TEMA 2.

CROMATOGRAFA: PRINCIPIOS GENERALES

2.1. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS 2.2. COMPORTAMIENTO CROMATOGRFICO DE LOS SOLUTOS 2.2.1. Comportamiento de retencin 2.2.2. Coeficiente de distribucin o de reparto 2.2.3. Factor de capacidad 2.2.4. Retencin relativa o factor de selectividad 2.3. EFICIENCIA DE LA COLUMNA Y RESOLUCIN 2.3.1. Altura de plato y nmero de platos 2.3.2. Asimetra de la banda 2.3.3. Resolucin 2.4. CONDICIONES CROMATOGRAFICAS 2.4.1. Procesos en la columna y ensanchamiento de la banda 2.4.2. Tiempo de anlisis y resolucin 2.5. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA 2.5.1. Determinaciones cualitativas: datos de retencin para la caracterizacin de la muestra 2.5.2. Determinaciones cuantitativas 2.5.2.1. Integracin del rea del pico: Integrador computarizado 2.5.2.2. Mtodos de evaluacin

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La caracterstica que distingue a la cromatografa de la mayora de los mtodos fsicos y qumicos de separacin, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. Una fase es estacionaria y la otra mvil. Una muestra que se introduce en la fase mvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase mvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase mvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interaccin con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el retenido ms fuertemente eluye al ltimo. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades fsicas y/o qumicas de los componentes de la muestra. La columna de separacin es el corazn del cromatgrafo. Proporciona versatilidad en los tipos de anlisis que pueden realizarse. Esta caracterstica, debida a la amplia gama de seleccin de materiales para las fases mvil y estacionaria, permite separar molculas que difieren muy poco en sus propiedades fsicas y qumicas. En un sentido amplio, la distribucin de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las molculas del soluto y las molculas de cada fase. Refleja la atraccin o repulsin relativas que presentan las molculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre s. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden deberse a fuerzas de dispersin del tipo London. En cromatografa de intercambio inico, las fuerzas en las molculas del soluto son sustancialmente de naturaleza inica; pero incluyen tambin fuerzas polares y no polares.

2.1. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS La fase mvil puede ser un gas o un lquido, mientras que la fase estacionaria slo puede ser un lquido o un slido (Tabla 2. l) dando lugar a la cromatografa de gases y a la cromatografa lquida En la cromatografa lquida, cuando la separacin involucra predominantemente un reparto simple entre dos fases lquidas inmiscibles, una estacionaria y la otra mvil, el proceso se llama cromatografa lquido-lquido (LLC). Cuando en la aptitud retentiva de la fase estacionaria intervienen principalmente fuerzas fsicas de superficie, el proceso se denomina cromatografa lquido-slido (LSC, de liquid-solid chromatography) (o de adsorcin). Otros dos mtodos de cromatografa lquida difieren un poco en su modo de accin, En cromatografa de intercambio inico (IEC, de ionic-exchange chromatography), los componentes inicos de la muestra se separan por el intercambio

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selectivo con contraiones de la fase estacionaria. En cromatografa de exclusin (EC, de exclusin cromatography), la fase estacionaria proporciona una clasificacin de molculas basadas en su mayor parte en la geometra y el tamao molecular. Este mtodo tambin se llama cromatografa de permeacin en gel, en la qumica de los polmeros, y de filtracin en gel, en la bioqumica Cuando la fase mvil es un gas, los mtodos se llaman cromatografa gas-lquido (GLC), y cromatografa gas-slido (GSC). Los mtodos que implican fases mviles gaseosas y lquidas, sern tratados en forma individual. Aun cuando hay pocas razones fundamentales para estudios separados, las diferencias en las tcnicas de operacin y en el equipo justifican su anlisis en captulos individuales. Tabla 2.1. Mtodos cromatogrficos

2.2. COMPORTAMIENTO CROMATOGRFICO DE LOS SOLUTOS El comportamiento cromatogrfico de un soluto puede describirse de diversas formas. Para cromatografa en columna, el volumen de retencin, VR, (o el correspondiente tiempo rentencin, tR) y la razn de reparto, k', son los trminos que se utilizan con ms frecuencia. Variando las combinaciones de fase estacionaria - fase mvil y varios parmetros operacin, el grado de retencin se puede cambiar de cerca de la retencin total hasta estado de migracin libre. 2.2.1. Comportamiento de retencin El comportamiento de retencin refleja la distribucin del soluto entre la fase mvil y estacionaria. La Fig. 2.1 muestra la separacin de dos alquenos isomricos. El volumen de fase mvil necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de inyeccin a travs de la columna, hasta el detector (en el mximo del pico del soluto) se define como volumen de retencin, VR. Se puede obtener directamente del cromatograma multiplicando el tiempo de retencin correspondiente, tR , por el gasto o flujo volumtrico, Fc expresado como el volumen de fase mvil por unidad de tiempo: VR = tRFc

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Figura 2.1. Separacin de 2-metil-1-buteno y 2-metil-2-buteno por cromatografa de gases De marcada influencia en el flujo volumtrico es la porosidad total del relleno (empaque) de la columna. La porosidad expresa la razn del volumen intersticial del relleno respecto al volumen de su masa total. Para empaques slidos la porosidad total es 0.35-0.45, mientras que para empaques porosos es de 0.70-0.90. En las columnas capilares el valor de la porosidad, es la unidad. La velocidad lineal promedio, u, de la fase mvil, u = L/tM donde tM representa el tiempo de trnsito de un soluto no retenido,. (L representa la longitud de la columna). En cromatografa interactiva ningn material puede eluir antes de este tiempo. Cuando se convierte a volumen, VM representa lo que se conoce como espacio muerto, volumen vaco o de retraso de la columna. Incluye las contribuciones efectivas del volumen del inyector, de cualquier tubera de conexin, de la columna en s y del detector. El volumen, VR o el tiempo, tR de retencin ajustados, estn dados por' VR = VR - VM y tR = tR tM

2.2.2. Coeficiente de distribucin o de reparto Cuando un soluto entra al sistema cromatogrfico inmediatamente se reparte o distribuye entre la fase mvil y la estacionaria. Si la fase mvil se para en cualquier

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momento, el soluto establece un equilibrio de distribucin entre las dos fases. La concentracin en fase est dada por el coeficiente termodinmico de reparto: K = CS/CM donde CS, y CM son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y mvil, respectivamente. Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos fases. El coeficiente de reparto determina la velocidad promedio de cada zona de soluto conforme la fase mvil avanza a lo largo de la columna.

2.2.3. Factor de capacidad El factor de capacidad k es la cantidad ms importante en cromatografa en columna. Relaciona el equilibrio de distribucin de la muestra dentro de la columna con las propiedades termodinmicas de la columna y con la temperatura. Para un conjunto dado de parmetros de operacin, k es una medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria en relacin con el tiempo transcurrido en fase mvil. Se define como el cociente de los moles de un soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fase mvil: k= (CS VS )/( CM VM ) = K VS / VM La razn volumtrica de fases VM / VS, se denota usualmente por . As, k' =K/. Dicho de otra forma, el factor de capacidad es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, en comparacin con un soluto no retenido (para el cual k=0), dividido entre el tiempo de elucin de una banda no retenida: Para valores de k' mayores que 10 se desperdicia tiempo analtico valioso. Los valores menores que la unidad no proporcionan una resolucin adecuada entre los solutos de elucin temprana.

2.2.4. Retencin relativa o factor de selectividad La retencin relativa o factor de selectividad, de dos solutos, donde el soluto 1 eluye antes del soluto 2, es = k2 / k1 = K2 / K1 = VR,2 / VR,1= tR,2/ tR,1 La retencin relativa depende de 1) la naturaleza de las fases estacionaria y mvil, y 2) la temperatura de operacin de la columna. Al escoger un par de fases para los solutos adyacentes ms difciles de separar se debe ser tan selectivo como sea posible.

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2.3. EFICIENCIA DE LA COLUMNA Y RESOLUCIN Bajo condiciones de operacin donde el reparto del soluto entre la fase estacionaria y mvil es lineal (esto es se sigue la ley de Henry), K y k' son independientes de la concentracin total de soluto. Despus de 50 o ms repartos entre las fases, el perfil resultante de la banda se aproxima muy de cerca al dado por una curva de distribucin gaussiana (Fig. 2.2). De todas maneras, conforme la banda de soluto pasa a travs de la columna cromatogrfica se ensancha y la concentracin en el mximo del pico disminuye. Este ensanchamiento finalmente afecta la resolucin de las bandas de soluto adyacentes.

Figura 2.2. Perfil de una banda de soluto

2.3.1. Altura de plato y nmero de platos Una caracterstica importante de un sistema crornatogrfico es su eficiencia, expresada como una cantidad adimensional y llamada nmero efectivo de platos, Nef . Refleja el nmero de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a travs de la columna. El nmero efectivo de platos se puede definir del cromatograma de una sola banda, como Nef = L/H = (tR/)2

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donde L es la longitud de la columna, H es la altura del plato, tR es el tiempo ajustado para la elucin del centro de la banda y es la variancia de la banda en unidades de tiempo. El ancho en la base del pico, (determinado con las intersecciones de las tangentes a los puntos de inflexin con la lnea base), es igual a cuatro desviaciones estndar suponiendo una distribucin gaussiana ideal (Fig. 2.2). La porcin superior del pico determina la lnea tangente, lo que minimiza cualquier contribucin de un segmento con coleo (o cabeceo). Frecuentemente es ms sencillo medir el ancho a la mitad de la altura del pico W1/2. y de ah obtener =0.425W1/2 La medicin del ancho del pico a la mitad de su altura es menos sensible a la asimetra del pico, ya que el coleo frecuentemente se muestra por debajo de la localizacin de la medida. El nmero de platos es solamente una indicacin de si ha sido bien rellenas una columna; no puede predecir adecuadamente el rendimiento de la columna bajo todas las condiciones. Est diseado para ser principalmente una medida de las contribuciones cinticas al ensanchamiento de la banda. Otras contribuciones al ancho del pico como los efectos extracolumna y factores termodinmicos (como el coleo de los picos que se discutir a continuacin), pueden desempear un papel importante. La altura del plato H, es la distancia que el soluto se mueve mientras se lleva a cabo un reparto. La altura del plato es una buena forma de expresar la eficiencia de la columna en unidades de longitud, sin especificar la longitud de la columna. Desde un punto de vista terico la altura del plato puede relacionarse directamente a las condiciones experimentales y los parmetros de operacin. Para una columna eficiente H es un nmero pequeo.

2.3.2. Asimetra de la banda Una queja comn entre los cromatografistas es la presencia de bandas asimtricas. Afortunadamente, lo que las causa es bien conocido y con frecuencia es posible diagnosticar 1as razones de la asimetra de una banda en una separacin en particular. Las bandas simtricas, se observan normalmente slo con muestras que no exceden un mximo de tamao, usualmente 1 mg de muestra por gramo de fase estacionaria (0.1 mg/g para empaques peliculares). Si k es mayor a concentraciones ms bajas de soluto, entonces el ala de baja concentracin del pico eluyente se mueve ms lentamente que el ala de alta concentracin. Conforme una banda inicialmente simtrica se mueva a lo largo de la columna se volver sesgada y, finalmente, desarrollar un frente agudo y una cola larga que da lugar al coleo del pico. La solucin en este caso es disminuir el tamao de la muestra hasta el punto en que el perfil de todas las bandas se vuelva simtrico y los tiempos de retencin constantes.

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2.3.3. Resolucin El grado de separacin o resolucin de dos bandas adyacentes se define como la distancia entre los picos de las bandas (o centros) dividida entre el ancho promedio de las bandas. Si la retencin y el ancho de la banda se miden en unidades de tiempo, como en la Fig. 2.3, la resolucin est dada por: Rs = (tR,2 - tR,1)/(0.5(W2+W1))

Figura 2.3. Definicin de la resolucin Las bandas de soluto se ensanchan gradualmente conforme emigran a travs de la columna cromatogrfica. La resolucin de los solutos individuales en bandas discretas ocurre solamente si las bandas se ensanchan en menos medida que lo que se separan los mximos de los picos. Los valores en la lnea base de los anchos de bandas adyacentes son casi constantes, esto es, W2 = W1. Puesto que el ancho de la banda en la lnea base es igual a cuatro desviaciones estndar, para una banda dada la resolucin tambin se puede expresar como Rs = (tR,2 - tR,1)/(4) Si es inadecuada, la resolucin de picos adyacentes puede mejorarse ya sea aumentando la separacin ente los picos o disminuyendo los anchos de los picos individuales. Esto involucra la selectividad de la columna cuando se alejan ms los picos y la eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico. Mejorar la selectividad implica alterar la termodinmica del sistema cromatogrfico. Mejorar la cintica del sistema aumenta la eficiencia de la separacin. Como se muestra en la Fig. 2.4 (cromatograma superior), una columna puede tener una selectividad adecuada pero mostrar poca eficiencia (comparada con el cromatograma de en medio). El cromatograma inferior muestra una eficiencia excelente, pero podra tener una mejor selectividad. Probablemente en este caso los valores de k' son muy pequeos. Cualquier criterio para la resolucin sera de algn modo arbitrario. Para una exactitud cuantitativa razonable los mximos de los picos deben estar separados al

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menos 4. Si es as, entonces RS = 1.0, que corresponde aproximadamente a un 3% de sobreposicin (contaminacin cruzada) de las reas de los picos. Un valor de RS = 1.5 (para 6) representa esencialmente una resolucin completa, con slo 0.2% de sobreposicin de las reas de los picos. Una advertencia: estos criterios son vlidos para concentraciones de soluto aproximadamente iguales. Se requerir una mayor resolucin cuando una banda de un componente mayor es adyacente a una banda de un constituyente menor. En la vida real hay muchos casos en los que la resolucin hasta la lnea base para todos los componentes es inalcanzable. La separacin es satisfactoria cuando la pareja menos resuelta de componentes puede ser determinada cuantitativamente en un grado aceptable.

Figura 2.4. Selectividad, eficiencia y razn de reparto para columnas La resolucin es una funcin de tres factores separados: 1) un factor de la selectividad de la columna que vara con , 2) una velocidad de migracin o factor de capacidad que vara con k' y 3) un factor de eficiencia que depende de L/H (o el nmero de platos tericos). Cada factor puede ser calculado directamente del cromatograma registrado y se puede ajustar en forma ms o menos independiente. Los primeros dos factores son por esencia termodinmicos, mientras que el trmino L/H est principalmente asociado a los aspectos cinticos de la cromatografa. Los cambios en y k' se logran seleccionando diferentes fases estacionarias y mviles o variando la temperatura y (con menor frecuencia) la presin. Adicionalmente, k' puede variarse cambiando las cantidades relativas de las fases mvil y estacionaria dentro de la columna. Cuando se optimiza una separacin en particular el trmino de k' debe ser considerado en primer lugar. El intervalo ptimo de valores de k' va de 1 hasta 10. Por desgracia, en una mezcla compleja con muchos componentes, a menudo slo es posible optimizar las condiciones de separacin para un par de ellos. La nica solucin efectiva de este problema cuando se trabaja con muestras complejas reales es la programacin de k. En cromatografa de gases se puede obtener un valor ptimo de k variando la temperatura. En cromatografa lquida usualmente se suele variar de manera sistemtica la composicin de la fase mvil. Si la resolucin es todava un problema se debe buscar un aumento en o en L/H.
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El trmino L/H se ajusta para proporcionar la mxima eficiencia compatible con un tiempo de anlisis razonablemente corto. Los valores ms altos de L/H siempre darn una mejor resolucin, siendo los dems factores iguales. La resolucin puede mejorarse aumentando la longitud de la columna, pero slo conforme a la raz cuadrada de la longitud de aqulla. La altura del plato debe disminuirse por medio de las caractersticas cinticas de la operacin de la columna, quiz disminuyendo el flujo de la fase mvil (pero no por debajo de un mnimo). Cualquier accin que aumente la eficiencia de la transferencia de masa de los solutos entre las fases estacionaria y mvil disminuir la altura del plato y por lo tanto mejorar la resolucin.

2.4. CONDICIONES CROMATOGRAFICAS 2.4.1. Procesos en la columna y ensanchamiento de la banda Existen varios procesos que tienen lugar en la columna durante una separacin cromatogrfica y que contribuyen a la variancia del pico, 2, o ensanchamiento de la banda. Las teoras de la dispersin de la banda en cromatografia de gases y de lquidos son prcticamente idnticas. La altura del plato expresa en trminos simples la magnitud del ensanchamiento de la banda y los factores que lo afectan. Es una funcin de procesos termodinmicos y cinticos dentro de la columna. Estos son (1) irregularidades del flujo que provocan mezclado convectivo, (2) difusin transversal y longitudinal en la fase mvil y (3) una velocidad finita en el equilibrio del soluto entre las fases estacionaria y mvil (transferencia de masa) Difusin por remolinos. La inhomogeneidad en las velocidades de flujo y en la longitud de los caminos alrededor de las partculas del empaque es el primero de los factores. Deben existir caminos de flujo de longitud desigual a travs de cualquier empacado que no sea perfecto. Algunas molculas de soluto de una especie nica pueden ser barridas a travs de la columna cerca de la pared, donde la densidad del empacado es comparativamente baja, en particular en columnas de dimetro pequeo. Otras molculas del soluto pasan por el centro de la columna, con un empacado ms compacto y a una correspondiente menor velocidad. Las molculas que siguen un camino ms corto eluyen antes que aquellas que siguen caminos ms errticos (y largos). Esto provoca para cada soluto un ensanchamiento de la banda de elucin. Para minimizar el efecto, las partculas del empaque deben tener un dimetro promedio tan pequeo y deben ser empacadas tan uniformemente como sea posible. Por supuesto, conforme las partculas son ms pequeas, la presin necesaria para impulsar la fase mvil a travs de la columna ser mayor y ms difcil ser empacar la columna de manera uniforme. De todas formas, debido a la mayor eficiencia que se obtiene con partculas de menor dimetro, la longitud de la columna puede reducirse en alguna medida. Debe establecerse un compromiso entre el tamao de las partculas, la longitud de la columna y la presin requerida. En cromatografa gas-lquido, cuando se utilizan pelculas en el interior de las columnas capilares el trmino es despreciable. Difusin longitudinal.

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La difusin longitudinal, o axial -esto es, movimiento molecular aleatorio dentro de la fase mvil (que no se ilustra en la Fig. 2.5). es un segundo proceso que produce ensanchamiento del pico. La contribucin de la difusin longitudinal a la altura del plato es significatica slo a velocidades bajas de fase mvil. Entonces, las velocidades altas de difusin del soluto en la fase mvil pueden causar que las molculas se dispersen axialmente mientras emigran lentamente a travs de la columna. Si esto pasa se produce ensanchamiento del pico.

Figura 2.5. Contribuciones al ensanchamiento de banda Transferencia de masa La resistencia a la transferencia de masa del soluto en la superficie de la fase estacionaria (Fig. 2.5b) es otro factor que contribuye al ensanchamiento del pico. El movimiento molecular lento dentro de la fase estacionaria significa un mayor tiempo de residencia en esta fase de una molcula de soluto, mientras que otras molculas avanzan con la fase mvil. Conforme la fase mvil se mueva ms rpidamente a travs de la columna y ms lenta sea la transferencia de masa, ms ancha ser la banda del soluto que eluye de la columna. Se deben escoger lquidos no viscosos para la fase estacionaria de manera que el coeficiente de difusin no sea indebidamente pequeo. Es benfico reducir el espesor de la fase estacionaria, aunque disminuye la capacidad de la columna. Otro trmino que afecta a la anchura de banda es el correspondiente a la resistencia a la transferencia de masa radialmente entre lneas de corriente de fase mvil adyacentes (Fig. 2.5c). Disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria siempre es til para reducir la altura del plato. En cromatografa lquida en columna, en contraste con la cromatografa gas-lquido, las mayores diferencias provienen de (1) la disminucin en un factor de 10000 en el valor del coeficiente de difusin del soluto en la fase mvil cuando la fase mvil est constituida por un lquido en lugar de un gas y (2) la presencia de zonas de fase mvil estancada, atrapada dentro de los poros y canales de la fase estacionaria. Las molculas de soluto se mueven por difusin hacia dentro y hacia afuera de estos poros
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(Fg. 2.5d). Estas molculas se retrasan en su movimiento hacia adelante, relativo a la banda principal de un soluto dado, y nuevamente se produce un aumento en la dispersin molecular. Tambin la velocidad de la fase mvil difiere entre un punto y otro debido a las perturbaciones provocadas por las partculas de soporte. Las lneas de corriente del lquido de la fase mvil cercanas a los lmites de las partculas se mueven lentamente, mientras que las lneas de corriente cercanas al centro entre partculas se mueven ms rpidamente. Por difusin lateral las molculas de soluto se transfieren constantemente a una lnea de corriente diferente. Por lo tanto, la obstruccin del camino de una molcula de soluto se debe tanto a la difusin entre lneas de corriente, como a la necesidad de viajar alrededor de las partculas de la fase estacionaria. El efecto de zonas estancadas se puede minimizar de varias formas. La estructura interna del empaque se puede hacer impenetrable; un ejemplo son los empaques peliculares con un ncleo slido y la superficie recubierta. La reduccin del dimetro de las partculas es muy efectivo. Tambin se puede elegir soportes que tengan poros muy amplios, de forma que el lquido fluya fcilmente hacia dentro y hacia afuera y aun a travs de los canales de los poros. Las contribuciones individuales de los cuatro trminos comentados anteriormente se muestran grficamente en la Fig. 2.6. En ambas, cromatografa gas-lquido y lquida en columna la difusin longitudinal es un factor significativo slo con velocidades de fase mvil menores que el mnimo en las curvas compuestas. Idealmente un operador desear utilizar una velocidad correspondiente a la mnima altura del plato. De hecho, la altura del plato en la regin a la derecha del mnimo aumenta slo gradualmente para la mayoria de las columnas de cromatografa gas-lquido o lquida en columna. Consecuentemente se puede negociar, una pequea perdida en la eficiencia de la columna por un menor tiempo de anlisis cuando se utilizan velocidades algo mayores que uopt.

Figura 2.6. Curva tpica de altura de plato en funcin de la velocidad promedio en una columna de cromatografa lquida 2.4.2. Tiempo de anlisis y resolucin Las discusiones anteriores han apuntado un parmetro importante de inters para el analista -a saber, el tiempo de retencin requerido para efectuar una separacin. Puede demostrarse que el tiempo de retencin mnimo requerido es aquel cuando k= 2, esto es cuando tR= 3 tM . Hay poco aumento en el tiempo de anlisis cuando k

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est comprendido entre 1 y 10, a condicin de que k no tenga efecto en las dems variables. Con un aumento al doble en la velocidad de la fase mvil esperaremos disminuir el tiempo de anlisis a la mitad. Sin embargo, esto no es estrictamente cierto porque H aumentar, como se muestra en las Figs. 2.6. De todas maneras es deseable utilizar velocidades mayores que uopt, con el correspondiente aumento en la longitud de la columna, por lo menos hasta que los requisitos de presin a la entrada de la columna se vuelvan excesivos. Aun cuando se necesita una columna mayor, el tiempo de anlisis puede ser menor. Tabla 2.2. Parmetros cromatogrficos experimentales y relaciones de inters

Tabla 2.3. Ecuaciones y parmetros relacionados de inters

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2.5. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA 2.5.1. Determinaciones cualitativas: datos de retencin para la caracterizacin de la muestra En un sistema cromatogrfico estable, el tiempo de retencin de un soluto particular es constante, y por lo tanto puede utilizarse para identificar ese soluto. As, aunque la cromatografa es primordialmente una tcnica de separacin, es posible identificar los compuestos separados de una mezcla compleja por medio de sus tiempos de retencin. Los tiempos de retencin pueden predecirse a partir de los tiempos conocidos de otros miembros de la serie homloga. La probabilidad de una coincidencia exitosa en los valores de los tiempos de retencin depende del conocimiento previo de la muestra, y por tanto de la aptitud para prever la presencia de compuestos especficos. El xito tambin depende de la disponibilidad de compuestos de referencia a propsito. El mtodo de las adiciones estndar se puede utilizar para verificar el tiempo de retencin del compuesto en cuestin. El tiempo de retencin del pico en la muestra no debe cambiar despus de efectuada la adicin con respecto al valor original si ambos compuestos (el problema y el estndar aadido) son el mismo Cuando no se tienen disponibles los compuestos de referencia debe recurrirse a la informacin estructural independiente que proporcionan otras tcnicas espectroscpicas. En muchos casos la identificacin de compuesto puede hacerse aislando el pico durante la obtencin del cromatograma y analizndolo a continuacin por un mtodo suplementario. La espectrometra de masas se ha acoplado con xito a la cromatografa tanto de gases como lquida. La informacin que se puede obtener incluye el peso molecular y la frmula emprica, informacin estructural y confirmacin de la estructura. 2.5.2. Determinaciones cuantitativas En cromatografa en columna la seal analgica generada por el detector se registra en la forma familiar de los picos cromatogrficos. El rea bajo estos picos puede integrarse en una variedad de maneras y los datos resultantes relacionarse con la composicin de muestras desconocidas. 2.5.2.1. Integracin del rea del pico: Integrador computarizado Los sistemas de datos basados en computadoras en lnea permiten una automatizacin completa. Esto incluye la adquisicin y reduccin de datos en forma automtica y la impresin de los resultados analticos. La seal cromatogrfica, inicialmente analgica, se digitaliza por medio de un convertidor digito-analgico. Con programas se puede entonces detectar la presencia de picos, hacer correcciones por la desviacin de la lnea de base, calcular reas y tiempos de retencin, determinar la concentracin de los componentes utilizando factores de calibracin almacenados y generar un informe completo del anlisis (Fig. 2.7). Las cuentas del rea del pico se acumulan cuando la seal abandona la lnea base. Este alejamiento de la lnea base usualmente se determina por medio de la medicin de la pendiente de la seal. El tiempo de retencin y las alturas de la seal en el mximo de cada pico se detectan con un programa almacenado en la memoria. El final del pico de un componente se establece cuando la seal regresa a la lnea base. Durante cromatogramas isotrmicos los programas pueden aumentar automticamente con el tiempo la sensibilidad a la pendiente, asegurando su habilidad para detectar los
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picos agudos iniciales y los picos bajos y chatos ms retardados con la misma precisin. En el caso de picos fusionados es posible asignar el rea a cada componente proyectando perpendicularmente el mnimo del valle a la lnea base corregida (Fig. 2.8). Algoritmos especiales distribuyen el rea de componente en el caso de picos sobrepuestos. Tambin en el caso de picos sobre colas de otros picos es posible distribuir las reas de cada pico de forma coherente (Fig. 2.9). Habitualmente se utilizan identificadores como los mostrados en la figura 2.10 para conocer el modo en que el ordenador ha integrado cada pico.

Figura 2.7. Impresin parcial de un cromatograma

Figura 2.8. Integracin de picos no resueltos

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Figura 2.9. Integracin de picos sobre colas de un pico mayoritario

Figura 2.10. Smbolos utilizados en algunos sistemas cromatogrficos para identificar el modo en que son integrados los picos

2.5.2.2. Mtodos de evaluacin Los tres mtodos principales de evaluacin son: 1) normalizaciones del rea, 2) calibracin con patrones o estndar y 3) patrn interno. Cada uno tiene su lugar, dependiendo de la naturaleza del anlisis. Normalizacin del rea. Cuando se sabe que el cromatograma representa la muestra completa, que todos los componentes se han separado y que cada pico se ha resuelto completamente; se puede utilizar la normalizacin de las reas para la evaluacin. Para utilizar este mtodo, se mide el rea bajo cada pico individual. Sumando todas estas reas de los picos se obtiene el rea total calculada. El porcentaje en volumen de los componentes individuales se obtiene multiplicando el rea calculada individual por 100 y luego dividindola entre el rea total calculada. El mtodo slo es vlido si el factor de respuesta de todos los componentes es el mismo, es decir iguales cantidades de distintos componentes dan la misma rea. En otro caso las reas deberan ser corregidas por un factor de respuesta de cada componente

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2. Cromatografa. Principios generales

Calibracin con estndares (mtodo del patrn externo). Cuando el volumen de la muestra es conocido con frecuencia se utiliza la calibracin con estndares o patrones. Tiene la ventaja de que slo se necesita, medir las reas de los picos de inters. Es un requisito que cada vez se inyecte la misma cantidad de muestra. Los estndares necesarios deben analizarse bajo las mismas condiciones de operacin que la muestra En la prctica, se preparan las soluciones estndar de(los) componentes de inters y se inyectan en el cromatgrafo. Para cada componente se obtiene la grfica: rea del pico en funcin de cantidad de componente. Despus, para el clculo de una concentracin desconocida, se obtiene el cromatograma de la muestra problema y el rea de cada pico se utiliza con la grfica anterior para obtener la cantidad.

Mtodo del patrn interno. El mtodo del patrn interno permite que varen las condiciones de operacin entre muestra y muestra y no requiere de repetibilidad en las inyecciones. El patrn interno debe ser un compuesto que pueda resolverse completamente de los picos adyacentes, que no est presente en la muestra problema y que no produzca ningn efecto interferente. Como en el caso anterior se preparan estndares que contienen los componentes de la muestra a analizar. A cada uno de ellos se aade una cantidad conocida del llamado patrn interno que obviamente no es uno de los componentes que se quiere analizar. Se obtienen los cromatogramas de cada estndar y se obtiene la grfica: cociente entre el rea de componente y rea del patrn interno frente a cociente entre cantidad de componente y cantidad de patrn interno. Entonces se aade una cantidad conocida del patrn interno a la mezcla desconocida. Se obtiene el cromatograma, y con el cociente entre las reas del pico de componente a determinar y la de patrn interno en la muestra problema se obtiene (con la grfica anterior determinada con estndares) el cociente entre cantidad de componente y cantidad de patrn interno. Como la cantidad de patrn interno aadida a la muestra problema es conocida puede calcularse la cantidad desconocida de componente. Cualquier variacin en el tamao de la muestra se evidenciar inmediatamente al comparar el rea del pico del patrn interno en cromatogramas diferentes pero no afectar al resultado.

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