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TÉCNICAS DE ESTUDIO DEL ADN Y LOS CROMOSOMAS

Hernández Bendezú, María del Rosario.

BANDEADO CROMOSÓMICO: G Y Q
El primer tipo de bandeado que se implementó fue el llamado “Q” ( por la sustancia fluorescente empleada, quinacrina), que produce uno de los patrones de bandas más informativos, aunque requiere microscopia de fluorescencia.  Después se comprobó que se podía obtener el mismo patrón de bandeado mediante la extracción selectiva de componentes cromosómicos con la enzima tripsina o con soluciones salinas y una tinción con el colorante de Giemsa; este patrón de bandas llamado “G”(de “Giemsa”), es el que se utiliza con mayor frecuencia como estándar.

El bandeado G es idéntico al bandeado Q, excepto en las zonas heterocromáticas de los cromosomas 1, 9 y 16 y en los satélites de los acrocéntricos, que dan una tinción variable.  Ambos patrones producen bandas que se relacionan con la composición predominante de bases en el ADN de las regiones bandeadas.  Las bandas oscuras del bandeado G y las brillantes (fluorescentes) del bandeado Q representan regiones cuyo ADN es rico en el par A-T, de manera que su coloración es proporcional a la concentración de A+T.

METAFASE MITÓTICA HUMANA TEÑIDA CON LA TÉCNICA DE BANDEO G

METAFASE MITÓTICA HUMANA TEÑIDA CON LA TÉCNICA DE BANDEO Q

BANDEADO CROMOSÓMICO: C, R Y N
El bandeado “C” (de constitutivo) tiñe solo la heterocromatina constitutiva, compuesta por ADN de tipo satélite.  En consecuencia, es completamente diferente de los bandeados G y Q y solo tiñe las regiones centroméricas y los bloques de heterocromatina C de los cromosomas 1, 9 y 16 y del brazo largo del cromosoma Y.  El procedimiento es diferente del clásico porque el material cromosómico se desnaturaliza y se extrae con álcali y se incuba en solución salina para teñirlo después con Giemsa u otros colorantes.

Las bandas C indican los sitios en los que hay ADN altamente repetitivo que no se ha extraído.  Este bandeado está indicado para la búsqueda de polimorfismos de heterocromatina.  El bandeado “R” es el inverso del bandeado clásico ( G o Q ); las bandas claras de un tipo de bandeado son oscuras en el otro tipo; se usa la cromomicina A3 y las bandas ricas en C-G son las fluorescentes.  El bandeado “N” o de los organizadores nucleolares (NOR) tiñe solo estas regiones; se utiliza nitrato de plata.

METAFASE MITÓTICA HUMANA TEÑIDA CON LA TÉCNICA DE BANDEO C

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ( PCR )

El método se basa, en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleótidos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde.

En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa.

Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers.

La técnica PCR es el método de detección de secuencias de ADN más sensible conocido hasta la fecha: mediante ella resulta posible identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Es, por lo tanto, un instrumento extremadamente valioso para establecer, por ejemplo, lazos de parentesco

Para lograr la duplicación de un tramo de ADN, cada ciclo de la técnica PCR incluye tres etapas: a) desnaturalización, durante la cual se separan las dos hebras constituyentes del ADN; b) apareamiento de los "iniciadores" o primers del tramo a replicar; c) extensión de las cadenas de primers gracias a la acción de una enzima ADN polimerasa. La repetición de los ciclos permite multiplicar geométricamente los tramos de ADN elegidos.

CARIOTIPO HUMANO
Esta clasificación se basa en el tamaño de los cromosomas y en la posición relativa del centrómero; si el centrómero es central el cromosoma es metacéntrico; cuando el centrómero está muy cerca de un extremo el cromosoma es acrocéntrico y en los casos intermedios los crosomosomas son submetacéntricos.  En la especie humana no hay cromosomas con el centrómero en un extremo (telocéntricos).

La clasificación básica de los cromosomas humanos comprende 7 grupos:

HIBRIDACIÓN IN SITU Y FLUORESCENCIA

La técnica HISYF o FISH consiste en la identificación de la región cromosómica en la que se encuentra una secuencia determinada de un ácido nucleico, detectada finalmente por una señal fluorescente. La base del procedimiento es lograr que la secuencia buscada del ADN celular se hibride con una secuencia preparada in vitro y rotulada con nucleótidos marcados, en especial con biotina o con digoxigenina, sustancias que reaccionan específicamente con otras (la biotina reacciona con avidina y la digoxigenina con su anticuerpo, antidigoxigenina) que pueden ser acopladas con una sustancia fluorescente (fluoresceína, rodamina)

La HISYF permite determinar en que cromosoma y en que región está presente una secuencia de ADN, lo que es de gran utilidad para el mapeo del genoma humano porque inmediatamente se puede relacionar esa secuencia con todos los genes y secuencias marcadores ya conocidas en ese cromosoma.  Además la HISYF permite la identificación inmediata y precisa de cada cromosoma por medio de “sondas” preparadas con secuencias específicas de ese cromosoma.

También se ha desarrollado el llamado “Pintado cromosómico” que se realiza con una mezcla de varias sondas, cada una específica de un cromosoma; como cada sonda es detectable con un colorante fluorescente de distinto color, en el mismo preparado es posible obtener, por ejemplo, la localización de dos cromosomas, identificables por su color de fluorescencia o de distintas regiones del mismo cromosoma, identificadas por colores diferentes.

La utilidad de la HISYF no se limita a cromosomas de células mitóticas; esta técnica también se puede utilizar en células interfásicas; esto permite reconocer por ejemplo, la presencia de una trisomía (como la del Síndrome de Down) por la señal triple que genera una sonda para ese cromosoma .  Presenta ventajas obvias de rapidez y economía al no exigir cultivos ni cierto número de células en mitosis.

Otra explicación importante es su uso en preparados histológicos de rutina, en especial en los obtenidos por biopsia. En estos preparados realizados mediante cortes de parafina es posible realizar HISYF para detectar, por ejemplo, la presencia de un gen determinado o de un oncogén en las células de una biopsia efectuada varios años atrás.

FISH DE UNA METAFASE MITÓTICA DE UNA MUJER EN
LA QUE SE OBSERVA UNA MICRODELECCIÓN PARA EL BRAZO CORTO DEL CROMOSOMA X

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