta técnica nos permite identificar en un suero problema el nivel de anticuerpos capaces de inhibir la hemoaglutinación. La técnica de IH. 1/40. por lo que es necesario evaluar simultáneamente la capacidad hemaglutinante del suero. Debe considerarse que dichos tratamientos resultan en detrimento de la detección de bajos niveles de anticuerpos. Interpretación de la Titulación: El punto final de la titulación será la dilución más alta del virus en la que se observe 100% de HA. Cuando el nivel de hemaglutininas de los sueros es muy alto. c) Utilizar una micropipeta para hacer diluciones 1:2 del suero en toda la placa (en general se comienza con una dilución final de 1/10 para el primer hoyo (Nº 1) y se continúa diluyendo en base 2 hasta el hoyo correspondiente a la columna 11 (1/10.

el suero en estudio se incuba con una suspensión estandarizada de Brucella abortus y una cantidad conocida y estandarizada de complemento (medida en unidades CH50). el hoyo 12 de cada hilera contiene glóbulos rojos y el diluyente del virus (PBS). sólo suero y glóbulos rojos y nos permite realizar un control sobre la capacidad hemaglutinante del suero per se.d) Agregar 25 μl de antígeno (virus) que contenga 4 a 8 unidades hemoaglutinantes. la que mediante un sistema indicador permite determinar la fijación del C a cualquier complejo antígeno-anticuerpo. La lectura se efectuará inclinando las placas y observando la presencia o ausencia de un botón bien definido similar al de los hoyos de control. (Figura 1) 106 . f) Añadir 50 μl de suspensión de hematíes al 1% o al 0. Por su parte. Agregar 25 μl de PBS en los hoyos 1 a 11 de la segunda hilera correspondiente a cada suero (para completar el volumen a 50 μl). en los hoyos 1 a 11 de la primera hilera correspondiente a cada suero. La segunda hilera de cada suero no contiene virus. como control para descartar una posible hemoaglutinación inespecífica.5% a todos los hoyos utilizados. En un paso posterior se agrega el sistema hemolítico. Esta técnica es muy empleada para la identificación cuantitativa de anticuerpos contra un antígeno en particular y es la técnica de referencia para muchas enfermedades infecciosas. en el diagnóstico de brucelosis mediante este método. j) En todas las pruebas deberá incluirse una titulación simultánea del virus para confirmar la presencia de las unidades de hemoaglutinación requeridas Técnica de Fijación de Complemento Las características del sistema de complemento han permitido idear una reacción serológica denominada “Fijación de Complemento”. e) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos. i) El título de Inhibición de la Hemoaglutinación será la mayor dilución del suero que produzca una inhibición completa de 4 u 8 unidades hemaglutinantes de virus. h) Leer las placas cuando se hayan sedimentado los hematíes de control (columna 12). que consiste en una suspensión de complejos antígeno-anticuerpo formados por glóbulos rojos de carnero y anticuerpos con especificidad por estos hematíes (hemolisina). Por ejemplo. Como sistema revelador se emplea el denominado “sistema hemolítico”. esté el antígeno en solución o en suspensión. g) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubarla a 4°C durante 16 hs.

no se forman complejos antígeno-anticuerpo que activen el C. Por lo tanto. el C se fija a las membranas de los glóbulos rojos sensibilizados y produce su lisis (figura 2 B). éstos se fijan a la bacteria (figura 3 A) y activan el complemento por la vía clásica. 107 . Figura 2 A Figura 2 B C’ GR C’ Ag Ag Si la muestra en estudio contiene anticuerpos específicos contra Brucella abortus. al agregar el sistema hemolítico. Cuando en un paso posterior se agrega el sistema hemolítico. ya no hay complemento disponible y los glóbulos rojos permanecen intactos (figura 3 B).Figura 1 Componentes de la reacción Ag Suspensión de antígeno Suero problema C’ GR Sistema hemolítico Complemento Si la muestra no posee anticuerpos específicos contra Brucella abortus (figura 2 A). que produce su lisis.

 El antígeno consiste en una suspensión de Brucella abortus cepa 19. libres de hematíes. 108 . El título se determina como la máxima dilución de suero que produce la hemólisis del 50% de los glóbulos rojos del sistema hemolítico. La ausencia de hemólisis indica la formación de complejos antígeno-anticuerpo debido a la presencia del antígeno en la muestra. a una concentración standard de 0.00018% v/v. Para la prueba diagnóstica se emplean 5 unidades CH50.  La hemolisina es un suero de conejo hiperinmune contra hematíes de oveja y se utiliza a la concentración que produce como resultado en ese sistema 12 unidades CH50. e inversamente.  Como fuente de complemento (C) se utiliza suero normal de cobayo. En estos casos se emplean sueros específicos conocidos y a concentración fija y diluciones de la muestra en estudio (en la cual se sospecha la presencia de un antígeno). Posteriormente se lavan por centrifugación y reemplazo del suero por una solución buffer. Se realizan diluciones del suero en base 2 que se incuban con cantidades fijas y conocidas del resto de los reactantes. Se utilizan en una suspensión al 6% v/v.  Los hematíes de oveja se obtienen por punción de la vena yugular en condiciones de asepsia y con anticoagulante.Figura 3 A Figura 3 B GR C’ Ag Ag El consumo de C por los complejos inmunes se manifiesta indirectamente por la ausencia de hemólisis al agregar el sistema hemolítico. Este método también se emplea para identificar. No es de práctica rutinaria. deben ser inactivadas a 56°C durante 30 minutos para desnaturalizar los factores del complemento del suero y evitar que interfieran en la prueba. la observación de hemólisis indica que la muestra carece de antígeno. La Fijación de Complemento es una técnica muy laboriosa y que depende de parámetros muy estrictos en lo que refiere a la estandarización y titulación de los reactantes. inactivada. Su aplicación esta limitada a los laboratrios de referncia nacionales e internacinales y reutiliza generalmente para confirmar la positividad de otras tecnicas. La hemoglobina presente en el sobrenadante se lee en unidades de densidad óptica en un espectrofotómetro a 542 nm de longitud de onda. El C no “fijado” indica la ausencia de reacción antígeno-anticuerpo durante la primera etapa de la prueba y se mide en unidades CH50 . tipificar y/o semicuantificar antígenos. Éste se conserva congelado y debe titularse cada vez que se usa. Para llevar a cabo esta prueba deben tenerse una serie de consideraciones:  Las muestras de suero. Para medir la hemólisis se centrifugan los tubos (para que sedimenten los glóbulos rojos que no se hemolizaron). aunque como se mencionó es la prueba de referencia para el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas.

Clinical Immunology of the Dog and the Cat. 976 pp. Por lo tanto. leche y sangre entera. Dicha radiación atraviesa un polarizador de cristal líquido que deja pasar solo un rayo de luz polarizada plana azul (481-489 nm). Para realizar este ensayo se requiere de la emisión de una luz (onda electromagnética) (a partir de una lámpara de tungsteno) cuyo campo eléctrico oscila en todas las direcciones espaciales al azar y con distintas longitudes de onda. 109 . manteniéndose la polarización. su velocidad de rotación disminuye y permite que la emisión de luz verde se detecte en el mismo plano de polarización que la radiación recibida.) en muestras de suero. se pierde el grado o valor de polarización. Técnica de polarización Fluorescente (FPA) Este ensayo ha mostrado tener buena utilidad en la detección de ciertas enfermedades infecciosas. La velocidad de rotación depende del tamaño y es inversamente proporcional. lo eleva a un estado de excitación.Bibliografía  Margni. Fundamento: Todas las moléculas en solución rotan al azar. Al incidir la luz polarizada plana sobre el trazador (fluorocromo ligado al antígeno). se detecta un valor alto de polarización. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. tras el cual dicho trazador vuelve al estado de equilibrio emitiendo un haz de luz verde (525-550 nm) que es captado y analizado por el equipo. 1996. De esta manera. antígenos) a grandes moléculas (anticuerpos) cuando la muestra es incidida con un haz de luz polarizada. R.. 1999. MJ. si dicho trazador está unido solo al antígeno (de pequeño tamaño) la rotación es rápida y la luz verde emitida se ubicará en otro plano distinto al de la luz polarizada. También está descripto su uso para la identificación de antígenos como proteínas o péptidos de Mycobacterium bovis y virus de la Anemia Infecciosa Equina. Ed.A. En el caso de que el antígeno marcado estuviese unido a una molécula de anticuerpo de gran tamaño. Salmonera sp.  Day. por lo tanto las moléculas pequeñas rotan a mayor velocidad que las moléculas grandes. Esta técnica detecta la unión de pequeñas moléculas marcadas con fluoresceína (por Ej. Por lo contrario. Interamericana. Es utilizada para identificar anticuerpos frente al Ag O-polisacárido de bacterias gram negativas (Brucella sp. Iowa State University Press.

produciendo una diferencia entre plano de polarización que la excita (plano de excitación) y el plano de polarización que emite (plano de emisión). Salmonella sp.: Brucella sp. rota a una determinada velocidad. mP = ( Iv – (Ih x G) / (Ih x G) x 1000 Iv = intensidad vertical de la luz Ih = intensidad horizontal de la luz G = Factor de polarización Ejemplos de los antígenos más utilizados: El polisacárido O-: Extraído a partir del LPS de cepas lisas de bacterias gram negativas. Cálculo de las unidades de mp de cada muestra. Estos antígenos son específicos para cada serotipo y se obtiene a partir de la purificación del LPS. (Luz verde) Anticuerpo Durante el tiempo que la molécula conjugada con fluoresceína permanece excitada. ésta diferencia se cuantifica y se determina utilizando una fórmula. Ej.Luz tungsteno Polarizador Emisión del haz de luz Luz azul en un único plano polarizada Suero positivo Dirección del haz de luz azul polarizada incidente Suero negativo Dirección del haz de luz azul polarizada incidente Dirección del haz de luz verde emitida Dirección del haz de luz verde emitida Antígeno marcado con fluorescencia. Expresión de los resultados: unidades de milipolarización (mP) del suero frente al antígeno. 110 .

2) Leer el blanco 3) Agregar 10 µl de antígeno marcado 4) Incubar no menos de 2 minutos 5) Realizar la lectura de las muestras ya sea en tubos o en multiplacas. Puede leer hasta 1500 muestras por hora. Metodología Protocolo FPA 1) Agregar 10µl de la muestra (generalmente suero del animal a evaluar) a 1 ml de buffer. Equipamiento * El SENTRY (Diachemic corporation) es un instrumento computabilizado para determinar las unidades de milipolarización (mP) del suero problema. * El POLARION (Tecan) También es un lector de polarización pero adaptado para la lectura de microplacas de 96. Es transportable al campo y puede funcionar una hora sin fuente externa de energía. Este aparato lee una muestra por vez en tubos de 10mm x 75mm. Presenta una ranura para el acoplamiento del tubo de ensayo. para que no interfiera su tamaño en una menor rotación del antígeno-trazador libre. las muestras con lecturas de 10 mP mayores al control negativo son consideradas positivas 111 . 6) Como dato orientativo.Estructura de LPS Péptidos: Sólo puede utilizarse péptidos de bajo peso molecular (que no superen los 20 kDa).

La lisis de la célula blanco (o célula diana) es la consecuencia de la reacción citotóxica. Cuando se encara el análisis de un fenómeno de este tipo es necesario contar.Esquema de la técnica. en primer lugar. Ventajas: Es fácil de realizar y los resultados se obtienen rápidamente. con un método apropiado para evaluar la muerte de la célula blanco. Es una técnica de alta sensibilidad y especificidad. capacidad de eliminar células alteradas por procesos tumorales. Varios tipos celulares.contacto estrecho entre la célula efectora y la célula blanco. Permite el procesamiento de varias muestras a la vez. no interfieren en la lectura de las muestras Citotoxicidad Introducción La citotoxicidad es un mecanismo efector de las células del sistema inmune que permite eliminar células infectadas o alteradas del organismo o células de microorganismos u organismos invasores. Implica solamente 2 pasos. 112 . receptores y mecanismos están involucrados en este mecanismo. etc. sueros lipémicos y yemas de huevo o soluciones coloreadas como sueros hemolizados o sangre entera.viabilidad de las células efectoras 2. Utiliza como ejemplo el Ag O de Brucella sp. Su evaluación permite conocer el nivel de protección frente a enfermedades infecciosas de origen viral. Suspensiones turbias tales como leche. Hay dos condiciones indispensables para que cualquier mecanismo citotóxico mediado por células se lleve a cabo: 1.

en:  Mecanismos de citotoxicidad específicos: Si es necesaria la sensibilización previa del animal del cual provienen las células blanco (por ejemplo. en el rechazo de los transplantes y de ciertos tumores. ya que estos colorantes tienen la particularidad de teñir únicamente a las células muertas. Tienen participación. en el rechazo de transplantes. los receptores para Fc (FcR) presentes en la membrana de las células efectoras intervinientes son los receptores para el Fc de la IgG (FcR). ciertos 113 .  Mecanismos de citotoxicidad específicos Linfocitos T: Los mecanismos citotóxicos mediados por linfocitos T son de gran importancia para la defensa del individuo contra las infecciones causadas por virus y contra parásitos intracelulares. parásitos y células infectadas por virus. en procesos de destrucción de bacterias. luego de su contacto con la célula efectora.  No deben liberarse al medio espontáneamente. no deben ser reutilizables en forma significativa por las células restantes. citotoxicidad por LT o ADCC). En la mayor parte de los casos. Las sustancias radiactivas deben cumplir ciertos requisitos para ser utilizadas:  Deben incorporarse a las células blanco en cantidades compatibles con los sistemas de microrreacciones. Para el caso de bacterias o parásitos que no incorporan 51Cr o que lo liberan en forma espontánea. se usan bases nitrogenadas radiactivas. además.  Su liberación al medio debe tener correlación directa con el efecto lítico producido  Una vez liberadas al sobrenadante. a través de receptores para el fragmento Fc de la Ig. medir su capacidad para liberar un determinado producto de secreción. citotoxicidad por células NK o por complemento). La función de CCDA está comprometida en procesos de inmunidad contra tumores. Por ejemplo. El agente radiactivo más utilizado es el Na251CrO4 (dicromato de sodio) que tiene la ventaja adicional de poner de manifiesto rápidamente el efecto citotóxico. En cambio.  Mecanismos de citotoxicidad innatos: Si funcionan sin necesidad de sensibilización previa (por ejemplo. Asimismo. si la célula blanco es una célula tumoral o normal. por consiguiente. La reacción citotóxica se inicia con el reconocimiento de los anticuerpos que recubren a la célula blanco por parte de la célula efectora. La destrucción de estas células permite que la sustancia radiactiva se libere al medio y pueda ser cuantificada fácilmente.Por ejemplo. como por ejemplo la 3H-Timidina (timidina tritiada) que se incorpora a los ácidos nucleicos o la 35S-Metionina que se incorpora a las proteínas. Sin embargo. Mecanismos de Citotoxicidad Los mecanismos de citotoxicidad pueden clasificarse de acuerdo a los requerimientos del sistema. el anticuerpo que participa en la CCDA es de la clase IgG y. El método más difundido para el estudio de los mecanismos citotóxicos es el de la incorporación de sustancias radiactivas a las células blanco. si se trata de una célula secretora. Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (CCDA o ADCC): Algunas células pueden ejercer citotoxicidad cuando se unen con un anticuerpo ya ligado al antígeno sobre la célula blanco a través de los receptores para Fc (CD16). es posible recurrir a alguna característica metabólica particular que pueda asociarse con la viabilidad de la célula blanco utilizada en la reacción. Este proceso se denomina citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. es posible observar microscópicamente su destrucción o la inhibición de su capacidad para proliferar en medios de cultivo adecuados. pueden utilizarse colorantes vitales como naranja de acridina o azul tripán (trypan blue) para poner en evidencia la lisis. si se trata de una bacteria o un parásito.

a diferencia de los detallados anteriormente. El primer paso de una determinación de citotoxicidad comprende la obtención de los linfocitos T citotóxicos específicos. aunque aún no están bien definidas. tendientes a reemplazar el material radiactivo y aumentar la sensibilidad. se cocultivan las células mononucleares obtenidas de sangre periférica con el antígeno en forma soluble o con células irradiadas que expresan el antígeno de interés. Éstas son capaces de lisar una gran variedad de células tumorales. Para que se lleve a cabo no es necesaria sensibilización previa de las células efectoras.linfocitos con FcR para IgA (FcR) y los polimorfonucleares neutrófilos. Citotoxicidad celular inducida por IL-2 Se ha demostrado que el tratamiento in vitro de linfocitos periféricos con IL-2 (ex vivo). en los últimos años se han desarrollado métodos colorimétricos. Este último sistema tiene relevancia en la inmunidad contra parásitos. los monocitos y los polimorfonucleares eosinófilos que expresan FcR para IgE (FcR) inducen la destrucción de células recubiertas con IgE. generalmente es necesario estimular a las células efectoras in vitro con el antígeno específico. . son capaces de mediar CCDA contra células blanco sensibilizadas con IgA. 114 . Para ello. Este fenómeno citotóxico. no está producido por la acción de células efectoras sino por la activación del complemento. Además. La activación de células ex vivo de pacientes oncológicos ha sido una de las propuestas terapéuticas ensayadas en humanos. incluso muchas que no son sensibles a células NK.Centrifugar la suspensión celular y resuspender el precipitado en dicromato de sodio marcado. Marcación de la célula blanco con dicromato de sodio (51Cr): Las células deberán encontrarse en fase logarítmica de crecimiento. La radiactividad liberada es directamente proporcional a la lisis celular producto de la citotoxicidad. induce una actividad citolítica sobre un grupo de células denominadas células LAK (por la sigla en inglés de células “Killer” activadas por linfoquinas). Si bien la liberación de 51Cr es un procedimiento ampliamente utilizado para detectar citotoxicidad. Evaluación de la funcionalidad celular por medio de reacciones de citotoxicidad mediadas por LT citotóxicos. Los linfocitos T citotóxicos se cosechan después de 5 a 7 días de cultivo. a menos que el individuo se encuentre en el período de actividad de una infección viral. Cuando se requiere medir la reactividad de los linfocitos T citotóxicos. se conoce como citotoxicidad natural killer o actividad NK. descrito alrededor del año 1970. Metodología: 1. fluorímetricos y más recientemente por quimioluminiscencia. durante 4 hs de incubación. La actividad NK no se ve influida por la exposición previa al antígeno por parte del individuo del cual provienen estas células. Éstos pueden encontrarse pre-estimulados en el huésped y deben ser expandidos in vitro. Los linfocitos T citotóxicos no pueden ser detectados habitualmente en sangre periférica sin una estimulación previa para ampliar el número de células activas por medio de la expansión clonal. Mecanismos de citotoxicidad innatos Células NK: El sistema inmune presenta poblaciones linfocitarias que tienen la capacidad innata de lisar cierto tipo de células tumorales y células infectadas por virus. La técnica más frecuentemente empleada para determinar citotoxicidad utiliza la liberación de 51 Cr debida a la lisis de la célula blanco. Se cree que estas células pertenecen al linaje de las NK. además de favorecer la citotoxicidad T y NK. Las células efectoras son puestas en contacto con las células blanco marcadas radiactivamente con 51Cr. Citotoxicidad generada por complemento: Este mecanismo.

Recoger el sobrenadante para la posterior medición de radiactividad en contador de centelleo. A continuación se describe un método para medir actividad efectora de CCDA en células mononucleares de sangre periférica. Frecuentemente se utiliza el 30% o el 50%. CTAC. células efectoras y células blanco (no olvidar los controles). se utiliza como células blanco una línea celular denominada K562 que son células tumorales humanas. empleando células blanco marcadas con 51Cr.  Medición de liberación espontánea (cpm espontáneas): En los cultivos de células blanco (sin células efectoras). que provienen de un linfoma murino inducido por el virus Moloney.   Cálculo del porcentaje de lisis específica: (cpm experimentales – cpm espontáneas) Lisis específica = (cpm máximas .. Para ello se grafica el porcentaje de lisis en función de la relación células efectoras: células blanco. Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de células blanco y células efectoras (por ej. la metodología utilizada es similar a la descripta para linfocitos T citotóxicos. Pruebas para determinar citotoxicidad de células Natural Killer (NK) La actividad NK se mide generalmente en ensayos de liberación de 51Cr.Lavar con medio de cultivo y resuspender las células marcadas a la concentración deseada. . En todos los casos. Reacción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo Clínicamente.cpm espontáneas) Las cpm espontáneas no deben superar el 20% de las cpm máximas para que la prueba sea válida. X 100 115 . .Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las células e incubar a 37ºC por 4 hs en estufa gaseada con CO2 al 5%. Cuando se realiza la evaluación en un sistema murino. 1:50). se mide la liberación espontánea del 51 Cr fijado durante la marcación. por ejemplo. La CCDA se utiliza para estudiar sueros de los pacientes que recibirán un trasplante o que padecen una infección viral.Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos. . Para evaluar la actividad NK en perros se utiliza una línea celular de adenocarcinoma canino. células tumorales o virus. Otra aplicación importante de la CCDA es la evaluación de anticuerpos contra aloantígenos. en pacientes con cáncer en tratamiento inmunológico. . generalmente se utilizan como células blanco las células de la línea Yac 1. Medición de la actividad citotóxica por medio de un ensayo de liberación de 51Cr: La relación entre células blanco y células efectoras es un factor importante a tener en cuenta. el ensayo de CCDA es útil en la evaluación funcional de células efectoras inmunocompetentes. En algunas ocasiones es conveniente expresar los resultados como unidades líticas (UL).  Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas): A los co-cultivos de células efectoras + células blanco se agrega un detergente (Tritón X-100) que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación total del 51Cr fijado durante la marcación.Incubar 60 min a 37ºC con agitación suave. utilizando una metodología similar a la utilizada para linfocitos T citotóxicos. correspondientes a un determinado porcentaje de lisis. Si la evaluación se realiza en seres humanos. Como fuente de células efectoras se utiliza una suspensión celular de bazo. 2.

3. Vet Immunol Immunopathol. Fainboim. Primary cytotoxic response of bovine peripheral blood leukocytes to parainfluenza Type 3 virus infection. Jennifer. Failing K. se mide la liberación espontánea del 51Cr fijado durante la marcación.Se agrega dicromato de sodio marcado (51Cr) y se incuba a 37ºC por 30 min. 45: 85-95 2. . Ed. L. R. ML. 57: 548-552 5.A. Cálculo del porcentaje de lisis específica: (cpm experimentales – cpm espontáneas) Lisis específica = (cpm máximas . Gondolf C. que se analiza en un contador de centelleo líquido. 387 pp. El porcentaje de CCDA se calcula restando al porcentaje de lisis específica de las células recubiertas con anticuerpos.C. se hacen diluciones seriadas (1:2. Foster.Luego de la incubación. 1995. 4. Adair. marcadas con 51Cr. Burkhardt E. 1:4. con los correspondientes controles. Stitz L. Bibliografía 1.M.Se prepara una suspensión de células efectoras. Medición de la actividad de CCDA por un ensayo de liberación de 51Cr: .Se lavan las células tres veces con medio de cultivo.Metodología: 1. Journal of Leukocyte Biology. Este antisuero ha sido previamente calentando a 56ºC por una hora. el porcentaje de lisis encontrado para las células blanco sin recubrir. 1996 Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos.Se centrifugan las placas para aumentar el contacto entre las células y se incuban a 37ºC por 4 a 18 hs. X 100 116 . J. en estufa gaseada con CO2 al 5%. E. 1996 Dec. 55(1-3):11-22. . Medición de liberación espontánea (cpm espontáneas): A los cultivos de células blanco recubiertas con anticuerpos y células blanco sin recubrir con anticuerpos (ambos sin células efectoras). . Margni. Interamericana. 976 pp. Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas): A los co-cultivos de células efectoras + células blanco recubiertas con anticuerpos y células efectoras + células blanco sin recubrir con anticuerpos. A. A la otra alícuota se la toma como control sin suero. procedimiento que inactiva los factores del complemento.R.cpm espontáneas) El porcentaje de lisis específica debe calcularse para las células blanco recubiertas por anticuerpos y paralelamente para las células no recubiertas por anticuerpos. Functional significance of two cytotoxic T lymphocites. . . J. A new colorimetric method for measuring cellmediated cytotoxicity in dogs. los cultivos se vuelven a centrifugar a mayor velocidad y se levanta el sobrenadante.Se lavan las células tres veces con medio de cultivo para retirar el cromo radiactivo no incorporado.A una de las alícuotas se le agrega el antisuero. se agrega un detergente (Tritón X-100) que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación de 51Cr. 1995.Se agregan células blanco incubadas con y sin anticuerpos. 1:8) y se siembran en una placa de 96 pocillos. 2. Bamford. Introducción a la Inmunología Humana. . Sensibilización y marcación de las células blanco: .I. Podack. Antes del último lavado se dividen en dos alícuotas iguales. Las cpm determinadas en el sobrenadante corresponden al radiactivo liberado por la ruptura celular.. 1999. Satz. B. Veterinary Iºmmunology and Immunopathology.

Una menor turbidez en el tubo del neonato indica falla en la transferencia pasiva de anticuerpos. Pruebas semicuantitativas a) Prueba de látex o aglutinación pasiva Es una técnica confiable y rápida. hubo (o no) ingestión de calostro y absorción de inmunoglobulinas. especies en las cuales el tipo de placentación que poseen (placentación completa). La desventaja es el tiempo de lectura. o si fuera necesario. Existen diferentes métodos que nos permiten al veterinario detectar si en cada ternero o potrillo. Permite conocer la concentración de Igs y a la vez reconocer clases y subclases de Igs. Las Igs del recién nacido se pueden cuantificar mediante la lectura en espectrofotómetro a 620nm. Por lo tanto. cuando se completa la parte esencial de la absorción de anticuerpos. si éste tiene IgG calostrales. Estos valores son válidos para bovinos y equinos. el consumo de calostro durante las primeras horas de nacido favorece la sobrevida del neonato. d) ELISA Esta es una técnica de interacción primaria. (Ver capítulo correspondiente en esta guía). elegir un método de suplementación adecuado (suero) que le permita adquirir anticuerpos. El resultado puede evaluarse a simple vista (cualitativamente) comparando la turbidez existente en el tubo de ensayo que contiene el suero del neonato con el tubo que contiene el suero de su madre. c) Electroforesis La electroforesis clásica de proteínas séricas sobre cellogel (tiras de acetato de celulosa) es una técnica rápida y relativamente sencilla. entonces. de 18 a 24 horas (Ver capítulo sobre técnicas de interacción secundaria en esta guía). 117 . Es un procedimiento rápido y económico. Las partículas de látex se cubren con anticuerpos anti– IgG de la especie en estudio. ya que sólo utiliza una solución de sulfato de zinc que se mezcla con el suero del animal. Es fundamental. impide la transferencia de Acs a través de esta vía. El éxito de la transferencia pasiva no puede evaluarse sino hasta las 18 horas después del nacimiento. asegurar al neonato la ingesta de calostro de buena calidad y en cantidad suficiente. Las pruebas de laboratorio que se utilizan miden proteínas en el suero del neonato y pueden clasificarse en:  Pruebas cuantitativas  Pruebas semicuantitativas  Pruebas cualitativas Pruebas cuantitativas a) Inmunodifusión radial o técnica de Mancini Es la técnica de referencia. En los dos últimos casos nos encontramos con neonatos hipogammaglobulinémicos.Técnicas para la detección de anticuerpos maternales Una adecuada protección contra enfermedades infecciosas que pueden comprometer la vida del neonato depende de la presencia de al menos 400–800 mg/dl de Igs transferidas pasivamente. altamente sensible y específica. que permite la posterior cuantificación de las proteínas por densitometría (Ver capítulo correspondiente en esta guía). Valores de 200 a 400 mg/dl indican falla parcial en la transferencia pasiva y menores a 200 mg/dl son indicativos de falla total en la transferencia pasiva de la inmunidad materna. b) Prueba de sulfato de zinc La técnica se basa en la capacidad de los iones pesados de dicha sal de unirse al Fc de las Igs y hacerlas precipitar. previa realización de una curva de calibración con sueros patrones de concentraciones conocidas. Al mezclarse con el suero problema.

si aglutina en 2 minutos. b) Prueba de sulfito de sodio Es una técnica similar a la prueba de precipitación con sulfato de zinc. cuanto más rápido aparece la aglutinación. la ausencia (-) o la ligera turbidez (+/-). Concentración de Igs (mg/ml) 0a1 Menos de 5 4a5 6 a 12 12 a 18 Más de 15 Solución de sulfito de sodio 14% +/+ 16% +/+ + + 18% + + + + + c) Refractometría Utiliza un refractómetro que permite medir el índice de refracción de la luz al incidir sobre una gota de suero. mediante una tabla de valores ya estipulado. La presencia (+). Cada suero es probado con 3 soluciones con concentraciones del 14.4 5. son los parámetros para estimar el rango de concentración de Igs en el suero. mayor es la concentración de Igs en el suero. Braun y Tennat relacionaron el nivel de gammaglobulinas en suero con la concentración de proteínas totales determinadas por refractometría. Es una técnica confiable en bovinos. Las soluciones de concentración inferior a 14% no producen turbidez alguna y las concentraciones superiores a 18% pierden sensibilidad. teniendo en cuenta que éstas constituyen del 18 al 22% de las proteínas totales y que del 90 al 97% de las gammaglobulinas plasmáticas corresponden a las Igs. Las técnicas de dosaje de proteínas son de uso más común en el laboratorio de diagnóstico clínico son: 118 . 16 y 18% de reactivo. Esto le permitió clasificar el riesgo del recién nacido. El tiempo que tarda en producirse la aglutinación es indicativo del estado de protección. ya que la concentración de Igs es proporcional al tiempo de lectura. La presencia.9 5 a 5. A modo de ejemplo. Esta prueba se efectúa en 10 minutos aproximadamente.9 Nivel de inmunidad alto riesgo riesgo medio bajo riesgo d) Dosaje de proteínas totales En forma indirecta pueden ofrecernos datos de valor sobre el nivel de gammaglobulinas totales. ausencia o ligera turbidez producida por el sulfito de sodio que precipita las Igs se determina a ojo desnudo. Concentración de Proteínas totales (g/dl) Menos de 4. indica buen estado de protección.los anticuerpos anti-IgG adheridas a las partículas de látex se unen a las IgGs del suero y determinan que las partículas de látex aglutinen.5 a 6.

5 ml de suero y agregar una gota de reactivo. N. Calostro: Rol en la crianza de terneros.31(3):358-65. basándose en la coagulación de las gammaglobulinas por el agregado de glutaraldehído (no permite cuantificar las Igs). Lunn DP. Harland R.- Técnica de Biuret Técnica de Lowry Técnica de Bradford Pruebas cualitativas a) Prueba del glutaraldehído Esta prueba determina si hubo o no falla en la transferencia pasiva. Belknap EB. Gabriela Catalani. McGuirk SM. La reacción es positiva cuando se forma un ”gel sólido” (coágulo) luego de la adición del reactivo. Interamericana. ya que la hemólisis puede conducir a resultados falsos. A. 7. Tsunemitsu H Enhancement of passive immunity with maternal vaccine against newborn calf diarrhea. Ing. J Vet Med Sci 1997 Nov. Babiuk LA Maternal immunization of pregnant cattle with recombinant VP8* protein of bovine rotavirus elicits neutralizing antibodies to multiple serotypes. 5. Sra Ana Mate. Veterinaria Argentina. El tiempo se toma desde la adición del reactivo (minuto o tiempo cero). Animal en alto riesgo. Kohara J. Gibbons E. Pág. Bibliografía 1. Margni.  La prueba debe realizarse a temperatura ambiente (20 – 25ºC). Tiempo de reacción Concentración aproximada de IgG (mg/dl) Mayor de 800 Interpretación Buena trasferencia calostral Valor normal. agitar y controlar la gelificación cada 10 minutos durante el término de una hora. Vol XII.L. Padola. al aumentar la reacción de coagulación. Estein. Argentina.Graw – Hill – 1995. 119 . Agosto 1995.Vet Immunol Immunopathol 1998 Mar 18. Falla total de trasferencia calostral. Bs. es decir. Entre 0 y 10 minutos Entre 10 y 60 minutos De 400 a 800 Mayor de 60 minutos Menor de 400 Se deben tener algunas precauciones para realizar esta prueba:  El suero utilizado no debe estar hemolisado. INTA – Castelar. 5º Edición. Vet Pathol 1994 May. Animal en riesgo potencial. Panamericana – 1996. La técnica consiste en colocar en un tubo de ensayo 0.. Inmunología e inmunoquímica. Lee J. Tizard.C.3.420 – 425. Yoo D. Collins JK. Detección de Inmunidad. M. Mori K. S. Hirai T. 4.412:405-11. 8. Aldridge BM. que el suero se haya gelificado. Effect of colostral ingestion on immunoglobulin-positive cells in calves. 6. R. Esto se visualiza inclinando el tubo unos 45º. I. Dr Guillermo Berra. Colostral neutralizing antibody by rotavirus VP8*. 4° Edición. verificando que el contenido no se vuelque. N° 116. Ishizaki H. 3. Falla parcial de trasferencia calostral. Elazhary Y.59(11):1023-5. Inmunología Veterinaria. Adv Exp Med Biol 1997.As. Fernandez. Schultheiss PC Experimental infection of neonatal calves with neurovirulent bovine herpesvirus type 1.M.S. 2. 62(1):51-64. Ayers VK.

J. Yaofeng Zhao. The neonatal Fc receptor (FcRn) is expressed in the bovine lung.Se efectúan dos perforaciones en el agar: una con un molde circular (sacabocado) y otra estrecha y longitudinal. 120 . Edwards S. para producir una banda o línea de precipitación.6). la mayoría de las proteínas se cargarán negativamente y migrarán hacia el ánodo (polo positivo). Durante el período de incubación. En este momento se extrae el agar sólo de la perforación circular. denominada capa de impregnación.4-8. Inmunoelectroforesis La técnica de inmunoelectroforesis combina la electroforesis y la inmunodifusión en gel de agar. Bradshaw BJ. Este efecto es producido porque el agar en un medio alcalino tiene carga negativa. Vet Immunol. sobre todo las que no tienen carga o poseen carga baja. Si se usa una solución amortiguadora alcalina. 10. 4.159. Una vez terminada la separación electroforética. Immunopathol. Gyózó Kaján.2 g de agar en 10 ml de solución amortiguadora). lo que hace que el agua se cargue positivamente y migre hacia el cátodo arrastrando las moléculas que se encuentran en solución. Con un hisopo embebido en esta solución. László V. Antibody isotype responses to experimental infection with bovine herpesvirus 1 in calves with colostrally derived antibody. Hammon. 11. Balázs Mayer. se cubre el portaobjetos tratando de formar una delgada capa y luego se deja secar. que poseen un punto isoeléctrico (PI) muy cercano al pH de la solución amortiguadora utilizada. 3.. los antígenos que fueron separados electroforéticamente y los anticuerpos del antisuero se desplazan en el gel de agar hasta encontrarse (al igual que en la inmunodifusión doble).6) Soluciones de antígenos y de anticuerpos a valorar Procedimiento 1. paralelo a la dirección de la migración electroforética. El primer paso es la separación de los componentes de la mezcla antigénica por electroforesis en gel de agar. Algunas moléculas como las gammaglobulinas. 5. Cada línea de precipitación representa la reacción de un antígeno con su respectivo anticuerpo. migran hacia el cátodo (polo negativo) debido al fenómeno conocido como movimiento electroendosmótico. La primera. Se deja gelificar a temperatura ambiente. 96 (2003) 229 – 233.Los portaobjetos (con la capa de agar de impregnación seca) se colocan en posición horizontal y sobre ellos se agregan 3 ml de una solución de agar al 1% caliente. Immunopathol. Frenyó.Se colocan dos capas de agar sobre un mismo portaobjeto. Livestock Production Science 66 (2000) 151. Imre Kacskovics. se coloca el antisuero en un canal cortado en el agar.W. Los portaobjetos con el agar perforado se colocan en la cuba y se establece contacto entre la placa de agar y la solución utilizando tiras de papel de filtro previamente humedecidas con la solución amortiguadora (uno de los extremos de la tira se apoya sobre el agar y el otro se sumerge en la solución amortiguadora). de gel ó 8 mAmp/portaobjeto durante 15 minutos para equilibrar el sistema.En el recipiente de la unidad de electroforesis (cuba). contiene una solución de agar al 2% (0.9.53(12):143-51. Zsuzsanna Kis. Blum. H. Vet Microbiol 1996 Nov. . Zhihui Zhao. 98 (2004) 85 – 89. Presence of the di-leucine motif in the cytoplasmic tail of the pig FcRn α chain. se coloca la cantidad necesaria de solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8.Se conecta la cuba a la fuente de poder y se ajusta la corriente a razón de 10 voltios/cm. 2. Vet Immunol. Materiales necesarios:Cuba de electroforesis Portaobjetos limpios y desengrasados Cámara húmeda Agar noble Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8. 12.

mayor es la concentración inicial del antígeno.Se desconecta el aparato.Cuando se observa que la muestra teñida ha migrado lo suficiente hacia el ánodo para una correcta separación. Así.  La inmunoelectroforesis puede ayudar a distinguir si un aumento en las gammaglobulinas es policlonal o monoclonal. es necesario llevar a cabo una inmunoelectroforesis para determinar la clase de cadena pesada y de cadena liviana de la inmunoglobulina. 121 . cuidando que la corriente sea correcta. la inmunoelectroforesis es útil para identificar las proteínas presentes en cantidades elevadas en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con diversas enfermedades nerviosas. 7. De esta manera se puede confirmar la naturaleza monoclonal de la proteína de Bence–Jones en el mieloma. Es una técnica cualitativa y semicuantitativa.  La disminución o ausencia de inmunoglobulinas que se observa en diversos trastornos o deficiencias inmunológicas. Las soluciones de antígeno se colocan en las perforaciones circulares de las placas de agar utilizando una pipeta Pasteur.  La inmunoelectroforesis permite la identificación de cadenas livianas en la orina de enfermos con discracias de células plasmáticas o trastornos autoinmunitarios. se desconecta el aparato y se retiran los portaobjetos de la cuba. (Ver capítulo sobre técnicas de interacción secundaria) Aplicaciones de la inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis permite separar e identificar antígenos o anticuerpos en una mezcla antigénica debido a su diferente movilidad electroforética. En el caso de la inmunoelectroforesis en placa de agar. a mayor intensidad.6.Se asegura que las tiras de papel de filtro estén bien colocadas y se conecta nuevamente el aparato. Se remueve el agar del canal para colocar el anticuerpo específico.Los portaobjetos se incuban en cámara húmeda durante 24 a 48 horas. Para una correcta interpretación de los resultados. por ejemplo:  La presencia de un aumento franco o de una espiga en la región gamma en una electroforesis sugiere fuertemente la presencia de una paraproteinemia monoclonal. los resultados de la electroforesis de zona y de la inmunoelectroforesis deberán ser combinados. Una de las muestras de antígeno deberá estar teñida con azul de bromofenol para indicar el desplazamiento (frente de corrida). la capa de agar puede teñirse de manera similar a la descripta para la técnica de inmunodifusión doble. mediante anticuerpos anti– kappa o anti–lambda específicos. observándose el resultado por medio de la tinción de las bandas de precipitación que se producen luego de la incubación con el antisuero. pueden ser analizados mediante esta técnica. En el diagnóstico de laboratorio de las paraproteinemias. longitud y cercanía de las bandas al lugar de siembra del anticuerpo.  Finalmente. No obstante. 9. Esto debe hacerse con rapidez para evitar la difusión excesiva del antígeno. pues se puede estimar la concentración de antígenos según sean las características de las bandas de precipitación respecto de la muestra testigo normal. 8.

Comparación de un proteinograma con una inmunoelectroforesis. 122 .

Morilla A. F) Se forman líneas de precipitación. 123 . C) Los componentes del suero son separados por electroforesis. y Bautista C. Inmunología e Inmunoquímica. Cada línea corresponde a un único componente del suero. Veterinarias. Año 2000. Margni R. Capítulo 18. R.F. octubre de 1972. Edición consultada: 5º edición septiembre de 1996. México D. V. E) El suero y el antisuero difunden a través del agar. 7° edición. : Editorial Médica Panamericana 1º edición. Se han excavado una ranura para el antisuero y un pozo para el antígeno. Editorial El Manual Moderno S. A. 3. de C. 2. Capítulo I. Fundamentos. septiembre de 1986. Bibliografía 1. Cs. Guía de trabajos prácticos.Técnica de inmunoelectroforesis: A) Gel de agar vertido y solidificado sobre un portaobjetos. Fac. Stites Daniel P. As. Inmunología Básica. Bs. y Terr Abba I.A. D) La ranura se llena con antisuero. 4. 1993 Sección II. B) El pozo para el antígeno se ha llenado con el suero en estudio. Capítulo 6. Manual de Inmunología México: Editorial Diana 1º edición. Inmunología Básica y Clínica.

Recientemente se descubrió que la alfa glicoproteína ácida (AGP). si actúan o no como presentadoras de antígeno y patrón de migración.Ejercicios y problemas de aplicación 1) Realice un cuadro que incluya las células que intervienen en el sistema inmune innato indicando: receptores de membrana. 4) La Peritonitis pleuritis infecciosa felina (PPIF) es una infección de etiología viral en la cual se desarrolla en el animal una intensa respuesta inflamatoria por parte del sistema inmune.8 0. En base a sus conocimientos analice las imágenes que corresponden a las electroforesis (EF) de suero de dos felinos distintos y responda: 124 . mecanismos involucrados en su acción (fagocitosis. Células o tejidos que los producen Complemento (vía alterna) Proteínas de fase aguda IFN  y  Anticuerpos naturales Funciones 3) Se realizó un experimento en el cual se evaluó la producción de óxido nítrico (ON) utilizando el reactivo de Griess. b) Compare los resultados obtenidos entre los animales. en los dos animales. apoptosis.). se centrifugó y se separó el halo de células mononuclares Estas células se incubaron con dos antígenos distintos: LPS y Staphylococcus sp inactivados con formol. c) Proponga una hipótesis que pueda justificar las diferencias observadas.2 1 0. una proteína de fase aguda.4 1. a) Indique mediante una tabla que respuesta en producción de ON se obtuvo según los estímulos indicados. d) Diseñe un experimento para confirmar la hipótesis propuesta. Los resultados se muestran en el siguiente gráfico: Canino 1 Nanomoles de Oxido nítrico Nanomoles de Oxido nítrico Canino 2 1. 2) Complete el siguiente cuadro con los componentes humorales del sistema Inmune Innato. 6 5 4 3 2 1 0 Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus spp.6 0.2 0 Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus spp. sufre un gran incremento en el suero de los animales afectados. etc. Un tercer grupo de células a las que no se incubó con antígeno se utilizó como control negativo.4 0. Para ello se obtuvo sangre con heparina de dos perros con las siguientes características: Canino 1: animal adulto de 3 años de edad y el Canino 2: cachorro de tres días).

Albúmina

2 1





Paciente A a) b) c)

Paciente B

¿Que técnica se utilizó para detectar el aumento en las proteínas de fase aguda? Describa el fundamento ¿Qué paciente sospecha que puede estar afectado de PPIF? ¿Cuál es el mecanismo inmunológico por el cual aumentan las proteínas de fase aguda? ¿Cuales son los componentes en los cuales puede separarse un suero? ¿Qué componente está alterado en este caso?

5) Durante una investigación sobre mecanismos de fagocitosis implicados en la inmunidad frente a distintas bacterias, se realiza un experimento para determinar la importancia de la opsonización en cada caso. A estos fines, se cultivan las bacterias en dos medios distintos: plasma humano y RPMI (medio de cultivo). Luego se agrega a los medios un cultivo de células dendríticas -con actividad fagocítica- y se los deja interactuar por 1,5 horas. Por último, se lleva a cabo el recuento del nº de bacterias fagocitadas a través de tinción con Giemsa de las células dendríticas y visualización de los microorganismos en su citoplasma. Los resultados obtenidos se representan en el siguiente gráfico:

A

B

C

D

Pie de figura: Cuantificación del nivel de ingestión de L. monocytogenes, por células dendríticas. Las bacterias fueron pre-incubadas con: A- Medio de cultivo, B- Suero decomplementado, C- complemento purificado, D- suero

125

completo. Los resultados se expresan como número de bacterias intracelulares por 100 células dendríticas luego de la tinción con Giemsa, a) ¿Cuáles son los mecanismos de inmunidad evaluados? ¿Qué fases de la fagocitosis está estudiando? b) ¿Qué conclusiones puede extraer a partir de este experimento? c) ¿Qué componentes del suero pueden haber actuado como opsoninas? Explique. 6) Un veterinario necesita purificar anticuerpos de tipo IgG presentes en el suero de un conejo para probar un nuevo tratamiento. a) Enumere y explique los pasos que debería seguir en la purificación. b) Según los resultados de SDS-PAGE que se muestran a continuación: indique qué enzimas puede haber utilizado para el fraccionamiento de las IgG obtenidas. Esquematice la molécula de IgG e indique los PM de cada uno de sus componentes antes (To) y después (Tf) de la digestión enzimática.
PM 97 50 T0 Tf

30 25

7) Se desea estudiar el efecto de la presencia de anticuerpos específicos frente a Staphyloccus sp. en la fagocitosis de dicha bacteria. Como fuente de Igs, se cuenta con suero de un animal infectado, y de Igs purificadas a partir del mismo por diferentes métodos. En las siguientes figuras se observa la corrida electroforética y el SDS-PAGE de los 3 tipos de muestras de Igs que se poseen:
1 2 3 1 2 3

50 kDa

25 kDa

a) Las muestras 1, 2 y 3 corresponden a las fracciones: Igs purificadas por afinidad a proteína G, suero e Igs obtenidas por precipitación salina. Observando las figuras, qué imagen considera que podría corresponder a cada muestra y por qué? b) Cuál de las 3 muestras usaría para opsonizar las bacterias y realizar ensayo de fagocitosis. Justifique

126

8) Se evaluó un nuevo kit diagnóstico para virus rábico, para ello se seleccionaron 180 cobayos libres de patógenos específicos (LPE) a los que se dividieron en dos lotes de 90 animales cada uno. Los animales del lote Nº 1 se conservaron como negativos, mientras que los del lote Nº 2 fueron inoculados con virus rábico y presentaron las lesiones características en el 100% de los animales (positivos). El análisis del suero de los 180 animales, a través del nuevo kit diagnóstico arroja los siguientes resultados: Lote Nº 1: 3 positivos y 87 negativos Lote Nº 2: 85 positivos y 5 negativos Realice un cuadro con los resultados y calcule la sensibilidad y especificidad del kit diagnóstico. 9) La Paratuberculosis bovina es una enfermedad crónica y de difícil diagnóstico que afecta a los bovinos. La prueba de oro para la confirmación de esta enfermedad es el aislamiento del microorganismo causante (Mycobacterium paratuberculosis) a partir de muestras de animales sospechosos. Dado el lento desarrollo de este microorganismo, se hace necesario contar con otras pruebas que permitan un diagnóstico más rápido. A continuación se transcribe una tabla de datos obtenidos por un equipo de investigadores que analizó el valor predictivo de un ELISA frente a un antígeno proteico de M. paratuberculosis como prueba diagnóstica de rutina: Aislamiento positivo positivo ELISA comercial negativo total 3 2 5 negativo 0 75 75 Total 3 77 80

Calcule la sensibilidad (S) y la especificidad (E) de la prueba de ELISA y decida en función de estos parámetros, si la implementaría o no como prueba diagnóstica de rutina. 10) A partir de las siguientes muestras para el diagnóstico de enfermedades infecciosas indique que tipo de Inmunofluorescencia realizaría (directa o indirecta) y reactivos necesarios. Sospecha Rabia canina Leptospirosis canina Toxoplasmosis muestra Impronta de cerebro Sedimento urinario Suero IF Reactivos necesarios

  

11) La Pseudorrabia es una enfermedad infecciosa, producida por el virus de Aujeszky, que afecta principalmente a cerdos pudiendo transmitirse a otras especies. Se caracteriza clínicamente por trastornos nerviosos, respiratorios y reproductivos, siendo el prurito generalizado seguido de parálisis y muerte los signos característicos. El agente etiológico pertenece a la familia Herpesviridae, presenta una cápside icosaédrica que contiene glicoproteínas (GP) que son los principales componentes estructurales reconocidos por el sistema inmune y contra las que se producen grandes cantidades de anticuerpos. La detección de anticuerpos específicos contra el virus en un cerdo se considera sinónimo de infección y el animal debe ser separado de la población sana. Para la prevención de la enfermedad se utilizan vacunas que generan una respuesta inmune similar a la infección natural.

127

El diagnóstico se realiza por la identificación de anticuerpos precipitantes en el suero de los animales infectados.689 Control Negativo 0. dependiendo del protocolo) ¿Cuál es el objetivo? 13) ¿Cómo sería el esquema de un ELISA diseñado para detectar la presencia del virus de la Influenza equina en muestras de secreciones nasales? Indique los reactivos que necesitaría. Esta variante es idéntica a la cepa de campo. Los números expresan el promedio de los valores de densidad óptica de cada muestra leída a 450 nm. de carácter crónico.999 Responda: a) ¿Cuál seria su informe sobre cada uno de los pacientes? b) ¿Qué sucedería si se hubiese omitido por error el agregado de los sueros. una variante de la cepa de campo a la que denominó “GPp 7 (-)”. la GP7. en estos casos se deben repetir los estudios.Un grupo de investigación generó. Usted tiene un laboratorio de diagnóstico y realiza esta prueba de forma rutinaria.055 B 0. Las densidades ópticas comprendidas en el rango de 0.300 a 0. con aparición de episodios agudos febriles.153 PACIENTE A 0. El contagio se produce a través de vectores hematófagos que transportan el virus en forma mecánica desde los animales enfermos a los sanos. Control Positivo 1. test de Coggins. marcada depresión y debilitamiento.412 C 1.499 indican valores indeterminados. 14) Los siguientes datos son los resultados de un ELISA de tres gatos sospechosos de padecer VIF. excepto que carece de una de las glicoproteínas de superficie. Diseñe un ELISA donde se pueda diferenciar animales sanos no vacunados de vacunados y de infectados (No olvide los controles) 12) Al final de la prueba de ELISA se agrega una solución ácida (o alcalina. y los otros pasos se hubiesen realizado correctamente? c) ¿Qué sucedería si no se hubiese lavado el conjugado Anti-inmunoglobulinas felinas antes del agregado del sustrato? d) ¿Por qué repetiría los resultados en el paciente B? ¿En qué momento lo haría? 15) La anemia infecciosa equina es una enfermedad de etiología viral de los caballos. Ag: antígeno P: control positivo P 1-2-3: muestras 1 Ag P 3 2 P 128 . por técnicas de ingeniería genética. Un colega tomó muestras de sangre de tres caballos y se las remite para su análisis.

a) Explique el fundamento de la prueba de aglutinación.D: 1/128 A.FI. 17) La leucosis bovina es una enfermedad inmunosupresora que afecta al ganado y es producida por un retrovirus. b) Otro antígeno viral compartido que se expresa tanto en la superficie del virus de la leucosis como en la de otros virus emparentados. El SENASA acepta como prueba de diagnóstico de rutina a la inmunodifusión doble en placa con un antígeno estandarizado altamente conservado entre las cepas de este virus.I: 1/2048 A. Se evaluó la supervivencia de los ratones luego del desafío a) ¿Cuáles fueron los resultados al día 2. al día 9 y al día 17? Realice un cuadro. 18) Un canino hembra de 8 meses de edad presenta convulsiones.F.) y obtiene los siguientes resultados: Día 0 Día 15 I. La vacunación se lleva a cabo con una cepa viva atenuada de Brucella abortus denominada cepa 19.) y aglutinación directa (A. El laboratorio realiza las pruebas de inmunofluorescencia indirecta (I.F. . b) ¿En que consistió en control negativo y para que lo realizó? 129 . Para identificar los animales infectados se realiza diagnóstico serológico a la totalidad de las hembras mayores de 18 meses de vida y los toros mayores de 6 meses.Analice los resultados explicando a que se deben las bandas observadas y como las interpreta. El veterinario. b) Explique por qué el diagnóstico serológico se realiza a diferentes edades según sean hembras o machos. Los ratones tenían dos semanas de vida y se les aplicó una dosis de 150ul de suero.I: 1/512 I. solicita serología de toxoplasmosis al momento de la primera consulta y quince días después. entre otras pruebas.D: 1/512 a) ¿Por qué los titulos informados son diferentes? b) Analice si hubo conversión serológica y explique el por qué de su respuesta 19) Con el objetivo de estudiar el efecto de la inmunización pasiva frente al desafío viral se obtuvieron sueros inmunes frente al virus del Sarampión de diferentes cepas de ratones y se utilizaron para inmunizar pasivamente un grupo homogéneo de ratones de la cepa Balb/c. Responda: Analice las variaciones esperables en la sensibilidad y la especificad de esta prueba diagnóstica de esta prueba si sustituimos el antígeno empleado por: a) Otro antígeno viral de alta variabilidad entre cepas debido a una gran frecuencia de mutación. Indique ¿Qué informaría sobre estos animales? 16) La campaña nacional de erradicación de la brucelosis bovina se basa en dos pilares: la vacunación de todas las terneras entre los 3 y 8 meses de edad (los machos no se vacunan) y la posterior identificación de los animales infectados y su segregación del rodeo.D.

¿Por qué? 21) En 1974 Peter Doherty y Rolf Zinkernagel realizaron el siguiente experimento: Infectaron cepas de ratones BALB/c y CBA con virus de la linfocoriomeningitis murina (LCMV). b) En base a los resultados: Explique qué demostraron con este experimento. Siete días después tomaron células de bazo de estos ratones y evaluaron su habilidad para lisar células blanco infectadas con el virus (midieron el grado de lisis por la liberación del radioisotopo 51Cr por parte de las células blanco).c) Admitiendo que las diferencias observadas entre los tratamientos son estadísticamente significativas ¿Cómo interpreta los resultados? % supervivencia Cuadrados negro: ratones tratados con suero proveniente de cepa Balb/c Cuadrados blanco: ratones tratados con suero proveniente de cepa CBA Triángulos blancos con borde negro: ratones tratados con suero de ratón normal 20) En la prueba de fijación de complemento se inactivan los sueros antes de evaluarlos. Lisis de célula blanco Cepa dadora de Célula efectora Célula blanco BALB/c inmune BALB/c no inmune CBA inmune CBA no inmune BALB/c inmune BALB/c no inmune CBA inmune CBA no inmune BALB/c BALB/c BALB/c BALB/c CBA CBA CBA CBA Infectadas + + No infectadas - 130 . ¿cuál es el objetivo? Y ¿cómo se realiza? Además. a) Explique los mecanismos celulares y las moléculas involucradas en esta evaluación. el suero en estudio debe estar completamente libre de hemólisis y de contaminaciones.

la célula y/o mediadores químicos efectores. ADCC. Unos meses después el potrillo es vendido y su nuevo dueño decide vacunarlos contra el tétanos. dirigidos contra los antigenos eritrocitarios en una transfusión? (alo – iso – idio) 25) Luego de una castración. argumentando que el suero antitetánico ya recibido funcionaría como primer estímulo para el sistema inmune. se procedió a la inoculación de ratones BALB/c y se evaluó el porcentaje de lisis específica utilizando diferentes tratamientos: Medio de cultivo solo (●). un potrillo recibe antibióticos y suero antitetánico para prevenir complicaciones postquirúgicas. ¿Está de acuerdo con la actuación del veterinario? Justifique 26) a) Analice el cuadro y explique qué pasará con el potrillo en cada caso b) En caso que sea necesario realizar una transfusión: Cual seria según su criterio el donante indicado: . Explique los resultados en las diferentes proporciones de células. 23) Para evaluar una vacuna BCG recombinante. Ante la información de que el potrillo ya ha recibido una dosis de suero antitetánico. lisis por complemento.otro Justifique en cada caso. 131 . mecanismo de reconocimiento y de lisis.madre . actividad NK. Explique los mecanismos celulares y las moléculas involucradas en esta evaluación.22) Haga un cuadro en el que se comparen los siguientes mecanismos de citotoxicidad celular: fagocitosis. el veterinario actuante decide darle sólo una dosis de vacuna y suprimir el refuerzo. Anti-CD4 () y Anti-CD8 (□) Se realizó una estimulación previa in vitro con un péptido y luego se la evaluó sobre células blanco que expresan el mismo péptido.padre . Mencione la célula blanco. 24) Como se denominan los Ac.

Los cultivos de E. Los dueños de los haras afectados solicitan que se importe y se aplique la vacuna de USA. que ha dado muy buenos resultados. coli se analizaron por la técnica de SDS-PAGE. La enfermedad es endémica en Estados Unidos y Europa. a) ¿Si usted fuera responsable del organismo de control sanitario nacional.madre 2º parición 27) La Arteritis Viral Equina es una enfermedad respiratoria que puede causar abortos en yeguas preñadas. el virus puede acantonarse en el tracto reproductor transformando al animal en portador sano. proponga un plan profiláctico alternativo. donde se utiliza una vacuna a virus vivo atenuado como herramienta profiláctica. 132 . Utilizando clonación en un vector de expresión (el plásmido: PRsetA este vector agrega a la proteina una cola de histidinas) se obtuvo en un cultivo de bacterias E. Se transmite por vía aérea y venérea. En los machos. En nuestro país es una enfermedad exótica de la que se han registrado algunos brotes en los últimos años como consecuencia de la importación de semen infectado. permitiría la utilización de dicha vacuna? ¿Por qué? De no permitirlo. y cura espontáneamente dejando inmunidad duradera. que elimina virus con los fluidos seminales. 28) Las vacunas a subunidades proteicas pueden ser obtenidas por técnicas de biología molecular. coli la siguiente proteína perteneciente a una secuencia de Mycobacterium paratuberculosis.

6 y 7 se observan las eluídos de la columna de Níquel. En las calles 4. ¿considera que la purificación fue efectiva? Justifique. En la calle 3 se observan los patrones de PM. a la mitad le aplicó la vacuna por la vía convencional y con la otra mitad empleó el sistema de spray. sin provocar alteraciones entre los animales vacunados de la manera convencional. por haber formulado una vacuna a virus atenuado con un vehículo a base de agua destilada estéril apirógena no debe realizar un control de inocuidad. a) ¿Le parece correcto vacunar con spray sólo a la mitad de los animales disponible para evaluar la eficacia del sistema? ¿Por qué? b) ¿Cómo explicaría los resultados obtenidos por este colega? 32) Usted debe elegir entre dos vacunas atenuadas para vacunar a todos los cerdos del país contra la gastroenteritis transmisible. ¿Está usted de acuerdo? 133 . ¿qué vacuna le parece mejor? Justifique 33) Un laboratorio entiende que. se propuso evaluar el efecto de la aplicación en spray de la vacuna covencional antiaftosa (virus inactivado) sobre las vías áreas.En la calle 1 se observa las proteínas de los cultivos de E. a) ¿Cuál es el fundamento de la metodología utilizada para la purificación proteica? b) Según los resultados de las corridas. coli sin transformar y en la calle 2 las proteínas de los cultivos de E. ¿Es correcto inmunizar con 2 antígenos distintos el mismo día? ¿Y administrarlos en la misma jeringa? ¿Por qué? 31) Un veterinario había oído decir que la vía ideal para la inmunización es la puerta de entrada natural del patógeno y sabía que el virus de la Fiebre Aftosa ingresa por vía aerógena. 5. cuentan con aislamientos de las serovariedades de la zona y con sueros de bovinos infectados. a) ¿Qué metodología les propondría para la identificación de proteínas compartidas por las distintas serovariedades? b) Una vez identificados las proteínas compartidas ¿Cómo podrían seleccionar aquellas que son más inmunogénicas para los bovinos? 30) Para ahorrar material descartable un veterinario carga en la misma jeringa una dosis de vacuna antirrábica (virus inactivado) y una de moquillo (virus atenuado). Una contiene el virus completo y otra el virus completo más una proteína extraña (la betagalactosidasa) Desde el punto de vista epidemiológico. 29) Un grupo de investigadores está intentando desarrollar una vacuna contra leptospirosis bovina a subunidades. coli transformadas con el plásmido. Unos meses después un brote de aftosa afectó a la gran mayoría de los animales vacunados con el sistema de spray. Para esta evaluación. Juntando estos conocimientos. dividió en dos grupos losa animales de un campo en el que trabajaba.

Se presentan los dueños en la veterinaria con la queja. Al cabo de unos años aparece en el pueblo un brote de moquillo que afecta principalmente a los perros no vacunados. Cuando el veterinario es confrontado como responsable del brote. ya que también habían enfermado los animales inmunizados. 40) Para la elaboración de suero antitetánico se recurre a la inoculación de equinos. c) Indique reactivos y equipamiento necesarios. La mujer quiere saber cómo proceder. a) Si usted fuera una autoridad sanitaria con jurisdicción en dicho pueblo. ¿Le parece correcto este proceder? Justifique 35) Cuando aparece un foco de una enfermedad exótica es imperioso el control de dicho foco para evitar la diseminación de la enfermedad. debido entre otras razones a los grandes volúmenes de suero que producen estos animales. además de no producir 100% de protección. pero también a algunos que sí habían sido vacunados. Como los anticuerpos contra el virus de la Pseudorrabia son protectores. Su dueña está preocupada porque la perra nunca fue vacunada y una vecina le comentó que los cachorros se podían morir de parvovirosis. Qué tipo de vacuna eligiría para aplicar en uno de estos casos: a) vacuna a virus vivo atenuado b) vacuna a virus inactivado c) vacuna a subunidades? Justifique su elección 36) A un pueblo llega un nuevo veterinario que sostiene la teoría de que es mejor no vacunar contra el virus del moquillo debido a que. Cuando un animal se infecta. Debido a su prédica. donde produce las lesiones causantes de la sintomatología de la enfermedad.34) Un cerdo ingresa al país desde un área de USA libre de Pseudorrabia. muchos dueños de perros dejan de vacunar contra este patógeno. a) ¿Usted qué le aconsejaría como veterinario? Si decide vacunarla. esta vacuna induce reacciones adversas en algunos de los animales vacunados. Sus dueños lo sacan de paseo por la plaza y a la semana el perro comienza a manifestar signos compatibles con Parvo/Moquillo. ¿cómo respondería a la aseveración del veterinario? 37) A una clínica veterinaria llega a consulta una perra recientemente preñada. ¿Tienen razón estos dueños? ¿Cómo argumenta su respuesta? 39) La Rabia es una enfermedad neurológica de origen viral. alegando que la vacunación recibida por su mascota no había sido correcta. Entre las medidas sanitarias que se adoptan en estos casos se encuentran el rifle sanitario y la vacunación en anillo de todos los animales susceptibles que habitan las zonas lindantes a la de la aparición del foco. a) ¿Qué antígenos inocularía y cómo diseñaría el plan de inoculación del equino en cuanto al nº de dosis y al intervalo temporal entre las mismas? ¿Por qué? b) ¿Qué técnica utilizaría en los equinos inoculados para evaluar la respuesta frente al antígeno? c) ¿Qué tipo de inmunidad podría conferir la administración a otro animal del antisuero producido? 134 . ya que a pesar de haber recibido 2 dosis de vacuna el cachorro se había enfermado. Teniendo en cuenta estas consideraciones: a) Proponga una técnica diagnóstica que permita confirmar la etiología rábica frente a la muerte de un animal con signos clínicos compatibles. se decide administrarle una dosis de suero hiperinmune anti-pseudorrabia al momento del ingreso al país. indique qué tipo de vacunas utilizaría y ¿por qué? 38) Un cachorro de 2 ½ meses recibió 2 dosis de vacuna contra Parvovirus y Moquillo. aduce que después de todo el tenía razón. b) Esquematice la metodología propuesta. Al llegar al establecimiento de destino el veterinario propone esperar unas semanas para vacunarlo contra la enfermedad. el virus se disemina por vía neurógena hacia el encéfalo.

que se aloja en los pulmones y causa lesiones que suelen llevar a la muerte. Este animal no tenía historia previa de enfermedad autoinmune. mascota de la veterinaria.  Anti – IgA bovina marcada con fosfatasa alcalina. Se le detectan anticuerpos contra antígenos de la retina en suero. se encontró que los animales jóvenes tienen deficiencia de IFN gamma. a) Describa alguna técnica in vitro que le permita demostrar la diferencia en la producción de IFN gamma.d) Explique ventajas y desventajas de la administración del antisuero a otro animal. Con sus conocimientos sobre técnicas Inmunológicas y con los reactivos que usted posee: ¿Qué técnica puede usted realizar que le permita determinar si lo que se está exportando es plasma bovino? Explique brevemente cómo la realizaría. el profesional actuante decide instaurar una hemotransfusión. Explique: a) ¿Qué mecanismos inmunológicos podrían estar involucrados? b) ¿Cómo se podría confirmar el diagnóstico? c) ¿Cómo se podría haber prevenido el agravamiento del caso? 42) El virus de la linfocoriomeningitis murina infecta. CD40 y CD80. ¿Cuáles serán las consecuencias de esta acción en el desarrollo de la respuesta inmune contra el virus? Explique. 41) En la Clínica veterinaria. b) ¿Cómo se verá afectada la respuesta inmune a esta bacteria por la deficiencia de IFN gamma? 46) Un perro de cinco años de edad sufre una herida el ojo. 43) Usted trabaja en un laboratorio y lo consultan porque una empresa desea exportar plasma bovino. 44) Estoy desarrollando una vacuna inactivada para caninos y quiero efectuar una prueba de potencia. El paciente comienza a manifestar vómitos. Para ello la aduana le exige un análisis cualitativo del mismo. a) ¿Cuál es la especie de elección? b) ¿Qué características deberán tener los animales en los que se lleve a cabo la prueba? c) ¿Cómo diseña y evalúa la prueba? 45) Los potrillos son susceptibles de padecer neumonía por Rhodococcus equi. Tiempo después. Usted en su laboratorio sólo posee los siguientes reactivos:  Anti – IgG bovina marcada con fluoresceína. entre otras. presenta lesiones oculares resistentes a la terapéutica convencional. En ellas disminuye la expresión de moléculas de MHC clase II. Al estudiar las causas de la marcada susceptibilidad de los potrillos. hipertermia y signos compatibles con un shock incipiente. a las células dendríticas. como donante de sangre . ¿Por qué normalmente un individuo no tiene anticuerpos contra antígenos de la retina en suero? ¿Por qué se podrían haber desarrollado en este caso? 135 . lo que afecta su respuesta inmune. Dada la urgencia del caso y considerando que el animal no había recibido transfusiones previas se decide recurrir a “Lucy”. Esta es una bacteria intracelular facultativa. Entre las pautas iniciales de manejo.  Anti – plasma bovino. es recibido un paciente canino con signos de anemia aguda severa.

a) ¿Qué le preguntaría a los dueños (anamnesis)? b) ¿Qué técnicas utilizaría para comprobar sus sospechas? 49) El diagnóstico de la tuberculosis se realiza por la intradermorreacción con PPD. Responda: a) ¿Qué mecanismos efectores del sistema inmune consideran que tendrán mayor importancia para lograr una respuesta inmune efectiva frente a Rotavirus? b) Proponga un modelo de vacunación para la prevención de esta enfermedad en terneros neonatos. Aquellos que presentaban un aumento de 5mm de diámetro o más. a) ¿Cuál fue el experimento llevado a cabo? b) Describa la técnica y su fundamento c) ¿Cuáles son las células que los investigadores pretenden evaluar? d) ¿Por qué se seleccionaron individuos previamente expuestos al antígeno? 51) Los individuos positivos (con anticuerpos frente al Dengue) fueron seleccionados a través de la técnica de ELISA. 48) Se presenta a consulta una gata siamesa de 5 años de edad con 5 cachorros de los cuales 1 estaba muerto y otros 2 presentaban decaimiento e ictericia. El veterinario sospecha de isoeritrólisis neonatal. y se los consideraba como tal a aquellos que presentaban títulos en suero mayor o iguales a 256. ¿Cuál es el objetivo buscado al realizar intradermorreacción a bovinos con PPD? ¿Qué grupo/s control faltaría/n? ¿Qué tipo de hipersensibilidad es esta intradermorreacción? ¿Cómo se produce? e) Interprete los resultados 50) Un grupo de investigadores estudió la respuesta de memoria de células T humanas en individuos con antecedentes de infección por dengue. Para esto se incubaron células mononucleares de sangre periférica de individuos inmunes (expuestos) a dengue y un grupo de individuos controles no expuestos.47) Dentro de las patologías del tracto digestivo que afectan a los terneros neonatos. materiales. a) Describa el tipo de ELISA utilizado. para una evaluación posterior de la antigenicidad de proteínas virales inmunodominantes para su empleo en el diseño de futuros inmunógenos. 136 . fundamento y controles. explicando qué tipo de vacuna. Este virus ingresa al organismo por vía oral e infecta los enterocitos de las vellosidades intestinales. la Rotavirosis es una de las más relevantes. a) b) c) d) Describa cómo se obtienen las proteinas recombinantes. generando las lesiones responsables del cuadro de diarrea observado. La lectura se realizó a las 72 hs. justifique. se los consideró como positivos. para ello realizan la intradermorreacción de las proteinas recombinantes E6/C10 (de Myobacterium tuberculosis) a bovinos infectados. Un grupo de investigadores desea mejorar el diagnóstico de bovinos infectados.

Los ensayos para evaluar respuesta inmune se realizaron mediante un ELISA y los sueros utilizados en una dilución 1/250 Responda: a) ¿Qué isotipos deberían evaluarse para conocer la respuesta inmune primaria y secundaria? b) Establezca los pasos del ELISA utilizado c) Si la dilución utilizada fue siempre la misma ¿Cómo se evaluaron los niveles de Ac. Si existen diferencias.14 y 28 (A la vez se tomaron muestras de sangre del seno venoso retroorbital). Se utilizaron 12 ratones BALB/c machos y 12 ratones BALB/c hembras de entre 5 y 8 semanas de edad y fueron divididos en dos grupos de 12 animales c/u (6 machos y 6 hembras) Los animales fueron inoculados intraperitonealmente con seroalbúmina bovina el grupo 1 y con Dextran el grupo 2. En el presente trabajo se presentó un modelo animal. Se utilizó dextran como Ag T independiente y seroalbúmina bovina como Ag T dependiente. y se estudió la respuesta analizando los isotipos de los anticuerpos producidos. medidos en este trabajo? d) Grafique la respuesta primaria y secundaria esperable para ambos antígenos. ratones BALB/c.b) Indique las diluciones de uso de los sueros. ¿Encuentra diferencias? Explique f) ¿Qué control agregaría? 137 . teniendo en cuenta que títulos > 256 son considerados positivos y la dilución final de uso fue de 1/2048. los días 1 (preinmune). de respuesta inmune frente a dos antígenos típicos. ¿Cómo realiza las diluciones teniendo en cuenta que el volumen a utilizar es de 20 μl de suero? 52) Un paradigma clásico de la inmunología plantea que para que ocurra cambio de isotipo en los anticuerpos es condición sine qua non la presentación del antígeno a un linfocito T helper (LTh) por parte de una célula presentadora de antígeno (CPA). 7. indicando el isotipo predominante. ¿A que las atribuye? e) Analice los gráficos de detección de anticuerpos frente a ambos antígenos.

obtenidos (en relación directa con la concentración de anticuerpos específicos contra la enfermedad en cuestión) se elaboran histogramas de frecuencia según rangos de D. Durante la anamnesis se informó que el animal recibió 2 dosis de vacuna contra IBR hace 1 año.61 – 0. De acuerdo a los valores de D. Cinco días después de llegar a destino el torito muere súbitamente.41 – 0.00 Grupo 1 2 3 4 5 138 .20 0. Se toman muestras de sangre de 30 cada 10. el torito recibe una vacuna contra IBR y Pasteurella multocida (principales agentes causales de la enfermedad). etc) que se transmiten muy rápidamente entre los pollos de un galpón de engorde Las gallinas transfieren anticuerpos en forma pasiva a sus pollitos a través del huevo.O. se observaron lesiones compatibles con neumonía.40 0. Los resultados son concluyentes.60 0. New Castle.81 – 1. obtenidas se establece el “grado de protección” o “status inmunitario” del lote frente a esa enfernedad y se anticipa o retrasa el momento de vacunación activa para mantener las aves en un “alto status inmunitario” durante todo el período de producción (45 – 60 días). La muerte se debió a una infección aguda por P. Discuta a) 1 ¿Qué muestras envió al laboratorio? b) 2 ¿Qué estudios solicitó? Descríbalos y fundamente su elección c) 3 ¿Cómo debieron ser los resultados para asegurar que la muerte del animal se debió a una pasteurelosis aguda y que el virus de IBR no puede ser acusado de toricidio d) 4 ¿Qué medidas se deberían haber tomado para evitar esta muerte? 54) La producción industrial de pollos para carne se ve afectada por la ocurrencia de diferentes enfermedades virales (Bronquitis infecciosa.53) Una Cabaña vende un torito a un establecimiento ganadero.O. antes de subir al camión.21 – 0. Se sospecha de ¨Fiebre de los transportes¨ Se toman muestras y se envían al laboratorio.000 aves. no así contra Pasteurella. De acuerdo a la distribución de las D.O. Para prevenir la ¨Fiebre de los transportes¨. establecidos por estudios estadísticos. multocida. Para evaluar la eficacia de esa transferencia se emplea la técnica de ELISA indirecto. sin participación del virus de IBR.80 0. Gumboro. que lo protegen contra enfermedades específicas durante un período variable de tiempo (hasta un máximo de 40 días) si éstas fueron correctamente inmunizadas. Densidad Optica 0 – 0. La necropsia se realizó inmediatamente.

80 1.61 – 1. cantidad y tipo de vacunas convencionales a emplear en cada lote. Para marcarla se emplearon 3 anticuerpos: anti CD3 (maracador de LT).21 – 1.20 1.O.60 1. Realice comparaciones sobre el “status inmuntario” de cada lote y sobre la necesidad. cada uno marcado con un fluorocromo distinto. cantidad de muestras cantidad de muestras 20 15 10 5 0 1 13 17 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 4 5 5 7 6 3 2 3 4 5 6 7 8 9 10 7 8 9 10 Grupo 1 Grupo 2 cantidad de muestras 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 13 9 8 cantidad de muestras 10 8 6 4 2 0 1 2 3 7 4 8 6 3 2 7 8 9 10 4 5 6 7 8 9 10 Grupo 3 Grupo 4 55) Se sabe que el Virus de la Inmunodeficiencia Felina (VIF) infecta a los linfocitos T CD4+.81 – 2.00 6 7 8 9 10 a) Describa la técnica empleada. anti CD4 y anti CD8.41 – 1. b) El Diseño empleado: ¿Corresponde a una técnica cualitativa. obtenidas de muestras de suero de 4 grupos diferentes de pollitos bb que ingresaron a galpones de engorde. causando una depleción de los mismos y que en esta infección. la relación CD4:CD8 de linfocitos circulantes constituye un factor pronóstico.40 1. semicuantitativa o cuantitativa? c) Los gráficos representan los histogramas de frecuencias de D. Los siguientes gráficos corresponden a la corrida en un citómetro de flujo de la muestra de sangre de un paciente felino recién diagnosticado.1. 139 .01 – 1.

En este problema se muestran los resultados de uno de sus ensayos.Teniendo en cuenta que la relación CD4:CD8 esperada para un felino sano es aproximadamente 2:1. Emplearon como estímulo linfoproliferativo una solución de virus inactivado. reactivos) para el ensayo realizado. CD3 y CD4 vs. controles. Indice de Estimulación (IE) Animal Infectado Animal NO infectado 17.3 15. analice e interprete estos resultados: SSC-Height -> Linfocitos CD8: 19% CD4: 10% Los gráficos CD8 vs.1 1. donde realizaron una prueba de linfoproliferación de sangre periférica de animales infectados con el virus. a) Analice los resultados expresados en la siguiente tabla y proponga un diseño (muestras empleadas.8 Células SIN estímulo Células + ConA Células + VPP 140 . CD3 fueron construidos considerando solamente los eventos incluidos en la región linfocitaria (gate linfoide) 56) Un grupo de científicos está investigando la respuesta inmune de porcinos frente al virus de la Peste Porcina (VPP).5 9.

qué tipo celular cree que está representando la nube de puntos CD4-? c) Qué conclusiones piensa que el equipo de investigación pudo haber extraído analizando el perfil de citoquinas encontradas? 141 . Expresión intracitoplasmática de citoquinas en LT CD4+ de porcinos vacunados contra la Peste Porcina. Los gráficos “A” representan células no estimuladas (control de producción basal de citoquinas).b) Luego. Se representa CD4FITC en eje Y y las respectivas citoquinas en el eje X. los gráficos “C” corresponden a células estimuladas in vitro con una solución viral inactivada a) Qué información puede extraer de los gráficos presentados? b) En los gráficos de il-2 e IFNγ. evaluaron las citoquinas producidas por los LT CD4+ proliferados usando la citometría de flujo.

Los docentes de Inmunología Básica estamos convencidos de que adquirir competencias de lectura e interpretación de trabajos científicos es fundamental para ustedes. dadas las exigencias de actualización que la actividad profesional veterinaria supone en cualquiera de sus ámbitos. luego aparecen el Resumen (en español y en inglés).GUIA DE LECTURA PARA UN TRABAJO CIENTÍFICO MODELO Texto: Fernández B. Ahora. Fernández E.. Antes de centrarnos en la lectura del trabajo. Si se fijan. figuran los Autores del trabajo y su Filiación. ¿Podrían mencionar cómo se denominan las partes principales que aparecen con una secuencia dada en él? Primero está el Título. En él se presenta de manera sintética los objetivos.. cuando uno realiza una búsqueda bibliográfica en bases de datos internacionales en la web. y del contenido particular que en este trabajo se presenta:  El Título suele guardar relación con la problemática investigada.. En este caso. en la medida que se familiaricen con este tipo de textos. comunes a todos los trabajos científicos. Como pueden ver. Debajo del título. las Conclusiones y por último. una Introducción. a través de la escritura de nuevas publicaciones científicas. que es un artículo publicado recientemente en la Revista InVet. el resumen es a lo que primero se accede para leer. “Efecto de la infección de Mycobacterium avium paratuberculosis en la producción de anticuerpos bovinos”. y analizar la manera en que los autores del trabajo muestran los resultados que obtuvieron. Mundo S. Generalmente.  El Resumen es una parte muy importante de una publicación científica. In Vet 13(1):9-17. funcionando estas palabras clave como “motores de búsqueda”. en este caso son investigadores de dos Cátedras de nuestra Facultad. que permite a los lectores la posibilidad de contactarse con los autores del trabajo. el título nos sitúa en la enfermedad en estudio (la paratuberculosis. 2011. y conclusiones del trabajo. podrán difundir en un futuro sus propias experiencias y los nuevos conocimientos que generen. Colavecchia S. Esta guía fue pensada para acercarlos a la lectura del trabajo mencionado. Particularmente en esta clase. Podrán reflexionar sobre la aplicación de la técnica de ELISA a partir de este caso real. resultados. los Materiales y Métodos empleados.L. los objetivos y la pregunta de investigación. como es aquí el caso.. seguido de los nombres de los autores y la/s institución/es a la/s que pertenecen. producida por Mycobacterium avium subp. paratuberculosis . Éstas tienen que ver con la esencia de la investigación y ayudan a la localización del artículo en los buscadores de bibliografía. Jolly A. una a una irán leyendo las partes del texto y podremos detenernos para analizar detalles de su estructura. los Agradecimientos y la Bibliografía citada. evaluar la metodología empleada. analicemos rápidamente cómo es la estructura general de este tipo de texto. la lectura del trabajo elegido les permitirá abordar algunas de las principales técnicas de Interacción Primaria antígeno-anticuerpo desde una perspectiva diferente a la planteada en la Guía de lectura y trabajos prácticos de nuestra materia. los Resultados y la Discusión de los mismos. A veces.Map -) y en la especie animal en la que se abordó su estudio: bovinos. También nos dice que el trabajo se va a centrar en el análisis de la respuesta inmune de anticuerpos generada en animales que padecen esta infección. el resumen aparece tanto en el idioma oficial de la revista como en inglés. métodos. 142 . al finalizar el resumen aparece una serie de Palabras clave. En función de la información que los resúmenes nos proveen es que decidimos qué trabajos de todos los que se enlistan como resultado de nuestra búsqueda sobre un tema en particular son los que nos interesaría leer en su versión completa. editada semestralmente por nuestra Facultad y en la que se nuclean publicaciones científicas de diversas áreas de la veterinaria. a los fines de incrementar la difusión del mismo dentro de la comunidad que podría tener interés en leerlo. Además. Otra información de los autores que puede incluirse es un mail de correspondencia (aquí aparece en el pie de página).

sintomáticos y sintomáticos en fase terminal. y por lo tanto el sistema inmune tendrá que combatirlas valiéndose principalmente de sus mecanismos celulares (perfil Th1. dentro de esta categoría. La aclaración de que los animales controles provienen de campos libres de tuberculosis surge de que al ser ambas enfermedades producidas por micobacterias. la respuesta inmune inducida por la infección con una de ellas podría generar interferencias o reacciones cruzadas con el diagnóstico inmunológico de la otra. Si el antígeno usado para realizar este ELISA no les resulta familiar. En el apartado siguiente Detección de anticuerpos específicos en sueros frente al PPA por ELISA. 143 . los antecedentes. podrán darse cuenta de que en ellos se abordó el estudio del impacto económico de esta enfermedad y es seguramente en base a los resultados que esos autores encontraron que los autores de este trabajo enuncian esa afirmación. los autores detallan el protocolo empleado. la/s hipótesis y la justificación. cuál fue el criterio de clasificación aplicado para considerarlos sanos o infectados. en el primer párrafo. Debería contener toda la información necesaria como para que otro investigador pudiera. Por ejemplo. a partir de esos datos.  A continuación se presentan los Materiales y Métodos. el origen de las muestras estudiadas. y a su vez. e identifican los trabajos previos en que se basa aquello que los autores están afirmando en esa frase. en formato de superíndice al finalizar algunas de las frases. es decir el diseño experimental general. los procedimientos metodológicos y las técnicas empleadas. y GEFFNER. la frase que dice “La enfermedad causa notables pérdidas económicas en la producción agropecuaria. tanto a nivel sistémico (en suero) como local (en materia fecal) en bovinos en distintos estadios de paratuberculosis. 2005. en general se presenta la problemática abordada y su contextualización. explicando de qué manera se estableció el valor de corte. vamos a referirnos a algunos conceptos que aquí aparecen implícitos pero que sería bueno tener presentes: La enfermedad en cuestión es causada por una micobacteria. En este trabajo. Médica Panamericana. Introducción a la inmunología humana. Seguramente habrán notado la aparición de números.. Si necesitan revisar los conceptos generales relacionados con los perfiles de la respuesta inmune. la pregunta de investigación. En este apartado. L. Si recuerdan estas bacterias son de vida intracelular. activación de macrófagos. 9 y 10. especificando los reactivos utilizados y los laboratorios que los produjeron. donde se explica qué es. Si leen los títulos de esos dos trabajos en la Bibliografía. citotoxicidad mediada por linfocitos CD8+ y células NK). que hacen referencia a distintas metodologías aplicadas y que pretenden organizar la información de manera más clara para el lector. cómo se los subdividió en asintomáticos. habrán notado que se hace referencia al estado de los bovinos con respecto a otra enfermedad que no es la paratuberculosis: la tuberculosis. Ed. En relación a ella. donde nos cuentan la cantidad de animales estudiados. Si vemos cómo está organizada en este caso. Cap. vuelvan al último párrafo del apartado anterior del trabajo. Si leyeron este apartado con atención. Ahora sí nos sumergimos en el cuerpo del texto. pueden remitirse a: FAINBOIM. reproducir los experimentos planteados en el trabajo. el primer apartado que contiene es Animales y muestras. Estos números nos llevan al apartado final: Bibliografía.(…)” nos conduce a las citas 19 y 20. objetivos del estudio. Aquí también se explicita cuál fue el criterio para considerar positivo/sospechoso/negativo un resultado obtenido. con producción de IFNγ. se menciona el objetivo que persiguieron al realizar esta investigación: la evaluación y caracterización de la presencia de anticuerpos. J. a través de su Introducción. Ustedes cuentan con una descripción general de esta técnica en la Guía de Lectura y Trabajos Prácticos de la materia (páginas 53 a 62). los autores nos cuentan que parece existir una relación entre el estadio de la infección y el tipo de respuesta inmune predominante en el animal. 5ta ed. Como cierre de la Introducción. En el tercer párrafo. Esta sección suele estar a su vez subdividida en segmentos. cada uno con un subtítulo. la enfermedad estudiada es la paratuberculosis.

En la Figura 2. proyecta los alcances del nuevo conocimiento generado y puede proponer nuevas líneas de investigación. nos encontramos con la concentración relativa de los diferentes isotipos de IgGespecífica a Map encontrados en cada uno de los grupos de bovinos evaluados. Focalícense en la lectura de los otros apartados y en el análisis de la información contenida en las tablas y en Figura 2. ya sea logrando su crecimiento en un medio de cultivo o identificando la presencia de un fragmento de ADN exclusivo de esta bacteria (IS900) mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Más adelante en la cursada. Es por esto que para clasificar certeramente a un bovino como infectado se necesita encontrar al microorganismo en muestras tomadas de él. estaban o no afectados. Por ejemplo. y por otro los niveles de anticuerpos. Mientras que en la Tabla 2. Se describen los resultados obtenidos en relación a la caracterización de la respuesta de anticuerpos en los bovinos en diferentes estadios de la infección estudiados.“. También en esta sección 144 . específicos frente a paratuberculosis. En este trabajo vemos cómo se comparan algunos resultados obtenidos con otros ya publicados por otros autores. En Isotipos de inmunoglobulinas por ELISA nos cuentan qué determinaciones hicieron: por un lado evaluaron los niveles de anticuerpos totales en suero y materia fecal. los autores nos demuestran. el segundo apartado titulado Producción de IgG3r y caracterización de los anti-isotipos de IgG bovinos como así también la Figura 1. totales o por isotipos. en la primer frase “Nuestros resultados muestran (…). en contraposición al estudio realizado en pequeños rumiantes3. hacen referencia al origen de los reactivos empleados para la identificación de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas bovinas estudiadas: IgM. en forma verbal y gráfica. El último apartado de Materiales y Métodos hace referencia al Análisis Estadístico. que utilizando secuencias de cebadores (primers) específicos para dicho segmento. si se respondió o no a la pregunta de investigación. que también son proteínas circulantes. En esta sección se muestran. los valores de IgM e IgG totales y Map-específicos obtenidos por ELISA a partir del suero y la materia fecal de los animales evaluados. Los apartados que siguen. producción de sueros hiperinmunes) que hoy exceden el límite de los conocimientos que hasta ahora poseen. indicando qué programa se empleó y qué estadísticos se aplicaron para analizar los diferentes resultados obtenidos. si se refutó o no la hipótesis. los hallazgos resultantes de la investigación y su interpretación más directa y el análisis estadístico de los mismos. a través de un gráfico de barras. IgG1. Pero ¿de qué manera se vinculan los niveles totales de anticuerpos con esta enfermedad? Otros autores describieron previamente que en los estadios terminales de la paratuberculosis se produce un cuadro de hipoproteinemia (niveles circulantes de proteínas totales por debajo del rango normal para la especie). Hay que tener en cuenta que si bien el objetivo de este trabajo es focalizar en la respuesta inmune humoral inducida durante esta infección. los vamos a pasar por alto en esta ocasión. Producción de IgG3 bovina recombinante y Caracterización de los anti-isotipos de IgG. en este caso. no serán analizados en esta ocasión.  Bajo el título de Discusión se suele presentar la interpretación más extensiva de los resultados y la reflexión sobre el logro de objetivos.En Aislamiento e identificación de Map a partir de materia fecal nos detallan cómo realizaron este procedimiento. puede amplificarlo hasta lograr concentraciones detectables a partir de una muestra tomada del animal. Entonces. En general. Teniendo en cuenta la aclaración que realizamos sobre la metodología. Básicamente. la confirmación del diagnóstico de paratuberculosis en los animales no puede realizarse sólo mediante el estudio de la respuesta inmune específica. los autores quisieron evaluar si en aquellos bovinos con hipoproteinemia (en Animales y Muestras de Materiales y Métodos explican cómo los detectan) los niveles totales de anticuerpos.  Ahora sí aparecen los Resultados. volveremos sobre este trabajo para poder profundizar en estos puntos (producción de antígenos con vectores de expresión. de doble entrada. derivado de la malabsorción que las lesiones granulomatosas producidas por esta enfermedad generan en la pared intestinal. planes de inmunización. limitando la asimilación de nutrientes de la dieta. IgG total. IgG2 e IgG3.

 La Bibliografía es el listado de fuentes documentales utilizadas para el sustento de la investigación y que aparecen referenciadas en el cuerpo del artículo. Fernando Paolicchi). especifica los lineamientos para la presentación de las referencias.” Puesto que no es esperado que animales que no están infectados (ni que tampoco han tenido contacto vacunal) con el microorganismo en cuestión posean altos niveles de anticuerpos específicos. También puede incluirse un agradecimiento a alguna persona que haya participado en la lectura y revisión crítica del manuscrito previamente a su remisión a la revista (en este caso. económica. los autores enuncian esta hipótesis que explicaría el hallazgo. material. han financiado la investigación (en nuestro texto. sería la referencia a los subsidios de UBA-SeCyT). a través del otorgamiento de subsidios de investigación. para realizar alguna de las metodología (en nuestro trabajo. Este hallazgo los lleva a plantear como proyección de su línea de investigación el “(…)desarrollar un ELISA diagnóstico utilizando PPA como antígeno y antisuero frente a IgG3 bovina recombinante(…)” Esta nueva prueba podría mejorar la identificación de los bovinos con infección subclínica y en un futuro poder ser incorporada en los planes de control de paratuberculosis en los rodeos. llegamos a la sección de Agradecimientos. Gilardoni y L. El último párrafo de las discusión menciona el hallazgo que los autores del trabajo consideran más destacable: “(…) el predominio de la IgG3 específica en los animales asintomáticos(…)”. era la categoría de animales más difícil de diagnosticar en esta enfermedad. la cual suele ser opcional. que.  Las Conclusiones pretenden resumir en pocas palabras los resultados más relevantes encontrados. Este es el caso en el párrafo que dice “La IgM es una inmunolgobulina pentamérica que posee alta avidez pero poca afinidad.se suele incluir las hipótesis que los autores elaboran para explicar aquellos resultados anómalos o no esperados. aportando una herramienta que mejoraría el diagnóstico de esta enfermedad en los rodeos bovinos. mencionando a las instituciones que. Como reflexión final. los altos niveles de IgM obtenidos en los bovinos controles podrían deberse a reacciones cruzadas con otras micobacterias25. recordemos. Los párrafos que comienzan por “Son pocos los trabajos (…)” y “La IgG2 e IgG3 (…)” hacen referencia a cuestiones relacionadas con los apartados que hemos omitido en este lectura. pensemos cómo de esta manera una investigación básica habría generado un nuevo conocimiento que podría transferirse a la práctica profesional veterinaria.  Finalmente. dirigirse puntualmente a alguna de ellas si al aparecer citada en el texto nos interesa profundizar más en ese tema o tener acceso a la fuente original de información. Goldman). a los fines de no generar confusiones. No es la idea leerlas sino. el agradecimiento al Dr. si es que los hubiera. Cada revista. por ejemplo cuando algún otro investigador facilita un reactivo o alguna muestra que fue obtenida en otro centro de investigación). 145 . Aquí los autores se refieren a quienes les han aportado ayuda: técnica. Por lo tanto. en sus normas editoriales. serían los agradecimientos a L.

La IgG3 fue la inmunoglobulina específica de mayor cantidad detectada tanto en suero como en materia fecal de los asintomáticos. El hallazgo de incrementos de IgG3 específica en asintomáticos sugiere el estudio de este isotipo para poder mejorar su identificación. Universidad de Buenos Aires. (bovino). causada por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis.. 2 Cátedra de Clínica de Rumiantes. Jolly.1. Chorroarín 280 (1427) Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires.1. (anticuerpos). e IgG-específica en materia fecal de los sintomáticos.L. E. 1. Nuestros resultados muestran que la infección no afecta la producción de inmunoglobulinas totales. Se determinaron los niveles de inmunoglobulinas totales y se cuantificaron los subisotipos de IgG específicos a paratuberculosis en suero y materia fecal por ELISA. 2011 9 . sintomáticos y terminales) y cinco controles. El predominio de IgG1 se corresponde con el cambio de perfil a Th2 en el periodo sintomático. Mundo S.uba. 2011. RESUMEN La paratuberculosis es una enfermedad granulomatosa crónica intestinal. Los niveles de inmunoglobulinas totales en sueros fueron similares. 13 Nº 1. Fernández. B. S. Facultad de Ciencias Veterinarias. seis infectados (asintomáticos. La IgG1 específica fue predominante en sueros de bovinos sintomáticos y terminales. 13(1): 9-17 ISSN 1514-6634 (impreso) ISSN 1668-3498 (en línea) ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Efecto de la infección de Mycobacterium avium paratuberculosis en la producción de anticuerpos bovinos Effect of the infection with Mycobacterium avium paratuberculosis on the production of bovine antibodies Fernández. se evidenciaron aumentos significativos de IgM e IgG totales. que afecta a los rumiantes. Colavecchia.InVet.2. InVet Vol.ar Recibido: 26-05-2011 Aceptado: 20-07-2011 * Premio “Estímulo a la Investigación Científica 2010” en la categoría graduados de la Facultad de Ciencias Veterinarias. Correspondencia e-mail: Silvia Mundo smundo@fvet. El aumento de inmunoglobulinas en materia fecal podría relacionarse con la lesión de la mucosa intestinal. Se estudiaron once bovinos. Palabras clave: (paratuberculosis).1 1 Cátedra de Inmunología. Sin embargo. El objetivo del trabajo fue caracterizar la respuesta inmune humoral sistémica y local de bovinos infectados. A.

mientras que al Th2 se lo asocia con IgG1 e IgA8. El papel de los Ac en la protección frente a micobacterias ha sido reevaluado. Our aim was to characterize systemic and local humoral responses of infected cows. were assessed by ELISA. 20. symptomatic and terminal) and five control. Además. al perfil Th1 se lo relaciona con las IgM e IgG2. SUMMARY Paratuberculosis. (bovine).6.. S. En este contexto.. Total IgM and IgG and paratuberculosis-specific IgG subisotypes. Eleven cows were studied: six naturally infected (asymptomatic. The use of anti-IgG3 could improve the identification of asymptomatic cows.24. from feces and serum. por causas todavía inciertas. MUNDO S. En ese momento hay un cambio de perfil de la respuesta inmune de Th1 (celular) a Th2 (humoral)1. lo que conlleva a un aumento de inmunoglobulinas (Ig) circulantes facilitando el diagnóstico serológico de la enfermedad. La infección se produce por ingestión de calostro. 2011 .L. que se caracteriza por la aparición de diarrea profusa. Symptomatic cows showed significative higher level of totals IgM and IgG. The increment of immunoglobulins in feces could be caused by the lesions of intestinal mucosa. se plantean como objetivos del presente trabajo la evaluación de la respuesta inmune humoral local y sistémica de bovinos en distintos estadios de paratuberculosis. paratuberculosis (Map)10.7. La enfermedad causa notables pérdidas económicas en la producción agropecuaria19. IgG3 was the highest specific immunoglobulin in sera and feces of asymptomatic. Sin embargo. Nuestro grupo ha demostrado un incremento en la asociación del Map con la célula blanco de la infección (el macrófago bovino) luego de la opsonización con IgG1 específica frente a la bacteria entera o a la proteína p34 recombinante. INTRODUCCIÓN La paratuberculosis es una patología crónica intestinal que afecta a los rumiantes y es causada por el Mycobacterium avium subsp. JOLLY. se utilizan principalmente kits que evalúan la producción de inteferón gamma por linfocitos en cultivo22. IgG1 was the highest from sera of symptomatic and terminal. is a chronic granulomatous enteric disease affecting ruminants. No differences were detected on the levels of total immunoglobulins in sera. FERNÁNDEZ. En algunos bovinos. la forma subclínica avanza hacia el período clínico. The predominance of IgG1 in symptomatic period is related to the change toward Th2 profile.. and specific-IgG in feces. (antibodies). 13 Nº 1. Key words: (paratuberculosis). leche o materia fecal de animales eliminadores de bacterias. el papel funcional de los isotipos de anticuerpos (Ac) aún no ha sido totalmente dilucidado. y al IgG2 se lo relaciona principalmente con el incremento de la fagocitosis mediada por neutrófilos frente a las infecciones bacterianas agudas. En la especie bovina.11. COLAVECCHIA. MATERIALES Y MÉTODOS Animales y muestras Se estudiaron 11 bovinos adultos: 6 provenientes de rodeos infectados con paratuberculosis y 5 bovinos controles (C) 10 InVet Vol. Se describe al isotipo IgG1 como crítico para bloquear bacterias y toxinas en el sitio de infección. Su identificación es dificultosa. B. A.FERNÁNDEZ. Our results showed total immunoglobulins levels in serum are not modified by the infection. Los animales infectados atraviesan un largo estadio subclínico durante el cual eliminan pequeñas cantidades de Map por leche y heces en forma intermitente. demostrando que los Ac juegan un rol importante en la respuesta inmune frente a micobacterias2. se detectó un incremento en la activación celular y la formación del granuloma17. caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. mala absorción de nutrientes y pérdidas de proteínas. E..

Se realizó la purificación parcial de las proteínas a través de una columna de Níquel (His*Bind® Resin. anti-IgG2 bovina monoclonal en ratón (Sigma-Aldrich Co. A partir de los resultados se clasificó cada suero como: negativo (menor al VC). 2011 11 . USA). inc. y el anti-IgG de conejo en cabra conjugado a peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratorios. Se observaron todos los cultivos una vez por semana durante 18 semanas. phlei ATCC 11758 fueron utilizadas como cepas controles. Las MFs fueron fraccionadas para realizar el cultivo y los ELISAs (se homogenizó 10 gr de MF y 10 ml de PBS Tween 20 al 0. USA). Montgomery.coli. Para el estudio de IgG1 e IgG2 se utilizaron reactivos comerciales: anti-IgG1 bovina en ovino conjugado a peroxidasa (Bethyl inc. Para evitar reacciones cruzadas con otras micobacterias. niveles de proteínas séricas (evaluados por refractometría). utilizando los patrones comerciales IgG1 e IgG2 (Bethyl Aislamiento e identificación de Map a partir de materia fecal Se cultivó la MF de los bovinos problema en medio Herrold con huevo.). Fountain.. Pennsylvania. El suero de conejo anti-IgG3r fue preadsorbido con BL21-pRSET A en medio líquido (a una densidad óptica660nm de 2) y EEc en medio sólido (en placas de 96 hoyos) con el fin de disminuir la cantidad de Ac anti-E. El suero se fraccionó y congeló a -20ºC hasta el momento de utilización. Para interpretar los valores de densidad óptica (DO) obtenidos se calculó el valor de corte (VC) sumando al promedio de los sueros controles negativos. Producción de IgG3 bovina recombinante Para obtener la IgG3 bovina recombinante (IgG3r) se cultivaron21 las E.5 el VC). USA) (anti-IgG-HRP). USA. USA). presencia de signos clásicos de la enfermedad. Maryland.. Luego fueron fraccionadas y congeladas a -20ºC hasta el momento de uso). De cada bovino se obtuvo 10 ml de sangre sin anticoagulante y materia fecal (MF). En aquellos casos que crecieron colonias de bacterias con las características esperadas. coli (EEc). Missouri. Map ATCC 19698 y M. 13 Nº 1. Darmstadt.16. a fin de confirmar el diagnóstico12. Germany). Para ello se utilizaron las secuencias de primers diseñadas por Mundo18 y Collins5.ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS provenientes de campos libres de paratuberculosis y tuberculosis de la provincia de Buenos Aires. La determinación de las reacciones cruzadas se realizó por Inmunoblot y ELISA. El sistema de revelado empleado fue un anticuerpo anti-IgG bovina en conejo conjugado a peroxidasa (Cappel. phlei) inactivada por calor (crecida en nuestro laboratorio).5 el VC) y positivo (mayor a 1.. se identificó el IS900 por PCR9. USA). Los bovinos fueron clasificados según: rodeo de origen. Posteriormente se realizó la diálisis de las proteínas purificadas. dos desvíos estándares. coli BL21 (BL21-pRSET A) transformadas con el plásmido pRSET A sin inserto fueron procesadas y denominadas como extracto de E. se centrifugaron varias veces a fin de obtener las muestras lo más límpida posible15. detección de anticuerpos específicos en sueros frente al Antígeno Protoplasmático de Map (PPA). se pre-adsorbieron los sueros con Mycobacterium phlei (M.05%. Detección de anticuerpos específicos en sueros frente al PPA por ELISA Se utilizaron placas de 96 hoyos sensibilizadas con 2µg/hoyo PPA (Allied Monitor Inc. Caracterización de los anti-isotipos de IgG. Las bacterias E. coli BL21 pLysS transformadas con un plásmido obtenido en nuestro laboratorio17. USA).. aislamiento e identificación de Map a partir de materia fecal. Novagen.. Missouri. piruvato y micobactina (Allied Monitor Inc. Mientras que para evaluar la IgG3 se utilizó el suero de conejo anti-IgG3r obtenido previamente en nuestro laboratorio17. anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Jackson Immuno Research Laboratories. InVet Vol. Inc. sospechoso (con densidades ópticas entre el VC y 1.

La pre-adsorción del suero de conejo anti-IgG3r disminuyó notablemente la cantidad de Ac anti-E. Se determinó la homogeneidad de varianza y se realizó el Test de Dunet como análisis post-ANOVA. Por la técnica de ELISA se observó que el reactivo comercial anti-IgG2 reconoce la IgG3r y el antisuero anti-IgG3r pre-adsorbido reconoce IgG2 (patrón comercial). inc. especialmente en los IS en relación al C. estas reacciones cruzadas son siempre con menor intensidad que al reactivo correspondiente (Figura 1C). La lectura de los Inmunoblots reveló la existencia de reacciones cruzadas entre IgG3r con IgG1 e IgG2. Producción de IgG3r y caracterización de los anti-isotipos de IgG bovinos La purificación permitió obtener la IgG3r acompañada de una pequeña cantidad de proteínas contaminantes provenientes de la E. Raul Barletta).. Análisis Estadístico Para analizar los resultados se utilizó el software estadístico Stastistix 8. Se evidenció un incremento en los niveles de IgMs totales en IS e IT. B. USA) y anti-IgG-HRP. Se determinaron niveles similares de IgG totales en sueros de los distintos grupos. coli por el anti-IgG3r mediante ELISA demostró que. Por otro lado. coli (Figura 1B).FERNÁNDEZ... Se detectó un leve aumento de IgMs totales y específicas a Map en los sueros de los infectados. de reactividad frente a PPA en suero y el aislamiento e identificación de Map en materia fecal se muestran en la Tabla 1. Esta cepa se cultivó en medio 7H9 líquido y fue inactivada por calor en nuestro laboratorio. coli (Figura 1A). se realizó el análisis de varianza (ANOVA). Sin embargo.16 (suero pre-absorbido). Montgomery. suero de un bovino normal y EEc.01 (suero sin pre-adsorber) a 0. al pre-adsorber el suero. 2011 . Niveles de Igs específicas a Map. y de las MFs sin diluir (IgM) y 1/100 (IgG). los antiisotipos comerciales (anti-IgG1 y anti-IgG2) sólo reconocieron el patrón correspondiente (IgG1 e IgG2 respectivamente. infectados sintomáticos (IS) e infectados terminales (IT). ya que el anti-IgG3r preadsorbido reconoce a las tres subclases de IgG bovina (Figura 1B).. 13 Nº 1. Isotipos de inmunoglobulinas por ELISA Niveles de Igs totales... A. La evaluación del reconocimiento de E. IgG3r. USA). sinología y los resultados de niveles de proteínas séricas. la DO obtenida pasó de 1. Se utilizaron 50µl de K10 a una DO660nm de 0. Niveles de IgG. Se sensibilizaron hoyos con 50µl de los sueros diluidos 1/6000 (IgM) y 1/20000 (IgG). Montgomery.0 (Analitical Software. Isotipos de inmunoglobulinas totales y específicas a Map en sueros y MFs Niveles de IgM. Se utilizaron los siguientes Ac conjugados a peroxidasa: anti-IgM bovina en ovino (Bethyl inc. Tallahasee. siendo sólo significativa la diferencia entre los C y el IS. aunque el análisis estadístico no permitió identificar estas diferencias como significativas. MUNDO S. JOLLY. Los hoyos fueron sensibilizados con una cepa de referencia de origen bovino totalmente caracterizada y secuenciada denominada K1014 (gentilmente cedida por el Dr. En MF los niveles fueron bajos en relación a los del suero. E. 12 InVet Vol. COLAVECCHIA. el comportamiento fue similar al del suero. RESULTADOS Clasificación de los grupos de animales infectados El origen. Los niveles de significación fueron fijados en un 5%. FERNÁNDEZ. Sin embargo. Para la comparación de los niveles (DO) o cantidad de isotipos (µg/ ml) entre grupos. S.L. USA). resultados no mostrados). Los resultados se muestran en Figura 2. Estos resultados permitieron clasificar a este grupo en infectados asintomáticos (IA).4. Los resultados se muestran en la Figura 2.

C. Caracterización del anti-IgG3r.2±0. Calle 4 EEc. Isotipos de IgG específicas a Map: Los resultados se muestran en Tabla 2. Mientras que sólo se detectó IgG1 específica en MF del grupo sintomático (14. Antígenos: Calle 1 IgG2. 2011 13 . Calle 1 IgG3r expresada por Clon 36. B.6±0. IS (infectado sintomático). Grupo C (control). Se utilizó el anti-IgG3r como anticuerpo primario. InVet Vol. la cantidad de IgG específica a Map en sueros de IA fue menor que en los C. 13 Nº 1. Calle 2 IgG3r purificada. Calle 5 IgG3r.3 ELISA PPA Sospechoso + + Cultivo de MF + + Grupo C (n=5) IA (n=2) IS (n=2) IT (n=2) Campo de origen + + + Signos + + PCR + + Figura 1. A.ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS Tabla 1. ELISA. e IT (infectado terminal).5 8. Calle 3 suero bovino.7±0. Producción de IgG3r. SDS-PAGE al 12%. Niveles de IgG1: Se observaron incrementos significativos en los niveles de IgG1 de sueros de IS e IT. En MFs se evidenciaron comportamientos similares entre IgG totales y específicas.1 4.3 7. Llamativamente. Así mismo se detectaron altos niveles en IS e IT (IgG total y específica). proteínas séricas (g/dl) 6.3±1. coli BL21 transformadas con el plásmido pRSET A sin inserto (EEc).8± 3 µg/ml). Clasificación de los grupos de bovinos. Calle 3 E. Reacciones cruzadas de los anti-isotipos de IgG. siendo significativa la diferencia entre el IS y el C. Producción de IgG3r y caracterización de los anti-isotipos de IgG bovinos. Calle 2 IgG1. IA (infectado asintomático). Se observó un incremento estadísticamente significativo en los niveles de IgG Map específica en los sueros de los bovinos IS e IT. Inmunoblot.

13 Nº 1. sólo esperable en infecciones agudas o re-agudizaciones de infecciones crónicas. JOLLY. FERNÁNDEZ. La IgM es el isotipo indicador de respuesta activa.4±3.7* 10.1±0. los altos niveles de IgM obtenidos en los bovinos controles podrían deberse a reacciones cruzadas con otras micobacterias25.2±2.FERNÁNDEZ. Niveles de IgG3. se pudo observar un incremento de los niveles de IgM e IgG totales en materia fecal coincidiendo con el periodo clínico sintomático (IS). Niveles de IgM e IgG totales y Map-específicas en sueros y materias fecales evaluados por ELISA.7 10. los infectados IA e IS mostraron niveles similares a los detectados en suero. Este aumento de IgM en MF podría ser posible por la lesión intestinal y la re-estimulación de nuevos clonos de linfocitos B como respuesta a la re-infección endógena característica de éste periodo. Figura 2. DISCUSIÓN Nuestros resultados muestran que la infección con Map afecta los niveles de proteínas séricas sin modificar la producción de anticuerpos totales en suero. MUNDO S. COLAVECCHIA.2 48 112 Niveles de IgG2.08 <0. 2011 .08 18.2±1* 1160.0 µg/ml). en contraposición al estudio realizado en pequeños rumiantes3.8* 14.9±13 <0. E.09±0. IS e IT)...08 14.1 679. Por lo tanto.5±14* IgG3 MF 9. Se determinó un incremento significativo en los sueros de los bovinos infectados mostrando además cantidades similares entre ellos. 14 InVet Vol.8* 17.2±0.08 IgG1/IgG2 Suero <0. En MF sólo pudo ser detectado en el grupo sintomático y en baja concentración (0.08 <0.08 µg por ml correspondiente al límite de detección de la técnica. Grupos Suero C IA IS IT *p<0. S.L.7* 19.5±6.08 0.8±3* <0. A. Por otro lado.3±0.5±8. En MF.05 <0. Mientras que en el resto de los bovinos los niveles fueron menores a 0.02 0. Se identificó un aumento significativo en los sueros de todos los animales infectados (IA.08 2. Análisis de isotipos de IgG en sueros y materias fecales.08 Suero <0.3±3* IgG1 MF <0. B.09±0.8 18.0 <0. Tabla 2. La IgM es una inmunoglobulina pentamérica que posee alta avidez pero poca afinidad.08 Suero 3..8 10.07±0.7* IgG2 MF <0. expresados en μg/ml..4±0.

2011 15 . principalmente de IgG1. Paolicchi por sus aportes teóricos en el presente trabajo. 2. nuestro próximo objetivo será desarrollar un ELISA diagnóstico utilizando PPA como antígeno y antisuero frente a IgG3 bovina recombinante.17. Se detectó IgG3 en sueros y materias fecales de animales asintomáticos y sintomáticos. y Bjune G. Immunol. Clarke C. sintomáticos. La IgG2 e IgG3 poseen cadenas pesadas similares. Se corroboró el predominio de IgG1 en sueros de bovinos sintomáticos y terminales.P. terminales). CONCLUSIONES En el presente trabajo se determinó que la infección con Map no modifica los niveles de Igs totales séricas. AGRADECIMIENTOS Se agradece a los veterinarios L. La respuesta de tipo Th2 no es tan clara dado que la IgG2 específica en suero aumentó en todos los bovinos infectados y los niveles son similares. Se encontró un aumento de este isotipo en sueros de todos los bovinos infectados. Abebe F.J. La IgG3r producida para este trabajo. Abbas B. Esto podría deberse al tipo de respuesta inmune que predomina en esta etapa (celular). Goldman por su apoyo técnico. lo que justifica las reacciones cruzadas encontradas. IgG.. Dado que el diagnóstico serológico utilizado de rutina falla en la identificación de este grupo. Gilardoni y L.A. se sugiere la utilización de un reactivo específico anti-IgG3 para mejorar su detección. Son pocos los trabajos que estudiaron la IgG3 en bovinos infectados con Map17. Sin embargo. incluye regiones compartidas. And Experimental Immunology. En este sentido. 1988. razón por la cual Butler4 las clasificó como IgG2a e IgG2b. 3. The protective role of antibody responses during Mycobacterium tuberculosis infection. Se identificó IgG1 específica en materia fecal de los sintomáticos. Es de destacar el predominio de la IgG3 específica en los animales asintomáticos. 11:171-175. Early immunophatological events in experimental ovine InVet Vol. Sin embargo. Riemann H. Estos resultados concuerdan con los expresados por Estes y Brown (2002) y Vanden Bush (2003). mostrando el poder de discriminación del reactivo (anti-IgG3r). Dis. Los niveles fueron levemente superiores a los hallados para IgG2 y parecería tener una cinética similar a la de IgG2. Begara-McGorum I. Los animales asintomáticos presentaron niveles basales de IgGs Map -específicas en sueros. Se demostró que los reactivos desarrollados en nuestro laboratorio permitieron ampliar el conocimiento de la respuesta inmune humoral específica a paratuberculosis. y al doctor F. 157: 235-243.Clin. IgM and IgA in the serum of cattle naturally infected with Mycobacterium paratuberculosis. 2009. BIBLIOGRAFÍA 1. este es el primer trabajo que describe a la IgG3 bovina en mucosas. Comp. La detección de IgG3 Map-específica en MF del grupo control podría deberse a reacciones cruzadas con micobacterias intestinales no patógenas.ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS Estos resultados coinciden con trabajos nuestros previos sobre bovinos infectados18. Wildblood L. Infect. Esta investigación fue financiada por los subsidios UBA-SeCyT v038 y v023. Los altos niveles de IgG1 específicos encontrados en materias fecales de bovinos sintomáticos coinciden el predominio de este isotipo en la mucosa intestinal en bovinos normales4. El aumento de IgG específica a Map en sueros de bovinos sintomáticos y terminales está acompañado de incrementos de todas las sub-clases de IgG.. Y a nuestro entender.. al analizar la relación IgG1/IgG2 se observa un incremento de dicha relación. Microbiol. 13 Nº 1. coincidente con el avance de la patología (asintomáticos. Esta última parecería ser la Ig predominante en suero en estas etapas de la enfermedad tal como se han descripto previamente13. se han encontrado diferencias entre los niveles de IgG2 e IgG3 en sueros y MFs estudiados.

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