Universit De JIJEL Facult des Sciences Dpartement de Biologie Molculaire et Cellulaire

Immobilisation des enzymes

ralis par:
Boudjelida .H Bellal. Ch

propos par:
Dr .Siffour M
Anne universitaire 2011-2012

Kaaboub. K

Introduction
la catalyse par les cellules microbiennes est peu efficace en raison de la perte du substrat due au besoin de croissance des microorganismes et de la prsence des ractions secondaires gnantes, la possibilit dextraire des enzymes et de les utiliser pour la conversion du substrat procure des avantages non ngligeables quant au rendement et luniformit du produit.
Pour compenser les problmes lis linstabilit et au cout dextraction des enzymes en solution. On cherche les immobiliser sur des supports insolubles afin de pouvoir les rutiliser aprs lopration, et de faciliter leur sparation du produit de raction obtenu. Par ailleurs, les enzymes immobilises se prtent mieux leur incorporation dans les ractions ou lentre de substrat un bout permet de rcuprer le produit transform lautre bout en flux continu.

Quest ce quune enzyme immobilise?

Quelles sont les principales techniques dimmobilisation ? Quelles sont les domaines dapplication denzymes immobilises?

Chapitre I : Gnralits sur limmobilisation des enzymes

I.1. enzyme immobilise

Une enzyme immobilise est une enzyme lie par des moyens physico-chimiques en surface ou lintrieur dun support solide
On cherche gnralement conserver son activit enzymatique, qui a tendance: diminuer aprs immobilisation du fait de possibles gnes striques et de limitations dans laccessibilit au site actif . augmenter sa stabilit dans le temps.

I.2.But et principe dimmobilisation

lultrafiltration est lune des mthodes qui permet la rutilisation denzyme, mais il semble que celle qui a donn naissance aux plus grands dveloppements consiste rendre lenzyme insoluble par un traitement physique ou chimique convenable, suffisamment doux et slectif pour viter une perte trop importante dactivit biologique. On peut combiner les deux mthodes pour assurer une meilleure fixation de lenzyme. La rtention physique

exploite la grande diffrence de taille entre lenzyme et le substrat. Elle peut tre un rseau, une capsule ou une membrane

 Le traitement chimique se ralise par: simple interaction ionique. cration dune vraie liaison covalente. prsente lavantage de stabiliser la protine et de permettre une utilisation prolonge.

I.3.Proprits denzymes immobilises

Proprits physico-chimiques

Une des proprits importantes et caractristiques de limmobilisation est : lamlioration de la stabilit dans le temps. la rsistance vis--vis de la dnaturation.
La stabilit de lenzyme immobilise dpend beaucoup du microenvironnement impos par le support. On distingue normalement trois types de stabilit pour une enzyme immobilise: Stabilit de stockage Stabilit oprationnelle Stabilit thermique

Proprits cintiques Limmobilisation des enzymes affecte beaucoup leurs

proprits cintiques. En effet, la vitesse de raction enzymatique proprement dite il faut ajouter leffet du microenvironnement qui conditionne toute lactivit catalytique. Ainsi, les phnomnes de diffusion limitent laccs du substrat au niveau du site enzymatique

I.4. Intrts de limmobilisation

Stabilit
lie une diminution du degr de libert de la macromolcule et donc une diminution des variations conformationnelles de lenzyme. due une augmentation de la concentration de la protine locale.

Fonctionnement catalytique continu

concerne les application prparatives avec les
racteurs

les dveloppement analytiques avec les biocapteurs.

 Localisation de catalyseur
Il est simple de sparer le catalyseur et les ractants au cours ou en fin de process. Modulation de microenvironnement des enzymes charge, groupement hydrophobes, concentration locale des substrats et effecteurs. Intrt conomique conduit un abaissement des cots de revient de la production du produit recherch de faon considrable. Intrt technologique conduit un meilleur suivie et contrle de la raction catalytique.

I.5.choix de technique
Le choix dpend:
du type denzyme utilise , du transducteur et de lenvironnement dans lequel le biocapteur fonctionne. aussi des stabilits mcaniques et chimiques de la matrice et de son cot. de lapplication finale donne lenzyme

Chapitre II : Principales techniques dimmobilisation

II.1. les mthodes dimmobilisation :

II.1 Immobilisation denzyme par inclusion

Les molcules denzyme sont retenues dans le rseau tridimensionnel dun polymre insoluble dans leau rseau tridimensionnel dune matrice , ou emprisonnes dans des microcapsules dlimit par une membrane semi permable dont les pores sont suffisamment larges pour permettre le passage des molcules du substrat ou des produits de la raction.

II.1.1 inclusion dans une matrice

Figure1 : Inclusion dans un rseau de polymre insoluble.

 Inclusion dans un gel

Lenzyme est incorpore dans un gel insoluble. Ce gel peut tre constitu dune matrice organique (polymre) ou inorganique (argiles). La maille de la matrice assure de manire purement physique la rtention de lenzyme tout en permettant la diffusion du substrat jusquau site actif de lenzyme grce une porosit du gel suffisante.

Le choix du type de polymres va tre dpend de :

Proprits mcaniques du gel : compression, forces de cisaillement Proprits chimiques : toxicit, condition de stabilit en fonction de pH ; Proprits physiques : permabilit du gel.

Figure2 : inclusion dans un gel

 On utilise comme matrice pour linclusion plusieurs

polymres : Gel partir des polymres naturels: lalginate , Carraghnane, Chitosane Gels partir des polymres synthtiques: le gel de polyacrylamide.

Figure 3 : inclusion dans le gel de polyacrilamide

fibres de polyactate de cellulose On ralise une solution de triactate de cellulose dans le chlorure de mthylne. on ajoute sous agitation une solution denzyme dans leau froide ou dans un tampon contenant de glycrol mulsion obtenue est ensuite extrude sous pression dazote dans un bain de coagulation contenant de tolune. La fibre obtenue est sche sous vide pour liminer les solvants et conserver 5C.

Figure 4 : inclusion dans des fibres de polyactate de cellulose.

II.1.2. Inclusion laide une matrice II.1.2.1 Microcapsulation

La mthode consiste inclure lenzyme lintrieur de la membrane semi-permable obtenue en copolymrisant un monomre hydrophobe, dessous dans la phase organique, et un monomre hydrophile, dessous dans la phase aqueuse en mulsion dans la phase organique.

Figure 5 : Inclusion dans des microcapsules. Les micro-capsules emprisonnant lenzyme sont recueillies par centrifugation.Leur diamtre peut varier de quelques microns une centaine de microns.

II .2.2. Membrane semi- permable

assure la rtention des molcule denzyme dans un volume dtermin en vue dune utilisation continue (les hydrolase). Sont utilises dans la dgradation des macromolcules (amidon, protine). Les produits obtenus aprs lhydrolyse peuvent franchir les membranes, ce que permet de les rcuprer dans leffluent selon la figure suivante :

Figure7 : Inclusion laide dune membrane semi-permable A: membranes planes, B:fibres creuses

 Avantages et inconvnients dimmobilisation par inclusion

Avantage Raction de polymrisation et de glification bien connues. Raction chimiques avec lenzyme limite (inclusion dans des gels naturels). Application toutes les enzymes (utilisation de mlanges). Obtention de supports de forma adaptables (films, billes, fibre) Risque de fuite prvenue par rticulation du support aprs immobilisation.

Inconvnients
Certaines polymrisations font appel des agents dnaturants ou des radicaux. Problme de transfre de masse (inaccessibilit de certains substrats) Risque de fuite de lenzyme (micropores) Proprits mcaniques des gels insuffisantes.

II.2.Immobilisation par adsorption

Cest la mthode la plus simple et la plus rentable. elle consiste assurer la rtention de la molcule enzymatique la surface dun support insoluble, par interaction faible entre les groupes fonctionnels de lenzyme et du support. Linteraction enzyme-support pourra impliquer lensemble des liaisons non covalentes ou secondaires de bas niveau nergtique tel que les liaisons de Vander Waals, les liaisons hydrogne, les liaisons ioniques et le transfert de charge.

Figure 8 : immobilisation par adsorption

 Les supports utiliss

Les supports organiques Comprennent les polyosides comme lactate de cellulose, nitrate de cellulose, dextrane, agarose, alginate et les polymres comme le polystyrne, le polythylne Les supports inorganiques (support minraux) sont gnralement plus stables, rsistent lusure, aux agents chimiques et aux bactries mais la fixation covalente sur ces support est difficile cause de leurs faible ractivit.

les matriaux actifs peuvent tre des : * Les argiles * Verre poreux et silice poreuse

Figure 9 : les supports inorganiques

Autres supports : le nylon, oxyde cramique, cellulose, collagne et charbon actif.

Les paramtres qui influencent ladsorption

La concentration de lenzyme Le temps de contacte

Le pH Composition du milieu La temprature (effet positif)

 Avantages et inconvnients de limmobilisation par adsorption Avantages

Trs grande facilit de mise en uvre.
Possibilit de rgnrer les complexes enzyme-support (si lenzyme perd son activit en cours de son fonctionnement, il est possible de la dsorber et de la remplacer par une prparation active) Fixation rapide du support et immobilisation simple et non dnaturante.

 inconvnients :
Malgr sa simplicit de mise en uvre, elle demeure peu utiliser pour la conception des bioracteurs (risque de dsorption) La fragilit de la fixation (les enzymes peuvent facilement se dsorber sous laction de variation de pH, temprature

Lorientation de lenzyme et mauvaise accessibilit au site actif.

Figure 10: mauvaise accessibilit au site actif.

II.3.Immobilisation par liaison covalentes

On peut diviser les mthodes dimmobilisation denzymes par liaison covalente en deux groupes :

II.3.1. Immobilisation par liaisons covalentes sur support :

Elle est ralise par lintermdiaire de liaisons irrversibles et covalentes entre les groupements fonctionnels de lenzyme et les groupes ractifs du support Ces groupes, en gnral insuffisamment ractif, ncessiteront une activation pralable. A priori, il faut activer soit lenzyme, soit le support. lactivation des groupes fonctionnels de lenzyme peut conduire la dnaturation de lenzyme.

 Lactivation du support se fait par :

Greffage de compos bifonctionnel (bras espaceur) qui comporte une fonction capable de former une liaison covalente avec les fonctions portes par lenzymes
* Ce compos permet de fixer lenzyme une certaine distance du support et davoir une meilleure accessibilit de lenzyme son substrat. Lapparaition des fonctions chimiques ractives sur le support par raction directe .ex: cellulose +BrCN .

Figure 9: immobilisation par liaison covalente

tap1: activation du support , tape 2: fixation de lenzyme

Figure10: immobilisation au bromure de cyanogne BrCN

tap1: activation du support , tape 2: fixation de lenzyme

II.3.2. Immobilisation par rticulation ( sans support) c'est un procd d'association des diffrentes units
biocatalytiques ou de protines l'aide d'un agent rticulant masse molaire leve
Elle peut tre effectue aprs inclusion ou adsorption afin de stabiliser lenzyme immobilise et limiter les phnomnes de fuites ou de dsorption.

Figure 11: Immobilisation par rticulation.

 Lagent rticulant le plus utiliss est le glutaraldhyde (OHC-(CH2)3-CHO).

Figure12: Rticulation au glutaraldhyde

 Avantages et inconvnients dimmobilisation par liaison covalente Avantages

Stabilit accrue cause de la liaison covalente Grand choix de mthodes diffrentes Grande varit de support minraux (verre, silice, cramique) et organiques (cellulose, polymre synthtiques) Possibilit deffectuer limmobilisation en prsence de substrat pour viter linactivation (protection du site actif).

 Inconvnients
Mise en uvre de ractions chimiques souvent complexes Longueur des expriences (tape de lactivation du support) Rendements de fixation inferieurs 100% Risques de modifications chimiques de lenzyme (perte dactivit) Ncessite de purifier lenzyme pralablement Investissement important

Chapitre III : Cintique enzymatique htrogne et applications des enzymes immobilises

 III.1.Cintique enzymatique htrogne

Figure13 : la catalyse homogne.

Figure 14 : catalyse htrogne

III.2.Lapplication des enzymes immobilises dans quelques procds industriels

Lagro-alimentaire
Production dacides amins (pnicilline amidase )

Production du glucose, sirop

Production de fructose en utilisant glucose isomrase

Amlioration des proprits de boissons alimentaires : viscosit, clarification, digestibilit, got, etc Amlioration de procd de panification Amlioration de la production de produits lacts.

La chimie industrielle et pharmaceutique

Production dacides divers (lipase, pnicilline amidase) Modification de la structure dantibiotique.

Autres secteurs
Textile Blanchissage Tannerie

Exemples dapplication
Lactase immobilis par inclusion
Cest une enzyme utilise pour lhydrolyse du lactose du lait. Elle est produite par Saccharomyces lactis. Limmobilisation se fait par inclusion dans des fibres de triactate de cellulose. Les fibres ainsi obtenues sont mise en uvre dans un racteur fonctionnant en batch aliment avec du lait crm strilis.

 Les lipases immobilises Dans la raction dhydrolyse lhydrolyse du triglycride en acide gras et en glycrol. lhydrolyse du suif de buf la lipase de Condida cylindracea immobilise par liaison covalente sur des billes de Chitosane Applications dans le domaine de dtergents Entrent dans la composition des lessives dveloppement des aromes des fromages lors de la maturation

 Dans la raction de synthse synthtiser des esters la lipase de C. rugosa

immobilise sur du nylon a permis la synthse d'olyl butyrate partir d'acide butanoque et de n-butanol en prsence de n-hexane

Transestrification

la production des quivalents du beurre de cacao, des huiles de basse valeur calorique aussi dans lindustrie cosmtique et la production de biodiesel .

Interestrification

La lipase de Pseudomonas sp. immobilise sur de la clite et celle de Rhizomucor miehei immobilise sur une rsine changeuse d'anions

pour l'interestrification de l'huile de palme, l'huile de palmiste .

Conclusion
Lapplication de la catalyse enzymatique aux processus chimiques diminue lutilisation de produits nocifs dans lenvironnement et rduit ainsi le cot de traitement Les enzymes offrent un avantage distinct d leur spcificit, la biodgradabilit et la limitation de la formation de sous-produits. Lenzyme doit tre compatible et stable. Au niveau fonctionnel, la stabilit dune enzyme limite souvent son application pratique dans des processus mdicinaux et biotechnologiques.
Une approche possible pour stabiliser des enzymes est leur immobilisation sur une matrice approprie. Du point de vue industriel, les biocatalyseurs immobiliss prsentent une stabilit augmente, des changements dans lactivit enzymatique, le pH optimum et laffinit pour le substrat ont t observs. Ces changements dpendent de la source de lenzyme, du type de support et de la mthode dimmobilisation.