Trabajo PracticoN10

Hidratos de Carbono Florencia Skoropad, Roco Torres, Mnica Guberman y Nicols Gonzlez

Trabajo Practico N10 Hidratos de Carbono

Objetivos:
Identificar monosacridos y derivados a partir de cromatografa de particin sobre capa delgada de celulosa y cromatografa gas-lquido. Reconocer los monosacridos que componen un disacrido en este caso lactosa, realizando su hidrlisis acida

Introduccin:
En la prctica se estudiaran los hidratos de carbono mediante tres distintos enfoques. Primeramente se identificarn diferentes azcares por cromatografa en capa delgada de celulosa; luego se realizar la hidrlisis de lactosa siguiendo la reaccin por CCD de celulosa con los patrones correspondientes y por ltimo se identificar una mezcla de azcares por CGL habindolos derivatizado adecuadamente con anterioridad.

Desarrollo Experimental: 1. Separacin de hidratos de carbono por cromatografa en celulosa:

Los azcares pueden identificarse por varios mtodos; cuando se tratande azcares relativamente sencillos puede realizarse un CCD de celulosa; si fuese ms complicada serian necesario utilizar ms mtodos. En este caso, se estudiar como varan los Rg de los compuestos carbohidratados con solo la variacin de un carbono quiral (como Dglc y D-gal) o tambin por grupos funcionales distintos (como D-Glc y D-Fructosa, o tambin un disacrido cualquiera). Las eluciones de cada uno ahora no solo depender de la polaridad de cada enlace y por lo tanto de la molcula en general, as como de su estructura; sino tambin de la posiciones de estos enlaces en el espacio por su quiralidad; es decir, en estas determinaciones se separan adems diasteroisomeros. La celulosa es la fase estacionaria, que se encuentra adherida sobre un soporte para as lograr formar una pelcula sobre la misma pudindose as adsorber selectivamente cada compuesto. Respecto del solvente de elucin es una mezcla muy polar que maximiza la solubilidad de los azcares (ms que en agua), ya que es una mezcla de

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acetato de etilo, piridina y agua en relacin 6:3:1. Las propiedades polares (por los oxgenos) y no polares (por la cadena etlica) del acetato de etilo, as como tambin para la piridina dada por el nitrgeno y el anillo hidrocarbonado, hacen solubles a una mezcla de azucares de estas caractersticas.

Reveladores:
El problema principal para revelar placas de celulosa es evitar que esta misma reaccione, ya que a pesar de su estructura diferente, no deja de ser tambin un polmero de hidratos de carbono. Es por ello que deben evitarse reveladores destructivos como cido sulfrico que carbonizara no solo los compuestos eluidos sino tambin la placa, y tambin la lmpara de UV-Vis (de 240nm en general) no resulta til debido a que los compuestos no son insaturados y mucho menos conjugados. Los reveladores utilizados son los siguientes:

a) Para azcares reductores:

Para todos aquellos azucares que posean un grupo ceto reactivo, ser posible oxidarlos a acido con plata en solucin; en este caso se requiere medio bsico no amoniacal y se evitara la formacin del xido correspondiente con un agregado posterior de tiosulfato. Este ltimo se compleja con la plata no reactiva (en general precipitara inicialmente como un slido marrn del Ag2O) mantenindola en solucin en una especie incolora. Pudindose observar en las reas donde la plata reacciona, la formacin de plata slida que se observara como una mancha oscura. Con este revelador se identifican todas las azucares reductoras; ya sean aldosas como disacridos reductores. Adems, como el medio ser bsico se favorece la formacin de enoles derivadas de la cetosa correspondiente que est en equilibrio a su vez con la forma aldlica y por ende reductora; pudiendo reaccionar as tambin las cetosas al irse desplazando el equilibrio ceto-enolico.

b) Para azcares aldosas reductoras:

Luego, pueden diferenciarse aldosas mediante el uso de cido ftlico en anilina. La mezcla de reactivos se realizara in-situ y forman primeramente un compuesto coloreado (Rosa) que ser ste quien reaccione sobre el carbono carbonlico de la aldosa. Dependiendo de si es una hexosa o una pentosa el color del producto variar; ya que el primero forma un compuesto amariilo-marron y el segundo ser de color rosa. Nuevamente debido al equilibrio ceto-enolico existente para las cetosas, es posible que se revelen luego de un cierto tiempo, ya que como en este caso el medio no es bsico, la concentracin de especie aldoica es mucho menor y por ende menor ser la velocidad de la reaccin.

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c) Para polialcoholes
El ultimo revelador es universal para azucares y polialcoholes no derivatizados. Este es un oxidante especifico de periodato que destruye enlaces de dioles vecinales (presentes en azucares y polialcoles) formando las cetonas correspondientes. A estos productos se los oxida nuevamente, con permanganato en medio carbonato (levemente bsico, disminuye poder oxidante) producindose los cidos correspondientes y la formacin del xido de manganeso (IV) de color marrn, que a estas concentraciones se observa amarillo. La aparicin de este color- as como la desaparicin del color prpura propio del permanganato- indica el positivo a la presencia del compuesto.

Como cada revelador y compuesto difieren en velocidad de reaccin y reactividad, ser necesario que se siembren una cierta cantidad de gotas de cada patrn o muestra de forma de que se observe la reaccin positiva o no en un tiempo mnimo, pero a la vez se deben minimizar la cantidad de las mismas para evitar difusin durante las eluciones y dificultar la identificacin de las mismas; por lo que existe un compromiso entre estos dos aspectos en la cantidad de gotas utilizadas. Asimismo se alejan las siembras lo mximo posible tambin para contribuir a disminuir las difusiones que puedan ocurrir.

2. Hidrlisis de la lactosa e identificacin de los productos de hidrlisis por cromatografa en capa delgada de celulosa:

La lactosa es un disacrido de la D-glucosa y la D-galactosa, como la unin es 1-4 y no involucra ambos carbonos anomericos, una de las terminales es reductora, pudiendo as observarse por CCD de celulosa su reaccin con los reveladores anteriormente citados. En este caso, se producir su hidrlisis en medio cido y por digestin, de forma de romper la unin glicosidica formndose los hidratos de partida, en este caso sern Dglucosa y D-galactosa. Ambas tambin son identificables por CCD en celulosa por lo que se realizara el seguimiento de la reaccin por cromatografa, sembrando la solucin resultante a varios tempos de reaccin en una misma placa. La condiciones de la siembra, elucin y revelado son idnticas al tem anterior. Se revelarn las placas con las primeras dos tcnicas a) y b).

3. Preparacin de los acetatos de alditoles:

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En la ltima parte del trabajo prctico se dispondr de una muestra de azucares incgnita, dada por los docentes, de la cual se deber identificar su composicin. Para el anlisis de la mezcla se utilizara un mtodo muy comn debido a su selectividad, precisin y sensibilidad: el CGL. Pero es necesario que los compuestos carbohidratados sean derivatizados primeramente, ya que la enorme cantidad de hidroxilos que contienen nunca podran eluirse de la fase estacionaria y podran hasta permanecer en la misma como impurezas en posteriores anlisis. Se realizarn entonces una reduccin y una posterior acetilacin; la reduccin es necesaria porque de no realizarse, se observaran en el anlisis de cada carbohidrato las distintas variedades de sus formas furanosas y piranosas (4 solamente por cada aldosa o hexosas, y otros ms para disacridos dependiendo del tipo de unin); la acetilacin es necesaria para aumentar la volatilidad de los productos y su termoestabilidad.

4. Anlisis por Cromatografa Gaseosa

La cromatografa gaseosa utilizada en este caso es gas-liquido. La resolucin en CGL est dada tanto por la volatilidad de los productos como por la particin selectiva en la columna debida a las diferentes solubilidades. La volatilidad de los hidratos aumenta al derivatizarlos ya que los compuesto acetilados poseen un menor punto de ebullicin al no existir ahora posibilidades de puente hidrogeno entre las molculas que existan tanto en forma de hidratos y aun ms en la forma del polialcohol. Luego tambin las solubilidades disminuyen considerablemente por lo que los tiempos de retencin disminuyen proporcionalmente. De esta manera, la muestra reducida y acetilada, habindose previamente eliminado los subproductos y residuos con lavados orgnicos, y obtenindose la muestra derivatizada pura, se la inyectara en el CGL, que le realizar PREVIAMENTE un Split, de 1:100 tomando solamente 10L de muestra. Los tIempos de retencin variaran por tamao de molcula y por la estructura de la misma, comparndose luego con patrones pertinentes.

Procedimiento: 1. Separacin de hidratos de carbono por cromatografa en celulosa:

Los hidratos de carbono que se analizaran con esta tcnica sern los siguientes:

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Estas corresponden a tres aldosas (dos hexosas y una pentosa), una cetosa, un polialcohol, un disacarido y un glicosido. Se siembran en una cromatoplaca de 10x10cm de celulosa utilizado una mezcla de Acetato de etilo-Piridina-Agua 6:3:1 como solvente de desarrollo. Dejando un centimetro entre cada calle de la placa para evitar dispersion de las mismas, dificultando la identificacion de cada azucar luego de los revelados. Debido a que los compuestos son muy polares, es neceario que la placa sea eluida dos veces para lograr no solo el aumento general de cada mancha sino tambien, poder aumentar las diferentes eluciones de los diasteroisomeros que son minimas y que solo de esta forma pueden seraparse adeacuadamente.

Reveladores: a) Para azcares reductores:

La placa recientemente corrida, se deja secar y se la sumerge en una mezcla acetona saturada en solucin de nitrato de plata y posteriormente se le pulveriza una solucin alcohlica bsica de NaOH 5% en EtOH 5%. Posteriormente se eliminan los excesos de plata con un lavado en solucin de tiosulfato 5% en agua. La reaccin global que se lleva a cabo es:

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Se observa asi que la presencia de estos grupos, ceto y aldolico se identifican por la presencia de la mancha oscura de plata. En particular, las cetonas son reactivas (lentamente, pero lo hacen),por el quilibrio ceto-anolico que experimentan en medio basico; dada por la siguiente reaccion de equlibrio

La lentitud de la reaccion se debe a la minima proporcion de forma aldolica que hay presente respecto a la cetosa. Ademas, la plata en medio basico precipita en forma de su oxido marron, muy insoluble; por lo que para diferenciar las manchas oscuras de plata del oxido se disuelve este ultimo por el lavado en solucion de tiosulfato, que forma el siguiente complejo incoloro que disuelve el precipitado debido a una constante de formacion mas favorable.

b) Para azcares aldosas reductoras:

Mediante el uso de este revelador es posible diferenciar entre hexosas y pentosas. En el caso de aldopentosas se obtiene furfural y para las aldohexosas, el producto es hidroximetilfurfural. Luego, este compuesto carbonlico reacciona con la anilina a travs de un ataque nucleoflico al carbono carbonlico. El producto que se forma es la correspondiente imina. Para que este ltimo paso ocurra, el azcar de partida debe ser reductor. Las primeras dan una mancha de color rosado mientras que las segundas presentan manchas de coloracin parda. Las cetosas tambin pueden reaccionar pero lo hacen muy lentamente.

La reaccin global es:

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El reactivo se prepara en el momento usando acido ortoftalico en butanol saturado con agua y anilina previamente destilada. Se pulveriza sobre la placa de celulosa recientemente eluida y secada y se seca en estufa por solo unos minutos. Evitando asi en este tiempo que la celulosa se descomponga.

c) Para polialcoholes

Para identificar todo tipo de compuestos con dioles vecinales, se usa una mezcla de periodato al 2% y permanganato al 1% en bicarbonato al 2%; al igual que las anteriores se prepara en el momento. La reaccin es ms lenta que las anteriores pero da buenos resultados. Primeramente el periodato oxida los enlaces de los dioles fragmentando la molcula en dos compuestos ceto-derivados. Luego, el permanganato oxida a acido cada uno de esto y por lo tanto este se reduce a dixido de manganeso (IV) que es de color marrn, pero se observara como una coloracin amarilla sobre los compuestos recientemente eluidos.

La reaccin Global correspondiente es:

2. Hidrlisis de la lactosa e identificacin de los productos de hidrlisis por cromatografa en capa delgada de celulosa:

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Se hidroliza lactosa en medio acido, obtenindose D-glc y D-gal. Se hidratan 200 mg de lactosa en 1 ml de agua y se hidroliza adicionando 0,2ml de cido clorhdrico 2M. Luego se calentara a bao mara por 30 minutos. El seguimiento de la reaccin se realiza sembrando en cromatoplaca de celulosa de 10x10cm utilizando como testigos lactosa, d-glc y d-gal. Se tomaran muestras a los tiempos: 0, 5, 10, 20 y 30 min, sembrndolas adecuadamente en la placa, Nuevamente se utiliza como solvente de elucin una mezcla de AcOEt-Py-H2O (6:3:1) y se revelaran con nitrato de plata y permanganato; por lo que se sembrara cada muestra y patrn en dos placas paralelamente. La reaccin resulta:

Es vlido aclarar que ambos productos, por hallarse en solucin, al cabo de un tiempo se encontrarn en equilibrio con sus otras formas (abiertas y cerradas, en y en ).

3. Preparacin de los acetatos de alditoles:

A la muestra incgnita de hidratos de carbono que se nos suministr por el grupo docente, se la disolvi en metanol y se agreg una punta de esptula de borohidruro de sodio. Se deja reaccionar y se procede a la eliminacin con actico del borohidrato resultante por el docente a cargo. Se elimina por volatilidad el ster-borato resultante. Luego se procede a la acetilacin adicionando a la solucin anterior anhdrido actico en piridina y calentando por 30min a 80C aproximadamente.

Luego se realizan extracciones a partir de la solucin resultante en cloruro de metileno con agua, eliminando la posible existencia de borato aun persistente, luego con bicarbonato para eliminar el cido actico en exceso y luego con agua para neutralizar y eliminar posibles sales resultantes. La fase orgnica se evaporara luego a sequedad y el residuo se disuelve en cloruro de metileno y se analiza por CGL.

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Reacciones Involucradas: Reduccin:

Acetilacin:

Mecanismo de la acetilacion (R en este caso es cada terminal alcohlica del alditol):

4. Anlisis por Cromatografa Gaseosa

Se inyecta la mezcla anterior en el cromatografa, 1L , y se corre la cromatografa a 230C con flujo de 1ml por min. Se compara luego los picos obtenidos con los patrones correspondientes.

Resultados y Conclusiones: 1. Separacin de hidratos de carbono por cromatografa en celulosa:

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La mancha correspondiente a la xilosa era de un color rosa intenso, la de la glucosa marrn, la de la galactosa era marrn amarillenta y la de la lactosa era muy tenue. Los compuestos revelados con biftalato fueron xilosa, galactosa, glucosa y lactosa, mientras que el glucitol, la fructosa y el metilglicsido no fueron revelados. Es decir, se consigui revelar aldohexosas, aldopentosas y azcares reductores, pero no cetosas, alditoles ni metilglicsidos. Como indica la reaccin correspondiente (expuesta anteriormente) el biftalato de anilina reacciona con el carbono carbonlico del azcar, por lo tanto se necesita que este est libre para reaccionar, y no reacciona con alditoles ni con carbonilos involucrados en uniones glicosdicas (metilglicsidos o azcares no reductores), tampoco con cetosas, porque al ser el medio de reaccin cido no puede establecerse el equilibrio ceto-enlico necesario para formar el aldehdo. Adems, tras colocar la placa en la estufa, se observo que la xilosa (pentosa) revelaba fucsia, mientras que los restantes compuestos revelaban marrn, en concordancia con las reacciones anteriormente planteadas.

No se obtuvieron placas de revelado con nitrato de plata o permanganato con resolucin suficiente como para ser analizadas.

2. Hidrlisis de la lactosa e identificacin de los productos de hidrlisis por cromatografa en capa delgada de celulosa:

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Se observa en ambos revelados, por contraste con patrones en la misma placa: a tiempo cero presencia de lactosa, y a medida que avanza el tiempo de reaccin se nota un aumento en la concentracin de los productos de hidrlisis, glucosa y galactosa (el aumento de concentracin se ve en el hecho de que las manchas se hacen ms intensas) y una disminucin en la concentracin del disacrido (identificado por manchas ms tenues). Luego de veinte minutos de reaccin, la hidrlisis es total y no se observa presencia del disacrido.

3. Anlisis por Cromatografa Gaseosa

Condiciones de corrida Columna SP 2330 Longitud: 30m Dimetro interno: 0,25m Grosor del film: 0,2m Programa:

Temp. columna: 230C isotrmica Temp. Inyector y detector: 240C Flujo: 1ml/min Split: 1/100

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Cromatograma de patrones incgnita

Cromatograma de la muestra

De acuerdo a la comparacin basada en los tiempos de retencin del cromatograma obtenido para la muestra incgnita con el cromatograma de patrones, se identifica en la mezcla incgnita la presencia de los derivados acetilados de la d-glucosa y de la dxilosa, en proporciones de 34% y 66% respectivamente, en base al rea encerrada bajo cada una de los picos (las integraciones para los picos estn indicadas en los cromatogramas adjuntos). Caben entonces dos posibilidades: los compuestos originales podran ser D-glucosa y D-xilosa, o los alditoles glucitol y xilitol (puede ser que hubiese un alditol, ambos alditoles, o mezclas de las mencionadas hexosas con sus alditoles). Se descarta la posibilidad de que hubiese una fructosa presente, o alguna otra hexosa presente, porque entonces se deberan haber observado picos correspondientes a los derivados de dos azcares que son epmeros en la posicin en la que se encuentra el cabonilo de la cetosa: por ejemplo, de tener fructosa se debera haber observado en el CG la presencia de los derivados de la glucosa y de la manosa (epmeros en C2, que es donde la fructosa tiene el carbonilo) y de tener una cetopentosa adems del derivado de la xilosa se debera haber observado la presencia del derivado de otra pentosa (epmero de la xilosa).

Conclusiones
En este trabajo prctico se busc, principalmente, analizar y reconocer hidratos de carbono segn distintas tcnicas; algunas de estas tcnicas han perdido su plena

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vigencia en la actualidad- como los distintos reveladores sobre placas de celulosa-, y han sido desplazados por mtodos ms prcticos, cmodos y precisos, como la cromatografa gas-lquida. No se pueden establecer conclusiones claras sobre la utilidad del revelado de placas de celulosa para identificar compuestos, ya que se obtuvieron resultados confusos y poco claros. El nico revelador con el cual se obtuvieron placas con claridad suficiente para establecer un anlisis fue el de biftalato/anilina, en el que se pudieron diferenciar claramente hexosas de pentosas. Sin embargo, este revelador no permite identificar compuestos tales como cetosas, alditoles o glucsidos, por lo que sera necesario emplear otra tcnica para ellos. Sin embargo, fue posible controlar el progreso de una reaccin de hidrlisis mediante placa de celulosa, tanto revelada con plata en medio bsico como en la ya mencionada mezcla de biftalato/anilina, en la cual se observ claramente la progresiva disminucin en la concentracin del disacrido y su correspondiente aumento en la concentracin de los monosacridos obtenidos. Por otro lado, el anlisis de una muestra incgnita por cromatografa gas-lquida present resultados muy satisfactorias, ya que no solo se pudieron identificar las muestras incgnitas, si no incluso tambin la proporcin en la que se encontraban. Pese a su precisin, esta tcnica presenta algunas contras. En primer lugar, las muestras deben ser sometidas a un especial tratamiento antes de ser utilizadas en esta tcnica, ya que no todos los compuestos son aptos para ser analizados por cgl. Las derivatizaciones necesarias para analizar la muestra por cgl pueden demorar el anlisis horas o incluso das. Por otro lado, es necesario contar con patrones bien analizados, para poder contrastar con estos las muestras a identificar, aunque esta es una necesidad que presentan prcticamente todos los mtodos de identificacin. Por ltimo, los tratamientos a los que es necesario someter a las muestras pueden llegar a generar resultados ambivalentes en las identidades de estas. Por ejemplo, si se hubiese obtenido una mezcla de manitol y sorbitol, esta mezcla podra haber provenido originalmente de una mezcla de glucosa y manosa, de fructosa, o de los alditoles directamente (por no mencionar todas las posibles combinaciones). Sin embargo, existen otros mtodos que pueden ser utilizados a la hora de hacer un anlisis ms fino como, por ejemplo, realizar una derivatizacin con grupos nitrilo, etc.